CN108459159A - 超分子自组装介导网状纳米金增强免疫层析试纸条灵敏度的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种放大胶体金免疫层析比色信号强度的方法，包括：用金刚烷胺标记的牛血清白蛋白封闭金标抗体，得到金标抗体I；用β‑环糊精合成胶体金纳米粒子，得到β‑环糊精包被的胶体金溶液；在使用金标抗体I执行双抗夹心胶体金免疫层析的体系内加入待测样品后，再加入所述β‑环糊精包被的胶体金溶液；再在体系内多次重复加入5,10,15,20‑四(4‑羧基苯基)卟啉与β‑环糊精包被的胶体金溶液的混合溶液。本发明的方法利用超分子自组装原理介导形成网状纳米金，实现了循环信号放大，从而大大提高检测线和质控线上金纳米粒子的显色强度，可实现对超低浓度目标检测物进行现场快速检测的目的。本发明还提供一种用于胶体金免疫层析法的高灵敏度试剂盒。

Description

超分子自组装介导网状纳米金增强免疫层析试纸条灵敏度的 新方法

技术领域

本发明涉及免疫层析分析技术领域，进一步涉及胶体金免疫层析法中比色信号强度的放大方法及试纸条的改进，具体涉及一种基于超分子自组装介导网状纳米金增强免疫层析分析灵敏度的新方法。

背景技术

胶体金免疫层析试纸条因其简单、快速、方便以及裸眼检测已被广泛应用于临床诊断、食品安全检测以及环境监控等领域。传统胶体金免疫层析试纸条主要采用粒径为20～40nm胶体金作为信号探针，然而由于其较小的粒径导致其比色信号强度相对偏弱，进而导致其检测灵敏度偏低。相对较低的检测灵敏度在一定程度上局限了其在超灵敏检测中的应用。近些年，随着纳米科学和技术的快速发展，各种各样的新型纳米材料如荧光微球、量子点、量子点微球、上转换荧光纳米粒子、碳纳米材料以及磁性材料已经被报道可用于替代胶体金作为检测探针提高传统免疫层析试纸条的检测灵敏度，但这些纳米探针的合成相对复杂，价格昂贵很难被市场推广使用。相对于这些新型纳米材料，胶体金因其合成简单、易修饰、生物相容性好、光学性质稳定以及易读取等优势一直以来在免疫层析试纸条占据主要的位置，特别是在商业化生产中，其市场占有率达90％以上。因此，如何提高传统胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度对于进一步拓展其在超灵敏检测中的应用具有重要意义。

现今，提高传统胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度的方法主要包括以下几类：1)读条仪的开发：通过优化胶体金免疫层析试纸条读取仪信号采集、信号增强、以及数据处理等方面来提高其检测灵敏度，如专利CN103018439A；2)金或银染增强技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，当还原剂存在的情况下，金或银离子容易以胶体金为核心，聚集在胶体金表面还原成金或银原子，使纳米级大小的胶体金通过金或银离子的聚集和还原生长为更大的颗粒，从而使胶体金的比色信号得到放大，如专利CN102135536A；3)酶增强技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过引入辣根过氧化物酶或具有过氧化物酶活性的纳米酶催化氧化相应的底物如四甲基联苯胺(TMB)等生成有色的沉淀物沉积于检测线，从而使胶体金的比色信号得到放大；4)双金信号放大：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过引入信号扩增金标垫，其可以借助抗原抗体反应和生物素-链霉亲和素系统等特异性地在检测线结合金标抗体偶联物，导致胶体金纳米粒子的进一步聚集，从而放大胶体金的比色信号，如专利CN102507929A；5)杂化金纳米复合物：将胶体金纳米粒子通过物理或化学方法结合到更大载体如磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子等颗粒的表面，从而增加检测线结合的胶体金数量，进而放大其检测信号。虽然这些方法在一定程度上提高了传统胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度，但其提高检测灵敏度的能力是有限的，仅为1～2个数量级。因此，增强后的胶体金免疫层析试纸条依然无法满足超灵敏检的要求。

