CN114966016A - 基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，纸板切割成2‑5mm宽后制成试纸条，试纸板是通过在背板上顺次相互搭接样品垫、吸附有量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS偶联标记的SARS‑CoV‑2His‑RBD和鸡IgY的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫后组装形成；样品垫经过样品垫处理液预先处理，结合垫经过结合垫处理液预先处理。本申请将新型量子点荧光微球应用到LFIA中，可对样本中的SARS‑CoV‑2中和抗体进行快速、简便的检测，且检测的灵敏度高，检出限可低至1.08ng/mL；其性能显著优于传统胶体金检测法，可广泛应用于LFIA领域。

Description

基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫荧光检测技术领域，具体涉及一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒。
背景技术
新型严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV-2)对人类健康造成了巨大威胁。SARS-CoV-2是近年在人体中首次发现的冠状病毒新毒株， SARS-CoV-2与另外两种密切相关的高致病性病毒SARS-CoV和MERS-CoV同属冠状病毒科β冠状病毒属。SARS-CoV-2能跨越物种屏障感染人类，可通过密切接触、呼吸道飞沫、高浓度气溶胶传播，诱发以肺部病变为主的传染性疾病，也可诱发包括神经系统和消化系统在内的全身性损伤，严重情况下可导致死亡。
SARS-CoV-2的RNA基因组编码四种结构蛋白；刺突蛋白(S)、包膜蛋白 (E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。S蛋白是一种大型I型跨膜蛋白，包含两个亚基，S1和S2。S1主要包含一个受体结合域(receptor binding domain,RBD)，负责识别细胞表面受体，即血管紧张素转换酶2(ACE2)。S蛋白与ACE2结合，使病毒进入宿主细胞，它可通过RBD的基因重组或突变在不同宿主之间传递，导致较高的死亡率，因此在诱导中和抗体、T细胞应答以及保护性免疫中起着关键作用，是疫苗、治疗性抗体以及临床诊断的关键靶点。
目前还未研发出特异性针对SARS-CoV-2感染的特效药，SARS-CoV-2感染的早期临床症状(即发热、咳嗽和疲劳)与流感等其他呼吸道传染病相似，同时发现了许多无症状病毒携带者。早期诊断和接种疫苗成为阻止疫情进一步传播扩散的关键。人体接种疫苗后可通过免疫应答机制产生保护性抗体，即中和抗体，对中和抗体进行滴度测定，可以判断疫苗的临床疗效。因此对中和抗体的检测可应用于疫苗的研发评价，以及疫苗研发成功正式应用于大众后，对个体自身免疫效果的评价。另外，对于治愈后的新冠患者检测，可以判断是否存在再次感染的风险。因此，开发高灵敏度的SARS-CoV-2抗体检测技术和方法是极有必要的。
目前，中和抗体检测的金标准是活病毒微量血清中和试验(cVNT)，但是此方法需要在三级生物安全实验室(BSL 3)中进行，且需要专业人员对活病毒进行培养，检测周期长达一周，因此，该方法具有检测周期长、设备要求高、对操作人员技术要求高等不足。酶联免疫吸附法(ELISA)在检测中和抗体时，因具有较高的灵敏度和特异性而在实验室层面被广泛应用，但该方法的操作步骤繁琐，对操作者技术要求高，不利于SARS-CoV-2中和抗体检测的扩大化实际应用。
横向流动免疫分析(LFIA)是一种重要的基于膜的生物传感器，可用于POCT 免疫诊断。基于胶体金纳米颗粒(AuNPs)的LFIA是被广泛采用且能初步或即时对患者进行诊断的方式，它通过肉眼的比色检查实现对待分析人员的定性或半定量检测。然而，目标浓度细微变化造成的颜色细微变化是难以被识别的，该方法的检测灵敏度还有待提高，这也就阻碍了基于AuNPs的LFIA的精确定量。为了提高LFIA的检测灵敏度，人们开发了荧光染料、稀土发光体、荧光聚合物、量子点等一系列荧光标记物。
量子点(QD)荧光微球因具有优异的光学性能以及良好的热稳定性和化学稳定性而引起了研究人员的广泛关注。目前可重复、有效的量子点荧光编码微球制备方法包括四种：(i)在微球的纳米孔隙中掺杂量子点；(ii)依靠静电力的层层自组装(LBL)；(iii)在微球的聚合过程中填装量子点；(iv)利用硅化学方法制备包覆量子点的二氧化硅微球。
