KR20100107648A - 표면증강 라만 산란 복합 프로브 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

표면증강 라만 산란 복합 프로브 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법이 개시된다. 상기 표면증강 라만 산란 복합 프로브는 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분 및 라만 리포터 분자가 표면에 고정된 할로우 금속 나노입자; 및 상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분이 표면에 고정된 자성 비드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 표면증강 라만 산란(SERS) 복합 프로브는 표적 물질의 검출한도(LOD)가 1~10 pg/mL 수준으로서 효소면역측정법(ELISA)의 LOD에 비하여 약 100~1000배 더 민감한 수준을 나타낼 수 있으며, 또한 고체 기판 상에 면역복합체를 고정화하는 종래의 검출법에 비해 재현성, 분석 시료의 양 및 분석 시간의 측면에서 큰 이점을 가질 수 있다.
표면증강 라만 산란, SERS, 면역복합체

Description

표면증강 라만 산란 복합 프로브 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법{COMBINATIONAL SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING PROBE AND METHOD FOR DETECTING TARGET SUBSTANCE BY USING THE SAME}
본 발명은 표면증강 라만 산란 복합 프로브 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
면역분석은 임상 진단, 생물학적 센서 및 식품 안전 테스트에 적용될 수 있는 빠르고, 비용효율적인 방법이다. 현재, ELISA 및 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분광법은 항원 또는 그의 상보적 항체의 존재를 검출하기 위하여 가장 널리 사용되고 있는 기술적 툴(tool)이다. 면역분석에서 특이적 항원-항체 상호작용을 확인하기 위해 형광 염료 등의 분자적 표지(label)가 통상적으로 사용된다. 최근에는 금속 나노입자가 우수한 광학적 특성 때문에 검출 태그로서 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 높은 광안정성과 함께 조절성(tunable) 및 좁은 방출밴드를 제공하는 형광 양자점(fluorescent quantum dots)이 생물학적 면역분석용의 효율적인 형광 표지로서 사용된다. 보다 최근에는, 항체 접합(conjugated) 금속 나노입자를 사용한 표면 증강 라만 분산(SERS) 기초 면역분석 기술이 빠르고 민감한 센싱(sensing) 능력 때문에 많은 연구자들로부터 큰 관심을 받고 있다.
SERS 기초 면역 분석법을 위한 가장 알려진 플랫폼 기술 중의 하나는 고체 기판(substrate) 상에 고정화된 샌드위치 면역복합체의 검출법이다. 이러한 방법에서는 폴리클로날 항체(PAb)를 고체 기판 상에 고정화시킨 후, 항원 용액 및 모노클로날 항체(MAb) 접합 금속 나노입자를 이어서 첨가한다. 고체 기판 상에 샌드위치 면역복합체가 형성된 후, 비특이적 결합 항원 및 MAb 접합 금속 나노입자를 버퍼 용액으로 세척한 다음, SERS 스펙트럼을 측정한다. 인간 이뮤노글로린(IgG) 항원, 래빗 IgG 항원, 고양이 칼리시바이러스(FCV), B형 간염 바이러스, 전립샘 특이적 항원(PSA), 및 단백질 A에 대한 많은 SERS 기초 면역분석 결과가 이러한 표면 고정화 기술을 이용하여 보고된바 있다. 또한, 고체 기판 상에 고정화된 2개의 상이한 종류의 IgG에 대한 SERS 검출을 기초로 한 이중 분석물 면역분석(duplex analyte immunoassay)이 보고된 바 있다.
이러한 SERS 기초 검출 기술이 고정화된 면역복합체에 대한 민감한 방법을 제공하기는 하지만 아래와 같은 결점을 가지고 있다.
