JP2012112042A - 免疫学的測定用青色金ナノ粒子、その製造方法およびそれを用いた測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ピペラジン環を有する有機緩衝剤と第一の金塩の溶液を反応させて核金ナノ粒子を形成させる核形成工程と、次いで該核金ナノ粒子の溶液に第二の金塩の溶液と還元性を有する有機酸を同時的に添加反応させて、核金ナノ粒子を成長させる成長工程を行なうことによって、コロイド溶液として分散された液が目視で青色を呈する金ナノ粒子を容易に製造することができる。
【選択図】なし
Description
不溶性担体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー法検査薬は、操作が簡便であり、検査も短時間で終わることから汎用的に使われているが、一般的にEIAと比較して感度が低く、陽性の場合に観察されるラインが明瞭でない等の問題点があった。
かかる問題点を解決するために、従来から実用化されている金コロイド粒子よりも一層高感度で、免疫学的測定用の標識剤、タンパク質染色剤として好適な種々の金属コロイドの開発が行なわれている。
特許文献4では、第一の金塩溶液に第一の還元剤(クエン酸塩)を添加して、核コロイド粒子(平均粒子径:12〜17nm)を形成する核形成段階、前記核コロイド粒子の溶液に、第二の金塩と第二の還元剤(アスコルビン酸塩)を同時に添加して核コロイドを成長させる成長段階とを含み、前記成長段階は1回以上行なっている。金コロイド粒子の平均粒子径は、1回目の成長段階で17〜55nm未満、2回目の成長段階で55〜110nm未満、3回目の成長段階で110〜220nmとしており、その粒径の標準偏差は10%以内となっている。(特許文献4参照)
その特許文献7および8には、青色を呈する金ナノ粒子は、金ナノシェル、ナノロッド、ナノチューブまたはナノプリズム粒子の構造・形状であること、また、金ナノ粒子は、(1)黄色を呈する銀ナノ粒子液(ポリビニルピロリドンおよびエチレングリコールといった保護剤を含有)に、還元剤を添加した後、約100℃で還流させる段階、(2)前記還流された反応液に金塩溶液を注入反応させる段階、(3)前記反応物を常温まで冷却した後、0.2μmのマイクロフィルターを使用してろ過する段階、によって製造しており、得られた金ナノ粒子は、表層のみが金で構成される形態(金ナノシェル)である。金ナノロッド、金ナノチューブまたは金ナノプリズムは、金ナノ粒子の生成時にヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(臭化物)(C16TAB)のような界面活性剤を用いて得られることの記載がある。粒子の大きさについては、明確な記載が無く、その用途としては化粧料用顔料の記載があるが、免疫学的測定法における標識剤やタンパク質染色剤としての使用については記載が無い。(特許文献7、8参照)
しかしながら、界面活性剤として用いたC16TABが、得られた金ナノロッド中に含有されているので、検出抗体等の蛋白質の直接担持(修飾)には不向きであり界面活性剤の除去・置換などの煩雑な操作が必要なことから、免疫学的測定法における検査薬に用いる蛋白質などの標識物質としては好ましいとは言えない。また、C16TABは毒性を有しており、取り扱いの観点からも好ましいとは言えない。
以上の先行技術に見るとおり、青緑色の金ナノ結晶のコロイドが、特にイムノクロマト診断薬の標識用担体に適さない理由は、そのナノコロイドの粒子サイズが、約30〜50nmと比較的小さく、さらに、いわゆるマルチポット型、枝状型、或いは金平糖状と称されるものは、形状安定剤を使用する場合が多く、この形状安定剤により、タンパク質の金ナノ粒子への直接の修飾が困難となる問題が発生する為である。
参考にした技術文献における青色金ナノ粒子は、イムノクロマト診断薬用の担体に適さない問題点が2つ存在する。
1.免疫学的測定に適した粒子サイズではない。(イムノクロマト試薬に適する粒子サイズは、平均粒子径40〜100nm程度である。参考技術文献によると、粒子サイズは30nm程度である。)
2.形状安定剤を含んでいる点。(他の技術文献における三次元枝状金ナノ粒子は、その形状を制御するために形状安定剤を含んでいる。この形状安定剤により、タンパク質の金ナノ粒子への直接の修飾が困難となる。)
すなわち、本発明の青色金ナノ粒子は、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸(例えば、HEPES等)、Au(金)、および還元性を有する有機酸(例えば、アスコルビン酸、クエン酸等)からなり、平均粒子径が20〜200nm、色彩の鮮明性や持続安定性さらにコロイドの持続安定性から考えると好ましくは40〜180nm、検査の識別顕著性などの実用的な諸事情の見地からは通常最も好ましくは50〜120nm、さらに最も適正な範囲は60〜100nmであって、青色金ナノ粒子がコロイド液として分散された液が目視で青色を呈することを特徴とする。
本発明は、青色金ナノ粒子、青色金ナノ粒子のコロイド液、その製法および免疫学的測定に適した、タンパク質の青色金ナノ粒子への修飾が容易で、且つ多項目検出試薬に最適な、金平糖状の色違い青色金ナノ粒子を提供することができたものである。
なお、本発明の青色金ナノ粒子のコロイド液とは、ナノサイズ(nm)の微粒子、特に金ナノ粒子が水のような各種の媒体中に分散している状態のものを指す。
