CN103201057A - 免疫学测定用蓝色金纳米颗粒、其制造方法以及使用该蓝色金纳米颗粒的测定方法 - Google Patents

免疫学测定用蓝色金纳米颗粒、其制造方法以及使用该蓝色金纳米颗粒的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种金纳米颗粒，其包括含有哌嗪环的有机缓冲液、金和具有还原性的有机酸，并且当其分散为胶体溶液时通过目视观察显示为蓝色，所述金纳米颗粒能够通过以下步骤容易地制得：核形成步骤，其中，通过使含有哌嗪环的有机酸与第一金盐的溶液反应以形成核金纳米颗粒；生长步骤，其中，通过向该核金纳米颗粒的溶液中同时添加第二金盐的溶液和具有还原性的有机酸并使其反应，从而使该核金纳米颗粒生长。可将所制得的金纳米颗粒用作免疫学测定法中的标记试剂。

Description

免疫学测定用蓝色金纳米颗粒、其制造方法以及使用该蓝色金纳米颗粒的测定方法
技术领域
本发明涉及蓝色金纳米颗粒和蓝色金纳米颗粒的胶体溶液，它们均具有高度鲜明的显色性，同时具有稳定的耐久性和优异的识别性，并可用作免疫学测定用标记试剂或蛋白质染色剂。本发明还涉及制造本发明的蓝色金纳米颗粒的方法，以及使用该蓝色金纳米颗粒的检测试剂盒和测定方法。此外，本发明涉及免疫学测定用标记物质，在该免疫学测定中，本发明的蓝色金纳米颗粒被用作免疫测定系统中的标记物质。
背景技术
近年来，作为利用抗体所具有的特异反应性来检测样品液中的抗原的简易体外诊断试剂盒或便携式诊断装置，免疫层析试纸条式免疫学测定法变得更加重要。特别是，为了检测是否存在流感病毒或细菌等病原体的感染，对基于免疫层析法的简易多项检测工具进行了研究与研发。
胶体金属颗粒或乳胶颗粒通常被用作用于免疫学测定法的不溶性载体。为了牢固地担载蛋白质等待标记物质，乳胶颗粒需要化学官能团的修饰等复杂的制造步骤。因此，优选使用能够容易地担载待标记物质并能够以低成本方便地制造的胶体金颗粒。
由于抗体由不溶性载体标记的免疫层析法的检查药品仅需要简易的操作、且利用其进行检查仅需要短时间，因此广泛使用，然而，与EIA相比，由于这种检查药品通常灵敏度低，因此在结果为阳性时能够观察到的线是不清晰的。
为了解决该问题，开发了多种金属胶体，这些金属胶体比已经投入实际应用的常规胶体金属颗粒具有更高的灵敏度，并且适合用作免疫学测定用标记试剂或蛋白质染色剂。
专利文献1提供了通过在胶体金属颗粒（平均粒径为30-100nm）的表面上担载铂而获得的平均粒径为50-150nm的胶体金属颗粒，这是因为胶体箔颗粒的平均粒径小而不充分显色，不适合用在免疫层析法中。该胶体金属颗粒是通过在溶剂中还原氯金酸以形成胶体金颗粒、然后在所得胶体金颗粒的存在下还原氯铂酸而制备的（参见专利文献1）。
专利文献2提供了通过对上述胶体金属颗粒进行改良而获得的具有更高灵敏度的胶体金属颗粒。即，提供了在其上担载有平均粒径为5nm的铂的胶体金属颗粒（平均粒径为30-100nm）。这种胶体金属颗粒是通过如下制造方法所制得的：将在介质中制备胶体金属颗粒时添加的还原剂的量、以及在胶体金属颗粒上还原并担载铂时添加的还原剂的量调节至预定范围，其中，所述介质基本上不包含保护性胶体形成剂。这种保护性胶体形成剂的例子包括水溶性高分子物质（如PVA、PVP和明胶等）、表面活性剂以及高分子螯合剂（参见专利文献2）。
作为提高免疫学和免疫细胞学诊断检查的灵敏度的另一种方法，提供了这样一种方法：用烷基硫醇涂布金溶胶超细颗粒，以赋予该金溶胶表面以特定的疏水亲水平衡，从而防止发生由盐引起的凝集，这使所述金溶胶表面与外源蛋白质之间的非特异性相互作用最小化（参见专利文献3）。
另一方面，在妊娠诊断用体外诊断剂中，已经投放市场的红色球状胶体金颗粒得到改良并表现出更高的灵敏度。胶体金需要具有：适于预期用途的粒径；尖锐的粒径分布；以及均匀的圆球形，其制造工艺正在开发中。
专利文献4包括：向第一金盐的溶液添加第一还原剂（柠檬酸盐）以形成胶体核颗粒（平均粒径为12-17nm）的核形成阶段；以及向该胶体核颗粒的溶液中同时添加第二金盐和第二还原剂（抗坏血酸盐）以使胶体核生长的生长阶段。此生长阶段至少进行一次。所述胶体金颗粒的平均粒径在第一次的生长阶段中为大于或等于17nm且小于55nm；在第二次的生长阶段中为大于或等于55nm且小于110nm；在第三次的生长阶段中为111-220nm。所述粒径的标准偏差在10%以内（参见专利文献4）。
在诸如用于检查是否妊娠的妊娠检查试剂盒等仅检查一个项目的情况下，在目视判定时，只需要使用一种标记试剂。近来，在诸如感冒状感染或呼吸道感染的病毒检查中，需要对致病病毒进行鉴定，此时应该进行多项检查。因此，为了减轻患者和医护人员的负担，研制了多种检查系统。
例如，尽管已知有一种能够通过使用一种检查工具而对多个病毒（轮状病毒、杯状病毒、冠状病毒、腺病毒和肠病毒等）进行检测的侧向流动免疫测定，然而，该测定具有如下问题：多条检测线易于导致错误的目视判定。
在通过使用免疫层析法对呼吸道感染中的病毒进行检查时，研发出了这样一种检查方法，该方法包括：用检体处理液对鼻涕、痰或鼻腔拭子液进行预处理，以制备适合于检查多个呼吸道感染的检查样品；以及通过使用第一检查工具（例如，用于检查流感病毒感染的工具）和第二检查工具（例如，用于检查腺病毒感染或RS病毒感染的工具）等多个检查工具对所得检查样品的各部分进行分析（参见专利文献5）。
另外，开发出了一种包括免疫层析法的测定方法，该免疫层析法通过使用具有任意颜色的已标记抗体颗粒而具有强的判定能力，并且通过使用两种以上的已标记抗体颗粒而能够同时测定两种以上的测定对象。更具体而言，通过使用TRITC（吸收最大值位于约550nm，红色）和FITC（吸收最大值位于约500nm，橙色）等荧光染料而同时对hCG和LH进行测定（参见专利文献6）。
当通过使用一种检查工具以目视判定同时进行多项目检查、并且所使用的标记试剂或蛋白质染色剂为同一颜色或同类颜色时，会有导致误判或误诊的可能性。为了防止目视判定的误判或误诊，需要通过使用颜色的识别性高的标记试剂或蛋白质染色剂来进行目视判定。
当存在两种颜色时，它们的识别性根据组合使用时的颜色而有所不同。由于红色和蓝色通过目视能够高度的相互区分，因此，它们被用于各种区分目的，如区分男女或区分热水（红）和水（蓝）。常规的投入实际应用的胶体金颗粒是红色球状颗粒。若将颜色不同的、即对于红色而言识别性高的蓝色胶体金颗粒用作标记试剂或蛋白质染色剂，则推断通过目视判定的误判或错判会明显减少。然而，蓝色胶体金颗粒尚未投入实际应用。
在专利文献7-9中，对通过改变金属纳米颗粒的大小、式样、结构/形状等使光吸收波长性质发生变化的金属纳米颗粒进行了描述。
根据专利文献7和8，蓝色金纳米颗粒具有金纳米壳、纳米棒、纳米管或纳米棱柱颗粒的结构/形状；所述金纳米颗粒通过以下方式制造：（1）向黄色银纳米颗粒溶液（含有聚乙烯吡咯烷酮或乙二醇等保护剂）添加还原剂，然后使所得混合物在大约100℃下进行回流；（2）向这样经过回流的反应混合物中注入金盐溶液，使其反应；以及（3）在冷却至常温后，使该反应混合物通过0.2μm的微孔过滤器进行过滤，这样获得的金纳米颗粒仅其表面层由金（金纳米壳）形成。根据这些文献，金纳米棒、金纳米管或金纳米棱柱是在形成金纳米颗粒时，通过使用溴化十六烷基三甲铵（溴化物）（C6TAB）等表面活性剂而获得的。这些文献中没有对颗粒大小的限定性描述。这些文献中包括将所述颗粒用作化妆品用颜料的描述，但是没有关于将所述颗粒用作免疫测定中的标记试剂或蛋白质染色剂的描述（参见专利文献7和8）。
专利文献9描述了通过在含有C16TAB（铵盐的表面活性剂）的水溶液中使用还原剂（胺类）来还原金离子而获得的棒状金纳米颗粒。所述金纳米颗粒的纵横比（长轴/短轴）可以通过调节组合使用的所述胺和所述铵盐的混合比例来进行控制。通过这样的方式，得到纵横比为2至11且吸收波长峰面积为658nm至1200nm的金纳米棒。根据该描述，这些金纳米棒可以被用作检查药品（参见专利文献9）。
由于如此获得的金纳米颗粒含有C16TAB作为表面活性剂，因此，它们不适合用于直接担载（修饰）检测抗体等蛋白质。由于这种金纳米颗粒需要去除或置换表面活性剂等复杂操作，因此，作为在免疫学测定法中被用作检查药品的蛋白质的标记物质，不优选该金纳米颗粒。此外，由于具有C6TAB毒性，因此从操作的角度考虑，不优选该金纳米颗粒。
非专利文献1描述了呈现为蓝绿色的棍状金纳米晶体的胶体。该棍状金纳米晶体具有复杂的三维结构，具有1-8个突起，并且包括突起在内的晶体尺寸为30nm至50nm（突起的长度为大约15nm至25nm、宽度为大约8nm）。此三维枝状金纳米晶体通过氯金酸水溶液和为Good’s缓冲成分的有机酸（HEPES、HEPPSO或PIPES等）在室温下反应而以高产率（92%）获得（非专利文献1）。
然而，在非专利文献1中获得的呈现为蓝绿色的枝状纳米晶体的胶体其晶体大小为30nm至50nm，这并不是所需尺寸。因此，即使将其用作免疫层析诊断剂，不充分的显色也会妨碍顺利的目视判定。
从相关技术文献中可清楚的得知，呈现为蓝绿色的金纳米晶体的胶体由于其胶体粒径相对较小（为约30nm至50nm），因此并不适合用作免疫层析诊断剂的标记载体。此外，被称为多脚状（multipod-shaped）、枝状或金平糖状的胶体大多使用形状稳定剂，这些形状稳定剂难以利用蛋白质完成金纳米颗粒的直接修饰。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP-A-2003-262638
专利文献2：JP-A-2005-233744