첫째로, 표면 근처의 분자 분산 상의 제한이 단백질-단백질 분석의 키네틱스(kinetics)를 더 늦게 만들기 때문에, 각각의 결합 단계를 위해 긴 배양시간이 필요하다. 둘째로, 비특이적 결합 단백질의 제거를 위한 반복적인 세척 단계가 이러한 고정화 기초 기술을 불편하게 만든다. 셋째로, 모든 면역시약 성분이 공기 중의 고체 기판의 표면 상에 고정화되어야만 하고, 이 때, 많은 경우에 있어 단백질 의 공기에 대한 노출은 그들의 생물학적 활성의 심각하게 감소시킨다. 마지막으로, 고정화 기초 SERS 칩에서, 고도의 재현성 있는 증강을 가진 표면을 제조하기가 매우 어렵다. 결과적으로, 상이한 레이져 스팟에 대해 재현성있는(reproducible) SERS 신호를 얻을 수 없다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여, 할로우 금속 나노입자와 자성 비드를 조합한 표면증강 라만 산란(SERS) 복합 프로브 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분 및 라만 리포터 분자가 표면에 고정된 할로우 금속 나노입자; 및 상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분이 표면에 고정된 자성 비드를 포함하는 표면증강 라만 산란(SERS) 복합 프로브가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 할로우 금속 나노입자는 핀홀을 가지는 골드 나노스피어일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 자성 비드는 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo 및 이들의 산화물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 자성 물질을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표적 물질은 항원, 합텐, 핵산, 압타머, 단백질, 펩티드, 세포, 암세포 및 종양 마커로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 결합 성분 및 제2 결합 성분은 각각 독립적으로 항체, 핵산, 단백질, 펩티드 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표적 물질은 항원이고, 상기 제1 결합 성분은 상기 항원에 특이적인 폴리클로날 항체이며, 상기 제2 결합 성분은 상기 항원에 특이적인 모노클로날 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표적 물질은 암배아 항원(CEA)이고, 상기 제1 결합 성분은 암배아 항원 특이적 폴리클로날 항체이며, 상기 제2 결합 성분은 암배아 항원 특이적 모노클로날 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 결합 성분 및 상기 제2 결합 성분은 각각 상기 할로우 금속 나노입자 및 상기 자성 비드의 표면에 결합된 링커(linker)를 통해 결합되어 고정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 라만 리포터 분자는 4,4'-디피리딜(DP), 크리스탈 바이올렛(CV), 4-머캅토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머캅토 피리미딘(2-MPY), 2-머캅토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 물질일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 할로우 금속 나노입자와 자성 비드를 각각 준비하는 단계; 상기 할로우 금속 나노입자의 표면에 라만 리포터 분자 및 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분을 고정화시키는 단계; 및 상기 자성 비드에 상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분을 고정화시키는 단계를 포함하는 전술한 표면증강 라만 산란 복합 프로브의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 결합 성분의 고정화 및 상기 제2 결합 성분의 고정화는 각각 활성화된 링커를 통한 결합을 통해 고정화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에서는, 전술한 표면증강 라만 산란 복합 프로 브를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표적 물질 검출 방법은 표적 물질이 포함된 용액 중에 상기 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 첨가하여 상기 할로우 금속 나노입자, 상기 표적 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 샌드위치 복합체를 형성하는 단계; 및 자기장을 사용하여 상기 샌드위치 복합체를 수집하여 표면증강 라만 산란을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 다르면, 상기 표면증강 라만 산란을 측정하는 단계는 자기장을 사용하여 샌드위치 복합체를 용기 내의 한 부분으로 수집하여 잔류 용액을 제거한 다음, 자기장을 제거하여 상기 샌드위치 복합체를 버퍼 용액 중에 재분산시키고, 상기 재분산된 샌드위치 복합체를 이용하여 표면증강 라만 산란을 측정을 하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 할로우 금속 나노입자는 그 구조에서 핀홀(pinhole)을 가지고 있어 표면 전자기장을 편재화할 수 있기 때문에 각각의 입자에서 강한 증강 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 표면증강 라만 분산법을 이용한 고도로 재현성있는 표적 물질 검출이 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 샌드위치 면역복합체의 형성을 위한 지지 기질로서 고체 기판이 아니라 자성 비드를 사용하기 때문에, 모든 반응이 용액 중에서 일어나며, 고체 기판 상의 분산 제한 키네틱스에 기인하는 늦은 반응의 문제를 극복할 수 있어, 세척 및 SERS 측정 시간을 포함하고도 1시간 미만의 반응 시간으로 표적 물질의 검출이 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 표적 물질의 검출한도가(limit of detection, LOD)가 1~10 pg/mL 수준으로서 효소면역측정법(ELISA)의 LOD에 비하여 약 100~1000배 더 민감한 수준을 나타낼 수 있다.
이하에서는, 본 발명에 따른 표면증강 라만 산란 복합 프로브에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 표면증강 라만 산란(SERS) 복합 프로브는, (1) 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분 및 라만 리포터 분자가 표면에 고정된 할로우 금속 나노입자; 및 (2) 상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분이 표면에 고정된 자성 비드를 포함한다. 상기 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 사용함으로써(즉, 금속 나노입자와 자성 비드를 동시에 사용), "할로우 금속 나노입자"-"표적 물질"-"자성 비드"가 결합된 샌드위치 복합체를 형성하여 SERS 분석을 수행할 수 있게 한다.
이하, 상기 각 구성요소에 관하여 설명한다.
(1) 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분 및 라만 리포터 분자가 표면에 고정된 할로우 금속 나노입자
할로우 금속 나노입자
상기 할로우 금속 나노입자는 속이 빈 나노 사이즈의 금속 입자를 의미한다. 바람직하게는, 입자 구조에 핀홀(pinhole)을 가진 구형의 할로우 골드 나노스피어인 것이 바람직하다.
상기 할로우 골드 나노스피어는 입자 구조에서 핀홀(pinhole)을 가지고 있어 표면 전자기장이 편재화(핫 스팟, hot spot)될 수 있기 때문에 각각의 입자에서 강한 증강 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 표면증강 라만 분산법을 이용한 고도로 재현성있는 면역 분석용으로 사용할 수 있다.