すなわち、本発明の色違い青色金ナノ粒子は、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸、Au(金)、および還元性を有する有機酸(例えば、アスコルビン酸、クエン酸等)から形成されてなる目視で青色を呈する青色金ナノ粒子である。
(a)本発明の第1の特徴は、平均粒子径が20〜200nmの金ナノ粒子から構成されてなる青色金ナノ粒子にある。
(b)本発明の第2の特徴は、極大吸収波長が570〜800nmの範囲であることを特徴とする(a)に記載の青色金ナノ粒子にある。
(c)本発明の第3の特徴は、粒子の形態がグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元突起部を有する金ナノ粒子であることを特徴とする(a)または(b)に記載の青色金ナノ粒子にある。
(d)本発明の第4の特徴は、金ナノ粒子からなる核の外周を成長させることにより形成されてなる(a)〜(c)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子にある。
(e)本発明の第5の特徴は平均粒子核サイズが20〜60nm、核突起部を含めた平均粒子径が50〜120nmの範囲に含まれ、突起部の数が核1個につき4個以上存在し、この突起部の長さは5〜50nmであることを特徴とする(a)〜(d)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子にある。
(f)本発明の第6の特徴は、(a)に記載の青色金ナノ粒子、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸、および還元性を有する有機酸からなり、コロイド液として分散されてなることを特徴とする青色金ナノ粒子のコロイド液にある。
(g)本発明の第7の特徴は、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸と第一の金塩の溶液を反応させて核金ナノ粒子を形成させる核形成工程と、次いで該核金ナノ粒子の溶液に第二の金塩の溶液と還元性を有する有機酸を同時的に添加反応させて、核金ナノ粒子を成長させる成長工程の反応を行なうことを特徴とする青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(h)本発明の第8の特徴は、成長工程の反応温度を10℃以上40℃未満で実施することを特徴とする(g)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(i)本発明の第9の特徴は、有機酸の濃度が0.075〜0.15mMであることを特徴とする(g)または(h)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(j)本発明の第10の特徴は、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸が、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンプロパンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸及びピペラジン−1,4−ビス(2−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)からなる群から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする(i)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(k)本発明の第11の特徴は還元性を有する有機酸が、酒石酸、酒石酸塩、タンニン酸、タンニン酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、クエン酸及びクエン酸塩からなる群から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする(g)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
次に、本発明の特に免疫学的測定用標識物質としての特徴は、以下のとおりである。
(m)本発明の第13の特徴は、(a)〜(e)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子を含む免疫学的測定用標識物質にある。
(n)本発明の第14の特徴は、形状の異なる少なくとも二種類の金ナノ粒子から構成されることを特徴とする(m)に記載の免疫学的測定用標識物質にある。
(o)本発明の第15の特徴は、球状の金ナノ粒子とグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元突起を有する金ナノ粒子の少なくとも2種類から構成される(n)に記載の免疫学的測定用標識物質にある。
(p)本発明の第16の特徴は、(a)〜(e)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子を標識物質として用いる免疫学的測定方法にある。
以上の発明の構成を採ることにより、本発明の課題を解決することができた。
また、球状の赤色金ナノ粒子等と併用することにより、複数色の判定ラインを有するイムノクロマト診断薬を製造できるため、多項目検査において目視判定が容易かつ正確にできるので、誤診断・誤判定をすることが無い。
さらに、本発明の色違い青色金ナノ粒子にあっては、タンパク質の修飾が容易であるため、感度の低下がなく、正確に結果の判定が可能であって、イムノクロマト診断薬としての性能が優れている。