发明内容

本发明旨在针对现有胶体金免疫层析试纸条因其20～40nm胶体金探针信号强度偏弱导致检测灵敏度偏低的现状缺陷，使用超分子自组装介导网状纳米金形成，促使胶体金纳米粒子在试纸条检测线不断积累，提供一种增强免疫层析分析灵敏度的新方法，实现对超低浓度目标检测物进行现场快速检测的目的。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

首先，本发明提供一种放大胶体金免疫层析比色信号强度的方法，包括：

1)用金刚烷胺(ADA)标记的牛血清白蛋白(BSA)封闭金标抗体，得到金标抗体I；用β-环糊精(β-CD)合成胶体金纳米粒子，得到β-CD包被的胶体金溶液；

2)在使用步骤1)所得金标抗体I执行双抗夹心胶体金免疫层析的体系内加入待测样品后，再加入步骤1)得到的β-CD包被的胶体金溶液，实现一次信号放大；

3)在步骤2)完成一次信号放大的体系内多次重复加入5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)与步骤1)所述β-CD包被的胶体金溶液的混合溶液，实现循环信号放大。

本发明还提供一种用于胶体金免疫层析法的高灵敏度试剂盒，它包括胶体金免疫层析试纸条和比色信号放大试剂；所述的胶体金免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜和吸水纸，所述的结合垫上设有用ADA标记的BSA封闭的金标抗体，所述的硝酸纤维素(NC)膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；所述的比色信号放大试剂包括TCPP溶液和β-CD包被的胶体金溶液。

本发明中，所述的用ADA标记的BSA封闭的金标抗体优选通过以下方法制备：

I)柠檬酸包被胶体金溶液在7.0～8.0pH值下与鼠抗目标分析物检测抗体溶液于室温下振荡反应28～32min，得到混合溶液；

II)将ADA标记的BSA溶液加入步骤I)所得混合溶液中继续于室温下振荡反应28～32min；

III)将步骤II)所得溶液在3～5℃条件下于8000～10000rpm离心18～22min，得到沉淀物，所述沉淀物复溶于0.01M pH7.4的PBS中，得到用ADA标记的BSA封闭的金标抗体。

进一步优选的方案中，所述的ADA标记的BSA通过以下方案制备：

配制浓度为0.8～1.2mg/mL的金刚烷胺溶液，向溶液中分别加入N-羟基丁二酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐溶液，使N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐的重量比在1:1.5～2.5，于室温避光反应60min完成活化；将活化后的溶液与含BSA浓度为3.0mg/mL的碳酸氢钠溶液混合，于室温避光反应12h；反应完毕后透析去除游离的金刚烷胺，即得到ADA标记的BSA。

本发明中，所述的β-CD包被的胶体金溶液优选通过以下方法制备：

i)于剧烈搅拌下，依次将5mL 0.1M磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0)、1mL 0.01M氯金酸溶液(HAuCl₄)和10mL 0.01Mβ-CD溶液加入至35mL超纯水中；于90～110℃反应55～60min；

ii)待步骤i)反应后溶液冷却后于8000～10000rpm离心8～10min，得到所述的β-CD包被的胶体金溶液。

本发明所述的用于胶体金免疫层析法的试剂盒中，所述的试纸条按样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜和吸水纸的顺序依次固定于PVC塑料底板上，相邻间重叠长度为2mm，试纸条宽度为4mm。

本发明提出的放大胶体金免疫层析比色信号强度的方法是一种基于超分子自组装介导网状纳米金增强免疫层析灵敏度的方法，其中，ADA和TCPP与β-CD组成了超分子自组装体系，并涉及三者之间的主客体识别。本发明方法中，通过使用ADA标记的BSA封闭金标抗体，可以借助传统的双抗夹心免疫层析试纸条将ADA分别结合到NC膜上的检测线和质控线，随后在步骤2)加入β-CD包被的胶体金溶液，由于ADA和β-CD超分子识别将β-CD包被的胶体金纳米粒子结合到检测线和质控线实现一次信号放大；接着在步骤3)通过加入TCPP与β-CD包被的胶体金的混合溶液实现β-CD包被的胶体金在检测线和质控线的进一步聚集，从而实现二次信号放大；这样重复加入TCPP与β-CD包被的胶体金的混合溶液，反复利用超分子自组装原理介导形成网状纳米金，就能够实现循环信号放大，该过程大体可参见图1B所示。由于检测线上胶体金纳米粒子的数目不断积累，其检测信号逐渐增强，从而大大提高检测线和质控线的金纳米粒子的显色强度。特别是对于低浓度的目标分析物，其检测T线的信号随着步骤3)中加入所述混合溶液的循环次数的增加逐渐增大，条带的颜色呈现从无到有再到更强的变化过程，进而实现超低目标物浓度下的定性(裸眼)和定量检测，增强了传统胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度。

