CN112147323A - 一种用于检测溶栓后脑出血31-kDa Occludin的试纸条及其制备方法和用途 - Google Patents

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徐迹
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Abstract

本发明公开一种用于检测溶栓后脑出血31‑kDa Occludin的试纸条，所述试纸条由样品垫、反应垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次贴在PVC底卡上制成，所述硝酸纤维素膜采用羊抗兔抗体划线作为质控线C线，采用兔抗31‑kDa Occludin蛋白的IgG捕获抗体在硝酸纤维素膜上线作为检测线T线，所述反应垫喷涂Fe3O4纳米酶‑抗31‑kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物，所述反应垫采用含有1‑2%的Casein‑PBS和0.5%‑1%Triton X‑100进行预处理，所述试纸条特异性好，灵敏度高是一种价格低廉、准确性高、快速检测、操作简单的脑卒中溶栓或取栓后脑出血风险的预测产品，具有良好市场应用价值。

Description

一种用于检测溶栓后脑出血31-kDa Occludin的试纸条及其 制备方法和用途
技术领域
本发明属于免疫层析检测领域，具体涉及脑卒中溶栓或取栓后脑出血的检测，特别是一种脑卒中溶栓或取栓后脑出血蛋白片段及其应用。
背景技术
从1990年到2017年近20年来，脑卒中一直位列我国国民死亡原因首位。其高发病率、高致死率、高致残率、高复发率、经济负担重五大特点，严重威胁人类健康。血管再通治疗（溶栓或取栓）是目前脑卒中急性期治疗的唯一有效手段，但存在脑出血的巨大风险，导致其治疗率不足5%。如何明确溶栓或取栓导致脑出血的病因、早期识别风险预警标志、提供快速精确诊断成为困扰临床医生的棘手问题，是目前临床亟需解决的重要问题。
再灌后脑出血的发生与脑缺血早期血脑屏障损伤密切相关，相关的分子机制研究层出不穷，积累了大量相关血清学标志物的数据。其中来源于凋亡血脑屏障内皮细胞的31-kDa Occludin蛋白降解片段，具有“血脑屏障损伤达到临界点之前，一直维持低水平的正常血清基线；一旦血脑屏障损伤达到临界点，血清水平骤然大幅升高”的生物学特性，具备作为理想血清标志物的重要特征。通过纳米酶免疫层析抗原抗体反应对被测患者血清样本进行31-kDa Occludin蛋白检测，可实现血脑屏障损伤人群的快速识别，从而为脑卒中急性期治疗后脑出血的发生，提供一种新型血清标志物及其检测方法。
31-kDa Occludin蛋白降解片段，由于其分子量小、血清中含量低，对于其检测的特异性和灵敏度有严格要求，传统胶体金等免疫层析技术的检测疾病受到巨大限制，而与此同时，从脑卒中发病到血管再通治疗的时间窗仅有不到6小时，需要实现短时间的床旁检测，基于蛋白质组学检测难以担当此任。2007年出现的纳米酶技术，是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶，已在多个领域得到了应用。在农药残留方面建立了以四氧化三铁纳米颗粒为核心的有机磷农药检测系统。在微生物方面利用纳米酶的过氧化物酶样活性，催化H2O2产生的强氧化性羟自由基能够直接杀死病原微生物，破坏细菌膜。在医学方面纳米酶有保护心肌、改善阿尔茨海默病和缺血性脑卒中等功能。中国科学院生物物理研究所的阎锡蕴院士课题组在发现纳米酶的基础上，发展出了“纳米酶试纸条”新技术，已成功应用于埃博拉、新布尼亚、流感病毒等的检测。但是，现有技术中的这些纳米酶并不具有普遍适用性，针对不同的靶标检测，还需要寻找合适的纳米酶，目前尚没有出现适用于31-kDa Occludin蛋白降解片段的检测纳米酶检测试纸条及相应的检测方法。因此，开发一款价格低廉、准确性高、快速检测、操作简单的蛋白免疫层析产品，特别是对于脑卒中溶栓或取栓后脑出血风险的预测产品，具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，发明人通过多次，反复的实验和摸索，开发一款价格低廉、准确性高、快速检测、操作简单的脑卒中溶栓或取栓后脑出血风险的预测产品，该产品以31-kDa Occludin蛋白降解片段为检测靶标，采用纳米酶技术，具有特异性高，灵敏度好的特点。
在一个实施方式中，本发明提供一种检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条，所述试纸条由样品垫、反应垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次贴在PVC底卡上制成，所述硝酸纤维素膜采用羊抗兔抗体划线作为质控线C线，采用兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕获抗体在硝酸纤维素膜上线作为检测线T线，所述反应垫喷涂Fe3O4纳米酶-抗31-kDaOccludin蛋白抗体偶联复合物，所述反应垫采用含有1-2%的Casein-PBS和0.5%-1% TritonX-100进行预处理。