さらにまた、本発明の色違い青色金ナノ粒子は、イムノクロマト診断薬化した際のコストが、他の製法で得られた粒子に比べて安価である。
定量的には、通常は20〜200nmの範囲に属する金ナノ粒子の総重量は、40%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは80重量%以上存在することが好ましい。残りのものは、成長しないもの、真球状のもの、未反応残渣などから構成される。
このような多項目診断試薬における免疫学的測定用標識物質として用いる金ナノ粒子としては、形状の異なる少なくとも二種類の金ナノ粒子から構成されることを特徴とする免疫学的測定用標識物質である。具体的には、球状の赤色金ナノ粒子とグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元状突起を有する青色金ナノ粒子の少なくとも2種類から構成されるものが適している。
この混在型金ナノ粒子標識物質を構成する、例えば、球状の金ナノ粒子の寸法は、平均粒子径が20〜220nm、好ましくは30〜200nm、より好ましくは40〜150nm程度と比較的大きい粒子である。一方、三次元状突起を有する金ナノ粒子の平均粒子径が20〜200nm程度のものが一応混在し得るが、色彩の鮮明性、色彩に長時間の安定性、コロイドの安定性、標識の精度の向上、信頼性を高めるためには、好ましくは40〜180nm、通常最も好ましくは50〜120nm、さらに最も適正な範囲は60〜100nmの範囲である。
混在型金ナノ粒子標識物質の入手法は、単純に予め製造された所定の平均粒子径を有する球状の金ナノ粒子標識物質と三次元状突起を有する金ナノ粒子標識物質とを、所定割合に混合する手法が挙げられる。
1)2種類の金ナノ粒子両方の平均粒子径が20〜220nmであること、
2)2種類の金ナノ粒子の一方が球状で、他方が三次元状突起を4個以上有する
ことを特徴とする金ナノ粒子、の態様が挙げられる。
このような二種類の、または三種類の混在型金ナノ粒子標識物質は、一度に多様な抗原を、赤、青、のような色違いで、鮮明に識別することができるので、医療現場の検査負担を軽減し、簡便化できるため、その有用性を著しく向上することができる。
成長段階において、より長い突起を持つ金平糖状の金ナノ粒子を形成させたい場合には、第二の還元剤と共に第一の還元剤、即ち、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸との混合物を用いて行なうことを特徴とする。
第二の還元剤と併用する第一の還元剤の使用量は、成長段階で用いる第二の還元剤の使用濃度の仕様にしたがってそれと同一量の程度で使用できる。即ち、使用する第一の還元剤の濃度は、0.01〜100mMの範囲内で達成できる。
ピーク波長を変えずに本発明の粒子サイズを大きくした例を示すと、図2に基づいて詳細に説明をすれば、図2の左図(2a)「粒子1」の粒子の吸収スペクトルにおいて、本発明はピーク波長を変えることなく、粒子サイズを、右図(2b)「粒子2」の状態に成長させることができるということを本発明者等が達成できたものである。図2のピーク波長とは、約570〜630nmの範囲を指すものである。
核形成段階において使用する第一の還元剤の濃度は、1〜150mM、好ましくは30〜100mMが使用できる。150mMを超えると必要以上の濃度となり、技術的に無意味になり、経済的でなく無駄となる。1mM未満では還元剤の機能が弱すぎて核形成反応が十分でなくなる。
核形成段階において使用する第一の金塩の濃度は、0.1〜100mM、好ましくは1〜50mM、より好ましくは5〜25mMが使用できる。
核形成段階で上記濃度範囲の第一還元剤と上記濃度範囲の第一金塩を反応させて得られる金コロイド溶液の金の濃度が、最終的に0.1〜100mMとなるような範囲で反応させる。
同様に図4に基づいて説明をすれば、図4の左図(4a)は、各種反応温度10℃、20℃、30℃および40℃における波長(nm)の関係を調べたものである。40℃以上にすれば、青色から赤色に移行する傾向を示す。いわゆる反応温度を高くすれば、金ナノコロイド粒子が赤味を増す傾向を示す。一方、反応温度を低くすれば、金ナノコロイド粒子は青味を増す傾向にある、詳細には、図4の右図(4b)に見るとおり、例えば、波長600nm程度の金ナノコロイド粒子を収得する場合には、約10〜30℃、最適温度として15〜25℃の反応温度を設定すれば容易に達成できる。
成長段階におけるアスコルビン酸およびその誘導体の最適量を吟味すれば、図5に見るとおり、青色の金コロイドを発色させるためには、アスコルビン酸濃度は0.02〜0.07(質量%)と一応広範囲に使用できるが、青色波長との関係で見れば、アスコルビン酸濃度は、0.075〜0.15mMが最適条件であることがわかり、この範囲は技術的に臨界性のある値であることは本発明者等の知見に基づくものである。
本発明の成長段階で用いる第二の還元剤のモル濃度は、添加した該核金ナノ粒子のモル濃度に対して、5〜500倍の範囲、より好ましくは25〜250倍の範囲が使用できる。本発明の成長段階で用いる第二金塩のモル濃度は、添加した該核金ナノ粒子のモル濃度に対して、0.1〜10倍の範囲、より好ましくは0.5〜5倍の範囲である。
第二の金塩と第二の還元剤とは、核形成段階で合成した金コロイド溶液中に、それぞれ0.1〜3.0ml/分、好ましくは0.3〜1.5ml/分、特に好ましくは0.5〜1.0mL/分の速度で同時的に滴下する。
