CN108463726B - 检测分析物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于5检测样品中的分析物的竞争性测定设备和方法。所述竞争性测定设备包括样品接收区域、缀合物区域、检测区域、吸收区域和任选的操持区域,并且在其近端和检测区域之间包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和10羟乙基纤维素的化合物。该测试适合于检测抗生素例如β‑内酰胺类,并且具有优异的灵敏度。
Description
发明领域
本发明公开了用于检测液体组合物中的分析物的方法、设备和试剂盒。
背景技术
抗生素用于抗人和动物二者中的感染性疾病。人们熟知,抗生素的滥用(比如当从医学角度来讲不需要却施用了抗生素时,或未完成的治疗疗程)是抗生素抗性发展的最重要的原因。因此,用于检测样品中的抗生素存在的方法对于预防不希望的抗生素传播是最重要的,所述样品例如乳、血、鱼、饲料、肉、血清、尿、水等。在许多区域,如果能够得到快速和简单的测试,该检测方法才可充分地进行。
一般而言,有适于常规监测样品中抗生素存在与否的两种类型的测试。首先是微生物抑制测试,其中测试微生物与待测试的样品接触并且(例如使用指示剂)观察微生物的生长(或生长的抑制)。这种测试的例子描述在EP 0755 456B1中。微生物抑制测试的主要缺点是其花费相对长的时间来获得结果。
第二是竞争性免疫测定,其中待测试的抗生素和测试中存在的参考抗生素竞争结合对抗生素具有亲和性的结合蛋白和/或抗体。通常通过标记的手段进行可视化。这种测试的例子描述在WO 2013/037885和EP0593112B1中。尽管这些类型的测试通常比微生物抑制测试更快,但是它们仍需要终端使用者的大量操作,并且因而不是使用者友好的。此外,现有技术的竞争性免疫测定通常不够灵敏。
鉴于以上,存在对抗生素测试领域进行改进的相当大的空间,尤其是在涉及灵敏性时。
发明描述
在本说明书和所附权利要求书的各个部分,词语“包括”、“包含”和“具有”及其变形应被理解为“包含在内”。也就是说,在语境允许的情况下,这些词语意图传达的意思是:可以包括其它没有明确列举的要素或整体。
本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)对象。例如,“分析物”可意味着一种分析物或者两种或更多种分析物,“受体”可以包括两种或更多种受体。
在第一方面,本发明提供了检测液体组合物中的分析物的方法,所述方法包括:
a)提供具有近端和远端的测试设备,所述测试设备被配置为允许从所述近端到所述远端的侧向流,所述测试设备包括固体支撑物,所述固体支撑物以从所述近端至所述远端的顺序包括以下区域:
i.样品接收区域,
ii.缀合物区域,所述缀合物区域包含标记的对照试剂和能够结合所述分析物的标记的受体,
iii.检测区域,所述检测区域包括至少两个带:
A.检测带,其包含固定化的结合剂,当所述标记的受体未被来自所述样品的分析物结合时,所述固定化的结合剂能够结合所述标记的受体,和
B.对照带,其包含能够结合所述标记的对照试剂的固定化的结合剂,
iv.吸收区域,和
v.任选的操持区域(handling region),
b)使所述液体组合物与所述测试设备的样品接收区域接触,
c)允许所述液体组合物从所述样品接收区域通过所述缀合物区域和检测区域移动至所述吸收区域,从而允许包含所述标记的受体和标记的对照试剂的所述液体组合物接触所述检测带和对照带,
d)检测在所述检测带的信号和在所述对照带的信号,其中
i.在所述检测带存在比在所述对照带的信号更强的信号指示样品中不存在分析物,和
ii.在所述检测带不存在信号或在所述检测带存在比在所述对照带的信号更弱的信号指示样品中存在分析物,
其中设备中所述近端和所述检测区域之间的部分包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物。
在本发明的方法中,液体组合物与测试设备的样品接收区域接触。这可以例如通过将设备浸入液体组合物中来实现。液体组合物可被方便地放入容器(诸如管或小瓶)中,使得设备的样品接收区域可以浸入液体中。
在液体组合物与样品接收区域接触之前,所述液体组合物可以与化合物接触,所述化合物例如有机缓冲液例如Tris或磷酸盐缓冲液,表面活性剂例如Tween-20或TritonX-100(优选浓度为0-2%w/v),蛋白质例如牛血清白蛋白,多元醇例如甘油和糖例如二糖诸如蔗糖。
在一种实施方式中,所述方法包括,在使液体组合物与测试设备的样品接收区域接触之前,将所述液体组合物加入包含缓冲液例如有机缓冲液的容器中。加入容器中的液体组合物的量可以为50μL-10mL,优选50-1000mL,更优选125-250μL。在样品与缓冲液接触后,可以摇动所得到的液体组合物。通常摇动1-60秒,优选1-20秒,优选15-45秒,其中约30秒是优选的。可用于本发明的容器可以是任何形状和尺寸的管并且可来自任何合适的可用材料。容器也可以是孔,比如合并在微量滴定板中的孔。使用容器有助于接触。例如,设备可以简单地浸入含有液体组合物的容器中。
