CN111596065B - 一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸及其制备方法和应用，属于生物分析技术领域。制备方法包括：通过原位还原法制备Fe3O4/Au复合纳米粒子，然后采用物理或化学方法制备成金磁纳米酶免疫探针，最后完成其侧向流免疫层析试纸的膜材处理和组装，得到基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸。该制备方法中，利用Fe3O4/Au复合纳米粒子相提供了更多的酶催化活性位点，有效提高了酶催化显色反应速率具有工艺简单、成本低、易规模生产的特点，得到的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸与现有侧向流免疫层析试纸相比检测灵敏度可提高2～3个数量级，且检测体系特异性强，为低检测限的标记物分析提供了高效的检测技术。

Description

一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，涉及一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸及其制备方法和应用。
背景技术
侧向流免疫层析检测(Lateral flow immunoassay，LFIA)试纸是一种理想的即时检测手段，具有检测时间短，操作简单，可实现现场检测，通用性强等优点被广泛用于医学诊断、食品毒性检测、化学污染检测、农业、识别药物滥用和监测动物健康等。然而，基于传统胶体金的侧向流免疫层析检测试纸检测灵敏度低，易出现假阳性，重复性差，只能提供定性或半定量检测结果，极大地限制了该检测方法在生物诊断领域的发展和推广。
为了克服这一发展局限性，信号放大成为了研究热点。目前，常见的改进方法有采用荧光，化学发光或磁定量分析检测结果，但是，这些分析方法均需要特定的设备和专业人员来实施检测。此外，天然酶的催化活性容易受到使用环境的影响，限制了具体使用中的催化效果。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸及其制备方法和应用，该基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸与现有侧向流免疫层析试纸相比获得更低检测限，具有高检测灵敏度、目视化、普适性的特点，能够很好地适用于生物医学领域痕量物质的检测。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)Fe3O4/Au复合纳米粒子的制备
将粒径为20～200nm的Fe3O4纳米粒子、柠檬酸钠、氯金酸溶液加入水中混合均匀，然后在100～120℃下反应30～60min，得到Fe3O4/Au复合纳米粒子；
2)金磁纳米酶免疫探针的制备
采用物理吸附法或化学法将Fe3O4/Au复合纳米粒子与靶标分子的第一个识别抗体结合，得到金磁纳米酶免疫探针；
3)基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备
将靶标分子的第二个识别位点均匀喷涂在侧向流免疫层析检测试纸的硝酸纤维素膜的检测线上，将多克隆抗体二抗均匀喷涂在侧向流免疫层析检测试纸的硝酸纤维素膜的质控线上，将金磁纳米酶免疫探针喷涂在侧向流免疫层析检测试纸的结合垫上，得到基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸。
优选地，步骤1)中，氯金酸溶液的浓度为24mmol/L；
Fe3O4纳米粒子、柠檬酸钠、氯金酸溶液和水的反应投料比为(100～150)mg：(0.1～0.5)g：(1～5)mL：(100～200)mL。
优选地，侧向流免疫层析检测试纸的制备过程具体包括：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜分别置于样品垫处理缓冲溶液、结合垫处理缓冲溶液和硝酸纤维素膜处理缓冲溶液中，浸泡后干燥，得到处理过的样品垫、处理过的结合垫和处理过的硝酸纤维素膜，然后将处理过的样品垫、处理过的结合垫、处理过的硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在支撑板上，并保证每两个部分之间有2mm宽的重叠部分，得到侧向流免疫层析检测试纸。