本発明において、緩衝剤としては、酢酸緩衝液(酢酸+酢酸ナトリウム)、リン酸緩衝液(リン酸+リン酸ナトリウム)、クエン酸緩衝液(クエン酸+クエン酸ナトリウム)、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液(トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタン+塩酸)、TE緩衝液(トリス+エチレンジアミン四酢酸)、TAE緩衝液(トリス+酢酸+エチレンジアミン四酢酸)、TBE緩衝液(トリス+ホウ酸+エチレンジアミン四酢酸)又はHEPES緩衝液(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルフォン酸)等のグッドバッファー等が挙げられる。好ましくは、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などであり、より好ましくは、トリス塩酸緩衝液である。
従来のイムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド中へ、展開液を使用して予め検体を希釈処理して得られた検体試料を滴下して、イムノクロマトグラフィー媒体上を吸収部位の方向へ展開させて、抗原抗体反応により検体中の被検出物質の同定・定量等の検査をすることができる。
試料添加部位(1)は、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へと試料が移動していくような性質の、ガラス濾紙等の多孔質シートで構成されている。
吸収部位(5)は、過剰の試料を迅速に吸収する能力を有する材料、ガラス濾紙等が用いられる。
バッキングシート(6)は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部位(1)、標識物質保持部位(2)、クロマトグラフィー媒体(3)、検出部位(4)、および吸収部位(5)の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート(6)は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
モノクローナル抗体は、常法に従って、抗原(例えば、インフルエンザAウイルス)で免疫したマウスの脾臓細胞と骨隋腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する。例えば、ケーラーとミルスタインの技法(Nature 256(1975)495−497)を参照。
ポリクローナル抗体は、常套手法により、抗原(例えば、インフルエンザAウイルス)を産生動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等)に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。
1.検体試料(検体を展開液で希釈処理したもの)を、サンプルパッド(1)上に、所定量(通常、0.1〜2ml)滴下する。検体試料が滴下されると、検体試料はサンプルパッド(1)に迅速に吸収されるが、速やかに試料と共に移動を始める。サンプルパッド(1)中にイムノクロマトグラフィー用試薬組成物が含浸されていた場合には、含浸されていたイムノクロマトグラフィー用試薬組成物は、検体試料の水分に溶解し、検体試料と共に移動を始める。
2.検体試料は、まず標識物質保持部位(2)へと移動する。ここを検体試料が通過する際、標識物質保持部位(2)に保持されていた標識試薬(第二試薬)が試料の水分に溶解し、試料と共に移動する。
4.最後に、試料の水分は、吸収部位(5)へと移動する。
このように、検体試料中の被検出物質(例えば、抗原)の有無を正確に判定することができる。
(i)平均粒子径の測定
重力的光散乱法(コロイド粒子を、ゾル状体のまま、14000〜5530000×gで回転させて超遠心分離機にかけ、その沈降速度から求める。)により求めることができるが、本発明では、動的光散乱(DLS)測定器Zetasizer Nano ZS(マルバーン社製)により平均粒子径を算出する。また、透過型電子顕微鏡(TEM:日本電子(株)製、JEM−2010)により、撮影した投影写真を用いて無造作に100個の粒子を粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から平均粒径(平均粒子径)を算出することもできる。尚、平均核径も同様にTEM投影写真を用いて無造作に100個の粒子を粒子の投影面積円相当径による平均値から算出され、平均突起長(グラフトの平均長さ)は、前記平均粒子径と平均核径の差分を2で除することで算出される。
(ii)極大吸収波長の測定
紫外可視分光光度計JASCO V−530(装置名、(株)島津製作所社製)を用い測定する。測定は、波長800〜200nm、バンド幅0.5nm、石英セル光路長10mmの条件で行い、その測定により得られるスペクトルの極大値の波長を極大吸収波長とする。
この実施例では、核形成段階において、第一の金塩である塩化金酸を第一の還元剤であるHEPESで還元し、金平糖状の核コロイドを形成した。その後、成長段階では、第二の金塩である塩化金酸と、第二の還元剤であるL−アスコルビン酸とを同時に滴下してよりサイズの大きい金平糖状の金コロイドを形成させた。