在一个实施方式中，所述反应垫采用含有1.5%的Casein-PBS和0.75% Triton X-100进行预处理，所述预处理为浸泡5min。
在一个实施方式中，所述试纸条用浓度为2mg/mL的羊抗兔抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线C线；用浓度为3mg/mL 的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕获抗体在硝酸纤维素膜上线作为检测线T线。
在一个实施方式中，将浓度为 1.5 mg/mL Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物喷涂至反应垫上。
在一个实施方式中，所述Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物的制备方法为：（1）配制1mL活化剂，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物质的量之比为1:1；
（2）向步骤的活化剂中加入分散度好、粒径均一的Fe3O4纳米酶5mg，涡旋振荡，放置在静音混合器中充分反应30min；将100μg的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG抗体与500μL醋酸钠溶液混合后加入至步骤的活化后的纳米酶溶液中，振荡混匀，置于4℃旋转混匀仪孵育过夜；所述醋酸钠溶液的pH为6.0，所述醋酸钠溶液的摩尔浓度为50mmo l/L；
（3）将孵育过夜溶液放置磁力架上，待溶液透明弃上清，加入1mL终止液，放置于4℃的旋转混匀仪中3h，然后磁分离去除上清；所述终止液为Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
（4）加入1mL的5％BSA-PBS溶液，超声混匀，放置在4℃的旋转混匀仪上2h，期间振荡2-3次，最后磁性分离弃上清后，加入500μL的质量体积分数为1％BSA-PBS溶液，制成抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存；
在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条。
在一个实施方式中，本发明提供一种检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条的制备方法，具体为将样品垫、反应垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次贴在PVC底卡上，所述6cm的PVC底板上依次贴上长度为2cm的吸水垫、长度为2.5cm的硝酸纤维素膜和长度为分别为1.5cm的样品垫和反应垫，制成空白试纸条；所述C线和T线的宽度均为1mm；采用切条机切成宽度为4.5mm的试纸条。
在一个实施方式中，所述反应垫采用以下方法制备：将反应垫浸泡于反应垫缓冲液中直至完全浸透；浸泡5min，取出沥干并烘干；所述反应垫缓冲液含有1.5%的Casein-PBS和0.75% Triton X-100；将Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物稀释到1％BSA-PBS缓冲液中，配制得到偶联复合物的浓度为 1.5 mg/mL；将稀释的偶联复合物喷涂至反应垫上，喷涂参数为0 .6μ L/mm；然后将反应垫置于恒温箱中干燥1.5h，干燥温度为42℃。
在一个实施方式中，本发明提供一种检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条或试剂盒在制备检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的产品中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供一种检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条或试剂盒在制备检测脑卒中溶栓或取栓后脑出血风险的预测产品中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供所述检测方法为取100μL检测样本，滴加到加样孔内，层析15min；将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min。如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性，即待测样品中有31-kDa Occludin蛋白；如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条只出现C线，检测结果为阴性，即待测样品中没有31-kDa Occludin蛋白；如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条只出现T线，则检测结果无效，需重新检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本申请运用免疫层析技术，31-kDa Occludin蛋白为检测样本，利用纳米酶具有过氧化物酶催化活性的特点，将传统的胶体金替换为纳米酶，研究纳米酶免疫 层析试纸条在31-kDa Occludin蛋白中的应用，通过在免疫层析后加入酶的催化底物 DAB，可显著增强检测信号，达到更高检测灵敏度的效果。