专利文献3：JP-A-6-116602
专利文献4：JP-A-2007-321232
专利文献5：JP-A-2008-164403
专利文献6：JP-A-10-132817
专利文献7：JP-A-2008-545884
专利文献8：JP-A-2009-501786
专利文献9：JP-A-2006-118036
非专利文献
非专利文献1：Chem.Mater.2007,19,2823-2830
非专利文献2：Langmuir2005,21,2012-2016
非专利文献3：J.Phys.Chem.B2006,110,19291-19294
非专利文献4：Nano Lett.2006,6,683-688
发明内容
本发明需要解决的问题
本发明的目的是提供蓝色金纳米颗粒、通过将该金纳米颗粒分散于介质中而获得的蓝色金纳米颗粒的胶体溶液、以及下述这样的蓝色金纳米颗粒，该蓝色金纳米颗粒在目视时表现出高度鲜明的蓝色，优异的质量稳定性、保存稳定性和识别性，可用作免疫学测定的标记试剂或蛋白质染色剂，并且由于与常规的红色不同而容易识别；并且本发明的目的是解决有关蓝色金纳米颗粒的制造方法、通过使用该蓝色金纳米颗粒而使测定精确度提高的检查试剂盒、以及使用该检查试剂盒的测定方法相关的问题。
以上用作参考的非专利文献1至3中的蓝色金纳米颗粒因为如下两个问题而不适合用作免疫层析诊断剂的载体：
1.这些蓝色金纳米颗粒的尺寸不适合用于免疫学测定。就平均粒径而言，适合用于免疫层析法试剂的粒径为大约40nm至100nm。根据非专利文献1，所述粒径为大约30nm。
2.它们含有形状稳定剂。在非专利文献2至4中所述的三维棍状金纳米颗粒含有形状稳定剂，以控制它们的形状。该形状稳定剂防止了蛋白质对金纳米颗粒的直接修饰。
当实施多项检查且常规的红色金纳米颗粒和着色乳胶颗粒被用于多项同时测定时，由于金纳米颗粒和乳胶颗粒的粒径不同（通常采用的乳胶颗粒的尺寸要大于金纳米颗粒），因此在免疫层析法中，难以选择孔径适合这两种颗粒的免疫层析载体。因此，需要使用两种颜色不同的胶体金颗粒作为标记物质，这两种胶体金颗粒能够容易地担载蛋白质等被标记物质，并且不昂贵。
为了解决上述问题，本发明的发明人通过增加颗粒的大小以使其适合于免疫学测定、并通过选择允许用蛋白质对金纳米颗粒进行直接修饰的形状稳定剂，从而成功提供了适合用于免疫层析诊断剂的载体的蓝色金纳米颗粒，更具体而言，提供了可用于通过免疫层析法进行的多项检测中的多项检测试剂的蓝色纳米金颗粒。
解决问题的方法
本发明提供了适合于免疫学测定的蓝色金纳米颗粒，其使得蛋白质对该金纳米颗粒的修饰变得容易，同时最适合用作多项检测试剂。
具体而言，本发明的蓝色金纳米颗粒由为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸（如HEPES等）、Au（金）和具有还原性的有机酸（如抗坏血酸和柠檬酸等）构成，该金纳米颗粒在目视时呈现为蓝色，并具有金平糖形状。
从色彩鲜明性、稳定耐久性以及胶体的稳定耐久性的角度考虑，本发明的蓝色金纳米颗粒的平均粒径为20nm至200nm，优选为40nm至180nm，从包括检查时的显著识别性的各种实用角度考虑，通常最优选为50nm至120nm。最适宜的范围为60nm至100nm。在蓝色金纳米颗粒分散为胶体的液体中，所述蓝色金纳米颗粒具有视觉观察时呈蓝色的特征。
本发明使用的术语“平均粒径”表示通过包括后面将进行说明的蓝色金纳米颗粒的核突起部分而确定的值。在本发明的蓝色金纳米颗粒中，核突起部分的长度优选为5nm至50nm。突起的数目为每核4个以上。
在含有根据本发明的蓝色金纳米颗粒的胶体水溶液中，胶体金颗粒的平均粒径为20nm至200nm，优选为40nm至180nm，通常最优选为50nm至120nm，最适合的为60nm至100nm。平均颗粒核径为20nm至60nm。含有根据本发明的蓝色金纳米颗粒的胶体水溶液的特征在于：在紫外可见吸收光谱中，其在570nm至750nm的范围内具有最大吸收波长。通过将本发明的胶体金水溶液中所含的金纳米颗粒用作免疫层析法中的标记物质，则可利用高度区分于红色的蓝色进行检测。这使得在多项同时检测中，可在减少误诊案例的情况下实施免疫层析学检测。需要注意的是，表述“根据本发明的蓝色金纳米颗粒的胶体水溶液”表示纳米级（nm）的微细颗粒（特别是金纳米颗粒）在水等溶剂中的分散体系。简言之，本发明成功提供了蓝色纳米颗粒、蓝色金纳米颗粒的胶体溶液及其制造方法、以及适合于免疫学测定的金平糖状蓝色金纳米颗粒，其使得蛋白质对蓝色金纳米颗粒的修饰变得容易，同时其最适合用作多项检测试剂。
本发明提供了蓝色金纳米颗粒、其制造方法以及其使用方法。本发明的金纳米颗粒具有以下特征：
（a）本发明的第一特征为蓝色金纳米颗粒，包括平均粒径为20nm至200nm的金纳米颗粒；
（b）本发明的第二特征为根据（a）所述的蓝色金纳米颗粒，其中，其紫外可见吸收光谱的最大波长在570nm至800nm的范围内；
（c）本发明的第三特征为根据（a）或（b）的蓝色金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒为具有三维突起的接枝状颗粒、多脚状颗粒或金平糖状颗粒；
（d）本发明的第四特征为根据（a）至（c）中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒，其通过使由金纳米颗粒构成的核的外周生长而获得；以及
（e）本发明的第五特征为根据（a）至（d）中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒，其平均颗粒核尺寸为20nm至60nm、平均粒径为50nm至120nm、每个核具有4个以上的突起、并且突起长度为5nm至50nm。
本发明的金纳米颗粒分散于水等介质中而形成的胶体具有以下特征：
（f）本发明的第六特征为蓝色金纳米颗粒的胶体溶液，其包括：权利要求1中所述的蓝色金纳米颗粒；为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸；以及具有还原性的有机酸，并且其分散为胶体溶液。
特别是本发明的金纳米颗粒的制造方法具有以下特征：
（g）本发明的第七特征为制造蓝色金纳米颗粒的方法，包括：核形成步骤，其中，通过使为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸与第一金盐的溶液反应以形成核金纳米颗粒；生长步骤，其中，通过向该核金纳米颗粒的溶液中同时添加第二金盐的溶液和具有还原性的有机酸并使其反应，从而使该核金纳米颗粒生长；
（h）本发明的第八特征为根据（g）所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述生长步骤是在大于或等于10℃且小于40℃的反应温度下进行的；
（i）本发明的第九特征为根据（g）或（h）所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述生长步骤中的所述有机酸的浓度为0.075mM至0.15mM；
（j）本发明的第十特征为根据（i）所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸为选自由2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷-3-磺酸)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸和哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)构成的组的一种以上的有机酸；
（k）本发明的第十一特征为根据（g）所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述具有还原性的有机酸为选自由酒石酸、酒石酸盐、单宁酸、单宁酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸盐、柠檬酸和柠檬酸盐构成的组中的一种以上的有机酸；以及
（l）本发明的第十二特征为根据（g）所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，在所述生长步骤中，所述为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸与所述具有还原性的有机酸组合使用。
接下来，特别是本发明的作为用于免疫学测定的标记物质具有以下特征：
（m）本发明的第十三特征为用于免疫学测定的标记物质，其包括（a）至（e）中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒；
（n）本发明的第十四特征为根据（m）所述的用于免疫学测定的标记物质，其包括至少两种形状不同的金纳米颗粒；
（o）本发明的第十五特征为根据（n）所述的用于免疫学测定的标记物质，其包括至少两种形状不同的金纳米颗粒，即：球状金纳米颗粒以及具有三维突起的接枝状、多脚状或金平糖状金纳米颗粒；以及
（p）本发明的第十六特征为一种免疫学测定法，其将（a）至（e）中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒用作标记物质。
本发明的所述问题能够通过采用上述本发明的构成而得到解决。
发明的有益效果
由于本发明的蓝色金纳米颗粒的平均粒径为20nm至200nm，优选为40nm至180nm，通常最优选为50nm至120nm，最适宜为60nm至100nm，因此，该蓝色金纳米颗粒能够提供最适合于免疫层析诊断剂的粒径。
