JPH06508211A - ２ステップイオン捕獲結合アッセイを実施するための試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２ステップイオン捕獲結合アッセイを実施するための試薬及び方法 発明の背景 １、発明の分野 本発明は広義には結合アッセイの装置及び方法の分野に係わる。特に本発明は、 均一イムノアッセイを実施する際に有効な新規の装置に係わる。

２、従来技術 体液または他の材料中に存在し得る問題の物質または臨床上重要な物質の存在及 び／または濃度を判定するアッセイにおいて、種々の分析方法及び装置が一般に 使用されている。かかる物質は一般に“被分析物質（ａｎａｌｙｔｅＳ）”と称 されており、これには例えば、抗体、抗原、薬物、ホルモンなどを挙げることが できる。

イムノアッセイ法は、該生物に対して病原性または外来性の抗原が存在すると、 これに応答して抗体が産生される旨の高等生物の免疫機構を利用している。かか る抗体及び抗原、即ち免疫反応物質は相互に結合し、それによって高度に特異的 な反応機構を生成するが、この機構をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用して生物試料中の 特定の抗原の存在または濃度を判定することができる。

少なくとも１種の免疫反応物質を検出可能な成分で標識して分析的に同定可能と した、免疫反応物質を使用するイムノアッセイ法が幾つか公知である。例えば“ サンドイッチ”または“２部位（ｔｗｏ−ｓ　ｉ　ｔ　ｅ）ｍ法は、１つの抗原 と２つの抗体とで３要素結合体を形成することを含む。

かかる方法において結合体の形成を検出する便宜的な方法では、標識抗体と、結 合体を容易に単離し得るように固相支持体に結合させた非標識抗体とを用いる。

この例では、固相に付着した標識抗体の量が試験試料中の被分析物質の量に正比 例する。

別の方法として“競合アッセイ”を挙げることができる。

競合アッセイの１つの例では、捕獲機構はここでも不溶性固相に結合させた抗体 を使用するが、（標識抗体ではなくてむしろ）標識被分析物質が試験試料中に存 在する被分析物質と、固定抗体への結合において競合する。同様に、固定被分析 物質が問題の被分析物質と標識抗体に対して競合することもできる。これらの競 合アッセイにおいては、捕獲された標識試薬の量は、試料中に存在する被分析物 質の量と反比例する。

多大な有用性にも係わらず、上記アッセイ法には欠点がある。第１に、液体試験 試料と可溶性または不溶性アッセイ試薬とが不均一反応混合液となるときには、 反応速度が抑制され得る。全ての試薬が可溶性である液相反応、即ち均一反応混 合液と比較し、不均一反応混合液は、反応混合液中で不溶性固相系と、試験試料 中の遊離被分析物質と、可溶性標識試薬と、新たに形成された不溶性結合体とが 平衡に達するのにより長時間インキュベートすることが必要となり得る。第２に 、抗体を固相に吸着させるなどして、結合メンバーを面相に付着させる慣用方法 では、固相が被分析物質以外の物質とも容易に結合し得る。これは非特異的結合 と称され、陽性結果の検出を妨害し得る。第３に、慣用の固定方法においては、 固相試薬に固定されている結合メンバーの量が製造バッチごとに異なり得る。

結合アッセイに使用するための面相装置の製造に関して言えば、被分析物質の存 在を、固相（例えば浸漬片、試験ストリップ、流通パッド（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏ ｇｕｈ　ｐａｄ）、濾紙、ファイバーマトリックスまたは他の固相材料）に結合 された、標識試薬及び／または相補的結合メンバーに結合した被分析物質の存在 によって示す、多数のアッセイ装置及び方法がある。このような特異的結合反応 では、標識試薬が固相に固定されているものと遊離したままのものとに分配され る結果となる。典型的には、試験試料中の被分析物質の存在または量は、標識試 薬が固相に固定された程度によって示される。

特異的結合アッセイを実施する上で多孔質試験ストリップを使用することもよ（ 知られている。サンドイッチアッセイ法においては、試験試料を試験ストリップ の一部分に添加し、ストリップ材料中を毛管作用によって移動させる。

検出または測定すべき被分析物質は、流体試験試料の成分としてまたはストリッ プに別個に添加することができる溶出即ちクロマトグラフィー溶剤によって、試 験ストリップ材料中を移動する。それによって被分析物質は、被分析物質に特異 的な結合メンバーが固定されている試験ストリップ上の検出ゾーンまで輸送され る。検出ゾーン内に被分析物質が結合した程度は、試験ストリップ内に取り込ま れているかまたはストリップに別個に添加することができる標識被分析物質特異 的結合メンバーによって測定することができる。

上記原理に基づく装置の例としては、以下の特許及び特許出願に記載のものを挙 げることができる。Ｄｅｕｔｓｃｈらは米国特許第４，０９４，６４７号、第４ ．２３５，６０１号及び第４．３６１，５３７号に、定量的クロマトグラフィー 試験ストリップ装置を記載している。該装置は、溶液を毛管作用によって輸送し 得る材料を含む。ストリ・ノブの種々の領域またはゾーンが結合アッセイを実施 するのに必要な試薬を含んでおり、被分析物質がかかるゾーンに到達するかまた はそれを通過すると検出可能なシグナルを生成する。このデバイスは、化学アッ セイや、抗原及び相補的抗体間の結合反応によって代表される結合ア・ソセイに 適している。

続いてＤｅｕｔｓｃｈらの装置の多数の変形が開示されティる。例えば、Ｔｏｍ ら（米国特許第４，３６６．２４１号）は、固定された特異的結合メンバーを含 む免疫吸着ゾーン（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｉｎｇ　ｚｏｎｅ）を有する吸湿性支 持体を開示している。試験試料を免疫吸着ゾーンに添加し、この免疫吸着ゾーン においてア・ソセイ結果を読取る。

Ｗｅｎｇら（米国特許第４．７４０，４６８号及び第４゜８７９．２１５号）も また、結合ア・ソセイを実施するｔこめの試験ストリップ装置及び方法を記載し ている。該装置は、問題の被分析物質を含むと推定される試験試料と、被分析物 質に結合する標識特異的結合メンバーとを含む試験溶液に使用される。アッセイ は、標識結合メンバーに結合する固定第２結合メンバーと、未結合の標識結合メ ンバーをアッセイ系から除去する固定被分析物質類縁体とを必要とする。

Ｇｒｅｅｎｑｕｉｓｔら（米国特許第４，８０６，３１１号及び第４．８０６， ３１２号）は、Ｗ　ｅ　ｎ　ｇらのものに類似の、結合アッセイを実施するため の層状アッセイデバイスを記載しており、ここでは、被分析物質類縁体のような 第１固定試薬を使用して未結合物質を反応混合液から除去してから、反応混合液 を後続の検出層に通す。

Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ　（欧州特許公開筒０　２８４　２３２号）及びＣａｍｐ ｂｅ　Ｉ　Ｉら（米国特許第４，７０３，０１７号）は、色素を含むリポソーム からなる着色粒子を好ましい検出可能標識とする、特異的結合アッセイを実施す るアッセイ方法及び装置を記載している。Ｂａｈａｒら（米国特許第４，８６８ ，１０８号）は、試験試料がその中を輸送される複数ゾーンを含む支持体と酵素 ／基質検出手段とを使用する、特異的結合アッセイを実施するアッセイ方法及び 装置を記載している。Ｅｉｓｉｎｇｅｒら（米国特許第４，９４３，５２２号） は、試験試料が毛管作用によって輸送される複数ゾーンを含む大孔側方流動膜（ Ｉａｒｇｅ　ｐｏｒｅｄ　１ａｔｅｒａｌ　ｆｌｏｗ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使 用する、特異的結合アッセイを実施するアッセイ方法及び装置を記載している。

Ｕｌｌｍａｎら（欧州特許出願第８７３０９７２４．０号：公開筒０　２７１　 ２０４号）は、前出のＷ　ｅ　ｎ　ｇらの特許（米国特許第４，７４０，４６８ 号及び第４，８７９，２１５号）に関連している。Ｕｌｌｍａｎらは、被分析物 質類縁体と被分析物質を含むと推定される試験試料とを含む試験溶液の調製を記 載している。試験溶液を、２つ並んだ結合部位を有する吸湿性材料に接触させる 。第１結合部位は、被分析物質及び被分析物質類縁体に結合し得る特異的結合対 メンバーを含んでおり、第２結合部位は、第１結合部位において結合しなかった 被分析物質類縁体を結合し得る。

Ｃｅｒｎｙ　Ｅ、（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５１０２５３４号、公開筒Ｗ０　 ８６１０３８３９号）は、試験試料及び標識試験物質を含む試験溶液を、測定可 能な拡散パターンを与える固相を通して拡散させる結合アッセイを記載している 。得られた拡散パターンの直径は、標識試験物質単独の拡散パターンの直径より も大きい。

Ｚｕｋら（米国特許第４，９５６，２７５号）は、センサー装置によって被分析 物質を検出する方法及び装置を記載している。被分析物質関連シグナルをセンサ ー装置によってアッセイ装置の２力所以上で測定し、測定値間の数学的関係によ っである値（例えば差、比、勾配など）を得、これを既知量の被分析物質を含む 標準値と比較する。

Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ　（米国特許第４．０５９，４０７号）は、流体中の 被分析物質の半定量的測定のために生物試料中に浸漬し得る浸漬片装置を開示し ている。被分析物質の半定量的測定は、被分析物質の量の増加に応じて検出可能 な色（即ち陽性結果）を与える一連の試薬含有パッドを使用して行われる。米国 特許第３，８０２，８４２号、第３，９１５，６３９号及び第４，６８９，３０ ９号もまた浸漬片装置の領域で重要である。

Ｇｒｕｂｂら（米国特許第４，１６８，１４６号）は、抗原特異的抗体を共有結 合によってストリップに固定する、多孔質試験ストリップ材料の使用を開示して いる。試験ストリップを、抗原を含むと推定される溶液中に浸漬し、溶液を試験 ストリップ中で毛管作用により移動させる。抗原が試験ストリップを移動すると き、固定されている抗原特異的抗体に結合する。次いで、蛍光物質または酵素標 識を共有結合させた第２の抗原特異的抗体でストリップを濡らすことにより、抗 原の存在を判定する。定量試験は、結合抗原を含むストリップの長さを測定する ことにより行うことができる。かかる試験ストリップの変形として、米国特許第 ４，４３５，５０４号は２つの酵素指示薬系を使用するものを開示しており、米 国特許第４．５９４，３２７号は、空気／液体界面に隣接するストリップの領域 で赤血球細胞を凝固させる結合剤を全血試料に添加することを開示しており、ま た米国特許第４，７５７，００４号は、試験ストリップに沿って移動する流体の 前面の形状を制御する手段を開示している。アッセイ原理は、Ｚｕｋ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ａ　Ｑｕａ ｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ　Ｎｏ　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔａＬｉｏｎ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１ （７）・１１４４−１１５０．１９８５に更に記載されている。

ストリップタイプの診断装置の別の例としては以下のものを挙げることができる 。Ｓｗａｎｓｏｎら（欧州特許公開第０８８　６３６号）は、間隔を開けて連続 的に並べた所定数の反応ゾーンを含む流体浸透性固体媒質を含む、被分析物質の 定量分析のための装置を記載している。反応ゾーンは、被分析物質と反応して検 出可能なシグナルを生成し得る試薬を含む。検出可能なシグナルを生成したゾー ンの数が多いほど、試験試料中の被分析物質中の被分析物質の量は多いとされる 。Ｆｒｅｉｓｅｎら（米国特許第４゜８６１．７１１号）は、試料が通過すべき 幾つかの機能セクターを含むシート状診断装置を記載している。少なくとも１つ のセクターは、被分析物質または被分析物質結合体に対して生物学的親和性を有 する固定試薬を含んでいる。

Ｇｏｒｄｏｎら（米国特許第４，９５６，３０２号）は、被分析物質、試験試料 及び／または溶出溶剤を該デバイス中で単一方向に移動させ、それによって試薬 含有ゾーンまたは検出ゾーンと順次接触させることを特徴とする試験ストリップ 装置を記載している。Ｇｏｒｄｏｎら（米国特許第４．９６０，６９１号）は、 被分析物質、試験試料及び／または溶出溶剤を試薬含有ゾーン及び検出ゾーンに 所定の順序で導（ための１つ以上の境界付き経路を含む装置を記載している。

被分析物質を試験溶液から取り出すために種々の結合方法が使用されている。Ｂ ｏｌｚら（米国特許第４，０２０゜１５１号）は、試験試料中の抗原または抗体 の定量化のための固相アッセイを記載している。試料抗原または抗体をアニオン 交換樹脂のような固相支持体表面に直接吸着させ、次いで支持体を、試料抗原ま たは抗体に対して免疫的反応性を示す標識特異的結合メンバーに暴露する。

５ｃｈｉｃｋら（米国特許第４．１４５，４０６号）は、タンパク質に非特異的 に結合するイオン交換吸着剤の使用を記載している。Ｍａｒｓｈａｌｌら（米国 特許第４，２１１．７６３号）は、タンパク質を結合して凝集体を形成。

するアニオン交換樹脂を使用する、甲状腺機能を測定する方法を記載している。

Ｔａｂｂら（米国特許第４，３６２゜６９７号）は、増強物質としてビニルピロ リドンのコポリマーを使用する試験装置を記載している。Ｇｉｅｇｅｌら（米国 特許第４，５１７．２８８号）は、被分析物質特異的結合メンバーを多孔質媒体 に吸着または免疫学的に結合し、次いで被分析物質を多孔質媒体に適用すること が必要なりガントアッセイを実施する方法を記載している。

他のアッセイ方法は、補助的な特異的結合メンバーの使用を含む。Ｔａｎｓｗｅ 　１１ら（米国特許第４．６４２，９３０号）は、抗原を３種のレセプターと一 緒にインキュベートすることにより多価抗原の存在を判定する方法を記載してい る。３種のレセプターは、第１及び第３レセプターが抗原に結合し、固体支持体 に結合された第２レセプターが第ルセブターに特異的に結合するものである。Ｖ ａｌｋｉｒｓら（米国特許第４，７２７，０１９号）は、Ｔａｎｓｗｅ　Ｉ　Ｉ らのごとく、抗レセプター（例えばアビジン）を多孔質メンバー上に固定し、標 的リガンドに結合させたレセプター（例えばビオチンに結合させた被分析物質特 異的抗体）に結合する、リガンド−レセプターアッセイの方法及び装置を記載し ている。Ｗｏｌｔｅｒｓら（米国特許第４．３４３，８９６号）は、検出可能な 結合体を生成または完成するために補助の特異的結合メンバーを使用すること、 即ち検出可能な被分析物質−結合メンバー結合体を完成するために結合アッセイ において第３の抗体を使用することを記載している。Ｗ、Ｇｅｏｒｇｈｅｇａｎ 　（米国特許第４．８８０，７５１号）は、選択した１ｇ０分子のＦ（ｃ）部分 を帯電表面に吸着させることにより免疫吸着マトリックスを作製する方法を記載 している。Ｐａｒｔｋｈら（米国特許第４．２９８，６８５号）は、ビオチンと 抗被分析物質抗体の結合体を、アビジンが固定された不活性支持体と一緒に使用 することを記載している。アビジン成分及びビオチン成分の特異的結合によって 抗体を不活性支持体上に固定することができる。

別の分離方法としては、磁性固相の使用、重合技術、及び未結合の被分析物質と は異なる特性を有する被分析物質結合体の形成を挙げることができる。Ｕｌｌｍ ａｎら（米国特許第４，９３５，１４７号）は、帯電非磁性懸濁粒子を液体媒質 から、粒子を帯電磁性粒子及び化学試薬と接触させることにより分離する方法を 記載している。化学試薬は、磁性粒子と非磁性粒子との間で非特異的結合を形成 して磁性凝集体を生成する。反応容器に磁場勾配を印加し、凝集体を容器の一方 の側に集め、次いで液体媒質をデカントする。