加入样品接收部分的液体组合物的量优选为50-1000μL,优选75-750μL,更优选100-500μL,特别地125-250μL。
所述方法适合于分析样品中是否存在分析物。样品可以是固体或液体。当样品是液体时,其可以原样与测试设备的样品接收区域接触。当样品是固体时,需要从样品中提取分析物,所述提取产生液体组合物,所述液体组合物可以与测试设备的样品接收区域接触。从样品中提取液体的方法取决于样品的类型。用于不同类型样品的合适的提取方法是本领域技术人员已知的,包括通过均化、与珠子一起漩涡、研磨或超声处理使固体样品崩裂,和/或溶剂提取。
液体组合物可源自体液、器官、肉或蛋。分析物也可存在于其中添加了这些动物产品作为成分的食品中。食品的例子是乳;蜂蜜;牛肉、猪肉、禽肉和鱼肉;海产食物,比如虾;经加工的肉产品,比如香肠;即食膳食;饲料;和婴儿食物。分析物也可存在于适于被例如食品检测机关检查的体液或动物组织中。例子有血、肝脏组织、肌肉组织、心脏组织、肾脏组织或从肾脏获得的原尿和尿。尿和血适于在屠宰动物之前检查。分析物也可存在于水比如废水中,例如来自产抗生素的工厂或来自医院流。在一种优选的实施方式中,液体组合物是乳。乳可来自牛(例如母牛)、马、绵羊、山羊、牦牛、水牛、人、驴、驯鹿、野牛和骆驼。分析物也可存在于半加工的或加工的食物中,所述食物比如巴氏消毒的产品、UHT-产品、脱脂或部分脱脂的乳、乳清、新鲜或熟化的乳酪、酸乳、奶油、黄油、酸奶油、酪乳等等。
在一种实施方式中,使测试设备与液体组合物在40-70℃的温度、优选地50-65℃的温度、更优选地60-64℃的温度下接触1-10分钟、优选地1.5-4分钟、更优选地2-3分钟。可借助于恒温设备比如水浴或孵育器进行孵育。在一种优选的实施方式中,液体组合物与测试设备接触之前和之后的温度相同。一旦在检测带和/或对照带检测到信号,便可立即停止孵育。
标记的受体能够结合待检测的分析物。所述方法能够检测至少一种分析物的存在。所述方法可以能够检测样品中多种分析物(例如两种或三种(不同)分析物)的存在。
标记的受体和标记的对照试剂的标记可以不同或相同。可使用可见的标记和不可见的标记。合适的标记包括但不限于荧光化合物,发色化合物,化学发光化合物,放射性化合物,比色化合物,磁性化合物(例如珠或颗粒),酶,催化化合物,底物,具有标记的囊泡和颗粒,比如染料颗粒、着色的乳胶颗粒、碳颗粒、金属颗粒、非金属颗粒、胶体金属颗粒。在一种优选的实施方式中,标记是可见的标记,优选胶体金属颗粒,最优选金颗粒例如胶体金颗粒。标记可通过任何合适的方式与受体和/或对照试剂结合,所述方式包括缀合、共价结合或非共价结合。标记可直接与受体和/或对照试剂结合,或标记可通过缀合物,比如生物素-链霉亲和素缀合物或生物素-亲和素缀合物结合。
在一种实施方式中,标记的对照试剂不能与样品中的分析物结合。在一种实施方式中,标记的对照试剂与在测试设备的检测区域的对照带中固定的结合剂形成特异性结合对。在本文中使用时,术语“特异性结合对”指彼此特异性结合的两种物质。
在一种实施方式中,测试设备是测试条。考虑到加入标记的受体和标记的对照试剂的液体样品的体积小,推荐放置测试设备以使得其在底和壁之间成角度放置。
在本发明的方法中,当检测带中的标记密度(即信号)大于对照带中的标记密度时,样品不含分析物或含有低于给定阈值的浓度的分析物(换句话说,分析物未以足够的量存在,并且测试被认为是“阴性”的)。换言之,当在本申请中提及“样品中不存在分析物”时,意思是样品不含分析物或含有浓度低于给定阈值的分析物。但是,当检测带中的标记密度小于对照带中的标记密度时,分析物以高于给定阈值的浓度存在于样品中(换句话说,分析物以超过允许水平的量存在并且测试被认为是“阳性”的)。换言之,当本申请提及“样品中存在分析物”时,意思是样品含浓度高于给定阈值的分析物。当检测带中的标记密度(即信号)与对照带中的标记密度(即信号)是等强度时,分析物以高于、等于或低于给定阈值的浓度存在于样品中。这取决于所选择的阈值。在本文中使用时,“阈值”指下述浓度值:大于该值认为存在给定的分析物;小于该值认为不存在所述分析物。一般而言,具体样品中具体分析物的阈值由地方、地区或地区间机关给出,但是对于某些研究目的而言也可预先设定所述阈值。信号可通过眼睛视觉检测,但是也可通过信号读取设备(例如分光光度计、反射系数读取器、荧光计、照相机、磁性探测器、闪烁计数器等等)来检测。合适的检测设备是智能手机或平板电脑,优选地是具有放置测定设备的支持物的平板电脑,使得可以读取信号。这种智能手机或平板电脑可具有能够分析信号并指示测试结果的软件。
可测量处于检测带的可检测标记的强度,以确定本发明方法的结果。本发明的方法可提供是或否的结果(即存在或不存在分析物)或可确定存在或不存在大于或小于某阈值的分析物(实际上也是是或否的结果)。信号的强度可与样品中分析物的浓度反相关。此外,在检测带的信号强度可与在对照带的信号强度比较,以确定本发明方法的结果。不同带的强度之间的差异甚至可通过信号读取设备来分析,并通过例如将结果与预定的值比较来计算样品中分析物的浓度。