与球状红色金纳米颗粒等组合使用能够制备具有两条以上判定线的免疫层析诊断剂。由于这能够使多项检查中的目视判定变得容易和准确，因此防止了误诊或误判。
此外，本发明的蓝色金纳米颗粒可易于被蛋白质修饰，所以他们使得能够在不降低灵敏度的情况下对结果进行准确的判断。因此，所述纳米颗粒作为免疫层析诊断剂具有优异的性能。
另外，由本发明的蓝色金纳米颗粒制备的免疫层析诊断剂比由通过其他方法而获得的颗粒所制备的免疫层析诊断剂更加廉价。
附图说明
[图1A]图1A为示出本发明的蓝色金纳米颗粒的一个例子的形状和粗略大小的透射式电子显微镜图像。
[图1B]图1B为示出本发明的蓝色金纳米颗粒的另一个例子的形状和粗略大小的透射式电子显微镜图像。
[图2A]图2A为示出生长前的本发明的蓝色金纳米颗粒的一个例子的透射式电子显微镜图像。
[图2B]图2B为示出生长后的本发明的蓝色金纳米颗粒的一个例子的透射式电子显微镜图像。
[图3A]图3A为以20倍的放大倍率（图中比例尺的长度为50mm）示出生长前的本发明的蓝色金纳米颗粒的另一个例子的透射式电子显微镜图像。
[图3B]图3B为以50倍的放大倍率（图中比例尺的长度为20mm）示出生长后的图3A的蓝色金纳米颗粒的透射式电子显微镜图像。
[图4A]图4A示出了在本发明的蓝色金纳米颗粒的合成中的紫外可见吸收光谱的波长（nm）与吸光度之间的关系。
[图4B]图4B示出了在图4A中的本发明的蓝色金纳米颗粒的合成中的各反应温度（℃）与最大吸收波长之间的关系。
[图5]图5示出了在本发明的蓝色金纳米颗粒的合成中的紫外可见吸收光谱的最大吸收波长（nm）和抗坏血酸的浓度之间的关系。
[图6]图6示出了在本发明的蓝色金纳米颗粒被用作免疫层析试剂时的检测灵敏度的比较。
具体实施方式
作为本发明的蓝色金纳米颗粒，尽管理想的是在一个步骤中制造出那些平均粒径大的蓝色金纳米颗粒，然而，首先形成预定大小的颗粒、然后进行生长步骤以获得较大粒径的颗粒才是合理的。本发明的蓝色金纳米颗粒由平均粒径为20nm至200nm的金纳米颗粒构成。通过将本发明的金纳米颗粒分散于介质中而获得的胶体溶液的胶体金颗粒的平均粒径为20nm至200nm，优选为40nm至180nm，通常最优选为50nm至120nm，最适宜的为60nm至100nm。从检查时的显著识别性等实际应用中的各种角度考虑，所述金纳米颗粒优选具有尖锐的粒径分布以及均一的金平糖状的形状。平均粒径通常能够通过重力光散射法来确定（使溶胶状的胶体颗粒在超速离心机中以14000至5530000×g的速度旋转并对其进行处理，由该胶体颗粒的沉淀速率来确定平均粒径）。在本发明中，对从通过透射式电子显微镜（TEM，“JEM-2010”，JEOL,Ltd.的产品）拍摄的投影照片中随机选择的100个颗粒的投影面积直径进行测量，然后确定基于平均值的平均粒径（平均颗粒直径）。
当设定X轴（例如，金纳米颗粒的大小）和Y轴（例如，数目比率）以在它们之间绘制金纳米颗粒的粒径分布和平均颗粒的分布曲线时，本发明的金纳米颗粒的分布曲线的顶点通常基本上位于40nm至120nm的粒径范围，优选为50nm至110nm，更加优选为60nm至100nm。这揭示了该分布曲线相对较窄，这表示很多纳米颗粒具有相近的粒径，因而具有均一的粒径。可预期该纳米颗粒表现出稳定且高度可靠的行为，并抑制了由于混入其中的异物而导致的误差跨度的产生。
在数量上，属于20nm至200nm范围内的金纳米颗粒的总重量通常为40%以上，优选为60%以上，更加优选为80重量%以上。其余的部分由没有生长而残留下来的颗粒、圆球状颗粒和未反应的残余物构成。
本发明的金纳米颗粒是具有核和三维突起的所谓的金平糖状纳米颗粒。那些在20nm至200nm的范围内具有任意平均粒径的金纳米颗粒可通过改变制造方法的操作而获得。在用作标记颗粒时，在提高基于标记颗粒的特定颜色而进行的目视判定的准确性方面，那些平均粒径落入50nm至120nm的范围内（优选在55nm至100nm的范围内）的金纳米颗粒是优异的。
这些金平糖状颗粒优选具有多个三维突起。此处使用的术语平均粒径表示包括所述核突起在内而确定的值。本发明的金纳米颗粒每个核具有大约1个至20个突起，优选每个核具有大约4个至10个突起。这些突起的数目或长度因为取决于核的生长而非常难以预先确定。
核上具有三维突起的金纳米颗粒和胶体金纳米颗粒分别统称为接枝状、多脚状或金平糖状金纳米颗粒和胶体金纳米颗粒。作为所谓的金纳米颗粒和胶体金纳米颗粒，它们可以为具有三维突起的各种结构，并通过纳米立方体、纳米棒、纳米脚（nanopods）、星形金纳米颗粒或者接枝状金纳米颗粒等已知的名称来进行称呼，其中所述接枝状金纳米颗粒具有如图1A和1B所示的核，在该核上以三维方式生长出棒状突起。显色为鲜明的蓝色的胶体金纳米颗粒具有类似于用于防波堤的四脚防波石的形状或结构。因此，采用了该术语，将具有生长为接枝的一个分支的胶体金纳米颗粒称为“单脚”，胶体金纳米颗粒可以随着分支数目的增加而具有各种形状，如“双脚”、“三脚”、“四脚”和“五脚”。在本发明中，每个核的突起数目优选为相对较大，从而将这种形状统称为“多脚”。
与传统的呈现为红色的圆球状胶体金颗粒相比，根据本发明的多脚状胶体金颗粒或金平糖状胶体金颗粒所呈现出的颜色取决于它们的展开方式。这使得胶体金纳米颗粒溶液呈现出包括蓝色在内的多种颜色。
具体而言，作为典型的具有三维突起的接枝状、多脚状或金平糖状的本发明蓝色金纳米颗粒，示出了具有图1A或图1B所示形状的金纳米颗粒作为一个例子。这些金纳米颗粒在其中心部分具有所谓的核，并且在核上生长出突起或分枝作为接枝。由于接枝的生长起始点与所述核紧密接触，因此它们看起来像突起和核一体化的多脚状金纳米颗粒或金平糖状金纳米颗粒。
图1A和图1B中的金纳米颗粒的例子具体示出了尺寸为大约50nm的蓝色金纳米颗粒的例子。更具体而言，图1A和图1B所示的金纳米颗粒具有66.5nm的平均粒径（DLS）和大约610nm的最大吸收波长。此外，根据通过TEM观察的测量，金纳米颗粒的平均外径为62.2nm、平均核直径为35.7nm、平均突起长度为13.2nm、并且突起角为大约50度。金纳米颗粒的AR（纵横比）为1以上。不言而喻的是，可通过考虑不同颜色的生成物而任意改变本发明的金纳米颗粒的平均外径、平均核直径、平均突起长度和突起角。
在包括实施例在内的本发明中，波长是由以下方式进行测量的。使用紫外可见吸收光谱仪（光谱仪名：“UV-2550”，ShimadzuCorporation的产品）来测量波长。测量在以下条件下进行：石英槽：10mm；波长：800-200nm；带宽：0.5nm。
蓝色金纳米颗粒和蓝色胶体金纳米颗粒有效用于多项诊断剂的开发。当存在多条判定线时，所述蓝色金纳米颗粒和蓝色胶体金纳米颗粒能够消除目视判定时误诊的可能性。被用作这种多项诊断剂中的免疫学测定标记物质的金纳米颗粒是具有如下特征的免疫学测定标记物质：其由至少两种形状不同的金纳米颗粒构成。更具体而言，由球状红色金纳米颗粒和具有三维突起的接枝状、多脚状或金平糖状蓝色金纳米颗粒中的至少两种构成的免疫学测定标记物质是适宜的。
被用作多项诊断剂中的免疫学测定标记物质的本发明金纳米颗粒包括（例如）两种或三种形状不同的金纳米颗粒的混合物（下文中将其称为“混合物型金纳米颗粒标记物质”），例如球状金纳米颗粒和具有三维突起的金纳米颗粒的混合物。在这种情况下，当根据形状来分析粒径分布时，所述混合物型可以形成具有两个顶点的分布曲线，即由球状金纳米颗粒形成的粒径分布曲线和由具有三维突起的金纳米颗粒形成的粒径分布。不言而喻的是，对于由具有三种形状彼此不同的金纳米颗粒形成的混合物，可以绘制出具有三个顶点的粒径分布曲线。在本发明中，若不考虑形状差异而对至少两种金属纳米颗粒的粒径分布进行分析，则由于平均粒径相对较小的金纳米颗粒和平均粒径相对较大的金纳米颗粒以混合物的形式存在，因此不可避免地使平均粒径落入20nm至100nm的相对宽的范围内。总之，当各粒径分布曲线形成尖锐的峰时，表示预定的金纳米颗粒的量更大，因此能够提高测量准确性。下面将对此混合物型金纳米颗粒标记物质的具体例子进行说明。
具体描述本发明的“混合物型金纳米颗粒标记物质”的状态。当发明的混合物型金纳米颗粒标记物质被识别为两种时，例如，一种是球状金纳米颗粒，另一种是具有三维突起的金纳米颗粒，考虑到标记的检测灵敏度，认定混合物以10:90-90:10的质量%含有这两种颗粒。这表示，当球状金纳米颗粒的量为40质量%时，具有三维突起的金纳米颗粒的量为60质量%。不言而喻的是，计算是通过除去未反应的物质、没有生长而残留下来的纳米颗粒和杂质等预计物质之外的其他物质而进行的。
例如，构成该混合物型金纳米颗粒标记物质的球状金纳米颗粒为相对较大的颗粒，其平均粒径为20nm至220nm，优选为30nm至200nm，更加优选为大约40nm至150nm。至于具有三维突起的金纳米颗粒，那些平均粒径为大约20nm至200nm的金纳米颗粒可以存在于混合物中。为了提高色彩的鲜明性、长时间的色彩稳定性、胶体的稳定性、标记准确性和可靠性，所述平均粒径优选为40nm至180nm，通常最优选为50nm至120nm，并且最适宜的范围为60nm至100nm。
混合物型金纳米颗粒标记物质能够通过（例如）将球状金纳米颗粒标记物质和具有三维突起的金纳米颗粒以预定的比率混合的简单方法获得，其中所述球状金纳米颗粒标记物质是预先制备的，并且具有预定的平均粒径。
