KR20160144416A - 파클리탁셀의 약물동태-유도된 투여를 위해 혈장 중의 파클리탁셀 농도를 모니터링하는 방법, 장치 및 시약 - Google Patents

파클리탁셀의 약물동태-유도된 투여를 위해 혈장 중의 파클리탁셀 농도를 모니터링하는 방법, 장치 및 시약 Download PDF

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유에 정 이
박철호
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오토텔릭 엘엘씨
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Abstract

본원은 치료제를 분석하는 방법, 장치 및 조성물에 관한 것이다. 한 가지 측면에서, 본원은 파클리탁셀의 유도된 치료를 모니터링하는 치료 약물을 제공하기 위해 파클리탁셀을 분석하는 방법, 장치 및 조성물에 관한 것이다.

Description

파클리탁셀의 약물동태-유도된 투여를 위해 혈장 중의 파클리탁셀 농도를 모니터링하는 방법, 장치 및 시약 {METHODS, DEVICES, AND REAGENTS FOR MONITORING PACLITAXEL CONCENTRATION IN PLASMA FOR PHARMACOKINETIC-GUIDED DOSING OF PACLITAXEL}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2014년 4월 4일자로 출원된 미국 특허원 제61/975,386호 및 2014년 9월 17일자로 출원된 미국 특허원 제62/051,757호의 이익을 주장하며, 각각은 이의 전체가 명백하게 참조로서 도입된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 카피를 대신하여 텍스트 형식으로 제공되며, 이에 의해 명세서에 참조로서 도입된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 화일의 명칭은 53634_SEQ.txt이다. 텍스트 화일은 11KB이고; 2015년 4월 6일에 작성되었으며; 명세서의 제출과 함께 EFS-Web을 통해 제출된다.
주목(Pacific Yew) 나무의 껍질로부터 최초로 단리된 파클리탁셀은 폐, 난소 및 유방암을 포함하는 다양한 암 유형에 대한 가장 효과적적인 화학요법 약물 중의 하나로서 확립되어 있다. 파클리탁셀의 주요 제한은 이의 낮은 용해성, 및 독성 유기 용매, 전형적으로 폴리옥시에틸화 피마자유 및 탈수화 에탄올 혼합물(Taxol®로서 공지됨)에서 제형화될 필요가 있다는 것이다. 용매 독성을 방지하기 위해, 파클리탁셀은, 파클리탁셀 등의 소수성 약물의 용해도를 개선시킬 수 있는 나노입자 전달 시스템을 사용하여 다양한 부형제로 제형화되어 왔다.
아브락산(Abraxane®), 파클리탁셀 알부민 결합된 나노입자 제형은 2005년에 FDA에 의해 승인되었고, 현재 화학요법을 위한 파클리탁셀의 최상의 제형 중의 하나이다. 다른 시스템은 파클리탁셀의 전달에 대해 조사되어 왔고, 예를 들면, 중합체성 나노입자, 지질-계 나노입자 제형, 중합체 접합체, 무기 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정 또는 사이클로덱스트린 나노입자를 사용하여 개발중에 있다[참조: Ping Ma et al., 2013, J　Nanomed. Nanotechnology:4:2].
아브락산®은 광범위하게 사용되는 화학요법제이고 실제로 모든 암 유형에 적용가능하지만, 아브락산®에 대한 반응은 20%와 같이 낮을 수 있다. 일부 환자에서 발견된 파클리탁셀에 대한 상대적 비감수성은 낮은 반응율의 기여 인자일 수 있다. 그러나, 이러한 비감수성은 낮은 반응율에 대한 주요 요인은 아닐 수 있다. 다양하게 승인된 용량(전이성 유방암의 경우에 260mg/m2, 췌장암의 경우에 125mg/m2 및 폐암의 경우에 100mg/m2)으로 투여되는 경우에 임상 환자 샘플에서 모니터링된 파클리탁셀의 혈중 농도는 최대 10배의 편차가 존재한다[참조: Nyman DW et al., 2005, J Clin. Oncol. 23, 7785-93]. 이러한 편차는 대다수의 환자가 잠재적으로 파클리탁셀 투여 농도를 너무 과도하게 부정확하게 투여하고, 치료를 중단하거나, 투여된 용량이 너무 낮고 치료로부터의 이익을 제공하지 못한다는 것을 암시한다. 환자가 파클리탁셀에 감수성인 경우에도, 불충분한 약물 수준은 이들을 비반응성으로 되게 하고 치료를 비효과적으로 되게 할 것이다. 저용량-투여 그룹은, 이들이 파클리탁셀에 비감수성이거나 충분한 파클리탁셀이 투여되지 않았는지의 여부를 결정하는 것이 곤란하기 때문에, 가장 취약한 환자 모집단이다. 전체 약물동태(PK) 프로파일링은 개개 약물동태 변화에 기반하여 적절한 약물 용량을 위한 유도를 제공하기 위해 이러한 경우의 유일한 접근법이다.
현재, 환자가 입원을 필요로 하는 종합적 임상 시험에 등재되지 않고서 파클리탁셀의 전체 PK 정량화를 수행하는 이용가능한 방법은 없다. 이러한 PK 시험의 전형적 기간은 48시간에 걸쳐 이루어질 수 있고, 반복적 채혈을 포함한다. 현재, 복잡한 실험 장비의 사용은, 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS) 방법을 포함하여 파클리탁셀의 혈액 농도를 분석하는 것을 필요로 한다. 이들 방법은 매우 고가, 현재 $120/샘플 이상이고, 설비 비용은 장치당 $150K 내지 $200K를 초과하는 범위에 있다. 또한, 48 내지 72시간의 기간에 걸쳐 수집된 최소 4개 데이터 점이 각각의 특정 환자에 대한 PK 파라미터를 적절하게 특성화하기 위해 요구되는 것으로 입증되었다. PK 시험을 위해 입원으로 환자를 유지하는 것은 비용을 환자당 대략 $10,000까지 용이하게 증대시킬 수 있다. PK 유도된 투여를 위한 임상 유효성을 입증하기 위해 충분한 동력의 상 III 임상 시험은 500명의 환자를 필요로 할 것이다(BSA 투여를 위한 250명 환자 및 PK 유도된 투여를 위한 250명 환자). 생물분석 비용은 단독으로 $1.5M일 것이다(500 점 × 화학요법 6 사이클 × PK 분석을 위한 4개 혈액 샘플링 × $120/샘플 분석). 시험의 기타 성분은 환자당 대략 $100,000, 총 $50M의 비용이 들 것이다. 이는 최적 종양 반응에 대한 용량 조정을 유도하는데 필요한 의미있는 임상 데이터 및 상기 장치의 규제당국의 승인을 수득하는데 중요한 장벽을 나타낸다. 따라서, 분석 및 기구의 높은 비용은, 비교적 좁은 치료 범위를 갖는 다수의 약물에 대한 치료 약물 모니터링(TDM)을 확립하는데 고비용의 결과를 갖는다.
따라서, 환자에서 파클리탁셀의 약물동태를 모니터링하고, 이에 의해 투여 전략의 임의의 조정을 통지함으로써 치료를 개개 환자에게 적절하게 개별화하는 단순하고 효과적이고 저렴한 접근법에 대한 요구가 남아있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고자 하고, 추가로 관련된 잇점을 제공한다.
본 발명은 치료제를 분석하는 방법, 장치 및 조성물을 제공한다. 한 가지 측면에서, 파클리탁셀을 분석하는 방법, 장치 및 조성물이 제공된다.
한 가지 측면에서, 본 발명은 액체 샘플에서 파클리탁셀을 분석하는 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 방법은
(a) 파클리탁셀을 포함하는 액체 샘플을 측방향 유동 분석 장치 (lateral flow assay device)에 적용하는 단계로서, 상기 장치는
(i) 액체 샘플을 수용하기 위한 샘플 수용 구역;
(ii) 상기 샘플 수용 구역과 액체 연통하고 상기 샘플 수용 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 검출 시약 구역으로서, 상기 검출 시약 구역은 이에 부착된 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약은 검출가능한 리포트 그룹으로 표지된, 파클리탁셀 항체, 또는 파클리탁셀에 결합하는 이의 단편 또는 유도체이고, 상기 파클리탁셀 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 104 내지 약 107의 Kon 및 약 10-3 내지 약 10-7의 Koff를 갖는, 검출 시약 구역; 및
(iii) 상기 검출 시약 구역과 유체 연통하고 검출 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 포획 구역으로서, 상기 포획 구역은 이에 고정된 제1 및 제2 포획 시약을 포함하고, 상기 제1 포획 시약은 검출 시약(시험 라인)에 결합할 수 있는 파클리탁셀 물질이고, 상기 제2 포획 시약은 검출 시약(대조군 라인)에 결합할 수 있는 항체이고, 상기 제1 포획 시약은 상기 포획 구역의 상류 말단으로부터 유동 방향으로 하류측에 제1 거리로 위치되어 있고, 상기 제2 포획 시약은 상기 포획 구역의 상류 말단으로부터 유동 방향으로 하류측에 제2 거리로 위치되어 있고, 상기 제2 거리는 상기 제1 거리보다 크고, 상기 제1 거리 대 상기 제2 거리의 비율은, Kon이 약 2.0×105 초과이고 Koff가 약 1.0×10-3 미만인 경우, 약 0.0 내지 약 0.4이고, 상기 제1 거리 대 상기 제2 거리의 비율은, Kon이 약 2.0×104 초과이고 Koff가 약 2.0×10-4 미만인 경우, 약 0.2 내지 약 1.0인, 포획 구역을 포함하는, 단계;
(b) 샘플을 검출 시약 구역을 통해 샘플 수용 구역으로부터 유동시켜 파클리탁셀을 갖는 검출 시약을 제공하는 단계;
(c) 파클리탁셀을 갖는 검출 시약을 포획 구역을 통해 유동시키는 단계로서, 이에 의해 제1 포획 시약(시험 라인)은 검출 시약과의 결합에 대해 분석물(파클리탁셀)과 경쟁하고, 제2 포획 시약(대조군 라인)은 과량의 검출 시약에 결합하는, 단계; 및
(d) 제2 포획 시약(대조군 라인)과 비교하여 제1 포획 시약(시험 라인)에 결합된 검출 시약의 양을 관찰하는 단계
를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 상기 방법은 제1 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플에서 파클리탁셀의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 제1 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량하는 것을 광학 밀도 측정을 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 파클리탁셀 항체는 3C6이다. 또 다른 실시형태에서, 파클리탁셀 항체는 8A10이다. 특정 실시형태에서, 2개의 파클리탁셀 항체, 또는 파클리탁셀 항체에 결합하는 이의 단편 또는 유도체가 사용된다(예: 3C6 및 8A10).
상기 방법에서, 파클리탁셀 물질은 검출 시약에 결합하기 위해 파클리탁셀과 경쟁하는 파클리탁셀 항원이다. 한 가지 실시형태에서, 파클리탁셀 물질은 파클리탁셀 단백질 접합체이다.
본 발명의 방법에서, 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리는 파클리탁셀 검출 감도를 최적화하기 위해 변화된다. 특정 실시형태에서, 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리는 파클리탁셀 검출 감도를 최적화하기 위해 최소화된다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 제2 포획 시약(대조군 라인)에 결합된 과량의 검출 시약의 양을 관찰하는 것을 추가로 포함한다. 이들 실시형태에서, 상기 방법은 제2 포획 시약에 결합된 과량의 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 파클리탁셀의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
감도 및 동적 범위를 증강시키기 위해, 상기 방법은 제1 및 제2 포획 구역의 중간에 제3 포획 구역을 추가로 포함하고, 상기 제3 포획 구역이 검출 시약에 결합할 수 있는 파클리탁셀 물질을 포함한다. 이들 실시형태에서, 파클리탁셀의 양을 측정하는 것은 제3 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 측정될 수 있다. 제3 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량하는 것은 광학 밀도 측정을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 포함하여 기타 고체 상 분석에 적용할 수 있음은 자명할 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 하나 이상의 항체, 이의 단편 또는 유도체가 상기 방법에 사용될 수 있다. 이들 실시형태에서, 제1 항체는 비교적 높은 Kon(예: 1×104 초과)을 가질 수 있고, 제2 항체는 비교적 낮은 Koff(예: 1×10-3 미만)을 가질 수 있다.