本申请的纳米酶免疫层析试纸条具有良好的检测特异性，仅能和血清中31-kDa Occludin蛋白降解片段反应，与55-kDa Occludin蛋白不产生非特异性结合，并且本发明的检测的灵敏度极高，可以检测限值可低至0.5ng/ml，是一种价格低廉、准确性高、快速检测、操作简单的脑卒中溶栓或取栓后脑出血风险的预测产品，具有良好市场应用价值。
附图说明
图1 本发明检测31-kDa Occludin蛋白降解片段试纸条的原理图；
图2本发明检测31-kDa Occludin蛋白降解片段试纸条的特异性检测结果；
图3 本发明检测31-kDa Occludin蛋白降解片段试纸条的灵敏度检测结果。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。
实施例1抗31-kDa Occludin蛋白抗体-纳米酶偶联复合物的合成制备
1.Fe3O4纳米酶的合成
采用水热法合成纳米酶：将0.3g FeCl3·6H2O溶解于20mL乙二醇中， 搅拌溶解，再加入1 .5g醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜 中，200℃反应14小时，得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗3次然后，用电热恒温干燥箱50-60℃烘干保存，得到Fe3O4纳米酶。
34纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物的合成
（1）配制1mL活化剂，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物质的量之比为1:1；
（2）向步骤的活化剂中加入分散度好、粒径均一的上述方法制备的Fe3O4纳米酶5mg，涡旋振荡，放置在静音混合器中充分反应30min；将100μg的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG抗体与500μL醋酸钠溶液混合后加入至步骤的活化后的纳米酶溶液中，振荡混匀，置于4℃旋转混匀仪孵育过夜；所述醋酸钠溶液的pH为6.0，所述醋酸钠溶液的摩尔浓度为50mmo l/L；
（3）将孵育过夜溶液放置磁力架上，待溶液透明弃上清，加入1mL终止液，放置于4℃的旋转混匀仪中3h，然后磁分离去除上清；所述终止液为Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
（4）加入1mL的5％BSA-PBS溶液，超声混匀，放置在4℃的旋转混匀仪上2h，期间振荡2-3次，最后磁性分离弃上清后，加入500μL的质量体积分数为1％BSA-PBS溶液，制成抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存；
实施例2 检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的制备
用于检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的制备，包括如下步骤：
(1)样品垫预处理：将玻璃纤维膜浸泡于样品垫缓冲液中完全浸透，浸泡5min，取出沥干并烘干备用；所述样品垫缓冲液为1％BSA-PBS、1% Tween-20，所述1％BSA-PBS的制备方法为：将质量为1g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmo l/L。
(2)反应垫的预处理：将另一块玻璃纤维膜浸泡于反应垫缓冲液中直至完全浸透；浸泡5min，取出沥干并烘干备用；所述样品垫缓冲液为1％BSA-PBS、1% Tween-20，所述1％BSA-PBS的制备方法为：将质量为1g的牛血清蛋白BSA，溶于100mL磷酸缓冲溶液PBS，所述磷酸缓冲溶液的pH为7.4，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
（3）反应垫的制备：将实施例2制备的Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物稀释到1％BSA-PBS缓冲液中，配制得到偶联复合物的浓度为 1.5 mg/mL；将稀释的偶联复合物喷涂至反应垫上，喷涂参数为0 .6μ L/mm；然后将反应垫置于恒温箱中干燥1.5h，干燥温度为42℃。
（4）质控线C线和检测线T线的制备：在硝酸纤维素膜制备质控线C线和检测线T线，质控线和检测线之间的距离为8.5mm，用浓度为2mg/mL的羊抗兔抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线C线；用浓度为3mg/mL 的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕获抗体在硝酸纤维素膜上线作为检测线T线，划线参数为0.7μL/mm；划线后，将硝酸纤维素膜置于恒温箱中干燥1.5h，干燥温度为42℃。
