CN110779905A - 一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法 - Google Patents

一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法，涉及生物检测技术领域。其包括共轭垫，共轭垫上含有金纳米棒和拉曼分子，拉曼分子修饰于金纳米棒的表面，制备共轭垫所用的金纳米棒的局域表面等离子体共振峰(LSPR)可以根据需要自由调整。试纸条具有大散射截面和明显的拉曼散射峰且没有荧光干扰，具有灵敏度高、特异性好的优点。该试纸条使用该方法简单，检测速度快，检测范围广。

Description

一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方 法及使用方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法。
背景技术
癌症是世界上最具生命威胁的疾病之一，由于它的症状通常要到末期才会出现，所以由癌症导致的死亡率较高。因此，癌症的早期诊断可以指导积极治疗并提高患者的生存率。其中癌症生物标志物的检测已成为癌症的早期诊断的最有前途的方法之一。肿瘤发生和治疗反应的关键指标是癌症生物标志物浓度在人类生物标本如血清，血液，尿液，或唾液等中的变化。目前用于肿瘤生物标志物检测的方法主要有化学发光免疫法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法、电化学免疫分析法等，但这些方法均存在着操作繁琐、检测时间长、费用高等缺点。上述缺陷阻碍了现有的标志物检测方法在医疗点检测的广泛应用。对于肿瘤标志物的诊断，建立灵敏、方便的检测方法显得极为必要。
侧流免疫分析法(LFIA)具有操作简单、分析速度快、成本低等优点，然而传统的免疫侧流分析以胶体金为标记，依赖色度信号，具有灵敏度低、有限的定性和半定量的缺点。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种高灵敏度的有效检测工具，它可以解决传统免疫侧流分析的局限性。但是现有基于SERS的金或银纳米颗粒的局域表面等离子体共振峰(LSPR)在400-600nm之间，与通常使用的785nm激发波长不匹配，因此，在SERS信号增强性能方面并不理想。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条，其包括共轭垫，共轭垫上含有金纳米棒和拉曼分子，拉曼分子修饰于金纳米棒的表面，制备共轭垫所用的金纳米棒的局域表面等离子体共振峰(LSPR)可自适应调整。
在本发明应用较佳的实施例中，上述金纳米棒的表面还修饰有牛血清白蛋白，牛血清白蛋白通过羧基端肽链与检测抗体的氨基端肽链偶联；
优选的，检测抗体为肿瘤标志物检测抗体；
优选的，检测抗体为鼠抗人甲胎蛋白检测抗体。
该试纸条包括共轭垫，在共轭垫上含有金纳米棒，在金纳米棒表面修饰有拉曼分子和牛血清白蛋白。拉曼分子作为拉曼报告分子，用于反馈在激发光下最大表面增强拉曼散射的信号。牛血清白蛋白(BSA)具有增强金纳米棒的稳定性的作用，防止金纳米棒彼此相互聚集，影响金纳米棒的性能。发明人经验证发现，修饰有BSA的金纳米棒能在较高的盐离子强度和杂质环境下保持活性。在金纳米棒表面修饰牛血清白蛋白以增强金纳米棒在生物样品中的高稳定性，防止金纳米棒彼此相互聚集，影响金纳米棒的性能。
检测抗体通过氨基与BSA的羧基进行偶联，检测抗体可以实现抗原(肿瘤标志物)的特异性结合，抗原又可以与硝酸纤维素膜上的抗体特异性结合，进而实现对捕获抗原的金纳米棒复合物进行定性和定量的检测。
本发明创造性的发现，通过控制硝酸银的含量可以实现制备共轭垫所用的金纳米棒的局域表面等离子体共振峰的调节。这样可以满足常规的785nm激发波长的需求，从而使得表面增强拉曼散射信号增加更为明显，有利于对低含量的生物标志物的检测。
本发明提供的试纸条通过在共轭垫上包被肿瘤标志物检测抗体，从而实现抗原肿瘤标志物的拦截，检测抗体优选为鼠抗人甲胎蛋白检测抗体。
在本发明应用较佳的实施例中，上述金纳米棒的局域表面等离子体共振峰在690-825nm；
优选的，金纳米棒的局域表面等离子体共振峰在785nm。
