CN110672845B - 莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法和检测方法 - Google Patents

莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，在PVC底板上依次贴上吸水垫、硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜在吸水垫和玻璃纤维膜之间；利用XYZ三维划膜喷金仪在空白试纸条的硝酸纤维素膜表面分别喷上C线和T线，并在37℃烘箱中烘干；C线为羊抗兔IgG抗体线；T线为兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体线；将PVC盖板放置到PCV底板上，PVC盖板上设有显色窗孔和加样孔；C线和T线在所述显色窗孔内，T线与所述加样孔的距离小于所述C线与所述加样孔的距离。该方法有相对较高的灵敏度、良好的特异性、价格低廉、检测时间短、操作简单等优点，适合莴苣花叶病毒的口岸现场快速检测。该方法的建立为LMV的快速检测提供了一种新的方法。

Description

莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及纳米酶免疫层析技术领域。具体地说是莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法和检测方法。
背景技术
莴苣(Lactuca sativa)又称生菜、鹅仔菜等，为菊科莴苣属1年或2年生草本植物，是生活中常见的一种蔬菜。莴苣易受病毒危害，侵染莴苣的病毒主要有莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus,LMV)、蒲公英黄花叶病毒(Dandelion yellow mosaic virus,DaYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和番茄不孕病毒(Tomato aspermyvirus,TAV)等病毒。这些病毒可单独侵染危害，也可两种或两种以上复合侵染。莴苣特别容易受到LMV侵染，侵染初期，叶片边缘出现不规则及皱缩症状，继而出现淡绿色或淡黄色斑驳或者花叶症状；最终可导致莴苣矮化、结籽率下降，严重降低莴苣的产量及营养价值。LMV可由桃蚜进行传毒，也可通过种子进行远距离传播，导致LMV在世界各地均有分布，包括欧洲、南美、西印度群岛、中东、亚洲、和大洋洲的各个国家，危害巨大。
目前莴苣花叶病毒的检测技术主要有RT-PCR、ELISA、RT-RPA法及胶体金免疫层析技术。2007年出现的纳米酶技术，为该病毒的检测提供了一种新的选择。纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶，已在多个领域得到了应用。在农药残留方面建立了以四氧化三铁纳米颗粒为核心的有机磷农药检测系统。在微生物方面利用纳米酶的过氧化物酶样活性，催化H2O2产生的强氧化性羟自由基能够直接杀死病原微生物，破坏细菌膜。在医学方面纳米酶有保护心肌、改善阿尔茨海默病和缺血性脑卒中等功能。中国科学院生物物理研究所的阎锡蕴院士课题组在发现纳米酶的基础上，发展出了“纳米酶试纸条”新技术，已成功应用于埃博拉、新布尼亚、流感病毒等的检测。但是，现有技术中的这些纳米酶并不具有普遍适用性，针对不同的病毒检测，还需要寻找合适的纳米酶，目前尚没有出现适用于莴苣花叶病毒的检测纳米酶检测试纸条及相应的检测方法。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测灵敏度高、特异性好的莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法和检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1-1)在PVC底板上依次贴上吸水垫、硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜在吸水垫和玻璃纤维膜之间，且硝酸纤维素膜的两端分别与吸水垫和玻璃纤维膜搭接，制成空白试纸条；
(1-2)利用XYZ三维划膜喷金仪在空白试纸条的硝酸纤维素膜表面分别喷上C线和T线，并在37℃烘箱中烘干；所述C线为羊抗兔IgG抗体线；所述T线为兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体线；
(1-3)将PVC盖板放置到步骤(1-2)中的PCV底板上，所述PVC盖板上设有显色窗孔和加样孔；所述显色窗孔正对着硝酸纤维素膜，所述C线和T线在所述显色窗孔内，所述T线与所述加样孔的距离小于所述C线与所述加样孔的距离。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，
在步骤(1-1)中：在长度为6cm的PVC底板上依次贴上长度为2cm的吸水垫、长度为2.5cm的硝酸纤维素膜和长度为1.5cm的玻璃纤维膜，制成空白试纸条；
在步骤(1-2)中：所述C线和T线的宽度均为1mm；
在步骤(1-3)中：所述加样孔正对玻璃纤维膜。
利用莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(2-1)待测样品的制备；
(2-2)兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体与纳米酶颗粒的偶联；
