CN101144820A

CN101144820A - 快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法

Info

Publication number: CN101144820A
Application number: CNA2007102022185A
Authority: CN
Inventors: 潘长旺
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2007-10-23
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2008-03-19

Abstract

本发明涉及一种试条，具体是检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法。本发明采用近年来发展起来的具有特异性强、灵敏度高、简便快速特点的胶体金免疫层析检测技术，利用杂交瘤技术筛选出的抗重组AP33蛋白的5株单克隆抗体，通过不同株单抗配对，优化最佳反应模式，制成快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条。

Description

快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法

技术领域

本发明涉及一种诊断试条，具体是快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法。

背景技术

阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，T.v)是一种寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛虫，可引起滴虫性阴道炎、前列腺炎和尿道炎等多种生殖系统疾病。滴虫病是常见的性传播疾病(STD)，该病呈全球分布，人群普遍易感。此病也与男性不育有关。除引起泌尿生殖道感染外，T.v也是HIV感染和诱发宫颈癌的危险因素之一。目前国内外临床常规检查方法有生理盐水涂片法、培养检测法及免疫学方法(如ELISA、直接荧光抗体试验(DFA)、乳胶凝集试验(LAT)等)等。生理盐水涂片法(湿片法)简便易行，但该法只能检测活虫，虫体易与白细胞相混淆，检测结果与操作人员技术熟练程度有关，检出率仅为35％～80％。而培养检测法有利于提高检出率，但检测周期较长，一般需要2～7d(天)。免疫学方法虽然敏感性高，但操作较繁琐。PCR技术检测阴道毛滴虫虽具有较高的敏感性和特异性，但容易出现假阳性或假阴性反应。因此有必要研制一种特异性强、灵敏度高、简便快速、不易出现假阳性或假阴性反应的滴虫病诊断方法。而近年来发展起来的胶体金免疫层析检测技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、不易出现假阳性或假阴性反应的特点。胶体金免疫层析检测技术通常采用试条检测方式。试条一般包括衬板和设置在衬板上依次搭接的样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、NC膜及吸水层，将试纸条浸入待检标本，标本中抗原与结合垫中的金标单抗结合后形成抗原抗体复合物，通过层析运动到NC膜上，与包被单抗发生反应，形成双抗体夹心复合物，出现红色可见条带，达到检测目的。目前尚无用于快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的不足而提供一种特异性强、灵敏度高、简便快速、不易出现假阳性或假阴性反应的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法。

本发明为达到上述目的所采用的技术解决方案如下：一种快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，包括衬板和设置在衬板上依次搭接的样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有包被点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层，其特征在于：所述的金标单抗为胶体金标记的单克隆抗体AP33中的一株，所述点膜单抗为单克隆抗体AP33中的另一株。

制备试条的方法包括以下步骤：

1)单抗的纯化杂交瘤细胞培养上清和腹水，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，除去较大的凝块及脂肪滴，然后分别依次用50％、33％饱和硫酸铵沉析1次，再通过蛋白A亲和层析柱收集、合并洗脱液中含蛋白的部分，然后将其置于0.01mol/L PB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl中透析，换液35次，4℃条件下900012000r/min离心1h，除去聚合物，得到纯化好的单抗，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；

2)胶体金的制备取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％柠檬酸三钠1-2ml，加热煮沸使溶液由蓝逐渐变为紫红色，直至变红，即为胶体金溶液，并用紫外分光法确定胶体金最大吸收峰；

3)胶体金探针的制备确定胶体金标记蛋白的最适稳定量，将胶体金的PH值调至8.2，加入最适稳定量的单抗，搅拌混合1530min，加1％的BSA或0.05％的PEG20000，继续搅拌15-60min，在4℃环境中静置1-2h；4℃条件下1500-3000r/min离心10-20min，取上清液，接着在4℃条件下，9000-12000r/min离心20-60min，小心吸弃上清液，沉淀用金标保存液0.01mol/LPB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl重新悬浮至原体积的1/10，用0.45μm滤膜过滤，4℃环境中避光保存备用，所述金标保存液中含1％的BSA或0.05％PEG20000、0.05％NaN₃；