10ml蓋付ガラス容器に、4×10−2mol/L HEPES pH7.8を10ml添加し、液温25℃となるまで恒温槽内で保持した。一方、塩化金酸四水和物0.7g(1.6×10−2mol)を超純水100mlに溶解させ、液温4℃になるまで氷上で保持した。HEPES水溶液、塩化金酸水溶液共に液温が安定したら、塩化金酸水溶液0.3mlをHEPES水溶液に滴下し、25℃恒温槽に1時間静置した。これにより、突起を含めた平均粒子径が43nm程度の、ほぼ金平糖型、グラフ型またはマルチポット型(突起数1〜8)程度の金ナノコロイド粒子が製造された。コロイド溶液の単位体積(0.1ml)当たりの収率は91%程度のものができた。残りのものは、真球状のもの、未反応物、などと推定できる。
上記方法によって形成した金濃度4.0×10−4mol/Lの核コロイド5mlを、500mlの三口フラスコに入れ、液温が20℃になるまで恒温槽内で攪拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物1.5×10−2g(4.0×10−5mol)を超純水116mlに溶解させた塩化金酸水溶液と、L−アスコルビン酸4.2×10−2g(2.4×10−4mol)を超純水116mlに溶解させたL−アスコルビン酸水溶液116mlとを、1.0ml/minの速度で同時に滴下して、2時間攪拌しながら反応させて、成長段階を行なった。滴下終了後、三口フラスコを恒温槽から取り出し、冷蔵庫で一晩静置した。得られた金ナノ粒子は、平均粒子径(DLS)約66.5nm程度、TEM観察による計測では、平均核径が約35.7nm程度であり、平均突起は13.2nm、突起数平均4以上、突起角50度程度、ARは1以上のものが生成された。得られた金コロイドの溶液は、青色(目視によるマンセル表色系測色値:色相5B付近)、極大吸収波長は610nmであった。
この実施例では、より長い突起を持つ金平糖状の金コロイドの合成を目的として行なった。
実施例1の核形成段階で形成した4.0×10−4mol/Lの核コロイド5mlを、500mlの三口フラスコに入れ、液温が20℃になるまで恒温槽内で攪拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物1.5×10−2g(4.0×10−5mol)を超純水116mlに溶解させた塩化金酸水溶液と、L−アスコルビン酸4.2×10−2g(2.4×10−4mol)とHEPES 0.11g(4.0×10−3mol)を超純水116mlに溶解させたL−アスコルビン酸HEPES水溶液116mlとを、1.0ml/minの速度で同時に滴下して、2時間攪拌しながら反応させて、成長段階を行なった。滴下終了後、三口フラスコを恒温槽から取り出し、冷蔵庫で一晩静置した。
得られた金ナノ粒子は、突起を含めた平均粒子径(DLS)約98nm程度、TEM観察による計測では、より長い突起を持つ金平糖状の金コロイドがより多く生成されているものと推定される。平均核径が約65.7nm程度であり、成長した突起(グラフト)の平均長さは約16.7nm程度、突起数平均4以上、突起角50度程度、ARは1以上のものが生成された。得られた金コロイドの溶液は、青緑色(目視によるマンセル表色系測色値:色相8BG付近)、極大吸収波長は641nmであった。
実施例1において、成長段階の液温を10℃にした以外は、実施例1と同様にして、金コロイドを合成した。得られた金コロイド溶液の極大吸収波長を表1に示す。
実施例1の核形成段階で形成した4.3×10−4mol/Lの核コロイド5mlを、500mlの三口フラスコに入れ、液温である成長温度を10℃になるまで恒温槽内で攪拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物1.7×10−2g(4.2×10−5mol)を超純水116mlに溶解させた塩化金酸水溶液と、L−アスコルビン酸4.2×10−2g(2.4×10−4mol)を超純水116mlに溶解させたL−アスコルビン酸水溶液116mlとを、1.0ml/minの速度で同時に滴下して、2時間攪拌しながら反応させて、成長段階を行なった。滴下終了後、三口フラスコを恒温槽から取り出し、冷蔵庫で一晩静置した。
得られた金ナノ粒子は、突起を含めた平均粒子径(DLS)が約67nm程度、TEM観察による計測では、平均核径が51.0nmであり、成長した突起(グラフト)の平均長さは8.0nm程度、突起数平均4以上、突起角50度程度、ARは1以上のものが生成された。得られた金コロイドの溶液は、青色(目視によるマンセル表色系測色値:色相5PB付近)、極大吸収波長は587nmであった。
実施例1において、成長段階の液温を30℃にした以外は、実施例1と同様にして、ほぼ金平糖型、グラフ型またはマルチポット型(突起数2〜4)程度の三次元状突起を有する金コロイドナノ粒子を合成した。
得られた金ナノ粒子は、突起を含めた平均粒子径(DLS)60.5nm程度、TEM観察による計測であり、成長した突起(グラフト)の平均長さは7.5nm程度、突起数平均4以上、突起角50度程度、ARは1以上のものが生成された。得られた金コロイド溶液の極大吸収波長は586.5nmであった。
結果を表1に示す。
実施例1において、成長段階の液温を40℃にした以外は、実施例1と同様にして、金コロイドを合成した。得られた金コロイド溶液の極大吸収波長を表1に示す。
成長段階の温度を40℃にしたものであり、突起を含めた平均粒子径(DLS)約53nm程度、TEM観察による計測では、平均核径が45nmであり、成長した突起(グラフト)の平均長さは4nm程度、突起数平均4以上、突起角10度程度、のものが生成された。マルチポット型(突起数2〜4)の三次元状突起がやや丸みを帯びた金コロイド粒子が製造された。残りは、真球状のもの、未反応物、などと推定できる。得られた金コロイドの溶液は、赤味を帯び(目視によるマンセル表色系測色値:色相10RP付近)、極大吸収波長が530nmであった。