传统的量子点荧光微球的制造需要基于配体交换技术，并且涉及复杂的工艺，制备过程中的一些技术手段(如超声或加热回流)可能会改变量子点的量子产率，使荧光下降。此外，量子点荧光微球制备成核壳纳米晶后，它们的实际应用受到限制，因为它们在溶液中的量子产率(QY)相当低(2％-20％)。另外还探索了在聚合物中进行表面封装以提高基于量子点发射的QY，然而，这一过程往往很难控制，过载会导致量子点的聚集和荧光猝灭。在量子点上覆盖一层惰性壳层，例如二氧化硅，以阻止电子、质子和氧气扩散到量子点表面。虽然原则上可以通过在二氧化硅球体内封装适当比例的量子点来产生荧光信号，但设计出一种能够实现这种复杂结构的有效合成方法也是很困难的。现有的合成路线依赖于配体封顶的量子点的预组装，然而，量子点通常在二氧化硅涂层所需的极性介质(如水或乙醇)中迅速降解或聚集，导致不均匀涂覆和荧光猝灭。
中国专利CN 106010501 A公开二氧化硅包覆量子点的多功能纳米复合材料及其制备方法，其首先制备出具有较高荧光强度和量子效率的近红外量子点，掺杂一定量的钆，并通过反相微乳液聚合反应在油溶性量子点的表面生长一层二氧化硅壳层，这样就有效解决了油溶性量子点生物相容性差、生物毒性的问题，同时也避免了相转移过程中量子效率的大幅下降，制备出的二氧化硅包覆量子点的多功能纳米复合材料具有近红外发射、高荧光强度、高量子效率，同时兼具荧光、 MRI显影的功能，在生物荧光成像技术领域有着非常广泛的应用前景。
但是，为获得更高质量的量子点荧光微球，精确控制半导体量子点(QD) 的荧光特性和量子点荧光微球的尺寸、形状、组成和表面性质是极有必要的。目前，树枝状二氧化硅胶体(dSiO2)已被开发用于包裹大颗粒，如刚性大分子或纳米颗粒，树枝状二氧化硅胶体具有规则的中心-径向孔道和极大的孔径，非常适合于纳米组分的均匀组装。不过目前还未见将基于树枝状二氧化硅胶体的高荧光强度、高量子效率的量子点荧光微球成功应用在新冠检测领域的案例，因而，为了实现新冠抗体高灵敏度检测，利用基于树枝状二氧化硅胶体制备的量子点荧光微球构建新型新冠抗体试剂盒将会是一个很好的思路。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，可实现对样本中的SARS-CoV-2中和抗体的快速、简便和高灵敏度检测，可广泛应用于LFIA领域。
本发明公开的技术方案为：一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡是先制备试纸条，再将试纸条装入塑料外壳后形成的；
试纸条是将试纸板切割成2-5mm宽后制成，试纸板是通过在背板上顺次相互搭接样品垫、吸附有量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS偶联标记的 SARS-CoV-2 His-RBD和鸡IgY的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫后组装形成；
样品垫经过样品垫处理液预先处理，结合垫经过结合垫处理液预先处理。
进一步地，硝酸纤维素膜上包被有SARS-CoV-2 His-RBD形成检测线、包被有羊抗鸡IgY形成质控线。
进一步地，所述量子点荧光微球的激发波长是470nm，发射波长是610nm；荧光微球直径范围是200±10nm。
作为优选，所述量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS的量子点进样量为60％。
进一步地，所述量子点荧光微球的制备过程如下：
步骤S1：合成具有中心径向孔径的树枝状二氧化硅纳米颗粒dSiO2；
步骤S2：合成量子点CdTe/CdS；
步骤S3：利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氢氧化铵对步骤S2合成的二氧化硅颗粒进行表面氨基化处理；
对水相量子点进行硅烷基化的修饰是为了使量子点具有更好的稳定性和生物相容性；在硅烷基化外壳上修饰-NH2或者-COOH等功能基团是用于蛋白类的标记工作。
步骤S4：将步骤S2中合成的量子点CdTe/CdS和步骤S3中获得的表面胺基化的二氧化硅颗粒混合，在EDC和NHS存在的情况下自组装获得量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS；
步骤S5：利用聚赖氨酸对步骤S4获得的dSiO2@CdTe/CdS进行包封，并用戊二醛进行交联，使微球更加稳定；接着重悬于水中，加入一定量的聚丙烯酸水溶液孵育，离心弃上清并用超纯水重悬，即得到高质量量子点荧光微球目标产物(表面带有-COOH)。