추가로, 특정 실시형태에서, 포획 구역은 다중 포획 위치(예: 2개 또는 3개 라인, T1, T2, T3)를 포함하여 동일한 샘플에 대해 다중 판독을 제공함으로써 재현성 및 확장된 동적 범위를 증가시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 약물 모니터링된(TDM) 유도 파클리탁셀 요법을 위한 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 암으로 진단된 환자에서 파클리탁셀 요법의 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
(a) 암 환자를 제1 시점에서 파클리탁셀로 치료하는 단계;
(b) 제1 시점에서 환자의 파클리탁셀의 제1 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 파클리탁셀 분석을 위해 상기 언급한 방법을 포함하는 단계;
(c) 상기 환자를 제2 시점에서 파클리탁셀로 치료하는 단계;
(d) 제2 시점에서 환자의 파클리탁셀 약물의 제2 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 파클리탁셀 분석을 위해 상기 언급한 방법을 포함하는 단계; 및
(e) 상기 환자에서 파클리탁셀의 제1 및 제2 농도를 비교하여 암 치료의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 암으로 진단된 환자에서 파클리탁셀 요법의 PK-유도 투여를 위한 방법으로서,
(a) 상기 암 환자를 제1 시점에서 파클리탁셀로 치료하고;
제1 시점에서 상기 환자의 파클리탁셀의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 파클리탁셀 분석을 위해 상기 언급한 방법에 의해 파클리탁셀의 농도를 측정하는 것을 포함하는 단계;
(b) 제1 투여로부터의 PK 정보를 사용하여 상기 환자를 제2 시점에서 파클리탁셀로 치료하는 단계;
(c) 제2 시점에서 상기 환자의 파클리탁셀의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 파클리탁셀 분석을 위해 상기 언급한 방법을 포함하는 단계; 및
(d) 제1 시점에서 대상체의 파클리탁셀의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 제2 시점에서의 수준과 비교하여 최적 투여가 달성된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에서, 상기 약물동태 파라미터가 시간 대 최대 농도(Tmax), 농도 최대(Cmax), 곡선하 면적(AUC), 클리어런스(CL), 분포 용적(Vd), 종점 상 동안의 겉보기 분포 용적(Vz), 정상 상태 동안의 겉보기 분포 용적(Vss) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 파클리탁셀에 대해 상기 기재된 것들과 유사하지만 다른 치료제를 분석하는데 유용한 장치 및 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 측방향 유동 장치로서,
(a) 액체 샘플을 수용하는 샘플 수용 구역;
(b) 샘플 수용 구역과 액체 연통하고 샘플 수용 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 검출 시약 구역으로서, 이에 부착된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는, 검출 시약 구역;
(c) 검출 시약 구역과 액체 연통하고 검출 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 포획 구역으로서, 이에 고정된 하나 이상의 포획 시약을 포함하는, 포획 구역; 및
(d) 포획 구역과 액체 연통하고 포획 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 흡착 구역을 포함하는, 측방향 유동 장치를 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, 하나 이상의 항체, 이의 단편 또는 유도체가 상기 방법에 사용될 수 있다. 이들 실시형태에서, 제1 항체는 비교적 높은 Kon(예: 1×104 초과)을 가질 수 있고, 제2 항체는 비교적 낮은 Koff(예: 1×10-3 미만)을 가질 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 상기 검출 시약은 치료 약물에 대한 제1 친화성을 갖는 제1 항체 및 치료 약물에 대한 제2 친화성을 갖는 제2 항체를 포함하고, 상기 제1 친화성은 상기 제2 친화성보다 크다. 추가로, 특정 실시형태에서, 상기 포획 시약은 복수의 포회 위치(예: 2개 또는 3개 라인, T1, T2, T3)을 포함하여 동일한 샘플에 대한 다중 판독을 제공함으로써 재현성 및 확장된 동적 범위를 증가시킬 수 있다.
상기 방법에서, 검출 시약은 검출가능한 리포트 그룹으로 표지된 항체이고, 포획 시약은 검출 시약에 결합할 수 있는 항체이거나, 포획 시약은 검출 시약에 결합할 수 있는 항체이다. 특정 실시형태에서, 포획 시약은, 검출 시약에 결합하기 위해 치료 약물과 경쟁하는 항원인 제1 포획 시약, 및 검출 시약에 결합할 수 있는 항체인 제2 포획 시약을 포함한다. 제1 포획 시약은 제2 포획 시약으로부터 유동 방향으로 하류측에 고정되어 있다. 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리는 치료 약물의 검출을 최적화하기 위해 변화된다.
특정한 실시형태에서, 상기 장치는 제1 및 제2 포획 시약의 중간에 고정된 제3 포획 시약을 추가로 포함한다. 이러한 실시형태에서, 상기 제3 포획 시약은, 검출 시약에 결합하기 위해 치료 약물과 경쟁하는 항원이다.
특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 파클리탁셀이고, 상기 검출 시약은 8A10 및 3C6으로부터 선택된 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하고, 상기 항체 또는 단편 또는 유도체는 파클리탁셀에 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 샘플 중의 치료 약물을 분석하는 방법으로서,
(a) 샘플을 상기 언급한 장치의 샘플 수용 구역에 적용하는 단계; 및
(b) 하나 이상의 고정된 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 관찰하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
상기 방법은 하나 이상의 고정된 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 치료 약물의 양을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다(예를 들면, 검출 시약은 제1 포획 위치에서 포획 시약에 결합하고, 검출 시약은 제2 포획 위치에서 포획 시약에 결합하고, 검출 시약은 제1 및 제2 포획 위치에서 포획 시약에 결합하고, 검출 시약은 제1, 제2 및 제3 포획 위치에서 포획 시약에 결합한다).
추가의 실시형태에서, TDM 유도된 치료 방법이 제공된다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 질환 또는 상태로 진단된 환자에서 치료학적 치료의 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
(a) 환자를 제1 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
(b) 제1 시점에서 환자의 치료제의 제1 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 상기 기재돤 방법을 포함하는, 단계;
(c) 상기 환자를 제2 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
(d) 제2 시점에서 환자의 치료제의 제2 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 상기 기재된 방법을 포함하는, 단계; 및
(e) 환자에서 제1 및 제2 농도를 비교하여 치료학적 치료의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 질환 또는 상태로 진단된 환자에서 치료학적 치료의 PK-유도 투여를 위한 방법으로서,
(a) 제1 투여로부터 수득된 PK 데이터를 사용하여 상기 환자를 제1 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
(b) 제1 시점에서 환자의 치료제의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 본원에 기재된 방법에 의해 치료제를 분석하는 것을 포함하는, 단계;
(c) 상기 환자를 제2 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
(d) 제2 시점에서 환자의 치료제의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 본원에 기재된 방법에 의해 치료제를 분석하는 것을 포함하는, 단계; 및
(e) 제1 시점에서 대상체의 치료제의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 제2 시점의 수준과 비교하여 최적 투여가 달성된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에서, 상기 약물동태 파라미터는 시간 대 최대 농도(Tmax), 농도 최대(Cmax), 곡선하 면적(AUC), 클리어런스(CL), 분포 용적(Vd), 종점 상 동안의 겉보기 분포 용적(Vz), 정상 상태 동안의 겉보기 분포 용적(Vss) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 방법은 치료 약물 모니터링으로부터 이익을 갖는 질환 또는 상태 치료에 적용가능하다. 대표적 질환 또는 상태는 암, 염증, 고혈암, 심혈관 또는 통증을 포함한다. 대표적 치료제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 7-에피파클리탁셀, t-아세틸 파클리탁셀, 10-데스아세틸-파클리탁셀, 10-데스아세틸-7-에피파클리탁셀, 7-크실로실파클리탁셀, 10-데스아세틸-7-글루타릴파클리탁셀, 7-N,N-디메틸글리실파클리탁셀 및 7-L-알라닐파클리탁셀로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 파클리탁셀 항체를 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 8A10 및 3C6으로부터 선택된 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 제공하고, 상기 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 파클리탁셀에 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 서열번호 2, 4, 6 또는 8에 함유된 CDR과 적어도 95% 상동성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
본 발명의 상기 측면 및 다수의 부수 잇점은, 이것이, 첨부 도면과 조합하는 경우, 하기 상세한 설명을 참조함으로써 보다 잘 이해되는 바와 같이 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 대표적 시스템 및 방법을 사용하는 약물동태-유도 투여 개념 및 프로세스의 개략도이다.
도 2a는 본 발명에 따른 치료 약물 모니터링 장치에 대한 대표적 공정 흐름도를 나타낸다.
도 2b는 본 발명에 따른 측방향 유동 면역검정을 위한 대표적 시험 스트립을 나타낸다.
도 2c는 본 발명에 따른 파클리탁셀 측방향 유동 면역검정을 위한 대표적 시험 스트립을 나타낸다.
도 3은, 대표적 분석물(파클리탁셀)의 양이 변화되는, 본 발명에 따른 상태를 분석하기 위한 대표적 시험 스트립 대상체의 이미지이다. 이러한 분석 구성에서, 시험 스트립은 3개의 포획 구역을 포함한다: 시험 라인 1 및 시험 라인 2는 제1 포획 물질로서 고정된 항원(파클리탁셀, 고정된 BSA-파클리탁셀의 형태)를 사용한 포획을 나타내고; 대조군 라인은 제2 포획 물질로서 고정된 항체(염소 항-마우스 항체, GAM)을 사용한 포획을 나타낸다. 이러한 분석에서, 검출 시약은 콜로이드성 금으로 표지된 항-파클리탁셀 항체(8A10)이었다.
도 4는 ELISA로 BSA-파클리탁셀 항원에 대한 본 발명의 무손상 (intact) IgG(8A10 및 3C6)의 직접 결합을 나타내는 그래프이다.
도 5a 및 5b는 도 2c에 개략적으로 설명되고 실시예 3에 기재된 장치를 사용하여 수행된 본 발명의 대표적 측방향 유동 분석에서 라인 T1 및 T2에 결합된 8A10에 대한 곡선을 나타낸다. 도 5a는 표준 곡선, 즉 대조군 라인(T/C)에 대한 시험 라인의 비율 대 파클리탁셀 농도를 나타낸다. 보다 낮은 농도의 경우 T1 대 T2에서 8A10에 대한 비율의 보다 큰 차이는, 분석물의 농도가 보다 높은 가능성이 있는 경우, 샘플 포트에 보다 근접하게 위치시킬 때, 이러한 부류의 항체에 대한 훨씬 보다 높은 감도를 나타낸다. 도 5b는 판독 장치에 의해 제공된 바와 같이 스캔 시험 스트립의 출력 강도 대 위치 판독치를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 도 2c에 개략적으로 설명되고 실시예 3에 기재된 바와 같은 장치를 사용하여 수행된 본 발명의 대표적 측방향 유동 분석에서 라인 T1 및 T2에 결합된 3C6에 대한 곡선을 나타낸다. 도 6a는 표준 곡선, 즉 대조군 라인(T/C)에 대한 시험 라인의 비율 대 파클리탁셀 농도를 나타낸다. 보다 낮은 농도의 경우 T1 대 T2에서 3C6에 대한 비율의 비교적 미세한 차이는, 분석물의 농도가 보다 높은 가능성이 있는 경우, 이러한 부류의 항체에 대한 비교적 낮은 개선이 항체를 샘플 포트에 보다 근접하게 위치시킬 때에 수득될 수 있음을 나타낸다. 이러한 부류의 항체는 샘플 포트로부터의 위치 독립 신호에 의해 특징 지어진다. 도 6b는 판독 장치에 의해 제공된 바와 같이 스캔 시험 스트립의 출력 강도 대 위치 판독치를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 도 2c에 개략적으로 설명되고 실시예 3에 기재된 장치를 사용하여 수행된 본 발명의 대표적 측방향 유동 분석에서 라인 T1 및 T2에 결합된 조합된 8A10 및 3C6에 대한 곡선을 나타낸다. 도 7a는 표준 곡선, 즉 대조군 라인(T/C)에 대한 시험 라인의 비율 대 파클리탁셀 농도를 나타낸다. T1 및 T2의 높은 감도는 접합체 패드에서 2개 부류의 항체(8A10 및 3C6)를 조합함으로써 수득되었다. 이는 분석의 동적 범위를 개선시켰다. 도 7b는 판독 장치에 의해 제공된 바와 같이 스캔 시험 스트립의 출력 강도 대 위치 판독치를 나타낸다.
현재, 다수의 치료제는 임상 사용중 또는 개발중에 있다. 곤란성은 치료를 위한 약물을 발견하는 것이 아니라, 환자에게 적합하도록 치료를 조정하는데 있다. 약물동태(PK) 변화와 무관하게 개별된 (personalized) 의약은, 보다 낮은 양의 투여된 약물로부터 이익을 얻을 수 있는 환자 중에서 독성을 야기하는 과도하게 많은 약물 노출, 또는 추정상 감수성 모집단에서 과도하게 적은 약물 노출에 기인하여 일부 환자의 오분류를 제공할 것이다. 치료 약물 모니터링(TDM)을 사용한 개별화된 의약은 PK 변동성을 제거하고, 이들의 생물마커에 따라 환자의 정확한 분류를 가능하게 한다.
