JPS60500548A - 発色性支持体免疫測定法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発　明　の　名　称 発色性支持体免疫測定法 発明の詳細な説明 技術分野 本発明は可溶性の有機抗原寂よぴ不完全抗原、細胞、微生物、およびそれらの生 産物の検出および測定のための免疫測定法に関し、さらに特異的には、標識成分 または活性の支持体上またけそれとともにある標識付免疫複合体の標識成分の生 産物の相互作用によシ発せられる信号が支持体との間の化学的、物理的また（１ イオン的相互作用の故に支持体上にａ縮されている免疫測定法に関する。

背景技術 臨床検査室の化学的診断テストは、保健医療実施の重要な構成部分である。近年 において体液中の薬剤、ホルモン、ビタミン、代謝産物等を包含する可溶性の抗 原性または不完全抗原性の化合物の測定のために抗原抗体反応の特異性の有利さ を利用する多くの免疫測定技法が記述されている。

免疫測定法において検知可能な信号を発せしめるために、放射性同位元素、酵素 、螢光体、酵素阻害剤、化学発光または生物発光性の物質等を包括する多種類の 標識成分がへ、特許文献および特許以外の文献に記述されている。例えばＨ，ｖ ａｎ　Ｖａｎａｋｉｓ　＊　Ｊ、Ｌａｎｇｏｎｅ１両氏編−１’−Ｍ８ｔｈＯ’ ｄＳｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙＪ第７０巻（１９８０年、ニューヨーク市、ア カデミツクブレス社刊行）および該書中の文献ならびにｖａｎＶｕｎａｋｌ、Ｓ 　＋　Ｊ、　Ｌａ、ｎｇＯｎｅ両氏編１−Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙＪ第７３％（１９ｆｌＮ年、ニューヨーク市アカデミツクプレス社刊行 ）および該書中の文献全参照されたい。

数種類の免疫測定法は、標識成分の遊離形と結合形とを区別するために、分離の ステップ全必要とする。そのような測定法は不均一型と称せられ、放射免疫測定 法（Ｒ工Ａ　）および酵素連結免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような有名な技 法を包含する。遠心分離、濾過およびクロマトグラフィーのような各種の分離法 が該技術に知られている。

他の免疫測定法は分離のステップを要せず、均一型と称せられる。均一型測定法 は実施が迅速でまた簡単であるが、しばしば不均一型測定法よりも感度が低゛く また妨害を受けやすい。

通常の免疫測定法は、均一型でも不均一型でも、標識成分の反応生成物はテスト 媒液中へ自由に拡散できる。

生成物はテスト、容量中に均等に分布せしめられるので、これにより分光測光法 による検知が可能になる。しかしながら反応生成物が希釈されるために感度が限 定され、また直接的な可視化全困難ならしめる。

多層性のテスト装置が記述されている。例えば米国特許ｉ４，２５８，００１号 （Ｐｉｅｒｃｅ氏らに対し１９８１年６月２４日付与）、および米国特許２３， ７２３，０６４号（Ｌｉｏｔｔａ氏に対し１９７３年６月２７日付与）を参照さ れたい。このような装置の構成は複合的であり、試薬による多重のコーティング 寸たは含浸および異なる材料の薄片化全必要とする。界面の不規則性はテスト装 置内における不均等な液体の移動を起させ得る。逆方向への液１移動は下方の層 の生成物全最上方の層へ移動せしめ、結果的に化学的妨害と反応に対する応答の 低下−奮起す。さらに壕だ多くめ臨床的試料中に含まれる大分子および、Ｉａ　 ＆ｌの砂層は、多層性テスト装置の設計および開発に特別な困難全発生せしめる 。それはこれらの特質が装置をつ寸らせ、液体の流れを妨げるからである。最も 重要な束縛の一つは、分析が標識の遊離の両分に限定されることである。結合さ れた両分を直接に測定するためには、さらに洗浄と溶離のステップを要し、通常 それらはあ１シに面倒で時間を費やすので、このタイプのテスト装置においては 実施されない。

免疫測定法が可溶性の抗原および不完全抗原に対して広く用いられているのに対 して、伝染病に関する伝統的な診断法では感染体をカラス器内または実、験動物 中で培養することが行われてきた。しかしこのアプローチは数種類の難点に悩ま される。第一に、医学的に重要な数種類のウィルスは、通常利用可能な組織培養 寸たは動物系内において培養できない。これらにはロタウィルス、Ａ型およびＢ 型肝炎ウィルス、およびエプスタイン・バーウィルスが含ブれる。第二に、多く の感染体は同定が完了するまでに長期間の培養を必要とする。いくつかの場合に は、この期間が長すぎるので、結果は臨床医に役立たない。第三に、試料が以前 にすでに抗生物質による治療を受けたことのある個体から得られた場合には、伝 統的な培養法は不適なこともある。

感染体を臨床的試料中から直接て検出し得る測定法に対する需要市場が広がりつ つある。このような測定法は・抗原抗体反応または微生物の酵素活性の測定を基 礎となし得る。抗原または酵素の検出を基礎とする測定法は、必ずしも生きてい るあるいは感染性の生物１　＄＋；定するわけで４ないことに留意すべきである 。このような測定法が実際的に有用であるためには、測定法の実施回転が速く、 関心対象の生物または生物群に対して特異的であシ、比較的少数の生物に対して 感受性があシ、また体液中で遭遇する各種成分よりの妨害と比較的無縁であるこ とが必須である。　− 微生物およびつ１ルスの抗原に対する測定法が多数記述されている。総説として は、Ｒ、Ｈ，Ｙｏｌｋｅｎ氏、「ＲｅＶ。

工ｎｆｅｃｔ、Ｄｊ、ｓ、Ｊｊｆｆｊ４巻第６５頁（１９８２年）を参照された い。これらの測定法は伝統的な培養法より優れてはいるが、多くはなお比較的長 時間（１〜６時間）を要し、また労働集約的（多ぐの試薬添加と洗浄のステップ が必要）′７′ある。発生された信号は溶液中で測定されるので、不十分な感度 もまたしばしば難点となる。

米国特許第３．８５６．６２８号（１９７４年１２月２４日５ｂａｒｒａ氏らに 対して付与）は、複数の別々のテストゾーンがあり、各ゾーンはそれぞれ基質お よび指示剤を有する吸着材の平らなシートラ用いる微生物同定の方法を開示して いる。関心対象徴生物の生成物と基質と指示剤との間の反応は発酵反応である。

吸着材のシートは基質および指示剤のいずれに対しても特別な親和性を示さず、 両者がともに周囲の媒液中へ拡散することを許す。

米国特許第４，６２乙０７３号（１９８２年４月２７日Ｈｕａｎｇ氏に対して付 与）はそれぞれの物質がそれぞれの認識化合物と少なくとも１回の反応をする複 数種類の物質について体ｉｔ定量的に分析する方法を開示している。この発明に おいて機能する反応性化合物（抗体あるいは非抗体を結合する蛋白質）全不動化 するために用いられる基質担体は、反応性の化合物の共有結合のための官能基ま たは機能のある反応物のイオン結合のためのイオン交換部位を有し得る。基質担 体はまた、反応性化合物がファンデルワールス力によシ相引される吸着材であっ てもよい。酵素が追跡子として用いられ、担体をその酵素のための呈色物質中に 浸して測定される。そしてその結果生成するのは、有色固形物の沈殿である。

米国特許！４，０１１，３０．８号Ｃ１９７７年６月８日Ｇｉａｅｖｅｒ氏に対 して付与）は、基質上における検出されるべき粒子とその標識付抗体との間の免 疫反応を利用して細菌、ウィルスおよびその他の細胞を検出するための方法を開 示している。標識は通常放射性同位元素であシ、基質は金属丑たは金属化された ガラススラ゛イドである。記述された基質は不活性で標識の発展には関与しない 。

米国特許第４．３２２，４９５号（１９８［Ｊ年６月６０日に、ａ　ｔ　０氏に 対して付与）は、関心対象徴生物をその上に固定化した非多孔性のセラミックま たは重合物の支持体を利用して行う抗微生物抗体の免疫測定法全開示している。

支持体は生物に対する抗体を含有すると疑われる試料とともに保温され、非結合 状態にある成分を除くために浸漬洗浄され、酵素で標識を付された抗抗体ととも に保温された。さらに１回洗浄の後に、酵素標識と反応する能力を有する指示剤 が呈色のために施用される。有色の生成物が支持体と物理約１たは化学的に相互 作用することはない。

米国特許第６，１８４０７５号（１９８０年２月５日Ｎｏ１ｌｅｒ氏に対して伺 与）は、試料からウィルスを捕捉す゛るために抗体で被覆された不活性な固体の 支持体を利用するＢ型肝炎ウィルスに苅する免疫測定法を開示している。洗浄の 後結合したつ１ルスは第２の酵素標識付抗体および標識酵素の基質と反応せしめ られる。有色の反応生成物はナイロン製の支持体上に沈殿し、測定のために食塩 水とアセトンとの混合物によシ溶離される。

西独特許出願用２，９２３，７３５号（１９７９年１２月１６日公告）は、精製 された標識を付された抗原を用いてＭ肥土の抗原レセプターを測定するための方 法を開示している。細胞はｐ適法によシ集められ、結合せしめられた標識をイ」 けられた抗原の量は、例えばガンマ線計数により測定される。フィルター上にお ける標識の保持は、１ｆｔＢ胞との結合に基づいており全面的に分子のサイズ対 孔隙のサイズの関数である。

カナダ特許第１，１０４，９２７号（１９８１年７月１４日Ｃｏ１ｅ氏らに対し て付与）は、成分の一つが微小孔隙性の膜上に固定化されている免疫化学反応の 一成分を検出するための方法を開示している。それを免疫化学反応の第２の成分 を含有する試料と反応せしめ、ついで第２の成分に対する酵素標識性の免疫化学 反応剤と反応せしめる。膜の表面における色変化の量は、酵素標識と発色剤との 反応の後に測定される。発色剤は酵素標識の作用を受けたときに膜上に沈殿する ことがちシ、また膜と選択的に結合することもある。発色剤の支持体上での沈殿 または選択的結合は大抵偶発的である。

米国特許第４，２００，６９０号（１９８０年４月２９日Ｒｏｏｔ氏らに対して 付与）は、支持体上に形成される色にょシテストの結果が測定される腸内寄生生 物のための免疫測定法を開示している。用いられる発色物質は、反応溶媒に難溶 である力・または有色状態でフィルターの基礎物質中に選択的に捕捉される。発 色剤の支持体上における沈殿または支持体への選択的結合は、ここでもまた多く の場合偶発的である。