作为本发明的混合物型金纳米颗粒标记物质并且由至少两种形状不同的金纳米颗粒构成的免疫法检测标记物质含有至少两种金纳米颗粒，这两种金纳米颗粒被用作构成标记试剂的标记物质，所述标记试剂对能够结合免疫学测定系统中的目标物质的测定物质进行修饰，并通过与该目标物质结合而进行标记，其中
1）所述两种金纳米颗粒的平均粒径均为20nm至220nm，并且
2）所述两种金纳米颗粒中的一种为球状，另一种具有至少四个三维突起。
当使用这种混合物型金纳米颗粒标记物质时，能够通过红色和蓝色等颜色的差异而清楚地区分各种抗原。因此，能够减轻医疗现场的检查负担并简化检查操作。因此能够明显提高其实用性。
本发明的胶体金颗粒在视觉观察时呈现为蓝色。这表示，通过将胶体金颗粒分散于水等溶剂中而获得的胶体金溶液在视觉观察时呈现为蓝色或类似于蓝色的颜色，如蓝绿色或蓝紫色。更具体而言，这表示，所述溶液的色相通过孟塞尔颜色系统定义为3P至1P、10PB至1PB、10B至1B、10BG至1BG或10G至8G。其中，考虑到与红色的区分性，优选10PB至1PB、10B至1B或10BG至1BG的色相。关于比色法，用胶体溶液填充用于分光光度测量的石英槽（光路长度：大约10mm），在白色背景（白色图画纸）上目视确定其色调，然后基于市售的孟塞尔颜色图册对所述色相进行评价。
制造根据本发明的金纳米颗粒的方法包括：核形状阶段，其中，用第一还原剂将水溶液中的第一金盐还原为金平糖状核金纳米颗粒；以及生长阶段，其中，同时滴加第二金盐和第二还原剂，以使所述核金纳米颗粒生长为具有更大尺寸的金平糖状金纳米颗粒。所述生长阶段可以进行至少一次。
为了在生长阶段形成具有更长突起的金平糖状金纳米颗粒，使用了第二还原剂和第一还原剂的混合物，即，使用了为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸。
根据生长阶段中使用的第二还原剂的浓度，与第二还原剂组合使用的第一还原剂的量几乎等于第二还原剂的量。即在生长阶段使核金纳米颗粒生长的水溶液中，将所使用的第一还原剂的浓度调节为0.01mM-100mM。
为了分析蓝色金纳米颗粒的化学种类的行为，作为一个实施方案，将相当于生长反应前的核颗粒的颗粒称为“颗粒1”，并通过混合0.43mM的AuCl4和39.0mM的HEPES来制备“颗粒1”的溶液。将相当于生长反应后的已生长颗粒的颗粒称为“颗粒2”，并通过混合0.05mM的AuCl4、0.82mM的HEPES和0.10mM的抗坏血酸来制备“颗粒2”的溶液。对所得溶液的行为进行分析。
基于图2A和2B对不改变峰值波长而增加本发明的粒径的例子进行说明。在图2A的“颗粒1”的吸收光谱中，本发明的发明人在本发明中实现了在不改变紫外可见吸收光谱的峰值波长的情况下使粒径生长为图2B中的“颗粒2”。在图2A和2B中，峰值波长表示约570nm至630nm的范围。
用于本发明的核形成阶段的第一金盐的例子包括：氯金酸、三溴化金、三氟化金、三碘化金、三氰化金、氯化亚金、碘化亚金、氟化亚金、氰化亚金、羟基氧化金（hydroxy gold oxide）、三硝酸金（goldtrisnitrate）和硝酸金（gold nitrate）等盐及其水合物；以及金的王水溶液。金盐并不局限于上述物质，而是可使用能够在水溶液中形成第一金盐的任何物质。
作为被用于本发明的核形成阶段的第一还原剂，可以使用为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸。其例子包括（但不局限于）2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（下面将简称为“HEPES”）、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸（下面将简称为“HEPPS”）、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷-3-磺酸)（下面将简称为“HEPPSO”）、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)（下面将简称为“PIPES”）、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸（下面将简称为“EPPS”）和哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)（下面将简称为“POPSO”）。作为还原剂，更加优选的是HEPES、HEPPSO和PIPES。更优选HEPES作为还原剂。可视需要使用这些还原剂的组合。
作为在本发明的生长阶段中使用的第二金盐，可使用描述为核形成阶段中所使用的第一金盐的例子。第二金盐和第一金盐可以相同或不同。可优选将氯金酸用作第一金盐和第二金盐。
作为在本发明的生长阶段中使用的第二还原剂，可以使用具有还原性的有机酸，如抗坏血酸及其衍生物、柠檬酸及其衍生物、α-羟基羧酸（如D(L)-苹果酸、D(L)-酒石酸、丙醇二酸和黏酸）、乳酸、单宁酸和还原糖。其中，优选抗坏血酸及其衍生物和柠檬酸及其衍生物，其中最优选抗坏血酸及其衍生物。也可以使用它们的混合物。
作为抗坏血酸及其衍生物，可以使用那些具有还原性的抗坏血酸及其衍生物，如抗坏血酸（其盐）、其异构体或类似物、及其衍生物。例子包括L（或D）-抗坏血酸、异抗坏血酸、赤藓酸（erythorbic acid）、氨基去氧抗坏血酸（scorbamic acid）、脱氢异抗坏血酸、脱氧抗坏血酸、氯代脱氧抗坏血酸等卤代脱氧抗坏血酸、抗坏血酸乙酯等抗坏血酸烷基酯、抗坏血酸钠等抗坏血酸的碱金属、以及抗坏血酸钙等抗坏血酸的碱土金属盐。其中，特别优选L（或D）-抗坏血酸（其盐）和异抗坏血酸。也可视需要使用它们的混合物。
作为柠檬酸及其衍生物，可以使用具有还原性的柠檬酸及其衍生物，如柠檬酸（其盐）、其异构体或类似物、及其衍生物。其例子包括柠檬酸、异柠檬酸、柠檬酸酐、异柠檬酸酐、柠檬酸钠和柠檬酸钾等碱金属盐、柠檬酸铵等铵盐、柠檬酸钙等碱土金属盐、以及柠檬酸甲酯和柠檬酸乙酯等柠檬酸烷基酯。其中，特别优选柠檬酸和柠檬酸钠。也可视需要使用它们的混合物。
本发明的核形成阶段中的反应温度为0-40℃，优选为10℃-30℃（室温），更加优选为15℃-25℃。反应进行30分钟至5小时。反应温度超过40℃会增加球状颗粒的数目，并降低产率。即使将反应温度降低至小于0℃也不会使产率增加，因而在技术上是没有意义的，并且不经济且浪费。
在核形成阶段形成有核金纳米颗粒的水溶液中，本发明的核形成阶段中所使用的第一还原剂的浓度为1mM至150mM，优选为30mM至100mM。当该浓度大于150mM时，该浓度超过了必要浓度而在技术上变得毫无意义，并且不经济且浪费。当该浓度小于1mM时，还原剂的功能太弱，使得不足以进行核形成反应。
在核形成阶段形成有核金纳米颗粒的水溶液中，本发明的核形成阶段中所使用的第一金盐的浓度为0.1mM至100mM，优选为1mM至50mM，更加优选为5mM至25mM。
此处使用的术语“mM”表示mmol/L。
以这样的方式进行反应，使得在核形成阶段中，在通过使具有上述浓度范围的第一还原剂和具有上述浓度范围的第一金盐反应而获得的胶体金溶液中，金的浓度落入0.1mM至100mM的范围内。
本发明的生长阶段中的反应温度为0至40℃，优选为10℃至30℃（室温），更加优选为15℃至25℃。反应进行1小时至10小时。当反应温度超过40℃时，颗粒倾向于变成球状颗粒，从而导致产率降低。同时，紫外可见吸收光谱的最大吸收波长小于570nm，因此迁移至较短波长侧。反应温度降低至小于0℃没有效果，因此是毫无意义的。
在从降低未反应的氯金酸的量的角度对本发明金纳米颗粒的合理合成方法进行深入研究时，将基于图4A和4B对结果进行说明。通过对未反应的氯金酸和反应温度或反应率之间的关系进行研究，结果发现，通过将反应温度设置为低温，使得纳米颗粒而表现出变得更蓝的行为。图4A和4B揭示了将反应温度设置为10℃至35℃是最合适的。
同样的，当基于图4A和4B进行说明时，图4A示出了在10℃、20℃、30℃和40℃的不同反应温度下对于波长（nm）的研究结果。当反应温度被设置为40℃以上时，能够观察到从蓝色迁移至红色的趋势。当所谓的反应温度增加时，胶体金纳米颗粒趋向于变得更红。另一方面，当所述反应温度降低时，胶体金纳米颗粒趋向于变得更蓝。更具体而言，从图4B中能够发现，通过将反应温度设置为10℃至30℃，最适合的是设置为15℃至25℃，能够容易地获得最大吸收波长为大约600nm的胶体金颗粒。
在生长阶段中生长有核金纳米颗粒的水溶液中，本发明的生长阶段中所使用的抗坏血酸或其衍生物等第二还原剂的浓度为0.01mM至100mM，优选为1mM至50mM，更加优选为5mM至25mM。
图5示出了胶体金颗粒悬浊液的紫外可见吸收光谱的最大吸收波长的变化的测量结果，其中该胶体金颗粒悬浮液是通过改变实施例4中所述的生长阶段中抗坏血酸的使用量而获得的。沿着图5的横坐标绘制生长阶段中添加的抗坏血酸水溶液的重量浓度。考虑到生长阶段中抗坏血酸或其衍生物的最适宜的量，如图5所揭示的，为了显色为胶体金的蓝色，添加的抗坏血酸水溶液能够以0.02至0.07（质量%）的相对较宽的浓度范围使用。然而，从与蓝色波长的关系的角度考虑，在生长阶段中生长有核金纳米颗粒的整个水溶液中，抗坏血酸的浓度的最适条件为0.075mM至0.15mM。根据本发明的发明人的发现，此范围在技术上是临界性的。
在生长阶段中生长有核金纳米颗粒的水溶液中，本发明的生长阶段中使用的第二金盐的浓度为0.1mM至100mM，优选为0.2mM至20mM。