进一步地，步骤S1中，树枝状二氧化硅纳米载体的合成过程为：称取三乙醇胺溶于去离子水中，在78-85℃下反应30-60min，随后加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠反应1-2h，再加入TEOS继续反应1.5-2.5h，反应结束用乙醇稀释，离心收集并用乙醇纯化，再分散于盐酸/甲醇混合溶液中60℃加热回流反应6-8h，该步骤重复3-4次，乙醇离心纯化。
进一步地，样品垫是事先浸泡在样品垫处理液中进行处理的，样品垫处理液的配方如下：1M Tris-HCl 2.5mL、10％BSA 5mL、10％Tween-20 1mL、海藻糖1.5g、蔗糖1.5g，加水定容至50mL即配置成样品垫处理液。
进一步地，结合垫是事先浸泡在结合垫处理液中进行处理的，结合垫处理液的配方如下：0.1M BS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮0.1g、BSA 0.5g、酪蛋白 0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g、RBC-mAb 5μL，加水定容至50mL即配置成结合垫处理液。
进一步地，结合垫是浸泡在标记物稀释液中进行处理后完成量子点荧光微球 -His-RBD、量子点荧光微球-IgY的包被的，标记物稀释液中稀释有量子点荧光微球和SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY的偶联标记物；标记物稀释液的配方如下： 0.1M BS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮0.1g、BSA 0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g，加水定容至50mL即配置成标记物稀释液。
本发明的有益效果为：
1.本申请将新型量子点荧光微球应用到横向流动免疫分析(LFIA)中，可对样本中的SARS-CoV-2中和抗体进行快速、简便的检测，技术难度低，对操作人员的技术要求低，操作简便，适于实际推广应用，且检测的灵敏度高，检出限可低至1.08ng/mL；
2.在使用同样的免疫原料、免疫原理、检测同样的商业SARS-CoV-2中和多克隆抗体时，本申请制备的量子点荧光微球LFIA试纸条的灵敏度是传统胶体金LFIA试纸条灵敏度的9.3倍；所以，本申请提供的量子点荧光微球LFIA的性能显著优于传统胶体金检测法，可广泛应用于LFIA领域；
3.本申请制备的量子点荧光微球所用量子点载体为树枝状二氧化硅纳米颗粒，其具有规则的中心-径向孔道和极大的孔径，适于纳米组分的均匀组装，且基于模板的亲和力驱动的组装能够从有机相或水相直接整合成高质量的量子点荧光微球，将有利于保持高堆积密度和功能单元的完整物理性质；
4.本申请公开的基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒可对中和抗体进行高灵敏度的有效检测，可应用于疫苗的研发评价；以及疫苗研发成功并正式应用于大众后，对个体自身免疫效果的评价；可以通过检测血液样本提供有关SARS-CoV-2感染后患者体内中和抗体产生的关键信息。
附图说明
图1为量子点荧光微球合成过程的示意图；
图2是实施例1中制备的树枝状二氧化硅的透射电镜图；
图3是实施例1中制备的量子点CdTe/CdS的紫外吸收图谱(左)和荧光发射图谱(右)；
图4为实施例1中得出的量子点负载量与进样量关系实验结果图；
图5为量子点CdTe/CdS进样量为60％的荧光微球透射电镜图；
图6为量子点进样量为60％的量子点荧光微球的粒径图和电位图；
图7为量子点进样量为60％的量子点荧光微球时间稳定性实验结果图；
图8是基于量子点荧光微球的LFIA结构图，其中，1-PVC背衬，2-样品垫， 3-结合垫，4-硝酸纤维素膜，5-检测线，6-质控线，7-吸水垫；
图9是量子点荧光微球的LFIA层析条带图，1-8对应的SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0ng/mL；
图10是利用荧光免疫分析仪检测量子点荧光微球LFIA试纸条上T线、C 线荧光值后，以SARS-CoV-2中和多克隆抗体的浓度为横坐标，T/C荧光值为纵坐标所作标准曲线；
图11是胶体金LFIA层析条带图，1-8对应的SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0ng/mL；
图12是胶体金LFIA层析条带图，1-5对应的SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度为10、9、8、7、6ng/mL。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