米国特許第４，３４０，６７０号（１９８２年７月２０日！１（ｅｎｎｅｎ氏に 対して付与）は、テトラメチル発色剤浴液が、患者の試料中に存在する生物によ ジ生成される酵素と反応して、試料採取に使われたものと同じ吸収片上に赤紫色 を呈するネイセリア・ゴルア（淋菌）検出のための吸収片キノ）ｋ開示している 。これは免疫化学的ではなく・微生物酵素に基づく測定法である。

Ｒ：、Ｔ、Ｄｏｙｌｅ氏（ｄ　Ｅ、Ｙ、ラボラトリーズ社の「Ｂｉｏｔｅｃｈ誌 」８２−１夏季号中の「診断微生物学におけるレクチン」と題する論文において 、細胞の炭水化物と選択的に相互作用をするレクチンの利用を総説している。レ クチンは、炭水化物結合部位に加えて疎水性の結合部位を有し、各種の微生物を それらの異なる表面成分を通じて特異的かつ選択的に結合するために利用され得 る。

米国特許第４，２９９，９１６号（１９８１年１１月１０日Ｌｉ’ｅｍａｎ氏ら に対して付与〕は、免疫学的対合の一方のノンバーおよび信号発生系（ただし後 者は免疫学的対合の一方のノンパーと結合した触媒および触媒による触媒反応を 行うことができる溶質よシなるもの）が共役結合された表面全利用する免疫測定 法全開示している。信号発生化合物の不溶化の結果として、測定可能な信号は表 面上に発生される。感染早期の生物学的試料中の少数の生物に対して迅速で高感 度で、また潜在的に定量的であるような抗原特にウィルスおよび細菌起原の抗原 に対する免疫測定法がめられている。

発　明　の　開　示 生物試料中の可溶性有機抗原ならびに不完全抗原、細胞、微生物ならびにそれら の生成物のような分析対象物全検出または測定するための、本発明による発色性 支持体免疫測定法は、分析対象物が最終的１（酵素標識付抗体と接触せしめられ 、酵素とその基質との反応によシ発生せしめられた信号が活性支持体上にｉ縮さ れる系を利用し、下記の各操作段階よりなる。すなわち（Ａｌ　少なくとも１種 類の抗体と免疫化学的に結合している分析対象物よりなる酵素成分を有する免疫 複合体を活性支持体上に収集するかまたは形成せしめ、ＦＢ＋　支持体上の免疫 複合体の酵素のような標識成分を信号発生試薬と接触させて生成物を形成せしめ 、ただしその生成物が発色物質である場合は、測定媒液に可溶であること全前提 とし、 （ＣＪ　その生成物を支持体と相互作用せしめその相互作用の結果検知可能な信 号が支持体上で濃縮される。

標識付免疫複合体は溶液中またけ活性の同形支持体上のいずれにも形成され得る 。分析対象物を酵素標識付抗体または最初に抗体とともに予め保温しつぎに酵素 標識付抗体を加えることによシ溶液中で形成された場合には、しかる後に支持体 上に収集される。支持体上における複合体の直接的形成には、分析対象物の免疫 化学的または非免疫化学的捕捉（そのつぎに酵素標識付抗体と反応せしめる）あ るいは支持体に結合された抗体またはレクチンによる酵素標識付抗体の捕捉、ま たは特異的結合反応による媒介以外の方式により支持体に結合された分析対象物 による抗体酵素複合体の免疫化学的捕捉が関与し得（１０） る。この後者の場合においては、分析対象物は支持体に共有結合的あるいは非共 有結合的のいずれによっても結合され得る。

呈色信号すなわち信号放射生成物の電磁的反射は、標識（酵素）により触媒され る基質の分解生成物により直接に放射され得る。この場合には信号放射生成物は 発色原子団であり、測定媒液１／Ｃ可俗であシ、活性支持体と相互作用してその 結果支持体上に濃縮される。別途には、信号は標識（酵素）により触媒される反 応の生成物と支持体自身との相互作用の結果として発生し得る。この場合眞は、 信号放射生成物は、もし支持体から独立して存在するならば、それは測定媒液に 可溶であろう。

発　明　の　記　述 本発明の発色性支持体免疫測定法は、□可溶性有機質抗原ならびに不完全抗原、 細胞、微生物およびそれらの生成物のような谷８ｉ各様の分析対象物の検出ふ・ よび測定に応用可能である。可溶性有機質抗原ｒｒｉならびに不完全抗原、抗原 性合成はプチド、薬剤、ホルモン、ビタミン、食品添加物および農薬を包括する 。微生物は細菌、マイコプラスマ、リケッチア、クラミジアおよびウィルスを包 括する。生成物は、酵素、毒素、コリシンまたは細胞表面抗原のような合成物で も、またウィルス外被蛋白質の抗原性の断片のような分解産物でもよい。興味を ひく細菌としては、ぶどう状球菌、連鎖状球菌、イイセリアおよび腸内細菌科の 細菌類がある。興味をひくウィルス（１１） トシてはヘルはス・シンプレックス・ウィルス、サイトノカロウイルス、ミクノ ウイルス、アテノウイルスおよび肝炎ウィルスがある。分析対象物が抗原または 細胞あるいは微生物によシ生成された酵呆である場合には、それは生存または死 滅細胞あるいは生物の表面に見いだされるか、細胞あるいは生物の抽出物中に見 いだされるか、また（ｆ：ｉ細胞砕屑として見いだされるかである。患者の試料 中における分析対象物の存在は、従って必すしも感染性との関連はない。

本発明による測定は、標識成分により造出される呈色信号を濃縮する機能全充足 するように設計された活性支持体をオリ用する。これに加えて支持体は丑だ信号 発生試薬ならびに分析対象物を免疫学的対合ｆ７Ｃは非免疫化学的に捕捉１〜得 る試薬の担体としても役立ち得る。

「活性支持体」とは、本発明の免疫測定法の反応成分ならびに酵素標識と信号発 生試薬との間の反応の生成物（Ｃ結合するかまたはそれらと会合する能力を有す る支持体のことである。

信号は、もしそれが溶液中に均一に分布してｔ／−４るならば測定媒液中に高度 に希釈されるために・・ツクグランド゛から判別することは本質的に不可能であ ろうが、支持体による信号の濃縮はその可視化を可能にする。定性的テスト結果 の視覚的直接読み取りが従って可能になる。結果は寸た例えば濃度計測により定 量的に読み取られ、あるいは色強度の異なる標準体の系列との視覚的比較によ（ １２） り半定量的に読み取られる。

支持体上に濃縮された色強度に加えて、色の局在もまた情報をもたらす。例えば 関心対象の分析対象物を含有すると疑われる患者の試料が支持体に塗布され、そ こへ抗体・酵素複合体が加えられた場合には、支持体上での信号の局在は分析対 象物の局在に対応する。この現象は、云統的な培養法により決定される生存菌ま たは感染性菌の数を試料中に含有される抗原性物質の存在と関係づける目的のた めにオリ用され得る。

支持体は各種各様の多孔性材料より構成され得る。適当な支持体のなかにはナイ ロンのようなポリアミド、殿粉粒、綿やＰ紙のような材料を殿粉でコーティング したもの、硝化セルロース・エチルセルロース、ナ）　ｌ）ラム殿粉クリコレー ト、ポリビニルアセテートおよび部分的に加水分解されたポリヒニルアセ７−１ ・ならびにポリ（アクリルアミドラ／殿粉を基にした粒子、その他の合成または 天然の重合物、変性されたポリアミドおよびｓ、ｓ’＝；チオビス（２−＝トロ 安息香酸）（ＤＴＮＢ）で修飾された支持体が包括される。ナイロンメツシュ円 板は、さらにそれ以上に可能性のある反応のための官能基例えば−１９Ｈ２およ び−ＣＯＯＨｉ生せしめるために、例えばＨＣｌで加水分解され得る。ナイロン はさらにコルドパ・ケミカル社製の三官能性のアジリンン化合物であるＸＡＭＡ 、−７あるいはヘキサンンアミンのような交差結合性試薬で処理され得る。ＤＴ ＮＢは・例えばイオン交喚試桑を介して支持体に付着せしめられる。

支持体はまた免疫測定を実施するために顆粒の多孔性を要しない場合にはセラミ ックビーズ、浸漬片、試験管および顆粒状材料のような非多孔性材料からも構成 され得る。

支持体また抗原およびそれらに対する杭木を結合するかあるいは会合する能力の ある他の物質を含有し得る。

蛋白質を共有結合的または非共有結合的に付着せしめ得るラテックス重合物で上 記の材料をコーティングすることに時によシ有利である。さらに１だ上記の多孔 性材料と抗原あるいはそれに対する抗体を結合しまたは会合する能力を有する他 の担体とを混合することにより活性支持体を調製することが可能である。これら の担体はカラスビーズ、ゲル濾過ビーズ例工ばセファデックス、セファロース、 バイオ−ゲル、バイオ−ビーズ２よびゾルパックス■（Ｅ、１．テユボン　ド・ ネモアーズ社の包装材料の商標名）を包括する。

支持体自身は、その上で測定を行うのに適当ないかなる物理的形状をもなし得る 。形状は測定の条件によって定められ、ｐ紙のような円板状、吸収片または浸漬 片のように長形、柱状、矩形等であシ得る。一般的に反応性成分の捕捉ならびに 洗浄のカイネティックスおよび効率が最大になるので、多孔性または微多孔性の 支持体が好適である。

大炎孔性の支持体が適する場合もあるが、微多孔性（１４） （孔隙の平均直径１μｍ以下）の支持体のほうが一般的に好適で、それは反応の ために利用される表面積が増加するからである。孔隙のサイズはまた、測定の間 に形成される各種の免疫複合体の次元により左右される。一般的用途のためには 、支持体の孔隙のサイズは１０ｎｍ以下、支持体内における粒子の間隙空間また は支持体の孔隙サイズは１０μｍ以上であることが好適である。小さい孔隙サイ ズの選択は生物学的試料中に存在するウィルス性抗原のいかなる粒子間の力・ら まりをも除去するであろう（大多数のウィルスのサイズは約１８〜２５　Ｄ　ｎ ｍである）。

大きい孔隙サイズの選択は細菌（一般の桿状生物の平均サイズは０５μｍＸ２１ １ｍ）Ｋ対してさえも粒子によるサイズ関連の分画化に導くことはないであろう 。一般的必要条件として、支持体材料の多孔性は抗体・酵素複合体（平均分子量 １０４〜１０６クルトン）の分画化を避けるような程度でなくてはならない。支 持体の特性はまた、分析対象物全生物学的試別中から効率よく捕捉する必要性に よっても決定される。