実施例1において、成長段階のアスコルビン酸量を2.1×10−2g(1.2×10−4mol)にした以外は、実施例1と同様にして、金コロイドを合成した。得られた金コロイド溶液の極大吸収波長を表1に示す。
実施例1の核形成段階で形成した4.3×10−4mol/Lの核コロイド5mlを、500mlの三口フラスコに入れ、液温である成長温度が30℃になるまで恒温槽内で攪拌した。液温が安定したら、塩化金酸四水和物1.7×10−2g(4.2×10−5mol)を超純水116mlに溶解させた塩化金酸水溶液と、L−アスコルビン酸2.1×10−2g(1.2×10−4mol)を超純水116mlに溶解させたL−アスコルビン酸水溶液116mlとを、1.0ml/minの速度で同時に滴下して、2時間攪拌しながら反応させて、成長段階を行なった。滴下終了後、三口フラスコを恒温槽から取り出し、冷蔵庫で一晩静置した。
得られた金ナノ粒子は、突起を含めた平均粒子径が約48nm程度のものが生成された。
得られた金コロイドの溶液は、極大吸収波長は536.3nmで赤味を帯びたものであった。
実施例1において、成長段階のアスコルビン酸量を、8.4×10−2g(4.8×10−4mol)にした以外は、実施例1と同様にして、金コロイドを合成した。得られた金コロイド溶液の極大吸収波長を表1に示す。
成長段階温度30℃にしたものであり、核平均直径が60.2nm、平均粒子径が70.2nmであった。得られた金コロイドの溶液は、極大吸収波長が550.0nmで橙味を帯びたものであった。
実施例2のHEPESに換えHEPPSOを用いたこと以外は、実施例2と同様にして、平均粒子径が約72nmである金コロイド粒子を作成した。得られた金コロイドの溶液は、青色(目視によるマンセル表色系測色値:色相1B付近)を呈し極大吸収波長は632nmであった。
実施例2のHEPESに換えPIPESを用いたこと以外は、実施例2と同様にして、平均粒子径が約81nmである金コロイド粒子を作成した。得られた金コロイドの溶液は、青色(目視によるマンセル表色系測色値:色相3B付近)を呈し極大吸収波長は626nmであった。
実施例2において、成長段階のアスコルビン酸に換えL−アスコルビン酸Naを 4.7×10−2グラム(2.4×10−4mol)用い、HEPESの量を0.22g(8.0×10−3mol)用いたこと以外は、実施例2と同様にして、金コロイド溶液を合成した。
得られた金コロイド粒子の突起を含めた平均粒子径(DLS)は約82nm程度、平均核径が約48nm程度であり、成長した突起(グラフト)の平均長さは約20nm程度、突起数平均4以上、突起角50度程度、ARは1以上のものが生成された。得られた金コロイド溶液は、紺色(目視によるマンセル表色系測色値:色相5PB付近)、極大吸収波長は752nmという、若干高い波長のものができる。
得られた金コロイド粒子の突起を含めた平均粒子径(DLS)、平均核径は同等程度であり、成長した突起(グラフト)の平均長さ、平均突起数、突起角度は同等程度であり、ARは1以上のものが生成された。得られた金コロイド溶液は各実施例のものと同等程度のものが得られた。これにより、
本発明の成長段階で用いる第二の還元剤としては、還元性を有する有機酸、例えば、アスコルビン酸およびその誘導体、またはクエン酸およびその誘導体、以外の例えば、D(L)−リンゴ酸、D(L)−酒石酸、乳酸、タンニン酸、還元糖などを用いて実施すれば、生成する金コロイド溶液には、若干の違いがあるが、一応本発明の目的とする所定の範囲内の特性を有するものが製造できる。それらの各酸の無機または有機塩を用いて、上記実施例7等の方法に従って実施すれば、所定の金コロイド溶液を収得することができる。
<イムノクロマトグラフによるウイルス検出の実験例>
[実施例8]
ニトロセルロース膜(ミリポア社製:HF120)に、抗体塗布機(BioDot社製)を用いて、5重量%のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝(pH7.4)で1.0mg/mLの濃度になるように希釈した抗インフルエンザウイルスAモノクローナル抗体を展開方向上流側(表2:ライン1)に、抗インフルエンザウイルスBモノクローナル抗体を前記抗インフルエンザAモノクローナル抗体の下流側(表2:ライン2)に塗布し、50℃で30分間乾燥させた。乾燥後、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体上へ反応部位を作製した。
前記実施例1で作成された青色金コロイド懸濁液0.5mLに、リン酸緩衝(pH7.4)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗インフルエンザウイルスBモノクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、10重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1mL加え、十分撹絆した後、8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液1とした。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:平均粒子径40nm)0.5mLに、リン酸緩衝(pH7.4)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗インフルエンザウイルスAモノクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、10重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1mL加え、十分撹絆した後、8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液2とした。