本发明所述的胶体金免疫层析法的试剂盒可适用于各种疾病相关标志物的超灵敏检测，所述的疾病相关标志物包括：

肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)；

炎症标志物，如C反应蛋白(CRP)；

心肌标志物，如肌钙蛋白、肌红蛋白、血浆B型脑利钠肽(BNP)；

传染病标志物，如HIV P24抗原、乙肝表面抗原(HBsAg)；

病原体，如病毒、致病菌等。

本发明所述的试剂盒特别适用于目标分析物的痕量检测。样品处理按照常规处理方法即可。

本发明优选的所述超灵敏检测方案具体包括以下步骤：

a)取70～100μL待测样品溶液加入到试纸条样品孔中，于室温反应10～15min后，读取计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 0)；

b)向试纸条样品孔中加入80～100μLβ-CD包被的胶体金溶液，于室温反应10～15min后读取计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 1)；

c)向试纸条样品孔中加入80～100μL TCPP与β-CD包被的胶体金的混合溶液，于室温平衡反应10～15min后读取计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 2)；

d)最后循环重复步骤c)，并计录每次反应后的T和C线的光密度值(随后的步骤依次设定为Cycle 3、Cycle 4、Cycle 5……)。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明是在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，采用超分子自组装介导网状纳米金形成既增强了胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度，也保留了其特异性强的特点。

2、本发明所采用的超分子自组装体系涉及ADA和TCPP与β-CD之间的主客体识别。通过使用ADA标记的BSA封闭金标抗体，借助传统的双抗夹心免疫层析试纸条将ADA分别结合到NC膜上的检测线和质控线，随后加入β-CD包被的胶体金溶液，由于ADA和β-CD超分子识别将β-CD包被的胶体金纳米粒子结合到检测线和质控线实现一次信号放大。接着通过加入TCPP与β-CD包被的胶体金的混合溶液实现β-CD包被的胶体金在检测线和质控线的进一步聚集，从而实现二次信号放大。这样重复加入TCPP与β-CD包被的胶体金的混合溶液就能够实现循环信号放大，从而大大提高检测线和质控线的金纳米粒子的显色强度，进而提高传统免疫层析试纸条的检测灵敏度。在超分子自组装介导网状纳米金放大体系中所涉及的ADA、TCPP和β-CD均以实现商业化大规模生产，因此本方法试剂成本低、稳定性高以及重现性好，具有较好的商业化前景。

3、本发明所使用超分子自组装介导网状纳米金信号放大技术可适用于所有胶体金免疫层析试纸条。

4、本发明所构建的免疫层析试纸条特别适合于痕量目标分析物的超灵敏检测，在临床和突发事件的现场检测中具有广泛的应用前景，如传染病的早期筛查等。

总之，本发明创新地在传统胶体金免疫层析试纸条基础上引入了超分子自组装介导网状纳米金放大检测线上结合的胶体金纳米粒子的比色信号强度，在降低检测灵敏度的同时保留了其良好的特异性；与此同时，本发明使用的超分子自组装体系涉及ADA和TCPP与β-CD之间的主客体识别，三者大规模的商业化生产，降低了检测的成本，保证了试剂稳定性和重现性，从而为本方法更广泛的应用提供了前提，为其商业化奠定了基础。

附图说明

图1中(A)是本发明胶体金免疫层析试纸条结构及试剂分布示意图，图1中(B)是本发明所述放大胶体金免疫层析比色信号强度方法的原理示意图。

图2是本发明实施例1中对PBS溶液中癌胚抗原的检测其浓度与试纸条检测线(T线)上光密度值以及循环次数间相关性曲线。

图3是本发明实施例1中对血清中癌胚抗原的检测其浓度与试纸条检测线(T线)上光密度值以及循环次数间相关性曲线。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