(2-3)利用权利要求1-2任一所制备的莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条对待测样品进行检测。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，在步骤(2-1)中：向0.1g待测样品中加入5mL的1％BSA-PBS溶液并充分研磨；5500r/min离心20min，取上清；再次离心20min，取上清，-20℃冷冻保存备用；所述1％BSA-PBS的溶液制备方法为：将质量为1g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，在步骤(2-2)中，包括如下步骤：
(2-2-1)配制1mL活化剂，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物质的量之比为1:1；
(2-2-2)向步骤(2-2-1)的活化剂中加入纳米酶5mg，涡旋振荡，放置在静音混合器中充分反应30min；
(2-2-3)将100μg的兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体与450μL醋酸钠溶液混合后加入至步骤(2-2-2)的活化后的纳米酶溶液中，振荡混匀，置于4℃旋转混匀仪孵育过夜；所述醋酸钠溶液的pH为6.0，所述醋酸钠溶液的摩尔浓度为50mmol/L；
(2-2-4)将孵育过夜溶液放置磁力架上，待溶液透明弃上清，加入1mL终止液，放置于4℃的旋转混匀仪中3h，然后磁分离去除上清；所述终止液为Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
(2-2-5)加入1mL的5％BSA-PBS溶液，超声混匀，放置在4℃的旋转混匀仪上3h，期间振荡3-4次，最后磁分离弃上清后，加入500μL的质量体积分数为1％BSA-PBS溶液，制成抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存；所述5％BSA-PBS的制备方法为：将质量为5g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，在步骤(2-3)中，
将步骤(2-2)制备的抗体纳米酶偶联复合物震荡混匀5min，并用1％BSA-PBS溶液稀释5倍，再次震荡混匀，制成抗体纳米酶偶联复合物稀释液；
取步骤(2-1)中的65μL待测样品研磨液与5μL抗体纳米酶偶联复合物稀释液混合，滴加到莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的加样孔内，层析15min；
最后将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min；如果莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性，即待测样品中有莴苣花叶病毒；如果莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现C线，检测结果为阴性，即待测样品中没有莴苣花叶病毒；如果莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现T线，则检测结果无效，需重新检测。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，所述纳米酶溶液的制备方法如下：将水溶性镧盐、铁盐和镍盐溶于水中得到混合物A，将2-二乙氨基乙醇溶于乙醇中得到混合物B，将聚乙烯亚胺溶于乙醇中得到混合物C；然后同时将混合物B和混合物C滴加到混合物A中，搅拌后得到混合物D，用氨水调节混合物D的pH为9-10；再将混合物D至于密闭反应釜内，并以5-10℃/min的升温速度升温至200℃，反应12-24h后降温至25℃，离心分离出来的固体在500℃焙烧1-5小时，焙烧产物研磨后超声分散于水中，即得纳米酶溶液。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，混合物A中镧离子的浓度为0.01-0.1mol/L、铁离子的浓度为0.05-0.15mol/L、镍离子的浓度为0.01-0.05mol/L；混合物B中2-二乙氨基乙醇的浓度为0.1-0.3mol/L，混合物C中聚乙烯亚胺的浓度为3-15g/L，聚乙烯亚胺的平均分子量为600。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，混合物A、混合物B和混合物C三者的体积之比为1:2-3:2-3。
上述莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法，水溶性镧盐为醋酸镧，水溶性铁盐为醋酸亚铁，水溶性镍盐为醋酸镍。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
以莴苣花叶病毒为研究对象，带有LMV纳米酶标记的兔抗体IgG与硝酸纤维素膜质控线上的兔抗体结合，并在二氨基联苯胺的作用下进行显色。建立纳米酶免疫层析试纸条制备方法和检测方法。
1、莴苣花叶病毒的检测灵敏度高，纳米酶试纸条检测提纯LMV的灵敏度为100ng·mL-1，高于酶联免疫吸附测定法一个数量级；
2、用同样侵染莴苣的南芥菜花叶病毒(ArMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、番茄环斑病毒(ToRSV)和与LMV同属的马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯A病毒(PVA)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)作对照进行特异性实验，结果显示只有LMV为阳性，7种对照病毒均为阴性，表明建立的NISA具有良好的特异性。