上記作製した標識物質溶液1及び2をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、検出試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフ媒体、検出試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、および展開した試料、不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体を作製した。
上記作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中のインフルエンザウイルスA(表2:抗原A)及びインフルエンザウイルスB(表2:抗原B)の有無を測定した。即ち、0.5%Tween20、0.6%ポリビニルピロリドン(PVP)K−90
( 分子量 36万)、1.0%牛血清アルブミンと150mM塩化ナトリウムを含むトリス緩衝溶液(pH8.0)から成る展開液を陰性検体試料とし、ここに不活化処理した蛋白濃度がそれぞれ25ng/mLのインフルエンザウイルスAおよび/またはインフルエンザウイルスBを加えたものを陽性検体試料とし、各々150μLをクロマトグラフ媒体のサンプルパッド上に載せて展開させ、15分後に目視判定をした。反応部位におけるテストライン(ライン1及び2)の発色シグナルを明確に確認できるものを「+」、発色シグナルは確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、発色シグナルを確認できないものを「−」とした。実施例5の結果を表2に示す。
1) 上記金コロイド粒子の球状の核に4〜20の突起が形成されていること
2) 上記金コロイド粒子の平均粒子径が20〜200nmであること
を特徴とする目視の青色によって検出対象物を標識し識別する為の金コロイド粒子を利用することが可能である。
(a)本発明の第1の特徴は、平均粒子核サイズが20〜60nm、平均粒子径が50〜120nmの範囲に含まれ、突起数が核1個につき4以上存在し、この突起部の長さは5〜50nmであることを特徴とする金ナノ粒子から構成されてなる青色金ナノ粒子にある。
(b)本発明の第2の特徴は、紫外可視吸収スペクトルの極大吸収波長が570〜800nmの範囲であることを特徴とする(a)に記載の青色金ナノ粒子にある。
(c)本発明の第3の特徴は、粒子の形態がグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元突起部を有する金ナノ粒子であることを特徴とする(a)または(b)に記載の青色金ナノ粒子にある。
(d)本発明の第4の特徴は、金ナノ粒子からなる核の外周を成長させることにより形成されてなる(a)〜(c)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子にある。
(e)本発明の第5の特徴は、(a)に記載の青色金ナノ粒子、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸、および還元性を有する有機酸からなり、コロイド液として分散されてなることを特徴とする青色金ナノ粒子のコロイド液にある。
(f)本発明の第6の特徴は、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸と第一の金塩の溶液を反応させて核金ナノ粒子を形成させる核形成工程と、次いで該核金ナノ粒子の溶液に第二の金塩の溶液と還元性を有する有機酸を同時的に添加反応させて、核金ナノ粒子を成長させる成長工程の反応を行なうことを特徴とする青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(g)本発明の第7の特徴は、成長工程の反応温度を10℃以上40℃未満で実施することを特徴とする(f)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(h)本発明の第8の特徴は、成長工程における有機酸の濃度が0.075〜0.15mMであることを特徴とする(f)または(g)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(i)本発明の第9の特徴は、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸が、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンプロパンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸及びピペラジン−1,4−ビス(2−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)からなる群から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする(h)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