在以下试验中，磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH 7.4)的配置方法如下：NaCl 40g，Na₂HPO₄ 13.5g，KH₂PO₄ 1.0g，KCl 1.0g溶于1L超纯水中。用0.1M NaOH调pH值至8.0～9.0。

试验中所涉及的癌胚抗原(CEA)、鼠抗癌胚抗原检测抗体和捕获抗体均由北京热景生物技术股份有限公司提供。所述的驴抗鼠二抗为驴抗鼠多克隆抗体，购买于无锡中德伯尔生物技术有限公司。所述ADA、BSA、TCPP及β-CD均可自市面购得。

试验中使用的胶体金试纸条读取仪为HG-8胶体金试纸条读取仪由无锡中德伯尔有限公司提供。

实施例1

一种用于胶体金免疫层析法的试剂盒，它包括胶体金免疫层析试纸条和比色信号放大试剂；如图1中A所示，所述的胶体金免疫层析试纸条包括样本垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜和吸水纸，所述的结合垫上设有用ADA标记的BSA封闭的金标抗体，所述的硝酸纤维素(NC)膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；所述的比色信号放大试剂包括TCPP溶液和β-CD包被的胶体金溶液。

所述的试剂盒按以下方法制备得到：

一、胶体金免疫层析试纸条的制备

1、金标检测抗体的制备

1.1、金刚烷胺标记的牛血清白蛋白(ADA@BSA)的制备：

金刚烷胺和牛血清白蛋白的偶联采用活泼酯法，具体如下：配制浓度为1.0mg/mL金刚烷胺溶液，向溶液中分别加入10μL浓度为2.0mg/mL N-羟基丁二酰亚胺溶液和浓度为4.0mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐溶液，于室温避光反应60min；将上述活化后的溶液与含牛血清白蛋白浓度为3.0mg/mL的碳酸氢钠溶液混合，于室温避光反应12h；然后将上述混合溶液透析去除游离的金刚烷胺，即得到ADA@BSA。

1.2、取1mL粒径为34nm柠檬酸包被胶体金溶液，用浓度0.2M的碳酸钾溶液调节该溶液的pH值至7.0；向溶液加入5μL浓度为1mg/mL鼠抗癌胚抗原检测抗体溶液，室温下振荡反应30min；然后再向其中加入100μL 1mg/mL按步骤1.1制备的ADA@BSA溶液继续于室温下振荡反应30min；再在4℃条件下，于10000rpm离心20min，弃上清，沉淀物复溶于0.01MpH7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)，得金标抗体I。

2、胶体金免疫层析试纸条的制备：

2a)金标抗体结合垫的制备是将步骤1制备的金标抗体I喷涂于玻璃纤维膜上；

2b)具有检测线和质控线的硝酸纤维膜的制备是将浓度为1mg/mL鼠抗癌胚抗原捕获抗体溶液和浓度为1mg/mL驴抗鼠二抗溶液分别喷涂NC膜上绘制两条线平行线，鼠抗目标分析物捕获抗体溶液划线作为检测线(T线)，驴抗鼠抗体溶液划线为质控线(C线)；

2c)胶体金免疫层析试纸条组装：将样品垫、2a)制备的具有金标抗体I的结合垫、2b)制备的具有检测线和质控线的NC膜、以及吸水纸分别依次粘贴到塑料衬板上，相邻重叠部分的长度为2mm，按照常规方法制备成检测用试剂盒，于4-25℃密封干燥保存。

二、比色信号放大试剂的制备

3、β-环糊精(β-CD)包被的胶体金溶液的制备：

于剧烈搅拌下，依次将5mL 0.1M磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0)、1mL 0.01M氯金酸溶液(HAuCl₄)和10mL 0.01Mβ-CD溶液加入至35mL超纯水中；混合溶液于100℃反应60min，待溶液冷却后于8000rpm离心8min，得到所述终产物β-CD包被的胶体金溶液。透射电镜分析显示其粒径约为20nm。