本発明による測定は、円板形の多孔性支持体上において、活性支持体を詰めたカ ラム中において、または適当な支持体材料で作られた吸収片上において実施され 得る。

上記のそれぞれは、単一の分析対象物の存在のテストのためにも、また複数の分 野に分割されそれぞれが別の分析対象物の存在のテストのためにも適用され得る 。測定が吸収片」二で行われる場合には、その測定が行われる吸（１５） 収片と患者試料の採取に用いられる吸収片とは同一のものであり得る。測定が円 板上またはカラム中で行われる場合には、患者試料は通常側の容器中に収集され 、測定のために一定単位量が取り出される。別法としてカラムが注射器形を外す 場合には、試料は面接に注射器中へ導入される。

本発明による測定は１、殿粉でコーティングされたガラス繊維フィルターのよう なフィルター上においても実施され得る。この場合には、患者試料は予め抗体を 伺着せしめであるフィルター上へ直接に塗布され得る。

支持体への非特異的結合は、支持体をその非特異的結合部位を飽和せしめる蛋白 質（例えばアルブミン〕希薄溶液で予め処理するか、または各種の試薬液および 洗浄液中に低濃度の非イオン性界面活性剤を添加するこδ・により減少せしめる 刀・または除去することができる。

標識（酵素）成分とその基質との反応により生成される生成物と支持体との相互 作用は、迅速かつ選択的に起らねばならない。支持体上における呈色信号の濃縮 は、物理的力または化学的結合を通じて起り得る。結合はイオン結合または共有 結合であり得る。

水素結合、ファンデルワールス力および疎水性相互作用のような物理的力は、酵 素標識と信号発生試薬との間の反応生成物が、各種の支持体材料に付着するのに 関与する。支持体のイオン的特性に、反応生成物のイオン的特性全補完するよう に構成され得る。例えば陽イオン性（１６〕 の支持体は陰イオン性生成物を付着せしめるために用いられ得る。その逆も１だ 真である。酸性の重合物の例は、ポリスチレンスルホン酸、カルホキ／メチルセ ルロースおよびアクリル酸、ツタクリル酸ならびにマレイン酸の共重合物である 。塩基性重合物の例は、ボｖＯプチド、アミノ官能性モノマーの共重合物ならび にジエチルアミンエチルセルローステアル。

支持体への反応生成物の共有結合的付着は、異なる方法により達成され得る。こ のアプローチの有オＵ点は色の永久化の促進で、それは生成物が支持体の不可分 な一部分となる力）らである。

支持体は、反応生成物の共有結合的付着のための官能基を含有するように調製さ れ得る。これらの基は、写真術において知られている結合発色剤である。その例 はアゾメチン、アゾ色素、ａイコ色累１インタソリン色累、インドアニリン色素 およびビラザロン色累である。

結合発色剤を有する支持体を調製するためには、これ水性および７寸たはイオン 性の基を付加して分子量を増加せしめることにより非拡散性にされ得る。この結 果重合物性の支持体に面接に組みこまれ得る界面活性剤類似の構造が生ずる。結 合発色剤もそれを共有結合的に支持体に結合せしめることによシ、支持体上に固 定化され得る。

若干の場合には、試料中から分析対象物を選択的に捕捉するために、支持体を抗 分析対象物抗体またはレクチンでコーティングすることが望丑しい。一般的に抗 体またはレクチンを抗体上の官能基を介して直接的にか・または蛋白質、ポリア ミノ酸、寸たは合成の連結基のようなス投−サー・アームを介して間接的に支持 体に共有結合的に付着せしめることが好適である。共有結合的付着は安定性の見 地から好適と思われるが、抗体またはレクチンの吸収は、場合によシタ１］定の 間十分な安定性をもたらし得る。付着せしめる方法は、結合活性全可能な限フ最 高度に保持するように選ばれるべきである。抗分析対象物抗体がこのような仕方 で利用される場合には、酵素標識付抗体複合体において用いられる抗体は支持体 をコーティングするために使われるものと同一であってもよく、また分析対象物 上の別の抗原性決定因子に向けられた抗体てあってもよい。

分析対象物を免疫化学的に捕捉するための共通の実施法すなわちその操作段階で 支持体上にすでに分析対象物に対する抗体が存在することを必要とする方法とは 対照的に、本発明による測定は、分析対象物の非免疫化学的捕捉を利用する。こ の捕捉は前記の物理的力によシ起るかまたは例えば支持体上のレクチンにより媒 介されて起り得る。

分析対象物を含有する試料と酵素標識付抗体または第一に抗原抗体複合物または 抗体、そのつぎに酵素標識付抗体とが予め保温されるような、標識付免疫複合物 が測（１８〕 定媒液中に形成される他の若干の場合には、支持体は形成された免疫複合物を保 持するが余剰の試薬が通過し去るのを許すような孔隙サイズのもあでなくてはな らない。

市販のｐ紙および孔隙性膜のなかから各種の適蟲な孔隙サイズを便利に選択する ことが可能である。一種の特に適轟な孔隙性膜は０．４５μｍの公称孔隙サイズ を有する。

分析対象物全結合する蛋白質は通常の場合抗体であるが、しかしそれは蛋白質Ａ 、レクチン、細胞レセプターおよび血清輸送蛋白質のような非抗体蛋白質であっ てもよい。

レクチンが異なる細胞炭水化物に対して示す特異性のゆえに、異なるレクチンが 生物学的試料中に見いたされる多種多様な微生物全本発明による免疫測定法に用 いられる活性支持体に選択的（（結合せしめるために利用される。利用可能な多 くのレクチンのうち若干のものを、それらが捕捉し得る微生物と七もに下記の表 に示す。

（１９） レクチンにより捕捉される微生物 ＰＮＡ　なし　ネイセリア　なし　なし　ギアルティ　なしア （梅毒菌→ ター ター ＷＦＡ　なし　連鎖状球菌　なし　なし　なし　なしＬＣＨなし　ンウドモナス 　なし　なし　なし　なしく１）　レクチンの略記法 ＨＰＡ　Ｌｒｉカタツムリのアグルチニン、　ＰＮＡはビーナソ（２０） （７）　７　クルチニン、ＷＧＡＵ小麦胚芽のアグルチニン、ＳＢＡは大豆のア グルチニン、ＲＣＡＵヒマ種子のアグルチニン、ＤＢＡ［ホースゲレーンのアグ ルチニン、　ＷＦＡは藤のアグルチニン、ＵＥＡＵウレソクスーエウロはアのア グルテニン、ＬＣＨ［レンス゛豆 ＋２１　Ｗ（）Ａは淋菌全選択的に捕捉するが髄膜炎菌を結合しない。

上記により評価され得る通シに、レクチンは少なくとも２通りの異なる機能を発 揮する。一方の作用方式においては、レクチンはそれが特異性を有する生物学的 試料からすべての微生物を捕捉し得る。このような状況においては、抗分析対象 物抗体・酵素複合物は探索対象徴生物の同定にはたらく。他方において、レクチ ン自体が関心対象徴生物の選択的捕捉のために役立つ（上記の表の脚注２を参照 ）。活性支持体上にそうして固定化された微生物は本発明の免疫測定法により検 出される。

他の若干の場合には、各種の細菌を捕捉し得るフィブロネクチンと同様に、各種 の分析対象物を非免疫化学的に捕捉するためにポリアクリルアミドが利用され得 る。

さらに他の若干の場合には、支持体全各種の異なる浦乳動物から採取した赤血球 または赤血球ゴースト膜でコーティングすることが望ましい。これらの赤血球ま たは赤庇球膜は、異なるクループのウィルス上の表面突出物として見いだされる 糖蛋白質ヘムアグルチニン決定因子に選択的に結合する。下記の表には赤血球と それらが結合するウィルスを掲げる。

オルトミクノウイルス　はしかウィルス　−−一十一抗体は動物免疫化および細 胞融合（・・イブリドーマ）法を包括する当業者によく知られた方法によＱ生産 され得る。それは全血清、腹水讐たは組識培養液として使用され得るが、一般的 には精製または部分的に精製した調製物を用いるのが好適である。免疫グロブリ ン分画は硫酸アンモニウム沈殿により調製され得る。Ｉｇ（）分画はイオン交換 クロマトグラフィーまたはゲル濾過により得られる。抗体は、抗原でコーティン グした支持体からの溶離により親和性精製され得る。

若干の場合には全抗体のかわｊ）　Ｋ　Ｆａｂ　、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ま たは牛分子のような抗体の断片を用いるのが好適である。可能性のある利点は、 断片の結合価またはＦｃ部分の欠如に関連し得る。

（２２） 標識付抗体複合物の標識は、放射性同位元素、螢光性原子団、酵素阻害剤、化学 発光または生体発光性物質のような、鴫業界によく知られている各種の物質から 選択され得る。多くの場合、標識は酵素である。酵素は、その安定性、代謝回転 数、精製の容易さ、測定の容易さ、ならびに生物学的試料中にしばしば見いださ れる妨害物質に妨げられないことを目途として選定される。分析対象物が酵素で ある場合には、それは標識としてもまた特異的結合対の構成員としても作用する 。

酵素標識を抗体に共役的に結合せしめることは、既知の方法により、抗体の免疫 反応性の滅失および標識の活性の滅失全ともに最少限にとどめるように実施され る。

付着はスは−ザーアームを介して＠接的ても間接的でもよい。通常は、いかなる 未反応標識、未標識抗体および非免疫反応性の標識付抗体をも除去するために複 合物を測定に使用する前に広範囲に精製することが必要である。

これはゲル濾過ど親和性クロマトグラフィーの両操作段階全組合わせて達成され る。複合物は、酵素標識付の抗分析対象物抗体であっても、抗分析対象物抗体に 対する抗体が酵素標識されたものでもよい。

一般的に抗体光りに可及的多数の酵素分子を有することが望１しく、酵素／′抗 体の比が１対１以下であってはならない。酵素標識分子の数は、抗体の免疫反応 活性と標識の酵素反応活性を共に維持するという至上的必要性により限定される 。若干の場合には、抗体と標識とを互（２３） いに結合させるよりも両者を共通の担体に結合せしめるのが有利であり得る。例 えば１種の抗体と数種の標識とが高分子量の蛋白質またはテキストランのような 多糖質に共役的に結合せしめられ得る。