实施例1：基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒
一、量子点荧光微球的制备
图1为量子点荧光微球合成过程的示意图。具体制备流程如下：
1)树枝状二氧化硅的合成：称取三乙醇胺60mg溶于25mL去离子水中，在80℃下反应30min，随后加入350mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和160mg 水杨酸钠继续反应1h，再加入3mL正硅酸乙酯(TEOS)继续反应2h，反应结束用乙醇稀释，离心收集并用乙醇纯化。再分散于盐酸/甲醇混合溶液中，于 60℃加热回流反应6h，该步骤重复三次，以除去模板剂CTAB。最后乙醇离心纯化3次。
图2为制备的树状二氧化硅透射电镜图。
2)量子点CdTe/CdS的合成
a.合成碲氢化钠前体：取80mg硼氢化钠溶于水，在氮气保护下加入127mg 碲粉反应1h获得NaHTe溶液，置于4℃保存；
b.镉前体溶液的制备：将氯化镉溶于水中，加入808mg的N-乙酰-L-半胱氨酸，再用氢氧化钠将溶液调至pH＝5，制成镉前体溶液；
c.将步骤a合成的NaHTe溶液加入步骤b制成的镉前体溶液中，剧烈震荡后置于聚四氟乙烯水热釜中，170℃反应45min，即得发射波长在610nm处的高质量的CdTe/CdS量子点。
图3为制备的量子点CdTe/CdS的紫外吸收图谱和荧光发射图谱；如图所示，量子点CdTe/CdS在554nm处具有较强吸收，在470nm的激发光下，荧光强度较强。
3)二氧化硅微球的表面氨基化处理：将步骤1)中合成的树枝状二氧化硅取1g分散于50mL乙醇溶液中，向溶液体系中加入500μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和2mL氢氧化铵，室温下反应12h，最后离心收集，乙醇洗涤纯化3次，50℃真空干燥。
4)量子点与二氧化硅载体的自组装：准确称取10mg表面氨基化的二氧化硅微球溶于5mL水中，再加入不同量的步骤2)中合成的CdTe/CdS量子点(量子点进样量分别为3mg(30％)、6mg(60％)、9mg(90％)、12mg(120％)、 15mg(150％)、18mg(180％)、21mg(210％)、24mg(240％))、5mg 1-乙基 -(3-二甲基氨丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和5mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，超声20min，最后离心收集，水洗纯化3次。
5)量子点荧光微球的包封：将步骤4)合成的自组装微球分散于1mg/mL 的聚赖氨酸中(含有0.5％的氯化钠)，加入适量戊二醛，室温反应20min，离心收集，水洗纯化3次；接着重悬于10mL水中，加入1mg/mL的聚丙烯酸(PAA) 水溶液孵育，离心弃上清并用超纯水重悬，得到高质量量子点荧光微球(表面带有-COOH)。
量子点性能检测：
1)图4为量子点负载量与进样量关系实验结果图；其中，(a)小图为基于不同量子点进样量条件下获得的量子点荧光微球的紫外吸收分布图；(b)小图为基于不同量子点进样量条件下获得的量子点荧光微球的荧光发射分布图；(c)小图为基于不同量子点进样量条件下获得的量子点荧光微球的上清与沉淀重悬液对比图；(d)为量子点进样量与上载量的关系图。
从图4可看出，量子点上载量为60％时，表现出的荧光性能最强；并且在进样量为60％时，离心后的上清液澄清无荧光。
2)将量子点进样量为60％的微球重悬于1mL去离子水中；
图5为量子点CdTe/CdS进样量为60％的荧光微球透射电镜图；
图6为量子点进样量为60％的量子点荧光微球的粒径图和电位图；从粒径图可看出，量子点荧光微球具有均一的粒子分散性，电位分布图可表征量子点荧光微球表面具有负电荷。
图7为量子点进样量为60％的量子点荧光微球时间稳定性实验结果图，量子点进样量为60％的量子点荧光微球通过长达三十天的荧光稳定性观察，荧光性能优良，可以看出量子点荧光微球在水溶液中十分稳定。
二、量子点荧光微球和SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY的偶联
1)清洗量子点荧光微球：取量子点进样量为60％的量子点荧光微球(浓度 10mg/mL)100μL，加入1000mL 50mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(pH＝6.0)，超声分散后，10000rpm离心10min，弃去上清，沉淀即为清洗后的量子点荧光微球；