4)试纸条的组装①将衬板、样品垫层、结合垫层、包被NC膜及吸水层裁剪成适当尺寸，浸泡在处理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37℃烘干16h以上备用，所述处理液中含1％BSA、0.02％PEG20000、0.1mol/LNaCl、1％NaN₃；②将金标单抗、点膜单抗、羊抗鼠二抗制成工作浓度，将金标单抗喷涂在结合垫层上，将点膜单抗和羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上制成检测线和质控线，将样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层依次搭接在衬板上组成试条，置37℃烘箱烘2030min，将试条与干燥剂一起装入铝箔袋内，4℃密封贮存。

与现有技术相比的有益效果是：本发明采用近年来发展起来的具有特异性强、灵敏度高、简便快速特点的胶体金免疫层析检测技术，利用杂交瘤技术筛选出的抗重组AP33蛋白的5株单克隆抗体，通过不同株单抗配对，优化最佳反应模式，制成快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1为本发明试条具体实施例结构示意图；

附图2为本发明胶体金在400-600nm吸收曲线图；

附图3为本发明胶体金标记蛋白最适稳定量曲线图。

具体实施方式

快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条包括衬板和设置在衬板上依次搭接的样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有包被点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层，金标单抗为胶体金标记的单克隆抗体AP33中的一株，点膜单抗为单克隆抗体AP33中的另一株。先选择任一株作为点膜单抗，然后与其他4株单抗配伍(金标)，选择反应最强的配伍对，本实验用4A2点膜，4F8做金标反应最强，然后以反应最强的金标抗体4F8为金标，再与其他4株单抗配伍，选择反应最强配伍对。重复上述步骤，通过试验筛选出4对反应较好的配伍对，即当点膜单抗为4A2，金标单抗为4F8，或点膜单抗为4A2，金标单抗为4F11，或点膜单抗为4F8，金标单抗为4E7，或点膜单抗为4F8，金标单抗为4F11时具有较高的灵敏度。

试条的制备步骤如下：

1)单抗的纯化杂交瘤细胞培养上清和腹水，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，除去较大的凝块及脂肪滴，然后分别依次用50％、33％饱和硫酸铵沉析1次，再通过蛋白A亲和层析柱收集、合并洗脱液中含蛋白的部分，然后将其置于0.01mol/L PB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl中透析，换液35次，4℃条件下9000-12000r/min离心1h，除去聚合物，得到纯化好的单抗，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度并记录。

2)胶体金的制备取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％柠檬酸三钠1-2ml，加热煮沸使溶液由蓝逐渐变为紫红色，直至变红，即为胶体金溶液，将胶体金滴在覆有Formvar膜的铜网上，37℃烘箱干燥，透射电镜下观察拍照，测量金颗粒的直径，并计算100个胶体金颗粒直径的平均值及标准差，其颗粒直径应在20-40nm之间，以30nm为佳，然后以双蒸水作对照，用紫外分光光度计(如UV7502PC紫外分光光度计)对制备的胶体金在400-600nm范围内进行扫描，测定其吸收曲线及最大吸收峰，如图2所示，经测定最大吸收峰在524nm处，且OD524nm＝0.685，记录最大吸收波长，选择该波长为胶体金标记过程中特定的检测波长。