免疫複合体の酵素成分と信号発生試薬との反応による生成物は可溶性で、支持体 と選択的に相互作用しまたそれに結合する。この支持体上への信号の濃縮は、支 持体材料と生成物とを注意深く適合関係にした結果であり、本発明による測定法 を感染症を起す病原体の迅速な決定のためにすぐれて有用ならしめる。信号発生 試薬は、免疫複合体の酵素標識成分との相互作用に際して検知可能な信号を発生 するために必要な、本発明による免疫測定法の成分である。これらの試薬は、酵 素標識の基質、または共役酵素反応におけるように最終的には酵素標識の基質全 生成する能力を有、する材料の組合わせである。

若干の場合には、生成物自身が有色物質であり、例えばｐ−ニトロフェニル燐Ｍ 　オ、！：　ヒｏ−二トロフェニルガラクトースのような発色物質は、多くの普 通の酵素に対して知られている。発色物質／基質の対も知られている。

例えば西洋わさびパーオキ７グーゼに対するパーオキシドとＯ−フェニレンジア ミンとの対がそれである。別法として、生成物（は難可視的または本質的に前色 であっても支持体との相互作用によ夕易可視的捷たは有色化するものであればよ い。例えば支持体は殿粉でコーティングした材料でそれが酵素により触媒される 反応の生成物である沃素と（２４） 複合体音生じて支持体上に特徴的な青色を生ずることがある。他の態様において は、支持体の多孔性構造が溶液のｐＨと異なるｐＨ微環境を作シ出し、反応生成 物は支持体の倣環境においては灰色するが溶液中では発色しない。

例えばｐ−二トロフェニル燐ばの酸性ホスファターゼによる加水分解において、 測定媒液のｐＨは酸性であったにもかかわらず、支持体は黄色を呈した。また支 持体が、生成物のうちイオン化していない照色の状態と平衡状態にあるイオン化 して有色の状態と結合し、平衡を移動させる働きをすることも可能である。

本発明による測定は、第一に分析対象物を含有している疑いのある患者の試料を 抗分析対象物と酵素との複合体と混合することにより実施される、患者の試料に は、全血、血清、血漿、尿、脳を髄液、咽喉からの採取物、病変部からの流出液 、糞の水中分散物２よび排泄物、掻取り物および洗浄物を包括し得る。試料およ び抗体酵素複合物は通常、１分〜１時間、最も多くは５〜１５分間、温度範囲４ 〜４５℃、最も多くは２６〜３７℃に加温される。制約された短時間内に十分な 抗原抗体反応を確実にやらせるために、分析対象物に対し抗体・酵素複合物を１ モル過剰に用いる。有利なことに大過剰量ですら、可溶性の複合物の生成を起す ことなしに利用される。反応の定量化学的関係は経験的に決定される。

予備加温の後に、生成された抗原抗体複合物は、例えばデンプンでコーティング した微多孔性フィルターのような適当な支持体上に（ｆ−Ａにより収集される。

複合物は多孔性支持体上提たはその内部に保留されるのに対して、試料中に存在 する他の物質ならびに抗原・抗体結合しなかった複合物はともに洗去される。洗 浄は、ｐＨ４〜１０に緩衝された水性溶液を用いて行われ得る。緩衝液は非イオ ン性界面活性剤のような界面活性剤、アルブミンのような蛋白質、ならびに電解 質を含有してもよい。洗浄は、支持体を通して緩衝液を流すことにより達成され るか、または若干の場合には支持体を反復して新しい緩衝液に浸漬することで十 分である。しかし前者の方法は通常迅速で効率がよく、好適である。

洗浄の後に支持体は信号発生試薬と接媒せしめられる。

酵素標識が例えば西洋わさびパーオキ７ダーセ（ＨＲＰ　）である場合には、信 号発生試薬は適当に緩衝された媒液中のグルコースオキ７ターゼ、グルコースお よび沃化ナトリウムよりなる。信号発生試薬は支持体を通して流されてもよく、 丑た支持体が溶液中に浸漬されてもよい。グルコースに対するグルコースオキ７ ターゼの作用によシ発生するＨ２Ｏ２はＨＲＰの基質として働き、ヒドロパーオ キシド接合物ｔｇ生せしめる。このものは、ついで沃素イオンを沃素に酸化し、 沃素はデンプン中のアミロースと複合物全形成して深青色を呈する。この色は支 持体上に濃縮され、その強度が試料中の分析対象物の濃度に正比例する。形成さ れる色が安定で、テスト結果の永久的記録とｊ−で保存され得るものが好゛適で ある。

（２６） 細注においては、患者の試料が最初に支持体に塗布され、その次に抗体・酵素複 合物が加えられる。試料は支持体上に濾過、点上または塗布によシ沈着せしめら れる。

遊離の複合物は支持体を通過するが、分析対象物に結合した複合物は支持体上に 保留され、その次の信号発生試薬との反応に利用可能である。

他の態様においては、支持体は抗分析対象物物質によりコーティングされ得る。

試料のみ過の結果分析対象物の特異的捕捉が起る。洗浄の後、抗分析対象物抗体 と酵素との複合物のモル比過剰分は、支持体を通過してＰし去られる。結合され る複合物の舒は、第１のステップにおいて結合された分析対象物の量の関数であ り、信号発生試薬の象加によシ定童化される。

本発明による測定Ｕｔた支持体と、非免疫化学的に捕捉される分析対象物抗分析 対象物抗体複合物とを接触せしめることによシ実施され得る。この場合における 酸素複合物は、同−丑たは異なる抗分析対象物抗体、あるいは最初の抗分析ズ・ Ｊ象物抗体に対する抗体を含有してもよい。支持体はつぎにｐＨ４〜ＩＯＫ緩衝 された水浴液で洗浄され得る。緩衝液は１だ非イオン性界面活性剤のような界面 活性剤、アルブミンのような蛋白質および電解質全含有１〜得る。洗浄は緩衝液 を支持体全通して流すことにより達成されるか、または若干の場合では支持体を 新しい緩衝液に反復浸漬することによシ洗浄すれば十分である。前者の方法は迅 速で効率がよく、好適である。

実施例１　ｈ−ＩｇＧの測定 この例は、支持体上の酵素標識付複合物と信号発生試薬との反応により生成され た支持体上における色の濃縮を詳述する。

ポリアミドのメノンー円板（Ｈｘｏ、ｏｏ２インチ）は、最初にＣｅ、Ｃ１２１ ０φ（容量中重量）を含む含水メタノールで処理され、しかる後６，６５モル濃 度のＨＣＮで４５℃において３０分間処理された。この処理は重合物の骨格を加 水分解し、フィルム表面に蛋白質の付着のだめの官能基（ｃｏｏＨ，ＮＨ２）を 提供する。ついてフィルム表面は、３官能性アジリジン交差結合試薬ＸＡＭＡ− ７（コルドパ・ケミカル社製）の新しく調製された５係水溶液を用いて２５分間 室温において活性化された。余剰のＸＡＭＡ−７試薬は精製水を用いる反復洗浄 により除去された。

蛋白質の付着は、つきに活性化さえしたナイロン円板を２ｍ？／−のヒトエｇＧ 　（ｈ−ＩｇＣ）、　マイルスラホラト’）　７’社製）を含む０８５係の食塩 水中において平衡化せしめることにより達成でれた。〔家兎ＩｇＧ　（ｒ−Ｉ（ ７Ｇ）が対照として用いられた。〕しかる後フィルムはｐＨ７，５の冷い食用・ 燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ　）で余剰の蛋白質がなくなるまで洗浄され４℃において ＰＢＳ緩衝液中で使用直前捷で貯蔵された。

測定は、テスト用フィルムを抗り一工ｇＧ−ＨＲＰ（西洋わさひパーオキソダー ゼ）酵素複合物（０１”？　／　ｍｌ、ポリサイエンセス社より入手可能）と１ 係のＢＳＡ　（牛血清アルブミン）を含むｐＨ７，８の０１１モル濃ＰＢＳｉｌ Ｅｉ中において平衡化させ（２時間）、冷ＰＢＳ緩衝液で３回連続的に洗浄して 余剰の複合物を除去し、しかる後信号発生試薬（２ｄ／円板）に加えることによ り実施された。信号発生試薬は、ｐＨ５，０緩衝液５０ｍ１中に０−フェニレン ジアミン塩酸塩ろ５　ｒｑと尿素パーオキシド２５９とを溶・解することにより 、使用直前に調製された。ｈ−工ｇＧを付着せし７められたテスト用フィルムは 数分以内に呈色反応を４示したのに対し、　ｂ−工ｇＧを（したがってＨＲＰ複 合物をも）有しないテスト用フィルムは呈色反応を示さなかった。

支持体上の色は、その後の反復洗浄により示された通り永久的に安定で、テスト 用溶液には認め得る色はなかった。

実施例２　ＰＡＰの測定 この例は、分析対象物が酵素であり、従って標識として働き得るので、本発明に よる免疫複合体が単に分析対象物／酵素に結合された抗体であるという特別な事 例である。

直径約１錆の円板多数をナイロン織物（ＣＭＮ−５単フイラメントナイロンメッ シュ、メツ／ユの目は５μｍ１　フロリダ州マイアミ市のスモール・パーツ社よ り入手可能）からパンチで切り抜いた。円板の半数は、水中１モル濃１ｉノ１． ６−ヘキサンジアミンに１時間室温において浸漬処理された。残りは処理されな かった。全部Ｖ′ｉｐＨ７，０の０．１モル濃度トリス緩衝液に４回浸漬するこ とにより洗浄された。円板は使用するまでｐＨ７，０の０１１モル濃トリス中に 貯蔵された。

処理済および無処理の円板は、−抗ゾロスタテン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）モ ノクローナル抗体（ＩｇＧ　、１Ｔｄ！／円板）ｏｌｏ　ｓ　ｍｑ　／　ｍｌを 含有する０、１モル濃度のｐＨ７，０のトリス液中に１時間室温において浸漬さ れた。ＩｇＧ分画はマウス腹腔液の５０係硫酸アンモニウム沈殿物から、既知方 法によりｐＨ８，口の００２モル濃度燐酸塩緩衝液中でＤＦＡＥ−セルロース上 のイオン交換クロマ（・ダラフイーにより得られた。対照の円板は抗体を加えず に緩衝液のみに浸漬した。浸漬の後、円板はｐＨ７，０の０゜１モル濃度トリス に２回およＱ；ｐＨ８，０の０１１モル濃硼酸塩緩衝液に２回沈漬することによ り洗浄された。（それ以前の実験は、無処理の円板さえもその上に抗体を物理的 に吸着せしめＰＡＰ　（ヒト、蛋白質１ｍｇ当り活性７０単位、カル・４イオケ ム社より入手）は、５μｙ　／　ｒｎｌの濃度となるようにｐＨ８，０の０１１ モル濃硼酸塩緩衝液中に溶解された。上記のように調製された円板は、このＰＡ Ｐ溶液（１ｆｎｌ／円板）に１５分間室温において浸漬された。それらはしかる 後非イオノ性界面活性剤ツイン８００１％を含有するｐｉ（８，０の０１１モル 濃硼酸塩緩衝液に２回沈漬することにより洗浄された。対照の円板ＶｉＰＡＰ浸 漬を省略することにより調製された。