在本发明的生长阶段中使用的第二还原剂的添加量可为所添加的核金纳米颗粒的摩尔浓度的5倍至500倍，更加优选为25倍至250倍。在本发明的生长阶段中使用的第二金盐的添加量可为所添加的核金纳米颗粒的摩尔浓度的0.1倍至10倍，更加优选为0.5倍至5倍。
将第二金盐和第二还原剂同时滴加到在核生长阶段中合成的胶体金溶液中，其滴加速率为0.1ml/分钟至3.0ml/分钟，优选为0.3ml/分钟至1.5ml/分钟，特别优选为0.5ml/分钟至1.0ml/分钟。
根据本发明的免疫学测定法是基于免疫学特异结合反应的测定法，其中所述免疫学特异结合反应来自于生物分子所具有的亲和性。例如，已知有免疫染色、凝集反应、ELISA和免疫层析法。作为来自于亲和性的这种结合，抗原-抗体结合具代表性并被广泛用于免疫学测定法中。不仅是这种结合，还可使用糖-凝集素结合、激素-受体结合、酶-抑制剂结合、核酸-互补核酸结合、或者核酸和具有能够与其结合的蛋白质的结合。作为免疫反应或免疫学反应，可用的有（例如）夹心法或竞争法，在夹心法中，形成了例如“固相抗体-抗原-标记抗体（标记抗原）”的夹心式复合物以捕捉并检测抗原，竞争法的原理是利用检体中的固相抗体和游离抗原与添加到反应体系中的预定量的标记抗体（标记抗原）的竞争反应。其中，利用抗原和抗体之间的夹心反应的最便利的方法是使用层析法的免疫层析法。由于免疫层析法操作简单、仅需要很短的测定时间、并且有助于目视判定，因而是人们所通常采用的方法。
基于图6，对本发明的蓝色金纳米颗粒在用于各种免疫层析试剂时的检测灵敏度的优异性进行了说明。图6示出了在与实施例8所述的B型流感病毒的免疫层析检测类似的检查中，通过使用免疫层析分析仪（immunochromatographic reader）而得到的颜色强度的测定结果。“颗粒1”是将仅通过实施例1的核形成阶段而形成的蓝色胶体金颗粒悬浮液用作标记物质的体系，“颗粒2”是将通过实施例1的核形成阶段和生长阶段而形成的蓝色胶体金颗粒悬浮液用作标记物质的体系。作为抗原，在“颗粒1”的情况中，将含有60μg/ml抗原的水溶液稀释至1400倍后使用，在“颗粒2”的情况中，将含有60μg/ml抗原的水溶液稀释至2400倍后使用。在将“颗粒1”（抗原稀释倍率：1400倍）和“颗粒2”（抗原稀释倍率：2400倍）进行比较时，结果表明“颗粒2”中的色彩鲜明，推测这是由于“颗粒2”的表面积更大。由于存在众多原因，因此不可能判定其准确原因。然而，本发明的蓝色金纳米颗粒的检测灵敏度优异，并且通过使用免疫层析试剂而具有明显提高目视判定的准确性的效果。
在本发明的免疫学测定法中，含有检测对象的样品（检体）（例如）主要为生物体样品，如血液、血清、血浆、尿、唾液、髓液、汗、眼泪、羊水、乳头分泌液、鼻涕、痰、鼻腔或咽拭子液、皮肤分泌物、以及组织、细胞或粪便的提取物。
本发明的检测对象没有特别的限制，只要存在与其特异性结合的物质（例如，如抗原和抗体之间的反应或核酸和与其互补的核酸之间的反应中的那样的特异性结合的物质）或能够制备出这样的物质即可。所述检测对象可以是本身具有抗原性的完全抗原，或者是本身没有抗原性、但可以通过化学修饰得到抗原性的半抗原（不完全抗原）。只要存在或可以制备与这些检测对象特异性结合的物质即可。该物质可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明中的检测对象的例子包括：肽类激素（生长激素（GH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、黑素细胞刺激激素（MSH）、催乳激素、促甲状腺激素（TSH）、黄体化激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、垂体激素、钙代谢调节激素、肾脏激素、胃肠激素、血管活性激素和人绒毛膜促性腺激素（hCG）等胎盘激素）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺特异抗原（PSA）、碱性磷酸酶、转氨酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）等肿瘤特异物质、免疫球蛋白G（IgG）等血清蛋白组分、类风湿因子、血清素、尿激酶、铁蛋白、P物质、雌激素（如雌激素酮）、便潜血、梅毒抗体、流感病毒、腺病毒、RS病毒、轮状病毒、HBs抗原、HBs抗体、衣原体抗原、化脓性链球菌（Streptococcus pyogens）抗原等细菌抗原、天然或合成的孕激素、睾酮等雄性激素、皮质醇等肾上腺皮质激素、其它类固醇（如胆固醇、胆汁酸、强心性类固醇和皂苷元等）、肾上腺素、多巴胺、生理活性生物碱、含氨基的精神药物、TRH等小分子肽、二碘甲状腺氨酸等甲状腺激素、前列腺素、维生素类、青霉素等抗生素、DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸、它们的扩增产物、其它体内组分、以及体内投药及其代谢产物、食物（如猪肉、牛肉、鸡肉和蛋等）以及食物（包括猪肉、牛肉、鸡肉和蛋等）提取物。在这些检测对象中，优选病毒，更加优选流感病毒、腺病毒和RS病毒。
在本发明中，最合适的检体是鼻涕、鼻腔或咽拭子液、或者痰。通过预先使用展开液稀释这种检体，能够确切地检测出作为检测对象的采集自呼吸疾病患者的抗原（病毒：主要是流感病毒、腺病毒、RS病毒）。
在本发明中使用的免疫层析用展开液通常是通过将水用作溶剂并向其中添加缓冲剂、盐、阻断剂和非离子型表面活性剂而制备的。添加顺序没有特别的限制，并且可以同时添加。在使用展开液时，可以将待检测样品（目标样品）和展开液的混合物供给/滴加到样品垫（样品添加部分）上来进行展开。根据样品的不同，也可先将待检测样品供给/滴加到样品垫（样品添加部分）上，然后将展开液供给/滴加于样品垫（样品添加部分）上以展开样品。
用于本发明的免疫层析展开液的缓冲剂没有特别的限制，只要其作用（缓冲作用）不由于样品添加所致的浓度变化、样品的蒸发或稀释、或者一些来自于外部的异物的混入而受到严重影响即可。
本发明中的缓冲剂的例子包括Good缓冲液，如乙酸缓冲液（乙酸+乙酸钠）、磷酸缓冲液（磷酸+磷酸钠）、柠檬酸缓冲液（柠檬酸+柠檬酸钠）、硼酸缓冲液、tris-HCl缓冲液（三羟甲基氨基甲烷+盐酸）、TE缓冲液（tris+乙二胺四乙酸）、TAE缓冲液（tris+乙酸+乙二胺四乙酸）、TBE缓冲液（tris+硼酸+乙二胺四乙酸）和HEPES缓冲液（2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸）。其中，优选乙酸缓冲液、磷酸缓冲液和tris-HCl缓冲液，更加优选tris-HCl缓冲液。
用于本发明的免疫层析用展开液的盐没有特别的限制，只要是通过酸和碱的反应而获得的盐即可。其例子包括氯化钠和氯化钾。其中优选氯化钠。
用于本发明的免疫层析用展开液的非离子型表面活性剂的例子包括：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯（“Tween”系列，商品名，Sigma Aldrich的产品）、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚（“Triton”系列，商品名，Sigma Aldrich的产品）、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚（“Triton N”系列，商品名，SigmaAldrich的产品）、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺和烷基单甘油基醚等。这些非离子型表面活性剂可以单独使用，或者以它们的两种以上的混合物的形式使用。
在本发明的免疫层析用展开液中，加入一种以上抑制由生物亲和性引起的副反应或抑制非特异性反应的公知添加剂是可能并有效的，所述公知添加剂为（例如）作为抗原抗体反应的促进剂或抑制非特异性反应的阻断剂的蛋白质（如牛血清蛋白、明胶和酪蛋白等）、高分子化合物（如聚乙二醇、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖等）、以及离子型表面活性剂或聚阴离子（如硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、硫酸软骨素等）、或者抗生素。它们的加入不会影响本发明的效果。将用于促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质、高分子化合物、离子型表面活性剂或聚阴离子、或者抗生素中的一种以上保持在构成固定相的层析介质上的移动相的迁移路径上也是可能并有效的。它们的保持不影响本发明的效果。
在用于检测检体中的检测目标的免疫层析装置中，其结构和操作/检测方法是已知的。免疫层析装置通常具有（1）样品添加部、（2）标记物质保持部、（3）层析介质、（4）检测部（也被称为“判定部”）、（5）吸收部和（6）底板。
使用展开液，将预先稀释检体而获得的检体样品滴加到常规的免疫层析装置的样品垫上，使其在免疫层析介质中沿着吸收部的方向展开，从而发生抗原抗体反应。基于此反应，能够对检体中的检测目标进行识别或判定等检查。
下面将对免疫层析装置进行说明。
样品添加部（1）由玻璃滤纸等多孔片制成，所述玻璃滤纸等多孔片允许样品的迅速吸收，但保持力弱，使得样品迅速向反应部位移动。