2)活化量子点荧光微球：向沉淀中加入500μL 50mM MES缓冲液(pH＝6.0) 超声分散后，加入浓度均为10mg/mL的EDC、NHS各5μL，混匀后超声分散。
3)偶联量子点荧光微球：将活化后的量子点荧光微球10000rpm离心10min，弃上清，以去除多余的EDC、NHS。然后加入500μL 5mM的硼酸缓冲液(BS 缓冲液，pH＝8.0)，超声分散，分别加入0.1mg SARS-CoV-2 His-RBD(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)和0.1mg鸡IgY(购自北京博尔西科技有限公司)获得量子点荧光微球-His-RBD、量子点荧光微球-IgY，混匀，室温孵育2 小时。
4)封闭量子点荧光微球：向偶联了SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY的量子点荧光微球中分别加入20μL的封闭液(10％牛血清白蛋白(BSA))，混匀，室温封闭2小时。
5)洗涤定容：将封闭后的量子点荧光微球分别在10000rpm离心10min，弃上清，分别加入1000μL的5mM的BS缓冲液(pH＝8.0)，超声分散，10000rpm 离心10min，重复以上洗涤操作5次，以去除多余未反应的SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY和BSA。最后使用保存液(0.05％proclin300的5mM的BS缓冲液)分别将量子点荧光微球-His-RBD、量子点荧光微球-IgY标记物定容至100μL。
三、构建检测SARS-CoV-2中和抗体的量子点荧光微球LFIA
(1)样品垫预处理：将样品垫裁成13mm×100mm的长条，将样品垫长条浸泡在样品垫处理液中，30min后取出，37℃烘干处理2h后取出备用；
样品垫处理液的配置：取1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)2.5mL、 10％BSA5mL、10％Tween-20 1mL、海藻糖1.5g、蔗糖1.5g，加水定容至50 mL；
(2)结合垫预处理：将结合垫裁成13mm×100mm的长条，将结合垫长条浸泡在结合垫处理液中，30min后取出，37℃烘干处理2h后取出备用；
结合垫处理液的配置：量取0.1M BS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 0.1g、BSA0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g、抗红细胞抗体RBC-mAb 5μL，加水定容至50mL；
(3)T线和C线划膜包被：将硝酸纤维素膜黏在PVC背衬上，将SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY分别用PBS溶液稀释至1mg/mL，使用划膜喷金仪(购自上海金标生物科技有限公司)分别包被在硝酸纤维素膜的T线(检测线)和C 线(质控线)位置，SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY划膜量为1μL/mL，将包被了SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY的硝酸纤维素膜37℃烘干处理3h，备用；
(4)结合垫包被：将步骤二中获得的量子点荧光微球-His-RBD、量子点荧光微球-IgY标记物分别使用标记物稀释液稀释20倍，超声分散，将已预处理的结合垫浸泡在稀释液中，30min后取出，37℃烘干处理2h后取出备用；
标记物稀释液的配置：量取0.1M硼酸(BS)缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.1g、BSA 0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g，加水定容至50mL，配置成标记物稀释液；
(5)吸水垫准备：将吸水纸裁成17mm×100mm的长条，37℃烘干处理3h，备用；
(6)LFIA试纸条组装：如图8所示，将已包被的结合垫和烘干后的吸水垫交叠黏在包被了SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY的硝酸纤维膜上，之后将已处理的样品垫交叠黏在结合垫上。使用自动斩切机(购自海金标生物科技有限公司)将组装后的PVC背衬切成宽度为3.5mm的LFIA试纸条。