Ｌｏｎｇｏｒｉａら（米国特許第４，９４８．７２６号）は、抗原分子と抗体分 子を反応させ、個々の分子のイオン電荷とは異なる固有のイオン電荷を示す抗原 ／抗体結合体を形成することを含むアッセイ方法を記載している。濾紙マトリッ クスを、抗原／抗体結合体に対する固有の親和性において選択する。Ｍ　ｉ　ｌ 　ｂ　ｕ　ｒ　ｎら（米国特許第４．９５９．３０３号）は、試験試料由来の抗 原及び該抗原に特異的な抗体を、抗原が抗体に結合したときにその抗体が支持体 に結合するのに十分な条件下でインキュベートする。

Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ　（米国特許第４，８３９゜２３１号）は、まず 、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルのようなゲル中で標的タンパク質を分離また は単離し、次いで、単離タンパク質を固定用の被膜支持体の表面に移送すること を含む、２段階タンパク質固定方法を記載している。

被膜支持体は、（負電荷基を有する）化学的に不活性な支持体材料を（正電荷基 を有する）ポリビニルピリジンまたはポリブレンの溶液と接触させることにより 作製される。

正電荷ポリマーが支持体材料の負電荷基とイオン結合を形成し得ることにより、 支持体上に不溶性ポリマー薄膜が形成される。

Ｍｏｎｊｉら（米国特許第４，７８０，４０９号）は、試験溶液の温度または塩 濃度を適当なレベルに調整すると該溶液から沈殿する感温性または感塩性（ｓａ ｌｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ポリマーに結合させた反応物質を記載している。Ｍ ａｒｓｈａｌｌ（米国特許第４，５３０，９００号）は、可溶性ポリマーに結合 させた反応物質を記載しており、該ポリマーは溶液から取り出すために不溶性に され、濾過または遠心によって試験溶液から物理的に取り出される。

Ｍａｒｓｈａｌｌは、反応物質−ポリマー結合体を不溶性にするために、溶液の ｐＨを低下させるかまたはＭｏｎｊｉらのごとく塩を加えるかの２つの手段を開 示している。

Ｍａｒｓｈａｌｌは更に、不溶化した結合体を沈殿させ、試験溶液から取り出し 、最後に再度可溶化して第２の溶液を形成してから、被分析物質を検出すること を記載している。

従来技術の再検討から理解されるように、試験ストリップ分野は極めて活発であ る。所望のアッセイを実施するのに操作ステップを僅かしかまたは全く必要とし ない装置、比較的未熟な者でも使用し得る装置、及びアッセイ実施方法の変化に 最小限にしか影響されない結果を与える装置に対する要求が高まっている。得ら れた検出シグナルを観察するのが容易であること、及び検出部位に固定されたい かなるシグナル物質をも、検出部位を通過したシグナル物質から区別することが 容易であることも考慮される。更に、“汎用”装置、即ち装置の製造時に使用さ れる試薬ではなくてアッセイ実施時に使用される試薬によって使用可能性が規定 されるアッセイ装置を製造し得る装置製造フォーマットが長い間追究されている 。

発明の概要 本発明は、試験試料中の被分析物質の存在または量を判定するための新規の２ス テップ結合アッセイ法を提供する。

該アッセイは、ポリマーアニオン性物質に結合した第１結合メンバーを含む捕獲 剤と、検出可能な標識を有する第２結合メンバーを含む指示薬と、窒素含有量が 約２％以上のポリマーカチオン性物質でできた反応部位を含む固相材料とを必要 とする。捕獲剤及び指示薬の特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイ、競 合アッセイまたは間接アッセイにおいて被分析物質と一緒に結合体を形成し、そ れによって試験試料中の被分析物質の存在または量に応じて検出可能な結合体を 形成するように選択される。

固相を捕獲剤及び試験試料と接触させると、固相のポリマーカチオンが捕獲剤の ポリマーアニオンを引き付は且つそれに結合し、従って捕獲剤及びその結合体が 固相上に固定される。次いで固相を指示薬と接触させると、指示薬が、試験試料 中に存在する被分析物質の量に応じた量で固定されている捕獲剤またはその結合 体に結合する。一般的には、固相に付着した指示薬を検出し、試験試料中の被分 析物質の存在または量を判定する。或いは、未結合のままの指示薬を検出するこ ともできる。

本発明の２ステツプアツセイは、ポリマーカチオン性物質が、対イオンを除き窒 素含有量が約２％以上の第四級アンモニウムポリマー化合物である場合に有利に 実施される。

このようなポリカチオン性物質を使用すると、何回も洗浄ステップを受けても捕 獲剤を引き付は且つ保持する能力を失うことのない固相が与えられる。

別の実施態様においては、アッセイ方法は更に、シグナル生成試薬を指示薬に添 加し、試験試料中の被分析物質の存在または量を示す検出可能なシグナルを生成 することを含む。更に別の実施態様においては、アッセイ方法は補助特異的結合 メンバー試薬の添加を含む。間接アッセイ方法においては、補助特異的結合メン バーが、被分析物質を結合し得ると共に指示薬または捕獲剤にも結合し得る。

本発明によって更に、特異的結合アッセイに使用するための汎用固相装置の製造 が可能になる。種々の被分析物質に対するアッセイ法において、通常の流通装置 及び試験ストリップ装置に見られる特定の被分析物質のみを結合し得る固定結合 メンバーではなく、アニオン性またはカチオン性捕獲ポリマーの所定のゾーンを 含む同じ固相材料を使用することができる。

捕獲剤の特異的結合メンバー成分はハブテンまたは高分子とすることができる。

帯電捕獲剤によって、混合液を反対の電荷を有する固相と接触させることにより 反応結合体を反応混合液から取り出すことができる、均一アッセイ及び分離反応 が可能になる。実質的に全ての結合アッセイ（サンドイッチアッセイ、競合アッ セイ、間接アッセイ、補助特異的結合メンバー使用のアッセイ、阻害アッセイな ど）を、本発明の新規の捕獲剤及びイオン捕獲法を使用するよう適合させること ができる。

本発明は、特異的結合アッセイ分野に２つの主要な進歩をもたらす；ａ）液相反 応（ｌｉｑｕｉｄ　ｐｈａｓｅｋｉｎｅｔｉｃｓ）を使用することにより被分析 物質及びアッセイ試薬特異的結合メンバーの均一混合液から結合体が容易に形成 される、及びｂ）イオン捕獲法によって固体支持体上に固定され得る結合体の数 が増大する。液相反応の有益性をめないならば、本発明は更に、吸収、吸着また は共有結合以外の方法によって結合メンバーを固相上に固定する有効な方法を提 供する。

本発明の新規の捕獲剤は、分離操作に使用することもできる。試料から分離すべ き被分析物質を含む液体試料を捕獲剤と混合し、反応させ、帯電した被分析物質 ／補獲剤結合体を形成する。特異的結合反応に次いで、溶液を、新たに形成され た結合体を引き付け、そこに結合し、そして液体試料から分離する、反対の電荷 を有する固相に接触させる。

発明の詳細 な説明のアッセイ方法及び試薬は種々のイムノアッセイ形式に使用することがで きる。しかしながら、本発明はイムノアッセイに制限されることはない。被分析 物質とアッセイ試薬との間の特異的結合反応を使用する任意のアッセイを実施す ることができる。

定義 以下の定義が本発明に適用可能である。

本明細書における“特異的結合メンバー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　 ｍｅｍｂｅｒ）”なる用語は、特異的結合対、即ち一方の分子が化学的または物 理的手段によって第２の分子に特異的に結合する２つの異なる分子のメンバーを 指す。特異的結合対の相補的メンバーは、リガンド及びレセプターと称すること もできる。抗原及び抗体というよく知られた特異的結合対の例のほかに、以下の ものを特異的結合対の例として挙げることができる：ビオチンとアビジン、炭水 化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列（標的核酸配列を検出するためのＤ　 Ｎ　Ａ　／１イブリダイゼーションアッセイに使用されるプローブ及び捕獲核酸 配列を含む）、相補的ペプチド配列（組換え法によって形成されたものを含む） 、エフェクター分子とレセプター分子、ホルモンとホルモン結合タンパク質、補 酵素（ｅ　ｎ　ｚ　ｙｍｅ　ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）と酵素、酵素阻害物質と酵素 など。更に、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類縁体であるメンバー を含み得る。例えば、被分析物質と共通の少なくとも１つのエピトープを有する 限りは、被分析物質の誘導体またはフラグメント（被分析物質類縁体）を使用す ることができる。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、抗原、ハプテン、抗 体、及び組換えＤＮＡ法またはペプチド合成によって形成されるものを含むこれ らの結合体を挙げることができる。抗体は、モノクローナルもしくはポリクロー ナル抗体、キメラ抗体、組換えタンパク質、またはこれらの混合物もしくはフラ グメント、並びに抗体と他の特異的結合メンバーとの混合物であり得る。かかる 抗体の製造及び特異的結合メンバーとして使用する上でのそれらの適合性の詳細 は当業者にはよ（知られている。

本明細書における“ハプテン”なる用語は、抗体に結合することはできるが、担 体タンパク質に結合しないと抗体形成を誘導できない部分抗原または非タンパク 質結合メンバーを指す。

本明細書における“試験試料”なる用語は、実質的に全ての液体試料を指す。試 験試料は、体液、例えば血液、唾液、涙（ｏｃｕｌａｒ　１ｅｎｓ　ｆｌｕｉｄ ）、を髄液（ｃｅｒｅｂｒａｌ　５ｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ）、汗、尿、乳、腹 水、粘液、滑液、腹膜液、羊水など任意の所望の供給源から得ることができる。

液体試験試料は、血液から血漿を調製したり、粘性液体を希釈するなど、使用前 に前処理を行なうことができる。前処理方法としては、分離、濾過、蒸留、濃縮 、妨害性成分の不活性化、試薬の添加を挙げることができる。体液のほかに、水 、食品などの他の液体試料を使用することもできる。更に固体試験試料は、液体 媒質に変換すれば、それを使用することができる。

本明細書における“被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）”なる用語は、本発明によっ て試験試料中で検出すべき、またはそれから分離すべき物質を指す。被分析物質 は、その天然の特異的結合メンバーが存在するかまたはその特異的結合メンバー を調製し得る任意の物質であり得る。更に、被分析物質は２種以上の特異的結合 メンバーに結合し得る。

“被分析物質”としては、抗原性物質、ノ１ブテン、抗体、及びこれらの組合せ を挙げることもできる。このような被分析物質としては、限定的ではないが、タ ンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で 投与されるもの及び不正に投与されるものを含む薬物、細菌、ウィルス、及び、 これらの物質の代謝物またはそれに対する抗体を挙げることができる。

本明細書における“被分析物質類縁体”なる用語は、被分析物質に特異的な結合 メンバーと交差反応する物質を指すが、被分析物質類縁体は結合メンバーと、被 分析物質自体より高度にまたは低度に反応し得る。被分析物質類縁体は、それが 問題の被分析物質と共通の少な（とも１つのエピトープ部位を有する限りは、変 性被分析物質及び被分析物質分子のフラグメントまたは合成部分であり得る。

本明細書における“標識”なる用語は、特異的結合メンバーに直接または間接的 に結合し、目視または装置によって検出可能なシグナルを生成し得る任意の物質 を指す。本発明に使用するのに適当な種々の標識としては、色原体；触媒；蛍光 化合物：化学ルミネセンス化合物；放射性標識：金属及び非金属コロイド粒子、 色素粒子、酵素もしくは基質、または有機ポリマーラテックス粒子を含む直接可 視標識；シグナル生成物質を含むリポソームまたは他のビヒクルなどを挙げるこ とができる。

標識として使用するのに適した多数の酵素が米国特許第４．２７５．１４９号の カラム１９〜２３に記載されており、この特許の開示内容は参照により本明細書 の一部を構成するものとする。例えば、本発明に有効な酵素／基質シグナル生成 系は、酵素としてアルカリ性ホスファターゼを、基質としてニトロブルーテトラ ゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートまたはその誘 導体もしくは類縁体を含む。

別のシグナル生成系においては、標識を蛍光化合物とすることができるが、この 場合、検出可能なシグナルを生成するために標識の酵素作用は必要でない。フル オレセン、フィコビリタンパク質、ローダミン並びにこれらの誘導体及び類縁体 といった蛍光分子が、この系の標識として使用するのに適している。

本発明の特に好ましい実施態様においては、可視検出可能な着色粒子を指示薬の 標識成分として使用し、他のシグナル生成試薬を添加する必要なしに、試料中の 被分析物質の存在または濃度を着色度から直接読取ることができる。

着色粒子として使用される材料は、米国特許第４，３１３゜７３４号及び第４． ３７３，９３２号に記載のごとく、金のようなコロイド金属及び色素粒子であり 、この特許の開示内容は参照により本明細書の一部を構成するものとする。

セレンコロイド粒子のような非金属コロイド粒子の調製及び使用が米国特許第４ ，９５４，４５２号に開示されており、この特許の開示内容は参照により本明細 書の一部を構成するものとする。イムノクロマトグラフィーにおけるコロイド粒 子標識の使用は、本出願人による１９８７年７月１３日出願の同時係属米国特許 出願第０７２，４５９号に開示されており、この特許の開示内容は参照により本 明細書の一部を構成するものとする。標識として使用する有機ポリマーラテック ス粒子は、本出願人による１９８８年９月２３日出願の同時係属米国特許出願第 ２４８．８５８号に開示されており、この特許の開示内容は参照により本明細書 の一部を構成するものとする。

本明細書における“シグナル生成成分”なる用語は、被分析物質または他のアッ セイ試薬と反応し、被分析物質の存在または量を示すと共に目視または装置によ って検出可能な反応生成物またはシグナルを生成し得る任意の物質を指す。本明 細書における“シグナル生成系”なる用語は、所望の反応生成物またはシグナル を生成するために使用される一部の反応試薬を指す。例えば、１種以上のシグナ ル生成成分を使用し、標識と反応させて検出可能なシグナルを生成することがで きる。例えば標識が酵素であるならば、該酵素を１種以上の基質または追加酵素 と反応させて検出可能な反応生成物を生成することにより、検出可能なシグナル が増幅される。

本明細書における“指示薬”なる用語は、標識に結合しているかまたは標識に結 合する特異的結合メンバーを指す。

指示薬は検出可能なシグナルを、試験試料中の被分析物質の量に関係するレベル で生成する。一般に指示薬は、固相材料に捕獲させてから検出または測定するが 、未結合の指示薬を測定してアッセイ結果を判定することもできる。

指示薬の特異的結合メンバーは、サンドイツチア・ツセイにおいては被分析物質 、競合アッセイにおいては捕獲剤、また検出可能な複合体を完成するためには補 助特異的結合メンバーに結合し得る。前述したように、標識によって指示薬は、 試験試料中の被分析物質の存在または量に関係する検出可能なシグナルを生成す ることができる。指示薬の特異的結合メンバー成分によって、標識は、被分析物 質、補助特異的結合メンバーまたは捕獲剤に間接的に結合される。特定の標識の 選択は限定的ではな（、標識は、例えば着色有機ポリマーラテックス粒子により て生成される可視検出可能なシグナルのような単独で検出可能なシグナル、また は酵素／基質シグナル生成系のような１つ以上の追加シグナル生成成分と併用し て検出可能なシグナルを生成し得る。標識または特異的結合メンバーを変えるこ とにより種々の指示薬を形成することができる。選択には検出すべき被分析物質 及び所望の検出手段を考慮する必要があることは当業者には理解されよう。

上述したように、標識はアッセイの過程で特異的結合メンバーに結合することが できる。例えばビオチニル化抗被分析物質抗体は標識ストレプトアビジン分子と 反応することができる。結合メンバー及び標識を適当に組み合わせて使用するこ とができる。