（5）检测试纸条的组装：将样品垫、反应垫、硝酸纤维素膜和吸收垫 5依次贴在PVC底卡上，所述6cm的PVC底板上依次贴上长度为2cm的吸水垫、长度为2.5cm的硝酸纤维素膜和长度为分别为1.5cm的样品垫和反应垫，制成空白试纸条。所述硝酸纤维素膜上的检测线T线靠近结合垫，所述硝酸纤维素膜上的质控线C线靠近吸收垫，所述吸收垫为吸水滤纸组装成完整的纳米酶免疫层析试纸条，所述C线和T线的宽度均为1mm。采用切条机切成宽度为4.5mm的试纸条；在切割好的试纸条上加盖上外壳，外壳开设有加样孔和观察窗；加样孔处为样品垫上，质控线和检测线位于观察窗内，将组装好的检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条，置于密封袋中室温干燥保存。
实施例3 检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的制备工艺条件优化
1. 反应垫缓冲液中最适表面活性类型和浓度的探索
（1）不同类型和浓度的反应垫缓冲液的配制与反应垫预处理
合适的表面活性剂在整个反应过程中，往往可以起到增强反应信号，消除假阳性的效果。相反，如果表面活性不合适，往往会导致检测结果混乱，阴阳性无法区分等问题。所以，在反应垫中添加合适的表面活性剂，对于31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的检测性能起到作用至关重要的。本实验主要探索适合于31-kDa Occludin蛋白纳米酶检测的表面活性剂，将常用表面活性剂Tween-20，Tween-40，Tween-80，Triton X-100，分别以0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%的浓度梯度加入到1%的BSA-PBS溶液中，制备不同的反应垫处理缓冲液，具体如表1所示
表1 含有不同类型和浓度表面活性剂的反应垫处理缓冲液
Figure 407798DEST_PATH_IMAGE002
将一块玻璃纤维膜浸泡于表1所示的反应垫缓冲液中，直至完全浸透；浸泡5min，取出沥干并烘干备用；并采用实施例2的方法制备出经过不同（X1-X20）反应垫缓冲液处理的试纸条。
（2）不同（X1-X20）反应垫缓冲液处理的试纸条的检测
取100μL浓度为100 ng/mL 的标准品(即用人阴性血清作为基质配置的已知标准抗原浓度的血清样本) 进行检测，，滴加到31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条的加样孔内，层析15min； 最后将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min。如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性，即待测样品中有31-kDa Occludin蛋白；如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条只出现C线，检测结果为阴性，即待测样品中没有31-kDa Occludin蛋白；如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条只出现T线，则检测结果无效，需重新检测。观察检测线的强度，采用金标色卡进行显色强度评价，检测线的显色强度按照G1-G10分为10个等级，G1不显色，G10为最强。不同（X1-X20）反应垫缓冲液处理的试纸条的检测结果如表2所示。
表2 X1-X20反应垫缓冲液处理的试纸条的显色强度
Figure 964682DEST_PATH_IMAGE004
根据表2上结果显示当使用0.75% Triton X-100作为表面活性剂加入到BSA-PBS溶液中，制备的反应垫处理缓冲液时，产品的检测效果最好。
2. 反应垫缓冲液中最适封闭蛋白类型和浓度的探索
由于免疫反应的本质是抗原抗体反应，而人类血清中含有大量的不同类型的蛋白质，这就导致在实际的反应中，会存在非特异性结合或因为结合位 点不匹配等原因造成的假阳性问题。常见的方法是在反应体系中添加一些封闭蛋白，将这些非特异性蛋白或非特异性位点消除掉，确保产品的质量稳定。本实验主要探索适合于31-kDa Occludin蛋白纳米酶检测的封闭蛋白，分别将0.5g、1g、1.5g、2g的BSA（牛血清蛋白）、Casein（酪蛋白）、Casein-sodium（酪蛋白盐）加入到100的PBS溶液中，并加入0.75%的Triton X-100制备成反应垫处理缓冲液，具体如表3所示
表3含有不同类型和浓度封闭蛋白的反应垫处理缓冲液
Figure 762873DEST_PATH_IMAGE006
（2）不同（X21-X33）反应垫缓冲液处理的试纸条的检测