硝酸银的含量在0.35ml时，此时金纳米棒的局域表面等离子体共振峰(LSPR)在785nm处。若硝酸银含量大于或小于0.35ml均会导致金纳米棒的局域表面等离子体共振峰(LSPR)偏离785nm，从而导致表面增强拉曼散射(SERS)信号增加不明显。
在本发明应用较佳的实施例中，上述拉曼分子为DTNB，MBA，DTTC或PATP；
优选的，拉曼分子为DTNB。
本实施例中优选DTNB(5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))作为拉曼分子，抗体和抗原中含巯基化合物可以与DTNB反应断裂DTNB的二硫键产生2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB-)，若在中性或碱性pH条件下的水中可以离子化，生成NTB2-二价阴离子。这种NTB2-离子呈现黄色。可以在可见光或紫外光谱下定量检测。
在本发明应用较佳的实施例中，上述硝酸纤维素膜(NC膜)上涂覆有指示抗体和捕获抗体分别形成质控线和检测线；
优选的，指示抗体为Y抗X抗体，捕获抗体为X抗人肿瘤标志物，X为单克隆抗体，Y为多克隆抗体；
优选的，X来源于小鼠或大鼠，Y来源于羊、兔或马；
优选的，捕获抗体为鼠抗人甲胎蛋白捕获抗体，指示抗体为羊抗鼠IgG，(抗体包被膜为NC膜)。
当目标抗原滴加至样品垫上时，抗原在毛细管作用力下经过共轭垫，与共轭垫上的检测抗体特异性结合，继续沿着硝酸纤维膜向吸水纸方向移动，经过检测线(T线)，结合有金纳米棒的抗原与检测线上的捕获抗体特异性结合，剩余结合有金纳米棒的抗原与指示抗体特异性结合，从而使得检测线和质控线有条带产生。指示抗体必须配对检测抗体的同型，指示抗体的宿主物种应不同于检测抗体。
一种使用上述试纸条进行肿瘤标志物检测的方法，方法不涉及疾病的治疗和诊断，其包括如下步骤：将待测样本置于样品垫上。
当待测样本不含有目标抗原(肿瘤标志物)时，样本在毛细管作用力下进入共轭垫，毛细管作用使得共轭垫上的纳米棒(AuNRs@BSA@Antibody)进入到检测线区域，AuNRs@BSA@Antibody由于不含抗原，无法与抗体包被膜上的捕获抗体特异性识别，因此，检测线无条带产生，AuNRs@BSA@Antibody与指示抗体特异性结合，从而使得质控线有条带产生。
在本发明应用较佳的实施例中，上述方法还包括用拉曼光谱仪记录检测线的表面增强拉曼散射信号或者肉眼观察检测线的条带颜色；
优选的，拉曼光谱仪的激发波长为785nm。
进行定量分析时，需要进行表面增强拉曼散射(SERS)信号检测。
一种试纸条的制备方法，其包括如下步骤：将金纳米棒用拉曼分子进行修饰制得修饰有拉曼分子的金纳米棒(AuNRs-拉曼分子)。
上述制备方法还包括用修饰有拉曼分子的金纳米棒(AuNRs-拉曼分子)制备共轭垫，再将已致敏的硝酸纤维素膜、所述共轭垫、样品垫和吸收垫在PVC底板上依次组装；
优选的，制备共轭垫的方法包括在修饰有拉曼分子的金纳米棒(AuNRs-拉曼分子)表面进行牛血清白蛋白的包覆得到包覆有牛血清白蛋白的金纳米棒(AuNRs@BSA)，再将检测抗体与包覆有牛血清白蛋白的金纳米棒偶联制得偶联有抗体的金纳米棒(AuNRs@BSA@Antibody)，然后将偶联有抗体的金纳米棒用金标稀释液滴加在金标结合垫上制得共轭垫。
在本发明应用较佳的实施例中，上述制备方法还包括金纳米棒的制备，金纳米棒的制备包括在每40ml的含金纳米材料的CTAB溶液中添加0.8ml的氯金酸、0.3-0.35ml0.01M的硝酸银、0.4ml的盐酸、0.32ml的抗坏血酸和0.11ml种子液。本发明多次实验得出，金纳米棒的拉曼信号的强度最佳的硝酸银加入量为每40ml的CTAB溶液中添加0.35ml0.01M的硝酸银，此时金纳米棒的长径比最佳。若硝酸银的添加量大于或小于上述的量，则制得的金纳米棒尺寸过长或过短，将会使制备共轭垫所用的金纳米棒的局域表面等离子共振峰发生偏离，从而无法与给定的激发波长相匹配，进而降低共振增强效果，检测灵敏度下降。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条，该试纸条包括共轭垫，共轭垫上含有金纳米棒和拉曼分子，纳米棒尖端附近的稳定热点及其等离子体峰的局部化，使纳米棒具有较强的拉曼散射增强作用，硝酸银的含量影响金纳米棒的局域表面等离子体共振峰，从而根据激发波长的需要进行调节共振峰。这样有利于金纳米棒在激发波长范围处的局域表面等离子体共振峰(LSPR)与激发波长相匹配，产生最大的等离子体耦合效应，进而提升共振增强效果。在该等离子共振峰下，也可以减少生物样品的损失。本发明还提供了一种试纸条的制备方法和使用方法，该制备方法制备出的试纸条具有大散射截面和明显的拉曼散射峰且没有荧光干扰，具有灵敏度高、特异性好的优点。该试纸条使用该方法简单，检测速度快，检测范围广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为金纳米棒的制备过程(a)和试纸条的检测原理图(b)；
