KR20230050851A - 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법 - Google Patents

표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 면역검정법을 이용한 바이러스 검출 방법, 검출키트 및 검출용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법은 별도의 유전자 분리 및 증폭 단계 없이 신속하고 민감하게 표적 바이러스를 검출할 수 있는바, 바이러스에 대한 빠른 진단 정보를 제공할 수 있다.

Description

표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법{Surface-enhanced Raman Scattering (SERS)-based immunoassay for virus}
본 발명은 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 면역검정법을 이용한 바이러스 검출 방법, 검출키트 및 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
SARS-CoV-2 의 출현 이후, 바이러스 감염을 진단하기 위한 다양한 바이러스 항원 검출 기술들이 보고되고 있다. 예로, 면역 형광 스트립 어세이, 측면 유동 면역 발색법, 장효과 트랜지스터, 효소 면역법 등을 이용한 바이러스 항원 검출 기술들이 보고되어 있다.
한편, 표면증강라만산란(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS) 분광법은 귀금속 나노구조체 표면에 흡착된 분자의 라만 산란 세기가 108 배 이상 증가되는 현상을 이용하는 분광법이다. 현재에 이르러, 단 하나의 분자를 직접 검출할 수 있는 고감도의 기술로 발전하였으며, 전도 유망한 바이오 센서로 많은 기대를 받고 있다. 표면 증강 라만 산란 분광법은 단일 분자를 분석할 수 있는 민감도를 가지고 있으며, 분자의 고유 스펙트럼을 제공할 수 있는 장점이 있다. 이로 인하여 SARS-CoV-2 검출을 위해 SERS를 이용한 연구들이 진행되고 있으나, 임상 샘플 내의 바이러스를 직접적으로 검출하는 연구는 아직 부족한 실정이다.
이에 본 발명자들은 신속하면서도 정확한 SARS-CoV-2 검출을 위하여 노력한 결과, SERS 기반의 바이러스 면역검증법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 시료와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 반응물의 표면증강라만산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자를 포함하는 1구획; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자를 포함하는 2구획;을 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 자성 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 검출 항체를 고정화하는 단계; 및 (b) 중공형 금 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 리포터 항체 및 라만 염료를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 시료와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 반응물의 표면증강라만산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자를 포함하는 1구획; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자를 포함하는 2구획;을 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 (a) 자성 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 검출 항체를 고정화하는 단계; 및 (b) 중공형 금 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 리포터 항체 및 라만 염료를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법은 별도의 유전자 분리 및 증폭 단계 없이 신속하고 민감하게 표적 바이러스를 검출할 수 있는바, 바이러스에 대한 빠른 진단 정보를 제공할 수 있다.
도 1a는 자성 나노 입자에 부착되는 항체의 아미노산 서열이다.
도 1b는 중공형 금 나노 입자에 부착되는 항체의 아미노산 서열이다.
도 1c는 SARS-CoV-2 항원에 대한 도 1a에 해당하는 항체의 결합 친화도 확인 결과이다.
도 1d는 SARS-CoV-2 항원에 대한 도 1b에 해당하는 항체의 결합 친화도 확인 결과이다.
도 1e는 개발된 항체들 (도1a, b에 해당하는 항체)의 표적 항원에 대한 선택적 결합 확인 결과이다.
도 2a는 항체 고정화된 자성 나노 입자의 TEM 이미지이다.
도 2b는 중공형 금 나노 입자의 TEM 이미지이다.
도 2c는 중공형 금 나노 입자에 항체 및 MGITC 부착 전 (파란색), 후 (빨간색)의 DLS 측정결과이다.
도 2d는 중공형 금 나노 입자에 항체 및 MGITC 부착 전 (파란색), 후 (빨간색)의 UV-vis 측정결과이다.
도 2e는 항체 및 MGITC 부착된 중공형 금 나노 입자에서 측정한 SERS 신호 결과이다.
도 3a는 SERS 기반의 바이러스 면역검증법을 이용해 SARS-CoV-2 항원을 검출하는 모식도이다.
도 3b는 SARS-CoV-2 항원 검출 반응 이후, 중공형 금 나노 입자-자성 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 3c는 SARS-CoV-2 항원의 농도별 검출 반응 이후, 중공형 금 나노 입자-자성 나노 입자로부터 측정된 SARS-CoV-2 항원 농도별 (0 - 1 ng/mL) SERS 신호 결과이다.