円板は、ｐ−ニトロフェニル燐酸二ナトリウム塩の４（ろ０） ｍｆＩ／　ｍｌ　ｍ液口２５ｍ１および００９モル濃度クエン酸と０．０１１モ ル濃塩化ナトリウムとのｐＨ４，８の緩衝液Ｃ１，２５ｙｄ中に置かれた。室温 において′１５分後にツイン８００．１％を含むｐＨｌ３．０の０１１モル濃硼 酸塩緩衝液中に２回沈漬することによって洗浄された。

ＰＡＰの存在または不存在に関するこの定性的測定において、−・キサンジアミ ン処理されて抗体および酵素の両方にさらされた円板は黄色であり、信号すなわ ちｐ−二トロフェニル燐酸のＰＡＰにより触媒される加水分解の生成物（：↓支 持体上に濃縮されていたことを示した。無処理の円板上には色の濃縮はなかった 。抗体をも寸だ酵素（この実施例の分析対象物）をも欠如する対照の円板は無色 であった。

実施例ろ　連鎖状球菌Ａ＋７）測定 Ａ、抗連鎖状球菌抗体の親Ｊｌｌ性精製連鎖状球菌Ａクル−ゾ抗血清は、家兎に おいてＣｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄ工５ｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌにより確立された 術式に従って調製された。第６回の採血からの抗血清はプールされ、精製の段階 で用いられた。こうして得られた抗血清は、ランスフィールドの毛細管プレ／ピ ナンテストにかけたとき連鎖状球菌のグループ抗原Ａ、Ｃ，Ｅ、　ＦおよびＧと 陽性に反応したが、ＢおよびＤとは反応しなかった。用いられた連鎖状球菌のダ ループ抗原各種は、ディフコ社製／り゛り］・・連鎖状球菌抗原セット（品番　 ２３６８−３２、ロット番号６Ｅ１９５７　）であった。

（３１） 抗血清ろ０ｒｎＩ！はＮ−アセチルダルコザミンアガロースカラム（カラム床の 容積は約ＩＯ，８ｍ１）中に置かれた。結合サレナカッた血清成分をＰＢＳ　（ ＮａＣｎ　８．０グ、ＫＨ２ＰＯ４０，２モル、Ｎａ２ＨＰＯ４１２Ｈ２０２， ９？およびＫｃｌ　Ｏ，２９で調製）１２０＊で洗浄することにより除去した後 に結合された抗体はｐＨ７，４の６モル濃度ＮＨ４ＳＣＮ　９　口ｄで溶離され た。

分画は採取され、プールされ、ＰＢＳに対して徹底的に透析され、除外分子量公 称１０，０００ダルトンを有するＹ１ｉ１１０膜を装着したアミコン２０２型限 外ｐ過器を用いて８．０　ｍｌに濃縮された。免疫クロプリンの最終的収量は、 工ｇＧの１ｍｑ　／　ｍｌの溶液の吸光度は２８０　ｎｍにおいて１．４である と前提して、１２．８ｍ？であった。この親和性精製された抗連鎖状球菌抗体（ ＡＪＳＡ）は、ランスフィールド・プレシピチ／・テストにおいて連鎖状球菌Ａ 抗原とのみ陽性に反応した。対照として、ＡＰＳＡは等量のＮ−アセチルグルコ サミンと予め混合された。連鎖状球菌グループ抗原のいずれとも反応性が見られ なかった。ＡＰＳＡが等量のＰＢＳと混合された場合には、連鎖状球菌Ａ抗原と の反応性が見られた。

Ｂ、ＡＰＳＡ−ＨＲＰ複合物の調製 上記（Ａ）において調製されたＡＰＳＡ　８．　Ｏｍｔｉは、下記の手順により 西洋わさびパーオキ７ダーゼ（ＨＲＰ）と複合物化された。水１．　Ｏｄ中４　 ｍｇのＨＲＰ　（ＲＺ　３．０　）は、新しく調製された０１１モル濃のＮａｌ ０４Ｄ、　２−と混合された。混合（３２） 液は室温において２０分間攪拌され、しかる後ｐＨ４，４の１ミリモル濃度酢酸 ナトリウム緩衝液に対して４℃で終夜透析された。保留物に０２モル濃度、ｐＨ ９，５の炭酸塩緩衝液２０パならびに００１モル濃度ｐＨ９，５の炭酸塩緩衝液 １．０　ｍｌに溶解した］：ｇ３ｍｙが加えられ、しかる後室温において２時間 攪拌された。この時間経過の後に、新しく調製されたポロヒドリドナトリウム溶 液（水中４ｍｙ／ｍ／り　０．１　ｍｌが加えられ、混合物は４℃において２時 間静置された。しかる後等量の飽和硫酸アンモニウム溶液が加えられ、混合液は 遠心分離され、沈殿物は５０チ飽和硫酸アンモニウム溶液で２回洗浄され、ＰＢ Ｓに対して徹底的に透析された。しかる後生血清アルフミンが１％濃度になるよ うに加えられ、複合物はミリポアフィルタ−（０２２μｍ　）を通して沖過され た。ｐ過液に等量のグリセロールが加えられた。複合物は一２０℃において貯蔵 上記の）において調製されたＡＰＳＡ’ＨＲＰ複合物はＰＢＳ　／ツイン／　Ｂ ＳＡ緩衝液で２０倍に希釈された。複合物１００戚と熱殺菌した連鎖状球菌Ａ細 菌抗原１００パとが混合され、１０分間室温に置かれた。この試料の５０戒ずつ の定量が真空濾過器上の予め洗浄されたフィルター上にピはノド注下された。殿 粉でコーティングされたフィルターは、フィルター材（ミリボア社より入手の型 番ＨＡＷＰ０４７００、孔隙サイズ０．４５μ、直径４７　ｍｍ　）にイージー ・オン噴霧用殿粉て噴霧コーティングすることにより調製された。フィルターは 飽和され、余剰の殿粉け４５℃で２時間乾燥することにより除去され嶋フィルタ ーはしかる後約１０−の炭酸塩／ＢＳＡ緩衝液中に１分間浸漬され、追加の同じ 緩衝液２０ｍ１で洗浄され、最後に約２０ｍ１のＰＢＳ　／ツイン緩衝液で洗浄 され、つぎに余剰の緩衝液が全部除去されるまで真空中に保たれた。しかる後フ ィルターは深トす皿に移された。

そこで約１ｍｌの信号発生試薬が点灯されたフィルターを液浸するために用いら れた。信号発生試薬は、沃化すｌ・リウムの２％水溶液０．４Ｍ、β−Ｄ−クル コースの４条水溶液０．５Ｍ、ｐｉ（６，０のクエン酸塩／燐酸塩緩衝液０１ｍ １およびクルコースオキシグー七（シグマケミカル社より入手）の１ｒｒｑ　／ 　ｍ６の水溶液０．０５ｍ１から調製された。

クエン酸塩／燐酸塩緩衝液は、水１℃につきり再ン酸７７４７およびＮａ２ＨＰ Ｏ４１７，，９３？から調製された。陽性反応は約６０秒以内に暗青色の斑点が 形成されることにより指示された。下記のデータは、１試料につきコロニー形成 単位数が僅か２２という少数でさえもこの測定法により検出され得たことを示す 。テスト結果の色強度ばＯから４千までに段階評点され、４＋は最も濃い色であ る。

コロニー形成単位数／試料　色　強　度実施例４　単純ヘルＲス・ウィルス（１ 型）の測定単純へ四Ｒス・ウィルス（Ｈ８Ｖ）抗原は、１ｉ１１Ａ−”イオゾロ ダクノ社（メリーランド州ウォーカービル）から陰性の対照物とともに購入した 。ヘルＲス抗体は、西洋わさび、９−オキ／ダーゼと複合物化されだダコ社の抗 １型単純ヘル×ス・ウィルス家兎抗体てあった。複合物はＰＢＳ　／メイン／Ｂ ＳＡ中で１°５０の割に希釈された。抗原は、ｐＢｓ／ツイン／ＢＳＡ緩衝液中 に１１０口、１：１，０００およびｉ：ｉｏ、ｏｏ口に希釈された。上記の各希 釈Ｈ８Ｖ抗原の５０鱈定゛量は、複合物５０ｉｔｆｌと混合された。５０秒後に ポリエチレンクリコール（ＰＥＧ）液（ＰＢＳ中にポリエチレングリコール８０ ００の２０係容量中重量の溶液）が加えられ完全に混合された。１０分間室温に 保った後、溶液は上記のように予め殿粉てコーティングされたフィルクー上にビ 啄ソトて法灯された。フィルターはＰＢＳ　／ツイン緩衝液で洗浄され、しかる 後ｐＨ５に調製されたクエン酸塩／燐酸塩緩衝液０．１　ｍｌ　（ｐＨ６，０の 水１０１］ｍｌにつきクエン酸７７４２、Ｎａ２ＰＯ４１７，９３ｊから調製、 ｐＨ６，０）　、　ＮａＩの２％水溶液口４５ｍ１およびＨ２Ｏ２のロロろチ溶 液０．４５ｍ１から調製された信号発生試薬で液浸された。Ｈ，ＳＶ抗原の測定 は、１　：　１０００の希釈にまで陽性ｐ結果を示した。陰性の対照物は、同じ 希釈度の陽性の斑点と直ちに識別できる微弱な斑点を生じた。

実施例５　エンテロトキ７ンの測定 エンテロトキノン抗原（精製された豚の熱不安定な犬腸菌工、・テロトキー／ン ）および精製された豚の熱不安定な大腸菌エノテロトキノンに対する山羊抗血ｍ は、ともに市販品を購入した。豚の抗山羊ＩｇＧ　／パーオキ７ダー七複合物は 、タボ社から購入した（型番６４０１　）。エンテロ［ギ／ンば、ツイン／　１ ％　ＢＳＡ緩衝液で１００　／Ｉ？／　ｍｌ。

１０　μ？／ｍｌ、　１μｑ／ｍへ口１μｙ／ｍｅ、００１μり／箭および０． ００１１１９　／ｍｌに希釈された。アガロースはエンテロトキヅンを結答する 能力のあることが知られている。