标记物质保持部（2）保持有利用标记组分对试剂组分进行标记而获得的标记试剂。标记组分的例子包括：胶体金属颗粒、乳胶颗粒、酶和荧光化合物。其中，胶体金属颗粒是最适合的。本发明的蓝色金纳米颗粒的胶体颗粒杯用作标记组分。试剂组分是具有识别分析物的能力的颗粒或分子，优选单克隆抗体或多克隆抗体，或者它们的片段（第二试剂）。
层析介质（3）在膜载体上具有检测部（4）。膜载体没有特别的限制，只要是可以通过毛细作用吸收样品检体并使其移动即可。例如，膜载体可选自由硝化纤维素、乙酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯基醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素、以及由它们的混合纤维制成的人造聚合物构成的组。
在检测部（4）中，单克隆抗体或多克隆抗体、或者其片段（第一试剂）担载并固定于硝化纤维素片上。
吸收部（5）由具有迅速吸收过剩样品的能力的材料（例如玻璃滤纸等）制成。
底板（6）是基材。通过在底板的一个面上分别涂布粘合剂或者粘贴胶带，使底板在该面上具有粘合性，样品添加部（1）、标记物质保持部（2）、层析介质（3）、检测部（4）和吸收部（5）的一部分或全部被牢固地结合在底板的粘合面上。底板（6）作为基材没有特别的限制，只要是通过粘合剂使其对样品液具有不透过性或非透湿性即可。
用于检测部（4）的试剂组分（第一试剂）和用于标记试剂的试剂组分（第二试剂）中的一者或两者可以是单克隆抗体或多克隆抗体。从测定灵敏度等的角度考虑，用于标记试剂的试剂组分（第二试剂）优选为特异性高的单克隆抗体。用于检测部（4）的试剂组分（第一试剂）即可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
单克隆抗体和多克隆抗体及它们的片段是公知且可以得到的。并可通过公知的方法进行制备。产生抗体的动物的例子包括人、小鼠、大鼠、兔和羊等。作为免疫球蛋白，可以使用IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意一者。
单克隆抗体可以通过常规方法获得。将经抗原（例如A型流感病毒）免疫的小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞杂交。选择产生目标抗体的杂交瘤细胞，获得由其产生的单克隆抗体。例如可参照
Figure BDA00003146048600241
和Milstein发表的方法（Nature,256(1975),495-497）。
多克隆抗体可通过常规方法，利用抗原（例如A型流感病毒）对可产生抗体的动物（例如人、小鼠、大鼠、兔、羊或马等）进行免疫得到抗血清，在所得的抗血清中分离获得目标抗体而获得。
尽管如本发明的实施例所述：作为用于标记试剂的试剂组分（第二试剂），使用了来自于小鼠的抗A型流感单克隆抗体，并且作为用于检测部（4）的试剂组分（第一试剂），使用了来自于小鼠的抗A型流感单克隆抗体，但试剂组分并不限于此。也可以使用来自于小鼠的抗A型流感多克隆抗体。
下面是判定原理的概要。
1.将规定量（通常0.1至2ml）的检体样品（用展开液稀释的检体）滴加在样品垫（1）上。滴加检体样品时，虽然检体样品在样品垫（1）中被迅速吸收，但所得样品垫立即与样品一同开始移动。当利用免疫层析用试剂组合物含浸样品垫（1）时，免疫层析用试剂组合物溶解在检体样品的水分中，并与检体样品一同开始移动。
2.检体样品首先向标记物质保持部（2）移动。当检体样品通过该部位时，标记物质保持部（2）上所保持的标记试剂（第二试剂）溶解在样品的水分中，并与样品一同移动。
3.接着，溶解于检体样品水分中的标记试剂通过层析介质（3）上的检测部（4）。此处，溶解在检体样品中的免疫层析试剂组合物抑制了非特异性结合反应。当检体样品含有检测对象（例如抗原）时，由于抗原抗体特异性结合反应，它以夹在抗体和标记试剂之间的方式与该抗体发生特异性反应并结合，由此使检测部（4）着色，所述抗体担载并固定于检测部（4）上。当检体样品不含有检测对象（例如抗原）时，标记试剂溶解于样品的水分中，即使样品通过层析介质（3）上的检测部（4），也不会发生特异性结合反应。因此，检测部（4）没有被着色。
4.最后，样品的水分移动至吸收部（5）。
由此可以对检体样品中的检测对象（例如抗原）的存在与否做出正确的判定。
下面将通过实施例和对比例对本发明进行详细的说明。然而，本发明并不局限于或受限于这些实施例。
（i）平均粒径的测量
尽管通常能够通过重力光散射法来确定平均粒径（使溶胶状的胶体颗粒在超速离心机中以14000至5530000×g的速度旋转并对其进行处理，由该胶体颗粒的沉淀速率来确定平均粒径），然而在本发明中使用动态光散射（DLS）分析仪来计算平均粒径。也可以对从通过透射式电子显微镜（TEM，“JEM-2010”，JEOL,Ltd.的产品）拍摄的投影照片中随机选择的100个颗粒的投影面积直径进行测量，并且计算基于平均值的平均粒径（平均颗粒直径）。同样的，由随机选自TEM投影照片的100个颗粒的投影面积直径的平均值计算平均核尺寸，用平均粒径和平均核尺寸的差除以2来计算平均突起长度（接枝的平均长度）。
[实施例1]
在此实施例中，在核形成阶段中，通过用作为第一还原剂的HEPES还原作为第一金盐的氯金酸，从而形成金平糖状胶体核。然后，在成长阶段，同时滴加作为第二金盐的氯金酸和作为第二还原剂的L-抗坏血酸，以形成具有更大粒径的金平糖状胶体金。
[核形成阶段]
将10ml HEPES（4×10-2mol/L，pH7.8）注入10ml的带盖玻璃容器中，将其保持在温控浴中直至液体温度变为25℃。另外，将0.7g（1.6×10-2mol）的四水合氯金酸溶于100ml的超纯水中。将所得溶液保持在冰上直至液体温度变为4℃。当HEPES的水溶液和氯金酸的水溶液的液体温度均稳定时，将0.3ml的氯金酸的水溶液滴加到HEPES的水溶液中。将反应混合物在25℃的恒温槽中静置1小时。由此制得这样的胶体金纳米颗粒，该胶体金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径为大约43nm，并且几乎为金平糖状、接枝状或多脚状（具有1-9个突起）。胶体溶液每单位体积（0.1ml）的产率为大约91%。推断残余物包括圆球状颗粒或未反应的颗粒等。
[生长阶段]
将通过上述方法制得并且金浓度为4.0×10-4mol/L的胶体核（5ml）置于500ml的三颈烧瓶中，在恒温槽中搅拌直至液体温度变为20℃。在液体温度变得稳定后，以1.0ml/分钟的速率同时滴加氯金酸的水溶液和116ml L-抗坏血酸的水溶液，其中该氯金酸的水溶液是通过将1.5×10-2g（4.0×10-5mol）的四水合氯金酸溶于116ml的超纯水中而获得的，该L-抗坏血酸的水溶液是通过将4.2×10-2g（2.4×10-4mol）的L-抗坏血酸溶于116ml的超纯水中而获得的。通过搅拌使它们反应2小时，以进行生长阶段。完成滴加后，将三颈烧瓶从恒温槽中取出并将其在冷藏库中静置过夜。这样获得的金纳米颗粒的平均粒径（DLS）为大约66.5nm。TEM观察表明，该金纳米颗粒的平均核尺寸为月25.7nm；平均突起长度为13.2nm；平均具有4个以上的突起；突起角为大约50度；并且AR为1以上。这样获得的胶体金溶液为蓝色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为5B），并且其最大吸收波长为610nm。
[实施例2]
实施该实施例以合成具有更长突起的金平糖状胶体金。
将在实施例1的核形成阶段中形成的且金浓度为4.0×10-4mol/L的胶体核（5ml）置于500ml的三颈烧瓶中，在恒温槽中搅拌直至液体温度变为20℃。在液体温度稳定后，以1.0ml/分钟的速率同时滴加氯金酸的水溶液以及116ml的L-抗坏血酸和HEPES的水溶液，其中该氯金酸的水溶液是通过将1.5×10-2g（4.0×10-5mol）的四水合氯金酸溶于116ml的超纯水中而获得的，该116ml的L-抗坏血酸和HEPES的水溶液是通过将4.2×10-2g（2.4×10-4mol）的L-抗坏血酸和0.11g（4.0×10-3mol）的HEPES溶于116ml的超纯水中而获得的。通过搅拌使其反应2小时。由此进行生长阶段。完成滴加后，将三颈烧瓶从恒温槽中取出并将其在冷藏库中静置过夜。
这样获得的金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径（DLS）为大约98nm。由TEM观察结果推断，形成了更大量的具有更长突起的金平糖状胶体金。这些形成的金平糖状胶体金的平均核尺寸为大约65.7nm，如此生长的突起（接枝）的平均长度为大约16.7nm，具有4个以上的突起，突起角为大约50度，并且AR为1以上。这样获得的胶体金溶液为蓝绿色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为8BG），并且其最大吸收波长为641nm。
[实施例3]
按照与实施例1相同的方式合成胶体金，不同之处在于，将生长阶段的液体温度改为10℃。由此获得的胶体金溶液的最大吸收波长示于表1中。
将在实施例1的核形成阶段中形成的5ml胶体核（4.3×10-4mol/L）置于500ml的三颈烧瓶中，然后在恒温槽中搅拌直至达到生长温度，即液体温度变为10℃。以1.0ml/分钟的速率同时滴加氯金酸的水溶液和116ml L-抗坏血酸的水溶液，其中该氯金酸的水溶液是通过将1.7×10-2g（4.2×10-5mol）的四水合氯金酸溶于116ml的超纯水中而获得的，该116ml L-抗坏血酸的水溶液是通过将4.2×10-2g（2.4×10-4mol）的L-抗坏血酸溶于116ml的超纯水中而获得的。通过搅拌使其反应2小时。由此进行生长阶段。完成滴加后，将三颈烧瓶从恒温槽中取出并将其在冷藏库中静置过夜。