도 3d는 SARS-CoV-2 항원의 농도별 (0 - 1 ng/mL) 1170 cm-1파장대의 SERS 신호 값 결과이다.
도 4a는 SERS기반의 바이러스 면역검증법을 이용해 SARS-CoV-2를 검출하는 모식도이다.
도 4b는 SARS-CoV-2의 농도별 (0 - 1000 PFU/mL) 검출 결과이다.
도 4c는 SERS기반의 바이러스 면역검증법의 표적 바이러스 선택도 검사 결과이다.
도 5a는 SERS기반의 바이러스 면역검증법을 이용해 비인두 흡입물에 처리된 SARS-CoV-2를 검출하는 모식도이다.
도 5b는 비인두 흡입물에 처리된 SARS-CoV-2 농도에 따른 SERS 신호 결과이다.
도 6a는 SERS기반의 바이러스 면역검증법 및 휴대용 라만 측정장비를 이용해, COVID-19 환자의 임상 샘플 로부터 바이러스를 검출하는 모식도이다.
도 6b는 COVID-19환자 샘플에서 측정된 SERS 신호 측정 결과이다.
도 6c는 COVD-19환자 샘플 (1-15 샘플) 및 음성 검체 (16-19 샘플) 에서 측정된 1170 cm-1파장대의 SERS 신호 값 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 시료와 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 반응물의 표면증강라만산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, ‘자성 나노 입자’는 수십 나노미터에서 수 마이크로미터의 직경을 가지는 비드(bead) 형태의 자성 물질을 의미한다. 여기서 상기 자성 물질은 Fe, Co, Mn, Ni, Gd, Mo, 이들의 산화물 등일 수 있다. 상기 자성 나노 입자는 자성을 가질 수 있는 미세 입자라면 당업자에게 자명한 범위 내에서 다양한 입자를 사용할 수 있음은 물론이며, 상업적으로 수득할 수 있는 자성 나노 입자를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 자성 나노 입자의 표면에는 표적 물질인 바이러스에 특이적인 항체가 결합되어 있다. 상기 바이러스에 특이적인 항체는 중공형 금 나노 입자에 결합된 항체와 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 상기 자성 나노 입자에 결합된 항체; 및 중공형 금 나노 입자에 결합된 항체;가 상이한 경우 하나의 표적 물질(즉, 바이러스)에 대해 상이한 항체가 동시에 결합하여 샌드위치 복합체를 더 잘 형성하는 것이 가능하다.
상기 항체를 상기 자성 나노 입자의 표면에 결합시키는 방법은 다양하게 존재할 수 있으며, 예컨대, 금속 입자의 표면에 링커(linker) 분자를 결합시키고 상기 링커 분자의 활성화된 말단에 상기 항체를 결합시킴으로써 고정화시킬 수 있다. 링커 분자를 이용하여 항체 등을 자성 나노 입자의 표면에 고정화하기 위해서 사용되는 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 자성 나노 입자는 자성 코어; 및 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 금속 쉘 층을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, ‘중공형 금 나노 입자’는 입자 구조에서 핀홀(pinhole)을 가지고 있어, 표면 전자기장이 편재화(핫 스팟, hot spot)될 수 있기 때문에 각각의 입자에서 강한 증강 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 표면증강 라만 분산법을 이용한 고도로 재현성있는 면역 분석용으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 중공형 금 나노 입자의 표면에는 표적 물질인 바이러스에 특이적인 항체가 결합되어 있다. 상기 항체를 중공형 금 나노 입자의 표면에 결합시키는 방법은 다양하게 존재할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 라만 염료는 크리스탈 바이올렛, X-로다민-5-아이소티오시아네이트, 말라카이트 그린 아이소티오시아네이트, 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트, 아데닌, 4- 아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 말라카이트 그린 아이소티오시아네이트이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 라만 염료는 중공형 금 나노입자와 혼합하여 나노입자의 표면에 흡착시켜(absorbed) 고정화시킬 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계 전 상기 (a) 단계의 반응물에 포함된 표적 바이러스와 결합된 나노 입자를 농축하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 농축은 자석을 이용하여 농축하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 표면 증강 라만 산란법(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)은 금속 나노입자의 표면에 결합 또는 흡착된 화학물질의 라만 스펙트럼을 증폭하여 기존의 라만분광 분석법에 비해서도 감도가 매우 높으며, 표면 선택성이 있는 장점이 있다. 구체적으로, 거칠게 처리된 특정 금속 표면에 흡착되어 있거나 수백 나노미터 이내의 거리에 위치해 있을 때 발생되는 라만 산란의 일종으로 이때 라만 산란의 세기는 일반 라만의 세기와 비교하여 106~ 108 배 이상 증가되는 현상을 이용한 분광법을 말한다. 용어 "표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS)"이란 SERS 활성 표면에서의 흡착물에 대한 레이저 여기 파장의 공명 현상을 이용한 분광법을 말한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 시료는 표적 바이러스 항원, 표적 바이러스 배양액 또는 환자 유래 임상 시료 형태인 것이 바람직하며, 시료의 형태에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 바이러스는 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라믹소 바이러스(Paramyxovirus), 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 조류인플루엔자 바이러스, AIDS(Acquired immune deficiency syndrome) 바이러스, HMPV(Human Meta pneumo virus), 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus), 리노 바이러스 또는 파라 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 SARS 바이러스이나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 