본 발명은 치료 약물의 약물동태(PK)-유도된 투여를 위한 관리 현장(POC) 치료 약물 모니터링(TDM) 방법, 장치 및 관련 조성물을 제공한다.
도 1은 병원 정보 시스템 및/또는 실험실 정보 시스템을 사용하여 의사에게 데이터 전달을 가능하게 하여 궁극적으로 약물 용량 결정을 지원하는 장치의 시스템 특성, 잇점 및 잠재적 접속성을 나타낸다. 본 발명의 방법 및 장치는 24 내지 48시간에 걸쳐 핑거-프릭(finger-prick) 혈액 샘플을 채취함으로써 환자의 치료 약물(예: 파클리탁셀) PK 데이터를 수집하고, 상기 PK 데이터는 상기 데이터를 분석할 수 있고 치료 약물 용량이 변형되어야 하는지를 결정할 수 있는 의사에 의해 접근된다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 일반적으로 면역검정을 위한 방법 및 장치, 및 특히 파클리탁셀의 면역검정을 위한 방법 및 장치를 제공한다. 종종, 생물학적 샘플 중의 낮은 수준의 파클리탁셀은 파클리탁셀의 용량을 대상체에게 증가시킬 필요를 나타내고, 생물학적 샘플 중의 높은 수준의 파클리탁셀은 파클리탁셀의 용량을 대상체에게 감소시킬 필요를 나타낸다. 본 발명의 방법 및 장치는 대상체를 위해 치료제를 조정하는데 유용한 정보를 제공한다.
본원에 제공된 분석 방법 및 장치는 파클리탁셀을 검출 및 모니터링하기 위한 조성물, 방법 및 장치의 문맥에서 기재된다. 그러나, 기재된 조성물, 방법 및 장치의 형식은 이에 의해 제한되지 않고, 보다 일반적으로 임의의 선택 분석물을 모니터링하는데 용이하게 적용된다.
대표적 분석 방법 및 장치
본 발명은 샘플에서 분석물(예: 파클리탁셀)을 검출 또는 정량하는 분석 방법 및 장치를 제공한다.
상기 방법 및 장치는 상태의 치료를 위해 치료제(예: 파클리탁셀)을 제공받은 대상체(환자)로부터 수득된 샘플과 같이 생물학적 샘플을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석에 사용된 샘플은 궁극적으로 액체 샘플(예: 혈액, 혈장, 뇨)이다.
본 발명의 방법은 고체 상 분석법이고, 따라서 기타 고체 상 분석 구성에 적응하는데 적합하다. 본 발명을 예시하기 위해 상기 방법 및 장치는 측방향 유동 분석 구성을 사용하여 기재된다. 당해 기술분야에 공지된 기타 고체 상 분석법도 본 발명의 방법 및 장치에 따라 구성될 수 있음은 자명할 것이다.
측방향 유동 분석 방법 및 장치는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 측방향 유동 분석 방법 및 장치의 형식에 따라, 분석 시약은 특정 구정에 배치될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 한 가지 시약은 "검출 시약"으로 작용할 것이고, 다른 시약은 "포획 시약"으로 작용할 것이다. 이러한 형식 내에서, 검출 시약은 일반적으로 샘플 포트, 및 포획 시약이 부착되는 위치 사이의 소정 위치에서 접합체 패드 상에 부착된다. 검출 시약은 일반적으로 검출가능한 표지를 포함하고, 포획 시약은 패드상의 이의 위치에 고정된다. 따라서, 작동 동안, 샘플 포트에 도입된 액체 샘플은 패드를 따라 유동할 수 있다. 샘플은 먼저 검출 시약과 접촉한 다음, 후속적으로 포획 시약 위로 유동할 것이다.
본 발명에 따라 측방향 유동 분석을 수행하는 대표적 장치는 도 2a에 설명되어 있다. 도 2a를 참조하면, 장치(100)는 샘플 포트(120), 판독 윈도우(130) 및 시험 스트립 (200)을 갖는 하우징(110)을 포함하는 카세트이다(도 2b 참조). 작동시에, 분석되는 액체 샘플은 포트(120)를 통해 시험 스트립으로 도입되고, 유동 방향(샘플 패드(210)으로부터 흡착 패드(240)로)에 의해 지시된 바와 같이 시험 스트립을 따라 유동한다. 시험 결과는 판독 윈도우(130)을 통해 시험 스트립을 관찰함으로써 볼 수 있다.
시험 스트립은 분석을 수행하기 위한 몇몇 구역 및 시약을 포함한다. 도 2a 및 2b를 참조하면, 대표적 시험 스트립(200)은 샘플 패드(210), 접합체 패드(220), 막(230) 및 흡착 패드(240)를 포함한다. 샘플 패드(210), 접합체 패드(220) 및 흡착 패드(240)는, 샘플 패드에 도입된 액체 샘플이 접합체 패드 및 막을 통해 또는 이를 가로질러 흡착 패드로 유동하도록, 액체 연통하고 있다. 시험 스트립 성분의 크기 및 구성은 수행되는 특정 분석에 적합하도록 달라질 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 성분 패드 및 막은 한 성분으로부터 후속 성분으로의 유동을 촉진하기 위해 중첩할 수 있다(도 2a에 제시된 바와 같이, 샘플 패드(210)는 접합체 패드(220)와 중첩할 수 있고, 이는 막(230)과 중첩할 수 있고, 이는 흡착 패드(240)와 중첩할 수 있다). 시험 스트립 구역의 성질은 특히 중요하지 않고, 이들 성분을 위한 물질은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
대표적 장치의 작동은 다음과 같이 기재된다. 샘플 패드(210)은 시험되는 액체 샘플을 수용한다. 샘플은 샘플 패드로부터 접합체 패드(220)으로 유동한다.
접합체 패드(220)은 하나 이상의 검출 시약(예: 분석되는 샘플에서 분석물에 대해 친화성을 갖고 분석에서 항체의 검출을 촉진시키기 위해 표지되는 항체)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 단일 검출 시약은 접합체 패드 상에 부착된다. 다른 실시형태에서, 2개 이상의 검출 시약(예: 2개의 상이한 항체, 예를 들면, 분석되는 분석물에 대해 상이한 친화성, 상이한 Kon 속도 및/또는 상이한 Koff 속도를 갖는 제1 및 제2 항체)이 접합체 패드 상에 부착된다. 제1 및 제2 친화성은 동일하지 않다. 한 가지 실시형태에서, 제1 Kon은 제2 Kon보다 크다. 또 다른 실시형태에서, 제2 Koff는 제1 Koff보다 크다. 파클리탁셀 분석의 문맥에서 하기 기재된 항체 친화성, Kon 및 Koff 속도의 기재 및 명세는 일반적으로 치료제의 분석에 적용가능하다. 부착된 제1 및 제2 항체의 양은 달라질 수 있고, 동일할 필요는 없다.
접합체 패드(220) 상에 부착된 검출 시약(들)은 액체 샘플에 의해 고정되고, 샘플과 함께 막(230)으로 유동한다. 분석물이 샘플에 존재하는 경우, 분석물 및 검출 시약 사이의 결합은 샘플이 검출 시약과 접촉할 때에 발생하기 시작한다. 검출 시약의 포획(이중 일부는 결합된 분석물을 포함할 수 있고, 일부는 포함하지 않을 수 있다)은 막(230) 상에서 발생한다.
막(230)은 적어도 2개의 포획 구역: 결합된 분석물(시험 라인)을 포함하지 않는 검출 시약을 포획하기 위한 제1 포획 구역(도 2a, 2b 및 2c에서 232 참조), 및 결합된 분석물(대조군 라인)을 포함하는 과량의 검출 시약을 포획하는 제2 포획 구역(도 2a, 2b 및 2c에서 238 참조)을 포함한다. 제1 포획 구역은 결합된 분석물을 포함하지 않는 검출 시약(즉, 유리 검출 시약)을 포획하는데 효과적인 제1 포획 물질(예: 고정된 항원)을 포함한다. 제2 포획 구역은 결합된 분석물의 존재 또는 부재하에 검출 시약을 포획하는데 효과적인 제2 포획 물질(예: 고정된 항체)를 포함한다. 제1 및 제2 포획 물질에 의해 각각 포획된 검출 시약의 양은 샘플에 존재하는 분석물의 양에 의존할 것이다. 상기 기재된 분석은 분석물 및 제1 포획 물질이 검출 시약에 대한 친화성 결합을 위해 경쟁하는 경쟁적 분석이다. 샘플에 존재하는 분석물의 양이 보다 많으면, 제1 포획 물질에 의해 포획된 검출 시약의 양은 보다 적다. 포획 물질의 고갈에 기인하여, 샘플에 존재하는 분석물의 양이 보다 적으면, 제1 포획 물질에 의해 포획되는 검출 시약은 보다 많고, 따라서 제2 포획 물질에 의한 포획에 보다 적은 양이 이용가능하다. 제1 및 제2 포획 라인의 강도의 비율은 분석물의 정량화를 위한 최상의 값을 제공한다.
특정 실시형태에서, 포획 구역은 결합된 분석물을 포함하지 않는 검출 시약을 포획하는 2개 이상의 제1 포획 구역(예: 도 2b 및 2c에서 232 및 234)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 포획 구역은 검출 시약을 포획하는 2개 이상의 제2 포획 구역(예: 도 2b에서 236 및 238)을 포함한다.
측방향 유동 카세트의 설명된 접근법은 유동 카세트로부터 신호를 검출하기 위한 적절한 감도 및 이러한 신호를 보정 및 정량하는 능력을 갖는 임의의 호환성 판독기를 사용할 수 있다. 임의의 판독기의 유리한 특징은 터치 스크린, 집적된 RFID 또는 집적된 바코드 판독기를 포함하는 용이한 사용 특징, 및 메모리 카드 또는 USB 스틱 등의 결과를 용이하게 추출하는 능력을 포함할 수 있다. 판독기는 바람직하게는 언어 선택에 있어서 인터페이스를 촉진하는 사전-설치된 소프트웨어를 갖는다. 판독기는 바람직하게는 복수(예: > 1000) 결과의 저장을 촉진하는 고용량 메모리를 갖고, > 100개의 상이한 시험 방법 프로토콜을 저장할 수 있다. 판독기는 보다 큰 시스템 내로 이의 통합을 촉진시키는 접속능, 예를 들면, 데이터 저장 및 관리 시스템에 기반한 LIS 또는 클라우드에 대한 LAN 또는 WLAN 접속능을 함유할 수 있다. 마지막으로, 복수의 USB 포트는, 예를 들면, 외부 프린트에 대한 접속 등을 촉진시키기 위해 추가의 접속 성능에 바람직할 것이다.
대표적 판독기는 퀴아겐(Qiagen) 판독기 ESEQuant LFR(독일 퀴아겐으로부터 상업적으로 입수가능)이고, 이는 본원에 기재된 측방향 유동 카세트의 포함을 위한 호환성 유효 판독기로서 입증되었다. 이 판독기는 당해 기술분야에서 작동 가능하게 하는 내부 재충전가능한 배터리를 갖는 소형 휴대용 장치이고, 관리 현장(POC) 장치의 요건을 이용한다. 측방향 유동 카세트는 판독기에 매립된 공초점 카메라 시스템을 사용하여 스캔된다. 보드 상에서 이미지 분석 시스템은 분석 방법이 장치로 용이하게 업로드될 수 있도록 측방향 유동 카세트의 바 코드 판독기와 완전히 기능한다.
검출 시약. 특정 실시형태에서, 검출 시약은 본원에 기재된 적어도 하나의 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체이다. 검출 시약은 샘플 중의 분석물(예: 파클리탁셀)에 결합할 수 있고, 검출 시약이 샘플 중의 파클리탁셀에 결합하지 않는 경우, 검출 시약은 포획 시약에 결합한다.
검출 시약은 신뢰성 있는 정량을 가능하게 하는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 모이어티 또는 표지를 포함한다. 적합한 모이어티는 비색, 형광, 화학발광, 효소적 또는 방사 신호를 제공하는 면역검정 분야에 공지된 것들을 포함한다. 대표적 모이어티는 이들이 가시적이고 판독 기구를 필요로 하지 않는 검출가능한 신호를 제공하는 것을 포함한다(예: 착색 모이어티 또는 효소를 생성하는 착색 모이어티 또는 효소). 정량화는 통상 검출가능한 신호의 기구 분석을 통해 달성된다. 한 가지 실시형태에서, 검출 시약은, 가시적으로 관찰될 수 있는 콜로이드성 금으로 표지된 항체이다.