这样获得的金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径（DLS）为大约67nm。TEM观察显示由此获得的金纳米颗粒的平均核尺寸为大约51.0nm，生长的突起（接枝）的平均长度为大约8.0nm，具有4个以上的突起，突起角为大约50度，并且AR为1以上。这样获得的胶体金溶液为蓝色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为5PB），并且其最大吸收波长为587nm。
[实施例4]
按照与实施例1相同的方式合成几乎为金平糖状、接枝状或多脚状（具有2-4个突起）胶体金纳米颗粒，不同之处在于，将生长阶段的液体温度改为30℃。
这样获得的金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径（DLS）为大约60.5nm。TEM观察显示由此获得的金纳米颗粒的生长的突起（接枝）的平均长度为大约7.5nm，平均具有4个以上的突起，突起角为大约50度，并且AR为1以上。这样获得的胶体金溶液的最大吸收波长为586.5nm。
结果示于表1中。
[对比例1]
按照与实施例1相同的方式合成胶体金，不同之处在于，将生长阶段的液体温度改为40℃。由此获得的胶体金溶液的最大吸收波长示于表1中。
通过将生长阶段的温度变改为40℃而获得的金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径（DLS）为大约53nm。TEM观察显示由此获得的金纳米颗粒的平均核尺寸为大约45nm，生长的突起（接枝）的平均长度为大约4nm，平均具有4个以上的突起，并且突起角为大约10度。这样获得的胶体金颗粒为具有微圆的三维突起的多角形（具有2-4个突起）。推断残留部分包括圆球状颗粒和未反应的颗粒。这样获得的胶体金溶液呈红色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为10RP），并且其最大吸收波长为530nm。
[对比例2]
按照与实施例1相同的方式合成胶体金，不同之处在于，将生长阶段的抗坏血酸的量改为2.1×10-2g（1.2×10-4mol）。由此获得的胶体金溶液的最大吸收波长示于表1中。
将在实施例1的核形成阶段中形成的5ml胶体核（4.3×10-4mol/L）置于500ml的三颈烧瓶中，然后在恒温槽中搅拌直至达到生长温度，即液体温度变为30℃。当液体温度稳定时,以1.0ml/分钟的速率同时滴加氯金酸的水溶液和116ml L-抗坏血酸的水溶液，其中该氯金酸的水溶液是通过将1.7×10-2g（4.2×10-5mol）的四水合氯金酸溶于116ml的超纯水中而获得的，该116ml L-抗坏血酸的水溶液是通过将2.1×10-2g（1.2×10-4mol）的L-抗坏血酸溶于116ml的超纯水中而获得的。通过搅拌使其反应2小时。由此进行生长阶段。完成滴加后，将三颈烧瓶从恒温槽中取出并将其在冷藏库中静置过夜。
这样获得的金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径为大约48nm。
这样获得的胶体金溶液的最大吸收波长为536.3nm，并且呈红色。
[对比例3]
按照与实施例1类似的方式合成胶体金，不同之处在于，将生长阶段的抗坏血酸的量改为8.4×10-2g（4.8×10-4mol）。由此获得的胶体金溶液的最大吸收波长示于表1中。
通过将生长阶段的温度改为30℃而获得的金纳米颗粒的平均核直径为60.2nm，平均粒径为70.2nm。这样获得的胶体金溶液的最大吸收波长为550.0nm，并且呈橙色。
[实施例5]
按照与实施例2类似的获得胶体金颗粒，不同之处在于，使用HEPPSO来替代HEPES，获得了平均粒径为约72nm的胶体金颗粒。由此获得的胶体金溶液呈现为蓝色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为1B），并且其最大吸收波长为632nm。
[实施例6]
按照与实施例2类似的方式制备胶体金颗粒，不同之处在于，使用PIPES来替代HEPES，制得平均粒径为约81nm的胶体金颗粒。由此获得的胶体金溶液呈现为蓝色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为3B），并且其最大吸收波长为626nm。
[实施例7]
按照与实施例2类似的方式合成胶体金溶液，不同之处在于，将生长阶段中使用的抗坏血酸替换为4.7×10-2g（2.4×10-4mol）的L-抗坏血酸钠，并且HEPES的用量为0.22g（8.0×10-3mol）。
这样获得的胶体金纳米颗粒包括突起在内的平均粒径（DLS）为大约82nm，平均核尺寸为约48nm，由此生长的突起（接枝）的平均长度为大约20nm，平均具有4个以上的突起，突起角为大约50度，并且AR为1以上。这样获得的胶体金溶液为深蓝色（基于孟塞尔颜色系统的目测：色相大约为5PB），并且具有752nm的略大的最大吸收波长。
实施例1-7和比较例1-3的测量结果全都示于表1中。
[表1]
以上表格中的LAANa表示L-抗坏血酸。
按照与实施例1类似的方式合成胶体金溶液，不同之处在于，在生长阶段中使用柠檬酸来取代抗坏血酸。
这样获得的胶体金颗粒的包括突起在内的平均粒径（DLS）和平均核尺寸与各个实施例中获得的胶体金颗粒的平均粒径（DLS）和平均核尺寸处于同样的水平。这样获得的胶体金颗粒的生长的突起（接枝）的平均长度、平均数目和角度与各个实施例中获得的胶体金颗粒处于同样的水平。这样获得的胶体金颗粒的Ar为1以上。因此，这样获得的胶体金溶液与各个实施例中获得的胶体金溶液处于同样的水平。这表明能够将抗坏血酸或其衍生物、或者柠檬酸或其衍生物等具有还原性的有机酸之外的其他有机酸用作本发明的生长阶段中所使用的第二还原剂。例如，据推断，尽管使用D(L)-苹果酸、D(L)-酒石酸、乳酸、单宁酸或还原糖而获得的胶体金溶液与根据本发明而获得的胶体金溶液由少许不同，然而其性质仍位于满足本发明的目的的预定范围之内。通过使用上述各酸的无机盐或有机盐，根据上实施例7等所述的方法，能够获得预定的胶体金溶液。
尽管下面将通过实验例对本发明的有效性进行说明，然而本发明并不局限于或被限制于此。
<通过免疫层析进行病毒检测的实验例>
[实施例8]
1.层析介质上的反应部的制备
使用抗体涂布机（BioDot的产品），将被含有5重量%异丙醇的磷酸缓冲液（pH7.4）稀释为1.0mg/ml的浓度的抗A型流感单克隆抗体涂布于硝化纤维膜（“HF120”，Millipore的产品）的展开方向上游侧（表2：1号线），将抗B型流感单克隆抗体涂布于抗A型流感单克隆抗体的下游侧（表2：2号线），然后在50℃下干燥30分钟。干燥后，在室温下干燥过夜，在免疫层析介质上制得反应部。
2.标记物质溶液1的制备
将0.1ml由磷酸缓冲液（pH7.4）稀释为0.1mg/ml的浓度的抗B型流感单克隆抗体添加到在实施例1中获得的0.5ml蓝色胶体金悬浮液中，将所得混合物在室温下静置10分钟。然后，添加0.1ml含10重量%的牛血清蛋白的磷酸缓冲液（pH7.4）。充分搅拌后，以8000×g将反应混合物离心15分钟。除去上清液，然后加入0.1mL含1重量%的牛血清蛋白的磷酸缓冲液（pH7.4），从而获得标记物质溶液1。
3.标记物质溶液2的制备
将0.1ml由磷酸缓冲液（pH7.4）稀释为0.1mg/ml的浓度的抗A型流感单克隆抗体添加到0.5ml胶体金悬浮液“LC40”（田中贵金属的产品，平均粒径为40nm）中，将所得混合物在室温下静置10分钟。然后，添加0.1ml含10重量%的牛血清蛋白的磷酸缓冲液（pH7.4）。充分搅拌后，以8000×g将反应混合物离心15分钟。除去上清液，然后加入含1重量%的牛血清蛋白的磷酸缓冲液（pH7.4），从而获得标记物质溶液2。
4.免疫层析介质的制备
将以上制备的标记物质溶液1和2均匀添加到玻璃纤维制的垫子上，然后在真空干燥机中干燥，从而获得检测试剂保持部件。然后，将由此制备的层析介质、检测试剂保持部件、将用作样品添加部的样品垫、以及用于吸收展开样品和不溶性载体的吸收垫层叠到垫板制的基材上。最后，用切割机将所得层叠体切割为5mm宽的切片。
5.测定
使用上述制备的免疫层析介质，根据以下方法对样品中是否存在A型流感病毒（表2：抗原A）和B型流感病毒（表2：抗原B）进行分析。即将由0.5%的Tween20、0.6%的聚乙烯吡咯酮烷（PVP）K-90（分子量：360000）、以及含有1.0%的牛血清蛋白和150mM的氯化钠的tris缓冲液（pH8.0）组成的展开液用作阴性检体样品。向所得展开液中添加蛋白质浓度为25ng/mL的灭活A型流感病毒和/或B型流感病毒，得到阳性检体样品。将阴性检体样品和阳性检体样品各150mL置于免疫层析介质的样品垫上并展开，15分钟后进行目视判定。在反应部位，从检测线（1号线和2号线）清楚地观察到发光信号（luminescence signal）的检体样品被评为“+”；当观察到发光信号，但其颜色非常淡时，该检体样品被评为“±”；没有观察到发光信号的检体样品被评为“-”。实施例5的结果如表2所示。
[表2]
Figure BDA00003146048600331