本明細書における”捕獲剤（ｃａｐｔｕｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）”なる用語は、 帯電物質に結合した非標識特異的結合メンバーを指す。成分の結合は実質的に不 可逆的であり、共有結合を含み得る。特異的結合メンバーは、帯電物質への結合 が結合メンバーの結合部位を妨害しない限りは、ハプテンまたは小ペプチドのよ うな小分子であり得る。捕獲剤の結合メンバー成分は、サンドイッチアッセイに おいては被分析物質に、競合アッセイにおいては指示薬または被分析物質に、ま たは、それ自体も被分析物質に特異的である補助特異的結合メンバーに特異的で ある。

捕獲剤の帯電物質成分としてはアニオン性及びカチオン性のモノマーまたはポリ マーを挙げることができる。例えばアニオン性ポリマーとしては、ポリグルタミ ン酸（ＰＧＡ）、アニオン性タンパク質もしくは誘導タンパク質（例えばアルブ ミン）、アニオン性多糖（例えばヘパリンまたはアルギン酸）、ポリアスパラギ ン酸、ポリアクリル酸、及び、特異的結合反応に適当なｐＨ（例えばｐＨ４〜１ ０）で正味負電荷を有するポリアミノ酸を挙げることができる。

更に、特異的結合メンバーを１つ以上の帯電モノマーまたはポリマーに結合し、 捕獲剤に伴なう正味電荷を増大することができる。

本発明の新規の捕獲剤を使用し、被分析物質及び／または指示薬を他のアッセイ 試薬及び残りの試験試料成分から実質的に分離することにより、検出可能なシグ ナルの観察が容易になる。最も有利な使用においては、捕獲剤を試験試料及びア ッセイ試薬と均一反応混合液中で反応させる。

所望の特異的結合メンバー結合体を形成した後、捕獲剤を含む結合体を、均一反 応混合液を捕獲剤の電荷とは反対の電荷を有する固相に接触させることにより均 一反応混合液から取り出す。

本発明の１つの実施態様においては、選択した特異的結合メンバーを、一般式： 〔式中、ｎは約１０〜約５００であり；２は約１〜約６であり：ＷはＨ＋、Ｎａ ”、Ｋ”、Ｌｉ”、Ｈ”Ｎ　Ｒ、のごときアミン塩及びその誘導体から選択され ：Ｘは、特異的結合メンバーとポリマーの化学結合を可能にする反応基を有する 実質的に任意の反応基または部分である〕で表される１つ以上の活性化アニオン 性ポリマー分子及びその結合ベースに結合することにより、負電荷を有する捕獲 剤を作製することができる。“Ｘ”は、アミン反応基もしくは部分、チオール反 応基もしくは部分、または、−Ａ−３Ｈ［ここでＡはスペーサーアームである〕 で表されるチオール基もしくは部分であり得る。例えば、アミノ基を有する特異 的結合メンバーを、アミン反応性部分を有する活性化ＰＧＡアニオン性分子に結 合することができる。アミン反応性部分によって、活性化ポリマーを特異的結合 メンバー上のアミノ基へ結合することができる。アミン反応性部分としては、限 定的ではないが、式：％式％ 〔式中、ｍは２または３であり、Ｒ′は硫黄安定剤であり、Ｒ“は脂肪族または アリール基である〕で表されるものを挙げることができる。硫黄安定剤としては 、限定的ではないが、２−ピリジル基、４−ピリジル基及び５−ニトロ−２−ピ リジル基を挙げることができる。

“Ａ”は、限定的ではないが、炭素、窒素、硫黄及び酸素原子鎖並びにこれらの 組合せ、例えばポリエーテル、ポリメチレン及びポリアミドを含む約１〜約３０ 個の原子からなるスペーサー、或いはフェニルチオカルバミルのような芳香族ス ペーサーを表わす。

或いは、チオール基を有する特異的結合メンバーを、チオール反応性部分を有す る活性化ポリマーに結合することもできる。チオール反応性部分としては、限定 的ではない〔式中、Ａは前述のごとき約１〜約３０個の原子からなるスペーサー である〕 で表されるものを挙げることができる。更に別の態様においては、チオール反応 基を有する特異的結合メンバーを、−Ａ−３Ｈのようなチオール部分を有する活 性化ポリマーと結合することができる。

典型的には後記実施例の負電荷を有する捕獲剤は、所望の特異的結合メンバーを 、修飾末端アミノ基を有する活性化ＰＧＡ分子と反応させることにより形成した 。簡単に述べると、修飾方法は、１）ＰＧＡを溶剤（例えばジオキサン、ジメチ ルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノン及びジメチルスルホキシドのよ うな水混和性非プロトン性溶剤）中に溶解し；２）滴定カルボン酸当たり約１当 量のプロトン吸収剤（例えば４−メチルモルホリン）を加え；３）約２〜約１０ ０モル過剰量のアミン反応性変性剤（例えばジメチルホルムアミド中に溶解した １、４−フェニレンジイソチオシアネート）を加え；４）混合液を反応させ：及 び５）未反応のアミン反応性変性剤を除去することを含む。適当なプロトン吸収 剤としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムと いったアルカリ金属水酸化物や、４−メチルモルホリン及びトリエチルアミンと いった第三級アミンを挙げることができる。

アニオン性ポリマー分子または特異的結合メンバーは、１つ以上のアミノ、カル ボキシルまたはチオール基を含むか、またはアミノ、カルボキシルまたはチオー ル基を取込むことにより活性化することができ、それによって特異的結合メンバ ーをアニオン性ポリマー分子と化学的に架橋し得る。“活性化種（ａｃｔｉｖａ ｔｅｄ　５ｐｅｃｉｅｓ）”とは、架橋または他の活性化剤の取込みにより反応 基を含んだ特異的結合メンバー及びアニオン性ポリマー分子を指す。アミン反応 性変性剤は、特異的結合メンバーまたはアニオン性ポリマー分子を“活性化”す る、即ち特異的結合メンバーまたはアニオン性ポリマー分子を化学的架橋に対処 するために使用されるサブクラスの試薬である。活性化剤としては、チオラン（ 例えば２−イミノチオラン）、スクシンイミジルメルカプトアセテート（例えば Ｎ−スクシンイミジル−８−アセチルメルカプトアセテート）、及び後でチオー ルに還元されるジスルフィド化合物といったチオール導入剤を挙げることができ る。チオール導入剤を使用し、後でチオール反応性基と反応させるために、特異 的結合メンバー及び固相材料を活性化することができる。

アミン反応性変性剤としては、限定的ではないが、特異的結合メンバーとアニオ ン性ポリマー分子との化学的架橋を可能にする二官能性架橋剤またはカップリン グ剤、例えば無水コハク酸類縁体、イミノチオラン類縁体、ホモニ官能剤及びヘ テロニ官能剤を挙げることができる。ホモニ官能剤の例は式Ｘ−Ａ−Ｘ　［ここ でＸはアミン反応性基であり、Ａは約１〜約３０個の原子からなるスペーサーで ある〕で表すことができる。ヘテロニ官能剤の例は式Ｘ−Ａ−Ｙ〔ここでＸはア ミン反応性基であり、Ｙはチオール反応性部分、チオール部分またはチオール前 駆体であり、Ａは前述のごとき約１〜約３０個の原子からなるスペーサーである 〕で表すことができる。タンパク質の活性部位にシスティン残基を有するタンパ ク質特異的結合メンバーは、カップリング剤を添加することによりその活性が低 下され得るので、タンパク質をカップリング剤と反応させる前に、活性部位にあ るシスティン残基を当分野において周知の手段によって保護する必要がある。

本明細書における“カップリング剤“なる用語は、二官能性架橋剤またはカップ リング剤、即ちスペーサーによってつながれている２つの反応基または“末端” を含む分子を包含する。反応性末端は、限定的ではないが、アミノ反応性末端（ 例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ８）活性エステル、イミドエステル 、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、イソシアネート、イソチオ シアネート及びハロゲン化ニドロアリール）；及びチオール反応性末端（例えば ピリジルジスルフィド、マレイミド、チオフタルイミド、及び活性ハロゲン）を 含む種々の官能基のいずれかとし得る。ヘテロニ官能性架橋剤は２つの異なる反 応性末端、例えばアミノ反応性末端とチオール反応性末端とを有するが、ホモニ 官能剤は２つの同種の反応性末端を有しており、それには例えば、スルフヒドリ ル含有化合物を架橋し得るビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びＮＨＳホモニ 官能性架橋剤（例えばジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）並びに水溶性類 縁体）、スルホ−ＮＨＳエステル（Ｐｉｅｒｃｅ　１９８９　Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃａｔａｌｏｇ；Ｐｉｅｒｃｅ。

Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を挙げることができる。

他の市販のホモニ官能性架橋剤としては、限定的ではな□いが、例えばジメチル アジピミデートジヒドロクロリド（ＤＭＡ）　、ジメチルピメリミデートジヒド ロクロリド（ＤＭＰ）及びジメチルスベリミデートジヒドロクロリド（ＤＭＳ） といったイミドエステルを挙げることができる。

イミノチオラン類縁体は一般式： 〔式中、Ａは約１〜約５個の原子からなるスペーサー〕で表わされ、例えば２− イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）である。

本発明に使用するのに適した市販のへテロニ官能剤としルカップリング剤、例え ばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＭＢ Ｓ）；スクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェ ニル）ブチレート（ＳＭＰＨ）及び、スルホスクシンイミジル誘導体を含むその 誘導体（例えばスルホスクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シク ロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ））；ｍ−マレイミドベ ンゾイル−スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）及びスルホスクシ ンイミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＨ） （Ｐｉｅｒｃｅ）を挙げることができる。他の適当なヘテロニ官能剤としては、 Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）といった市販の活性ハロゲン−ＮＨ ８活性エステル力・ツブリング剤や、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセ チル）アミノベンゾエート（スルホ−８ＩＡＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ）といったスル ホスクシンイミジル誘導体を挙げることができる。別のグループのカップリング 剤としては、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー ト（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ）といったヘテロ二官能性チオール切断性剤を挙 げることができる。

更に別のグループのカップリング剤としては、本出願人による同時係属米国特許 出願第２５４，２８８号（１９８８年１０月１１日出願）及び第１１４．９３０ 号（１９８７年１０月３０日出願）に記載の長鎖ヘテロニ官能性カップリング剤 を挙げることができる。これら２つの特許出願の開示内容は参照により本明細書 の一部を構成するものとする。長鎖ヘテロ官能性カップリング剤としては、スベ ー〔式中、アミノ酸は、直鎖状の３〜１０個の炭素原子を有する置換または未置 換のアミノ酸であり、ｎは１〜１０であり：Ｒはアルキル、シクロアルキル、ア ルキル−シクロアルキルまたは芳香族カルボキシル環である〕で表わされるマレ イミド−Ｎ　ＨＳ活性エステル剤を挙げることができる。アルキル−シクロアル キルなる用語は、アルキル基がシクロアルキルをマレイミドまたはカルボニル基 に結合している、シクロアルキル環構造に結合しているアルキル基を含む。アル キルなる用語は、直鎖または分枝鎖アルキル基、好ましくは１〜６個の炭素原子 を有する低級アルキル基を含む。

スペーサーが存在する場合、スペーサーは、非反応性であり、安定であり、且つ それと一緒に使用される被分析物質または他の特異的結合メンバーに非結合性で ある任意の分子鎖とすることができる。スペーサーの長さは変化させることがで き、単一原子の大きさから、米国特許出願第２５４．２８８号及び第１１４．９ ３０号に記載の大きさまたはそれ以上の範囲とすることができる。

アミン反応性変性剤、チオール導入剤または他の活性化剤の選択は限定的ではな いが、当業者は、診断ア・ソセイに使用される特定のアニオン性ポリマー分子及 び特異的結合メンバーと一緒に使用するのに適したまたは好ましくＸ￥ｌＪ質が 判るであろう。従って、所与のアッセイに使用される力・ツブリング剤または活 性化剤は通常は経験的に決定されることが当業者には理解されるであろう。

ペテロ官能剤の適当なチオール反応性部分として（ま、限定的ではないが、式。

で表されるものを挙げることができる。

適当なチオール前駆体部分としては、限定的ではないが、式： で表わされるものを挙げることができる。

適当なアミン反応性部分としては、限定的ではないが、式： 〔式中、ｍは２または３であり、Ｒ′は前述のごとき硫黄安定化剤であり、Ｒ” は脂肪族またはアリール基である〕で表わされるものを挙げることができる。

本発明の更に別の実施態様においては、アミン反応性基を有する特異的結合メン バー（例えば活性化特異的結合メンバー）を、アニオン性ポリマー分子の末端ア ミノ基に結合することができる。簡単に述べると、結合方法の例は、１）ＰＧＡ を溶剤（例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジ ノン及びジメチルスルホキシドのような水混和性非プロトン性溶剤）中に溶解し ；２）滴定カルボン酸当たり約１当量のプロトン吸収試薬（例えば水酸化ナトリ ウム、水酸化カリウムもしくは水酸化リチウムのようなアルカリ金属水酸化物ま たは４−メチルモルホリンもしくはトリエチルアミンのような第三級アミン）を 加え；３）約２〜約１ｏｏモル過剰量のアミン反応性特異的結合メンバー（例え ばホスゲン活性化フェニルジクリジンまたはフェニルジクリジン−４−クロロホ ルメート）を加え；４）混合液を反応させ；及び５）未反応のアミン反応性特異 的結合メンバーを除去することを含む。

特異的結合メンバー上の適当なアミン反応性基の例としては、限定的ではないが 、 〔式中、Ａは前述のごとき約１〜約３０個の原子からなるスペーサーであり、ｍ は２または３であり、Ｒ′は硫黄安定化剤であり、Ｒ”は脂肪族またはアリール 基である〕を挙げることができる。

負電荷を有する捕獲剤の調製例は、アミノ基を有する特異的結合メンバー（ＳＢ Ｍ）とアミノ反応性部分を有する活性化ＰＧＡとを反応させることを含む。得ら れる反応及び反応生成物は以下のように表わすことができる。

本発明の更に別の実施態様においては、捕獲剤に使用するのに好ましいアニオン 性ポリマーは、種々のイムノアッセイ構成における特定の効力から、カルボキシ メチルアミロース（ＣＭＡ）である。ＣＭＡを含む捕獲剤の優れた効力は、カチ オン性固相に対するＣＭＡ捕獲剤の親和力（ａｖｉｄｉｔｙ）がより高いことに 起因し得る。このことは、指示薬のカチオン性固相への非特異的結合をブロック するためにポリアニオンを使用する２ステップサンドイッチアッセイ形式におい ては特に有利である。

本明細書における“補助特異的結合メンバー”なる用語は、捕獲剤及び指示薬の 特異的結合メンバーのほかに、アッセイに使用される特異的結合対のメンバーを 指す。例えば成るアッセイにおいては、補助特異的結合メンバーが被分析物質を 、被分析物質だけでは結合できない第２特異的結合メンバーに結合させることが できるし、また阻害アッセイにおいては、補助特異的結合メンバーが基準結合メ ンバーとなり得る。１つのアッセイに１種以上の補助特異的結合メンバーを使用 することができる。

本明細書における“固相”なる用語は、不溶性であるかまたは後続反応によって 不溶性にし得る任意の物質を指す。

固相は、その固有電荷及び捕獲剤を引き付ける能力において選択し、例えばメチ ル化ウール、ナイロン、及び正電荷を有する特殊ガラスとすることもできる。或 いは、捕獲剤の帯電物質とは反対の電荷を有する帯電物質で固相を前処理して電 荷を保持せしめることができる。例えば、アニオン性物質を特異的結合メンバー に結合して捕獲剤を形成し、カチオン性物質を固相に適用してそこに把持させて もよいし、この逆でもよい。

天然材料、合成材料または合成変性された天然材料をカチオン性物質として使用 することができる。第三級及び第四級アンモニウム化合物及びアンモニウム化合 物の誘導体を含む広範な特許ポリカチオンが入手可能である。このようなポリカ チオン性材料としては、限定的ではないが、ヘキサジメトリンプロミド（Ｐｏｌ ｙｂｒｅｎｅ　（登録商標）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ 、Ｓｔ。

Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ）　、ＧＡＦＱｕａ　ｔ　（商標）第四級アンモニウム化 合物（ＧＡＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｙｎｅ、ＮＪ、０７４７０）、ジ エチルアミノエチル−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（ 登録商標）化合物（ジメチルジアリルアンモニウムクロリドのカチオン性ホモポ リ？−；Ｃａ１ｇｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ ）及び水溶性セルロース誘導体、例えばジアリルジメチルアンモニウムクロリド −ヒドロキシエチルセルロースポリマー（Ｃｅｌｑｕａｔ（登録商標）Ｌ−２０ ０ポリマー第四級アンモニウム化合物及びＣｅ１ｑｕａｔ　（登録商標）Ｈ−１ ００ポリマー化合物、Ｎａｔｉｏｎａｌ　５ｔａｒｃｈ　＆　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ、０８８０７）を挙 げることができる。

ジメチルジアリルアンモニウムクロリドのカチオン性ホモポリマー及び窒素含有 量が約２％以上（対イオンは除く）の他のポリカチオン性物質は、アッセイ過捏 で洗浄される固相を製造する上で特に有利であることが意外にも見いだされた。

このようなポリカチオン性物質を使用して適当に帯電した固相を製造すると、反 対の電荷を有する捕獲剤を引き付は且つ保持する能力を失うことなく、固相の操 作性をさらに向上することができる。窒素含有量が約５％以上（対イオンは除く ）のポリカチオン性物質はより好ましく、窒素含有量が約１０％以上（対イオン は除く）の物質は最も好ましいことが判った。

イオン捕獲法に基づくアッセイ装置は多数の形状を有することができるが、その うちの幾つかは固相として選択する材料に依存する。種々の装置の実施態様にお いて、固相は、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微粒子、磁性粒子、チューブ 、シート、プレート、スライド、ウェル、テープ、試験管、層状フィルムなど、 または固有の電荷を有するかもしくは帯電物質を保持し得る他の任意の材料を含 み得る。

本発明の新規のイオン捕獲装置は、任意の適当な多孔質材料でできた固相を含む 。“多孔質”とは、試験試料が毛管作用または吸上作用によって容易に通過し得 る材料を指し、吸湿性及び非吸湿性の両固相材料を含む。例えば固相としては、 １種以上のアッセイ試薬を含む１つ以上の層を有する流通アッセイ（ｆｌｏｗ− ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｓｓａｙ）装置に使用するためのファイバーガラス、セルロ ースもしくはナイロンバッド；浸漬及び読取リア・ソセイ用の浸漬片：吸上もし くは毛管作用のための試験ストリ・ツブ（例えば濾紙、ニトロセルロース、ポリ エチレン）；または当業者には周知の他の多孔質もしくは連続細孔材料（例えば Ｐｏｒｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ。

ｒａｔ　ｉｏｎ、Ｆａｉｒｂｕｒｎ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡによって製造され ているようなポリエチレンシート材料）を挙げることができる。

天然材料、合成材料または合成変性した天然材料を、多糖を含む固相として使用 することができ、例えば紙のようなセルロース材料；セルロースアセテート及び ニトロセルロースのようなセルロース誘導体ニジリカ；塩化ビニル、塩化ビニル ーブロビレンコポリア−１及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーといった多孔 質ポリマーマトリ・ソクス中に均一に分散された、不活化アルミナ、ケイ藻土、 ＭｇＳＯ４といった無機材料または他の無機微粉砕材料、天然（例えば綿）また は合成（例えばナイロン）の布；多孔質ゲル（例えばシリカゲル、アガロース、 デキストラン及びゼラチン）、ポリマーフィルム（例えばポリアクリルアミド） などを挙げることができる。固相は、適当な強度を有するかまたは支持体によっ て強度を与えるべきであるが、支持体は検出可能なシグナルの生成を妨害すべき でない。

流通アッセイ装置に好ましい固相材料としては、多孔質ファイバーガラス材料も しくは他のファイバーマトリックス材料のような濾紙、及びポリエチレンパッド のような等方性多孔質材料を挙げることができる。使用する材料の厚さは、主に アッセイする試料または被分析物質の特性、例えば試験試料の流動性に基づいて 選択される。

固相の固有電荷を変化または増強するため、帯電物質を固相材料に直接適用する こともできるし、微粒子に適用し、次いでそれを固相支持体材料に保持させるこ ともできる。

或いは、カラム内に保持することにより、被膜微粒子を単独で帯電固相として使 用することもできる。“保持“とは、固相支持体材料上または内の粒子が支持体 内の他の位置に実質的に移動できないことを意味する。粒子は任意の適当なタイ プの粒子材料から当業者によって選択され得るが、その例としては、ポリスチレ ン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオ ロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ガラスまたは同様の材 料からなるものを挙げることができる。粒径は限定的ではないが、平均粒径が使 用される支持体材料の平均孔径より小さいのが好ましい。

典型的には、本発明のイオン捕獲原理を使用する新規の試験ストリップ及び流通 装置は、被分析物質、試験試料及び／または溶出溶剤を該装置に単一方向で移動 させ、それによって試薬含有ゾーンまたは検出ゾーンと順次接触させることを特 徴とする。或いは、本発明の新規の装置は、被分析物質が試料添加部位から試薬 含有ゾーンまたは検出ゾーンまで放射状に移動するように構成することもできる 。

別の実施態様においては、新規装置は、被分析物質、試験試料及び／または溶出 溶剤が試薬含有ゾーン及び検出ゾーンを所定の順序で通過するよう導く１つ以上 の境界付き経路を含むことができる。

イオン捕獲試薬の使用 本発明の開示によれば、捕獲剤が、アニオン性ポリマーのような帯電物質に結合 させた被分析物質特異的結合メンバーを含むサンドイッチアッセイを実施するこ とができる。

捕獲剤を、被分析物質を含むと推定される試験試料と、標識被分析物質特異的結 合メンバーを含む指示薬に接触させる。試薬は、同時に混合するかまたは１種ず つもしくは組み合わせて順次加え、均一な反応混合液を形成する。

サンドイッチアッセイ例においては、結合反応によって捕獲剤／被分析物質／指 示薬の結合体が形成される。得られた結合体を均一反応混合液の過剰なアッセイ 試薬及び試験試料から、捕獲剤と反対の固有電荷を有するかまたは反対の電荷を 有する物質を保持する固相、例えばカチオン性ポリマーによって取り出す。イオ ン捕獲アッセイにおいては、反対の電荷を有する固相が捕獲剤／被分析物質／指 示薬結合体を、アニオン性ポリマー／カチオン性ポリマーの相互作用によって引 き付は且つ結合する。次いで、固相に保持された結合体を、固相の試薬を調査す ることにより検出する。被分析物質が試料中に存在したならば、固相上に標識が 存在する。固相上の標識の量は試料中の被分析物質の量に比例する。サンドイッ チアッセイに固有の唯一の重要な制約条件は、被分析物質が十分な大きさを有す ると共に、少なくとも２つの特異的結合メンバーの結合を可能にする適当に配置 されたエピトープを有することである。他のサンドイッチアッセイは、被分析物 質を指示薬及び／または捕獲剤に結合するために１種以上の補助特異的結合メン バーを含むことができる。

更に本発明を使用して競合アッセイを実施することができる。競合アッセイ例に おいては、可溶性捕獲剤はここでも、アニオン性ポリマーのような帯電物質に結 合させた特異的結合メンバーを含む。捕獲剤を、試験試料と、シグナル生成化合 物を用いて標識しである第２結合メンバーを含む指示薬とに、順次または同時に 接触させる。捕獲剤と被分析物質とが指示薬への結合において競合する（例えば 捕獲剤と被分析物質とは標識抗原を競合する抗体である）か、または指示薬と被 分析物質とが捕獲剤への結合において競合し得る（例えば指示薬は、捕獲剤の抗 体成分への結合において抗原の被分析物質と競合する標識抗原である）。競合結 合または置換反応は均一混合液中で起こり、捕獲剤／被分析物質結合体及び捕獲 剤／指示薬結合体を形成する。

得られた結合体を過剰なアッセイ試薬及び試験試料から、反応混合液を反対の電 荷を有する固相と接触させることにより取り出す。補獲剤結合体は、反対の電荷 を有するポリマーの相互作用によって固相上に保持される。固相上に保持されて いる結合体は、指示薬の標識によって検出することができる。競合アッセイにお いては、固相に付着する標識の量は試料中の被分析物質の量と反比例する。従っ て、陽性試験試料は陰性シグナルを生成する。競合アッセイは、小さなペプチド またはハブテンのような、特異的結合相手を結合するための単一エピトープを有 する小分子の被分析物質の存在を判定するために使用するのが有利である。他の 競合アッセイは、被分析物質を指示薬及び／または捕獲剤に結合するために１種 以上の補助特異的結合メンバーを含むことができる。

例えば、テオフィリンに対するアッセイにおいては、抗テオフィリン抗体（モノ クローナルまたはポリクローナルいずれでも）をアニオン性ポリマーに結合して 可溶性捕獲剤を形成し、標識テオフィリン（即ち指示薬）と試験試料中の非標識 テオフィリンとの間で前記抗体への結合を競合させることができる。インキュベ ートした後、均一混合液を、カチオン性ポリマー被膜を保持する同相と接触させ る。

捕獲剤と固相の反対の電荷を有するイオン種間の引力が、反応混合液から免疫結 合体を分離するのに有用である。次いで指示薬のシグナルを検出することができ る。この例においては、試験試料中のテオフィリンレベルが増加すると、固相に 関連するシグナル生成は減少する。

更に本発明は、基準抗原の検出を阻害することにより抗体を測定するような阻害 アッセイに使用することができる。

例えば、捕獲剤が抗体／アニオン性ポリマー結合体を含み、指示薬が標識抗体を 含むことができる。被分析抗体を含むと推定される試験試料を、イオン捕獲反応 によって固相上に固定され得る検出可能なサンドイッチ結合体を捕獲剤及び指示 薬と一緒になって形成し得る基準抗原と混合する。

被分析抗体の濃度が増加すると基準抗原が固定サンドイッチ結合体を完成する可 能性が低下するので、捕獲剤による抗原取込みの阻害の程度は試験試料中の抗体 の量に比例する。

一般に、一旦被分析物質とアッセイ試薬の間で結合体を形成したら、反対の電荷 を有する固相を分離機構として使用する。即ち、均一反応混合液を固相と接触さ せると、新たに形成された結合体が固相上に、固相と捕獲剤とが有する反対の電 荷の相互作用によって保持される。使用者が液相反応に執着しないならば、捕獲 剤を固相上に予め固定し、捕獲部位を形成することもできる。

本発明は更に、液体試料から物質を分離するために使用することもできる。例え ば、単に被分析物質を試験試料から分離する目的で、指示薬を用いずに、捕獲剤 及び固相を使用することができる。更に、捕獲剤を、捕獲剤とは反対の電荷を有 する可溶性の第２帯電物質と接触することができる。第２帯電物質は、試料を固 相材料と接触させる前は固相上に保持されていないが、捕獲剤を引き付けてそれ に付着し、得られたアッセイ結合体が、反対の電荷を有する固相上に保持される 。

帯電状態の捕獲剤及び被分析物ｌ１ｔ（及び／または指示薬）の結合体を反対の 電荷を有する固相と接触させるとき、結合体を反応混合液から分離する効率は、 反対の電荷を有するイオン種の引力によって支配される。イオン引力は、捕獲剤 と反対の電荷を有する固相とに複数のポリカチオン及びポリアニオン種が含まれ るときは特に、抗原に対する抗体の免疫学的引力より大きいように選択される。

更なる利点は、“イオン捕獲”法によって妨害物質の固相への非特異的な吸着が 最小限に抑制され、優れた分析精度を与えることである。従ってイオン捕獲法に よって、高度に特異的な分離、最少の非特異的結合、及び高い感受性を有するア ・ソセイを実施することができる。

本発明の１つの実施態様においては、指示薬への非特異的結合の遮断薬を添加す ると、シグナル対ノイズ比を増加する結果となることが見い出された。非特異的 結合遮断薬は、アッセイに使用する捕獲剤が特異的結合メンノ＜一に結合したポ リアニオン性物質を含む場合でさえ遊離承りアニオンとし得ることが意外にも判 明した。遊離または未結合のポリアニオンが存在すると、捕獲剤の固相への固定 力（妨害または少なくとも低減されることが予期されて（また。しかしながら、 非特異的結合遮断薬は、ポリアニオン性捕獲剤のポリカチオン性固相への結合を 低下するよりも、指示薬の固相への非特異的な直接結合を阻害することにおＧ１ てより有効であることが判った。適当な非特異的遮断薬としては、限定的ではな いが、デキストラン硫酸、ヘノクツノン、カルボキンメチルデキストラン、カル ボキシメチルセルロ−ス スルフェート及びβーシクロデキスト＋Ｊンスルフエートを挙げることができる 。

指示薬に加えるポリアニオン性非特異的結合遮断薬の量は、捕獲剤中に含まれる ポリアニオン性物質の量より多くし得ることもまた判明した。遊離ポリアニオン 性非特異的結合遮断薬は、指示薬に、捕獲剤中に使用されるポリアニオン性物質 の量の４０，０００倍の量で添加し得ることが判った。一般に、指示薬に加える ポリアニオン性遮断薬の好ましい量は、捕獲剤中に使用されるポリアニオン性物 質の量の５０〜１　４．０　０　０倍の量である。２ステツプサンドイツチアツ セイにおいては、指示薬に加えるポリアニオン性遮断薬の好ましい量は、捕獲剤 に含まれるものの１０００〜２０００倍の量である。

問題の被分析物質の各々に対して適当な使用範囲を決定することができる。例え ば、デキストラン硫酸を指示薬に遊離ポリアニオン性非特異的結合遮断薬として 加える、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）を検出するアッセイにおいては、遊 離ポリアニオンの適量は捕獲剤の２３３〜１９．０００倍または約０．１〜８％ デキストラン硫酸の範囲であった。下記の表に示すように、好ましい非特異的結 合遮断薬及び好ましい非特異的結合遮断薬の量は、各被分析物質に対して最適化 することができる。

指示薬中の非特異的結合遮断薬 ％デキストラン硫酸（平均分子量５．０００）（遮断薬／捕獲剤、　ｗ／ｗ） 被分析物質　好ましい量　より好ましい量ＴＳＨ０，１〜８０．５〜２ （２３３〜１９，０００）　（１，０００〜４．０００）７３　０、１〜２０． １〜０，２ （２，０００〜４０．０００）　（２，０００〜４．０００）％カルボキシメチ ルセルロース（平均分子量２５０．０００）（遮断薬／捕獲剤、ｖ／ｗ） ｈＯＧ　０．０１〜０．２５　０．０２５（０，４４〜１１）　（１，１） ＨＩＶ　Ｏ〜０．２　０．０５ （０〜２０，０００）　（５，０００）更に、ポリアニオン性非特異的結合遮断 薬を分離剤（Ｓｅｐａｒａｔｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）としてア・ソセイに加えるこ ともできるし、捕獲剤中、補助結合メン／く一中、緩衝剤中、またはアッセイに 使用される成る種の他の試薬中の遊離ポリアニオンとして含めることもできるこ とが判明した。例えば、遊離ポリアニオンを捕獲剤中に含める場合、それは、試 験試料自体もしくは他のアッセイ試薬中に含まれていたり装置製造過程で混入し た妨害物質を中和することによりシグナル対ノイズ比を増大し得る。下記の表は 、種々の被分析物質に好ましい非特異的結合遮断薬の量を示しており、ここでは 、遊離ポリアニオンが補獲剤自体に含まれている。

捕獲剤中の非特異的結合遮断薬 ％デキストラン硫酸（平均分子量５．０００）（遮断薬／捕獲剤、ｗ／ｗ） 被分析物質　好ましい量　より好ましい量ジゴキシン　０〜０．００４　０．０ ０４（０〜２２２）　（２２２） Ｔ３　０．００４〜０．０１　０．００４〜０．００６（６６〜１６５）　（６ ６〜９９） 問題の被分析物質及び所望のアッセイ構成に従い、好ましい非特異的結合遮断薬 並びにその濃度の最適化及び別のアッセイ試薬の成分として含めるか否かは、多 大な実験をせずとも結合アッセイの当業者によって実施し得る経験的技術によっ て選択される。唯一の公知の例においては、ジゴキシン競合アッセイの捕獲剤に ０．００５％デキストラン硫酸を使用すると、非特異的結合遮断薬の添加により 、捕獲剤と固相との結合が阻害される。