进一步优选地，将质量比为2％的NaCl、0.05％的牛血清蛋白、0.1％的聚乙烯吡咯烷酮和体积比为0.05％的吐温-20溶于pH值为8.0～9.0、离子强度为0.005～20mol/L的硼酸钠缓冲液，制得样品垫处理缓冲溶液；
将质量比为1％的牛血清蛋白、0.05％的聚乙二醇和体积比为1％的吐温-20溶于pH值为8.0～9.0、离子强度为0.005～20mol/L的硼酸钠缓冲液，制得结合垫处理缓冲溶液；
将质量比为0.05％的聚乙二醇、1％的牛血清蛋白和体积比为0.005％的吐温-20溶于pH值为8.0～9.0、离子强度为0.005～20mol/L的硼酸钠缓冲液，制得硝酸纤维素膜处理缓冲溶液。
进一步优选地，样品垫置于样品垫处理缓冲溶液中浸泡20～30h，在50～60℃的烘箱中干燥2～5h；
结合垫置于结合垫处理缓冲溶液中的浸泡20～30h，在50～60℃的烘箱中干燥2～5h；
硝酸纤维素膜置于硝酸纤维素膜处理缓冲溶液中浸泡1～5h后，取出冷冻干燥。
优选地，步骤3)中，检测线和质控线相距6～10mm。
本发明还公开了采用上述制备方法制得的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸。
本发明还公开了上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于双抗夹心法检测的应用。
优选地，上述应用包括以下操作：
①将5～20μL、浓度为5～10mmol/L的显色有机底物和5～50μL、浓度为10～50mmol/L的H2O2溶液均匀混合得到混合溶液，然后将混合溶液pH值调至3～5得到酸性混合液；
②向所述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸中处理过的样品垫部分，滴加含待测抗原的标准品或实际样品溶液，静置15～20min；然后，向所述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸中处理过的硝酸纤维素膜部分滴加步骤①制得的酸性混合液，使检测线和质控线上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应；
③当检测线和质控线同时出现条带，则为阳性；当只有质控线出现条带，为阴性；当质控线无条带或只有检测线有条带，则检测结果无效。
优选地，显色有机底物包括四甲基联苯胺，重氮胺基苯，联氮二胺盐或3-胺基-9-乙基咔唑。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法。该制备方法中Fe3O4/Au复合纳米粒子通过在100℃以上的反应温度条件下发生还原反应，由Au纳米粒子和Fe3O4纳米粒子复合而成，该Fe3O4/Au复合纳米粒子相比于Fe3O4纳米粒子提供了更多的酶催化活性位点，并且两个材料之间特殊的电子结构和协同作用，进而通过将Fe3O4/Au复合纳米粒子制备成金磁纳米酶免疫探针，有效提高了酶催化显色反应速率。上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸条的制备方法具有工艺简单、成本低、易规模生产的特点。
进一步地，在试纸的制备过程中，膜材处理使用了含有亲水表面活性剂聚乙二醇和非表面活性剂吐温-20的缓冲液对硝酸纤维素膜进行表面处理，可有效消除免疫检测结果的假阳性。
本发明还公开了采用上述制备方法制得的一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸。该试纸通过借助金磁纳米酶免疫探针的酶催化活性，并通过结合显色反应，大幅提高检测灵敏度。本发明的优点在于检测装置中载体的选择，即通过Fe3O4/Au复合纳米粒子作为金磁纳米酶免疫探针，提供了更多的酶催化活性位点，并且由于Au纳米粒子和Fe3O4之间特殊的电子结构和协同作用有效提高了Fe3O4/Au复合纳米粒子的酶催化显色反应速率。因此，该基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸检测灵敏度高，与未显色检测结果相比，检测灵敏度可提高2～3个数量级，且检测体系特异性强，为生物医学领域更低检测限的标记物分析提供了一个很好的检测技术手段。