图8为基于量子点荧光微球的LFIA结构简图。
基于量子点荧光微球的LFIA的性能测试：
(1)将SARS-CoV-2中和多克隆抗体(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)梯度稀释，稀释的终浓度为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0ng/mL；
(2)分别将稀释后的各浓度SARS-CoV-2中和多克隆抗体滴加60μL在量子点荧光微球LFIA试纸条的样本垫上，静置层析20分钟后读取结果；
(3)将反应后的量子点荧光微球LFIA试纸条置于暗箱式紫外分析仪中，激发光为365nm，通过观察硝酸纤维素膜上的荧光条带得到定性结果；
当样品中含有中和抗体时，中和抗体先与结合垫上的量子点荧光微球标记的SARS-CoV-2 His-RBD(即量子点荧光微球-His-RBD)形成中和抗体-RBD-量子点荧光微球复合物，复合物和量子点荧光微球-IgY由于毛细管作用一起向吸水垫端层析，当流经T线(质检线)时，中和抗体-RBD-量子点荧光微球复合物可被T线上的SARS-CoV-2 His-RBD捕获而富集，在365nm紫外灯激发光的作用下，T线可出现肉眼可见的红色荧光条带，而量子点荧光微球-IgY可与C线上的羊抗鸡IgY结合而被富集，在365nm紫外灯激发光的作用下，C线可出现肉眼可见的红色荧光条带；
当样本中没有中和抗体时，量子点荧光微球-His-RBD不能与T线上的 His-RBD结合，T线无荧光条带，而量子点荧光微球-IgY可与C线上的羊抗鸡 IgY结合而被富集，在365nm紫外灯激发光的作用下，C线可出现肉眼可见的红色荧光条带。
因此，检测结果T线、C线都有荧光条带为中和抗体阳性；检测结果T线无荧光条带、C线有荧光条带为中和抗体阴性；C线无荧光条带则检测结果无效；
(4)将量子点荧光微球LFIA试纸条装入卡壳中，使用干式荧光免疫分析仪 (购自北京豪迈生物工程有限公司)对T线、C线荧光值进行分析，以多克隆抗体稀释的浓度为横坐标，T/C荧光值为纵坐标绘制标准曲线，即可计算量子点荧光微球LFIA的灵敏度；T线荧光强度在一定范围内还与样本中和抗体的浓度成正比；
在暗箱式紫外分析仪中层析条带图如图9所示，图中条带1-8对应的 SARS-CoV-2中和多克隆抗体的浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、 0ng/mL。
步骤(4)获得的标准曲线如图10所示，量子点荧光微球LFIA的灵敏度为 1.08ng/mL。
对比例：传统胶体金LFIA的制备和性能测试
(1)过滤胶体金：用0.22μm的滤膜过滤胶体金(购自上海捷宁生物科技有限公司)；
(2)调节pH：使用100mM碳酸钾/1M盐酸调节胶体金pH，使其最终pH 为7.0；
(3)标记胶体金：准确量取50mL胶体金，放置在磁力搅拌器上，一边搅拌一边各自滴加0.1mg SARS-CoV-2 His-RBD和0.1mg鸡IgY，室温标记30分钟形成胶体金-His-RBD、胶体金-IgY；
(4)封闭胶体金：一边搅拌一边滴加封闭液(10％BSA)，室温封闭45分钟；
(5)清洗定容：将封闭后的胶体金8000rpm离心10min，弃上清，分别加入2mM的Tris-HCl缓冲液，8000rpm离心10min，重复以上洗涤操作5次，以去除多余未反应的SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY和BSA。最后将胶体金标记的SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY的标记物定容至500μL；
(6)样品垫预处理：将样品垫裁成13mm×100mm的长条，将样品垫长条浸泡在样品垫处理液中，30min后取出，37℃烘干处理2h后取出备用；
样品垫处理液的配制：量取0.1M Tris-HCl 2.5mL、10％BSA 5mL、10％ Tween-201mL、海藻糖1.5g、蔗糖1.5g，加水定容至50mL，配置成样品垫处理液；
(7)结合垫预处理：将结合垫裁成13mm×100mm的长条，将结合垫长条浸泡在结合垫处理液中，30min后取出，37℃烘干处理2h后取出备用；
结合垫处理液的配制：量取0.1M BS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 0.1g、BSA0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g、抗红细胞抗体RBC-mAb 5μL，加水定容至50mL，配置成结合垫处理液；