设备中近端和检测区域之间的部分包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物。发明人发现本领域的方法通常不够灵敏。他出乎意料地发现:通过将选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物(下文称为“所述化合物”)应用于设备中近端和检测区域之间的部分,可以提高对分析物的灵敏度。在本发明上下文中,“选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物”被理解为包括由甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素组成的化合物列表中的一种化合物,或两种化合物,三种化合物,四种化合物或所有化合物。因此,设备中近端和检测区域之间的部分可包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的一种、两种、三种、四种或所有化合物。
甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素可商购获得,其制备在本领域中是公知的。
在一种实施方式中,设备中近端和检测区域之间的部分不包含硝酸纤维素和/或乙酸纤维素。因此,在一种实施方式中,设备中近端和检测区域之间的部分不包含硝酸纤维素素。在另一种实施方式中,设备中近端和检测区域之间的部分不包含乙酸纤维素。在又一种实施方式中,设备中近端和检测区域之间的部分既不包含硝酸纤维素也不包含乙酸纤维素。
所述化合物的量可以在0.5μg和100μg之间。如果设备中近端和检测区域之间的部分包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的两种或更多种化合物,则所述两种或更多种化合物的总和可以在0.5μg和100μg之间。
所述量可取决于设备的长度和宽度。本领域技术人员可以通过改变量并记录作为量的函数的所述方法的灵敏度从而容易地确定期望的量。
在一种实施方式中,设备中近端和检测区域之间的部分上所述化合物的量可以在1μg和60μg之间,更优选在2μg和30μg之间,更优选在3μg和20μg之间。
在另一种实施方式中,设备中近端和检测区域之间的部分上所述化合物的量可以在1-100μg/cm2之间,更优选在6-30μg/cm2之间。
在另一种实施方式中,其上应用了或将要应用所述化合物的设备中近端和检测区域之间的部分的表面积在0.1-2.5cm2之间,更优选在0.2-1cm2之间。
例如,如果其上应用了或将要应用所述化合物的设备中近端和检测区域之间的部分的表面积为0.5cm2,则所述化合物的合适量在3-12μg之间,更优选地4-10μg,甚至更优选约6μg。
所述化合物可以存在于设备的近端和检测区域之间的任何地方。所述化合物可以均匀分布在所述部分上,但也可以从近端开始以增加或减少的量存在于设备上。所述化合物可以连续或不连续地存在。在后一种情况下,所述化合物可以存在于例如两个分开的区域(具有不含所述化合物的间歇区域)或三个区域(具有两个不含所述化合物的间歇区域)上,等等。在本发明的上下文中,“在设备的近端和检测区域之间”并不意味着在设备的其他任何地方不能存在所述化合物,而是至少在设备中近端和检测区域之间的部分上存在所述化合物。所述化合物可以在样品接收区域上。所述化合物也可以存在于缀合物区域上。所述化合物也可以存在于样品接收区域和缀合物区域二者上。
在一种实施方式中,本发明方法中使用的设备进一步包括在近端和检测区域之间的包含所述化合物的流动减缓区域。该流动减缓区域可以位于样品接收部分和缀合物区域之间,或者位于缀合物区域和检测区域之间。所述设备还可以包括两个流动减缓区域,一个位于样品接收部分之间,另一个位于缀合物区域和检测区域之间。所述化合物也可以存在于流动减缓区域上并且另外存在于样品接收区域和/或缀合物区域上。
在一种实施方式中,分析物是抗生素。在本文中使用时,术语“抗生素”是指展示抗细菌活性的样品中的一种或更多种物质或化学成分(或此类物质或化学化合物的代谢物)。在本发明的一种实施方式中,待通过根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒检测的抗生素选自β-内酰胺抗生素家族、四环素抗生素家族、链霉素抗生素家族、磺酰胺抗生素家族、氨基糖苷抗生素家族和喹诺酮抗生素家族。
在本发明的一种实施方式中,待通过根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒检测的分析物是β-内酰胺抗生素、四环素抗生素和/或链霉素抗生素。根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒可以能够检测选自β-内酰胺抗生素、四环素抗生素和/或链霉素抗生素的抗生素。根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒可以能够检测β-内酰胺抗生素和四环素抗生素。根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒可以能够检测β-内酰胺抗生素和链霉素抗生素。根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒还可以能够检测四环素抗生素和链霉素抗生素。根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒还可以能够检测β-内酰胺抗生素、四环素抗生素和链霉素抗生素。