상기 할로우 골드 나노스피어는 바람직하게는 본 발명자들에 의한 한국특허출원 제2008-0062333호 및 Schwartzberg 등의 문헌[Anal . Chem. 2006, 78, 4732 4736]에 기재된 방법에 의하여 제조할 수 있으며(상기 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참조 통합됨), 기타 당업계에 알려진 할로우 골드 나노스피어의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분
상기 할로우 금속 나노입자의 표면에는 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분이 고정된다.
상기 표적 물질은 SERS 분석에 의하여 검출하고자 하는 표적 물질을 의미하는바, 예컨대, 생체 시료에서 검출하고자 하는 특정 항원, 합텐, 핵산, 압타머, 단백질, 펩티드, 세포, 암세포, 종양 마커 등이 포함될 수 있으며, 기타의 분석 대상 표적 물질이 포함될 수 있다.
상기 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분은 전술한 표적 물질과 특이적인 상호작용을 통해 결합할 수 있는 물질을 의미하는 바, 예컨대, 항체, 핵산, 단백질, 펩티드, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질 등이 포함될 수 있으며, 기타 특정 표적 물질과 특이적인 결합이 가능한 물질이 포함될 수 있다. 상기 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 상기 종양 마커에 특이적인 항체 이외에도, 특정 종양 마커에 특이적인 물질로서 포스파티딜세린, VEGFR, 인테그린 수용체, Tie2 수용체, 소마토스타딘 수용체, 바소인테스티날 펩타이드 수용체, 허셉틴, 리툭산, 폴산 등의 다양한 물질이 포함될 수 있다.
바람직하게는, 상기 표적 물질은 특정 항원이고, 상기 제1 결합 성분은 상기 특정 항원에 특이적인 항체일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 표적물질은 폐암 마커인 암배아 항원(CEA)이고, 상기 표적물질에 특이적인 제1 결합 성분은 암배아 항원에 특이적인 폴리클로날 항체(PcAb)일 수 있다.
당업자라면 검출하고자 하는 표적 물질에 따라 이와 특이적인 상호작용을 통하여 결합할 수 있는 제1 결합 성분을 결정할 수 있음은 자명할 것이다.
상기 제1 결합 성분을 상기 할로우 금속 나노입자의 표면에 결합시키는 방법은 다양하게 존재할 수 있으며, 예컨대, 금속 입자의 표면에 링커(linker) 분자를 결합시키고 상기 링커 분자의 활성화된 말단에 상기 제1 결합 성분을 결합시킴으로써 고정화시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 링커로는 디하이드로리포익산(DHLA)를 사용할 수 있다. DHLA 이외에도 금속 표면에 항체 등의 단백질을 고정화시키기 위하여 공지된 다양한 링커 분자를 사용하는 것이 가능하다.
링커 분자를 이용하여 항체 등을 금속 입자의 표면에 고정화 하기 위해서 사용되는 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
라만 리포터 분자
상기 할로우 금속 나노입자의 표면에는 상기 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분 이외에 라만 리포터 분자가 또한 고정된다.
상기 라만 리포터 분자는 특정 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에 SERS 분석에서 검출하고자 하는 표적 물질을 보다 효과적으로 분석할 수 있다. 이러한 라만 리포터 분자로서 사용될 수 있는 화합물로는, 4,4'-디피리딜(DP), 크리스탈 바이올렛(CV), 4-머캅토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머캅토 피리미딘(2-MPY), 2-머캅토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티 올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF), 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 전술한 할로우 금 나노스피어를 사용하는 경우 라만 리포터 분자로 4,4'-디피리딜(DP) 또는 크리스탈 바이올렛(CV)을 사용될 수 있고, 보다 바람직하게는 4,4'-디피리딜(DP)을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 라만 리포터 분자를 전술한 할로우 금속 나노입자와 혼합하여 나노입자의 표면에 흡착시켜(absorbed) 고정화시킬 수 있다.
(2) 상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분이 표면에 고정된 자성 비드
자성 비드
상기 자성 비드는 수십 나노미터에서 수 마이크로미터의 직경을 가지는 비드(bead) 형태의 자성 물질을 의미한다. 여기서 상기 자성 물질은 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, 이들의 산화물 등일 수 있다. 상기 자성 비드는 바람직하게는 직경 1 ㎛의 산화철일 수 있다. 상기 자성 비드로는 자성을 가질수 있는 미세 입자라면 당업자에게 자명한 범위 내에서 다양한 입자를 사용할 수 있음은 물론이며, 상업적으로 구득할 수 있는 자성 비드를 사용할 수 있다.
표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분
상기 자성 비드의 표면에는 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분이 고정된 다.
상기 표적 물질은 전술한 제1 결합 성분과 특이적으로 결합할 수 있는 표적 물질과 동일한 표적 물질을 의미한다.
상기 제2 결합 성분은 전술한 제1 결합 성분과 마찬가지로, 상기 표적 물질과 특이적인 상호작용을 통해 결합할 수 있는 물질을 의미하는 바, 예컨대, 항체, 핵산, 단백질, 펩티드, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질 등이 포함될 수 있으며, 기타 특정 표적 물질과 특이적인 결합이 가능한 물질이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 표적 물질은 특정 항원이고, 상기 제2 결합 성분은 상기 특정 항원에 특이적인 항체일 수 있다.
