CN116990510A - 一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原试剂条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原试剂条及其制备方法，属于分子检测领域。本发明的试剂条包括结合物垫、样本垫、层析膜和吸水纸，为双抗夹心胶体金试剂条，所述的结合物垫经结合物垫处理液处理，样本垫经过样本垫处理液处理。本发明的试剂条稳定性好、特异性强、灵敏度高，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原试剂条及其制备方法。
背景技术
眼睛出现少许分泌物属于正常现象，但如果眼睛总有分泌物，且分泌物较多，可能是由于炎症的刺激，或者是由于病菌的侵入所引起。对病因进行及时诊断有助于临床正确给药，使病症尽快消失。
目前腺病毒可以通过病原学检查，如腺病毒核酸检测、血清特异性抗体检测等，但这些检测往往耗时较长，导致患者等待结果的时间也长，因此开发快速检测的方法尤为重要。
氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态。胶体金法利用胶体金作为免疫标记物进行检测。胶体金法具有方便快捷、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，因而特别适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。但胶体金试剂条制备中，涉及到的部分缓冲液对最终整体的检测效果非常大，影响实际检测的准确性。
申请号为CN202310015351.9的中国专利申请中公开了：一种检测腺病毒抗原的胶体金免疫层析试纸及其制备方法、试纸盒、检测方法。该试纸包括底板、以及依次设置在底板上的样本垫、结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜上设有检测线和质控线；结合垫包被有胶体金标记的腺病毒抗体，胶体金的粒径为58-62nm，检测线处的抗体包括用以识别腺病毒抗原的第一抗体，质控线处的抗体包括用以识别腺病毒抗体的第二抗体。采用粒径为58-62nm的胶体金，可增加抗体分子与胶体金的有效碰撞，使抗体与胶体金结合效率增加，提高纳米金的有效标记数量，从而有利于提高腺病毒的检测灵敏度；且粒径为58-62nm胶体金的体积比表面积小，使用的抗体量较少，降低了抗体的使用量。但其制备的检测腺病毒抗原的胶体金免疫层析试纸条的最低检出限是4×104，说明其检出的灵敏度并不高，有进一步优化的空间。
申请号为CN201810293313.9的中国专利申请中公开了：一种双抗夹心法胶体金检测的试剂盒，该试剂盒使用了特定成分的金标抗体封闭液、金标抗体稀释液、固定抗体稀释液。该试剂盒通过三种特定成分的试剂，使得原本胶体金检测中的金标抗体和固定抗体能够互换，当使用该三种试剂后，检测灵敏度与原有的胶体金检测结果相比增加或相当。但其实际用于眼部分泌物检测时，准确率和灵敏度都不太理想。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过优化处理液和稀释液的成分和配比，提供了一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原的试剂条，以利于临床眼部分泌物的腺病毒检测。
本发明中，BSA表示牛血清白蛋白；
本发明中，Tween-20表示聚山梨醇酯-20；
本发明中，PVP40指聚乙烯吡咯烷酮；
本发明中，PEG20000为聚乙二醇。
一方面，本发明提供了一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原的试剂条，包括结合物垫、样本垫、层析膜和吸水纸，为双抗夹心胶体金试剂条。
所述的结合物垫经结合物垫处理液处理，所述的结合物垫处理液配方为：10-20mMTris-HCl，1%-2%m/V Na2HPO4，1%-1.5%m/V BSA，1%-3%m/V 蔗糖，1%-2%m/V 海藻糖，0.2%-0.5%m/V Tween-20，0.2%-0.5%m/V PVP40，0.1%-0.2%m/V PEG20000，0.1%-0.2%m/Vproclin300，pH7-8。
所述的样本垫经样本垫处理液处理，所述的样本垫处理液配方为：10-20mM PBS，1%-1.5%m/V Tween-20，2%-4%m/V 甘露糖，1%-2%m/V 酪蛋白酸钠，2%-4%m/V 蔗糖，0.5%-1%m/V PEG6000，1.5%-2%m/V BSA，0.1%-0.2%m/V proclin300，pH7-8。
所述的结合物垫和样本垫材质优选为玻璃纤维素膜。