本发明还公开了上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于双抗夹心法检测的应用。通过借助催化活性较高的Fe3O4/Au复合纳米粒子构建金磁纳米酶免疫探针，当待测物浓度较低时检测线没有条带或条带显色度较低时，通过在处理过的硝酸纤维素膜处滴加含有显色有机底物和H2O2的酸性混合液，使显色有机底物与检测线和质控线上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应，使得条带颜色增强，能够避免由于待测物抗原浓度低导致的T线条带弱或没有导致的检测灵敏度低，与未显色检测结果相比，检测灵敏度可提高2～3个数量级。因此该检测方法简单，灵敏度高，在医学领域具有应用价值。
附图说明
图1为本发明基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的原理示意图；其中，(a)为侧向流免疫层析检测试纸组成示意图；(b)为检测结果分析示意图；(c)为基于金磁纳米酶免疫探针的信号放大示意图；
图2为本发明实施例1的检测结果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
发明公开了的一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
(1)Fe3O4/Au复合纳米粒子的制备
称取100～150mg粒径约为20～200nm的Fe3O4纳米粒子，加入0.1～0.5g柠檬酸钠和1～5mL浓度为24mmol/L的氯金酸溶液，用超纯水定容至100～200mL，在100～120℃下加热反应30～60min，即可得到Fe3O4/Au复合纳米粒子。
(2)金磁纳米酶免疫探针的制备
采用物理吸附法或化学法将Fe3O4/Au复合纳米粒子与靶标分子的第一个识别抗体结合制备金磁纳米酶免疫探针。
具体方法如下：化学法制备免疫探针步骤分四步，活化，偶联，封闭和保存。活化：称取1mg Fe3O4/Au复合纳米粒子用1mL活化缓冲液(4-吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH＝5.5，0.01M))洗涤数次，直到上清液是清亮干净。随后，称取质量比为(0.1～1.0)：(0.1～1.0)的碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰胺(NHS)，溶于上述Fe3O4/Au复合纳米粒子溶液，活化粒子表面的羧酸根；偶联：在上述活化的Fe3O4/Au纳米粒子溶液中加入靶标分子的第一个识别抗体进行偶联。封闭：封闭液(包含质量比1％～5％牛血清蛋白(BSA)的pH值为8.0～9.0，离子强度为0.005mol/L～0.02mol/L的硼酸钠(BS)缓冲液)进行封闭；保存：将免疫探针保存于包含质量比为1％～5％的BSA，体积比为0.05％～0.1％的吐温-20(Tween-20)，且pH值为8.0～9.0，离子强度为0.005mol/L～0.02mol/L的硼酸钠(BS)缓冲液。
物理吸附制备金磁纳米酶免疫探针无需活化，只需调节pH进行偶联，封闭和保存三个步骤。
(3)基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备(膜材处理和组装)
样品垫处理缓冲液：将质量比为2％～5％的NaCl，0.05％～2.0％的BSA，0.1％～1％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Mw＝20000～100000)和体积比为0.05％～0.1％的Tween-20溶于pH值为8.0～9.0，离子强度为0.005～0.02mol/L的BS缓冲液。
结合垫处理缓冲液：将质量比为1％～5％的BSA，0.05％～2％的聚乙二醇(PEG，Mw＝2000～20000)和体积比为1％～5％的Tween-20溶于pH值为8.0～9.0，离子强度为0.005～0.02mol/L的BS缓冲液。
硝酸纤维素膜(NC膜)处理缓冲液：将质量比为0.05％～2％的PEG(Mw＝2000～20000)，1％～5％的BSA和体积比为0.005％～0.05％的Tween-20溶于pH值为8.0～9.0，离子强度为0.005～0.02mol/L的BS缓冲液。
试纸膜材处理方法，将样品垫切割成1.4×30cm，结合垫切割成1.0×30cm的长条，随后，将其浸泡在相应的处理缓冲溶液中室温保存20～30h，取出后，在50～60℃的烘箱中干燥2～5h。NC膜(2.5×30cm)浸泡在NC处理缓冲液中，浸泡1～5h后取出冷冻干燥，干燥完成后将处理后的膜材避光保存。