SARS 바이러스는 SARS-CoV-2인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 검출 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 항체인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 리포터 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 항체인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 상기 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명에 있어서, ‘항체(antibody)’는 전체 항체(whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다) 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 전체 항체 형태이다.
본 발명에 있어서, "가변 영역"은 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이(variation)을 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 변영역에는 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. “상보성 결정 역(complementarity determining regions: CDR)”은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정되는 중요한 부위이다.
본 발명의 범위에는 각 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 기능적 동등물 및 그들의 염을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 본 발명의 각 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함한다. 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 본 발명의 각각의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 각아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 각 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각 각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명의 ‘기능적 동등물’ 범위에는 본 발명의 각 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 기본골격을 유지하면서 펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함된다. 예를 들어 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자를 포함하는 1구획; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자를 포함하는 2구획;을 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 바이러스는 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라믹소 바이러스(Paramyxovirus), 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 조류인플루엔자 바이러스, AIDS(Acquired immune deficiency syndrome) 바이러스, HMPV(Human Meta pneumo virus), 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus), 리노 바이러스 또는 파라 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 SARS 바이러스이나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 SARS 바이러스는 SARS-CoV-2인 것이 바람직하다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
또한 상기 키트는 사용 지침(instruction) 및 기타 검출에 필요한 도구 또는 장비를 더 포함할 수 있다.
앞서 검출 방법에서 언급된 내용은 본 키트에서도 적절히 변형되어 적용 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 자성 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 검출 항체를 고정화하는 단계; 및 (b) 중공형 금 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 리포터 항체 및 라만 염료를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바이러스 검출용 조성물은, 상기 구성 외에 바이러스 검출에 통상적으로 사용되는 공지의 유효성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것이 바람직하다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 항체 선별
96-well microplate에 100 ng의 SARS-CoV-2 항원을 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 이후 PBS로 세척하고 4 %의 탈지 분유를 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. Fab 파지 디스플레이 라이브러리에 기반하여 ((5 × 1011), 한국생명공학연구원), 항체 라이브러리 파지들은 항원 코팅된 plate에 37℃에서 1시간 동안 처리되었다. 표면에 고정되지 못한 파지들은 PBST (0.05% Tween 20 in PBS) 용액에 의하여 세척되었고, 결합된 파지들은 0.1 M glycine-HCl (pH 2.2)에 의하여 추출된 후, 2 M Tris base에 의하여 중화되었다. 추출된 파지들로 TG1 세포를 감염하고, 이어서 helper 파지 (VCSM13)로 감염하였다. 최종 파지들로 추가적인 패닝이 실시되었고, 3차 패닝에서 TG1의 개별 콜로니들이 무작위적으로 선택되어 100 ug/mL 암피실린을 포함한 super broth 에서 600 nm에서의 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양되었다. 이후, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside를 최종 농도 1mM 이 되도록 첨가하고 30도에서 overnight 하여 Fab 발현을 유도하였다. 다음으로, 각 라이브러리에서 선택한 Fab 형태에서 완전한 면역글로불린 G (IgG)형태로 변환되었다.