3、检测时间短，检测速度快，缩短检测时间，在一定程度上可以限制莴苣花叶病毒的传播，对保护莴苣的农业生产具有一定的意义。
附图说明
图1：图1-1本发明莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法的莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条结构示意图；图1-2本发明莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法的莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条俯视结构示意图；
图2本发明莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的检测方法中的纳米酶试纸条法检测提纯莴苣花叶病毒灵敏度结果；其中1为空白对照，2为提纯的莴苣花叶病毒浓度为104ng·mL-1；3为提纯的莴苣花叶病毒浓度为103ng·mL-1；4为提纯的莴苣花叶病毒浓度为102ng·mL-1；5为提纯的莴苣花叶病毒浓度为101ng·mL-1；
图3本发明莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的检测方法中的纳米酶试纸条法检测莴苣花叶病毒特异性结果；其中：1.空白对照；2.莴苣阳性样品；3.莴苣阴性样品；4.南芥菜花叶病毒；5.黄瓜花叶病毒；6.烟草环斑病毒；7.番茄环斑病毒；8.马铃薯A病毒；9.马铃薯Y病毒；10.小西葫芦黄花叶病毒；
图4本发明莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的检测方法中纳米酶试纸条检测实际样品1#-7#的结果；其中：B为空白对照，1-7分别为实际样品1#-7#；
图5本发明莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的检测方法中纳米酶试纸条检测实际样品8#-14#的结果；其中：N为阴性对照，8-14分别为实际样品8#-14#。
图中附图标记表示为：1-PVC底板；2-吸水垫；3-硝酸纤维素膜；4-玻璃纤维膜；5-PVC盖板；5-1-显色窗孔；5-2-加样孔。
具体实施方式
1材料与方法
1.1实验材料
提纯的莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus,LMV)、南芥菜花叶病毒(Arabismosaic virus,ArMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomatoringspot virus,ToRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)、马铃薯A病毒(PotatovirusA,PVA)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus,ZYMV)和LMV兔抗IgG均来自中国检验检疫科学研究院。实际检测的样品由海关截获，编号为1#-14#。
生化试剂：羊抗兔IgG纯化抗体购自北京兰博利德商贸有限公司；纳米酶溶液自制；聚氯乙烯板(PVC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA)、硝酸纤维素膜(nmilliporehi-Flow135)、吸水垫为北京宏捷科技有限公司产品；二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。
供试仪器：XYZ三维划膜喷金仪、微电脑自动斩切机均购自上海金标生物科技有限公司，磁力架购自北京兰博利德商贸有限公司。
1.2试验方法
1.2.1试纸条制备(如图1-1和图1-2所示)
在6cm PVC底板1上依次贴上长度为2cm的吸水垫2、2.5cm硝酸纤维素膜3、1.5cm的玻璃纤维膜4制成空白试纸条。
利用XYZ三维划膜喷金仪在空白试纸条的硝酸纤维素膜表面分别喷上的羊抗兔抗体(C线)，特异性的LMV抗体(T线)，并在37℃烘箱中烘干，干燥保存；C线和T线的宽度均为1mm。
将PVC盖板5放置到PCV底板1上，所述PVC盖板5上设有显色窗孔5-1和加样孔5-2；所述C线和T线在所述显色窗孔5-1内，所述T线与所述加样孔5-2的距离小于所述C线与所述加样孔5-2的距离。
1.2.2待测样品制备向0.1g待测样品中加入5mL的1％BSA-PBS并充分研磨；5500r/min离心20min，取上清；再次离心，取上清，-20℃冷冻保存备用。
本专利申请中：1％BSA-PBS的溶液制备方法为：将质量为1g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L；5％BSA-PBS的溶液制备方法为：将质量为5g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
1.2.3抗体与纳米酶颗粒的偶联
纳米酶溶液的制备方法如下：将0.003mol醋酸镧、0.006mol醋酸亚铁和0.002mol醋酸镍溶于100mL水中得到混合物A，将0.04mol的2-二乙氨基乙醇溶于200mL乙醇中得到混合物B，将1g平均分子量为600的聚乙烯亚胺溶于200mL乙醇中得到混合物C；然后同时将混合物B和混合物C滴加到混合物A中，搅拌后得到混合物D，用浓度为25％的氨水调节混合物D的pH为10；再将混合物D至于密闭反应釜内，并以5-10℃/min的升温速度升温至200℃，反应12-24h后降温至25℃，离心分离出来的固体在500℃焙烧1-5小时，焙烧产物研磨后超声分散于水中，即得纳米酶溶液。