상기 제2 결합 성분은 전술한 제1 결합 성분과 동일한 성분일 수 있으며, 또한 동일한 표적 물질에 대해 특이적이지만 서로 상이한 성분일 수도 있다. 상기 제2 결합 성분의 상기 표적 물질에 대한 결합 부위와 상기 제1 결합 성분의 상기 표적 물질에 대한 결합 부위가 상이한 경우, 하나의 표적 물질에 대해 상기 제1 결합 성분과 제2 결합 성분이 동시에 결합하여 샌드위치 복합체를 더 잘 형성하는 것이 가능하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 표적물질은 폐암 마커인 암배아 항원(CEA)이고, 상기 표적물질에 특이적인 제1 결합 성분은 암배아 항원에 특이적인 폴리클로날 항체(PcAb)이며, 상기 표적물질에 특이적인 제2 결합 성분은 암배아 항원에 특이적인 모노클로날 항체(McAb)일 수 있다.
당업자라면 검출하고자 하는 표적 물질에 따라 이와 특이적인 상호작용을 통 하여 동시에 결합할 수 있는 제1 결합 성분 및 제2 결합 성분을 결정할 수 있음은 자명할 것이다.
상기 제2 결합 성분을 상기 자성 비드의 표면에 결합시키는 방법은 다양하게 존재할 수 있으며, 구체적인 설명은 전술한 금속 할로우 나노입자의 표면에 제1 결합 성분을 결합시키는 방법으로 대체하기로 한다.
이하에서는, 전술한 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법에 대해서 설명한다.
본 발명에 따른 표적 물질을 검출하는 방법은, (1) 시료에 전술한 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 첨가하여 샌드위치 복합체를 형성하는 단계; 및 (2) 상기 샌드위치 복합체를 수집하여 표면증강 라만 산란을 측정하는 단계를 포함한다.
이하, 각 단계에 대해서 설명한다.
(1) 샌드위치 복합체의 형성 단계
상기 샌드위치 복합체의 형성 단계에서는, 표적 물질이 포함된 시료 용액 중에 전술한 본 발명에 따른 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 첨가하게 되면, 전술한 제1 결합 성분과 표적 물질의 결합과 동시에 전술한 제2 결합 성분과 표적 물질의 결합이 일어나, 상기 할로우 금속 나노입자, 상기 표적 물질 및 상기 자성 비드가 함께 결합된 샌드위치 복합체가 형성된다.
여기서, 상기 복합 프로브의 첨가는 상기 할로우 금속 나노입자와 상기 자성 비드를 동시에 또는 순차적으로 첨가할 수 있다.
이러한 결합은 모두 용액 중에서 입자들 사이에서 이루어지기 때문에, 종래의 고체 기판(substrate) 상의 분산 제한 키네틱스(kinetics)에 기인하는 늦은 반응의 문제를 극복할 수 있으며, 빠른 샌드위치 복합체의 형성이 가능하다.
(2) 샌드위치 복합체의 수집 및 표면증강 라만 산란 측정 단계
상기 샌드위치 복합체의 수집 및 표면증강 라만 산란 측정 단계에서는, 자기장을 사용하여 상기 샌드위치 복합체를 수집하여 표면증강 라만 산란을 측정한다.
상기 샌드위치 복합체에는 자성 비드가 포함되기 때문에, 상기 용액의 용기 벽의 바깥에서 자석 등으로 자기장을 걸어줌으로써 용기 내부의 벽으로 샌드위치 복합체를 수집할 수 있게 된다. 이렇게 수집된 샌드위치 복합체를 이용하여 표면증강 라만 산란을 측정하여 표적 물질을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 자기장을 사용하여 샌드위치 복합체를 용기 내의 한 부분으로 수집한 후, 잔류 용액을 제거하고 버퍼 용액으로 세척을 수행할 수 있다. 이어서, 자기장을 제거하고 상기 샌드위치 복합체를 버퍼 용액에 재분산 시킬 수 있다. 이렇게 재분산된 샌드위치 복합체를 모세관을 사용하여 수집하여 SERS 측정을 수행할 수 있다.