图2为不同合成条件AuNRs的TEM图片、不同长径比下的金纳米棒的紫外-可见光谱和SERS强度图；
图3为验证BSA包被的金纳米棒制备的SERS标记的稳定性试验结果图；
图4为SERS-LFIA试纸条的分析性能图；
图5为对比例采用金纳米球作基底时的紫外-可见光谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条的制备方法。制备过程及检测原理参照图1所示，试纸条的制备方法具体包括如下步骤：
(1)称取182.5mg的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，加入5mL去离子水，在29℃水浴锅中搅拌，再加入42μL氯金酸(1％)和新鲜配制的硼氢化钠溶液300μL(0.01M)(溶液立即从黄色变成棕黄色)继续搅拌1min后，关闭搅拌，继续老化1h得到种子溶液。
(2)在40mL去离子水中加入1.46g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，超声使其完全溶解。然后依次在溶液中加入800μL氯金酸(1％)、0.35mL硝酸银(0.01M)、0.4mL盐酸(2M)和0.32mL的抗坏血酸(0.1M)，轻轻的上下颠倒混匀直至溶液变为无色，最后加入110μL步骤(1)中的种子溶液，29℃水浴12h得到金纳米棒溶液(AuNRs)。
(3)进行拉曼分子DTNB的修饰。将步骤(2)得到的金纳米棒溶液离心，再用去离子水水洗两次，浓缩为10mL。称取5，5‘-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)4mg溶于1mL的无水乙醇中得到10mM的DTNB乙醇溶液。在浓缩的金纳米棒溶液中加入20μL的DTNB乙醇溶液超声修饰1h，离心去除上清，用去离子水重悬，得到AuNRs-DTNB溶液。
(4)BSA的包覆。取1mL AuNRs-DTNB溶液，加入100μL BSA(1％)和1.5μL的戊二醛水溶液(25％)震荡4h，离心去除上清，再加入1mL甘氨酸溶液(0.01M，pH8.0)震荡30min去除多余的醛基，得到AuNRs@BSA。
(5)抗体的修饰。称取1.9mg的N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于0.4mL的去离子水中，取100μL与AuNRs@BSA溶液混匀并震荡30min，对BSA的羧基端进行活化。活化好的AuNRs@BSA离心，用BBS溶液重悬，加入20μg的检测抗体(鼠抗人甲胎蛋白检测抗体，购自Fitzgerald)震荡2h使抗体的氨基端与BSA的羧基端偶联，最后加入100μL的BSA封闭未偶联的羧基。将修饰抗体后的金纳米棒(AuNRs@BSA@Antibody)离心，再置于含有5％蔗糖、3％D-海藻糖、1％BSA、0.3％PVP和0.5％吐温-20的缓冲溶液中，混匀，用移液枪滴加在金标结合垫上，37℃烘箱烘3h得到共轭垫。
(6)基于SERS的免疫层析试纸条(SERS-LIFA)的制备。SERS-LIFA试纸条是由NC膜、样品垫、共轭垫和吸收垫组成。在NC膜上用Biodt xyz 5050喷雾平台分别将山羊抗小鼠IgG(0.8mg/mL，购自(上海)生工生物工程股份有限公司)和鼠抗人甲胎蛋白捕获抗体(0.6mg/mL，购自Fitzgerald)喷洒形成质控线和检测线。两种抗体都用缓冲液(1XPBS，pH 7.4)以1μL cm-1的速度在NC膜上喷涂。将喷涂完成的NC膜在37℃孵化器中干燥3h，组装并切割成3.0mm宽的SERS-LFIA试纸条，并储存在干燥的密封容器中备用。
实验例1