免疫层析试纸的组装，将处理过的样品垫，结合垫，NC膜和吸水纸贴在聚氯乙烯(PVC)支撑板上。具体方法为首先将NC膜贴在PVC底板对应的位置上；其次将预处理的结合垫贴于PVC底板上，与NC膜左侧重合长度为2mm；然后将预处理的样品垫贴于PVC板上与结合垫重叠2mm；最后将吸水纸(1.7×30cm)贴于PVC底板最右侧，与NC膜右侧交叠2mm。
(4)使用XYZ三维划膜喷金仪将靶标分子的第二个识别位点以0.8～1.1μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜检测线(T线)，使用XYZ三维划膜喷金仪将多克隆抗体二抗以0.8～1.1μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜质控线(C线)上。其中C线与T线相距6～10mm即可。此外，需将金磁纳米酶免疫探针喷涂在结合垫位置。最后，把喷涂好的试纸板使用数控快速斩切机切割成试纸条，储存在室温干燥环境下保存备用。
发明还公开了的上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于双抗夹心法检测的应用，包括如下步骤
①将5～20μL、浓度为5～10mmol/L的显色有机底物(显色有机底物包括邻苯二胺(OPD)，四甲基联苯胺(TMB)，重氮胺基苯(DAB)，联氮二胺盐(ABTS)或3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)任意一种显色有机底物)和5～50μL、浓度为10～50mmol/L的H2O2混合均匀，并将pH值调节为3～5，得到酸性混合液；
②滴加购买的含待测物的标准品或实际样品溶液于样品垫，进行层析检测，待测物为可用双抗夹心法检测的蛋白质大分子，静置15～20min；然后，在上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的NC膜中滴加80-100μL的酸性混合液，与检测线(T线)，质控线(C线)上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应，使得条带颜色增强，检测灵敏度提高。
③检测结果分析
采用双抗夹心法进行免疫检测时，当C线和T线同时出现条带，则为阳性；当只有C线出现条带，为阴性；当C线无条带或只有T线有条带，则检测结果无效。
下面结合具体实施例对本发明进行阐述。
实施例1
hCG抗原的侧向流免疫层析检测
(1)Fe3O4/Au复合纳米粒子的制备
称取100mg粒径约为20nm的Fe3O4纳米粒子，加入0.1g柠檬酸钠和1mL浓度为24mmol/L的氯金酸溶液，用超纯水定容至100mL，在100℃下加热反应30min，即可得到Fe3O4/Au复合纳米粒子。
(2)金磁纳米酶免疫探针的制备
采用化学法将Fe3O4/Au复合纳米粒子与β-hCG结合制备金磁纳米酶免疫探针。具体方法如下。
活化：称取1mg Fe3O4/Au复合纳米粒子用1mL活化缓冲液(4-吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH＝5.5，0.01mol/L))洗涤数次，直到上清液是清亮干净。随后，继续将0.1g碳二亚胺(EDC)和0.1g N-羟基硫代琥珀酰胺(NHS)，溶于上述Fe3O4/Au复合纳米粒子溶液，活化Fe3O4/Au复合纳米粒子表面的羧酸根；偶联：在上述活化的Fe3O4/Au复合纳米粒子溶液中加入100μgβ-hCG抗体进行偶联；封闭：加入封闭液(1％BAS的BS缓冲液(0.005mol/L，pH 8.0))进行封闭，得到金磁纳米酶免疫探针；保存：将金磁纳米酶免疫探针保存于包含1％BSA和0.05％Tween-20的BS缓冲液(0.005mol/L，pH 8.0)。
(3)基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸条的制备
样品垫处理缓冲液：将质量比为2％的NaCl，0.05％的BSA，0.1％的PVP(Mw＝20000)和体积比为0.05％的Tween-20溶于pH值为8.0，离子强度为0.005mol/L的BS缓冲液。