3)胶体金探针的制备先用光电比色法确定胶体金标记蛋白的最适稳定量：取胶体金5ml，用0.2mol/L K₂CO₃调PH至8.2；将单抗AP33中所选的如4A2、4F11、4F8、4E7和4H115株单抗的蛋白浓度调至0.5mg/ml；在10个EP管里分别加入0.5mg/ml单抗0、5、10～45μl，用0.01mol/LPB补充体积到50μl，并编号；依次加入胶体金500μl混匀，静置5min；加入50μl10％NaCl摇匀，静置5min；以1号管为空白对照，用紫外分光光度计测定1-10号管OD580nm值，如图3所示，以OD580nm值为纵坐标，蛋白用量为横坐标，绘制曲线。选取曲线上最先与横轴相近的那一点所对应的蛋白量作为蛋白最小稳定量x，胶体金标记蛋白的最适稳定量即为x(1+20％)，从曲线上可以看出，单抗浓度为30μg/ml时曲线与横轴最接近，即标记单抗的最小稳定量x为30μg/ml，标记时在此基础上再加20％即为胶体金标记蛋白的最适稳定量为36μg/ml。然后将胶体金的PH值调至8.2，加入最适稳定量的单抗，搅拌混合15-30min，加1％的BSA或0.05％的PEG20000，继续搅拌1560min，在4℃环境中静置1-2h；以4℃条件下1500-3000r/min离心1020min，取上清液，再以4℃条件下9000-12000r/min离心20-60min，小心吸弃上清液，沉淀物用0.01mol/lPB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl重新悬浮至原体积的1/10，用0.45μm滤膜过滤得到胶体金探针，4℃环境中避光保存备用；胶体金探针的鉴定：(1)定量测定：以金标保存液0.01mol/LPB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl为空白对照测胶体金最大吸收峰524nm处0D值，所述金标保存液中含1％的BSA或0.05％的PEG20000、0.05％NaN₃；(2)质量鉴定：采用斑点免疫吸附实验对胶体金探针进行质量鉴定，方法如下：①将NC膜剪成1cm×1cm方格，装入自制的反应板内(中央有一小孔，下垫有吸水材料)；②将0.5mg/ml金标单抗分别做1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8倍稀释，各取稀释液2μl，同时取2μl PB缓冲液做阴性对照，分别点于剪好的膜片中央，37℃1h烘干；③将标记金溶液(1∶10稀释)和待测滴虫抗原预混，取30μl预混液加到膜上，同时设裸针对照：取0D＝0.2的30nm胶体金30μl加到膜上；④双蒸水冲洗。

4)试纸条的组装①将衬板1、样品垫层2、结合垫层3、包被NC膜4及吸水层5裁剪成适当尺寸，浸泡在处理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37℃烘干16h以上备用，所述处理液中含1％BSA、0.02％PEG20000、0.1mol/LNaCl、1％NaN₃；②将金标单抗、点膜单抗、羊抗鼠二抗制成工作浓度，将金标单抗喷涂在结合垫层3上，将点膜单抗和羊抗鼠二抗喷涂在NC膜4上制成检测线6和质控线7，将样品垫层2、喷有金标单抗的结合垫层3、喷有点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜4及吸水层5依次搭接在衬板1上组成试条，置37℃烘箱烘2030min，将试条与干燥剂一起装入铝箔袋内，4℃密封贮存。其中NC膜4为硝酸纤维素膜，结合垫层3由玻璃纤维膜构成。

使用方法将试纸条浸入待检标本，标本中AP33抗原与结合垫中金标抗AP33的单抗结合后形成抗原抗体复合物，通过层析运动到NC膜4上，与包被单抗发生反应，形成双抗体夹心复合物，出现红色可见条带，全部实验过程需要315min。结果判断：阴性：试纸条检测带(T带)不显色，仅质控带(C带)显色，出现1条红色带；阳性：试纸条检测带和质控带均显色，出现2条红色带。

试纸条的性能测试

灵敏度测定将重组AP33抗原按0，0.25，0.5，1.0，5.0，10，20，40，80ng/ml稀释度进行检测，检测线出现红色的最低可检测量，结果显示本试纸条检测重组抗原的最低可检测量为20ng/ml。