イオン捕獲アッセイ装置 上述したように、イオン捕獲アッセイ装置は、ガラススライド、磁性粒子、試験 管及びプラスチックウェルといった不透過性固相を含み得る。しかしながら、イ オン捕獲アッセイ全体を多孔質固相材料内で実施し得ることも見い出された。本 発明のイオン捕獲アッセイ装置は特に、被分析物質を含む溶液または液体が通過 し得る任意の適当な、吸収性、吸着性、浸透性（ｉｍｂｉｂｉｎｇ）、吸湿性、 非吸湿性、等方性または毛管特性を有する材料（即ち多孔質材料）を含む。溶液 は、吸引、水圧、空気圧、吸湿、重力、毛管力、またはこれらの組合せによって 多孔質材料中を引上げまたは押上げられ得る。

使用し得るアッセイ装置としては、限定的ではないが、慣用のクロマトグラフィ ーカラム、液体流が実質的に直線形である細長い多孔質材料ストリップ、液体流 が直線形または放射状であるシート、パッド状多孔質材料、または多層ンートも しくはパッドを含む装置を挙げることができる。

本発明の新規の装置は、試験ストリップ及び流通装置の製造を含む。しかしなが ら、簡潔化のために以下の説明は試験ストリップ装置に的を絞るが、装置ゾーン の説明は、ストリップタイプ及び層状流通タイプの両装置に適用され得る。当業 者には、本発明が流通装置形式に適用可能であることが理解されよう。

試験ストリップの製造に有利に使用される１つの固相多孔質材料はニトロセルロ ースである。特に膜状固相材料を使用する場合は、被分析物質と指示薬の間で制 御された再現可能な結合反応が起こるよう、液体を固相に流し始める前に試験試 料と指示薬を混合する。或いは、試験装置は更に、細長ストリップと流体流通接 触しており且つ必要によっては指示薬を含む前混合添加パッドを含んでもよい。

添加パッドの材料は、試験試料を指示薬と前混合する能力において選択すべきで ある。例えば、ニトロセルロースを固相として使用するならば、親水性ポリエチ レン材料またはガラスファイバー濾紙が適当な添加パッド材料である。或いは、 ガラスファイバー濾紙のような固相材料を使用するならば、指示薬を細長ストリ ップの試料添加部位または添加部位より下流の別の部位に可逆的に固定すること ができる。

更に別の装置及び方法においては、指示薬を、別個の試薬溶液としてまたは試験 試料及び／または捕獲剤と順次にまたは同時に装置に加えることができる。

別の実施態様においては、試験ストリップまたは流通装置を、種々の試薬ゾーン 及び検出ゾーンを形成すべ（拡散性試薬または固定試薬を含む連続多孔質材料片 で製造することができる。更に別の実施態様においては、試験ストリップを、被 分析物質が一方の材料から他方の材料へと移動し得るように種々の材料が流体流 通接触しているような１種以上の固相材料で製造することができる。異なる材料 は異なる拡散性または固定アッセイ試薬を含むことができ、個々の材料は、細長 ストリップまたは流通パッド装置に組み立てられる。更に別の実施態様において は、装置の２つ以上のゾーンが一部重なり合っている。例えば、試料添加ゾーン は拡散性アッセイ試薬（例えば指示薬、捕獲剤など）を含み、それが被分析物質 と反応して結合体または反応生成物を形成し、それが装置内または装置上の他の ゾーンに続けて移動することができる。別の実施態様においては、試料添加ゾー ンは固定アッセイ試薬（例えば捕獲剤とは反対の電荷を有するポリマー）を含み 、それが、捕獲剤または補獲剤結合体を検出のために固定することができる。こ こでも、補獲剤結合体に直接または間接的に結合し、更にそれが、反対の電荷を 有する固相材料によって固定されることにより固定される種々の形式に本発明が 適用可能であることは、当業者には容易に理解されよう。

ａ、添加パッド 試験ストリップ装置に添加パッドを使用する場合、それは、試験試料または溶出 溶剤が添加パッドから多孔質材料へと通過または移動し得るように、近位端部と 称される多孔質材料の一端と流体流通接触している。流体流通接触は、添加パッ ドが多孔質材料と物理的に接触していてもよいし、パッドとストリップとの間で 流体が流れ得る中間スペース（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ　５ｐａｃｅ）または追 加材料によってパッドが多孔質材料から分離していてもよい。実質的に全ての添 加パッドが多孔質材料と一部重なり合い、試験試料が添加パッドの実質的に全て の部分を通って細長ストリップの近位端部に到達することができる。或いは、添 加パッドの一部分のみが細長ストリップ材料と重なり合ってもよい。添加パッド は、試験試料及び／または溶出溶剤を細長ストリップまで移送し得ると共に、細 長ストリップの全収容容積と等しいかまたはそれより多い量の試験試料及び／ま たは溶出溶剤を吸収し得る任意の材料とすることができる。

添加パッドに使用するのに好ましい材料としては、ニトロセルロース、多孔質ポ リエチレンパッド及びガラスファイバー濾紙を挙げることができる。パッド材料 は、被分析物質及びアッセイ試薬との相容性においても選択される必要があり、 例えばガラスファイバー濾紙は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）アッセ イ装置に使用するのに好ましい添加パッド材料であることが判明した。

更に、添加パッドは、拡散可能にまたは拡散不可能にそこに結合された１種以上 のアッセイ試薬を含むことができる。添加パッドに含み得る試薬としては、限定 的ではないが、指示薬、補助結合メンバー、試験試料前処理薬及びシグナル生成 系成分を挙げることができる。例えばイオン捕獲装置の好ましい実施態様におい ては、製造中に指示薬を添加パッド内に予め付着させる。このことで、装置を使 用する前に試験試料を指示薬と結合する必要は排除される。

添加パッド中でアッセイ試薬を独立させることで相互作用性試薬は別々に維持さ れ、製造工程は容易になる。例えば指示薬は添加パッド中に乾燥状態で保持させ 、試験試料または溶出溶剤と接触すると、指示薬が再構成及び拡散され、それに よって装置中を移動することができる。更に別の実施態様においては、拡散性指 示薬を、試験ストリップ材料自体の添加パッドと該試験ストリップ上の検出ゾー ンとの間の位置に置く。別の実施態様においては、拡散性指示薬を、多孔質試験 ストリップ材料の検出ゾーンに置き、アッセイ反応によって検出ゾーンに固定さ れなかった指示薬は検出ゾーンを通過して行（。

好ましいイオン捕獲装置においては、添加パッドが試験試料を受取り、試験試料 によって添加パッドが濡れることで少なくとも２つの機能が果たされる。第１に 、パッドに含まれる所定量の試薬が溶解または再構成される。第２に、試験試料 及び新たに溶解された試薬が多孔質材料まで移送され始める。添加パッドは、試 験試料とアッセイ試薬とに対し、最初の混合部位及び反応部位としての第３の機 能をも果たし得る。

別の好ましい実施態様においては、添加パッドは指示薬及び捕獲剤の両方を乾燥 形態で含む。試験試料を添加するとアッセイ試薬が再構成され、それによって被 分析物質と反応し、電荷を帯びた指示薬／被分析物質／捕獲剤結合体が形成され る。次いで結合体は、続いて検出ゾーン内に固定されているポリマー材料と反応 するため、添加パッドがら多孔質試験ストリップ材料まで移動する。検出ゾーン では、ポリマー材料は捕獲剤とは反対の電荷を有する。或いは、指示薬または捕 獲剤のいずれかを、多孔質試験ストリップ材料の添加パッドと検出ゾーンとの間 に含めることもできる。補獲剤結合体は、捕獲剤が検出ゾーン内を移動する前に またはそれと同時に形成されるのが好ましい。

本発明の別の実施態様においては、ゼラチンを使用して添加パッドの全部または 一部を閉じ込める。このような封入は典型的には、添加パッドをゼラチンで被覆 することにより行なわれる。この被覆の効果は、添加パッドに含まれる試薬の安 定性を増大することである。被覆された添加パッドに試験試料を添加するとゼラ チンが溶解し、それによって、予め付着されていたアッセイ試薬が再度水和され る。

本発明の別の実施態様においては、試薬含有添加パッドを乾燥または凍結乾燥し 、装置の貯蔵寿命を増大する。凍結乾燥した添加パッドは、空気乾燥した添加パ ッドより強力なシグナルを生成することが判明した上に、凍結乾燥添加パッドは より長い期間安定性を維持した。

別の好ましい実施態様においては、本発明のアッセイ装置は、濾過手段を追加す ることにより更に改良することができる。濾過手段は、添加パッドの上方または 添加パッドと多孔質材料の間に置かれた別個の材料とすることができる。或いは 、添加パッド材料はその濾過能力において選択することができる。濾過手段とし ては、所定の寸法より大きい粒子またはセルを試験試料から除去するために使用 される任意のフィルターまたはトラッピング装置とすることができる。例えばフ ィルタ一手段は、全血試料から赤血球を除去し、血漿を多孔質材料に移送するた めに使用される。

かかるフィルタ一手段は、米国特許第４．４７７．５７５号に開示されており、 この特許は参照により本明細書の一部を構成するものとする。必要によっては、 フィルタ一手段は、粒子または妨害物質を試験試料から除去するための１種以上 の試薬を含むことができる。

本発明の別の変形態様は、添加パッドと多孔質材料との間に設置されるかまたは 添加パッド上に重ねて設置される１つ以上の追加多孔質材料層の使用を含む。か かる追加パッドまたは層は、添加パッドへのまたは添加パッドからの試験試料の 流量を制御する手段として作用し得る。このような流量制御は、添加パッド内で の試験試料と試薬の反応に長時間のインキュベーションが所望される場合に好ま しい。

或いはかかる層は、試験試料が添加されるまで添加パッド試薬から隔絶されるの が好ましい追加アッセイ試薬を含むことができる。流量制御層は更に、未反応の アッセイ試薬が多孔質材料へ到達するのを防止する役割をも果たす。

ｂ、多孔質試験ストリップ材料 本発明の新規のイオン捕獲装置に使用される多孔質材料は、被分析物質を含む溶 液が吸上作用によってその中を輸送され得る、任意の適当な吸収性、多孔性また は毛管作用を有する材料とすることができる。試験ストリップ装置に好ましい１ つの多孔質材料はニトロセルロースである。しかしながら、ニトロセルロースを 使用する場合、任意の添加パッドの材料は、試験試料と１種以上のアッセイ試薬 とを前混合し得る能力において選択すべきである。ニトロセルロース膜を通る流 体流は層状であり、多孔質材料内で試験試料と添加パッド試薬を最初に混合し得 るようなより不規則な流れは起こらない。ニトロセルロースを多孔質材料として 使用する場合、Ｐｏｒｅｘ（登録商標）親水性ポリエチレン材料またはガラスフ ァイバー濾紙が、添加パッド内での試験試料とアッセイ試薬との混合及び反応を 可能にする添加パッドとして使用するのに適当である。特に好ましい多孔質材料 はガラスファイバー濾紙である。

多孔質ストリップ材料の特定の寸法は、関与する試験試料の寸法、アッセイ態様 、シグナルを検出及び測定する手段などに従って便宜的に決定される。例えば寸 法は、流体移動速度、多孔質材料によって吸収され検出部位までまたはそこを通 して輸送される試験試料の量を調整するよう選択される。

上述のごとく、結合アッセイにおける検出ゾーンは、典型的には、帯電ポリマー を多孔質材料の所定の場所に直接または間接的に結合することにより形成される 。直接結合方法としては、吸着、吸収及び共有結合を挙げることができる。間接 結合方法としては、帯電試薬が結合された不溶性微粒子を使用し、該粒子が多孔 質支持体材料内または上に保持及び固定される方法を挙げることができる。試薬 を微粒子に結合する手段は、共有結合及び非共有結合、即ち付着、吸収または吸 着を含む。イオン捕獲剤は微粒子に共有結合によって結合するのが好ましい。

１種以上の試薬を微粒子に結合し、次いでそれを多孔質材料内に固定することも 本発明の範囲内にある。例えば、検出可能な反応生成物が酵素／基質シグナル生 成系中で拡散するのを減速または防止するため、基質を多孔質材料内に固定する ことができる。基質は、当分野において良（知られた方法によって多孔質材料に 直接結合することで固定することもできるし、多孔質材料中及び／または上に堆 積された不溶性微粒子に共有結合することにより固定することもできる。

粒径は、使用する多孔質材料のタイプ及び粒子を製造する材料のタイプに応じて 変化させることができる。例えばガラスファイバー多孔質材料においては、ガラ ス及びポリスチレン粒子は、多孔質材料の細孔内に捕捉または固定され且つ移動 流体に直面したときに動かされないのに十分な寸法であるべきである。同じガラ スファイバーマトリックスにおいて、ラテックス粒子はそれ自体がガラスファイ バーに未知の機構によって予想外に付着するが故に、はるかに小さいラテックス 粒子を使用することができる。孔径に依存するガラス及びプラスチック粒子とは 違い、ラテックス粒子は孔径に無関係であり、多孔質材料の孔径がロットごとに 変動しても、装置の性能に悪影響を及ぼさない。その結果、１つの特に好ましい 結合アッセイ装置は、捕獲剤が結合されガラスファイバー多孔質材料中に分配さ れたラテックス粒子を使用する。微粒子または他の試薬の多孔質材料マトリック ス上または内の分配は、当業者には周知のごとき試薬プリンティング法（ｒｅａ ｇｅｎｔ　ｐｒｉｎイオン捕獲剤、シグナル生成成分または試薬被覆微粒子は、 多孔質材料上または内に単独でまたは種々の組合せで堆積することができる。ま たこれらは、種々の形状の検出または測定部位を生成すべく多様な構成で堆積す ることができる。例えば試薬を、多孔質ストリップ材料全体の面積より実質的に 小さい面積を有する個別部位として堆積することができる。

或いは、実質的に全多孔質材料を含む捕獲部位または検出部位を形成するように 実質的に均一に、試薬を多孔質材料全体に分配することもできる。この場合、一 定長の検出部位に沿ったシグナル生成の度合い、または多孔質材料の近位端部か ら検出可能なシグナルまでの距離は、試験試料中の被分析物質の量に関係する。

被分析物質の量は、得られた信号の長さまたは距離を較正標準試料に認められる ものと比較することにより決定することができる。

別の実施態様においては、試薬を小幅の縞として分配することができる。試薬を 均一に分配するのはなくて小幅縞を使用すると、多孔質材料上の検出可能なシグ ナルの像を鮮明化するよう作用する。更に、多孔質材料の長さに沿って１つ以上 の小幅縞を平行に分布することができる。このとき、各編向の試薬を異なる被分 析物質に対するものとし、多重分析アッセイ装置を形成することができる。被分 析物質の移動の長さまたは距離を測定する装置に加え、被分析物質の測定、即ち 定量化を助けるため、一定尺度の適当な符号、数値または文字を多孔質材料上に 印刷することができる。

別の実施態様においては、試薬を多孔質材料の一端にもう一端よりも少ない量で 分配する。競合結合アッセイにおいて、捕獲剤をこのように濃度勾配を持つよう 分配することで、指示薬が被分析物質によって捕獲剤の結合部位からより迅速に 変位するが故に、多孔質材料の分配がより少ない端部でより高い感度を得ること ができる。