结合垫处理缓冲液：将质量比为1％的BSA，0.05％的PEG(Mw＝2000)和体积比为1％的Tween-20溶于pH值为8.0，离子强度为0.005mol/L的BS缓冲液。
NC膜处理缓冲液：将质量比为0.05％的PEG(Mw＝2000)，1％的BSA和体积比为0.005％的Tween-20溶于pH值为8.0，离子强度为0.005mol/L的BS缓冲液。
试纸膜材处理方法，将样品垫切割成1.4×30cm，结合垫切割成1.0×30cm的长条，随后，将其浸泡在相应的处理缓冲溶液中室温保存20h，取出后，在50℃的烘箱中干燥2h。NC膜(2.5×30cm)浸泡在NC处理液中，浸泡1h后取出冷冻干燥，干燥完成后将处理后的膜材避光保存。
免疫层析试纸条的组装，将处理过的样品垫，结合垫，NC膜和吸水纸贴在PVC支撑板上。具体方法为首先将NC膜贴在PVC底板对应的位置上；其次将预处理的结合垫贴于PVC底板上，与NC膜左侧重合长度为2mm；然后将预处理的样品垫贴于PVP板上与结合垫重叠2mm；最后将吸水纸(1.7×30cm)贴于PVC底板最右侧，与NC膜右侧交叠2mm。
(4)使用XYZ三维划膜喷金仪将α-hCG以0.8μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜检测线(T线)，使用XYZ三维划膜喷金仪将羊抗鼠IgG以0.8μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜质控线(C线)上。其中C线与T线相距6mm即可。此外，需将金磁纳米酶免疫探针喷涂在结合垫位置。最后，把喷涂好的试纸板使用数控快速斩切机切割成3mm宽的试纸，储存在室温干燥环境下保存备用。
基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于hCG检测的应用，包括如下步骤：
①滴加含抗原hCG的待测溶液于上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的样品垫，静置15min。
②在步骤①中的样品垫继续滴加80μL的酸性混合液(由5μL浓度为5mmol/L的DAB和5μL浓度为10mmol/L的H2O2以及酸性缓冲液混合配制成pH值为3.0的酸性混合液)，与T线和C线上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应，使得条带颜色增强，检测灵敏度提高。
③检测结果分析
采用双抗夹心法进行免疫检测，滴加无hCG的空白样检测，只有C线出现条带，无假阳性；滴加含待测抗原hCG的溶液检测时，T线和C线同时出现条带。静置后，滴加显色底物DAB和H2O2的酸性混合液，T线条带颜色加深，检测灵敏度提高。
实施例2
抗原NT-proBNP(N端B型脑钠肽)的侧向流免疫层析检测
(1)Fe3O4/Au复合纳米粒子的制备
称取130mg粒径约为150nm的Fe3O4纳米粒子，加入0.3g柠檬酸和3mL浓度为24mmol/L的氯金酸溶液，用超纯水定容至150mL，在110℃下加热反应40min，即可得到Fe3O4/Au复合纳米粒子。
(2)金磁纳米酶免疫探针的制备
采用物理吸附将Fe3O4/Au复合纳米粒子与抗NT-proBNP单克隆抗体制备金磁纳米酶免疫探针。具体方法如下。
首先，用K2CO3溶液调节Fe3O4/Au复合纳米粒子溶液pH值为8.0；然后加入100μg抗NT-proBNP单克隆抗体进行偶联；偶联结束后，加入封闭液(3％BAS的BS缓冲液(0.01mol/L，pH 8.5))进行封闭；最后，将金磁纳米酶免疫探针保存于包含2％BSA和0.08％Tween-20的BS缓冲液(0.01mol/L，pH 8.5)。
(3)侧向流免疫层析检测试纸的膜材处理和组装
样品垫处理缓冲液：将质量比为3％的NaCl，1.0％的BSA，0.5％的PVP(Mw＝80000)和体积比为0.08％的Tween-20溶于pH值为8.5，离子强度为0.01mol/L的BS缓冲液。
结合垫处理缓冲液：将质量比为2％的BSA，1.0％的PEG(Mw＝7000)和体积比为3％的Tween-20溶于pH值为8.5，离子强度为0.01mol/L的BS缓冲液。
NC膜处理缓冲液：将质量比为0.05％的PEG(Mw＝2000)，3％的BSA和体积比为0.02％的Tween-20溶于pH值为8.5，离子强度为0.01mol/L的BS缓冲液。