通过将本发明的金平糖状胶体金颗粒与球状胶体金颗粒等常规使用的胶体金属颗粒组合使用，以作为免疫学测定、特别是免疫层析测定的标记试剂，从而使得生物体样品中含有的两种不同的检测目标分别被清楚地检出为来自于反应部的检测线（1号线和2号线）的发光信号，这种检测灵敏度高且不会出现错误识别。
工业实用性
本发明的胶体金颗粒呈现为蓝色，因为其不含有保护性胶体形成剂或铵盐，因而不具有毒性，并且其含有利于健康的金。因此，可将这种胶体金颗粒用作颜料、化妆品、免疫学测定用标记试剂、细胞化学标记或蛋白质染色剂。特别是上述胶体金颗粒的特征在于：
（1）在胶体金颗粒的球状核上具有4-20个突起；以及
（2）平均粒径为20nm至200nm，能够通过可视的蓝色来标记和区分检测目标，因此能够被用作具有两条以上颜色线的免疫层析检查中的免疫学测定用标记试剂。
尽管已经详细地或参照某些特定的实施方案对本发明进行了说明，然而对本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以做出各种变更或修改。
本发明基于2010年11月5日提交的日本专利申请（日本专利申请No.2010-248463），其内容以引用的方式并入本文。所有引用的参考文献作为整体并入本文。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.（修改）一种蓝色金纳米颗粒，其平均颗粒核尺寸为20nm至60nm、平均粒径为50nm至120nm、每个核具有四个以上的突起、并且突起长度为5nm至50nm。
2.根据权利要求1所述的蓝色金纳米颗粒，其中，其紫外可见吸收光谱的最大波长在570nm至800nm的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的蓝色金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒为具有三维突起的接枝状颗粒、多脚状颗粒或金平糖状颗粒。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒，其通过使由金纳米颗粒构成的核的外周生长而获得。
5.（修改）一种蓝色金纳米颗粒的胶体溶液，包括：权利要求1中所述的蓝色金纳米颗粒；为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸；以及具有还原性的有机酸，并且其分散为胶体溶液。
6.（修改）一种制造蓝色金纳米颗粒的方法，包括：核形成步骤，其中，通过使为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸与第一金盐的溶液反应以形成核金纳米颗粒；生长步骤，其中，通过向该核金纳米颗粒的溶液中同时添加第二金盐的溶液和具有还原性的有机酸并使其反应，从而使该核金纳米颗粒生长。
7.（修改）根据权利要求6所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述生长步骤是在大于或等于10℃且小于40℃的反应温度下进行的。
8.（修改）根据权利要求6或7所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述生长步骤中的所述有机酸的浓度为0.075mM至0.15mM。
9.（修改）根据权利要求8所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸为选自由2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷-3-磺酸)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸和哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)构成的组的一种以上的有机酸。
10.（修改）根据权利要求6所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述具有还原性的有机酸为选自由酒石酸、酒石酸盐、单宁酸、单宁酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸盐、柠檬酸和柠檬酸盐构成的组中的一种以上的有机酸。
11.（修改）根据权利要求6所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，在所述生长步骤中，所述为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸与所述具有还原性的有机酸组合使用。
12.（修改）一种免疫学测定用标记物质，其包括权利要求1至4中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒。
13.（修改）根据权利要求12所述的用于免疫学测定的标记物质，其包括至少两种形状不同的金纳米颗粒。
14.（修改）根据权利要求13所述的用于免疫学测定的标记物质，其包括至少两种形状不同的金纳米颗粒，即：球状金纳米颗粒以及具有三维突起的接枝状、多脚状或金平糖状金纳米颗粒。
15.（修改）一种免疫学测定法，其将权利要求1至4中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒用作标记物质。
16.（删除）

Claims (16)

1.一种蓝色金纳米颗粒，其包括平均粒径为20nm至200nm的金纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的蓝色金纳米颗粒，其中，其紫外可见吸收光谱的最大波长在570nm至800nm的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的蓝色金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒为具有三维突起的接枝状颗粒、多脚状颗粒或金平糖状颗粒。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒，其通过使由金纳米颗粒构成的核的外周生长而获得。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒，其平均颗粒核尺寸为20nm至60nm、平均粒径为50nm至120nm、每个核具有4个以上的突起、并且突起长度为5nm至50nm。
6.一种蓝色金纳米颗粒的胶体溶液，其包括：权利要求1中所述的蓝色金纳米颗粒；为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸；以及具有还原性的有机酸，并且其分散为胶体溶液。
7.一种制造蓝色金纳米颗粒的方法，包括：核形成步骤，其中，通过使为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸与第一金盐的溶液反应以形成核金纳米颗粒；生长步骤，其中，通过向该核金纳米颗粒的溶液中同时添加第二金盐的溶液和具有还原性的有机酸并使其反应，从而使该核金纳米颗粒生长。
8.根据权利要求7所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述生长步骤是在大于或等于10℃且小于40℃的反应温度下进行的。
9.根据权利要求7或8所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述生长步骤中的所述有机酸的浓度为0.075mM至0.15mM。
10.根据权利要求9所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸为选自由2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷-3-磺酸)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸和哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)构成的组的一种以上的有机酸。
11.根据权利要求7所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，所述具有还原性的有机酸为选自由酒石酸、酒石酸盐、单宁酸、单宁酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸盐、柠檬酸和柠檬酸盐构成的组中的一种以上的有机酸。
12.根据权利要求7所述的制造蓝色金纳米颗粒的方法，其中，在所述生长步骤中，所述为Good’s缓冲液组分的含有哌嗪环的有机酸与所述具有还原性的有机酸组合使用。
13.一种免疫学测定用标记物质，其包括权利要求1至5中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒。
14.根据权利要求13所述的用于免疫学测定的标记物质，其包括至少两种形状不同的金纳米颗粒。
15.根据权利要求14所述的用于免疫学测定的标记物质，其包括至少两种形状不同的金纳米颗粒，即：球状金纳米颗粒以及具有三维突起的接枝状、多脚状或金平糖状金纳米颗粒。
16.一种免疫学测定法，其将权利要求1至5中任意一项所述的蓝色金纳米颗粒用作标记物质。
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