別の実施例においては、適当な捕獲剤及びシグナル生成試薬を、限定的ではない が、アッセイ終了時に検出可能なシグナルを表示する数値、文字、ドツト及び符 号、例えば“＋／−”、“％”などを含む、検出に便利な任意のパターンに分配 することができる。必要によっては、１つの試薬の反応が検出可能パターンの一 部分を完成し、第２の反応が検出可能パターンの別の部分を完成するよう、アッ セイ試薬を材料中に一部重なり合った態様で取り込ませた反応マトリックスを製 造することができる。例えば、一方の反応が“十字形”の縦部分を完成し、第２ の反応が十字形の横部分を完成することができる。或いは、模様の一部分はアッ セイ実施前に可視または検出可能であって、単一反応によって模様全体が完成さ れる。一般には、縦部分のみの完成は陰性のアッセイ結果を示し、検出可能な模 様の画部分の完成は陽性のアッセイ結果を示す。任意のパターンまたは模様を使 用することができるが、模様の一部形成は陽性以外のアッセイ結果を示し、模様 の完全な形成は陽性のアッセイ結果を示すようにしてもよい。このような方法及 び装置が米国特許第４，９１６，０５６号に記載されており、該特許の開示内容 は参照により本明細書の一部を構成するものとする。

更に別の実施態様においては、多孔質材料のおおよそ近位端部からおおおそ遠位 端部まで一定の間隔を置いて多孔質ストリップ材料の幅を横切る一連の平行棒状 に、はしご様の捕獲部位を形成するように試薬を分配することができる。小幅縞 構成のように、環部及び中間のスペースは、多孔質材料上に生成されたシグナル の像を鮮明にするよう作用する。シグナルを検出し得る環部の数をカウントし、 試験試料中の被分析物質の量と相関させることができる。環部を相互に近付けて 並べると、装置の分析感度は低下するが、より多量の被分析物質を測定すること ができる。また、環部をより離して並べることにより、感度を徐々に高めること ができる。被分析物質に対するより高い限界感度（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏ ｎ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が濃度範囲の上限で要求されるか下限で要求され るかに従い、多孔質材料の種々の部分で感度を変えることも本発明の範囲内にあ る。平行棒状構成の別の変形態様は、捕獲部位及び検出部位内の試薬が異なる被 分析物質に対するものであって、多重分析アッセイ装置を形成する、複数の捕獲 剤または反応試薬の使用を含む。

固相の特定の寸法は便宜的に決定されるものであり、関与する試験試料のサイズ 、アッセイ方法、及びシグナルを検出及び測定する手段に依存する。例えば寸法 は、流体移動速度及び固相に吸収される試験試料の量を調整するように選択する ことができる。

所定量のアッセイ試薬を装置内に組込み、使用者による追加操作の必要を低減ま たは回避することができる。従って、１種以上の試薬を装置内に組込むことは本 発明の範囲内にある。例えば、検出可能な反応生成物が酵素／基質シグナル生成 系内で拡散するのを減速または防止するため、基質を試験ストリップ内に固定す ることができる。基質は、当分野においてよく知られた方法によって試験ストリ ップ上または中に固定することもできるし、試験ストリップ中及び／または上に 堆積された不溶性微粒子に共有結合することにより固定することもできる。試験 試料または溶出溶剤と接触するまで試薬が反応しない限りは、１種以上のアッセ イ試薬を装置上の任意の所与の試薬ゾーンまたは部位に存在させることができる 。

上述の種々のシグナル表示フォーマットまたはパターンには更に、アッセイ試薬 の効力、アッセイの終了またはアッセイの適正実施を確証するようなアッセイ対 照を組込むこともできる。このような対照は当業者にはよ（知られている。アッ セイの終了を示す試薬（例えば試験試料の装置中の移動が完了したことをシグナ ルで示すアッセイ終了指示薬）を試験ストリップ装置の遠位端部に有することも 本発明の範囲内にある。例えばアッセイ終了は、試験溶液、吸上液またはシグナ ル生成成分と接触したとき、対照部位の変色によって示すことができる。試験水 溶液と接触したときに変色する試薬としては、ＣｕＳＯ４、Ｃｏ　（ＮＯｓ）　 ｔなどの脱水遷移金属塩などを挙げることができる。緩衝吸上液のｐＨに応答す るｐＨ指示染料を選択することもできる。例えばフェノールフタレインは、ｐＨ 範囲が８．０〜１００の吸上溶液と接触すると、透明から濃ピンクに変色する。

試験試料を添加部位に添加するかまたは添加部位を試験試料中に浸漬することに より、試験試料を試験ストリップに接触させることができる。放射状の捕獲部位 及び結合体回収部位を有するシート状装置においては、試料を中央添加部位に添 加する。試料を固相に接触させる前に、試料を、指示薬、捕獲剤、緩衝剤または 吸上剤（即ち固相を通して試験試料を輸送するのを促進する物質）といった追加 試薬と混合してもよい。別の実施態様においては、試験試料を、捕獲部位の上流 に位置する試験ストリップの部分に添加し、１種以上の追加試薬を、試験試料添 加部位の上流に位置する試験ストリップの別の部分に添加する。

更に別の実施態様においては、装置は、捕獲部位の下流または下方に位置する追 加吸収材料を含む。吸収材料は、固相上にある捕獲部位及び検出部位を通過する 試験試料及び指示薬の量を増大するよう作用し得る。

少量の非水性または粘性試験試料を装置に添加する場合、アッセイ試薬及び試験 試料が該装置中を容易に移動するように、吸上液、好ましくは緩衝吸上液を使用 する必要があり得る。水性試験試料を使用する場合、吸上液は一般に必要ではな いが、吸上液を使用して流動性を向上したり試験試料のｐＨを調整することがで きる。イムノアッセイにおいては、吸上液は典型的には約５．５〜約１０．５、 より好ましくは約６．５〜約９．５のｐＨを有する。ｐＨは、特異的結合メンバ ーと被分析物質との間で有意なレベルの結合親和性を維持するように選択される 。しかしながら指示薬の標識成分が酵素である場合には、ｐＨは、酵素シグナル 生成系における発色のために有意な酵素活性を維持するよう選択されねばならな い。適当な緩衝液としては、限定的ではないが、ホスフェート、カーボネート、 バルビタール、ジエチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ Ｔｒｉｓ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパツールなどを挙げることがで きる。吸上液及び試験試料は、試験装置と接触させる前に混合してもよいし、添 加パッドに別々に接触させてもよい。

Ｃ０流通アッセイ装置 通常の流通アッセイ装置は、問題の被分析物質を固定するために非拡散性の特異 的結合メンバーが固定されている試料接触表面を含む少なくとも実質的に平面状 の層を有する。該層は、結合アッセイの実施に際して装置を使用するとき、第１ 表面と接触した試験試料の少なくとも一部が該第１表面を通過してそれと反対側 の第２表面に到達するように配置されている。

典型的には流通装置は、第１層を通過した流体を吸収するための第２層または吸 収手段を含んでおり、吸収手段は、第１層の第２表面と直接接触しているか、ま たは第２表面を通過した流体が吸収手段に輸送されるのに十分に接近している。

変形装置においては、吸収手段は第１層から間隔を置いて設置されており、後で ２つの層を相互に押し付けることにより第１層の第２表面に接触することができ る。

必要によっては、流通装置は、装置を使用する際に試験試料が濾過手段を通過し てから第１表面と接触するように第１層に関して配置されている濾過手段を含む ことができる。更に第１層からの流体の流量を調整するために、第１層と吸収手 段の間に流量制御手段を設置することもできる。

第１層と吸収手段の間に逆流制御手段を設置し、吸収手段から第１層へのシグナ ル生成物質の移動を防止することもできる。

流通装置は、装置を使用する際に試料流体がアッセイ試薬層を通過してから第１ 表面と接触するように第１層に関して配置された１つ以上のアッセイ試薬層を含 むこともできる。アッセイ試薬は一般には、試験試料を試薬層に添加することに より再度可溶化され、そうすると試薬は、被分析物質またはアッセイ装置内に収 容されている他の試薬と更に反応することができる。他の実施態様は、フィルタ ー層またはフィルター／試薬併存層を含み得る。更に別の装置は、着脱可能なフ ィルター及び／または試薬層を含み得る。

本発明の新規の流通アッセイ装置は、反対の電荷を有する捕獲剤及びその結合体 を非特異的に結合し固定するために帯電ポリマーが設置されている接触表面を含 む。該装置は、上述の１つ以上の他の装置の層と組み合わせた１つの層、即ち第 １層で構成される。例えば、被分析物質がアッセイ試薬と接触してから流通装置 のイオン捕獲表面と接触するように、１つ以上の前反応層が指示薬及び捕獲剤を 含み得る。

流通アッセイ装置または試験ストリップアッセイ装置において、指示薬または捕 獲剤のような１種以上のアッセイ試薬は、アッセイ実施中に装置に添加すること もできる。

しかしながら本発明の好ましい実施態様は、必要な全てのアッセイ試薬をアッセ イ装置に組み込んであり、試験試料及び場合によっては吸上液または溶出溶剤の みを装置に添加するだけでよい。

本発明は更に、結合アッセイを実施するキットをも提供する。例えば本発明のキ ットは、試薬が取り込まれたアッセイ装置を含むことができ、必要によっては、 装置内または上には組み込まれていない上述のごとき吸上液及び／または試験試 料前処理試薬を含むこともできる。当業者には周知の他のアッセイ成分、例えば 緩衝剤、安定剤、洗浄剤、非特異的結合阻害剤、細菌阻害剤などをアッセイ装置 及び吸上液中に存在させることもできる。

実施例 以下の実施例は、本発明の新規の材料を製造し且っがかる材料を使用してアッセ イ作業を実施する好ましい方法を示す。しかしながら、これらの実施例は説明の ためのものであり、請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を制限する ものではない。

実施例１ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のサンドイッチアッセイａ、抗ＣＥＡ抗体−ＰＧＡ捕獲 剤の調製以下の一連のステップは、抗体／ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）結合体、 即ち抗体／アニオン性ポリマー捕獲剤の調製に使用される化学機構を説明するも のである。

検出可能アニオン性ポリマーの調製：　ＰＧＡのナトリウム塩（Ｉｇ　：　７． １４Ｘ１０−５モ／ｌ／；平均分子量（ＭＷ）１４．０００；Ｓｉｇｍａ）を、 以下のように変更したＴｓｕｋａｄａら（ＪＮＣＩ　；７３ニア２１−７２９． １９８４〕の方法によって、３−　（２−ビリジルージチオ）プロピオニル−ｐ ｃＡ　（ＦＤＰ−ＰＧＡ）に変換した。チオプロピルセファロース６Ｂ単離前に 、ＰＤＰ−ＰＧＡを遊離スルフヒドリルに還元することはせず、代わりに、ＦＤ Ｐ−ＰＧＡを０．１Ｍリン酸ナトリウム及び１ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ６，５）中 に溶解し、チオプロピルセファロース６Ｂ（６０ｍｌ；３０ｇ；Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）と−緒に撹拌した 。透析及び凍結乾燥後、ＦＤＰ−ＰＧＡ結合体が収率２４％で得られた（０．２ ４４ｇ　；　１．７２ｘｌＯ−’モル）後続の化学反応の間ジスルフィドを確実 に維持するため、チオピリジル基を５−チオ−２−ニトロベンゾエート（ＴＮＢ ）保護基と交換した。１００モル過剰量の１．４−ジチオトレイトール（ＭＷＩ 　５４．２）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム（４，０ｍ　ｌ　；　ｐＨ７）中に ＦＤＰ−ＰＧＡ　（２０ｍｇ　：　１．４２ｘｌＯ−’モル）を溶解した溶液に 加え、４０℃で１時間反応させた。混合液を５．ＱｍＭ酢酸ナトリウム、０．１ ４ＭＮａＣ１及び１　、０　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ５，５）を用いて １０ｍ１に希釈し、２０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）チューブにおいて希 釈緩衝液に透析した。続いて蒸留水に透析してがら凍結乾燥した。チオプロピル −ＰＧＡ　（Ｈ８−ＰＧＡ）の収量は１３．５ｍｇであった。Ｈ３−ＰＧＡ　（ １３，５ｍｇ）を０．１Ｍリン酸ナトリ’ｙム（ｐＨ７，０；９．６Ｘ１０−’ モル）中に溶解し、１０モル過剰量の５．５゛−ジチオビス（２−ニトロ安息香 酸）（ＤＴＮＢ）と室温で１時間反応させた。この混合液を０゜１Ｍリン酸ナト リウム（ｐＨ７）で１０ｍ１に希釈し、２０００ＭＷＣＯチューブにおいて希釈 緩衝液に透析した。

続いて蒸留水に透析し、凍結乾燥し、５−（２−ニトロ安息香酸ジチオ）プロピ ニル−ＰＧＡ　（ＴＮＢ−ＰＧＡ　；　８゜５ｍｇ　；　６．０７　ｘ　１０− ’モル）を生成した。

各補獲剤抗体に結合したアニオン性ポリマー分子の数を追跡するため、ＴＮＢ保 護ＰＧＡをフルオレセンのエチレンジアミン誘導体で標識した。ＴＮＢ−ＰＧＡ 　（８，５ｍｇ）を乾燥Ｎ−Ｎジメチル−ホルムアミド（２０ｍｌ）中に溶解し 、９０モル過剰量のＮ−メチルモルホリン（ＭＷｌｏｌ、１５）で処理し、温度 を０℃に下げ、９０モル過剰量のイソブチルクロロホルメート（ＭＷｌ　３６． ５８）を加えることにより、ＴＮＢ−ＰＧＡをエチレンジアミン誘導フルオレセ ン（ＥＤＡ−Ｆ　Ｉ　；　ＭＷ５３２）をローディングした。上記反応は０℃で １時間実施した。混合液を室温に暖め、３０モル過剰量のＥＤＡ−Ｆ　Ｉを加え 、撹拌しながら室温で一晩反応させた。混合液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ Ｈ７，０）で１０ｍ１に希釈し、２０００ＭＷＣＯチューブおいて希釈緩衝液に 透析した。続いて蒸留水に透析し、凍結乾燥し、ＴＮＢ−ＰＧＡ／ＥＤＡ−Ｆ　 １結合体（７，８ｍｇ　；　５．６ｘｉｏ−’モル）を得た。

ＴＮＢ−ＰＧＡ−ＥＤＡ−Ｆ］　（７，８ｍｇ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ ３，０ｍｌ　：　ｐＨ７，０）中に溶解し、１００モル過剰量の１，４−ジチオ トレイトールを用いて４０°Ｃで１時間処理することにより、ＴＮＢ基を除去し た。

反応は、紫外／可視分光計においてピークが３３４ｎｍから４１２　ｎ　ｍにソ フトすることでモニターした。材料を蒸留水で１０ｍ１に希釈し、２０００ＭＷ ＣＯチューブにおいて蒸留水に透析した。凍結乾燥すると、チオプロピル−ＰＧ Ａ／ＥＤ’Ａ−Ｆ　Ｉ　（Ｈ８−ＰＧＡ／ＥＤＡ−Ｆ　Ｉ　、８゜４　ｍ　ｇ　 ）が得られた。この時点で、紫外／可視走査を行なってＰ　Ｇ　Ａ　１分子当た りのフルオレセンの数（即ちローディング）を決定した。この調製物においては 、ＰＧＡ１分子当たり０．８１フルオレセンの値が算出された。

抗体活性化：モノクローナル抗体である抗ＣＥＡ抗体を、Ｔｓｕｋａｄａら（Ｊ ＮＣＩ　ニア３；７２１−７２９．１９８４〕の方法によってマレイミド活性化 した。但し、抗体濃度は１ｍｇ／ｍｌとし、１５０モル過剰量のＮ−スクシンイ ミジルｍ−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（ＳＭＢＥ、ＭＷ３１４．３　；　 Ｓ　ｉｇｍａ）を使用した。３〜５個のマレイミド基を抗ＣＥＡ抗体に導入する には、１５０モル過剰量が必要であることが実験的に判明した。Ｍｅａｒｅｓら の遠心法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：１１４２；６８ −７８．１９８４）を使用し、３ｍｌシリンジカラムにおいて５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０／８０　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を用いてクリーンアッフヲ行なった。Ｌｉ ｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：１８；６９０−６９６．１９７９）の滴定法 を使用して１抗体当たりのマレイミドの数を決定した。この抗体活性化において １抗体当たり４．６のマレイミドが導入されたことが判明した。