术语“β-内酰胺抗生素”是指在其化学结构中包含β-内酰胺亚结构并且展示抗细菌活性的化合物(或其代谢物)。β-内酰胺抗生素的两个重要亚类是衍生自头孢菌素的抗生素和衍生自青霉素的抗生素。衍生自头孢菌素的抗生素的例子是头孢克洛(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢噻夫(ceftiofur)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢吡硫(cephapirin)和头孢拉定(cephradine)。衍生自青霉素的抗生素的例子是阿莫西林、氨苄西林(ampicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素G、青霉素V和替卡西林(ticarcillin)。
术语“四环素抗生素”是指在其化学结构中包含四环素亚结构并且展示抗细菌活性的化合物(或其代谢物)。四环素抗生素的例子是四环素、土霉素、多西环素和氯四环素。
术语“链霉素抗生素”是指链霉素或双氢链霉素。
所述方法中的设备包括缀合物区域,所述缀合物区域包含能够结合分析物的标记的受体和标记的对照试剂。
检测β-内酰胺抗生素的合适受体是抗生素结合蛋白。这种结合蛋白可以结合具有相似结构结合位点的抗生素家族。合适的结合蛋白包括但不限于抗体(单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体),抗体片段,酶,适体和受体诸如青霉素结合蛋白。优选地,这种抗生素结合蛋白是从微生物获得的蛋白质。在一种实施方式中,所述微生物是抗生素敏感性微生物。在本发明的一种实施方式中,所述微生物选自Bacillus种、Escherichia种和Streptococcus种。在本发明的一个优选实施方式中,所述微生物是嗜热的。例子为Bacillus stearothermophilus或Streptococcus thermophilus,其中Bacillusstearothermophilus是优选的。
检测链霉素抗生素的合适受体是抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体,并且可以在动物中产生,所述动物例如鸡、山羊、天竺鼠、仓鼠、小鼠、绵羊等。合适的抗体也可以从一些供应商商购获得。
检测四环素抗生素的合适受体是抗体或结合蛋白。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体,并且可以在动物中产生,所述动物例如鸡、山羊、天竺鼠、仓鼠、小鼠、绵羊等。合适的抗体也可以从一些供应商商购获得。受体也可以是结合蛋白,例如天然四环素基因阻遏物(TetR)蛋白或其突变体。它们可以分离自例如E.coli的四环素抗性菌株。它们也可以通过克隆到合适的生物体(例如E.coli)中来生产。
本发明还提供了检测样品中的β-内酰胺抗生素、四环素抗生素和/或链霉素抗生素的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供具有近端和远端的测试设备,所述测试设备被配置为允许从所述近端到所述远端的侧向流,所述测试设备包括固体支撑物,所述固体支撑物以从所述近端至所述远端的顺序包括以下区域:
i.样品接收区域,
ii.缀合物区域,所述缀合物区域包含标记的抗生素结合蛋白、标记的四环素抗体、标记的链霉素抗体和标记的对照试剂,
iii.检测区域,所述检测区域包括至少两种带:
A.第一检测带,其包含固定化的7-ACA,当所述标记的抗生素结合蛋白未被来自所述样品的β-内酰胺抗生素结合时,所述固定化的7-ACA能够结合所述标记的抗生素结合蛋白,
B.第二检测带,其包含固定化的四环素,当所述标记的四环素抗体未被来自所述样品的四环素抗生素结合时,所述固定化的四环素能够结合所述四环素抗体,
C.第三检测带,其包含固定化的链霉素,当所述标记的链霉素抗体未被来自所述样品的链霉素抗生素结合时,所述固定化的链霉素能够结合所述链霉素抗体,和
D.对照带,其包含能够结合所述标记的对照试剂的固定化的结合剂,
iv.吸收区域,和
v.任选的操持区域,
b)使所述液体组合物与所述测试设备的样品接收区域接触,
c)允许所述液体组合物从所述样品接收区域通过所述检测区域移动至所述吸收区域,从而允许包含标记的抗生素结合蛋白、标记的四环素抗体、标记的链霉素抗体和标记的对照试剂的所述液体组合物接触所述检测带和对照带,
d)检测在所述检测带的信号和在所述对照带的信号,其中