使用不同浓度的硝酸银合成金纳米棒(AuNRs)的进行电镜观察。结果参照图2所示，a图采用0.25ml 0.01M的硝酸银合成金纳米棒，b图采用0.3ml 0.01M的硝酸银合成金纳米棒，c图采用0.35ml 0.01M的硝酸银合成金纳米棒，d图采用0.4ml 0.01M的硝酸银合成金纳米棒。由图2可知，随着AgNO3浓度的增加，制得的金纳米棒长径比增大。
进一步测量了不同长径比的AuNRs的紫外-可见光谱，参照图2中的e图所示，随着AgNO3浓度的增加，所得AuNRs的局域表面等离子共振峰(LSPR)逐渐红移到近红外区。具有不同长径比的AuNR的LSPR波长分别为690、740、785和825nm(不同AuNR表示为AuNR-690、AuNR-740、AuNR-785和AuNR-825)。
用相同浓度的DTNB分子对合成的AuNR进行了修饰，直接比较合成的AuNR的SERS信号。结果参照图2中的f图所示，等离子体峰与785nm激光激发波长共振的AuNR-785的SERS强度是其它三种AuNR的两到三倍。即采用局域表面等离子体共振峰在785nm的金纳米棒具有更高的SERS强度。
实验例2
本实验例对BSA包被的金纳米棒制备的SERS标记的稳定性进行了试验。实验结果参照图3所示，图3中a图和b图为用HRTEM对BSA的涂层进行了研究。AuNR-DTNB为没有进行BSA包被的金纳米棒。通过对AuNR-DTNB(a图)和AuNR@BSA(b图)的HRTEM图像的比较，发现BSA的厚度约为4nm，分布在AuNR-DTNB周围。
c图中的SEM图像显示所制备的AuNR@BSA具有良好的分散性。
图3中的d图为当加入不同浓度的NaCl(10-1000mM)时，AuNR-DTNB溶液的颜色变得无色，说明AuNR-DTNB已经团聚，而AuNR@BSA的颜色在高盐情况下仍保持稳定。
图3中的e图为在不同的NaCl水溶液中，AuNR@BSA的紫外-可见光谱无明显变化，也表明了AuNR@BSA的稳定性。而AuNR-DTNB的紫外-可见光谱吸收峰基本消失。
图3中的f图为测定了纳米颗粒的Zeta电位，经过甲胎蛋白(AFP)抗体修饰后，Zata电位从AuNR@BSA的-34.5mV增加到+15.4mV，确定了BSA的包覆和抗体在AuNR@BSA表面的成功结合。
实验例3
将AFP(甲胎蛋白)抗原用缓冲液从500ng/mL至0.01ng/mL梯度稀释，同时以含有1％吐温-20和20％胎牛血清(FBS)的PBS溶液作为空白对照。将70μ上述稀释好的含不同浓度抗原的溶液滴加到试纸条的样品垫上。溶液通过毛细作用沿着NC膜迁移到吸收垫。试纸条干燥后，用便携式拉曼光谱仪，激光功率为10mV，积分时间为10s记录SERS信号强度。
图4为SERRS-LFIA试纸条的分析性能图。图4中的a图为不同浓度的AFP(500ng/mL至0ng/mL)下测试的试纸条的照片。在T线上观察到了暗带。颜色随AFP浓度的降低而逐渐减弱。肉眼观察的灵敏度为10ng/mL。
图4中的b图显示了对应于不同浓度AFP的SERS光谱。来自DTNB的SERS信号随着AFP浓度的降低而逐渐降低。拉曼检测灵敏度可达到0.01ng/mL。
图4中的c图根据甲胎蛋白浓度和测试线1328cm-1处的SERS强度，建立了基于AuNR的SERS条的校准曲线。误差线为测量五次所得。
图4中的d图、e图和f图使用胶体金制备SERS标签，肉眼观察的灵敏度为10ng/mL，拉曼检测灵敏度为1ng/mL。由图4中的e图和f图可知，胶体金制备的SERS标签灵敏度低于本发明提供的试纸条灵敏度，且线性较差。
实验例4
采用购买的商业化ELISA试剂盒进行免疫检测，该试剂盒原理是基于固相夹心酶免疫测定技术。首先，对人AFP/甲胎蛋白特异的单克隆抗体预先包被在孔板里。然后，将标准品和样品添加到孔中，样品中存在的人AFP/甲胎蛋白(AFP)与被固定的抗体结合。孵育后，洗涤孔板并加入辣根过氧化物酶偶联的抗人类AFP/甲胎蛋白抗体，反应结合后产生抗体-抗原-抗体“三明治复合物”。再次洗涤，去除多余的未结合的抗体后，加入TMB底物溶液(颜色因人类AFP/甲胎蛋白的含量不同而不同)。最后添加终止溶液来终止反应，在450nm处测量吸光度。
使用试剂盒进行免疫检测的实验步骤如下：
(1)准备所有试剂，包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液、检测抗体、底物溶液、终止液、标准品和样品。
(2)洗板：用1×洗涤缓冲液(300μL/孔)洗板三次，拍干酶标板。
(3)样本孵育：加入标准品和待测样本，100μL/孔，15分钟内完成，室温孵育2小时。