이상과 같은 방법을 통하여, 표적 물질을 검출할 수 있으며, 정량적인 검출도 가능함은 물론이다. 또한, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 검출 방법에 의할 때 샌드위치 복합체의 형성, 수집, 세척, SERS 측정의 전 과정이 1시간 미만의 시간으로 수행될 수 있어, 짧은 시간으로 표적 물질의 정확한 정량적 검출이 가 능하다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 - 표면증강 라만 산란 복합 프로브의 제조
할로우 골드 나노스피어의 제조 및 자성 비드의 준비
할로우 골드 나노스피어(HGN)를 전술한 문헌[Schwartzberg et al.]에 보고된 방법에 의해 제조하였다. N2 퍼징(purging) 조건 하에서 NaBH4로 CoCl2를 환원시킴으로써 코발트 나노입자를 합성하고, 이를 HGN의 주형으로 사용하였다. 0.1 M HAuCl4를 50 μL 씩 10회에 걸쳐 첨가하였다. 여기서, 금 원자가 핵형성(nucleation)되고 코발트 주형을 둘러싼 작은 껍질까지 성장되었다. N2 퍼징을 중단함으로써 상기 용액을 실온 조건에 노출시켰을 때, 코발트가 완전히 용해되어 할로우 내부구조를 형성하였다. 이 단계에서, 용액의 색이 암갈색(dark brown)에서 진청색(deep blue)으로 변화하였다. HAuCl4의 농도를 변화시킴으로써 벽 두께를 제어할 수 있었다. 도 1(a)에 HGN의 제조 방법을 개략적으로 나타내었으며, 도 1(b)에 HGN의 TEM 이미지를 나타내었다. 본 발명자들이 측정한 바에 따르면, HGN의 직 경 및 벽 두께는 각각 45 ± 12 nm 및 15 ± 5 nm이었다.
한편, 자성 비드로는 시판 중인 1 μm 직경의 산화철 비드를 이용하였다.
HGN 표면에 라만 리포터 분자의 고정화
제조된 HGN을 SERS 활성 프로브로 사용하기 위하여, 라만 리포터 분자로서 4,4'-디피리딜(DP)을 상기 HGN의 표면에 흡착(absorb)시켰다. 1.0 μL의 10-4 M DP를 1.0 mL의 0.7 nM HGN에 첨가하여, 그 혼합물을 교반하에서 1시간 동안 반응시켰다. 입자당 흡착된 DP 분자의 수는 대략 140개로 추정되었다.
HGN 표면에 CEA 특이적 폴리클로날 항체의 고정화
상기 라만 표지가 고정화된 HGN에 CEA 특이적 항체를 고정화시키기 위하여, 링커 분자로서 디히드로리포익산(DHLA)을 사용하였다. 2.0 μL의 5.0 mM DHLA를 1 mL의 0.7 nM 염료 흡착된 HGN에 첨가하고, 1시간 동안 반응시켰다. DHLA의 2개의 -SH 말단기가 쪼개져 HGN 표면에 화학적으로 결합되게 된다. 상기 나노입자의 표면상에 남아있는 비특이적 사이트를 2.0 μL의 2.5 mM 머캅토에탄올(mercaptoethanol)으로 코팅하였다. 용액 중의 과량의 비특이적 결합 머캅토에탄올을 원심분리를 통해 제거한 후, 그 침전물을 PBS 버퍼로 2번 세척하고, 울트라소니케이터(ultrasonicator)를 사용하여 재현탁시켰다. 그 결과, HGN과 기타 단백질의 비특이적 상호작용뿐만 아니라 나노입자의 응집이 효과적으로 차단될 수 있었 다. 기타의 -COOH 말단기들의 활성화를 위해서, 1.0 μL의 1.0 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 1.0 μL의 1.0 mM N-히드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 카르복실레이트-말단화 HGN을 EDC와 NHS의 에스테르화에서의 공유결합에 의한 단백질의 안정한 고정화를 이루기 위해 사용하였다. 마지막으로, 1.0 μL의 2.5 mg/mL 폴리클로날 CEA 항체(과량)를 NHS 활성화된 HGN에 첨가하고, 2시간 동안 반응시켰다. 여기서, 항체의 리신 잔기에 의한 NHS기의 치환에 의해 상기 HGNs 상의 항체 고정화가 일어났다. HGN의 표면상의 반응하지 않은 NHS 그룹을 1.0 μL의 1 mM 에탄올아민으로 2시간 동안 불활성화시켰다. 비특이적 결합 화합물(chemicals) 및 항체를 원심분리에 의해 제거하고, 최종적으로 PBS 버퍼로 2번 세척하여, 표면에 라만 리포터 분자 및 폴리클로날 CEA 항체가 고정화된 HGN을 수득하였다. 도 1(c)에 CEA 마커 검출을 위한 폴리클로날 CEA 항체가 접합된 HGN 나노프로브를 나타내었다.
자성 비드의 표면에 CEA 특이적 모노클로날 항체의 고정화
상기 HGN 표면에 CEA 특이적 폴리클로날 항체의 고정화와 유사한 방법으로 자성 비드의 표면에 CEA 특이적 모노클로날 항체의 고정화를 수행하였다.