实施例2

应用实施例1所述的试剂盒执行本发明方法，用于对癌胚抗原(CEA)的检测。

PBS溶液中癌胚抗原(CEA)的检测实验

参照图1中B所示流程，取75μL含不同浓度癌胚抗原PBS溶液加入到试纸条样品孔中，于室温反应10-15min后，于试纸条读取仪中扫描计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 0)；接着向样品孔中加入100μLβ-CD包被的胶体金溶液，于室温反应10-15min后于试纸条读取仪中扫描计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 1)；随后向样品孔中加入100μL TCPP和β-CD包被的胶体金混合溶液，于室温平衡反应10-15min后于试纸条读取仪中扫描计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 2)；最后循环重复步骤3)，并计录每次反应后的T和C线的光密度值(随后的步骤依次设定为Cycle 3、Cycle 4、Cycle 5……)。

以癌胚抗原(CEA)的浓度为横坐标，T线上光密度值为纵坐标，绘制相应的浓度关系曲线，具体实验结果见附图2。如图2所示，随着循环次数的增加，试纸条检测线和质控线的光密度值逐渐增加，其检测限下降，结果显示6次循环放大后的检测限达10^-16g/mL，较传统未放大的胶体金免疫层析试纸条降低了6～7数量级。

以上方法不局限于PBS中癌胚抗原(CEA)的检测，还适用于临床血清样本中癌胚抗原(CEA)的检测。

血清样本中癌胚抗原(CEA)的检测

参照图1中B所示流程，取75μL含不同浓度癌胚抗原加标血清样品加入到试纸条样品孔中，于室温反应10～15min后，于试纸条读取仪中扫描计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 0)；接着向样品孔中加入100μLβ-CD包被的胶体金溶液，于室温反应10～15min后于试纸条读取仪中扫描计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 1)；随后向样品孔中加入100μL TCPP和β-CD包被的胶体金混合溶液，于室温平衡反应10～15min后于试纸条读取仪中扫描计录T和C线的光密度值(此步骤设定为Cycle 2)；最后循环重复步骤3)，并计录每次反应后的T和C线的光密度值(随后的步骤依次设定为Cycle 3、Cycle 4、Cycle5……)。以癌胚抗原(CEA)的浓度为横坐标，T线上光密度值为纵坐标，绘制相应的浓度关系曲线，具体实验结果见附图3。如图3所示，随着循环次数的增加，试纸条检测线和质控线的光密度值逐渐增加，其检测限下降，结果显示6次循环放大后的检测限达0.5×10^-15g/mL，较传统未放大的胶体金免疫层析试纸条降低了6～7数量级。

结论：经实施例2所述的检测试验发现，本发明中所提到的新方法对PBS和临床血清样本中癌胚抗原均具有超高检测灵敏度，灵敏度达10^-16g/mL，较传统胶体金免疫层析试纸条提高了6～7数量级，表明本发明方法适合用于临床血清样本中CEA的超灵敏检测，进一步证明本发明所提供的基于超分子自组装介导网状纳米金增强免疫层析试纸条检测灵敏度的新方法是可行的。

尽管本发明以癌胚抗原作为模式分析物在传统双抗夹心免疫层析平台上探讨超分子自组装介导网状纳米金增强免疫层析试纸条检测灵敏度的可行性，但是本发明所限定的内容并不局限于癌胚抗原，其他所有使用本发明方法检测其他的目标分析物如生物大分子、小分子、核酸以及病原体等均在本专利的保护范围之内。此外，除了使用传统抗原抗体反应，本发明还可以采用近些年出现的新型生物识别反应如核酸杂交、核酸适配体结合、配体和受体结合等构建相应超灵敏的分析方法用于目标分析物的检测。因此，基于这些识别分子对本发明的拓展和延伸也在本发明所保护的范围之内。

Claims (9)