配制1mL活化剂，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物质的量之比为1:1；
向步骤(2-2-1)的活化剂中加入纳米酶5mg，涡旋振荡，放置在静音混合器中充分反应30min；
将100μg的兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体与450μL醋酸钠溶液混合后加入至步骤(2-2-2)的活化后的纳米酶溶液中，振荡混匀，置于4℃旋转混匀仪孵育过夜；所述醋酸钠溶液的pH为6.0，所述醋酸钠溶液的摩尔浓度为50mmol/L；
将孵育过夜溶液放置磁力架上，待溶液透明弃上清，加入1mL终止液，放置于4℃的旋转混匀仪中3h，然后磁分离去除上清；所述终止液为Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
加入1mL 5％的BSA-PBS，超声混匀，放置在旋转混匀仪上(4℃，3h)，期间振荡3-4次，最后磁分离弃上清后加入500μL的1％BSA-PBS，制成抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存。
1.2.4待测样品检测将抗体纳米酶偶联复合物震荡混匀5min，并用1％BSA-PBS稀释5倍，再次震荡混匀，制成纳米酶稀释液。取65μL待测样品研磨液与5μL纳米酶稀释液混合，滴加到试纸条加样孔，层析15min。最后将配制好的DAB底物液1mL滴加在盖有棉垫的显色窗中，显色7min。如果试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性；只出现C线，检测结果为阴性；只出现T线，则检测结果无效，需重新检测。
2结果与分析
2.1.1纳米酶试纸条灵敏度试验
将提纯的莴苣花叶病毒(104ng·mL-1)进行10倍梯度稀释后，分别用NISA和ELISA检测，结果表明其最低检测浓度分别为102ng·mL-1(如图2所示)和103ng·mL-1(表1)。NISA法比ELISA法灵敏度高10倍，具有较高的灵敏度。
表1 ELISA法检测提纯的莴苣花叶病毒
Figure BDA0002255216180000091
注：BC.空白对照；PC.阳性对照；NC.阴性对照。
2.1.2纳米酶试纸条特异性试验
用纳米酶试纸条检测8种病毒(LMV、ArMV、CMV、TRSV、ToRSV、PVA、PVY、ZYMV)，结果表明仅有LMV出现C线和T线，其他对照病毒只出现了C线，未出现T线，也无其它非特异性吸附(如图3所示)，说明该试纸条具有良好的特异性。
其中，图3中：
1.空白对照BC；2.莴苣阳性样品PC；3.莴苣阴性样品NC；4.南芥菜花叶病毒ArMV；5.黄瓜花叶病毒CMV；6.烟草环斑病毒TRSV；7.番茄环斑病毒ToRSV；8.马铃薯A病毒PVA；9.马铃薯Y病毒PVY；10.小西葫芦黄花叶病毒ZYMV。
2.1.3纳米酶试纸条实际样品检测
用纳米酶试纸条检测14份样品，发现有6份样品中(2#、4#、5#、10#、11#、14#)C线和T线分别出现了红褐色条带，检测结果为阳性。8份样品中(1#、3#、6#、7#、8#、9#、12#、13#)C线出现了红褐色条带，检测结果为阴性(如图4和图5)。经过序列测定以及ELISA方法验证以上结果准确(表2、3)，说明纳米酶试纸条法检测实际样品结果可靠。
表2 ELISA法检测实际样品1#-7#
样品信息Sample information BC PC NC 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#
重复1 Repetition2 0.09 2.93 0.11 0.11 1.88 0.15 1.02 2.44 0.01 0.01
重复2 Repetition2 0.11 2.93 0.11 0.12 1.04 0.15 1.16 1.70 0.12 0.14
重复3 Repetition2 0.20 2.90 0.11 0.13 1.05 0.16 1.15 1.30 0.18 0.15
平均值Average 0.10 2.92 0.11 0.12 1.32 0.15 1.11 1.81 0.10 0.10
表3 ELISA法检测实际样品8#-14#
样品信息Sample information BC PC NC 8# 9# 10# 11# 12# 13# 14#
重复1 Repetition1 0.01 1.88 0.09 0.02 0.13 0.49 0.47 0.26 0.24 0.31
重复2 Repetition2 0.14 1.60 0.12 0.19 0.15 0.38 0.31 0.13 0.12 0.38
重复3 Repetition3 0.13 1.38 0.14 0.18 0.17 0.40 0.41 0.13 0.15 0.37
平均值Average 0.09 1.62 0.11 0.13 0.15 0.42 0.40 0.17 0.17 0.35
3结论与讨论