선별된 자성 나노 입자에 부착하기 위한 검출 항체 및 중공형 금 나노 입자에 부착하기 위한 리포터 항체의 구체적인 서열은 도 1 상기 검출 항체 및 리포터 항체의 서열은 표 1, 도 1a 및 b에 각각 나타내었다.
명칭 서열 서열
번호
검출 항체 CDR1 STYAMS 1
CDR2 GITGSGGATDYADSVKG 2
CDR3 INYRAVWGMD 3
중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARINYRAVWGMDYWGQGTLVTVSSAS 4
CDR1 RASQNVSSYLA 5
CDR2 GASNLAS 6
CDR3 QQGANAPLT 7
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGANAPLTFGQGTKVETK 8
리포터 항체 CDR1 ANNAMS 9
CDR2 GINGYDGDTYYADSVK 10
CDR3 TYYSYAMD 11
중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFANNAMSWVRQAPGKGLEWVSGINGYDGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYYSYAMDYWGQGTLVTVSSAS 12
CDR1 RASQNISSYLA 13
CDR2 WASNLAS 14
CDR3 QQGAQIPL 15
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGAQIPLTFGQGTKVEIK 16
상기 검출 항체 및 리포터 항체의 SARS-CoV-2 항원에 대한 결합 친화도를 분석하였고, 그 결과는 각각 도 1c 및 d에 나타내었다.
도 1c 및 d에 나타낸 바와 같이, 선별된 검출 항체 및 리포터 항체는 SARS-CoV-2 항원에 대한 결합 친화도가 높은 것을 확인하였다.
상기 검출 항체 및 리포터 항체의 표적 항원인 SARS-CoV-2에 대한 선택적 결합을 분석하였고, 그 결과는 도 1e에 나타내었다.
도 1e에 나타낸 바와 같이, 선별된 검출 항체 및 리포터 항체는 SARS-CoV-2 항원에 선택적 결합능이 높은 것을 확인하였다.
실시예 2: 자성 나노 입자 및 중공형 금 나노 입자 표면 처리
자성 나노 입자에 항체를 부착하기 위하여, 1mg의 자성 나노 입자를 MES buffer (25mM, pH 6)를 이용하여 두 번 세척하였다. 이후, 50uL의 EDC 용액 (50mg/mL)과 50uL의 NHS 용액 (50mg/mL)을 순차적으로 넣어주고 30분 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, 25mM MES 용액을 이용해 두 번 세척하였다. 다음으로, 10ug의 항체를 100uL의 25mM MES 용액과 함께 자성 나노 입자와 25℃에서 4시간 동안 반응하였다. 이후, 자성 나노 입자에 부착되지 않은 항체를 제거하기 위하여, PBS 용액을 이용해 세번 세척하였다. 또한 1% BSA 용액을 이용해 1시간 동안 반응하고 PBS로 세척하였다. 마지막으로 항체가 부착된 자성 나노 입자는 PBS용액에 재분산하여 준비하였다. 항체 고정된 자성 나노 입자의 TEM 사진은 도 2에 나타내었다.
중공형 금 나노 입자에 항체와 라만 염료 중 하나인 MGITC를 부착하기 위하여, 중공형 금 나노 입자 3mL 을 20분간 2,500×g 에서 원심 분리한 후, 10mL의 PBS 용액에 재분산하였다. 다음으로 8uL의 MGITC 용액 (100mM) 을 중공형 금 나노 입자에 첨가하여 45분간 반응하였다. MGITC 부착된 중공형 금 나노 입자는 10분간 13,000×g 에서 원심 분리한 후, 1mL의 PBS 용액에 재 분산 하였다. 동시에, 5uL의 HS-(CH­­2)10-NHS용액을 (100 μM in THF) 100uL의 항체 (10 μg/mL in PBS)와 섞고 25도에서 45분간 반응하였다. 이후, 반응이 끝난 항체 용액 50uL을 MGITC 부착된 중공형 금 나노 입자 용액에 넣고 25도에서 1시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, 항체 및 MGITC가 부착된 중공형 금 나노 입자는 10분간 13,000×g 에서 원심 분리한 후, 500uL의 PBS 용액으로 재 분산 하여 준비하였다. 중공형 금 나노 입자의 TEM 사진은 도 2b와 같고, 항체와 MGITC 부착된 중공형 금 나노 입자의 DLS, UV, SERS 측정 그래프는 각각 도 2c, d 및 e에 나타내었다.