i.在所述检测带存在比在所述对照带的信号更强的信号指示样品中不存在分析物,和
ii.在所述检测带不存在信号或在所述检测带存在比在所述对照带的信号更弱的信号指示样品中存在分析物,
其中设备中所述近端和所述检测区域之间的部分包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物。
在第二方面,本发明还涉及检测液体组合物中的分析物的测试设备,所述设备具有近端和远端,所述测试设备被配置为允许从所述近端到所述远端的侧向流,所述测试设备包括固体支撑物,所述固体支撑物以从所述近端至所述远端的顺序包括以下区域:
i.样品接收区域,
ii.缀合物区域,所述缀合物区域包含能够结合所述分析物的受体,
iii.检测区域,所述检测区域包括至少两种带:
A.检测带,其包含固定化的结合剂,当标记的受体未被来自所述样品的分析物结合时,所述固定化的结合剂能够结合所述标记的受体,和
B.对照带,其包含能够结合标记的对照试剂的固定化的结合剂,
iv.吸收区域,和
v.任选的操持区域,
其中设备中所述近端和所述检测区域之间的部分包含选自甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和羟乙基纤维素的化合物。
在本文中使用时,“固体支撑物”是指用于为测试设备的不同区域提供支撑的材料。当用于根据本发明的测试设备时,固体支撑物通常由相对于测试设备将用于的应用而言是惰性的材料制成。合适的材料是玻璃、金属和多种类型的塑料,例如聚苯乙烯。固体支撑物可具有0.1mm和1mm之间的厚度。在一种实施方式中,测试设备可存放在非吸收性套或层压材料套中。换句话说,测试设备包括限定细长腔的外壳,用于接收和容纳测试设备。合适的外壳是本领域技术人员已知的。
可遵循已知的技术(比如胶合、热压缩等),将区域附到背衬上。
本发明的测试设备通常具有在10mm和200mm之间,优选地在20mm和150mm之间,更优选地在30mm和100mm之间,和特别地在50mm和75mm之间变化的长度;在1mm和20mm之间,优选地在2mm和15mm之间,更优选地在3mm和10mm之间变化的宽度,和在0.05mm和2mm之间,优选地在0.075mm和1.5mm之间,更优选地在0.1mm和1mm之间变化的厚度。
当在4℃下存储时,本发明的测试设备具有至少6个月,优选地至少9个月的货架期。在另一实施方式中,当在-20℃下存储时,本发明的测试设备具有长达10天,优选地长达20天和更优选地长达28天的货架期。仍在另一实施方式中,当在30℃下存储时,本发明的测试设备具有长达1天,优选地长达4天和更优选地长达7天的货架期。在本文中使用时,“货架期”意思是存储的测试设备的灵敏度不下降。换言之,存储的测试设备的灵敏度等于新制备的测试设备的灵敏度。
在一种实施方式中,可在-20℃和30℃之间的温度下存储测试设备。优选地,在4℃和8℃之间的温度下存储测试设备。
在本文中使用时,“样品接收区域”是指被用来与液体组合物直接接触的测试设备的部分。样品接收部分由多孔材料制成。在一种优选的实施方式中,样品接收区域由孔径为3-8μm的材料制成。优选地,样品接收区域是结合聚乙烯醇的玻璃纤维膜,比如Whatman VF2膜。
在本文中使用时,“缀合物区域”是指与样品接收区域和检测区域以侧向流接触的测试设备的部分。接触可以是端端连接,但是优选地在样品接收区域和缀合物区域之间和/或在缀合物区域和检测区域之间有重叠。缀合物区域可以由多孔材料制成,所述多孔材料例如玻璃(微)纤维、聚乙烯和聚酯。
在本文中使用时,“检测区域”是指与缀合物区域和吸收区域以侧向流接触的测试设备的部分。接触可以是端端连接,但是优选地在检测区域和缀合物区域之间和在检测区域和吸收区域之间有重叠。重叠可在1mm和2mm之间。检测区域由多孔材料制成。检测区域包括至少一个用于检测抗生素存在与否的检测带和起对照位点作用的对照带。检测区域可具有两个或更多个检测带和/或两个或更多个对照带。检测带可具有相同的功能性或可具有不同的功能性(即,处于不同检测带的受体可以能够结合相同的化合物或可以能够结合不同化合物)。对照带同样如此。一个或更多个带可由与检测区域不同的多孔材料制成。分开的带可由不同的多孔材料制成。优选地它们由相同的材料制成。优选地,一个或更多个带由与检测区域相同的材料制成。当液体组合物移动经过检测区域时,其可首先与检测带接触,然后与对照带接触,或反之亦然。如果检测区域具有若干个检测带和/或对照带,则可提供任何顺序的带。带可为各种构造,包括线、点或其他构造。在一种优选的实施方式中,带是线。
在本文中使用时,“侧向流”是指材料中样品的液体流,其中所有溶解的和/或分散的样品组分以基本上相等的速率被运输并且相对未受损害地侧向流过材料。
检测带和对照带各自可包含至少一种固定化的结合剂。优选地,通过凭借共价键合或其他结合方法将适当的结合剂或结合剂的混合物应用到检测区域来制造检测带和对照带。在本文中使用时,“结合剂”是指可用于在检测带和/或对照带中产生所需功能性的任何试剂。可通过已知的方法将结合剂应用(固定)到检测区域,所述方法比如喷射、分散、涂抹、拉伸、印刷、条纹化(stripping)等。根据结合剂和其结合伴侣之间存在或不存在络合,所述带能够产生信号,例如视觉色彩信号。在本领域中,“结合剂”有时也被称为“受体”(不要与标记的受体混淆)。类似地,“固定化的结合剂”也可以被称为“固定化的分析物”。