금 콜로이드는 단분산 성질을 갖는 염화금의 환원으로부터 생성되고, 이는 40nm 단분산 콜로이드 등의 조절된 및 균일한 직경의 것이다. 항체는 수동 흡수를 통해 콜로이드성 금과 접합된다.
상기 언급한 바와 같이, 바람직한 실시형태에서, 복수(즉 하나 이상의 유형) 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체가 사용된다. 일부 실시형태에서, 복수(상이한) 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체가 조합되고, 시험 스트립(즉, 접합체 패드) 상의 동일한 위치에 부착된다.
2개의 상이한 항-파클리탁셀 항체, 3C6 및 8A10이 본원에 기재되어 있다. 3C6 항체는 파클리탁셀에 고도로 특이적인 반면, 8A10 항체는 파클리탁셀에 덜 특이적이고 일반적으로 탁산에 대해 보다 광범위한 친화성을 갖는다. 2개의 항체는 전통적 경쟁 ELISA에서 유사하게 거동하지만, 놀랍게도, 고체 상 측방향 유동 분석에서, 8A10에 의해 제공된 신호는, 위치와 독립적인 3C6(T1 및 T2)과 비교하여, 제1 포획 시약(예: T1 위치)을 샘플 포트에 보다 근접하게 이동시킴으로써 개선된 것으로 밝혀졌다. 샘플 적용에 근접하는 T1은 보다 높은 농도의 분석물에 노출되고, 샘플 적용으로부터 추가로 존재하는 T2는 보다 낮은 농도의 분석물에 노출된다. 이는 포획 라인(들)의 최적 위치가 상기 방법에 사용된 항체의 Kon 및 Koff 값과 관련된다는 놀라운 발견이다. 3C6의 이용가능성은, 높은 Kon 항체(예: 8A10)이 가능한 샘플 기원에 근접하여 부착되고 낮은 Koff 항체(예: 3C6)이 제2/제3/제4 등의 판독치를 제공하기 위해 패드를 따라 부착되는 다중 라인 장치의 구성을 가능하게 한다.
따라서, 다양한 변형은 다양한 검출 특성을 촉진시키거나 부여하기 위해 측방향 유동 카세트 장치에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 장치의 동적 범위를 확장시키기 위해, 다중 친화성 항체를 사용한 다중 시험 라인(T1, T2 등), 분석물의 동적 범위 및/또는 재현성이 확장될 수 있다. 대표적 파클리탁셀 분석의 문맥에서 하기 기재된 시험 스트립 상에 포획 시약(T/C)를 위치시키는 기재 및 명세는 일반적으로 본 발명의 분석에서 포획 시약의 위치결정에 적용할 수 있다.
본 발명의 분석에서 유용한 대표적 검출 시약(예: 파클리탁셀 항체-콜로이드성 금 접합체)의 제조는 실시예 1에 기재되어 있다.
포획 시약. 포획 시약은 분석에서 검출가능한 신호의 관찰 및 정량화를 가능하게 하는 검출 시약을 포획하기 위해 작용한다. 상기 언급한 바와 같이, 분석 방법 및 장치는 각각 제1 및 제2 포획 구역에서 고정된 제1 및 제2 포획 물질을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 포획 시약은 고정된 분석물(예: 파클리탁셀 복합체)이고, 이는 검출 시약이 항체인 경우에 고정된 항원이며, 결합된 분석물을 포함하지 않는 검출 시약을 포획한다. 고정된 분석물은 시험 스트립에 직접 고정될 수 있다. 대안적으로, 고정된 분석물은 링커 또는 캐리어 물질(예: 캐리어 단백질, 예를 들면, 알부민에 접합된 분석물)을 통해 고정될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 포획 시약은 상기 기재된 바와 같은 제1 포획 물질이다.
한 가지 실시형태에서, 포획 시약은 결합된 분석물의 존재 또는 부재하에 검출 시약을 포획하는 검출 시약을 포획하는 고정된 항체이다. 검출 시약이 마우스 모노클로날 항체인 실시형태에서, 포획 시약은 항-마우스 항체(예: 염소 항-마우스 항체, GAM 항체)이다. 이러한 실시형태에서, 포획 시약은 상기 기재된 바와 같은 제2 포획 물질이다.
본 발명의 분석에 유용한 대표적 포획 시약(예: BSA-파클리탁셀)의 제조는 실시예 1에 기재되어 있다.
대안적 분석 구성. 본원에 기재된 본 발명의 측방향 유동 분석은 고체 상 면역검정이다. 분석 및 장치의 형식은 검출 시약이 표지된 항원(예: 검출가능한 표지를 갖는 BSA-파클리탁셀)이고 포획 시약이 하나 이상의 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체(즉, 포획 구역에 고정됨)로 되도록 상기 기재된 형식으로부터 반전될 수 있다. 이러한 형식의 작동에서, 샘플은 부착된 표지된 항원을 통해/가로질러 유동하고, 후속적으로 고정된 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체와 접촉한다. 이 시점에서, 샘플에 초기에 존재하는 유리 분석물(예: 파클리탁셀)은 고정된 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체에 결합하기 위해 표지된 항원과 경쟁한다. 상기한 바와 같이, 장치는 동일한 또는 상이한 위치에 고정된 복수의 상이한 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함할 수 있다. 포획 시약은 동일하거나 상이한 위치에 존재할 수 있다. 시험 스트립이 포획 시약을 고정시킨 복수의 위치를 갖는 모든 실시형태에서, 이들 위치에서 신호를 검출할 수 있는 적절한 판독기가 사용된다.
본 발명의 장치, 시스템, 조성물 방법은 일반적으로 측방향 유동 분석의 측면에서 본원에 기재되어 있음에 유의해야 한다. 그러나, 선택 항원을 모니터링하는 일반 전략은, 본원에 기재된 바와 같이, 측방향 유동 분석 형식으로 제한될 필요는 없고, 당해 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는 기타 고체 상 면역검정(표면 플라스몬 공명 분석) 등의 기타 분석 형식에 적용될 수 있다. 따라서, 측방향 유동 형식을 해결하는 기재에도 불구하고, 본 발명의 개시는 또한 임의의 공지된 분석 형식을 도입하는 장치, 시스템, 조성물 및 방법을 포괄한다. 일부 실시형태에서, 분석 형식은 기질 상의 포획 시약, 예를 들면, 항원 접합체(예: 파클리탁셀 접합체) 또는 항원 결합 시약(예: 항-파클리탁셀 항체, 단편, 유도체)의 고정화를 포함한다. 기질은 니트로셀룰로즈 또는 유리 등과 같이 분석 형식을 위한 임의의 공지된 적절한 기질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 나노구조체이다. 일부 실시형태에서, 기질은 탄소 나노구조체, 예를 들면, 포획 시약이 고정될 수 있는 탄소 나노튜브를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
대표적 파클리탁셀 분석. 도 2c는 본 발명에 따라 파클리탁셀 측방향 유동 면역검정을 위한 대표적 시험 스트립을 나타낸다. 도 2c를 참조하면, 대표적 시험 스트립(200)은 샘플 패드(210), 접합 패드(220), 제1 포획 구역(232 및 234; T1 및 T2) 및 제2 포획 구역(238(C))을 갖는 막(230), 및 흡착 패드(240)를 포함한다. 도 2a 및 2b와 관련하여 상기 언급한 바와 같이, 샘플 패드(210), 접합체 패드(220), 막(230) 및 흡착 패드(240)는 샘플 패드에 도입된 액체 샘플이 접합체 패드 및 막을 통해 또는 이를 가로질러 흡착제 패드로 유동하도록 액체 연통하고 있고; 시험 스트립 성분의 크기 및 구성은 수행되는 파클리탁셀 분석에 적합하도록 달라질 수 있다(예를 들면, 하나 이상의 성분 패드 및 막은 도 2a에 제시된 바와 같이 한 성분으로부터 다른 성분으로 최적 유동을 촉진시키도록 중첩할 수 있다).
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 액체 샘플에서 파클리탁셀을 분석하는 방법으로서,
(a) 파클리탁셀을 포함하는 액체 샘플을 측방향 유동 분석 장치에 적용하는 단계로서, 상기 장치는
(i) 액체 샘플을 수용하기 위한 샘플 수용 구역;
(ii) 상기 샘플 수용 구역과 액체 연통하고 상기 샘플 수용 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 검출 시약 구역으로서, 상기 검출 시약 구역은 이에 부착된 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약은 검출가능한 리포트 그룹으로 표지된, 파클리탁셀 항체, 또는 파클리탁셀에 결합하는 이의 단편 또는 유도체인, 검출 시약 구역; 및
(iii) 상기 검출 시약 구역과 유체 연통하고 검출 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 포획 구역으로서, 상기 포획 구역은 이에 고정된 제1 및 제2 포획 시약을 포함하고, 상기 제1 포획 시약은 제2 포획 시약으로부터 유동 방향에서 상류에 위치되고, 상기 제1 포획 시약은 검출 시약에 결합할 수 있는 파클리탁셀 물질이고, 상기 제2 포획 시약은 검출 시약에 결합할 수 있는 항체인, 단계;
(b) 샘플을 검출 시약 구역을 통해 샘플 수용 구역으로부터 유동시켜 파클리탁셀을 갖는 검출 시약을 제공하는 단계(예를 들면, 검출 시약과, 결합된 파클리탁셀, 임의로 유리 검출 시약 및 임의로 유리 파클리탁셀과의 조합);
(c) 파클리탁셀을 갖는 검출 시약을 포획 구역을 통해 유동시키는 단계로서, 이에 의해 제1 포획 시약은 제1 포획 시약에 결합된 검출 시약을 제공하기 위해 유리 검출 시약에 결합하고, 제2 포획 시약은 결합된 파클리탁셀의 존재 또는 부재하에 검출 시약에 결합하는, 단계; 및
(d) 제2 포획 시약과 비교하여 제1 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 관찰하는 단계
를 포함하는, 액체 샘플에서 파클리탁셀을 분석하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 제1 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 파클리탁셀의 양을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 제1 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량하는 것은 그 중에서도 광학 밀도 측정을 포함한다.
적합한 검출가능한 리포트 그룹은 상기 기재되어 있다. 한 가지 실시형태에서, 검출가능한 리포트 그룹은 콜로이드성 금이다.
본 발명의 방법에 유용한 파클리탁셀 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 1×104 초과의 Kon을 갖는다. 대표적 Kon 값은 약 2×104, 4×104, 8×104, 1×105, 1×106 및 1×107 초과이다. 바람직한 범위는 약 1×104 내지 약 1×107이다.
본 발명의 방법에 유용한 파클리탁셀 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 1×10-3 미만의 Koff를 갖는다. 대표적 Koff 값은 약 1×10-3, 1×10-4, 1×10-5 및 1×10-7 미만이다. 바람직한 Koff 값은 약 1×10-3 내지 1×10-7 범위이다.
특정한 실시형태에서, 파클리탁셀 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 1×104 내지 약 1×106의 Kon 및 약 1×10-3 내지 약 1×10-4의 Koff를 갖는다.
Kon 값 및 Koff 값을 측정하는 방법은 실시예 4에 기재되어 있다.
한 가지 실시형태에서, 항체는 높은 Kon 및 낮은 Koff(예: 최소 Kon은 2.0×105이고, 최대 Koff는 1.0×10- 3이다). 이러한 실시형태에서, 포획 라인은 0.0 내지 0.4 T/C에 배치되어 있다. 이러한 부류에 있어서, 모노클로날 항체 조작은 Kon을 가능한 많이 증가시키면서 Koff를 일정하게 유지시키는데 초점을 맞출 것이다. Kon이 보다 크면, 항체 검출이 보다 양호하다.
또 다른 실시형태에서, 항체는 낮은 Kon 및 높은 Koff를 갖는다(예를 들면, 최소 Kon은 2.0×104이고, 최대 Koff는 2.0×10- 4이다). 이러한 실시형태에서, 포획 라인은 0.2-1.0 T/C에 배치되어 있다. 이러한 부류에 있어서, 모노클로날 항체 조작은 Koff를 가능한 많이 감소시키면서 Kon을 일정하게 유지하는데 초점을 맞출 것이다. off 속도가 보다 낮으면, 검출을 위한 항체가 보다 양호하다.
특정 실시형태에서, 파클리탁셀 항체는 3C6이다. 다른 실시형태에서, 파클리탁셀 항체는 8A10이다. 추가의 실시형태에서, 파클리탁셀 항체의 조합이 사용될 수 있다(예: 3C6 및 8A10). 이들 항체는 하기에 상세히 기재되어 있다.