试纸条膜材处理方法，将样品垫切割成1.4×30cm，结合垫切割成1.0×30cm的长条，随后，将其浸泡在相应的处理缓冲溶液中室温保存25h，取出后，在60℃的烘箱中干燥4h。NC膜(2.5×30cm)浸泡在NC处理液中，浸泡3h后取出冷冻干燥，干燥完成后将处理后的膜材避光保存。
免疫层析试纸条的组装，将处理过的样品垫，结合垫，NC膜和吸水纸贴在PVC支撑板上。具体方法为首先将NC膜贴在PVC底板对应的位置上；其次将预处理的结合垫贴于PVC底板上，与NC膜左侧重合长度为2mm；然后将预处理的样品垫贴于PVP板上与结合垫重叠2mm；最后将吸水纸(1.7×30cm)贴于PVC底板最右侧，与NC膜右侧交叠2mm。
(4)使用XYZ三维划膜喷金仪将抗NT-proBNP多克隆抗体以0.9μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜检测线(T线)，使用XYZ三维划膜喷金仪将羊抗鼠IgG以0.9μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜质控线(C线)上。其中C线与T线相距8mm即可。此外，需将金磁纳米酶免疫探针喷涂在结合垫位置。最后，把喷涂好的试纸板使用数控快速斩切机切割成3mm宽的试纸条，储存在室温干燥环境下保存备用。
基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于NT-proBNP检测的应用，包括如下步骤：
①滴加含抗原NT-proBNP的待测溶液于上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的样品垫，静置17min。
②在步骤①中的样品垫继续滴加90μL的酸性混合液(由10μL、浓度为7mmol/L的TMB和20μL、浓度为30mmol/L的H2O2以及酸性缓冲液混合配制成pH值为4.0的酸性混合液)，与T线和C线上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应，使得条带颜色增强，检测灵敏度提高。
③检测结果分析
采用双抗夹心法进行免疫检测，滴加无抗原NT-proBNP的空白样检测，只有C线出现条带，无假阳性；滴加含抗原NT-proBNP的待测溶液检测时，T线和C线同时出现条带。静置后，滴加显色底物TMB和H2O2的酸性混合液，T线条带颜色加深，检测灵敏度提高。
实施例3
抗原cTnI的侧向流免疫层析检测
(1)Fe3O4/Au复合纳米粒子的制备
称取150mg粒径约为200nm的Fe3O4纳米粒子，加入0.5g柠檬酸和5mL浓度为24mmol/L的氯金酸溶液，用超纯水定容至200mL，在120℃下加热反应60min，即可得到Fe3O4/Au复合纳米粒子。
(2)金磁纳米酶免疫探针的制备
采用化学法将Fe3O4/Au复合纳米粒子与抗cTnI单克隆抗体结合制备金磁纳米酶免疫探针。具体方法如下。
活化：称取1mg Fe3O4/Au复合纳米粒子用1mL活化缓冲液(4-吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH＝5.5，0.01mol/L))洗涤数次，直到上清液是清亮干净。随后，称取1.0mgEDC和1.0mgNHS，溶于上述Fe3O4/Au溶液，活化粒子表面的羧酸根；偶联：在上述活化的Fe3O4/Au纳米粒子溶液中加入100μg抗cTnI单克隆抗体进行偶联。封闭：加入封闭液(5％BAS的BS缓冲液(0.02mol/L，pH 9.0))进行封闭；保存：将金磁纳米酶免疫探针保存于包含5％BSA和0.1％Tween-20的BS缓冲液(0.02mol/L，pH 9.0)。
(3)侧向流免疫层析试纸的膜材处理和组装
样品垫处理缓冲液：将质量比为5％的NaCl，2.0％的BSA，1.0％的PVP(Mw＝100000)和体积比为0.1％的Tween-20溶于pH值为9.0，离子强度为0.02mol/L的BS缓冲液。
结合垫处理缓冲液：将质量比为5％的BSA，2.0％的PEG(Mw＝20000)和体积比为5％的Tween-20溶于pH值为9.0，离子强度为0.02mol/L的BS缓冲液。
NC膜处理缓冲液：将质量比为2％的PEG(Mw＝20000)，5％的BSA和体积比为0.05％的Tween-20溶于pH值为9.0，离子强度为0.02mol/L的BS缓冲液。