结合剂可以是任何天然或非天然化合物。合适的结合剂的例子是抗生素、抗体、抗原、配体、蛋白质等等。在根据本发明的测试设备的检测带的结合剂(能够结合标记的受体)可以是抗生素或其类似物,其可以以1-3mg/mm的浓度固定在检测带。优选地,当固定在检测带时,抗生素或其类似物存在于Tris缓冲液中。合适的抗生素或其类似物的例子是β-内酰胺抗生素,例如头孢菌素,例如7-氨基-头孢烷酸(7ACA)、链霉素和四环素。优选地,抗生素或其类似物被固定在测试设备上,并且当所述标记的受体未被来自样品的抗生素结合时,抗生素或其类似物能够结合标记的受体。当标记的受体被来自样品的抗生素结合时,固定化的抗生素不能结合标记的受体。
在一种实施方式中,在根据本发明的测试设备的对照带的结合剂(能够结合标记的对照试剂)是结合对(例如特异性结合对,比如抗原/抗体对)的成员。但是,其也可以是抗体结合蛋白,例如蛋白A。当应用至对照带时,结合剂(能够结合标记的对照试剂)可存在于溶液中,所述溶液包含额外的蛋白质例如牛血清白蛋白,糖例如二糖(比如蔗糖),和盐比如NaCl。在一种实施方式中,在对照带的结合剂(能够结合标记的对照试剂)不能结合样品中的分析物和/或标记的受体,无论分析物受体是否结合了分析物均是如此。
可以以本领域已知的方式,例如通过共价或非共价吸附至检测区域,将结合剂固定到检测区域上。结合剂也可通过载体例如牛血清白蛋白(BSA)共价缀合到检测区域。任选地,结合剂可经由间隔物偶联到载体。许多双官能化合物适于作为间隔物。可应用对构造键而言可用的所有方法,例如偶联技术,例如从肽化学已知的那些技术,除非它们对结合剂有害。合适的间隔物、载体和偶联技术是本领域技术人员公知的。
无论分析物是否存在于样品中,对照带都产生信号并且按照需要给出测试设备运行的指示。对照带提供不随着样品中分析物的浓度变化的一致信号。对照带也可用于通知使用者液体组合物已经流过测试设备。在该意义上,对照带可用作流动对照。此外,对照带可用于与检测带比较。
在本文中使用时,“吸收区域”指测试设备的下述部分,其与检测区域以侧向流接触并起着促进侧向流经过检测区域的作用,并且能够吸收过量的液体样品。接触是端端连接,但是优选地是检测区域和吸收区域之间的重叠。重叠可在1mm和2mm之间。吸收区域由多孔材料制成。在一个优选的实施方式中,吸收区域是至少1cm。
在本文中使用时,“操持区域”是指可用来握持并操作测试设备而不妨碍测试结果的测试设备的区域。操持区域可以是与固体支撑物连接的分开的区域,但操持区域也可以是固体支撑物自身的一部分。如果期望的话,操持区域和吸收区域也可组合成一个区域。
在本发明的另一实施方式中,测试设备包括覆盖样品接收区域、检测区域和吸收区域中的一个或更多个的元件。所述元件可由任何材料、优选透明塑料材料制成,其有利地为所述区域提供关于指纹和/或机械毁坏和/或烟雾等的保护。可用单个元件覆盖一个或更多个区域,但也可使用任选地不同材料的多个元件。
在本文中使用时,“多孔材料”是指能够提供侧向流的任何材料。合适的多孔材料的例子是聚合材料(比如聚乙烯或聚酯)、棉花、玻璃纤维、硝酸纤维素、硝酸纤维素和聚合材料的掺混物、尼龙、纸、人造丝(rayon)等。
在一种实施方式中,测试设备包括比吸收区域长的检测区域、比操持区域长的吸收区域和比样品接收区域长的操持区域。
通过本领域技术人员已知的方法制造根据本发明的测试设备。固体支撑物可具有卡片(card)的形式。它们可例如使用可商业获得的层压机制备。卡片可被层压。在卡片上可附上各种区域。在组装卡片之前或之后,将结合剂以溶液形式沉积在检测区域上。这些溶液可使用可商业获得的装置(比如来自BioDot,Inc.的分散器)非常精确地沉积。在应用检测带和/或对照带之前和/或之后,可通过例如喷射封闭液来封闭检测区域。优选的封闭液包括缓冲液,例如有机缓冲液,比如Tris缓冲液,表面活性剂,例如Tween,比如Tween-20,和蛋白质,比如牛血清白蛋白。优选地,封闭液不直接喷射在检测带和/或对照带上。例如,通过将卡片放置在热空气流中,可以使沉积的溶液立即蒸发。在已经应用所有的区域和带之后,优选地在干燥气氛(即相对湿度<50%、<40%、<30%、<20%、<10%、优选地为0%的气氛)中干燥卡片。对于大规模生产,也可以制备卷筒(roll)。随后,可将带有期望受体的卡片和卷筒切割成条,这些条的每一个构成根据本发明的测试设备。或者,结合剂也可沉积在检测区域上,然后通过简单地将检测区域浸在含结合剂的溶液中来组装卡片或卷筒。
甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和/或羟乙基纤维素可以通过将水性悬浮液施用到设备(例如,通过滴涂或喷涂)而施用到设备。甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素和/或羟乙基纤维素可与标记的受体一起施用到设备。