取100μL浓度为100 ng/mL 的标准品(即用人阴性血清作为基质配置的已知标准抗原浓度的血清样本) 进行检测，滴加到31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条的加样孔内，层析15min； 最后将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min。如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条同时出现C线和T线，则检测结果为阳性，即待测样品中有31-kDa Occludin蛋白；如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条只出现C线，检测结果为阴性，即待测样品中没有31-kDa Occludin蛋白；如果31-kDa Occludin蛋白纳米酶免疫层析试纸条只出现T线，则检测结果无效，需重新检测。观察检测线的强度，采用金标色卡进行显色强度评价，检测线的显色强度按照G1-G10分为10个等级，G1不显色，G10为最强。不同（X21-X33）反应垫缓冲液处理的试纸条的检测结果如表4所示。
表4 X21-X33反应垫缓冲液处理的试纸条的显色强度
Figure 994397DEST_PATH_IMAGE008
根据表4上结果显示将1.5g Casein（酪蛋白）加入到100ml的PBS溶液中，并加入0.75%的Triton X-100制备成反应垫处理缓冲液，产品的检测效果最好。
实施例4 检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的特异性检测
1.检测样本
本实验主要探究31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的特异性，分别以浓度为100 ng/mL 的31-kDa Occludin蛋白标准品和55-kDa Occludin蛋白标准品(即用人阴性血清作为基质配置的已知标准抗原浓度的血清样本) 进行检测。
2. 检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的制备
采用实施例2的制备方法，其中反应垫处理缓冲液为1.5%的Casein-PBS、0.75% TritonX-100，即1.5 g Casein（酪蛋白）加入到100ml的PBS溶液中，并加入0.75%的Triton X-100制备成反应垫处理缓冲液
3.检测步骤
取100μL浓度为100 ng/mL 的31-kDa Occludin蛋白标准品和55-kDa Occludin蛋白标准品进行检测，滴加到试纸条的加样孔内，层析15min； 最后将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min。观察检测结果。
如图2所示，31-kDa Occludin蛋白标准品出现两条清晰的检测带，而55-kDaOccludin蛋白标准品仅出现质控线，可见，本发明的试纸条可以准确的检测31-kDaOccludin蛋白，特异性良好。
实施例5检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的灵敏度检测
1.标准样本制备
本实验主要探究31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的灵敏度，以31-kDa Occludin蛋白标准品 (即用人阴性血清作为基质配置的已知标准抗原浓度的血清样本) 进行稀释，制备浓度为50ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml，0.1ng/ml的梯队浓度检测样本。
2. 检测31-kDa Occludin蛋白纳米酶试纸条的制备
采用实施例2的制备方法，其中反应垫处理缓冲液为1.5%的Casein-PBS、0.75% TritonX-100，即1.5 g Casein（酪蛋白）加入到100ml的PBS溶液中，并加入0.75%的Triton X-100制备成反应垫处理缓冲液
3.检测步骤
取100μL上述梯度浓度的样本标准品检测，滴加到试纸条的加样孔内，层析15min； 最后将1mL的二氨基联苯胺DAB底物液滴加在试纸条盖有棉垫的显色窗孔中，显色7min。观察检测结果。
如图3所示，0.5ng/ml 的31-kDa Occludin蛋白样本仍然能够出现两条的检测带，而1ng/ml 的31-kDa Occludin蛋白样本则出现了非常清晰的两条的检测带，可见，本发明的试纸条可以检测样本中低至0.5ng/ml 的31-kDa Occludin蛋白，灵敏度良好。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条，所述试纸条由样品垫、反应垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次贴在PVC底卡上制成，所述硝酸纤维素膜采用羊抗兔抗体作为质控线C线，采用兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕获抗体在硝酸纤维素膜上作为检测线T线，所述反应垫喷涂Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物，所述反应垫采用含有1-2%的Casein-PBS和0.5%-1% Triton X-100进行预处理。