アガロース調製物（セファロース４Ｂ、ファルマノア社より入手可能、直径４０ 〜１９０μのビーズをツイン７”　ＢＳＡ緩衝液中に沈降容積５０ヂに懸濁）の １００バ分取量は、エンテロトキ／ン試料の１０ＱｔｔＱ分取量と混合され、１ ５分間室温に保たれた。しかる後山羊抗血清（メイン／ＢＳＡ緩衝液中に１：１ ００に希釈）１０口μ℃ずつが各試料に加えられ、さらに１５分間室温に保たれ た。つきに複合物（メイン／ＢＳＡ液中に１：１０に希釈）１００７１２ずつが 、各試料に加えられ、その最終混合液は再び１５分間室温に保たれた。各試料は 、ミリポアフィルタ−濾過器（型番ＸＸ１００４７００）　Ｋ装着された殿粉で コーティングされたフィルター−にに点打され、混合物の液体部分は真空吸引沖 過された。フィルター上に留まったビーズは、ツイン・’ＢＳＡ緩衝液で洗浄さ れた。１斑点当り約１０ｍ１の洗浄液−叶が用いられた。フィルターは外され、 ＮａＩの２係液０．４０ｍ１．　β−Ｄ−グルコースの４％Ｍ液口５０ｍＡ、Ｉ ）Ｈ６のクエン酸塩、・′燐酸塩緩衝液（上記の通り）　ｏ、　ｉ　ｙおよびク ルコースオキ／ダーゼの１　ｒｑ　／　ｍｌ溶液００５ｍ１！を含有する混合液 で液浸された。２分後に各斑点の呈色度を０から４＋に段階評点した。陽性の結 果は、トキシン１　／ｎ、７ｍｌ希釈に才で得られ、それは１試料につき１０Ｏ ｎ？に相当した。

対照反応す々わち緩衝液、アカロース、抗体ならびにその複合物でトギンンなし 、トキシン、緩衝液、抗体、複合物でアカロースなし、トキシン、アガロース、 緩衝液、複合物で抗体なし、はいずれも陰性であった。

実施例６　ヘルば・スウイルスの吸収測定Ｈｅｐ　−２細胞中で生育せしめた感 染性Ｈ８Ｖ　−１（Ｆ株）の各種の濃度が、ＰＢＳ　／　０．５多ツイン２０／ １チＢＳＡ緩衝液中に希釈することにより調製され、ガラス試験管中に入れられ た。殿粉でコーティングされた綿棒は、綿棒が浸漬される才でイージーオン噴霧 殿粉で１〜２回スプレー１〜、その後倒立位置で２時間４５℃において乾かすこ とにより調製された。綿棒はウィルスを含有する各試験管に１本ずつ入れられ、 試料液を約２０秒間吸収せしめられた。綿棒はとり出され、家兎抗Ｈ８Ｖ　−１ ／　ＨＲＰ複合物（ダコ社より入手可能、上記のＰＢＳ　／ツイン／ＢＳＡ緩衝 液中に１　：　１００に希釈）１５０μｌずつを含有する第２の試験管中に入れ られた。

５分間の保温の後に綿棒はとり出され、ＰＢＳ　／　０．５係ツイン２０緩衝液 中に６回沈漬することにより洗浄された。洗浄の後に綿棒は、新しく調製された 信号発生試薬２チ重量溶液０４５−および過酸化水素の０３％（容量中容量）蒸 留水溶液０．４５ｍ１から調製）　０．２　ｍ７！ずつを含有する新しい試験管 に移された。発色ば１ｏ秒以内に観察された。６０秒後に各綿棒は反応を止める ために水道水で洗浄された。異なるＨ８Ｖ試料濃度に対応する色強度を下希釈せ ず　１＝１／２＋ １　：１００，０００　１／２＋ 対　照　十− 観察された色強度の非直線性は、ゾロゾーン効果、すなわち抗原の１種類の希釈 のみが測定に用いられたことによる。この測定に対する対照は上記の通りに、た だしＨ８Ｖ抗原なしで実施さｔした。

実施例７　連鎖状球菌Ａに対する綿棒測定この測定の手順は、前記の実施例６お よび連鎖状球菌Ａ細菌において記述された親和性親和性精製状連鎖抗体／　ＨＲ Ｐ複合物（ＡＰＳＡ　／　ＨＲＰ　）を用い、ベル２スウイルスの綿棒測定の手 順と同じである。

抗原は１１ｏ、１：１００および１：１，０００に希釈された。

対照（ハ）抗原を含有しなかった。

観察された色強度の非直線性は、プロゾーン効果による。

実施例８　ヒｉ　ＩｇＥの検出 家兎の抗ヒト〒ｇＫは、ヒｌ−ＩｇＥ骨髄腫蛋白質のＦｃ断片を家兎に注射し、 その約１〜６か力抜に採血する標準的方法により調製きれた。家兎血清の全免疫 グロブリン分画に対して特異性を有する羊の抗家兎免疫グロブリンは市販品を入 手した。羊の抗家兎Ｉｇの漸減量（原液を１：５．１：１５．１：４５，１：１ ３５，１：４０５および１：１２１５に希釈）が、家兎の抗ヒ）　ｒｇＥの一定 量（原液を１．１５に希釈）に加えられた。１８時間４℃に保った後に、各溶液 は可溶性の複合体が形成される両試薬の相対比率を決（３９） 定するために視覚的に検査された。１：１３５希釈が、家兎技工ｇＫとともに澄 明な溶液を生ずる最初のものであった。

測定目的のためには、８０ｎ？／＋＋＋／！〜１ｏμ７／−の範囲を力か−する ４種類のヒ）　ＩｇＥの５倍増希釈液が調製された。ＩｇＪの取得源は患者Ｐｓ がら得られたヒト骨髄腫であった。５通りの希釈液１００／ｌｎずつが山羊の抗 ＩｇＥ　／　ＨＲＰ核金換金物溶液ルフリーズハイオロジカルズ社より入手、ロ ット番号２８２Ｄ　、　１０　■／ｍｌ濃度が０．００５　モル硼酸、０．００ １５モルテトラ硼酸ナトリウム、０．１４　モ／ｌ／　Ｎａ、Ｃ，９およびｉ　 ｍｆ／　／　ｍｌのセラチンを含有しｐＨ８，３の硼酸塩緩衝牧牛に１：５００ に希釈された）１００１ｉ、ｉｉずつに加えられ、１分間室温に保たれた。前記 のように調製された可溶性複合体液１００　ａｎずつが各混合液に加えられ、続 いて反応混合液中のＰＥＧの最終濃度を４チとするに必要な量の、５ミリモル濃 度燐酸塩緩衝液のＰＥ（）６００口の１６係（重量中重量）／８液が加えられた 。混合液は１０分間室温に保たれ、その後結果として生じた懸濁液ろパの分取量 が孔隙サイズ０．４５μを有するミリポアＨＡフィルター上に置かれた。液体が フィルターに吸収されるや否や直ちにフィルターはスウィニーフィルターホルダ ーに装着され、フィルターはトリトンＸ−１０００，０５％を含有するＰＢＳ液 ２ｍｌを用いて洗浄された。洗浄後フィルターは外され、００５モル濃度のクエ ン酸と０．０６５モル濃度の燐酸塩からなるＩ）Ｈ６のクエン酸塩緩衝液中にお いて過酸化水素口０２チおよびＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）０．０２％の 最終濃度を有する信号発生試薬溶液中に入れられた。ＩｇＥの存在は、Ｂｏｎｄ ７ｍｌにおよぶ低レベルにおいて６分以内にｐ紙上に黄褐色の斑点を生ずること により検出され得た。この測定に対する対照は、　ＰＥｆ）は存在するがたたし ＩｇＥなして可溶性複合体および技工ｇＥ　−ＨＲＰ複合物を利用することより なっていたが、結果としてごく微かな黄色の斑点のみを生じた。

ＯＰＤのかわりに６＋６′−ジアミノベンジジンを用いた場合には測定は満足に 行われなかった。すなわち１０μ？／ｍ濃度レベルにおいてさえも微かに褐色の 斑点が形成されたのみであった（前記の対照より僅かに濃い程度であり、その他 においては対照と判別がつかなかった）。このベンジジン基質の酸化生成物は不 溶性であり、従って本発明の範囲外である。

実施例９　連鎖状球菌Ａの測定 Ａ、交差結合されたアミロース／ＡＰＳＡカラムの調製６０７分取量のアミロー ス（馬鈴薯殿粉より、若干の不溶性物質およびアミロＲクチン約５弼を含有）は 、水冷の５規定水酸化ナトリウム１００−で処理され、均一な粒質の軟泥状物が 得られるまで攪拌された。攪拌はさらに６０分間続けられ、その時点でエピクロ ロヒドリン１５２が攪拌下に加えられ、反応は水浴中で２５分間継続せしめられ た。反応は４５〜５０℃においてさらに１時間継続された。この期間の後に反応 混合液はさらに太きい容器に移され、純水１℃が加えられた。反応混合液は２〜 ８℃において終夜静置された。懸濁された微粒は、上清を２回傾瀉することによ り除去された。残ったゲルは目の粗いガラスフィルターて濾過され、純水でろ回 、エタノールで２回、アセトンで２回洗浄された。洗浄後ゲ′ルは吸引乾燥され 、オーフン中で４０〜４５℃において終夜乾燥され、つぎに室温において２時間 真空乾燥された。乾燥されたゲルは分別され、１００〜２００７ソ／ユサイズの ものが活性化および抗体付着に用いられた。

上記のように調製された交差結合アミロースの０．５　ｆｔ’量がカラスの計数 管に移された。アセトン１０−および１．１′−カルポニルンイミダゾールロ３ ０？が管中に入れられた。管は蓋をはめて室温で２０分間振盪された。内容物は 目の粗い半融カラス漏斗を用いて濾過され、水、続いてｐＨ９，６の０１モル濃 度炭酸塩／重炭酸塩緩衝液で徹底的に洗浄された。洗浄されたケルは清潔なカラ ス計数管に移された。つきにＡＰＳＡ（前記の通り）５ｍ７が０１モル濃度炭酸 塩／重炭酸塩緩衝液中５ｍｇに希釈された。必要に応じてｐＨは９６に調整され た。この溶液は、１５ｍ／！容量のポリスチレン製遠沈管に移され、洗浄された ゲ゛ルか加えられた。遠沈管に蓋をはめ、室温において２２時間回転させられた 。このスラリーはカラムに入れられ、水、つぎにＰＢＳ　１００５％ツイン２０ 液で徹底的に洗浄された。