本申请的纳米酶试纸条检测提纯LMV的灵敏度为100ng·mL-1，而ELISA法检测相同梯度的提纯LMV的灵敏度为1000ng·mL-1，该试纸条具有较好的灵敏度，同时具有ELISA无法比拟的快速、便捷、可现场操作等优点。检测其它4种同寄主、3种同属病毒也具有良好的特异性。试纸条检测14份实际样品，其中6份为阳性，8份为阴性；经ELISA法及基因测序法验证结果可靠。该方法有相对较高的灵敏度，良好的特异性，价格低廉，检测时间短，操作简单等优点，适合莴苣花叶病毒的口岸现场的快速检测。该方法的建立为LMV的快速检测提供了一种新的方法。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (4)

1.利用莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(2-1)待测样品的制备；
(2-2)兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体与纳米酶颗粒的偶联；纳米酶溶液的制备方法如下：将水溶性镧盐、铁盐和镍盐溶于水中得到混合物A，将2-二乙氨基乙醇溶于乙醇中得到混合物B，将聚乙烯亚胺溶于乙醇中得到混合物C；然后同时将混合物B和混合物C滴加到混合物A中，搅拌后得到混合物D，用氨水调节混合物D的pH为9-10；再将混合物D至于密闭反应釜内，并以5-10℃/min的升温速度升温至200℃，反应12-24h后降温至25℃，离心分离出来的固体在500℃焙烧1-5小时，焙烧产物研磨后超声分散于水中，即得纳米酶溶液；混合物A中镧离子的浓度为0.01-0.1mol/L、铁离子的浓度为0.05-0.15mol/L、镍离子的浓度为0.01-0.05mol/L；混合物B中2-二乙氨基乙醇的浓度为0.1-0.3mol/L，混合物C中聚乙烯亚胺的浓度为3-15g/L，聚乙烯亚胺的平均分子量为600；混合物A、混合物B和混合物C三者的体积之比为1:2-3:2-3；水溶性镧盐为醋酸镧，水溶性铁盐为醋酸亚铁，水溶性镍盐为醋酸镍；
(2-3)利用莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条对待测样品进行检测；
莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的制备方法,包括如下步骤：
(1-1)在PVC底板(1)上依次贴上吸水垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和玻璃纤维膜(4)，硝酸纤维素膜(3)在吸水垫(2)和玻璃纤维膜(4)之间，且硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸水垫(2)和玻璃纤维膜(4)搭接，制成空白试纸条；在长度为6cm的PVC底板(1)上依次贴上长度为2cm的吸水垫(2)、长度为2.5cm的硝酸纤维素膜(3)和长度为1.5cm的玻璃纤维膜(4)，制成空白试纸条；
(1-2)利用XYZ三维划膜喷金仪在空白试纸条的硝酸纤维素膜(3)表面分别喷上C线和T线，并在37℃烘箱中烘干；所述C线为羊抗兔IgG抗体线；所述T线为兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体线；所述C线和T线的宽度均为1mm；
(1-3)将PVC盖板(5)放置到步骤(1-2)中的PCV底板上，所述PVC盖板(5)上设有显色窗孔(5-1)和加样孔(5-2)；所述显色窗孔(5-1)正对着硝酸纤维素膜(3)，所述C线和T线在所述显色窗孔(5-1)内，所述T线与所述加样孔(5-2)的距离小于所述C线与所述加样孔(5-2)的距离；所述加样孔(5-2)正对玻璃纤维膜(4)。
2.根据权利要求1所述的利用莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的方法，其特征在于，在步骤(2-1)中：向0.1g待测样品中加入5mL的1％BSA-PBS溶液并充分研磨；5500r/min离心20min，取上清；再次离心20min，取上清，-20℃冷冻保存备用；所述1％BSA-PBS的溶液制备方法为：将质量为1g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
3.根据权利要求1所述的利用莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的方法，其特征在于，在步骤(2-2)中，包括如下步骤：
(2-2-1)配制1mL活化剂，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物质的量之比为1:1；
(2-2-2)向步骤(2-2-1)的活化剂中加入纳米酶5mg，涡旋振荡，放置在静音混合器中充分反应30min；
(2-2-3)将100μg的兔抗莴苣花叶病毒LMV的IgG抗体与450μL醋酸钠溶液混合后加入至步骤(2-2-2)的活化后的纳米酶溶液中，振荡混匀，置于4℃旋转混匀仪孵育过夜；所述醋酸钠溶液的pH为6.0，所述醋酸钠溶液的摩尔浓度为50mmol/L；
(2-2-4)将孵育过夜溶液放置磁力架上，待溶液透明弃上清，加入1mL终止液，放置于4℃的旋转混匀仪中3h，然后磁分离去除上清；所述终止液为Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
(2-2-5)加入1mL的5％BSA-PBS溶液，超声混匀，放置在4℃的旋转混匀仪上3h，期间振荡3-4次，最后磁分离弃上清后，加入500μL的质量体积分数为1％BSA-PBS溶液，制成抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存；所述5％BSA-PBS的制备方法为：将质量为5g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