1.一种放大胶体金免疫层析比色信号强度的方法，包括：

1)用金刚烷胺(ADA)标记的牛血清白蛋白(BSA)封闭金标抗体，得到金标抗体I；用β-环糊精(β-CD)合成胶体金纳米粒子，得到β-CD包被的胶体金溶液；

2)在使用步骤1)所得金标抗体I执行双抗夹心胶体金免疫层析的体系内加入待测样品后，再加入步骤1)得到的β-CD包被的胶体金溶液，实现一次信号放大；

3)在步骤2)完成一次信号放大的体系内多次重复加入5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)与步骤1)所述β-CD包被的胶体金溶液的混合溶液，实现循环信号放大。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的用ADA标记的BSA封闭金标抗体通过以下方法完成：

I)柠檬酸包被胶体金溶液在7.0～8.0pH值下与鼠抗目标分析物检测抗体溶液于室温下振荡反应28～32min，得到混合溶液；

II)将ADA标记的BSA溶液加入步骤I)所得混合溶液中继续于室温下振荡反应28～32min；

III)将步骤II)所得溶液在3～5℃条件下于8000～10000rpm离心18～22min，得到沉淀物，所述沉淀物复溶于0.01M pH7.4的PBS中，得到用ADA标记的BSA封闭的金标抗体。

3.权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于：所述的ADA标记的BSA通过以下方法制备：

配制浓度为0.8～1.2mg/mL的金刚烷胺溶液，向溶液中分别加入N-羟基丁二酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐溶液，使N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐的重量比在1:1.5～2.5，于室温避光反应60min完成活化；将活化后的溶液与含BSA浓度为3.0mg/mL的碳酸氢钠溶液混合，于室温避光反应12h；反应完毕后透析去除游离的金刚烷胺，即得到ADA标记的BSA。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的β-CD包被的胶体金溶液通过以下方法制备：

i)于剧烈搅拌下，依次将5mL 0.1M磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0)、1mL 0.01M氯金酸溶液(HAuCl₄)和10mL 0.01Mβ-CD溶液加入至35mL超纯水中；于90～110℃反应55～60min；

ii)待步骤i)反应后溶液冷却后于8000～10000rpm离心8～10min，得到所述的β-CD包被的胶体金溶液。

5.一种用于胶体金免疫层析法的试剂盒，其特征在于：它包括胶体金免疫层析试纸条和比色信号放大试剂；所述的胶体金免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜和吸水纸，所述的结合垫上设有用ADA标记的BSA封闭的金标抗体，所述的硝酸纤维素(NC)膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；所述的比色信号放大试剂包括TCPP溶液和β-CD包被的胶体金溶液。

6.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的用ADA标记的BSA封闭的金标抗体通过以下方法制备：

I)柠檬酸包被胶体金溶液在7.0～8.0pH值下与鼠抗目标分析物检测抗体溶液于室温下振荡反应28～32min，得到混合溶液；

II)将ADA标记的BSA溶液加入步骤I)所得混合溶液中继续于室温下振荡反应28～32min；

III)将步骤II)所得溶液在3～5℃条件下于8000～10000rpm离心18～22min，得到沉淀物，所述沉淀物复溶于0.01M pH7.4的PBS中，得到用ADA标记的BSA封闭的金标抗体。

7.权利要求5或6任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的ADA标记的BSA通过以下方法制备：

配制浓度为0.8～1.2mg/mL的金刚烷胺溶液，向溶液中分别加入N-羟基丁二酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐溶液，使N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐的重量比在1:1.5～2.5，于室温避光反应60min完成活化；将活化后的溶液与含BSA浓度为3.0mg/mL的碳酸氢钠溶液混合，于室温避光反应12h；反应完毕后透析去除游离的金刚烷胺，即得到ADA标记的BSA。

8.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的β-CD包被的胶体金溶液通过以下方法制备：

i)于剧烈搅拌下，依次将5mL 0.1M磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.0)、1mL 0.01M氯金酸溶液(HAuCl₄)和10mL 0.01Mβ-CD溶液加入至35mL超纯水中；于90～110℃反应55～60min；

ii)待步骤i)反应后溶液冷却后于8000～10000rpm离心8～10min，得到所述的β-CD包被的胶体金溶液。

9.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的试纸条按样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜和吸水纸的顺序依次固定于PVC塑料底板上，相邻间重叠长度为2mm，试纸条宽度为4mm。