次いで、チオプロピル−フルオレセン標識ＰＧＡをマレイミド誘導抗体と反応さ せ、癌胎児性抗原イオン捕獲イムノアッセイに適した抗体／ＰＧＡ結合体を得た 。０．１Ｍリン酸ナトリウム（１，０〜２．０ｍ１　；　ｐＨ７，０）中にマレ イミド活性化抗体（１，Ｏｍｇ　；　６．２５Ｘ１０−’モル）を含む溶液のｐ Ｈを１．ＯＮ　ＨＣＩを用いて６．５に調整した。次いで、０．１Ｍリン酸ナト リウム（１００μｌ）中の１０モル過剰量のＨ８−ＰＧＡ／ＥＤＡ−Ｆｌ　（約 １゜０ｍｇ）を活性化抗体調製液に加えた。室温で静かに撹拌しながら一晩結合 させた。混合液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）で１０ｍ１に希釈し 、５０．ＯＯＯＭＷＣＯチューブにおいて０．００１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ ７，０）に透析し、凍結乾燥した。乾燥物質を蒸留水（０，２５ｍ１）中に再溶 解し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＡ２８０に最大ピー クを有する画分を得た。クロマトグラフィーは、Ｂｌｏ−８ｉｌＴＳＫ２５０　 （Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌ　ｉ ｆｏｒｎｉａ）３００ｍｍＸ７．５ｍｍカラムにおいて５ＱｍＭ硫酸ナトリウム 、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び０．３Ｍ　ＮａＣｌ　（ｐＨ６゜８）を用いて １ｍｌ／分で溶出することで実施した。

ウシＩｇＧ標準物質を用いたＢｉｏ−Ｒａｄ’ｓ　Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイに よって、最大ピークのタンパク質含有量を測定した。該ピークは、５．９７Ｘ１ ０−’モルのタンパク質（ＩｇＧ　ＭＷ　１６０．０００）に相当する９５．５ μｇ　／　ｍ　＋のタンパク質を含んでいた。紫外／可視を走査し４９４ｎｍに おける吸収を測定することにより、この両分は更に、抗体１分子当たり３．６の フルオレセンに相当する２、１２Ｘ１０−’モルのフルオレセンを含んでいるこ とが判った。ＰＧＡＩ分子当たり０．８１のフルオレセンがあることが判ってい ることから、各抗体に４．４個のＰＧＡ分子が結合していることになる。ピーク 画分を凍結し、後でアッセイに使用した。

上記化学機構の重要点は、各ポリマーアニオンと抗体との間に接合部位が１個だ け存在することである。２者間の唯一の共有結合によって、複数の活性化基を有 するポリマーアニオンを使用した場合に起こり得る分子間及び分子内架橋が阻止 される。

上記捕獲剤の別の例としては、アニオン性固相材料と併用するためにカチオン性 誘導抗体を形成することもできる。

ｂ、固相の調製 使い捨て流通材料の固相繊維質マトリックスを第四級ポリマー化合物で被覆し、 固相に正電荷を与えた。水溶性セルロース誘導体であるＣｅ１ｑｕａｔ　（登録 商標）Ｌ−２００ポリマー化合物を使用した。Ｃｅ１ｑｕａｔ　（登録商標）Ｌ −２００ポリマー化合物の１％水溶液（５０μｌ）を固相材料に塗布し、次いで 、３００ｍＭ　ＮａＣ１，５ＱｍＭＴｒｉｓ及びｏ、ｉ％ＮａＮ５を含む希釈剤 （７５μＩ　、ｐＨ７，５）で洗浄した。

Ｃ３指示薬の調製 指示薬は、アルカリ性ホスファターゼと、捕獲剤において特定された抗体とは別 のエピトープに結合する抗ＣＥＡ抗体フラグメントとで構成した。アルカリ性ホ スファターゼで標識した抗ＣＥＡ抗体フラグメントは、５０ｍＭＴｒ　ｉｓ、５ ０ｍＭ　ＮａＣ］、１．０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、ｏ。

１ｍＭ　ＺｎＣ！２．５．０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．５％ウシ皮膚ゼラチン 及び３％マウス血清を含む緩衝液中に置いた。

ｄ、イムノアッセイ方法−ＣＥＡ測定 指示薬（７０μｌ）を反応ウェルに入れた。次いで、緩衝捕獲剤（５０ｍＭ　Ｎ ａｔＳＯｎ、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム及び３００ｍＭＮａＣｌの緩衝液、ｐ Ｈ６，８中に抗ＣＥＡ／ＰＧＡ結合体を含む溶液２０μｌ）をウェルに加えた。

ＣＥＡを含む標本３５μｍをウェルに加え、均一免疫反応混合液を３４．５℃で ２０分間インキュベートした。

このアッセイでは、各々がＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＣＥＡ酵 素イムノアッセイキットからのＣＥＡ較正物質である４種類の標本を試験した。

各反応混合液のアリコート（１００μｍ）を同相材料に添加し、次いで７５μＩ の希釈液で３回洗浄した。最後に、指示薬と反応させるため、酵素基質（１００ ｍＭ　ＡＭＰ、１．０ｍＭＭｇ　Ｃ＋　２．　０．１％ＮａＮ、及び４．ＱｍＭ 　テトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ４−メチルウンベリフェリル− ホスフェートを含む溶液７０μｌ）を３４．５℃で加え、生じた蛍光量を測定し た。アッセイの用量一応答結果を表１に示す。この結果から、ＣＥＡ試験試料濃 度が増加すると、それに対応して捕獲剤／被分析物質／指示薬の結合体の形成が 増加し、従って固相に付着する検出可能な標識の量が増加したことが判る。

表１ ＣＥＡイオン捕獲サンドイッチアッセイ捕獲剤：抗ＣＥＡ抗体−ＰＧＡ結合体 指示薬：アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体フラグメントＣＥＡ（ｎｇ ／■ｌ）　量（カウント７秒７秒）実施例２ マウス免疫グロブリンの競合阻害アッセイａ、ＩｇＧ−ＰＧＡ捕獲剤の調製 以下の方法に従って水溶性カルボジイミド剤（１−エチル−３−（３−ジメチル アミノ−プロピル）カルボジイミド；　ＥＤＣＩ）を使用し、プロティンＡアフ ィニティー精製マウスモノクローナル免疫グロブリンＧを負電荷を有するＰＧＡ に結合した。

フルオレセン標識ＰＧＡ　（１０ｍｇ　；　Ｆ　１−ＰＧＡ）を、リン酸緩衝塩 水溶液（ＰＢＳ　；　７５ｍＭ　ＫＨＩＰＯ４及び３００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ ７，２）中に抗体（４，８ｍｇ／　ｍ　Ｉ　）を含む水冷溶液に加えた。この溶 液に、新たに調製した水冷ＥＤＣＩ溶液（１００μｌ　；　１０ｍｇ／ｍｌ）を 加え、得られた反応混合液を継続的に撹拌しながら２゜５時間かけて室温まで暖 めた。更に新たに調製した氷冷ＥＤＣＩ溶液（５０μｌ　；　１００ｍｇ／ｍｌ ）を反応混合液に急速撹拌しながら加えた。反応混合液を更に１．５時間撹拌し た。次いで混合液を、Ｓｐｈｅｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ−Ｇガードカラム（２，１５ ｃｍＸ７．５ｃｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、Ｆｕ ｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、９２６３４）を取り付けたＳｐｈｅｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ −３０００ＳＷＧカラム（２，１５ｃｍＸ３０ｃｍ）を使用したゲル濾過クロマ トグラフィーによって画分化した。カラムを流量５ｍ！／分のＰＢＳで溶出した 。

抗体のＦｌ−ＰＧＡ結合体中の蛍光を定量することにより、かかるプールのＰＧ Ａ／抗体比を決定した。結果を表２に示す。

表２ ＥＤＣＩを使用して調製したマウスＩｇＧ−ＰＧ＾結合体ブール　ピーク分子量 　ＰＧＡ／抗体 Ｉ　４２０．０００　３．８ ＩＩ　２８０．０００　４．　Ｉ ＩＩＩ　２２０．０００　５．５ ｂ８固相の調製 多孔繊維質マトリックス材料を第四級アンモニウムポリマー化合物（ＧＡＦＱｕ ａｔ　（商標）７５５Ｎ第四級アンモニウム化合物；ＧＡＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ）で被覆して固相を形成した。０．５％ＧＡＦＱｕａｔ　（商標）第四級 アンモニウム化合物の水溶液（５０μｍ）を材料表面に塗布し、次いで水（７５ μｍ）で洗浄した。

Ｃ１指示薬の捕獲剤への結合 指示薬としての、ヒツジ抗マウス免疫グロブリンに結合させたアルカリ性ホスフ ァターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、；Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、１９３９０）を、１％魚ゼラチンを含 むＴｒｉｓ緩衝塩水溶液（２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及 び１００ｍＭＮａＣＩ、ｐＨ７，５］で希釈した。捕獲剤としてのＰＧＡ／マウ スモノクローナル抗体結合体（表２のプール■）も同様に処理した。各々２００ μｌの各試薬を一連の試験管に入れ、３７℃で３０分間インキュベートした。反 応混合液のアリコート（７５μｍ）を固相に添加し、直後に、各々１５０μｌの Ｔｒｉｓ緩衝塩水溶液で３回洗浄した。

最後に、酵素基質（１００ｍＭ　ＡＭＰ、１ｍＭ　ＭｇＣＩ２．０．１％ＮａＮ ３及び４ｍＭ　テトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ４−メチルウンベ リフェリルホスフェートを含む溶液７０μｍ）を物質に３２．７℃で加え、生じ た蛍光量を測定した。実験結果を表３及び４にまとめて示す。

表３ 捕獲剤／指示薬結合の用量応答 表４ 指示薬／捕獲開本結合の用量応答 指示薬力価＊＊　蛍光量（カウント／秒／秒）１０”　５０６２ ｄ、マウスＩｇＧの競合阻害アッセイ 捕獲剤及び指示薬を上述のごとく調製した。全ての試薬を、１％魚ゼラチンを含 むＴｒ’ｉｓ緩衝塩水溶液で希釈した。指示薬はストック溶液の１０００倍に希 釈し、捕獲剤は１０μｇ／ｍｌに希釈した。一連の試験管において、各々１５０ μｍの適正に希釈した指示薬、捕獲剤及びマウスモノクローナル抗体を混合した 。混合液を３７℃で３０分間インキュベートした。混合液のアリコート（７５μ ｌ）を固相に添加し、即座に、各々１５０μｍのＴｒｉｓ緩衝塩水溶液で３回洗 浄した。次いで、酵素基質（１００ｍＭＡＭＰ、１ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、０．１％ 　ＮａＮ３及び４．０ｍＭ　テトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ　４ −メチルウンベリフェリルホスフェートを含む溶液７０μｍ）を固相に３２．７ ℃で加え、生じた蛍光量を測定した。マウスＩｇＧの競合阻害アッセイを示すこ の実施例の結果を表５に示す。結果から、マウスモノクローナル抗体濃度が増加 すると、これに対応して捕獲剤／指示薬結合体の形成が低下し、従って固相に付 着する検出可能な標識の量が減少したことが判る。

表５ マウスモノクローナル抗体による指示薬結合の阻害捕獲剤：　ＰＧＡ／マウスモ ノクローナルＩｇＧ結合体指示薬：アルカリ性ホスファターゼ−ヒツジ抗マウス 免疫グロプリ３、３Ｘ１０−’　１０６ ３、３Ｘ１０−”　９８ ３、３Ｘ１０−’　６７ 実施例３ ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のサンドイッチアッセイ ａ、捕獲剤の調製 以下の方法に従って、高い負電荷を有するアルブミン誘導体を調製し、抗ｈＣＧ 抗体に結合して、捕獲剤を形成した。

負電荷を有するタンパク質誘導体を形成するためのウサギ血清アルブミンの修飾 ：ウサギ血清アルブミン（ＲＳ　Ａ）を長時間スクシニル化し、Ｊｏｕらの方法 （Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｖｏｌ、９２．Ｐａｒｔ　Ｅ ；２５７−２７６、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８３）によってバラ−アゾベンゼンスルホネートに結合した。リン酸緩衝塩 水溶液（ＰＢＳ、１４ｍ１．ｐＨ８゜０）中の２％Ｒ８Ａを、バラ−ジオキサン （２，２８ｍ１）中の５％無水コハク酸と混合した。１．ＯＮ　ＮａＯＨを加え ることによりｐＨを８に維持した。反応混合液を室温で３０分間撹拌した。塩酸 ヒドロキシルアミンを加え（０゜６ｇ）、適量の５Ｎ　ＮａＯＨを加えることに より溶液のｐＨを９．５に調整した。混合液を水に透析し、得られたＳ　Ｕ　Ｃ ｓ　ｓ　ＲＳ　Ａを、以下の反応に従ってバラ−アゾベンゼンスルホネートに結 合した。

ＩＮ　ＭＣＩ　（０，８ｍ１）中にバラ−アゾベンゼンスルホン酸（０，１５ｍ ｍｏ　１．２６ｍｇ）を含む懸ｌＪ液ヲ水浴中で冷却し、ＩＮ　ＮａＮ０ｔ　（ ０，２ｍ１）を用いて３０分間急速撹拌しながら処理した。得られたジアゾニウ ム塩溶液を、水冷した５ＵＣｓｓ　Ｒ３Ａ溶液に、急速撹拌しながら滴下して加 えた。１．０ＮＮａＯＨを加えることにより反応混合液のｐＨを１１に維持した 。暗赤色の反応混合液を撹拌し、１時間かけて室温まで暖めてから、水に長時間 透析した。得られたＳｐ　５ＵＣｓｓ　Ｒ３Ａアニオン性誘導タンパク質は、使 用するまで冷蔵保管した。

抗ｈＣＧ　Ｆ（ａｂ’）ｚフラグメントの調製：アフィニティー精製したヤギ抗 ｈＣＧ抗体から、Ｎ１５ｏｎｏｆｆらの方法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙ、：８９：２３０−２４４．１９６０）に従って抗ｈＣＧ　Ｆ（ａｂ゛ ）２フラグメントを調製した。リン酸緩衝塩水溶液（ｐＨ７，２）中のアフィニ ティー精製抗体溶液の一部を、酢酸を加えることによりｐＨ４に酸性化した。こ の時点で好ましい抗体濃度はｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌであった。ペプシンを、終 濃度２０μｇ／まで加えた。混合液を３７℃で一晩インキユベートした。６．Ｏ Ｎ　ＮａＯＨを加えて反応混合液のｐＨを７．５にすることで反応を停止した。

消化抗体フラグメント溶液を２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。５ｐｈｅ　ｒｏｇｅＩ 　ＴＳＫ−Ｇガードカラム（２，１５ｃｍＸ７．５ｃｍ）を取り付けたＳｐｈｅ ｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ−３０００ＳＷＧカラム（２，１５ｃｍｘ３０ｃｍ）を使用 したゲル濾過高性能液体クロマトグラフィーによって、Ｆ（ａｂ’）ｔフラグメ ントを精製した。

抗ｈＣＧ　ＴＮＢ−Ｆａｂ’フラグメントの調製：Ｐａｒｈａｍら（Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏ　１．Ｍｅ　ｔｈｏｄ　：　５３　：　１３３−１７３．１９８２）及び Ｂｒｅｎｎａｎら［５ｃｉｅｎｃｅ：２２９：８１−８３．１９８５］の方法の 改良法に従い、抗ｈＣＧ　Ｆａｂ’フラグメントを調製し、チオール反応性形態 に誘導した。２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０゜１ＭＮａＡｓＯ２の溶液（１５８μ ｌ）を、ＰＢＳ中の微量の”’Ｉ　−Ｆ　（ａ　ｂ’）ｚを含むヤギＦ（ａｂ’ ）ｚ（ヤギ抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体フラグメント、１６ｍｇ／ｍｌ） の溶液１．２８ｍ１に、撹拌しながら加えた。０．１Ｍシスティン−ＨＣｌ　（ １５８μｌ）を加えることにより還元的切断反応を開始した。反応混合液に窒素 を重層し、撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１９ｍｇ の５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を加えることにより反応を停 止した。室温で一晩撹拌した後、混合液を、ＰＢＳで予め平衡化しておいたＰＤ −１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ） においてクロマトグラフィー処理し、更にサイズ排除高性能液体クロマトグラフ ィーカラム（Ｓｐｈｅｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ−Ｇガードカラム（２，１５ｃｍｘ７ ．５Ｃｍ）を取り付けたＳｐｈｅｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ−２０００ＳＷＧカラム（ ２，１５ｃｍＸ　３０　ｃｍ）　）においてクロマトグラフィー処理した。ＣＸ −１０限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ。