所述的结合物垫处理液配方优选为：20mM Tris-HCl，1%m/V Na2HPO4，1.5%m/VBSA，3%m/V蔗糖，1%m/V 海藻糖，0.5%m/V Tween-20，0.2%m/V PVP40，0.2%m/V PEG20000，0.1%m/V proclin300，pH为7；
所述的样本垫处理液配方优选为：20mM PBS，1%m/V Tween-20，2%m/V 甘露糖，2%m/V 酪蛋白酸钠，2%m/V 蔗糖，0.5%m/V PEG6000，2%m/V BSA，0.2%m/V proclin300，pH为8。
所述的结合物垫的制备方法可以是：玻璃纤维素膜放入结合物垫处理液中，使液体浸没过玻璃纤维素膜，浸泡15-20min；干燥；第一抗体溶液作为免疫标签涂覆。
所述的样本垫的制备方法为：玻璃纤维素膜放入样本垫处理液中，使液体浸没过玻璃纤维素膜，浸泡时间15-20min；干燥。
所述的层析膜为包括质控线和检测线的硝酸纤维素膜，所述的检测线包被第二抗体，质控线包被抗金标抗体。
本发明同时提供了试剂条的制备方法。
所述的制备方法中包括前述的结合物垫的制备方法和样本垫的制备方法。
所述的制备方法中还包括：胶体金溶液调节pH为8，然后加入第一抗体，室温下振荡反应，再加入BSA溶液封闭，之后离心去除上清液，采用复溶液重悬得免疫标签复溶液，将所述免疫标签复溶液涂覆于结合物垫，烘干。
所述的胶体金溶液胶体金颗粒粒径为40-60nm。
再一方面，本发明提供了前述的试剂条在制备用于眼部分泌物中腺病毒抗原检测的试剂盒中的应用。
同时，本发明提供了包括前述的试剂条的用于眼部分泌物中腺病毒抗原检测的试剂盒。
所述的试剂盒还包括样本稀释液：10-20mM磷酸缓冲液，10-20mM PBS，0.5%-1%m/VNaCl，0.1%-0.2%m/V Triton X100，0.01%-0.1%m/V Tween- 20，pH7-8。
优选地，样本稀释液为：10mM磷酸缓冲液，10mM PBS，1%(m/V) NaCl，0.1%(m/V)Triton X100，0.1%(m/V) Tween- 20，pH为8。
本发明的有益效果：
本发明制备的试剂条和试剂盒，用于眼部分泌物的腺病毒检测时，稳定性好，特异性强，灵敏度高，相较于现有产品，能够对较低浓度的病原体进行检测，且不受其他病原体的干扰，有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明试剂条的检测流程示意。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特别说明，本发明所采用的试剂的溶剂为水。
基础实施例
本发明胶体金法检测主要参照以下步骤进行操作：
（1）胶体金液制备：200mL超纯水中加入2.0mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸腾后搅拌加入1.5mL 1％柠檬酸三钠溶液，颜色变化后，继续加热15min，至颜色不再变化；冷却至室温后6000r/min离心，去上清，加超纯水定容至50mL，置于4℃备用。胶体金溶液呈酒红色。
使用前取出胶体金液，紫外-可见光分光光度计波长400nm-700nm范围内进行扫描，扫描间距为1nm，最高吸收峰在541nm±2nm处为合格。胶体金颗粒粒径为60nm。
（2）配制结合物垫处理液；结合物垫材质为玻璃纤维素膜（上海杰一，GL-b02），将其放入结合物垫处理液中，使液体浸没过玻璃纤维素膜，浸泡约15-20min。浸泡结束后，45℃-50℃鼓风干燥，干燥时间约为15h，干燥结束后，作为结合物垫，室温密封保存备用。
（3）配制样本垫处理液；样本垫材质为玻璃纤维素膜（上海杰一，GL0194），将其放入样本垫处理液中，使液体浸没过玻璃纤维素膜，浸泡时间约15-20min。浸泡结束后，45℃-50℃鼓风干燥，干燥时间约为15h，干燥结束后，作为预处理样本垫，室温密封保存备用。
（4）步骤（1）制备的胶体金溶液调节pH为8，然后加入终浓度为20μg/mL的第一抗体（Bio-Mapper，MC420102），在室温下振荡反应3h，再加入终浓度为0.15％m/V的BSA溶液封闭40min，之后7000r/min离心15min，去除上清液，得到浓缩的免疫标签，按1mg/mL终浓度使用复溶液（50mM NaCl+0.1%m/V BSA）重悬，得免疫标签复溶液，将所述免疫标签复溶液涂覆于结合物垫（10μL/cm)，于40℃烘干15h，备用。
（5）将抗金标抗体和第二抗体（Biorad，MCA2532）分别作为质控线和检测线包被在硝酸纤维素膜（层析膜）上（各1μg/mm)，然后将样本垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在底板上，即可。
（6）检测待测物时，采样拭子（眼部分泌物样本）加入样本稀释液5mL，摇晃，在试剂条加入6-8滴稀释液，10分钟后，观察检测的结果。