特异性试验本试纸条检测18例大肠埃希菌、20例阴道杆菌、22例白色念珠菌，结果与3例白色念珠菌有弱交叉反应，特异性为95％。

重复性试验用同一批不同试纸条测定同一样品，或用不同批号试纸条测定同一样品时，其测试带、质控带的显色时间、颜色深浅和最终结果判断基本相同。

稳定性试验将该试纸条4℃条件下放置半年，每月抽检，测定滴虫感染人群和健康人群，其敏感性和特异性未见明显改变。将该试纸条37℃温箱放置14d，做热稳定性试验与4℃条件下放置的试纸条对照，结果无明显差别。

临床敏感性检测从临床收集120份阴道分泌物标本，分别用胶体金免疫层析法(GICA)和湿片法检测阴道毛滴虫黏附蛋白AP33，两种方法比较见下表：

GICA和湿片法检测临床标本黏附蛋白AP33结果比较。

Tab.2Re sults of adhesion protein 33(AP33)of Trichomonas vaginalistested by GICA and wet mount examination

	湿片法		合计
	湿片法			+	-
	GICA	+-		+	-	546	357	5763
合计	GICA	+-	60	60	120	546	357	5763

由上表可见，以湿片法检测阴道毛滴虫黏附蛋白AP33为参照，则GICA法的敏感性为90％，特异性为95％，两法符合率为92.5％。

Claims

1.一种快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，包括衬板和设置在衬板上依次搭接的样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层，其特征在于：所述的金标单抗为胶体金标记的单克隆抗体AP33中的一株，所述点膜单抗为单克隆抗体AP33中的另一株。

2.根据权利要求1所述的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，其特征在于：所述的单克隆抗体AP33为4A2、4E7、4F8、4F11、4H11。

3.根据权利要求1或2所述的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，其特征在于：所述点膜单抗为4A2，金标单抗为4F8。

4.根据权利要求1或2所述的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，其特征在于：所述点膜单抗为4A2，金标单抗为4F11。

5.根据权利要求1或2所述的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，其特征在于：所述点膜单抗为4F8，金标单抗为4E7。

6.根据权利要求1或2所述的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，其特征在于：所述点膜单抗为4F8，金标单抗为4F11。

7.种制备权利要求1所述试条的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)单抗的纯化杂交瘤细胞培养上清和腹水，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，除去较大的凝块及脂肪滴，然后分别依次用50％、33％饱和硫酸铵沉析1次，再通过蛋白A亲和层析柱收集、合并洗脱液中含蛋白的部分，然后将其置于0.01mol/L PB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl中透析，换液3-5次，4℃条件下9000-12000r/min离心1h，除去聚合物，得到纯化好的单抗，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；

2)胶体金的制备取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％柠檬酸三钠1-2ml，加热煮沸使溶液由蓝逐渐变为紫红色，直至变红，即为胶体金溶液，并用紫外分光法确定胶体金最大吸收峰；

3)胶体金探针的制备确定胶体金标记蛋白的最适稳定量，将胶体金的PH值调至8.2，加入最适稳定量的单抗，搅拌混合15-30min，加1％的BSA或0.05％的PEG20000，继续搅拌15-60min，在4℃环境中静置1-2h；4℃条件下1500-3000r/min离心10-20min，取上清液，接着在4℃条件下，9000-12000r/min高速离心20-60min，小心吸弃上清液，沉淀用金标保存液0.01mol/LPB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl重新悬浮至原体积的1/10，用0.45μm滤膜过滤，4℃环境中避光保存备用，所述金标保存液中含1％的BSA或0.05％的PEG20000、0.05％NaN3；

4)试纸条的组装①将衬板、样品垫层、结合垫层、包被NC膜及吸水层裁剪成适当尺寸，浸泡在处理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37℃烘干16h以上备用，所述处理液中含1％BSA、0.02％PEG20000、0.1mol/LNaCl、1％NaN3；②将金标单抗、点膜单抗、羊抗鼠二抗制成工作浓度，将金标单抗喷涂在结合垫层上，将点膜单抗和羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上制成检测线和质控线，将样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层依次搭接在衬板上组成试条，置37℃烘箱烘20-30min，4℃密封贮存。