(4)洗板：弃去孔中液体，加入1×洗涤缓冲液(300μL/孔)洗板三次，拍干酶标板。
(5)酶标检测抗体孵育：将预先配制至工作浓度的检测抗体加入酶标板中，100μL/孔，混匀，室温孵育1小时。
(6)洗板：弃去孔中液体，加入1×洗涤缓冲液(300μL/孔)洗板三次，拍干酶标板。
(7)显色：将预先配制的底物液加入酶标板中，200μL/孔，混匀，室温避光孵育20分钟。
(8)终止：加入50μL/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。
(9)读值：20分钟内读取450nm的光吸收值。
图4中的g图和h图为ELISA试剂盒检测结果，检测限为0.1ng/mL。图4中的结果表明，用AuNRs制备SERS标签的SERS-LFIA试纸条测得的甲胎蛋白的检测限为9.2pg/mL，其灵敏度是AuNP纳米标记法的100倍，是商品化的ELISA法的10倍。
对比例
对比例采用金纳米球作基底，替换实施例1中的金纳米棒，其余步骤和制备条件与实施例1相同，其紫外吸收峰如图5所示，吸收峰在533nm处。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条，其特征在于，其包括共轭垫，所述共轭垫上含有金纳米棒和拉曼分子，所述拉曼分子修饰于所述金纳米棒的表面，制备所述共轭垫所用的金纳米棒的局域表面等离子体共振峰可自适应调整。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述金纳米棒的局域表面等离子共振峰在690-825nm之间；
优选的，所述金纳米棒的局域表面等离子共振在785nm。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述拉曼分子为DTNB，MBA，DTTC或PATP；
优选的，所述拉曼分子为DTNB。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述金纳米棒的表面还修饰有牛血清白蛋白，牛血清白蛋白通过羧基端肽链与检测抗体的氨基端肽链偶联；
优选的，所述检测抗体为肿瘤标志物检测抗体；
优选的，所述检测抗体为鼠抗人甲胎蛋白检测抗体。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括PVC底板、抗体致敏的硝酸纤维素膜、样品垫和吸水纸，在所述的PVC底板上，依次粘贴已抗体致敏的硝酸纤维素膜、金标共轭垫、样品垫和吸水纸；
优选的，抗体包被膜上涂覆有指示抗体和捕获抗体分别形成质控线和检测线；
优选的，所述指示抗体为Y抗X抗体，所述捕获抗体为X抗人肿瘤标志物，X为单克隆抗体，Y为多克隆抗体；
优选的，所述X来源于小鼠或大鼠，所述Y来源于羊、兔或马；
优选的，所述捕获抗体为鼠抗人甲胎蛋白捕获抗体，所述指示抗体为羊抗鼠IgG，所述抗体包被膜为NC膜。
6.一种使用权利要求1-5任一项所述的试纸条进行肿瘤标志物检测的方法，所述方法不涉及疾病的治疗和诊断，其特征在于，其包括如下步骤：将待测样本置于样品垫上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用拉曼光谱仪记录检测线的表面增强拉曼散射信号或者肉眼观察检测线的条带颜色；
优选的，所述拉曼光谱仪的激发波长为785nm。
8.一种如权利要求1-5任一项所述的试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将金纳米棒用拉曼分子进行修饰制得修饰有拉曼分子的金纳米棒。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括用修饰有拉曼分子的金纳米棒制备共轭垫，再将已致敏的硝酸纤维素膜、所述共轭垫、样品垫和吸收垫在PVC底板上依次组装；
优选的，制备共轭垫的方法包括在修饰有拉曼分子的金纳米棒表面进行牛血清白蛋白的包覆得到包覆有牛血清白蛋白的金纳米棒，再将检测抗体与包覆有牛血清白蛋白的金纳米棒偶联制得偶联有抗体的金纳米棒，然后将偶联有抗体的金纳米棒用金标稀释液混匀，滴加在金标结合垫上制得共轭垫。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括金纳米棒的制备，金纳米棒的制备包括在每40ml的CTAB溶液中添加0.8ml的氯金酸、0.3-0.35ml 0.01M的硝酸银、0.4ml的盐酸、0.32ml的抗坏血酸和0.1ml种子液。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111168058A (zh) * 2020-03-18 2020-05-19 安徽师范大学 janus金纳米棒@硫化铜纳米材料、核壳金纳米棒@硫化铜纳米材料及制备方法和应用