분석에서, 제1 포획 구역은 검출 시약에 결합하기 위해 파클리탁셀과 경쟁하는 파클리탁셀 항원인 고정된 파클리탁셀 물질을 포함한다. 제1 포획 구역은 결합된 파클리탁셀을 포함하지 않는 검출 시약(즉, 유리 검출 시약)을 포획한다. 특정 실시형태에서, 파클리탁셀 물질은 파클리탁셀 단백질 접합체이다. 적합한 단백질 접합체는 혈청 알부민 접합체, 예를 들면, BSA-파클리탁셀을 포함한다.
분석에서, 제2 포획 구역은 검출 시약에 결합할 수 있는 고정된 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 염소 항-마우스 항체이다.
상기 언급한 바와 같이, 분석에서 파클리탁셀 검출 감도는 샘플이 측방향 유동 장치(예: 샘플 수용 구역) 및 제1 포획 시약에 도입되는 지점 사이의 거리를 변화시킴으로써 최적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리는 파클리탁셀 검출 감도를 최적화하기 위해 최소화된다. 특정 실시형태에서, 상기 거리는 20mm 미만, 10mm 미만, 5mm 미만, 3mm 미만, 2mm 미만, 또는 1mm 미만이다. 특정 실시형태에서, 상기 거리는 20 내지 1mm, 10 내지 1mm, 5 내지 1mm, 3 내지 1mm, 또는 2 내지 1mm이다.
최적화는 T(시험 라인) 및 C(대조군 라인)의 상대적 위치로서 기재될 수 있다: T/C, 원점이 포획 구역의 상류 엣지(도 2a 내지 2c에서 막(230)의 상류 엣지)로서 정의되는 경우, 이는 원점으로부터 T까지의 거리/원점으로부터 C까지의 거리 비율로서 정의된다. T/C는 약 0.0 초과(즉, 제1 포획 시약은 포획 구역의 상류 엣지에 배치된다), 또는 약 0.01, 약 0.02, 약 0.04, 약 0.08, 약 0.10, 약 0.20, 약 0.40, 약 0.80 초과, 또는 약 1.0 미만(즉, 제1 포획 시약은 포획 구역의 하류 엣지에 배치되고, 제2 포획 시약은 제1 포획 시약과 포획 구역의 하류 엣지의 중간에 배치된다)이다. 바람직하게는, T/C는 약 0.2 내지 약 0.7이다.
특정 실시형태에서, 제1 거리 대 제2 거리의 비율은 약 0.0 내지 약 0.40이다. 다른 실시형태에서, 제1 거리 대 제2 거리의 비율은 약 0.20 내지 약 1.0이다.
특정 실시형태에서, 제2 포획 시약에 결합되는 과량의 검출 시약의 양을 관찰 및 측정한다. 특정 실시형태에서, 샘플 중의 파클리탁셀의 양을 측정하는 것은 최종 포획 시약(시험 라인)을 제2 포획 시약(대조군 라인)에 관련시킴으로써 측정된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 대표적 분석은 하나 이상의 제1 포획 구역에 하나 이상의 제1 포획 시약을 포함한다. 이들 특정 실시형태에서, 상기 방법은 제1(T1, 도 2c에서 232) 및 제2(C, 도 2c에서 238) 포획 구역의 중간에 제3 포획 구역(T2, 도 2c에서 234 참조)을 포함하고, 상기 제3 포획 구역은 검출 시약에 결합할 수 있는 파클리탁셀 물질을 포함한다. 제1 및 제3 구역 중의 파클리탁셀 물질은 동일하거나 상이할 수 있다. 이들 특정 실시형태에서, 샘플 중의 파클리탁셀의 양은 제1 및 제2 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 측정된다. 제1 및 제2 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량하는 것은 광학 밀도 측정을 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 측방향 유동 장치는 포획 시약 구역과 액체 연통하고 포획 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 흡착 구역을 추가로 포함한다.
도 3은 대표적 분석물(파클리탁셀)의 양이 변화되는 분석 조건에 대한 대표적 시험 스트립 대상체의 이미지이다. 이들 분석 구성에서, 막(230)은 3개 포획 구역을 포함하고; 시험 라인 1 및 시험 라인 2는 제1 포획 물질로서 고정된 항원(파클리탁셀, 고정된 BSA-파클리탁셀의 형태)을 사용한 포획을 나타내고; 대조군 라인은 제2 포획 물질로서 고정된 항체(염소 항-마우스 항체)를 사용한 포획을 나타낸다. 이러한 분석에서, 검출 시약은 콜로이드성 금으로 표지된 항-파클리탁셀 항체(8A10)였다.
본 발명의 방법 및 장치는 생물학적 샘플에서 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 프로드러그의 임의 제형을 포함하여 파클리탁셀의 수준을 검출하는데 유용하다. 파클리탁셀의 제형은 파클리탁셀의 전달을 촉진시키기 위한 임의의 공지된 작용제, 예를 들면, 중합체성 나노입자, 액체-계 나노입자 제형, 중합체 접합체, 무기 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정 및 사이클로덱스트린 나노입자를 포함한다.
본 발명의 방법 및 장치에 따르는 대표적 측방향 유동 면역검정의 기재는 실시예 3에 기재되어 있다.
파클리탁셀 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 파클리탁셀에 결합하는 항체(예: 모노클로날 항체 또는 mAb)를 제공한다. 8A10 및 3C6으로 지칭되는 mAb는 MabSelet(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)를 사용하여 항체-풍부 수거된 배지로부터 정제했다. mAb는 문헌[참조: J-G Leu et al., Cancer Res. (1993) 53:1388-1391]에 기재된 바와 같이 제조된 BSA-파클리탁셀에 대한 이들의 결합에 기반하여 선택했다.
한 가지 측면에서, 본 발명은 8A10, 3C6으로부터 선택된 모노클로날 항체 및 이의 단편 또는 유도체를 제공하고, 상기 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 파클리탁셀에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는, 임의의 항체-생성 동물(예: 마우스, 랫트, 래빗, 낙타, 및 인간을 포함한 영장류)로부터 유래되거나 합성 또는 재조합에 의해 생성되고, 목적하는 표적(예: 파클리탁셀) 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항체 단편을 포괄한다. 예시적 항체는 폴리클로날, 모노클로날 및 재조합 항체; 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체); 인간화된 항체; 마우스 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 모노클로날 항체; 및 항-이디오타입 항체를 포함하고, 항원 결합 단편 등의 임의의 완전한 분자 또는 이의 단편일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 모노클로날 항체는 이들이 치료 약물(예: 파클리탁셀) 등의 선택 항원의 결합에서 증가된 특이성을 제공하기 때문에 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 전장 항체로부터 또는 관련된 항원 결합 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 실예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv　단편, 디아바디, 나노바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는, 항원 결합을 위해 scFv가 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키메라 항체"는, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래하면서, 비-인간 종(예: 설치류)으로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성-결정 영역을 함유하는 재조합 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간화된 항체"는, 인간 항체 프레임워크 내로 이식되는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 특정한 상보성-결정 영역에 적합하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화된 항체는 전형적으로, 항체 상보성-결정 영역만이 비-인간 기원의 것인 재조합 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 항체 또는 항체 단편이 참조 항체로부터 생성된 것을 나타낸다. 예를 들면, 종종 참조 항체의 결합 특성을 변형 또는 증강시키는 것이 바람직하다. 따라서, 항체는 결합 특성을 변화시키기 위해 코딩 DNA로 처리한 돌연변이체를 포함하여 다양한 변형체로 처리될 수 있다. 이어서, 변형된 특성을 갖는 수득되는 항체는 참조 항체의 "유도체"로서 지칭된다. 예를 들면, 항체 유도체는 참조 항체에 적용된 친화성 돌연변이 프로세스로부터 수득되는 돌연변이체(또는 참조 항체를 코딩하는 핵산)를 함유하는 항체일 수 있다. 이러한 돌연변이체는 변화된(예: 개선된) 결합 친화성, 선택성 등을 갖는 항체를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 서열번호 2, 4, 6 또는 8에 함유된 CDR과 적어도 95% 상동성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 하기 보다 상세하게 기재된 서열번호 2 및 4는 각각 8A10 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이다. 또한, 하기에 보다 상세하게 기재된 서열번호 6 및 8은 각각 3C6 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열이다. 각각의 가변 영역은 하기에 나타내는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중의 어느 하나에 함유된 1, 2 또는 3개 모두의 CDR과 적어도 95% 상동성을 갖는 1, 2 또는 3개 모두의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 중쇄 및 경쇄를 갖고, 이는 8A10 가변 경쇄 및 중쇄 영역(서열번호 2 및 4에서)에 의해 제공된 CDR 영역의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 3C6 가변 경쇄 및 중쇄 영역(서열번호 6 및 8에서)에 의해 제공된 CDR 영역의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 CDR은 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중의 임의의 하나에서 하나 이상의 CDR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 서열 동일성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "퍼센트 상동성" 또는 "퍼센트 상동성"은, 본 발명의 실시에 사용된 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 최대 퍼센트 상동성을 달성하기 위해 서열을 정렬시킨 후에 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상동성인 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 비교를 수행하는 경우, 최상의 정렬을 달성하기 위해 바이오마커 서열 내에 어떠한 갭도 도입되지 않는다. 아미노산 서열 상동성은, 예를 들면, 하기 방식으로 결정할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열은 BLASTP 프로그램을 사용하는 GenBank 데이터베이스 등과 같은 단백질 서열 데이터베이스를 검색하기 위해 사용된다. 상기 프로그랩은 갭이 없는 방식으로 사용된다. 디펄트 필터링은 낮은 복잡성의 영역에 기인하여 서열 상동성을 제거하기 위해 사용된다. BLASTP의 디펄트 파라미터가 사용된다.
본 발명의 분석 방법에 유용한 대표적 파클리탁셀 항체(3C6 및 8A10)의 생성, 처리, 정제, 특성화 및 최적화는 실시예 2에 기재되어 있다. 본 발명의 항체는 탁솔® 또는 KLH에 접합된 박카틴으로 마우스를 면역화시킴으로써 생성된다. 항체는 다음과 같이 요약된다: 3C6 항-탁솔® IgG2a,k, 3H5 항-박카틴 III IgG1, 8A10 항-탁산 IgG2a. 3C6, 3H5 및 8A10 항체의 교차 반응성 프로파일은 표 1에서 다양한 탁산에 대한 이들의 IC50 값에 의해 제시되어 있다.
파클리탁셀 항체 교차-반응성.
탁산 3C6 3H5 8A10
파클리탁셀 (탁솔®) 10 nM >316 nM 7 nM
10-데아세틸탁솔 15 nM >333 nM 10 nM
7-에피-10-데아세틸탁솔 25 nM >333 nM 15 nM
7-크실로실-10-데아세틸탁솔 30 nM >286 nM 17 nM
7-에피-탁솔 80 nM >316 nM 50 nM
세팔로만닌 220 nM >325 nM 8 nM
박카틴 III >511 nM 10 nM 12 nM
박카틴 V >460 nM 10 nM 10 nM
10-데아세틸박카틴 III >551 nM 230 nM 21 nM
7-에피-10-데아세틸박카틴 III >469 nM 150 nM 27 nM
탁소테레(Taxotere)® >318 nM >318 nM 10 nM
2-디벤조일-2-(p-트리플루오로메틸벤조일)탁솔 >293 nM >293 nM >293 nM
20-아세톡시-4-데아세틸-5-에피-20,O-세코탁솔 >310 nM >310 nM >293 nM
동적 검출 범위를 달성하도록 진단 적용에서 항체를 효과적으로 사용하기 위해, 성공적으로 최적화될 필요가 있는 2개의 주요 인자는 표적화된 항원에 대한 항체 특이성 및 친화성이다. 3C6 및 8A10 모노클로날 항체는 파클리탁셀에 대해 고도의 특이성 및 친화성을 갖고, 이는 이들이 표적화된 파클리탁셀의 단일 에피토프에 고도로 상동성 방식으로 특이적으로 결합하는 것을 나타낸다. 이러한 특이성은 또한 검출 분석에서 교차 반응성 문제를 제거하는 역할을 한다. 특이성과 관련하여, 모노클로날 항체는 또한 진단 시험에서 동적 검출 범위를 달성하기 위해 항원에 대해 최적화된 및 개선된 친화성을 가질 수 있고, 이는 친화성 돌연변이의 프로세스에 의해 달성될 수 있다. 추가로, mAb는 신속한 유동 분석과 호환성이 있도록 신속한 Kon에 대해 선택될 수 있다.
도 4에 설명된 바와 같이, 3C6 및 8A10 모노클로날 항체 둘 다는 약 100 내지 200ng/mL의 감도 한계와 함께 약 10nM의 겉보기 Kd 값을 갖는다.