Ｂ、連鎖状球菌Ａグループ細菌の測定 ７本のカラム（内径約０．５　ｃｍ　）が前記のように調製された懸濁液でカラ ム高さ２陥を達成するように充填された。各カラムは全量２０〜２５ｍ１の水お よＱ：　ＢＳＡ　１　％を含有するｐＨ９，６の炭酸塩／重炭酸塩緩衝液１Ｔｄ ！、分取量６回で洗浄された。各カラムには、Ｂ５Ａ１％と０．０５％ツイン２ ０を含有するｐＨ７，４の全量０．１ｒｎ！、のＰＢＳ中に各種の異なる濃度の 殺された連鎖状球菌Ａグループの菌が加えられた。連鎖状球菌Ａクルージの濃度 は、１−につき９×１０７〜３Ｘ１０５コロニー形成単位数（ＯＦＵ）であった 。第７゛のカラムはブランクであった。すなわちＰＢＳ緩衝液は上記の通りでた たし連鎖状球菌Ａなしであった。カラムは１５分間平衡化せしめられ、前記のＰ ＢＳ　／　ＢＳＡ　／ツイン２０緩衝液の１’ｍ１分取量６回で洗浄された。こ の後前記ＰＢＳ　／　ＢＳＡ　／ツイン緩衝液中に前記の通りに調製されたＡＰ ＳＡ　／　ＨＲＰ酵素複合物を１２０に希釈１７たものｏ、　ｉ　ｙが各カラム に加えられ、１５分間平衡化せしめられた。

各カラムは同じ緩衝液の１−分取量６回で洗浄された。

洗浄の後２％沃化ナトリウム液０．５　ｍｌ　、β−Ｄ−グルコースの４係溶液 口、　４　ｍｌ、ｐＨ６，０のクエン酸塩／燐酸塩緩衝液０．ｉｍｌ、およびク ルコースオキ／ダーゼ１ｍｑ／ｍｉｍ液０、０５　ｍｌから調製された信号発生 試薬口、　１　ｍｌが加えられた。

８０秒後にカラムは反応を止めるために水で洗浄された。

各カラムの青色強度を下記の表に示す。

実施例１０　ザイトメ力ロウイルス（Ｃ＋ＶＶ）の測定Ａ、抗体／ウィルス複合 体の調製 Ｃ１ｖｓＶ抗原（相互固定力価１：８．ＭＡハイオシロタクツ社より入手）は、 ｐＨ６，５で牛血清アルブミン１チを含有するＰＢＳ　１００５％メイン２０緩 衝液中に不希釈から１・−′２５６甘で各種の濃度に希釈された。山羊の抗ＣＭ Ｖ血清（ＩｇＧ分画、ダイナチク社より入手）は前記の緩衝液中１：２００に希 釈された。可溶性抗原／抗体複合体は、　Ｃ］ｖｌＶ抗原および前記の抗血清５ ０　ｔＪずつを１５分間２２℃において混合することにより形成された。イージ ー珂ン噴霧殿粉てコーチインクされたミリボアＨＡフィルター（０４５μ）は先 に記述された通りに調製され、ＢＳＡ　１　％を含有するｐＨ９，６の００５モ ル濃度炭酸塩緩衝液で洗浄された。

抗原／抗体複合体５０戒が殿粉でコーティングされたフィルターに真空中で加え られた。添加後にフィルターはｐＨ６，５のＰＢＳ　／ツイン緩衝液ですすき洗 いされた。しかる後１ｍｌの家兎の抗山羊ＩｇＧ　／西洋わさひパーオキ／ダー ゼ複合物（カッはルラボラトリース社製、ＰＢＳ／メイン、、、／　ＢＳＡ中に １：３００に希釈）がフィルターに塗布され５分間室温に保たれた。フィルター はつきにｐＨ６，５のｌ″ＢＳ　、、′Ｑロ５％ツイン２０緩衝液で洗浄された 。フィルターは吸引装置から外され、信号発生試薬（沃化ナトｌ）ラムの２チ水 溶液５００μａ、β−Ｄ−グルコースの４％水溶液４００　ｌｒＱ、燐酸塩／く えん酸塩緩衝液１０口μ２および１ｒｑ／−のダルコースオキ／ダーゼ溶液５０ μ℃から調製）１　ｍｌで液浸された。読み取りは２分後になされ、その時点て フィルターは蒸留水で洗浄され、合計５分後に再びｈ″Ｃみ取られた。反応は下 記の通り１千〜４＋に段階評点された。データは２分後に得られたもので、時間 経過後も色の変化はなかった。

偽の感染細胞培養株（ＭＡパイオシログクツ社）を陰性対照に用い、不希釈試料 は十−を示し、他のすべての希釈では陰性の結果となった。

実施例１１　連鎖状球菌Ａクノト−ゾの測定のための殿粉粒ラテックス／抗体カ ラム Ａ、交差結合アミロースラテックス／抗体力シムの調製乾燥した交差結合アミロ ース（６０〜１００　メツ／ユサイズ）は実施例１に記述の通りに調製された。

交差結合アミロースの１０係懸濁液はｐ）１　ｓ、　５のｏ、１モル濃度硼酸塩 緩衝液中に調製され、３０分間室温において再水和せしめられた。再水利の後上 記の懸／ｆ３７＆　２００μｌがプラスチック製カラム（内径０．５　ｔｙｎ　 、流失を防ぐために半融ガラスフィルターをとりつけである）中へ充填され、Ｂ ＳＡ１チを含有するｐＨ９，６の０．１モル濃度炭酸塩緩衝液１　ｍｌずつで６ 回洗浄された。

平均直径２５．７μｍのスチレン／ンビニルベノ七ン共重合体ラテックス粒子は 、固形物含有量１０％として、シグマ社から入手された。親和性精製された連鎖 状球菌抗体（ＡＰＳＡ、実施例１０通りに調製）はラテックス粒子に下記のよう にして吸着された。すなわちラテックス１７はＡＰＳＡ　１−およびｐＨ９，６ の０１１モル濃炭酸塩緩衝液１ｍｌと混合され、断続的に混合しながら２時間３ ７℃に保たれた。上記の懸濁液１００μ℃はつぎにカラム中のアミロース層の上 に重層され、混合を防ぐために半融ガラスフィルターが上端に置かれた。つぎに カラムは遊離の旺軽を除去するためにＢＳＡ　Ｉ　％を含有するｐＨ９６の０１ モル（４６） 濃度炭酸塩緩衝液１　ｍｌずつで６回洗浄された。

Ｂ、連鎖状球菌Ａクルージの測定 連釧状球菌は、Ｉ・ノド、′ヘライツト肉汁培養中で６７℃で２４時間生育せし められ、感染性は血液寒天平板培地上の標準的コロニー計数法により測定された 。細胞は熱で殺され（６０℃、１時間）、ｐＨ７，４のＰＢＳで使用前に１回洗 浄された。抗原は、ツイン２ｏ　口ｏ５チおよびＢＳＡ　１　％を含イｊするｐ Ｈ６，５の高塩酸性緩衝液（１ｐにっきＮａＣｆ１９．０　？、Ｎａ２ＨＰＯ４ ６，９７？、ＫＨ２ＰＯ４０，３６？およびＫＣｌ２０．１９ｆｉ’　ヲ含有） 中に１０倍増系列に希釈さ＃１．　ｆｃ、。抗原の希釈度の異なる液の分取ｆｉ ｔ：１００／踵ずつが７本のカラムのそれぞれに加えらＪシ、１分以内にカラム を通って流去せしめるか捷たは底を封して１５分間室温に保つがされた。対照は 抗原なしの緩衝液を含有した。カラムは次いで高塩度酸ｌ″Ｊ−緩ｆ（液で３同 洗浄された。高塩度酸性緩衝液中に１．２０で希釈されたＡＰＳＡ　／’　ＨＲ Ｐ複合体（実施例１の通りに調製）の１００　ｔｉｎ分画が各カラムに加えられ 、１分以内に流去せしめられるかもしくは室温で１５分保温された。保温後カラ ムは高塩度酸性緩衝＠　１　ｍｌで６回通過洗浄され、その後に信号発生試薬１ ００／ｌｆｆが加えられた。信号発生試薬は、沃化ナトリウムの２チ水溶液０． ４０ｍ１．　β−Ｄ−グルコースの４俸溶液０．５０ｄ、ｐＨ６，０のクエン酸 塩／′″ｈ＃酸塩緩衝液０．１　ｍｌおよびグルコースオキ／ダーゼ（７７７社 より入手）の１ｒｒｑ　／　ｍｌ水溶液口０５−より調製された。宵色の強度は 、信号発生試薬添加の２分後に段階評点（Ｏ〜４＋基準）され記録された。

実施例１２　単純ヘルペス・ウィルス１型の測定Ａ、ポリアクリルアミド／／′ アノエチル化殿粉粒子の調製ポリアクリルアミド／′／アノエチル化殿粉（ＰＡ Ｃ８）ピースに、Ｂ３　ｕ　ｔＯｈ氏ら（Δｎａ１．　ＢｉＯＣｈｅｍ、第７９ 巻第３２９頁、１９７７年）の方法を改変して製造された。アクリルアミド６″ ？、Ｎ、Ｎ’−ノテレノービスーアクリルアミド（ＢＩＳ）０．６９．　ンアノ エチル化殿粉（ポリサイエンセス社より入手可能）０．２５９および脱イオン水 ５０ｉ中の過硫酸アシモニ：ウム４０ｍ７の混合液は、殿粉を懸濁状態に保つた めに再正旋回させながら５分間脱気せしめらｔＬだ。脱気は、Ｎ　、　Ｎ　、　 Ｎ’、　Ｎ’−デトラノチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）２０　ｌｒｉの添 加後さらに１分間継続された。混合物は窒素雰囲気上継続的に攪拌しつつピーナ ツ油ｉｏｏｍｌ中に徐々に注入された。攪拌はアクリルアミド溶液がピーズ形に 重（４８） 合する間窒素雰囲気下に２時間継続された。懸濁された殿粉は重合が起るにつれ てビーズ中に物理的に捕捉された。操作はすべて室温で行われた。

ピーナツ油は２００Ｘ９　（工ＥＣＰＲ−Ｊ型遠心機）１０００ｒｐｍ）で５分 間の遠心によりＰＡＣＳビーズがら分離された。沈降物はトルエン１００Ｔｄ！ 、中に再懸濁され、終夜攪拌された。