CN111624186A (zh) * 2020-06-24 2020-09-04 江南大学 一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法
CN111650370A (zh) * 2020-08-10 2020-09-11 苏州微湃医疗科技有限公司 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法及检测装置
CN114047172A (zh) * 2021-11-04 2022-02-15 北京大学 一种淬灭生物背景荧光实现拉曼光谱检测的方法
CN116990510A (zh) * 2023-09-26 2023-11-03 聚诚(北京)生物科技有限责任公司 一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原试剂条及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110412014A (zh) * 2019-08-28 2019-11-05 济南大学 表面增强拉曼散射纸基传感器在肿瘤标志物检测中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110412014A (zh) * 2019-08-28 2019-11-05 济南大学 表面增强拉曼散射纸基传感器在肿瘤标志物检测中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
贾小飞等: "SERS-侧流免疫层析研究进展", 《军事医学》 *
郭红燕等: "SERS标记的金纳米棒探针用于免疫检测", 《化学学报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111168058A (zh) * 2020-03-18 2020-05-19 安徽师范大学 janus金纳米棒@硫化铜纳米材料、核壳金纳米棒@硫化铜纳米材料及制备方法和应用
CN111168058B (zh) * 2020-03-18 2022-05-10 安徽师范大学 janus金纳米棒@硫化铜纳米材料、核壳金纳米棒@硫化铜纳米材料及制备方法和应用
CN111624186A (zh) * 2020-06-24 2020-09-04 江南大学 一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法
CN111624186B (zh) * 2020-06-24 2021-03-16 江南大学 一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法
CN111650370A (zh) * 2020-08-10 2020-09-11 苏州微湃医疗科技有限公司 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法及检测装置
CN114047172A (zh) * 2021-11-04 2022-02-15 北京大学 一种淬灭生物背景荧光实现拉曼光谱检测的方法
CN116990510A (zh) * 2023-09-26 2023-11-03 聚诚(北京)生物科技有限责任公司 一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原试剂条及其制备方法
CN116990510B (zh) * 2023-09-26 2023-12-26 聚诚(北京)生物科技有限责任公司 一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原试剂条及其制备方法

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