(8)T线和C线划膜包被：将硝酸纤维素膜黏在PVC背衬上，将SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY分别用PBS稀释至1mg/mL，使用划膜喷金仪(购自上海金标生物科技有限公司)分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线位置， SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY划膜量均为1μL/mL；将包被SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY的硝酸纤维素膜37℃烘干处理3h，备用；
(9)结合垫包被：胶体金标记的SARS-CoV-2 His-RBD、鸡IgY的标记物分别使用标记物稀释液稀释20倍，将已预处理的结合垫浸泡在稀释20倍的胶体金标记的SARS-CoV-2His-RBD、鸡IgY的标记物中，30min后取出，37℃烘干处理2h后取出备用；
标记物稀释液的配制：量取0.1M BS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 0.1g、BSA0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g，加水定容至50mL，配置成标记物稀释液；
(10)吸水垫准备：将吸水纸裁成17mm×100mm的长条，37℃烘干处理3 h，备用；
(11)胶体金试纸条组装：先将已包被的结合垫和烘干后的吸水垫交叠黏在包被了SARS-CoV-2 His-RBD和羊抗鸡IgY的硝酸纤维膜上，再将已处理的样品垫交叠黏在结合垫上。使用自动斩切机(购自海金标生物科技有限公司)将组装后的PVC背衬切成宽度为3.5mm的LFIA试纸条。
(12)胶体金LFIA试纸条灵敏度测试：将SARS-CoV-2中和多克隆抗体(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)梯度稀释，稀释的终浓度为40、20、10、 5、2.5、1.25、0.625、0ng/mL；将稀释后的各浓度SARS-CoV-2中和多克隆抗体分别滴加60μL在胶体金LFIA试纸条的样本垫上，静置层析20分钟后，通过肉眼读取结果。
若检测出T线、C线都有红色条带，则为中和抗体阳性；若检测出T线无红色条带、C线有红色条带，则为中和抗体阴性；若C线无红色条带，则检测结果无效。
各浓度的SARS-CoV-2中和多克隆抗体在胶体金LFIA试纸条上的层析结果如图11所示，图中1-8对应的SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度分别为40、20、 10、5、2.5、1.25、0.625、0ng/mL。当SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度为40、20ng/mL时，T线肉眼可见明显红色条带；当SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度为10ng/mL时，T线肉眼可见一条浅浅的红色条带，而当SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度低于10ng/mL时，T线则无肉眼可见条带。
进一步，将SARS-CoV-2中和多克隆抗体稀释为终浓度10、9、8、7、6ng/mL，根据步骤(12)上样层析，层析结果如图12所示，图中1-5对应的SARS-CoV-2 中和多克隆抗体浓度分别为10、9、8、7、6ng/mL，当SARS-CoV-2中和多克隆抗体浓度为10ng/mL时，T线肉眼可见一条浅浅的红色条带，而当SARS-CoV-2 中和多克隆抗体浓度低于10ng/mL时，T线则无肉眼可见条带。
所以，胶体金LFIA试纸条检测SARS-CoV-2中和多克隆抗体灵敏度为10 ng/mL。而根据前述实验结果可知，实施例一中制备的量子点荧光微球LFIA检测SARS-CoV-2中和多克隆抗体的灵敏度为1.08ng/mL。所以，在使用同样的免疫原料、免疫原理、检测同样的商业SARS-CoV-2中和多克隆抗体时，量子点荧光微球LFIA试纸条的灵敏度是传统胶体金LFIA试纸条灵敏度的9.3倍。所以，本实施方式提供的量子点荧光微球可实现对SARS-CoV-2中和抗体快速、准确、高灵敏度检测，具有更优于传统胶体金检测法的性能，可广泛应用于LFIA 领域。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (9)