자성 비드의 경우, 자성 비드 표면 상의 기타 -COOH 말단기들의 활성화를 위해서, 1.0 μL의 3.0 mM 10 μL의 3 mM NHS 및 10 μL의 3.0 mM NHS를 1.0 mL의 0.5 mg/mL 자성 비드에 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 6.0 μL의 1.0 mg/mL 모노클로날 CEA 항체(과량)을 NHS-활성화 자성 비드에 첨가하여 밤 샘(overnight) 반응시켰다. 여기서, 자석(magnetic bar)을 이용하여 자성 비드를 고정화시킨 후, 반응하지 않은 항체를 마이크로피펫을 사용하여 세척하였다. 또한, 자성 비드의 표면상의 반응하지 않은 NHS 그룹을 10 μL의 3.0 mM 에탄올아민으로 2시간 동안 불활성화시켰다. 비특이적 결합 화합물 및 항체를 원심분리에 의해 제거하고, 최종적으로 PBS 버퍼로 2번 세척하여, 표면에 CEA 특이적 모노클로날 항체가 고정화된 자성 비드를 수득하였다.
실시예 2 - 제조된 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 이용한 CEA 의 검출
SERS 분석 툴
SERS 측정을 Renishaw 2000 라만 마이크로스코프 시스템 (Renishaw, U.K.)을 사용하여 수행하였다. Melles Griot He-Ne 레이져(λ = 632.8 nm에서 작동)를 약 30 mW의 레이저 파워의 여기원(excitation source)으로 사용하였다. 수집(collection) 경로에 위치한 홀로그래픽 노치 필터를 사용하여 수집된 라만 분산으로부터 레일리 라인(Rayleigh line)을 제거하였다. 라만 분산을 4 cm-1 분광해상도에서 전하결합소자(CCD) 카메라를 사용하여 수집하였다. 추가의 CCD 카메라를 광학 현미경에 피트(fit)시켜 광학 이미지를 수득하였다. 마이크로튜브 내의 샌드위치 면역복합체를 모세관을 사용하여 수집하고, 20× 대물렌즈를 사용하여 유리 튜브 상의 레이저 스팟(spot)에 포커싱하였다. 본 명세서에 기재된 모든 라만 스펙트럼은 900-800 cm-1 범위에서 10 노출 시간에 대해 수집된 것이다.
SERS 분석
10 μL의 0.5 mg/mL McAb 접합 자성 비드를 50 ng/mL의 CEA 항원을 포함하는 10 μL의 PBS 버퍼 용액에 첨가하여 20분 동안 진탕하였다. 그 다음, CEA 항원 포획 자성 비드를 자석을 사용하여 분리한 후, 상기 용액을 마이크로피펫을 이용하여 PBS 버퍼로 2번 세척하였다.
얻어진 입자들을 10 μL의 0.7 nM McAb 접합 HGN과 추가로 반응시켜 20분 동안 진탕하였다. 얻어진 샌드위치 면역복합체를 마이크로튜브의 벽에 자석을 사용하여 분리하였다. 이 때, 도 3(c)의 왼쪽 그림에 나타낸 바와 같이 잔류 용액의 색이 무색("On")으로 변화하였다. 이러한 현상은 모든 HGN이 자성 비드의 표면에 결합되었고, 이들이 상기 벽에 자성 비드와 함께 수집되었기 때문이다. 결과적으로, 특징적인 보라색을 나타내는 HGN이 샌드위치 면역복합체의 형성에 따라 자성 비드의 표면에 부착되고, 마이크로튜브의 벽에 수집되었기 때문에, 용액의 색이 무색으로 변화하였다. 잔류 용액을 마이크로피펫을 사용하여 PBS 버퍼로 2번 세척하였다. 그 후, 자석을 제거하고, PBS 용액 중에 면역복합체를 다시 분산시켰다. 상기 면역복합체 입자들은 SERS 측정을 위하여 모세관(capillary tube)를 사용하여 수집하였다. 이 경우, 마이크로튜브 중에서 샌드위치 면역복합체가 형성되었기 때문에 상기 HGN으로부터의 SERS 신호가 관찰되었다.
도 2(a)에 2개의 상이한 금속 입자, 즉 PcAb 접합 HGN 및 McAb 접합 자성 비드를 사용한 샌드위치형 면역복합체의 형성에 대한 그림을 나타내었다. CEA 항원이 존재하는 경우, PcAb 접합 HGN 및 McAb 접합 자성 비드는 항체-항원-항체 상호작용에 의하여 샌드위치 복합체를 형성하지만, 항원이 존재하지 않는 경우 이들은 샌드위치 복합체를 형성하지 않는다.
도 2(b)에 단일 자성 비드에 대한 TEM 이미지를 나타내었다. 왼쪽 이미지에서, 항원이 존재하는 경우 항체-항원 상호작용에 의하여 HGN이 자성 비드의 표면에 결합되어 있다. 반면, 오른족 이미지에서는 항원이 존재하지 아니하여 자성 비드의 표면에 HGN이 결합되지 않은 것이 나타난다.
도 3(a)에 샌드위치 면역복합체의 형성을 도식적으로 나타낸 그림과, HGN 및 자성 비드를 사용한 SERS 면역분석 결과를 나타내었다. 여기서, HGN은 라만-활성 프로브로서 사용되고, 자성 비드는 분리 제제로서 사용되었다.