试纸条膜材处理方法，将样品垫切割成1.4×30cm，结合垫切割成1.0×30cm的长条，随后，将其浸泡在相应的处理缓冲溶液中室温保存30h，取出后，在60℃的烘箱中干燥5h。NC膜(2.5×30cm)浸泡在NC处理液中，浸泡5h后取出冷冻干燥，干燥完成后将处理后的膜材避光保存。
免疫层析试纸条的组装，将处理过的样品垫，结合垫，NC膜和吸水纸贴在PVC支撑板上。具体方法为首先将NC膜贴在PVC底板对应的位置上；其次将预处理的结合垫贴于PVC底板上，与NC膜左侧重合长度为2mm；然后将预处理的样品垫贴于PVP板上与结合垫重叠2mm；最后将吸水纸(1.7×30cm)贴于PVC底板最右侧，与NC膜右侧交叠2mm。
(4)使用XYZ三维划膜喷金仪将抗cTnI多克隆抗体以1.1μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜检测线(T线)，使用XYZ三维划膜喷金仪将羊抗鼠IgG以1.1μL/cm的划速均匀的喷涂在NC膜质控线(C线)上。其中C线与T线相距10mm即可。此外，需将金磁纳米酶免疫探针喷涂在结合垫位置。最后，把喷涂好的试纸板使用数控快速斩切机切割成3mm宽的试纸条，储存在室温干燥环境下保存备用。
基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于cTnI检测的应用，包括如下步骤：
①滴加含抗原cTnI的待测溶液于上述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的样品垫，静置20min。
②在步骤①中的样品垫继续滴加100μL的酸性混合液(由20μL、浓度为10mmol/L的3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)和50μL、浓度为50mmol/L的H2O2以及酸性缓冲液混合配制成pH值为5.0的酸性混合液)，与T线和C线上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应，使得条带颜色增强，检测灵敏度提高。
③检测结果分析
采用双抗夹心法进行免疫检测，滴加无抗原cTnI的空白样检测，只有C线出现条带，无假阳性；滴加含抗原cTnI的待测溶液检测时，T线和C线同时出现条带。静置后，滴加显色底物AEC和H2O2的酸性混合液，T线条带颜色加深，检测灵敏度提高。
下面结合附图，对本发明实施例进行阐述和说明。
参见图1，为本发明基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸条的原理示意图；其中，(a)为侧向流免疫层析检测试纸条组成示意图。试纸条由样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜(NC膜)，吸水纸和PVC底板组成；(b)为检测结果分析示意图。采用双抗夹心法进行免疫检测时，当C线和T线同时出现条带，则为阳性；当只有C线出现条带，为阴性；当C线无条带或只有T线有条带，则检测结果无效；(c)为基于金磁纳米酶免疫探针的信号放大示意图。以显色底物DAB为例，滴加待测物溶液检测后，在NC膜加入显色溶液DAB和H2O2的混合液与检测线(T线)，质控线(C线)上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应，使得条带颜色增强，检测灵敏度提高。
参见图2，为实施例1的侧向流免疫层析检测试纸的检测结果示意图，可以看出，采用催化显色后，检测限为0.05mIU/mL，与未显色的试纸条(5mIU/mL)相比，该检测方法其灵敏度可提高了两个数量级。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)Fe3O4/Au复合纳米粒子的制备
将粒径为20～200nm的Fe3O4纳米粒子、柠檬酸钠、氯金酸溶液加入水中混合均匀，然后在100～120℃下反应，得到Fe3O4/Au复合纳米粒子；
2)金磁纳米酶免疫探针的制备
采用物理吸附法或化学法将Fe3O4/Au复合纳米粒子与靶标分子的第一个识别抗体结合，得到金磁纳米酶免疫探针；
3)基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备
将靶标分子的第二个识别位点均匀喷涂在侧向流免疫层析检测试纸的硝酸纤维素膜的检测线上，将多克隆抗体二抗均匀喷涂在侧向流免疫层析检测试纸的硝酸纤维素膜的质控线上，将金磁纳米酶免疫探针喷涂在侧向流免疫层析检测试纸的结合垫上，得到基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸。