在第三方面,本发明还涉及试剂盒,其包含容纳样品的容器和根据本发明的测试设备。容器可以含有化合物,例如缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)和表面活性剂例如Tween 20。
测试设备优选地存储在包括干燥剂的包装中。优选地,试剂盒包括多于一个容器和多于一个测试设备,例如10、20、30、40、50或甚至100个容器和/或测试设备。根据本发明的试剂盒还可包括取样设备。取样设备是这样的设备:借助于该设备,可将样品(例如液体样品)加入容器中。例子包括但不限于,容器(任选地具有体积记号)、注射器、移液器或自动移液系统。这种注射器或移液器可以设计为使得仅用一种操作模式就能够从待分析的液体样品中取出预定的体积。任选地,可使用本领域已知的下述系统,用所述系统用单次操作就可操作多于一个注射器或移液器。在试剂盒包括取样设备比如移液器的情况下,其可额外地包括移液器头(pipette tip)。优选地,移液器头的量等于容器(即,其中存在标记的受体和标记的对照试剂的容器)和测试设备的量。以该方式,仅用一个移液器就可将不同的样品应用到不同的容器中。如果试剂盒包括一次性移液器作为取样设备,则一次性移液器的量等于容器(即,其中存在标记的受体和标记的对照试剂的容器)和测试设备的量。
任选地,试剂盒进一步包括使用说明书的插入物(insert)和/或设定孵育所需时间的工具。任选地,试剂盒进一步包括恒温设备,比如孵育器或水浴,借助于所述恒温设备,样品可保持在预先设定的温度下,比如液体样品、标记的受体、标记的对照试剂和任选的测试设备应被孵育的温度下。优选地,所述恒温设备以下述方式设计,所述方式使得其可容纳装有标记的受体、标记的对照试剂、液体样品和任选地测试设备的容器。任选地,恒温设备与设定孵育所需时间的工具偶联,使得在预先设定的时间过后停止加热。任选地,试剂盒也包括样品读取设备、载有计算机程序的数据载体,所述计算机程序适于指导计算机分析从样品读取设备获得的数字数据。
上文针对本发明方法公开的实施方式和特征也与本发明的测试设备和试剂盒有关。上文针对本发明测试设备公开的实施方式和特征也与根据本发明的方法和试剂盒有关。上文针对本发明试剂盒公开的实施方式和特征也与根据本发明的测试设备和方法有关。
实施例
实施例1
制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂
通过使胶体金(直径40nm;1OD/ml)与10μg/ml链霉亲和素反应来合成涂有链霉亲和素的金颗粒。接下来,将获得的溶液通过切向流过滤来浓缩,洗涤并存储在包含NaN3的Tris缓冲液(pH 8)中。用D-生物素基-ε-氨基己酸-N-羟基丁二酰亚胺酯生物素化从Bacillus stearothermophilus纯化的青霉素结合蛋白(1:4)。接下来,通过使1.5μg生物素化的青霉素结合蛋白与1OD涂有链霉亲和素的金颗粒反应1小时来合成青霉素结合蛋白-金缀合物,随后以10,000xg离心5分钟,并将获得的沉淀物重新悬浮在包含0.1%w/v TritonX-100(pH 9.6)的45mM碳酸氢盐缓冲液中。
通过使胶体金(直径40nm;1OD/ml)与10μg/ml IgY反应来合成涂有IgY的金颗粒。接下来,以7,500xg离心获得的溶液10分钟,并将获得的沉淀物重新悬浮在Tris缓冲液(pH8)中,通过另一轮的离心来进行洗涤和将获得的沉淀物重新悬浮在Tris缓冲液(pH 8)中,并存储在包含NaN3的Tris-缓冲液(pH 8)中。
制备测试设备
检测和对照区
使用硝酸纤维素膜(Sartorius CN95;长42mm)作为检测区。将该膜胶合至聚苯乙烯层压卡距卡片近端17mm处。
将检测带和对照带应用到硝酸纤维素膜上。使用前线(frontline)为0.2μI/cm(距近端31mm处)的Biodot Dispense工作站XYZ 3050,通过将1mg/ml的7ACA-间隔物-IgG缀合物分散在20mM KPO4-缓冲液(pH 7.5)中,来应用检测带。用前线为0.8μI/cm(距卡片近端36mm处)的Biodot Dispense工作站XYZ 3050,通过将0.15mg/ml的抗IgY抗体分散在包含0.675mg/ml BSA、5%w/v蔗糖和20mM NaCI的20mM KPO4-缓冲液(pH 7.5)中,来应用对照带。在37℃下在干燥气氛(0%相对湿度)中干燥获得的卡片。
缀合物垫
通过应用含有金标记的抗生素结合蛋白和金标记的对照试剂(参见实施例1)、40mM Tris(pH7.4)、10%蔗糖、1mgmL-1BSA、1%Tween-20和羟乙基纤维素(HEC)的悬浮液来制备缀合物垫(Porex PE,长0.85cm)。利用含有0%HEC(变体1)、0.25%HEC(变体2)或0.5%HEC(变体3)的悬浮液来产生三种变体。使用Biodot Dispense工作站XYZ 3050,利用以5μL/cm操作的空气喷射,将悬浮液喷到缀合物垫上。在环境温度下在干燥气氛(0%相对湿度)下干燥获得的缀合物垫。