하기 실시예는 본 발명을, 한정이 아닌, 예시하기 위한 목적으로 제공된다.
실시예 1
분석 시약
이 실시예에는 본 발명의 분석 방법 및 장치에 유용한 대표적 검출 시약 및 포획 시약의 제조가 기재되어 있다.
검출 시약: 항체- 콜로이드성 금 접합체. 요약하면, 항체(실시예 2 참조)를 0.5×PBS에서 1mg/mL로 희석시키고, 하기 단계를 수행했다: (1) 금을 진탕 또는 와동시켜 임의의 정착된 금을 재현탁시킨 다음, 0.5mL 네이키드 금 졸 (Naked Gold sol)을 10개의 깨끗한 개개 시험관에 배치하고; (2) 각각의 튜브를 제공된 pH 차트로부터 pH 값(또는 1 내지 10)으로 표지하고; (3) pH 차트를 사용하여 마이크로리터의 상이한 양의 완충제를 각 시험관에 첨가하고, 진탕시켜 혼합하고; (4) 저속 와동기 (vortexer)에 각 튜브를 배치하고, 항체 용액을 첨가하고, 철저하게(약 2 내지 3초) 혼합하고(20nm 금의 경우, 항체 또는 단백질의 2mg/mL 용액 14μL가 최적이다); (5) 일부 튜브 상에 농자색 및/또는 흑색 침전물은 항체 또는 단백질이 개개 금 용액의 교차-결합을 유도(교차-결합된 용액은 면역학적 분석에 사용될 수 없고 폐기되며; 농자색 용액은 또한 대부분 불활성이고; 약간 자색 또는 색 변화가 없는 튜브만이 면역학적 분석에 유용하다)하는 이의 등점점 이하임을 나타내고, (6) 반응을 총 30분 동안 지속시키고; (7) 50μL 차단 용액의 첨가에 의해 반응을 중단시킨다.
포획 시약: 파클리탁셀 -알부민 접합체. 파클리탁셀-알부민 접합체(예: BSA-파클리탁셀)은 문헌[참조: J-G Leu et al., Cancer Res. (1993) 53:1388-1391]에 기재된 바와 같이 제조했고, 일반적으로 다음과 같다. 2'-헤미석시닐탁솔의 합성을 위해, 결정은 캐리어 단백질에 대한 탁솔의 접합을 위한 출발 물질이다. 탁솔(20mg) 및 석신산 무수물(36mg)을 4시간 동안 실온에서 진공하에 P2O5 상에서 건조시키고, 무수 피리딘 480μL에 용해시켰다. 밤새 실온에서 정치시킨 후, 피리딘을 진공하에 제거하고, 잔사를 증류수 2mL로 1회 세척했다. 아세톤(1mL)을 첨가하고, 증류수를 소수의 결정(2'-헤미석시닐탁솔)이 나타날 때까지 아세톤 용액에 적가했다. 혼합물을 3시간 동안 4℃에서 유지시키고, 결정은 여과에 의해 회수하고, 진공하에 건조시켰다. 생성물 수율은 70%였다.
투석 단계는 임의의 비접합된 탁솔을 제거한다. 2'-헤미석시닐탁솔(10mg)을 1mL DMSO 및 300μL 아세토니트릴에 용해시킨 다음, n-트리부틸아민 50μL(35mg; 0.19mmol)을 첨가했다. 혼합물을 빙욕에서 4℃로 냉각시키고, 이소부틸클로로포르메이트 25μL(25mg; 0.18mmol)을 혼합물에 첨가하고, 이를 30분 동안 아이스 상에 유지시켰다. 용액을 BSA 용액[25mg, 증류수 3mL 중의 (3.73 × 10-4mmol), pH 9.5, 4℃에서]에 적가했다. pH는 1N HCl을 사용하여 즉시 7.5로 조정하고, 혼합물을 밤새 4℃에서 유지시키고, 4℃에서 밤새 PBS에 대해 투석했다.
한 가지 예시적 실시형태에서, 측방향 유동 시스템을 평가했다. 0.5mg/mL BSA-파클리탁셀(시험 라인) 및 0.5mg/mL 염소 항-마우스 항체(대조군 라인)를 시스템의 막 상에 스트리핑시켰다. 파클리탁셀 항체-콜로이드성 금 접합체는 시스템을 통해 유동했다. BSA-파클리탁셀에 결합된 항체-콜로이드성 금 접합체는 막 상에 고정되었고, 강력한 신호를 생성했다. 상기 신호는, 감소된 신호가 파클리탁셀을 샘플 내로 스파이크에 첨가하는 경우에 관찰되기 때문에 파클리탁셀에 특이적이었다.
실시예 2
파클리탁셀 항체
본 실시예에는 본 발명의 방법 및 장치에 유용한 대표적 파클리탁셀 항체의 생성, 처리, 정제, 특성화 및 최적화가 기재되어 있다.
항체 생성 및 처리. 세포를 5-10% FBS 및 1×Pen/Strep과 함께 CCM1(Hyclone)에서 성장시켰다. 이들이 >1×106 세포/mL의 밀도에 도달한 경우 분할했다(1:4). 이어서, 세포를 동결시키고, 백업으로서 2개의 별개의 액체 질소 극저온 탱크에 저장했다. 세포는 1×106 세포/mL의 밀도에 도달할 때까지 롤러 병에서 배양했다. 이 시점에서, 배양물은 더이상 공급되지 않고, 세포 생존율을 매일 모니터링했다. 세포 생존율이 <50%로 감소되는 경우, 세포를 제거하고, 항체-풍부 배지를 수거했다.
항체의 친화성 정제. 투석은 PBS(pH 7.4)를 사용하여 수행하고, 수거된 항체는 50Kd 컷-오프 막을 사용하여 10배 농축시켰다. MabSelect(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)을 친화성 정제에 사용했다. 용량 및 산출량 둘 다에 대해 최적화된 소수성의 고-유동 아가로즈 비드 및 r단백질 A 리간드의 배향된 커플링은 순도 및 수율이 높은 생성물 풀을 전달한다.
정제 작동 프로그램.
Figure pct00001
항체 친화성. BSA-파클리탁셀 항원에 대한 무손상 IgG(8A10 및 3C6)의 직접 결합에 대한 결과 플롯은 도 4에 제시되어 있다. 1×PBS에서 3.5㎍/mL의 농도로 BSA-파클리탁셀 항원 50μL는 플레이트에 결합시키고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS/0.05 트윈 20으로 4회 세척했다. 플레이트는 실온에서 PBS/0.05% 트윈 20 중의 1% BSA와 함께 2시간 동안 차단시켰다. 플레이트는 PBS/0.05 트윈 20으로 4회 세척했다. 항체 샘플(8A10 및 3C6) 50μL가 결합했다(300nM에서 출발하고, 역가를 3s까지 저하시킴). 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 4회 세척했다. 염소 항 mIgG 홀스래디쉬 퍼옥시다제(1:5000 희석) 50μL가 결합했고, 이어서 기질 용액 TMB 50μL를 첨가하고, 색을 발색시켰다. 반응은 50μL 1M HCl로 중단시키고, 광학 밀도는 450nm에서 판독했다. BSA-파클리탁셀 항원에 대한 무손상 IgG(8A10 및 3C6)의 직접 결합의 결과는 도 4에 제시되어 있다.
항체 최적화. 친화성 성숙을 포함하는 항체 최적화가 수행되었다. 이 접근법은 (1) 하이브리도마 세포주로부터 생성된 항체를 서열분석함으로써 항체의 특성화, (2) CDR 영역에 초점을 맞춘 항체 라이브러리 작제하고; (3) 유리한 돌연변이체를 스크리닝하고, (4) 유리한 돌연변이체를 조합하는 것이다.
단계 1: Fab로서 항-파클리탁셀의 클로닝 및 발현.
A. 항체(8A10 및 3C6)의 가변 영역의 서열분석은 하이브리도마 세포로부터 생성되었다.
i. 총 RNA 추출 및 mRNA 변성
총 RNA는 QIAGEN RNeasy 미니 키트를 사용하여 2개의 하이브리도마 세포(8A10 및 3C6)로부터 추출했다. mRNA 혼합물(하기 기재됨)은 72℃에서 3분 동안 인큐베이션하고, 42℃로 2분 동안 냉각시켰다. 냉각 후, 튜브를 14,000×g에서 10초 동안 간단히 원심분리하여 하부에서 내용물을 수집했다.
mRNA 혼합물
Figure pct00002
ii. cDNA 합성 및 5' RAGE 반응
cDNA 합성 및 5' RAGE 반응은 하기 제시된 바와 같이 수행했다.
Figure pct00003
iii. 아가로즈 겔 전기영동에 의한 PCR 반응의 분석
PCR 증폭의 생성물은 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 8A10 및 3C6 mAb의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응하는 앰플리콘의 존재를 확인했다.
iv. 클로닝, 서열분석 및 CDR 분석
PCR 양성 밴드를 벡터 내로 클로닝시키고, 서열분석했다. 항체 서열 분석은 8A10 및 3C6에 대해 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 동정했다. 최초로 3C6에 있어서, 하나의 경쇄 및 무 중쇄(이상 서열)만이 동정되었다. 따라서, N-말단 서열분석 결과로부터 수득된 서열에 따라 설계된 특이적 프라이머는 중쇄의 재-PCR에 사용되었다. 결과적으로, 3C6에 대한 중쇄의 동정이 달성되었다.
8A10 하이브리도마
8A10 하이브리도마 서열분석 결과는 하기에 기재되어 있다.
8A10 가변 경쇄 핵산 서열은 서열번호 1이다:
GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAA AAA TTC ATG TCC ATA ACA CTA GGA GAG AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG CCC AGT CAG AAT GTG GGT TCT GCT GTA ACC TGG TGG CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT CCT AAA CTA CTG ATT TAC TCA GCT TCC AAT CGG TAT ACT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATT AGT AAT GTG CAG TCT GAA GAC CTG GCA GAT TAT TTC TGT CAA CAA TAT AGC AGC TAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CG (서열번호 1).
CDR 영역을 코딩하는 서열은 밑줄되어 있다.
상응하는 8A10 가변 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 2이다:
DIVMTQSQKFMSITLGERVSITCKPSQNVGSAVTWWQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGTKLEIKR (서열번호 2).
3개의 CDR 영역은 밑줄되어 있다(즉, CDRL1은 KPSQNVGSAVT이고, CDRL2는 SASNRYT이고, CDRL3은 QQYSSYPYT이다).
8A10 가변 중쇄 핵산 서열은 서열번호 3이다:
GAG GTC CAG CTG CAA CAA TCT GGA CCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATT TCC TGT AAG GCT TCT GGA TAC ACG TTC ACT GAC TCC ACC ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT GAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT AAC TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAG TCC TCC AGC ACA GCC TAT ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG GTC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA (서열번호 3).
CDR 영역을 코딩하는 서열은 밑줄되어 있다.
상응하는 8A10 가변 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 4이다:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDSTMNWVKQSHGKSLEWIGEIDPNNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARGVWGQGTTLTVSS (서열번호 4).
3개의 CDR 영역은 밑줄되어 있다(즉, CDRH1은 GYTFTDSTMN이고, CDRH2는 EIDPNNGGTNYNQKFKG이고, CDRH3은 GV이다).
3C6 하이브리도마
3C6 하이브리도마 서열분석 결과는 하기에 기재되어 있다.
3C6 가변 경쇄 핵산 서열은 서열번호 5이다:
GAT GTT GTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTG GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT CGT CAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGT AGT GGA TCA GGG ACA GAA TTC ACA CTC GAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA C (서열번호 5).
CDR 영역을 코딩하는 서열은 밑줄되어 있다.
상응하는 3C6 가변 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 6이다:
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTEFTLEISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK (서열번호 6).
3개의 CDR 영역은 밑줄되어 있다(즉, CDRL1은 RSRQSLVHSNGNTYLH이고, CDRL2는 KVSNRFS이고, CDRL3은 SQSTHVPPT이다).
3C6 가변 중쇄 핵산 서열은 서열번호 7이다:
GAG GTG CAG CTT CAG GAG TCG GGA CCT AGT CTC GTG AAA CCT TCT CAG ACT CTG TCC CTC ACC TGT TCT GTC ACT GGC GAC TCC ATC ACC AGT GGT TAC TGG AAC TGG ATC CGG AAA TTC CCA GGG AAT AGA CTT GAG TAC ATG GGG TAC ATA AGC TAC AGT GGT AGC ACT TAC TAC AAT CCG TCT CTC AAA AGT CGA ATC TCC ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAG AAC CAG TAC TAC CTA CAT TTG ACT TCT GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCC CAA GGG GAT GGC GCC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA (서열번호 7).