2.根据权利要求1所述的检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条，其特征在于，所述反应垫采用含有1.5%的Casein-PBS和0.75% Triton X-100进行预处理，所述预处理为浸泡5min。
3.根据权利要求1所述的检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条，其特征在于，所述试纸条用浓度为2mg/mL的羊抗兔抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线C线；用浓度为3mg/mL 的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕获抗体在硝酸纤维素膜上线作为检测线T线。
4.根据权利要求1-3任意一项所述检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条，其特征在于，将浓度为 1.5 mg/mL Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物喷涂至反应垫上。
5.根据权利要求1-4任意一项所述检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条，其特征在于，所述Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物的制备方法为：
（1）配制1mL活化剂，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物质的量之比为1:1；
（2）向步骤的活化剂中加入分散度好、粒径均一的Fe3O4纳米酶5mg，涡旋振荡，放置在静音混合器中充分反应30min；将100μg的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG抗体与500μL醋酸钠溶液混合后加入至步骤的活化后的纳米酶溶液中，振荡混匀，置于4℃旋转混匀仪孵育过夜；所述醋酸钠溶液的pH为6.0，所述醋酸钠溶液的摩尔浓度为50mmo l/L；
（3）将孵育过夜溶液放置磁力架上，待溶液透明弃上清，加入1mL终止液，放置于4℃的旋转混匀仪中3h，然后磁分离去除上清；所述终止液为Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2；
（4）加入1mL的5％BSA-PBS溶液，超声混匀，放置在4℃的旋转混匀仪上2h，期间振荡2-3次，最后磁性分离弃上清后，加入500μL的质量体积分数为1％BSA-PBS溶液，制成抗体纳米酶偶联复合物，4℃保存。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-5任意一项所述的检测31-kDaOccludin蛋白降解片段的试纸条。
7.权利要求1-5任意一项检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条的制备方法，其特征在于，将样品垫、反应垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次贴在PVC底卡上，所述6cm的PVC底板上依次贴上长度为2cm的吸水垫、长度为2.5cm的硝酸纤维素膜和长度为分别为1.5cm的样品垫和反应垫，制成空白试纸条；所述C线和T线的宽度均为1mm；采用切条机切成宽度为4.5mm的试纸条。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应垫采用以下方法制备：将反应垫浸泡于反应垫缓冲液中直至完全浸透；浸泡5min，取出沥干并烘干；所述反应垫缓冲液含有1.5%的Casein-PBS和0.75% Triton X-100；将Fe3O4纳米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗体偶联复合物稀释到1％BSA-PBS缓冲液中，配制得到偶联复合物的浓度为 1.5 mg/mL；将稀释的偶联复合物喷涂至反应垫上，喷涂参数为0 .6μ L/mm；然后将反应垫置于恒温箱中干燥1.5h，干燥温度为42℃。
9.权利要求1-5任意一项所述检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条或权利要求6所述试剂盒在制备检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的产品中的用途。
10.权利要求1-5任意一项所述检测31-kDa Occludin蛋白降解片段的试纸条或权利要求6所述试剂盒在制备检测脑卒中溶栓或取栓后脑出血风险的预测产品中的用途。
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