한편, 도 3(b)에서와 같이 10 μL의 0.5 mg/mL McAb-접합 자성 비드 및 10 μL의 0.7 nM McAb 접합 HGN을 CEA 항원 없이 혼합하였다. 이 시료에 대해서 도 3(a)에서와 동일한 프로세스에 의하여 자석에 의한 분리, 세척 및 재분산을 수행하였다. 그러나, 이 경우에는 잔류 용액의 색은 도 3(c)의 오른쪽 그림에 나타낸 바와 같이 보라색으로 남아있었다("Off"). 이러한 현상은 모든 HGN이 면역복합체를 형성하지 않고 잔류 용액 중에 남아있었기 때문이다. 모든 HGN이 세척되고 단지 자성 비드 많이 마이크로튜브에 남아있기 때문에, 그에 상응하는 라만 스펙트럼에서는 도 3(b)에 나타낸 바와 같이 리포터 SERS 신호가 나타나지 않았다. 결론적으로, 이러한 기술은 용액 중의 특이적 항원 마커의 빠른 확인을 위하여 사용될 수 있다.
전술한 방법에 따라 다양한 농도로 CEA 항원을 변화시켜, 다양한 농도의 CEA 항원에 대한 샌드위치 면역복합체의 SERS 스펙트럼을 분석하여 이를 도 5(a)에 나타내었다. CEA의 농도는 1 pg/mL 내지 10 ng/mL로 변화시켰다. 1612 cm-1에서 DP의 라만 피크가 CEA 항원의 정량적 평가를 위해 사용되었다. CEA 항원의 부재 시 약한 SERS 신호가 얻어졌다(Blank). 이는 세척 과정을 통해 대부분의 HGN이 용액으로부터 제거되었음에도 불구하고, 소량의 HGN이 용액 중에 여전히 남아있다는 것을 의미한다. CEA 항원을 첨가하였을 때, 그 농도가 증가함에 따라 SERS 신호가 명확하게 증가하였다. 여기서, 이 농도에 대한 1612 cm-1에서의 라만 피크를 블랭크(blank) 스펙트럼에서의 그것과 구별하기가 어렵기 때문에, LOD(limit of detection)는 1 pg/mL으로 평가되었다.
피크 강도의 비(1612 cm-1에서의 I CEA / I Blank)로부터 구해진 칼리브레이션 곡선을 도 5(b)에 나타내었고, 여기서 에러 바(error bar)는 4번의 측정으로부터의 표준 편차를 나타낸다. I CEA / I Blank는 1 내지 100 ng/mL의 범위에서의 CEA의 농도 증가에 따라 대수적으로 점차 증가한다. 도 5(b)에 삽입된 그림은 0 내지 100 pg/mL의 저농도 범위에서의 매우 좋은 선형 반응을 보여준다. 본 발명자에 의한 이러한 실험 데이터는 HGN 기초 SERS 면역분석이 CEA 마커의 높은 민감도의 검출에 있어서 매우 유용한 분석 기술이라는 것을 증명한다. 특히, 그 검출 민감도는 통상적인 ELISA 방법에 비하여 2 또는 3 차수(order)의 규모로 증가한다. 더욱이, 분석 시간은 세척 및 광학 측정 단계를 포함하고서도 1시간 미만이었다.
비교예 1 - 효소면역분석( ELISA )
96-웰 플레이트가 장착된 마이크로플레이트 리더(Power Wave X340, Bio-TEK, U.S.A.)를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 먼저, 50 μL의 10 μg/mL CEA 모노클로날 항체를 상기 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 표면상에 항체의 안정한 고정화를 위하여, 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 50 μL의 3% BSA를 첨가하여 표면상의 비특이적 결합 부위를 차단시켰다. 이어서, 50 μL의 상이한 농도의 CEA 항원 (10 pg/mL ~ 10 μg/mL)을 각각의 웰에 첨가하고, 2시간 동안 반응시켰다. 0.1 M PBS 버퍼 용액으로 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항원을 제거하였다. 여기서, 50 μL의 10 μg/mL 효소(HRP) 연관 폴리클로날 항체를 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 반응시켜 샌드위치 면역복합체를 만들었다. 상기 플레이트를 다시 세척하여 비결합 항체-효소 접합체를 제거하였다. 50 μL의 ABTS 용액을 각 웰에 첨가할 때, 효소에 의해 녹색으로 색이 변하였다. 각 플레이트 웰에 대해 405 nm에서의 흡광도를 측정하여 항원의 존재 및 양을 측정하였다.
도 4에 ELISA 실험 결과를 나타내었다. 도 4(a)에 나타낸 바와 같이 CEA 농도가 감소함에 따라 진한 초록색에서 무색으로 변화하였다. 도 4(b)는 상이한 CEA 농도에서의 샌드위치 면역복합체의 형성에 대한 ELISA 표준 곡선(standard curve)를 보여준다. 3번의 측정으로부터 연관 표준편차를 에러 바(error bar)로 나타내었다. ELISA 면역분석법에 의하여 측정된 검출 한계(LOD)는 1 - 10 ng/mL 범위였다. 그러나, 이러한 LOD 값은 CEA의 컷오프 수준을 만족시키지 못하였다.