CDR 영역을 코딩하는 서열은 밑줄되어 있다.
상응하는 3C6 가변 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 8이다:
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKPGNRLEYMGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLHLTSVTTEDTATYYCAQGDGAYWGQGTTLTVSS (서열번호 8).
3개의 CDR 영역은 밑줄되어 있다(즉, CDRH1은 GDSITSGYWN이고, CDRH2는 YISYSGSTYYNPSLKS이고, CDRH3은 GDGAY이다).
Figure pct00004
Figure pct00005
B. M13 유전자조작 벡터 내로 mAb의 가변 영역의 클로닝.
mAb(즉, 8A10 및 3C6)의 VL, C 카파 및 VH 영역을 코딩하는 DNA는 PCR을 사용하여 서열 특이적 프라이머로 증폭시켰다. 수득되는 PCR 생성물을 겔-정제하고, lacZ 프로모터의 조절하에 M13-기반 파지 벡터 내에서 특이적 부위에 대해 제한 소화시켰다. 8A10 및 3C6 mAb의 VL, C 카파 및 VH 영역을 코딩하는 이중가닥 DNA를 인간 IgG1의 CH1 영역의 불변 영역에 대한 유전자를 함유하는 파지-기반 벡터 내로 결찰시켰다. DNA를 이. 콜라이(E. coli) 내로 형질전환시키고, 수득되는 플라크 함유 파지를 상세하게 검사했다. 플라크를 랜덤으로 선택하고, 이들의 DNA를 단리하고, 서열을 결정했다. 클론 8A10_1은 mAb 8A10의 것과 VL, C 카파 및 VH 영역에 대한 동일한 서열을 갖는 것으로 결정되었다(도시되지 않음). 3C6에 대한 클로닝 프로세스는 동일한 프로토콜에 따라 수행할 수 있다.
C. M13 유전자조작 벡터로부터 생성된 Fab의 파클리탁셀 결합 활성의 입증.
XL1-블루 이. 콜라이(그램-음성)의 클론 8A10_1 파지-감염된 배양물을 IPTG로 유도하면서 성장시키고, 원심분리를 통해 수거하고, 주변세포질 내용물을 삼투압 쇼크(peripre)에 의해 방출시켰다. 방출된 Fab 생성물을 배양물로부터 단리시켰다. Fab 농도는 ELISA에 의해 정량하고, Fab의 항원 특이적 결합은 무손상 IgG와 함께 파클리탁셀 ELISA를 사용하여 수행했다(도시하지 않음). 2개 무손상 IgG의 Kd 값(두 항체에 대해 대략 10nM)은 이전에 보고된 것들에 필적했다(도 3 참조). Fab 8A10의 Kd 값은 또한 10nM인 것으로 측정되었고, 이는 무손상 IgG 8A10의 것과 동일하다. 이들 결과는 모 항체 8A10의 정확한 가변 영역 서열이 본 Fab 8A10에 존재하고 정확하게 폴딩되고 M13 유전자조작 벡터로부터 Fab 형식으로 발현됨을 시사한다.
Fab는 BSA-파클리탁셀 접합체 코팅된 웰에 대한 농도-의존성 결합을 입증하기 위해 주변세포질 프렙에서 충분히 양호하게 발현했다.
실시예 3
대표적 고체 상 경쟁 분석
본 실시예에는 고체-상 경쟁 분석의 유효성을 입증하는 대표적 분석이 기재되어 있다. 이 분석은 샘플 중의 파클리탁셀의 존재에 대한 정보적 신호를 제공하기 위해 이러한 검출 형식으로 본원에 기재된 항-파클리탁셀 항체를 사용하는 유용성을 입증한다. 이 결과는 항체의 가변 배치가 분석 성능을 증강시킬 수 있음을 입증한다.
파클리탁셀 측방향 유동 시스템. 1.2mg/mL BSA-Pac(시험 라인, T) 및 0.2mg/ml의 염소-항-마우스 항체(대조군 라인, C)를 막 카드(고도-유동 + HF180 막 카드, Millipore) 상으로 스트리핑시켰다. 항-파클리탁셀 항체-콜로이드성 금 접합체를 흡수시키고, 접합체 패드(유리 섬유 패드, Millipore) 상으로 건조시켰다. 파클리탁셀(10μL)로 스파이킹하고 80μL의 PBS 트윈으로 추격한 (chased by) 태소 혈청(FBS)을 이 분석에서 유동시켰다.
탠덤 항체 분석. 항체-금 접합체는 증류수를 사용하여 재구성하고, 이어서 서로 첨가하여 적절한 농도를 작성했다. 이러한 탠덤 항체 용액을 적용하고, 이어서 분석 접합체 패드 상에서 건조시켰다.
판독기 출력: 강도 대 위치. 시험 스트립을 스캔한 결과의 판독. 스트립은 퀴아겐 판독기(Qiagen, Germany)를 사용하여 판독했다.
파클리탁셀 표준 곡선. 대조군 라인에 대한 시험 라인의 비율 대 파클리탁셀 농도의 표준 곡선을 생성했다.
도 5a 및 5b는 라인 T1 및 T2에서 결합된 8A10에 대한 곡선을 나타낸다. 도 5a는 표준 곡선, 즉 대조군 라인에 대한 시험 라인의 비율(T/C) 대 파클리탁셀 농도를 나타낸다. 보다 낮은 농도에 대한 T1 대 T2에서 8A10에 대한 비율의 큰 차이는, 분석물의 농도가 보다 높은 가능성이 있는 경우, 샘플 포트에 보다 근접하게 배치할 때에 항체에 대한 훨씬 높은 감도를 나타낸다. 도 5b는 판독기 장치에 의해 제공된 스캔된 시험 스트립의 출력 강도 대 위치 판독치를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 라인 T1 및 T2에서 결합된 3C6에 대한 곡선을 나타낸다. 도 6a는 표준 곡선, 즉 대조군 라인에 대한 시험 라인의 비율(T/C) 대 파클리탁셀 농도를 나타낸다. 보다 낮은 농도에 대한 T1 대 T2에서 3C6에 대한 비율의 비교적 작은 차이는, 분석물의 농도가 보다 높은 가능성이 있는 경우, 감도의 비교적 낮은 개선이 항체를 샘플 포트에 보다 근접하게 배치하기 위해 획득될 수 있음을 나타낸다. 그러나, T2와 비교하여 신호 강도의 개선이 관찰되었다. 도 6b는 판독기 장치에 의해 제공된 스캔된 시험 스트립의 출력 강도 대 위치 판독치를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 라인 T1 및 T2에서 결합된 조합된 8A10 및 3C6에 대한 곡선을 나타낸다. 도 7a는 표준 곡선, 즉 대조군 라인에 대한 시험 라인의 비율(T/C) 대 파클리탁셀 농도를 나타낸다. 분석은 팸플 포트에 근접한 8A10의 높은 감도 및 위치 독립적인 T2에서 3C6의 보다 높은 감도를 조합함으로써 보다 견고하게 되었다. 도 7b는 판독기 장치에 의해 제공된 스캔된 시험 스트립의 출력 강도 대 위치 판독치를 나타낸다.
상기 분석(및 도 5 내지 7)에서, 도 5b, 6b 및 7b에서 T1, T2 및 C(Pos [mm])의 위치 측정은 시험 스트립의 유동 방향에서 하류측 말단으로부터 이루어졌다(예를 들면, 샘플은 55mm 지점에서 도입했고, T2는 약 45mm에서 도입했고, T1은 약 40mm에서 도입했고, C는 약 35mm에서 도입했다).
실시예 4
항체 결합 특성을 측정하는 방법
본 실시예에는 항체 특성을 측정하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 바이아코어 분석을 사용하는 프레시젼 안티바디 인코포레이티드(Precision Antibody, Inc.; Columbia, MD)에 의해 수행했다. 본 실시예는 또한 본 발명의 LFA 분석이 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 등의 다른 고체 상 분석에 어떻게 적용될 수 있는지를 나타낸다.
결합 실험은 25℃에서 바이아코아 3000 장치(GE, Pittsburgh, PA) 상에서 수행했다. 대략 13,000RU의 항-BSA ab(Life Technologies, A11133, lot 1637270)를 아민 커플링(EDC/NHS)에 의해 CM5 칩의 유동 세포 2 상에 직접 고정시켰다. 110 내지 120RU의 BSA-파클리탁셀(BSA-Ag)가 포획되었다. 유동 세포 1은 동일한 방식으로 처리했지만 리간드가 부재했고 기준 감산을 위한 블랭크 표면으로 사용되었다. 비점유 위치는 1M 에탄올 아민으로 차단시켰다. 분석물 Ab1(8A10) 및 Ab2(3C6)은 가변 농도에서 칩 상으로 유동시켰다. 항체에 대한 항원의 결합을 실시간으로 모니터링하여 on(ka) 및 off(kd) 비율을 수득했다. 평형 상수(KD)는 관찰된 ka 및 kd로부터 계산했다.
완전한 동태 분석은 2배 연속 희석으로 나타낸 바와 같이 분석물 농도를 사용하여 수행했다. 출발 농도는 200nM이었고, 이어서 100, 50, 25, 12.5 및 0nM이었다. 100nM 농도는 이중으로 작동시켜 분석의 재현성을 확인했다. 완전한 동태 분석 결과는 표 3에 요약되어 있다.
분석 완충제는 10mM HEPES 완충제(pH 7.4), 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20(폴리옥시에틸렌솔비탄)이었다. 재생 완충제는 10mM 글리신 완충제(pH 2.0)이었다. 접합 완충제는 10mM 나트륨 아세테이트 완충제(pH 5.0)이었다. 리간드의 포획에 사용된 유동 속도는 1μL/분이었다. 동태 분석을 위한 유동 속도는 50μL/분이었다.
카이 자승(χ2) 분석은 분석의 정확도를 결정하기 위해 실제 센서그램 및 BIAnalysis 소프트웨어로부터 생성된 센서그램 사이에서 수행되었다. 1 내지 2 내의 χ2 값은 유의한(정확한) 것으로 간주되고, 1 미만은 매우 유의한(매우 정확한) 것으로 간주된다.
3개의 독립적 SPR 작동의 요약은 표 4에 제시되어 있다.
완전한 동태 분석.