(j)本発明の第10の特徴は還元性を有する有機酸が、酒石酸、酒石酸塩、タンニン酸、タンニン酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、クエン酸及びクエン酸塩からなる群から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする(f)に記載の青色金ナノ粒子の製造方法にある。
次に、本発明の特に免疫学的測定用標識物質としての特徴は、以下のとおりである。
(l)本発明の第12の特徴は、(a)〜(d)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子を含む免疫学的測定用標識物質にある。
(m)本発明の第13の特徴は、形状の異なる少なくとも二種類の金ナノ粒子から構成されることを特徴とする(l)に記載の免疫学的測定用標識物質にある。
(n)本発明の第14の特徴は、球状の金ナノ粒子とグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元突起を有する金ナノ粒子の少なくとも2種類から構成される(m)に記載の免疫学的測定用標識物質にある。
(o)本発明の第15の特徴は、(a)〜(d)のいずれかに記載の青色金ナノ粒子を標識物質として用いる免疫学的測定方法にある。
以上の発明の構成を採ることにより、本発明の課題を解決することができた。
Claims (16)
- 平均粒子径が20〜200nmの金ナノ粒子から構成されてなる青色金ナノ粒子。
- 極大吸収波長が570〜800nmの範囲であることを特徴とする請求項1に記載の青色金ナノ粒子。
- 粒子の形態がグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元突起部を有する金ナノ粒子であることを特徴とする請求項1または2に記載の青色金ナノ粒子。
- 金ナノ粒子からなる核の外周を成長させることにより形成されてなる請求項1〜3のいずれかに記載の青色金ナノ粒子。
- 平均粒子核サイズが20〜60nm、核突起部を含めた平均粒子径が50〜120nmの範囲に含まれ、突起数が核1個につき4以上存在し、この突起部の長さは5〜50nmであることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の青色金ナノ粒子。
- 請求項1に記載の青色金ナノ粒子、グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸、および還元性を有する有機酸からなり、コロイド溶液として分散されてなることを特徴とする青色金ナノ粒子のコロイド溶液。
- グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸と第一の金塩の溶液を反応させて核金ナノ粒子を形成させる核形成工程と、次いで該核金ナノ粒子の溶液に第二の金塩の溶液と還元性を有する有機酸を同時的に添加反応させて、核金ナノ粒子を成長させる成長工程の反応を行なうことを特徴とする青色金ナノ粒子の製造方法。
- 成長工程の反応温度を10℃以上40℃未満で実施することを特徴とする請求項7に記載の青色金ナノ粒子の製造方法。
- 有機酸の濃度が0.075〜0.15mMであることを特徴とする請求項7または8に記載の青色金ナノ粒子の製造方法。
- グッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸が、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンプロパンスルホン酸、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)、3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸及びピペラジン−1,4−ビス(2−ヒドロキシ−3−プロパンスルホン酸)からなる群から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする請求項9に記載の青色金ナノ粒子の製造方法。
- 還元性を有する有機酸が、酒石酸、酒石酸塩、タンニン酸、タンニン酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、クエン酸及びクエン酸塩からなる群から選ばれた1種又は2種以上であることを特徴とする請求項7に記載の青色金ナノ粒子の製造方法。
- 成長工程において、還元性を有する有機酸と共にグッドバッファー成分のピペラジン環を有する有機酸をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の青色金ナノ粒子の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の青色金ナノ粒子を含む免疫学的測定用標識物質。
- 形状の異なる少なくとも二種類の金ナノ粒子から構成されることを特徴とする請求項13に記載の免疫学的測定用標識物質。
- 球状の金ナノ粒子とグラフト型、マルチポット型、または金平糖型の三次元突起を有する金ナノ粒子の少なくとも2種類から構成される請求項14に記載の免疫学的測定用標識物質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の青色金ナノ粒子を標識物質として用いる免疫学的測定方法。
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