도 2c에 나타낸 바와 같이, 중공형 금 나노 입자는 직경이 55.7nm이고(파란색), 항체와 MGITC를 부착한 후 나노 입자는 68.5nm로 직경이 증가한 것(빨간색))을 확인하였다.
도 2d에 나타낸 바와 같이, 항체와 MGITC 부착된 중공형 금 나노 입자 합성 후 나노 입자는 피크가 부착 전에 비해 이동된 것을 확인하였다(파란색->빨간색).
도 2e에 나타낸 바와 같이, 중공형 금 나노 입자의 핀홀에 SERS hot spot이 생성될 수 있는바, 강력한 SERS 신호가 검출되었다. 이는 합성된 중공형 금 나노 입자가 SARS-CoV-2의 검출을 위한 우수한 SERS 활성 면역 프로브가 될 수 있음을 의미한다.
실시예 3: SERS 기반의 바이러스 표면 항원 면역 검출
SERS 기반의 바이러스 면역검증법을 이용해 SARS-CoV-2 항원을 검출하였다(도 3a). 보다 상세하게는, 바이러스 항원 샘플 100uL, 50uL의 항체 고정된 자성 나노 입자, 그리고 50uL의 항체 고정된 중공형 금 나노 입자를 섞고 25도에서 2시간 반응하였다. 이후, 자석으로 30초간 자성 나노 입자를 포집 하여, PBS 용액으로 세척하였다. 마지막으로 포집 된 입자에서 30초간 SERS 신호를 측정하였다. SARS-CoV-2 항원 검출 반응 이후, 중공형 금 나노 입자-자성 나노 입자를 TEM으로 관찰하였다. TEM 사진은 도 3b에 나타내었으며, SERS 신호 측정 결과는 도 3c 및 d에 나타내었다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 중공형 금 나노 입자는 검출항체-항원-리포터 항체의 결합을 통해 자성 나노 입자에 결합되는 것을 확인하였다.
도 3c 및 d에 나타낸 바와 같이, 10 fg/mL 에서 100 pg/mL 농도의 SARS-CoV-2 항원의 SERS 측정값이 선형적으로 증가하였으며, 2.56 fg/mL의 검출 한계 (LOD)를 얻었다. 이를 통해, SERS기반의 바이러스 면역검출을 통해 바이러스 항원 검출이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 4: 바이러스 배양액에서의 바이러스 검출
SERS 기반의 바이러스 면역검증법(도 4a)을 통해 바이러스 배양액에서 바이러스를 검출하였다. 구체적으로, 바이러스 배양액 90uL에 10uL의 TCEP/EDTA (최종 농도 각 100, 1mM)를 처리하고 50도에서 5분, 64도에서 5분 처리하였다. 이후, 반응이 끝난 100uL의 샘플 용액에 50uL 항체 고정된 자성 나노 입자, 50uL의 항체 고정된 중공형 금 나노 입자를 넣고 25도에서 2시간동안 반응하였다. 다음으로 자석으로 30초간 자성 나노 입자를 포집한 후 30초간 SERS 신호를 측정하였고, 그 결과는 도 4b 및 c에 나타내었다.
도 4b 및 c에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 농도에 따라 SERS 신호의 세기가 증가하는 것을 확인하였고, 동시에 표적 바이러스에 대한 선택적 검출 역시 가능함을 알 수 있었다.
실시예 5: 비인두 흡입물에서의 바이러스 검출
SERS 기반의 바이러스 면역검증법(도 5a)을 통해 비인두 흡입물에서 바이러스를 검출하였다. 구체적으로, 바이러스 배양액을 비인두 흡입물에 처리하고, 처리된 45uL의 용액에 5uL의 TCEP/EDTA (최종 농도 각 100, 1mM)를 처리하여 50℃에서 5분, 64℃에서 5분 반응하였다. 이후, 50uL의 샘플 용액에 25uL의 항체 고정된 자성 나노 입자, 25uL의 항체 고정된 중공형 금 나노 입자를 넣고 25도에서 30분간 반응하였다. 이후, 자석으로 30초간 자성 나노 입자를 분리한 후 PBS로 세척하여 SERS 신호를 측정하였고, 그 결과는 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, 비인두 흡입물에 처리된 SARS-CoV-2의 농도 (0 - 1000 PFU/mL)에 따라 SERS 측정값 역시 증가하는 것을 확인하였고, 이를 통해, 본 SERS 기반의 바이러스 면역검증법이 비인두 흡입물 내에 존재하는 바이러스의 측정이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 6: 임상 환자 샘플에서의 바이러스 검출
SERS 기반의 바이러스 면역검증법(도 6a)을 통해 임상 환자 샘플에서 바이러스를 검출하였다. 구체적으로, COVID-19 환자들로부터 얻은 임상 샘플 40uL에 20uL의 항체 고정된 자성 나노 입자, 20uL의 항체 고정된 중공형 금 나노 입자를 넣고 25℃에서 25분간 반응하였다. 이후, 자석으로 30초간 자성 나노 입자를 분리하고 PBS로 세척하였고, 휴대용 라만 측정장비를 이용하여 SERS 신호를 측정하였다. SERS 신호 측정 결과는 도 6b 및 c에 나타내었다.