トルエンはブフナー漏斗濾過により除去され、ビーズはアセトン４００ｍＩＶ中 に慰濁された。１０分後にそれらは濾過により再分離され、風乾せしめられた。

微粒子は乾燥された材料を６０メツ／ユでふるい分けして除去された。

乾燥ピースの最終的直径は約０．６〜０８陥であった。

Ｂ、ＨＳＶ抗原の直接結合免疫測定 乾燥したＰＡＣＳビーズ（０，１ｆ　）が底を蓋で封じたプラスチック製カラム （内径約０．５　ｔｙｎ　）に加えられた。希釈度が１２５．１ニア５．１：： ２２５．１　：６７５および１：２．ｏ２５のＨ８Ｖ抗原（抗原はメリーランド 州つォーカーズビル所在ＭＡバイオプロダ２）社より購入、ツイン２ｏを０．５ ％、ＢＳＡを１．０％含有するｐＨ７，４のＰＢＳ緩衝液中に希釈）１５０パず つがカラムに入れられ、カラム内容物を再水和せしめた（約１〜２分間）。再水 利の後、上記の通りツイン２０およびＢＳＡを含有するｐＨ７，２のＰＢＳ中に １１００に希釈された家兎抗Ｈ８■−１／ＨＲＰ複合物（ダコ社初５０ｔｉｎが 加えられ、５分間保温された。カラムは蓋を外して開かれ、ツイン２０を００５ ％含有するｐＨ７，２のＰＢＳ３−そ洗浄された（カラムの空虚容積は約２００ パ）。この段階において下記の通りの酵素検出システムがＰＡＣ８ｅ−ズ上に固 定化された抗原に結合された複合物の量を検知するために用いられた。すなわち 沃化すトリウムの２係液０．５−１β−Ｄ−グルコースの４係溶液０．４　ｄ、 ｐＨ６，０のクエン酸塩／燐酸塩緩衝液０１−およびグルコースオキシダーゼの １ｍ７／ｒｎｌ溶液０．０５ｍ１！からなる信号発生試′薬２　口０　／ｉｎが 各カラムに加えられた。６０秒後に各カラムの青色の強度は０〜４＋に段階評点 された。４＋は最も濃く、０は無色である。

陰性対照 １°７５　２＋ 希釈剤のみ　１〜２＋ 実施例１６　単純ヘルはス・ウィルス１型の測定本発明の免疫測定は、殿粉でコ ーティングされ、また゛／クチンが付着せしめられた綿棒を用いて実施され得る 。

レクチンの付着は、二段階の過程である。第１段において、綿棒は臭化／アノゲ ン（ポラース氏う、Ｊ、ＯｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　、第８６巻第５３ 頁、１９７６年）で活性化される。第２段においては、レクチンばＣ！ＮＢｒで 活性化された吸収片に何着せしめられる（　ｒｃｅｌｌＡｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒ ｏｍａｔｏｇｒａｐｂｙ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ＭｅｔｈｏｄｓＪ　 スエーデン、ファルマノアファインケミカルズ社、１９７９年）。吸収片の殿粉 コーティングおよび測定の手順は上記の実施例１に記述されている。

Ａ、レクチンの綿棒への付着 綿棒（綿、亜麻、大麻、ジュートおよびレーヨンのよりな多糖質繊維で構成）は 水で洗浄され風乾される。それらはｐＨ１１，９の５モル濃度燐酸カリウム緩衝 液中に入れられ（綿繊維１７につき緩衝液２５　ｍｌ　）、そこへ臭化ゾアノゲ ゛ン溶液（１００ｍｆ／　ｍｌ　）　２　ｍｌが一定少量ずつ２分間５〜１０℃ においてゆるやかに攪拌しつつ加えられる。

温度はさらに８分間５〜１０℃に保たれ、しがる後綿俸は完全に水洗され風乾さ れる。

上記の手順により得られると期待されるｃＮＢｒにより活性化された綿棒は、１ ミリモル濃度のＨＣＨＣｌ２０Ｏを数回に分けて洗浄され、つきに５−の共役緩 衝液（０１モルＮａＨＣＯ３，０５モルＮａＣｆ１．１）Ｈ８，３）で洗浄され た。綿棒は直ちに精製されたカタソムリ（Ｈｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａ）アグル テニン（ＨＰＡ　、カリフォルニア州サンマチオ所在、　Ｋ、Ｙ。

ラボラドｌ）−ズ社より入手可能）１８〜３５■を含有する共役緩衝液３０ｒｎ ｌ中へ移され、室温において２時間または４℃において終夜ゆるやかに攪拌され た（マグネチソクスクーラー不可）。綿棒はつぎに阻止緩衝液（グリヅン０２モ ル、ｐＨ８，０）　３０　ｍｌ中へ移され、室温において２時間または４℃にお いて終夜ゆるやかに攪拌された。

余剰のレクチンは共役緩衝液、そのつぎに酢酸塩緩衝液（０，１モル濃度、ｐＨ ４，０，５モルＮａＣｆｔを含有する）、次いで共役緩衝液で洗浄することによ り除去される。レクチ〕ノでコーティングされた綿棒は共役緩衝液中４〜８℃に おいてメルチオレートのような静菌剤を用いるが、または風乾することにより貯 蔵され得る。

Ｂ、レクチン綿棒の殿粉コーティング ７クチン綿棒（上記Ａの通りに調製）は、イージーオン噴霧殿粉で１〜２回、綿 棒が浸漬される寸でスプレーし、つぎに実施例１に記述されているように倒立の 位置で４５℃において２時間乾燥することにより殿粉コーチＩｊ］１１宕は前記 実施例１の通りに実施され得る。Ｈｅｐ−２細胞中で生育した感染性Ｈ８Ｖ−１ （Ｆ株）の各種の濃度は、ｐＨ７，４ノＰＢＳ　／”’　０．５％ソイ；２０／ １％ＢＳＡ緩衝液中−・Ｄ希釈およびガラス試験管中に入れられた各希釈液１０ ｏμＵ″でより調製される。殿粉でコーチインクしたレクチン綿棒はウィルスを 含有する各試験管中に入れられ試料液を吸収せしめられる。ＨＰＡ　Ｖｉ以下の 微生物を（もし臨床試料中に存在するならば）結合すると期待される。すなわち 単純ヘルはス・ウィルス１型捷たば２型［（表面の糖蛋白質ｇｏにより）　Ｏ］ ０ｆｆｓｏｎ氏ら、Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　、第３８巻第５６４頁、１９ ８１年〕、大腸菌、ザルモネラおよび連鎖状球菌。室温において５分間保った後 に綿棒は取り出され、通常の微生物相、宿主細胞の砕屑およびその他の妨害する 物質を除去するためにｐＩ（７，４のＰＢＳ　／　０．０５％ツイン２０緩衝液 中に５回沈漬することにより洗浄された。綿棒はつぎに家兎の抗Ｈ８Ｖ−１／　 ＨＲＰ複合物（ダコ社より入手可能、上記のＰＢＳ　／ツイン／ＢＳＡ緩衝液中 に１：１００に希釈）１５０μ２を含有する試験管の第２の七ノ［・に移される 。

５分間保温の後に、綿棒は取り出され、前記の通りに緩衝液で６回洗浄された。

洗浄の後に綿棒は信号発生試薬（沃化ナトリウムの２％液０．５　ｍｌ　、β− Ｄ−グルコースの４条溶液０．４　ｍｌ　、ｐＨ６，０のクエン酸塩／燐酸塩緩 衝液０１１ｍ１およびグルコースオキシクーゼのｉｒｑ　／　ｍｌ溶液Ｑ、（３ ５ｍｌから調製）２［１０μ悲ずつを含有する新しい試験管に移される。６０秒 後に綿棒は起っていると期待される反応を止めるために水道水で洗浄される。色 強度は各種の異なるＨＳ、■試料濃度に対応すると期待される。予期される一連 の結果は下記に示される。

１　：１００，０００　１／２＋ １：ｔｏｏＤ、０口ｂ　＋／− （１）偽の感染Ｈｅｐ−２細胞の溶解物プロゾーン効果による色強度の非直線性 は期待されない。それは数種類の抗体希釈が用いられ得るからである。陽性の色 反応はＨ８Ｖの存在を指示する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　次の段階すなわち、 （Ａ）　活性支持体上に少なくとも１種の抗体に免疫化学的に結合された分析対 象物よりなる酵素成分を有する免疫複合体を収集するかまたは形成せしめ、（Ｂ ）　支持体上の免疫複合体の酵素成分を信号発生試薬と接触せしめ、それにより 生成物が形成され、もし該生成物が発色原子団であればそれは測定媒液に可溶で あり、 （Ｃ）　生成物を支持体と相互作用せしめ、その相互作用が支持体上に検出可能 な信号の濃縮をもたらすことよりなる生物学的試料中の分析対象物検出のための 免疫測定法。 ２、　前記の免疫複合体が溶液中において分析対象物と酵素標識付抗分析対象物 抗体とを予め保温することにより形成され、シ、かる後支持体上に収集される、 請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 ３、　前言ｄの免疫複合体の支持体上における形成か、支持体に結合された抗分 析対象物抗体による分析対象物の免疫化学的捕捉とそれに続く酵素標識付抗分析 対象物抗体との反応よりなる、請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 ４、　前記の免疫複合体の支持体上における形成が、支持体に共有結合的に結合 された分析対象物による酵素標識付抗分析対象物抗体の免疫化学的捕捉よりなる 、請（５５） 求の範囲第１項記載の免疫測定法。 ５　前記の免疫複合体の支持体上における形成が、支持体に結合された抗分析対 象物抗体による酵素標識付抗分析対象物抗体と分析対象物との複合体の免疫化学 的捕捉よりなる、請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 ６、　操作段階（Ｂ）において形成される生成物が測定媒液に可溶であり、検出 可能な信号を特徴する請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 ７　分析対象物が、可溶性有機質抗原および不完全抗原、細胞、微生物およびそ れらの生成物よりなるグループから選択される、請求の範囲第１項記載の免疫測 定法。 ８　支持体が、ナイロン、硝化セルロース、エチルセルロースまたは変成された ポリアミドよりガる、請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 ９　多孔性の支持体が円板状である、請求の範：用第１項記載の免疫測定法。 １０　操作段階（Ｂ）において形成される生成物が、支持体上の噛能基を通じて 支持体に共有結合的に付着せしめられる請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 １１、官能基がアゾメチン、アゾ色素、ロイコ色素、インクプリン色素、インド アニリン色素およびピラゾロン色素よりなるグループから選択される結合発色物 質の部分である、請求の範囲第１０項記載の免疫測定法。 １２、前記の免疫複合体の支持体上における形成が分析対象物の非免疫化学的捕 捉よりなる、請求の範囲第１項記載の免疫測定法。 分析対象物がレクチンにより捕捉される、請求の範囲第１２項記載の免疫測定法 。