리간드 분석물 ka(1/Ms) Kd(1/s) Rmax KA(1/M) KD(M) Con (nM) χ2
BSA-Ag
(110RU)		 Ab1 4.70×105 3.04×10-4 4.01 1.55×109 6.45×10-10 0-100 0.173
BSA-Ag
(110RU)		 Ab2 2.05×104 9.67×10-4 15.6 2.12×107 4.72×10-8 0-200 0.179
SPR 요약
항체 장치 칩 상 On-비율 Off-비율 Kd Rmax 주
8A10 바이아코어 3000 항체 1.6×106 2.0×10-3 1.3×10-9 3.6
바이아코어 T-200 항체 2.4×105 8.7×10-4 3.6×10-9 8.6
바이아코어 3000 항원 4.7×105 3.0×10-4 6.5×10-10 4.0
3C6 바이아코어 3000 항체 2.8×104 2.9×10-4 1.0×10-8 54.4 단일점
바이아코어 T-200 항체 1.8×104 2.2×10-4 1.2×10-8 112
바이아코어 3000 항원 2.1×104 9.7×10-4 4.7×10-8 15.6
예시적 실시형태가 설명되고 기재되었지만, 다양한 변화가 본 발명의 정신 및 범위로부터 일탈하지 않고서 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AUTOTELIC <120> METHODS, DEVICES, AND REAGENTS FOR MONITORING PACLITAXEL CONCENTRATION IN PLASMA FOR PHARMACOKINETIC-GUIDED DOSING OF PACLITAXEL <130> IPA161349-US <150> US 61/975,386 <151> 2014-04-04 <150> US 62/051,757 <151> 2014-09-17 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccataa cactaggaga gagggtcagc 60 atcacctgca agcccagtca gaatgtgggt tctgctgtaa cctggtggca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gatttactca gcttccaatc ggtatactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagtaa tgtgcagtct 240 gaagacctgg cagattattt ctgtcaacaa tatagcagct atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acg 323 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ile Thr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Pro Ser Gln Asn Val Gly Ser Ala 20 25 30 Val Thr Trp Trp Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 3 gag gtc cag ctg caa caa tct gga cct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgt aag gct tct gga tac acg ttc act gac tcc 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 acc atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att gat cct aac aat ggt ggt act aac tac aat cag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aag tcc tcc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg gtc tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 333 Ala Arg Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 5 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 5 gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctg gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct cgt cag agc ctt gta cac agt 96 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggt agt gga tca ggg aca gaa ttc aca ctc gag atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Glu Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 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Claims (50)

  1. 액체 샘플에서 파클리탁셀을 분석하는 방법으로서,
    (a) 파클리탁셀을 포함하는 액체 샘플을 측방향 유동 분석 장치에 적용하는 단계로서, 상기 장치는
    (i) 액체 샘플을 수용하기 위한 샘플 수용 구역;
    (ii) 상기 샘플 수용 구역과 액체 연통하고 상기 샘플 수용 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 검출 시약 구역으로서, 상기 검출 시약 구역은 이에 부착된 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약은 검출가능한 리포트 그룹으로 표지된, 파클리탁셀 항체, 또는 파클리탁셀에 결합하는 이의 단편 또는 유도체이고, 상기 파클리탁셀 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 104 내지 약 107의 Kon 및 약 10-3 내지 약 10-7의 Koff를 갖는, 검출 시약 구역; 및
    (iii) 상기 검출 시약 구역과 유체 연통하고 검출 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 포획 구역으로서, 상기 포획 구역은 이에 고정된 제1 및 제2 포획 시약을 포함하고, 상기 제1 포획 시약은 검출 시약(시험 라인)에 결합할 수 있는 파클리탁셀 물질이고, 상기 제2 포획 시약은 검출 시약(대조군 라인)에 결합할 수 있는 항체이고, 상기 제1 포획 시약은 상기 포획 구역의 상류 말단으로부터 유동 방향으로 하류측에 제1 거리로 위치되어 있고, 상기 제2 포획 시약은 상기 포획 구역의 상류 말단으로부터 유동 방향으로 하류측에 제2 거리로 위치되어 있고, 상기 제2 거리는 상기 제1 거리보다 크고, 상기 제1 거리 대 상기 제2 거리의 비율은, Kon이 약 2.0×105 초과이고 Koff가 약 1.0×10-3 미만인 경우, 약 0.0 내지 약 0.4이고, 상기 제1 거리 대 상기 제2 거리의 비율은, Kon이 약 2.0×104 초과이고 Koff가 약 2.0×10-4 미만인 경우, 약 0.2 내지 약 1.0인, 포획 구역을 포함하는, 단계;
    (b) 샘플을 검출 시약 구역을 통해 샘플 수용 구역으로부터 유동시켜 파클리탁셀을 갖는 검출 시약을 제공하는 단계;
    (c) 파클리탁셀을 갖는 검출 시약을 포획 구역을 통해 유동시키는 단계로서, 이에 의해 제1 포획 시약(시험 라인)은 검출 시약과의 결합에 대해 분석물(파클리탁셀)과 경쟁하고, 제2 포획 시약(대조군 라인)은 과량의 검출 시약에 결합하는, 단계; 및
    (d) 제2 포획 시약(대조군 라인)과 비교하여 제1 포획 시약(시험 라인)에 결합된 검출 시약의 양을 관찰하는 단계
    를 포함하는, 액체 샘플에서 파클리탁셀을 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대조군 라인 및 시험 라인에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 파클리탁셀의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양이 광학 밀도 측정을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 검출가능한 리포트 그룹이 콜로이드성 금인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀 항체가 3C6인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀 항체가 8A10인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀 물질이, 검출 시약에 결합하기 위해 파클리탁셀과 경쟁하는 파클리탁셀 항원인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀 물질이 파클리탁셀 단백질 접합체인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 검출 시약에 결합할 수 있는 항체가 염소 항-마우스 항체인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리가 파클리탁셀 검출 감도를 최적화하기 위해 변화되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리가 파클리탁셀 검출 감도를 최적화하기 위해 최소화되는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 제2 포획 시약(대조군 라인)에 결합된 과량의 검출 시약의 양을 관찰하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 제2 포획 시약에 결합된 과량의 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 파클리탁셀의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 포획 구역의 중간에 제3 포획 구역을 추가로 포함하고, 상기 제3 포획 구역이 검출 시약에 결합할 수 있는 파클리탁셀 물질을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 제3 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 파클리탁셀의 양을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제3 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량하는 것이 광학 밀도 측정을 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 측방향 유동 장치가 포획 시약 구역과 액체 연통하고 포획 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 흡착 구역을 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, LFA가 SPR 또는 기타 고체 상 면역검정으로 대체될 수 있는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 항체가 사용되고, 제1 항체가 104 초과의 Kon을 갖고, 제2 항체가 10-3 미만의 Koff를 갖는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 2개 또는 3개 라인을 사용하여 동일한 샘플에 대해 다중 판독을 생성함으로써 재현성 및 확장된 동적 범위를 증가시키는, 방법.
  21. 암으로 진단된 환자에서 파클리탁셀 요법의 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 암 환자를 제1 시점에서 파클리탁셀로 치료하는 단계;
    (b) 제1 시점에서 환자의 파클리탁셀의 제1 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법을 포함하는 단계;
    (c) 상기 환자를 제2 시점에서 파클리탁셀로 치료하는 단계;
    (d) 제2 시점에서 환자의 파클리탁셀 약물의 제2 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법을 포함하는 단계; 및
    (e) 상기 환자에서 파클리탁셀의 제1 및 제2 농도를 비교하여 암 치료의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 암으로 진단된 환자에서 파클리탁셀 요법의 PK-유도 투여를 위한 방법으로서,
    (a) 암 환자를 제1 시점에서 파클리탁셀로 치료하고;
    제1 시점에서 환자의 파클리탁셀의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 파클리탁셀의 농도를 측정하는 것을 포함하는 단계;
    (b) 제1 투여로부터의 PK 정보를 사용하여 상기 환자를 제2 시점에서 파클리탁셀로 치료하는 단계;
    (c) 제2 시점에서 환자의 파클리탁셀의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 파클리탁셀의 농도를 측정하는 것을 포함하는 단계;
    (d) 제1 시점에서의 대상체의 파클리탁셀의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 제2 시점에서의 수준과 비교하여 최적 투여가 달성된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 약물동태 파라미터가 시간 대 최대 농도(Tmax), 농도 최대(Cmax), 곡선하 면적(AUC), 클리어런스(CL), 분포 용적(Vd), 종점 상 동안의 겉보기 분포 용적(Vz), 정상 상태 동안의 겉보기 분포 용적(Vss) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  24. 측방향 유동 장치로서,
    (a) 액체 샘플을 수용하는 샘플 수용 구역;
    (b) 샘플 수용 구역과 액체 연통하고 샘플 수용 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 검출 시약 구역으로서, 이에 부착된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는, 검출 시약 구역;
    (c) 검출 시약 구역과 액체 연통하고 검출 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 포획 구역으로서, 이에 고정된 하나 이상의 포획 시약을 포함하는, 포획 구역; 및
    (d) 포획 구역과 액체 연통하고 포획 시약 구역으로부터 유동 방향으로 하류측에 있는 흡착 구역을 포함하는, 측방향 유동 장치.
  25. 제24항에 있어서, 상기 검출 시약이 검출가능한 리포트 그룹으로 표지된 항체인, 장치.
  26. 제24항에 있어서, 상기 검출 시약이 치료 약물에 대해 제1 친화성을 갖는 제1 항체 및 치료 약물에 대해 제2 친화성을 갖는 제2 항체를 포함하고, 상기 제1 친화성이 상기 제2 친화성보다 큰, 장치.
  27. 제24항에 있어서, 상기 포획 시약이, 검출 시약에 결합하기 위해 치료 약물과 경쟁하는 항원인, 장치.
  28. 제24항에 있어서, 상기 포획 시약이 검출 시약에 결합할 수 있는 항체인, 장치.
  29. 제24항에 있어서, 상기 포획 시약이, 검출 시약에 결합하기 위해 치료 약물과 경쟁하는 항원인 제1 포획 시약, 및 검출 시약에 결합할 수 있는 항체인 제2 포획 시약을 포함하는, 장치.
  30. 제24항에 있어서, 상기 제1 포획 시약이 제2 포획 시약으로부터 유동 방향으로 상류측에 고정되어 있는, 장치.
  31. 제30항에 있어서, 샘플 수용 구역과 제1 포획 시약 사이의 거리가 치료 약물의 검출을 최적화하기 위해 변화되는, 장치.
  32. 제30항에 있어서, 제1 및 제2 포획 시약의 중간에 고정된 제3 포획 시약을 추가로 포함하고, 상기 제3 포획 시약이, 검출 시약에 결합하기 위해 치료 약물과 경쟁하는 항원인, 장치.
  33. 제24항에 있어서, 상기 치료제가 파클리탁셀이고, 상기 검출 시약이 8A10 및 3C6으로부터 선택된 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하고, 상기 항체 또는 단편 또는 유도체가 파클리탁셀에 결합하는, 장치.
  34. 샘플 중의 치료 약물을 분석하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 제24항 내지 제33항 중의 어느 한 항의 장치의 샘플 수용 구역에 적용하는 단계 및
    (b) 하나 이상의 고정된 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 관찰하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 고정된 포획 시약에 결합된 검출 시약의 양을 정량함으로써 샘플 중의 치료 약물의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 검출 시약이 제1 포획 위치에서 포획 시약에 결합되는, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 검출 시약이 제2 포획 위치에서 포획 시약에 결합되는, 방법.
  38. 제34항에 있어서, 검출 시약이 제1 및 제2 포획 위치에서 포획 시약에 결합되는, 방법.
  39. 제34항에 있어서, 치료 약물이 파클리탁셀인, 방법.
  40. 제34항에 있어서, 상기 검출 시약이 8A10 및 3C6으로부터 선택된 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하고, 상기 항체 또는 단편 또는 유도체가 파클리탁셀에 결합하는, 방법.
  41. 질환 또는 상태로 진단된 환자에서 치료학적 치료의 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 환자를 제1 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
    (b) 제1 시점에서 환자의 치료제의 제1 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 제34항 내지 제40항 중의 어느 한 항의 방법을 포함하는, 단계;
    (c) 상기 환자를 제2 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
    (d) 제2 시점에서 환자의 치료제의 제2 농도를 측정하는 단계로서, 상기 농도의 측정이 제34항 내지 제40항 중의 어느 한 항의 방법을 포함하는, 단계; 및
    (e) 환자에서 제1 및 제2 농도를 비교하여 치료학적 치료의 유효성을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 질환 또는 상태 치료가 치료 약물 모니터링으로부터 이익을 얻는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 암, 염증, 고혈압, 심혈관 또는 통증인, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 치료제가 파클리탁셀, 도세탁셀, 7-에피파클리탁셀, t-아세틸 파클리탁셀, 10-데스아세틸-파클리탁셀, 10-데스아세틸-7-에피파클리탁셀, 7-크실로실파클리탁셀, 10-데스아세틸-7-글루타릴파클리탁셀, 7-N,N-디메틸글리실파클리탁셀 및 7-L-알라닐파클리탁셀로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  45. 질환 또는 상태로 진단된 환자에서 치료학적 치료의 PK-유도 투여를 위한 방법으로서,
    (a) 환자를 제1 시점에서 치료제로 치료하고;
    제1 시점에서 환자의 치료제의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 제34항 내지 제40항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 치료제를 분석하는 것을 포함하는, 단계;
    (b) 제1 투여로부터 수득된 PK 데이터를 사용하여 상기 환자를 제2 시점에서 치료제로 치료하는 단계;
    (c) 제2 시점에서 환자의 치료제의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 약물동태 파라미터의 측정이 제34항 내지 제40항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 치료제를 분석하는 것을 포함하는, 단계; 및
    (d) 제1 시점에서의 대상체의 치료제 약물의 하나 이상의 약물동태 파라미터를 제2 시점에서의 수준과 비교하여 최적 투여가 달성된 것을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 약물동태 파라미터가 시간 대 최대 농도(Tmax), 농도 최대(Cmax), 곡선하 면적(AUC), 클리어런스(CL), 분포 용적(Vd), 종점 상 동안의 겉보기 분포 용적(Vz), 정상 상태 동안의 겉보기 분포 용적(Vss) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 암, 염증, 고혈암, 심혈관 또는 통증인, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 치료제가 파클리탁셀, 도세탁셀, 7-에피파클리탁셀, t-아세틸 파클리탁셀, 10-데스아세틸-파클리탁셀, 10-데스아세틸-7-에피파클리탁셀, 7-크실로실파클리탁셀, 10-데스아세틸-7-글루타릴파클리탁셀, 7-N,N-디메틸글리실파클리탁셀 및 7-L-알라닐파클리탁셀로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  49. 파클리탁셀에 결합하는 8A10 및 3C6으로부터 선택된 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체가 서열번호 2, 4, 6 또는 8에 함유된 CDR과 적어도 95% 상동성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.


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