检测线和质控线均显示红色，样本判断阳性；检测线不显示红色而质控线显示红色，样本判断阴性；检测线和质控线均不显示红色，无效，需要重新检测；检测流程参照图1。
在以上基础实验例的条件下，设置各实施例的条件，实施例中，结合物垫处理液均指以上步骤（2）中的结合物垫处理液；样本垫处理液均指以上步骤（3）中的样本垫处理液；样本稀释液均指步骤（6）中的样本稀释液。
实施例中部分试剂来源：
BSA：阿拉丁，B265993；
PVP40：sigma；
PEG20000：Solarbio P8280；
proclin300：sigma，48914-U；
Tween-20：赛默飞，12643977；
酪蛋白酸钠：sigma，C8654；
Triton X100：Solarbio T8200。
实施例1含腺病毒抗原试剂条的眼部分泌物检测试剂盒
本实施例中涉及的试剂如下：
1、结合物垫处理液配方：
20mM Tris-HCl，1%(m/V) Na2HPO4，1.5%(m/V) BSA，3%(m/V)蔗糖，1%(m/V) 海藻糖，0.5%(m/V) Tween-20，0.2%(m/V) PVP40，0.2%(m/V) PEG20000，0.1%(m/V)proclin300，pH为7。
2、样本垫处理液配方：
20mM PBS，1%(m/V) Tween-20，2%(m/V) 甘露糖，2%(m/V) 酪蛋白酸钠，2%(m/V)蔗糖，0.5%(m/V) PEG6000，2%(m/V) BSA，0.2%(m/V) proclin300，pH为8。
3、样本稀释液配方：
10mM磷酸缓冲液，10mM PBS，1%(m/V) NaCl，0.1%(m/V) Triton X100，0.1%(m/V)Tween- 20，pH为8。
实施例2含腺病毒抗原试剂条的眼部分泌物检测试剂盒
本实施例中涉及的试剂如下：
1、结合物垫处理液配方：
10mM Tris-HCl，2%(m/V) Na2HPO4，1%(m/V) BSA，1%(m/V)蔗糖，2%(m/V) 海藻糖，0.2%(m/V) Tween-20，0.5%(m/V) PVP40，0.1%(m/V) PEG20000，0.2%(m/V) proclin300，pH为8。
2、样本垫处理液配方：
10mM PBS，1.5%(m/V) Tween-20，4%(m/V) 甘露糖，1%(m/V) 酪蛋白酸钠，4%(m/V)蔗糖，1%(m/V) PEG6000，1.5%(m/V) BSA，0.1%(m/V) proclin300，pH为7。
3、样本稀释液配方：
20mM磷酸缓冲液，20mM PBS，0.5%(m/V) NaCl，0.2%(m/V) Triton X100，0.01%(m/V) Tween- 20，pH为8。
实施例3含腺病毒抗原试剂条的眼部分泌物检测试剂盒
本实施例中涉及的试剂如下：
1、结合物垫处理液配方：
20mM Tris-HCl，1.5%(m/V) Na2HPO4，1.5%(m/V) BSA，2%(m/V)蔗糖，1%(m/V) 海藻糖，0.5%(m/V) Tween-20，0.5%(m/V) PVP40，0.2%(m/V) PEG20000，0.2%(m/V)proclin300，pH为8。
2、样本垫处理液配方：
15mM PBS，1%(m/V) Tween-20，3%(m/V) 甘露糖，1.5%(m/V) 酪蛋白酸钠，3%(m/V)蔗糖，1%(m/V) PEG6000，1.5%(m/V) BSA，0.1%(m/V) proclin300，pH为8。
3、样本稀释液配方：
10mM磷酸缓冲液，15mM PBS，1%(m/V) NaCl，0.1%(m/V) Triton X100，0.05%(m/V)Tween- 20，pH为7。
对比例
参照实施例1设置对比例，具体如下：
实验例腺病毒抗原试剂条效果数据
（1）稳定性
采用已灭活的腺病毒培养物进行测试，检测液腺病毒浓度分别为1×106个/mL，1×105个/mL，1×104个/mL，1×103个/mL，溶剂为样本稀释液，对实施例1-3的试剂条各进行10次重复测试，检测的结果均无差异。
将产品进行50℃加速破坏60天，分别在0天，15天，30天，45天，60天，用浓度为1×106个/mL，1×105个/mL，4×104个/mL，1×103个/mL的腺病毒培养物进行测试，检测的结果无差别。
（2）特异性
用制备好的试纸条分别检测其他眼部分泌物中可能存在的常见病原体（金黄色葡萄球菌、变形杆菌、莫拉氏杆菌、大肠杆菌、沙眼衣原体），观察结果分析试纸条的特异性。
实施例1-3的试纸条对其他病原体的检测结果均为阴性，说明本申请的试纸条与其它病原体没有交叉反应。
（3）灵敏度
制备腺病毒浓度为1×104个/mL、1×103个/mL、1×102个/mL的检测液，采用样本稀释液为溶剂，分别使用实施例1-3和对比例1-5的检测试剂条进行检测，以确定各试剂盒的灵敏度。