4.根据权利要求1所述的利用莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条检测莴苣花叶病毒的方法，其特征在于，在步骤(2-3)中，
将步骤(2-2)制备的抗体纳米酶偶联复合物震荡混匀5min，并用1％BSA-PBS溶液稀释，再次震荡混匀，制成抗体纳米酶偶联复合物稀释液；
取步骤(2-1)中的65μL待测样品研磨液与5μL抗体纳米酶偶联复合物稀释液混合，滴加到莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条的加样孔内，层析15min；
最后将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min；如果莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性，即待测样品中有莴苣花叶病毒；如果莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现C线，检测结果为阴性，即待测样品中没有莴苣花叶病毒；如果莴苣花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现T线，则检测结果无效，需重新检测。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112147323A (zh) * 2020-09-07 2020-12-29 深圳市第二人民医院 一种用于检测溶栓后脑出血31-kDa Occludin的试纸条及其制备方法和用途
CN113189329A (zh) * 2020-10-14 2021-07-30 北京化工大学 一种基于单原子纳米酶的多重免疫比色病毒检测方法
CN113105530A (zh) * 2021-04-14 2021-07-13 中国检验检疫科学研究院 一种蓝莓休克病毒纳米酶免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN113173975A (zh) * 2021-04-21 2021-07-27 中国检验检疫科学研究院 夜来香花叶病毒纳米酶免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN115963278A (zh) * 2023-03-15 2023-04-14 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种用于犬病毒抗体三联检的检测试剂盒及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104941695A (zh) * 2015-06-08 2015-09-30 清华大学 一种纳米zsm-5分子筛催化剂及制备、使用方法
WO2018084340A1 (ko) * 2016-11-03 2018-05-11 (의료)길의료재단 효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 ig e 검출 및 알러지 진단법
CN109806877A (zh) * 2019-01-23 2019-05-28 南京大学 基于过渡金属氧化物及其衍生物的高活性纳米酶及其获得方法和应用
CN109813893A (zh) * 2019-01-28 2019-05-28 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 Cea检测试纸条及其制备方法、cea检测装置

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103808926B (zh) * 2014-01-14 2016-08-17 中国科学院生物物理研究所 纳米模拟酶免疫层析检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104941695A (zh) * 2015-06-08 2015-09-30 清华大学 一种纳米zsm-5分子筛催化剂及制备、使用方法
WO2018084340A1 (ko) * 2016-11-03 2018-05-11 (의료)길의료재단 효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 ig e 검출 및 알러지 진단법
CN109806877A (zh) * 2019-01-23 2019-05-28 南京大学 基于过渡金属氧化物及其衍生物的高活性纳米酶及其获得方法和应用
CN109813893A (zh) * 2019-01-28 2019-05-28 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 Cea检测试纸条及其制备方法、cea检测装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
莴苣花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制;魏梅生 等;《黑龙江农业科学》;20141231;第11卷;第139-141页 *
马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒胶体金免疫层析试纸条的研制;魏梅生 等;《植物保护》;20061231;第32卷(第6期);第74-77页 *

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