결론적으로, 전술한 실시예의 HGN 및 자성 비드를 사용한 SERS 면역분석법은 상기 ELISA 분석 보다 100 - 1000배 더 민감한 것으로 나타났다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 실시예 외의 많은 실시예들이 본 발명의 특허청구범위 내에 존재한다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 코발트 나노입자 주형으로 할로우 골드 나노스피어를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 순서도이고, 도 1b는 제조된 할로우 골드 나노스피어의 TEM 이미지이며, 도 1c는 표면에 라만 리포터 분자(라만 태그) 및 항체가 결합된 할로우 골드 나노스피어를 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 항체 접합 할로우 골드 나노스피어와 항체 접합 자성 비드가 항원과 결합하여 형성된 샌드위치 면역복합체를 도식적으로 나타낸 그림이고, 도 2b는 표적 물질 존재시(왼쪽)와 표적 물질 부재시(오른쪽) 형성된 면역 복합체의 TEM 이미지이다.
도 3a 및 도3c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 표적 물질 존재시(a)와 부재시(b) SERS 분석 과정을 도식적으로 나타낸 순서도 및 그에 따른 라만 스펙트럼 그래프이며, 도 3c는 표적 물질 존재시(왼쪽) 및 표적 물질 부재시(오른쪽) 용기 외부에서 자기장을 가했을 때 샌드위치 복합체(왼쪽) 및 자성 비드(오른쪽)가 수집되는 것을 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 비교예에 따른, ELISA 분석시 표적 물질 농도에 따른 비색(colorimetric) 분석을 나타낸 사진이고, 도 4b는 이러한 분석에 대한 칼리브레이션 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 표적 물질(CEA 항원)의 농도 감소에 따른 SERS 스펙트럼을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 표적 물질의 대수적 농도에 대한 SERS 신호의 강도 비를 나타낸 그래프이다.

Claims (14)

  1. 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분 및 라만 리포터 분자가 표면에 고정된 할로우 금속 나노입자; 및
    상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분이 표면에 고정된 자성 비드
    를 포함하는 표면증강 라만 산란(SERS) 복합 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 할로우 금속 나노입자는 핀홀을 가지는 골드 나노스피어인 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자성 비드는 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo 및 이들의 산화물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 자성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적 물질은 항원, 합텐, 핵산, 압타머, 단백질, 펩티드, 세포, 암세포 및 종양 마커로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 결합 성분 및 제2 결합 성분은 각각 독립적으로 항체, 핵산, 단백질, 펩티드 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 프로브.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적 물질은 항원이고, 상기 제1 결합 성분은 상기 항원에 특이적인 폴리클로날 항체이며, 상기 제2 결합 성분은 상기 항원에 특이적인 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항원은 암배아 항원(CEA)인 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 결합 성분 및 상기 제2 결합 성분은 각각 상기 할로우 금속 나노입자 및 상기 자성 비드의 표면에 결합된 링커(linker) 분자를 통해 결합되어 고정되는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 라만 리포터 분자는 4,4'-디피리딜(DP), 크리스탈 바이올렛(CV), 4-머캅토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머캅토 피리미딘(2-MPY), 2-머캅토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2- 아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브.
  10. 할로우 금속 나노입자와 자성 비드를 각각 준비하는 단계;
    상기 할로우 금속 나노입자의 표면에 라만 리포터 분자 및 표적 물질에 특이적인 제1 결합 성분을 고정화시키는 단계; 및
    상기 자성 비드에 상기 표적 물질에 특이적인 제2 결합 성분을 고정화시키는 단계
    를 포함하는 제1항에 기재된 표면증강 라만 산란 복합 프로브의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 결합 성분의 고정화 및 상기 제2 결합 성분의 고정화는 각각 활성화된 링커를 통한 결합을 통해 고정화시키는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란 복합 프로브의 제조 방법.
  12. 제1항에 기재된 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 이용하여 표적 물질을 검 출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 표적 물질을 검출하는 방법은,
    표적 물질이 포함된 용액 중에 상기 표면증강 라만 산란 복합 프로브를 첨가하여 상기 할로우 금속 나노입자, 상기 표적 물질 및 상기 자성 비드가 결합된 샌드위치 복합체를 형성하는 단계; 및
    자기장을 사용하여 상기 샌드위치 복합체를 수집하여 표면증강 라만 산란을 측정하는 단계
    를 포함하는 표적 물질을 검출하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 표면증강 라만 산란을 측정하는 단계는, 자기장을 사용하여 샌드위치 복합체를 용기 내의 한 부분으로 수집하여 잔류 용액을 제거한 다음, 자기장을 제거하여 상기 샌드위치 복합체를 버퍼 용액 중에 재분산시키고, 상기 재분산된 샌드위치 복합체를 이용하여 표면증강 라만 산란을 측정을 하는 것을 특징으로 하는 표적 물질을 검출하는 방법.
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