2.根据权利要求1所述的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤1)中，氯金酸溶液的浓度为24mmol/L；
Fe3O4纳米粒子、柠檬酸钠、氯金酸溶液和水的反应投料比为(100～150)mg：(0.1～0.5)g：(1～5)mL：(100～200)mL。
3.根据权利要求1所述的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，侧向流免疫层析检测试纸的制备过程具体包括：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜分别置于样品垫处理缓冲溶液、结合垫处理缓冲溶液和硝酸纤维素膜处理缓冲溶液中，浸泡后干燥，得到处理过的样品垫、处理过的结合垫和处理过的硝酸纤维素膜，然后将处理过的样品垫、处理过的结合垫、处理过的硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在支撑板上，并保证每两个部分之间有2mm宽的重叠部分，得到侧向流免疫层析检测试纸。
4.根据权利要求3所述的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，将质量比为2％的NaCl、0.05％的牛血清蛋白、0.1％的聚乙烯吡咯烷酮和体积比为0.05％的吐温-20溶于pH值为8.0～9.0、离子强度为0.005～20mol/L的硼酸钠缓冲液，制得样品垫处理缓冲溶液；
将质量比为1％的牛血清蛋白、0.05％的聚乙二醇和体积比为1％的吐温-20溶于pH值为8.0～9.0、离子强度为0.005～20mol/L的硼酸钠缓冲液，制得结合垫处理缓冲溶液；
将质量比为0.05％的聚乙二醇、1％的牛血清蛋白和体积比为0.005％的吐温-20溶于pH值为8.0～9.0、离子强度为0.005～20mol/L的硼酸钠缓冲液，制得硝酸纤维素膜处理缓冲溶液。
5.根据权利要求3所述的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，样品垫置于样品垫处理缓冲溶液中浸泡20～30h，在50～60℃的烘箱中干燥2～5h；
结合垫置于结合垫处理缓冲溶液中的浸泡20～30h，在50～60℃的烘箱中干燥2～5h；
硝酸纤维素膜置于硝酸纤维素膜处理缓冲溶液中浸泡1～5h后，取出冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤3)中，检测线和质控线相距6～10mm。
7.采用权利要求1～6任意一项所述的制备方法制得的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸。
8.采用权利要求7所述的基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸用于双抗夹心法检测的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下操作：
①将5～20μL、浓度为5～10mmol/L的显色有机底物和5～50μL、浓度为10～50mmol/L的H2O2溶液均匀混合得到混合溶液，然后将混合溶液pH值调至3～5得到酸性混合液；
②向所述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸中处理过的样品垫部分，滴加含待测抗原的标准品或实际样品溶液，静置15～20min；然后，向所述基于金磁纳米酶免疫探针的侧向流免疫层析检测试纸中处理过的硝酸纤维素膜部分滴加步骤①制得的酸性混合液，使检测线和质控线上发生免疫反应的金磁纳米酶免疫探针发生显色反应；
③当检测线和质控线同时出现条带，则为阳性；当只有质控线出现条带，为阴性；当质控线无条带或只有检测线有条带，则检测结果无效。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，显色有机底物包括四甲基联苯胺，重氮胺基苯，联氮二胺盐或3-胺基-9-乙基咔唑。
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