1.一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡是先制备试纸条，再将试纸条装入塑料外壳后形成的，试纸条是将试纸板切割成2-5mm宽后制成，其特征在于，
试纸板是通过在背板上顺次相互搭接样品垫、吸附有量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS偶联标记的SARS-CoV-2His-RBD和鸡IgY的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫后组装形成；
样品垫经过样品垫处理液预先处理，结合垫经过结合垫处理液预先处理。
2.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，硝酸纤维素膜上包被有SARS-CoV-2His-RBD形成检测线且包被有羊抗鸡IgY形成质控线。
3.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，所述量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS的激发波长是470nm，发射波长是610nm；荧光微球直径范围是200±10nm。
4.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，所述量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS的量子点进样量为60％。
5.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，所述量子点荧光微球的制备过程如下：
步骤S1：合成具有中心径向孔径的树枝状二氧化硅纳米颗粒dSiO2；
步骤S2：合成量子点CdTe/CdS；
步骤S3：利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氢氧化铵对步骤S2合成的二氧化硅颗粒进行表面氨基化处理；
步骤S4：将步骤S2中合成的量子点CdTe/CdS和步骤S3中获得的表面胺基化的二氧化硅颗粒混合，在EDC和NHS存在的情况下自组装获得量子点荧光微球dSiO2@CdTe/CdS；
步骤S5：利用聚赖氨酸对步骤S4获得的dSiO2@CdTe/CdS进行包封，并用戊二醛进行交联，接着重悬于水中，加入聚丙烯酸水溶液孵育，离心弃上清并用超纯水重悬，即得目标产物。
6.如权利要求5所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，步骤S1中，树枝状二氧化硅纳米载体的合成过程为：称取三乙醇胺溶于去离子水中，在78-85℃下反应30-60min，随后加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠反应1-2h，再加入TEOS继续反应1.5-2.5h，反应结束用乙醇稀释，离心收集并用乙醇纯化，再分散于盐酸/甲醇混合溶液中60℃加热回流反应6-8h，该步骤重复3-4次，乙醇离心纯化。
7.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，样品垫是事先浸泡在样品垫处理液中进行处理的，样品垫处理液的配方如下：1MTris-HCl 2.5mL、10％BSA 5mL、10％Tween-20 1mL、海藻糖1.5g、蔗糖1.5g，加水定容至50mL。
8.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，结合垫是事先浸泡在结合垫处理液中进行处理的，结合垫处理液的配方如下：0.1MBS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮0.1g、BSA 0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g、RBC-mAb 5μL，加水定容至50mL。
9.如权利要求1所述的一种基于量子点荧光微球构建的新冠抗体检测试剂盒，其特征在于，结合垫是浸泡在标记物稀释液中进行处理后完成量子点荧光微球-His-RBD、量子点荧光微球-IgY的包被的，标记物稀释液中稀释有量子点荧光微球和SARS-CoV-2His-RBD、鸡IgY的偶联标记物；标记物稀释液的配方如下：0.1M BS缓冲液1mL、聚乙烯吡咯烷酮0.1g、BSA 0.5g、酪蛋白0.5g、海藻糖0.5g、蔗糖0.5g，加水定容至50mL。
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