도 6b 및 c에 나타낸 바와 같이, 음성 검체 (16-19 샘플)에 비하여 COVID-19 환자 샘플 (1-15 샘플)에서 SERS 신호 값이 더욱 강하게 측정되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 개발된 시스템과 휴대용 라만 측정장비를 이용한, 보다 실용적인 COVID-19 진단이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Surface-enhanced Raman Scattering (SERS)-based immunoassay for virus <130> 1-111P <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody heavy chain CDR1 <400> 1 Ser Thr Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody heavy chain CDR2 <400> 2 Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody heavy chain CDR3 <400> 3 Ile Asn Tyr Arg Ala Val Trp Gly Met Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody heavy chain <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Asn Tyr Arg Ala Val Trp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody light chain CDR1 <400> 5 Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody light chain CDR2 <400> 6 Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody light chain CDR3 <400> 7 Gln Gln Gly Ala Asn Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> detection antibody light chain <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Asn Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Thr Lys 100 105 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody heavy chain CDR1 <400> 9 Ala Asn Asn Ala Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody heavy chain CDR2 <400> 10 Gly Ile Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody heavy chain CDR3 <400> 11 Thr Tyr Tyr Ser Tyr Ala Met Asp 1 5 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody heavy chain <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Asn 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Tyr Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody light chain CDR1 <400> 13 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody light chain CDR2 <400> 14 Trp Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody light chain CDR3 <400> 15 Gln Gln Gly Ala Gln Ile Pro Leu 1 5 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> reporter antibody light chain <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Gln Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (17)

  1. (a) 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 시료와 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 반응물의 표면증강라만산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 자성 나노 입자는 자성 코어; 및 금, 은, 구리 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 금속 쉘 층을 포함하는, 바이러스 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 라만 염료는 크리스탈 바이올렛, X-로다민-5-아이소티오시아네이트, 말라카이트 그린 아이소티오시아네이트, 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트, 아데닌, 4- 아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 바이러스 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계 전 상기 (a) 단계의 반응물에 포함된 표적 바이러스와 결합된 나노 입자를 농축하는 단계를 더 포함하는, 바이러스 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 농축은 자석을 이용하여 농축하는 것인, 바이러스 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 표적 바이러스 항원, 표적 바이러스 배양액 또는 환자 유래 임상 시료 형태인, 바이러스 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스는 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라믹소 바이러스(Paramyxovirus), 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 조류인플루엔자 바이러스, AIDS(Acquired immune deficiency syndrome) 바이러스, HMPV(Human Meta pneumo virus), 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus), 리노 바이러스 또는 파라 인플루엔자 바이러스인, 바이러스 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 검출 항체는
    서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 항체인, 바이러스 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 항체는
    서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 항체인, 바이러스 검출 방법.
  10. 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자를 포함하는 1구획; 및
    리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자를 포함하는 2구획;을 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스인, 바이러스 검출용 키트.
  12. (a) 자성 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 검출 항체를 고정화하는 단계; 및
    (b) 중공형 금 나노 입자에 표적 바이러스에 특이적으로 결합하는 리포터 항체 및 라만 염료를 고정화하는 단계;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물의 제조방법.
  13. 검출 항체가 고정된 자성 나노 입자; 및 리포터 항체와 라만 염료가 고정된 중공형 금 나노 입자;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것인, 항체.
  16. 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역;을 포함하는 SARS-CoV-2에 결합하는 항체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄를 포함하는 것인, 항체.
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