实施例1-3的试剂条均能检测到1×102个/mL的检测液，表明本发明的试剂条对腺病毒的最低检测限至少可达1×102个/mL。对比例1-5的检测结果分别为：1×104个/mL、1×104个/mL、1×104个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL。
（4）临床样本验证
采集10例眼结膜炎患者眼部分泌物样本和10例健康人群眼部分泌物样本，采用实施例1-3的检测试剂盒进行检测，结果如下：
“+”表示检测结果阳性，“-”表示检测结果为阴性。
以上结果中，患者组行核酸检测验证，结果表明，本发明的试剂盒检测结果准确率可达100%。
Claims (14)
1.一种基于胶体金法检测眼部分泌物中腺病毒抗原的试剂条，包括结合物垫、样本垫、层析膜和吸水纸，为双抗夹心胶体金试剂条，其特征在于，所述的结合物垫经结合物垫处理液处理，所述的结合物垫处理液配方为：10-20mM Tris-HCl，1%-2%m/V Na2HPO4，1%-1.5%m/VBSA，1%-3%m/V 蔗糖，1%-2%m/V 海藻糖，0.2%-0.5%m/V Tween-20，0.2%-0.5%m/V PVP40，0.1%-0.2%m/V PEG20000，0.1%-0.2%m/V proclin300，pH7-8。
2.根据权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述的样本垫经样本垫处理液处理，所述的样本垫处理液配方为：10-20mM PBS，1%-1.5%m/V Tween-20，2%-4%m/V 甘露糖，1%-2%m/V 酪蛋白酸钠，2%-4%m/V 蔗糖，0.5%-1%m/V PEG6000，1.5%-2%m/V BSA，0.1%-0.2%m/Vproclin300，pH7-8。
3.根据权利要求2所述的试剂条，其特征在于，所述的结合物垫和样本垫材质为玻璃纤维素膜。
4.根据权利要求3所述的试剂条，其特征在于，所述的结合物垫处理液配方为：20mMTris-HCl，1%m/V Na2HPO4，1.5%m/V BSA，3%m/V蔗糖，1%m/V 海藻糖，0.5%m/V Tween-20，0.2%m/V PVP40，0.2%m/V PEG20000，0.1%m/V proclin300，pH为7；
所述的样本垫处理液配方为：20mM PBS，1%m/V Tween-20，2%m/V 甘露糖，2%m/V 酪蛋白酸钠，2%m/V 蔗糖，0.5%m/V PEG6000，2%m/V BSA，0.2%m/V proclin300，pH为8。
5.根据权利要求3所述的试剂条，其特征在于，所述的结合物垫的制备方法为：玻璃纤维素膜放入结合物垫处理液中，使液体浸没过玻璃纤维素膜，浸泡15-20min；干燥；第一抗体溶液作为免疫标签涂覆。
6.根据权利要求3所述的试剂条，其特征在于，所述的样本垫的制备方法为：玻璃纤维素膜放入样本垫处理液中，使液体浸没过玻璃纤维素膜，浸泡时间15-20min；干燥。
7.根据权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述的层析膜为包扩质控线和检测线的硝酸纤维素膜，所述的检测线包被第一抗体，质控线包被第二抗体。
8.权利要求1所述的试剂条的制备方法，其特征在于，包括权利要求4中所述的结合物垫的制备方法和权利要求5中所述的样本垫的制备方法。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括：胶体金溶液调节pH为8，然后加入第一抗体，室温下振荡反应，再加入BSA溶液封闭，之后离心去除上清液，采用复溶液重悬得免疫标签复溶液，将所述免疫标签复溶液涂覆于结合物垫，烘干。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的胶体金溶液胶体金颗粒粒径为40-60nm。
11.权利要求1所述的试剂条在制备用于眼部分泌物中腺病毒抗原检测的试剂盒中的应用。
12.包括权利要求1所述的试剂条的用于眼部分泌物中腺病毒抗原检测的试剂盒。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液：10-20mM磷酸缓冲液，10-20mM PBS，0.5%-1%m/V NaCl，0.1%-0.2%m/V Triton X100，0.01%-0.1%m/V Tween-20，pH7-8。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，样本稀释液为：10mM磷酸缓冲液，10mMPBS，1%(m/V) NaCl，0.1%(m/V) Triton X100，0.1%(m/V) Tween- 20，pH为8。
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