组装
将缀合物垫胶合至聚苯乙烯层压卡距卡片近端8.5mm处,与硝酸纤维素膜重叠2mm。将样品接收区域(Millipore VF2,长8.5mm)胶合在卡片近端,与缀合物垫重叠2mm。
将吸收区域(来自Millipore的10038膜;长18.5mm)胶合在卡片远端,在硝酸纤维素膜上重叠2mm。将卡片切割成宽5.4mm的条并且保持在干燥气氛(0%相对湿度)中。
上述3种变体中HEC的量分别为每个测试设备0μg、6.6μg和13.2μg。
用测试设备检测抗生素
在含有干燥缓冲液(终浓度:1%Tween 20,50mM KPO4-缓冲液(pH 8))的管中加入150μl乳样品(不含抗生素或加入了PenG)并混合30秒。加入的乳中青霉素G的浓度为0ng/g或4ng/g。将含有获得的液体组合物的管置于64℃的加热块中,将测试设备加入管中并在64℃下孵育7分钟。孵育后,将测试设备从管中取出并使用读取器(Qiagen ESEQuant侧向流读取器)读取。结果显示在下表中。
结果显示:将羟乙基纤维素应用于缀合物垫提高了测试设备的灵敏度。具有含0.25%HEC和0.50%HEC的缀合物垫的设备显示出因测试样品中存在的4ppb PenG的越来越大的信号减弱。
Claims (12)
1.一种检测液体组合物中的分析物的方法,所述方法包括:
a)提供具有近端和远端的测试设备,所述测试设备被配置为允许从所述近端到所述远端的侧向流,所述测试设备包括固体支撑物,所述固体支撑物以从所述近端至所述远端的顺序包括以下区域:
i.样品接收区域,
ii.缀合物区域,所述缀合物区域包含标记的对照试剂和能够结合所述分析物的标记的受体,
iii.检测区域,所述检测区域包括至少两种带:
A.检测带,其包含固定化的结合剂,当所述标记的受体未被来自所述样品的分析物结合时,所述固定化的结合剂能够结合所述标记的受体,和
B.对照带,其包含能够结合所述标记的对照试剂的固定化的结合剂,
iv.吸收区域,
b)使所述液体组合物与所述测试设备的样品接收区域接触,
c)允许所述液体组合物从所述样品接收区域通过所述缀合物区域和检测区域移动至所述吸收区域,从而允许包含所述标记的受体和标记的对照试剂的所述液体组合物接触所述检测带和对照带,
d)检测在所述检测带的信号和在所述对照带的信号,其中
i.在所述检测带存在比在所述对照带的信号更强的信号指示样品中不存在分析物,和
ii.在所述检测带不存在信号或在所述检测带存在比在所述对照带的信号更弱的信号指示样品中存在分析物,
其中所述缀合物区域包含羟乙基纤维素。
2.根据权利要求1所述的方法,其中设备中所述近端和所述检测区域之间的所述部分不包含硝酸纤维素和/或乙酸纤维素。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述分析物是β-内酰胺抗生素、四环素抗生素和/或链霉素抗生素。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述羟乙基纤维素的量介于0.5μg和100μg之间。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述测试设备是测试条。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述固定化的结合剂通过间隔物-蛋白质缀合物与所述固体支撑物结合。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述测试设备在40℃-70℃的温度下与所述液体组合物接触1-10分钟。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述液体组合物是乳。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中与所述样品接收区域接触的所述液体组合物的体积介于50μl和500μl之间。
10.一种检测液体组合物中的分析物的测试设备,所述设备具有近端和远端,所述测试设备被配置为允许从所述近端到所述远端的侧向流,所述测试设备包括固体支撑物,所述固体支撑物以从所述近端至所述远端的顺序包括以下区域:
i.样品接收区域,
ii.缀合物区域,所述缀合物区域包含能够结合所述分析物的标记的受体,
iii.检测区域,所述检测区域包括至少两种带:
A.检测带,其包含固定化的结合剂,当所述标记的受体未被来自所述样品的分析物结合时,所述固定化的结合剂能够结合所述标记的受体,和
B.对照带,其包含能够结合标记的对照试剂的固定化的结合剂,
iv.吸收区域,
其中所述缀合物区域包含羟乙基纤维素。
11.一种试剂盒,其包括包含缓冲液的容器和根据权利要求10所述的测试设备。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其还包括移液器和/或手册。
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