ＭＡ）を使用し、Ｆａｂ’の精製チオニトロベンゾエート誘導体（ＴＮＢ−Ｆ　 ａ　ｂ’）を７．９ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

抗ｈＣＧ　ＴＮＢ−Ｆａｂ’フラグメントの５ｐ−８ＵＣ，５−ＲＳ　Ａへの結 合＝ＩＭジチオトレイトール（ＤＴＴ　；８６　ｕ　ｌ　）溶液を、３７．５ｍ Ｍリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣ１及び２．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６ ，８）中にＳｐ　５ＵＣｓ５　Ｒ８Ａ　（２，２ｍｇ／ｍＩ）を含む溶液（４， ２ｍ　ｌ　）に加えた。混合液を３７℃で３時間、次いで室温で一晩インキユベ ートした。得られた反応混合液を、５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標）Ｇ−２５（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）を充填し、７５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ 　ＮａＣｌ及び２．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，８）で予め平衡化しておいた ２、５ｃｍｘ２０ｃｍカラムにおいてクロマトグラフィー処理した。還元した５ ｐ−ｓｔｒｃａｓ　Ｒ８Ａ　（０，４８ｍｇ／ｍ１）のプールフラクション２ｍ ｌを抗ｈＣＧ　ＴＮＢ−Ｆａｂ’　（０，１５ｍ１　；　７．９ｍｇ／ｍｌ）と 混合した。混合液を室温で一晩撹拌した。

次いで反応混合液を１００ｍＭヨード酢酸（１０７μｍ）で処理し、室温で１時 間撹拌した。ＳｐｈｅｒｏｇｅｌＴＳＫ−Ｇガードカラム（２，１５ｃｍＸ７． ５　ｃｍ）を取り付けたＳｐｈｅｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ−３０００ＳＷＧカラム（ ２，１５ｃｍＸ３０ｃｍ）を使用したサイズ排除高性能液体クロマトグラフィー によって、Ｆａｂ’−３ｐ−８ＵＣ，５−Ｒ３Ａ結合体を精製した。

抗ｈＣＧ抗体のＳｐ　５ＵＣｓｓ−Ｒ８Ａへの結合二Ｎ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド中に３０ｍＭ　スクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイ ミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレートを含む溶液（２７μｍ ）を、ＰＢＳ中にアフィニティー精製ヤギ抗ｈＣＧ抗体（３ｍｇ／ｍｌ）を含む 溶液２．２５ｍ１に加えた。得られた反応混合液を室温で１時間撹拌し、次いで 、７５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭＮａＣ１及び２．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　 （ｐＨ６，８）で予め平衡化しておいたＰＤ−１０カラムにおいてクロマトグラ フィー処理した。修飾抗体（１，６ｍｇ／ｍｌ）のプールフラクション１．８ｍ ｌを、３ｍｌのＤＴＴ還元Ｓｐ　ＳＵＣ＠ｅ　Ｒ８Ａ　（０，４８ｍｇ／ｍｌ） と混合した。

室温で一晩撹拌した後、１００ｍＭヨード酢酸（０，２５ｍ１）を加え、室温で １時間撹拌することにより、反応を停止した。上述のごときサイズ排除高性能液 体クロマトグラフィーによって、抗体−ｓｐ　５ＵＣｓｉ　Ｒ３Ａ結合体を精製 した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１００ｍＭ　Ｎ ａＣ＋、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ、０．１ｍＭ　ＺｎＣ］ｚ、０．０７％ＮａＮ３及 び１％魚ゼラチンを含むアッセイ緩衝液ｐＨ７，５中の（抗ｈＣＧ抗体を過ヨウ 素酸活性化アルカリ性ホスファターゼに結合することにより調製した）アルカリ 性ホスファターゼ−ヤギ抗ｈｃＧ抗体結合体からなった。

ｃ、ｈＣＧのサンドイッチイムノアッセイ方法イオン捕獲イムノアッセイ方法は 、実質的に実施例２に記載の方法に従って調製した固相と、指示薬（アルカリ性 ホスファターゼ−ヤギ抗ｈＣＧ抗体結合体）と、上記実施例３ａで調製した２種 類の捕獲剤（ヤギ抗ｈＣＧ　Ｆａｂ’−Ｓ　ｐ　Ｓ　Ｕ　Ｃｓ　ｓ　ＲＳ　Ａ　 及ヒヤギ抗ｈ　ＣＧ　Ｉ　ｇ　Ｇ　Ｓｐ　−Ｓ　Ｕ　Ｃｓ　ｓ　ＲＳ　Ａ　）の うちいずれか１種と、精製ｈｃＧ標準液とを使用した。全ての試薬をアッセイ緩 衝液で（力価曲線によって決定されるように）適正に希釈した。

同量（７５０μｌ）の指示薬及びｈＣＧ試料溶液を一連の試験管に入れた。３７ ℃で３０分間インキュベートした後、各インキュベート混合液のアリコート１２ ５μｍを別々の試験管中で同量の捕獲剤と混合した。得られた混合液を３０分間 インキュベートした。次いで、アッセイ混合液（７５μｌ）を各固相材料に加え た。次いで固相材料を各々１５０μｍの洗浄用緩衝液（２５ｍＭ）リス（ヒドロ キシメチル）アミノメタン、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１，０ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　 ２．　０　、１　ｍ　Ｍ　Ｚ　ｎ　ＣＩ　２及び０．０７％　ＮａＮ。

、ｐＨ７，５）で３回洗浄した。酵素基質（１００ｍＭ　ＡＭ　Ｐ　、１　、０ 　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｍ、０　、１％　ＮａＮ、及び４．０ｍＭ　テトラミソ ール、ｐＨ１０，３中に１．２．ｍＭ４−メチルウンベリフェリルホスフェート を含む溶液７０μｍ）を固相材料に加えた。生じた蛍光量を３２．７℃で測定し た。実験結果を表６にまとめて示す。結果から、ｈＣＧ試験試料濃度が増加する と、それに対応して捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体の形成が増加し、従って 固相に付着する検出可能な標識の量が増加したことが判る。

表６ ｈＣＧイオン捕獲サンドイッチアッセイにおける種々の捕獲剤の比較指示薬：ｈ ＣＧ特異特異的ヤギ１−Ｇルカリ性ホスファターゼ蛍光量（カウント／秒／秒） ｈＣＧ特異的捕獲剤 １２．５　９６　１１０ 実施例４ ｈＣＧの間接サンドイッチイオン捕獲イムノアッセイ間接イオン捕獲イムノアッ セイは、実質的に上記実施例２に記載のごと（調製した固相と、アルカリ性ホス ファターゼ−ヒツジ抗マウスＩｇＧ結合体［Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅ ｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉ　ｎ　ｃ、］の指示薬と、実施例３に記載のごときヤギ抗ｈＣＧ　Ｆ（ａｂ’ ）ｚ　Ｓｐ　５ＵＣａｓ　Ｒ８Ａの捕獲剤と、マウスモノクローナル抗ｈＣＧ抗 体の補助特異的結合メンバー（ＩｍｍｕｎｏＳｅａｒｃｈ；Ｔｈｏｍａｓ　Ｒｉ ｖｅｒ、ＮＪ、０８７５３）と、精製ｈＣＧ標準液トヲ使用した。補助特異的結 合メンバーは、被分析物質及び指示薬に結合するよう使用した。全ての試薬をア ッセイ緩衝液で適正に希釈した。同量（１５０μｍ）の指示薬、ｈＣＧ試料溶液 及び補助特異的結合メンバーを一連の試験管に入れた。３７℃で５分間インキュ ベートした後、各試験管にそれぞれ１５０μＩの捕獲剤を加えた。得られた混合 液を５分間インキュベートした。次いでアッセイ混合液（，２００μｌ）をそれ ぞれ調製した固相材料に加えた。次いで上記実施例３に記載したのと同様に、固 相材料を洗浄用緩衝液で洗浄し、酵素基質溶液で処理した。生じた蛍光量を３２ ゜７℃で測定した。アッセイ結果を表７にまとめて示す。結果から、ｈＣＧ試験 試料濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／被分析物質／補助特異的結合メ ンバー／指示薬結合体の形成が増加し、従って固相に付着する検出可能な標識の 量が増加したことが判る。

表７ ｈＣＧのイオン捕獲間接サンドイッチアッセイ５０、０　２３０ １００、０　４４３ ２００、０　７３２ 実施例５ ２つの補助特異的結合メンバーを使用するｈＣＧの間接サンドイッチイオン捕獲 イムノアッセイ このイオン捕獲イムノアッセイは、実質的に実施例２に記載の方法に従って調製 した固相と、アルカリ性ホスファターゼ−ヒツジ抗マウスＩｇＧ結合体（Ｊａｃ ｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ、Ｉｎｃ、 ］の指示薬と、マウスモノクローナル抗ｈｃＧ抗体の補助特異的結合メンバー（ ＩｍｍｕｎｏＳｅａｒｃｈ；Ｔｈｏｍａｓ　Ｒｉｖｅｒ、ＮＪ、０８７５３）　 と、精製ｈＣＧ標準溶液とを使用した。更に、アフィニティー精製ヤギ抗ｈＣＧ 抗体の第２補助特異的結合メンバーと、ウサギ抗ヤギＩ　ｇＧ−８ｐ−８ＵＣｓ ｓ−Ｒ８Ａの捕獲剤をも使用した。捕獲剤は、上記実施例３に記載の方法に従っ てアフィニティー精製ウサギ抗ヤギｌ　ｇＧ　（Ｃａｐｐｅ　１；Ｃｏｃｈｒａ ｎｖｉｌｌｅ、ＰＡ、１９３３０〕を５ｐＳＵＣｓｓ　Ｒ８Ａに結合することに より調製した。全ての試薬をアッセイ緩衝液で適正に希釈した。同量（１００μ ｍ）の指示薬、ｈＣＧ試料溶液及び第１補助特異的結合メンバーを一連の試験管 に入れた。インキュベーション（３７°Ｃで１０分間）後、第２補助特異的結合 メンバー（１００μＩ）を加え、インキュベーションを続行した（３７℃で更に ５分間）。最後に、各試験管に捕獲剤（１００μＩ）を加えた。得られた混合液 を５分間インキュベートした。次いでアッセイ混合液（２００μｍ）をそれぞれ 調製した固相材料に加えた。次いで上記実施例３に記載したのと同様に、固相材 料を洗浄用緩衝液で洗浄し、酵素基質溶液で処理し、蛍光量を測定した。アッセ イ結果を表８にまとめて示す。結果から、ｈＣＧ試験試料濃度が増加すると、そ れに対応して捕獲剤／補助特異的結合メンバー／被分析物質／補助特異的結合メ ンバー／指示薬結合体の形成が増加し、従って固相に付着する検出可能な標識の 量が増加したことが判る。

表８ ｈＣＧのイオン捕獲間接サンドイッチアッセイ捕獲剤：ウサギ抗ヤギＩ　ｇＧ− ８ｐ　５ＵＣｓｓ　Ｒ８Ａ指示薬：ヒツジ抗マウスＩｇＧ−アルカリ性ホスファ ターゼ補助特異的結合メンバー：マウスモノクローナル抗ｈＣＧ抗体ヤギ抗ｈ　 ＣＧ　（ｎｇ／ｍｌ）　ｈＣＧ（４０ｍＩＵ／ｍｌ）　陰性対照（Ｏｖ＋ＩＵ／ ｍ１）実施例６ 抗プロゲステロン抗体のイオン捕獲イムノアッセイａ、ＰＧＡ標識ヤギ抗マウス 捕獲剤の調製以下の一連のステップは、抗体／ポリグルタミン酸結合体の調製に 使用される化学機構を説明するものである。

ＰＧＡ−ナトリウム塩の遊離酸形態への変換：　ＰＧＡのナトリウム塩（２００ ｍｇ　；　１．４７ｘｌＯ”モル；平均ＭＷＩ　３．６００　：　Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ）を５９ｍ１の水中でカチオン交換樹脂（ＡＣ３０Ｗ−Ｘ８　：　１３　ｇ　 ；　Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）と−緒に３時間撹拌した。

上清をデカントし、濾過し、蒸発させ、収率８ｏ％で白色粉末状の遊離酸形態の ｐＧＡ　（１３７ｍｇ　；平均ＭＷＩＩ。

６２０）を得た。

イソチオシアネート−ＰＧＡ　（ＩＴＣ−ＰＧＡ）の調製ニジメチルホルムアミ ド（ＤＭＦ；２ｍ１）中に遊離酸形態のＰＧＡ　（６５ｍｇ；５．６Ｘ１０−’ モル）を含む溶液に、トリエチルアミン（１００μｌ　；７．２Ｘ１０−’％ル ）及び１．４−フェニレンジイソチオシアネート（１１０ｍｇ；５．７ｘｌＯ− ’モル；Ａｌｄｒｆｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋ ｅｅ、ＷＩ）を加えた。室温で一晩撹拌した後、酢酸（１００μｌ　；　１．７ ＸＩＯ−３モル）を加え、次いで反応混合液を蒸発させた。

残渣に塩化メチレン（２５ｍｌ）を加え、２時間撹拌してから混合液を濾過し、 白色粉末状のＩＴＣ−ＰＧＡ　（１０１ｍｇ）を得た。

ＩＴＣ−ＰＧＡ　（２９５μｇ；２．５Ｘ１０−’モル；２０％ＤＭＦ１０．１ Ｍリン酸ナトリウム　４０μｌ、ｐＨ７゜０中）を、ヤギ抗マウスＩｇＧ　（２ ００μｇ　；　１．２５Ｘ１０−’モル；　Ｓ　ｉ　ｇｍａ　；　０．１Ｍリン 酸ナトリウム４０μＩ、ｐＨ７中）の緩衝溶液に加え、ＰＧＡ標識ヤギ抗マウス 捕獲剤を形成した。室温で２日間撹拌してから、０゜１Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（２ ０μ］　；　ｐＨ７，４）を加え、得られた混合液を、使用するまで２〜８℃で 保管した。

ｂ　抗プロゲステロン抗体のイムノアッセイ抗プロゲステロン抗体イオン捕獲イ ムノアッセイでは、実施例１に記載のごとき第四級ポリマー化合物で被覆した固 相材料を使用した。６０μｌの試料を反応ウェルに入れた。試料は、リン酸緩衝 塩水溶液（ＰＢＳ；５０ｍＭリン酸ナトリウム、９９ｍＭ　ＮａＣ＋、０．１％ ＮａＮ５．ＤＨ７，４）中にモノクローナル抗プロゲステロン抗体をＯ１５，５ ０，１００，２５０及び５００ｎｇ／ｍ＋の濃度で含む溶液からなった。次に、 ２０μｍのＰＢＳを反応ウェルに加え、更に緩衝指示薬としてアルカリ性ホスフ ァタアーゼで標識したプロゲステロン（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４，１５ ０ｍＭ　ＮａＣ１，１％ＮａＮ３，１ｍＭＭｇＣ１ｚ、０．１ｍＭ　ＺｎＣ］ｚ 及び１％ＢＳＡからなるＴｒｉｓ緩衝液中３μｇ／ｍ１）２０μｌを加えた。混 合液を３４．５℃で１０分間インキュベートした後、捕獲剤を加えた（２０μｌ ；上記ストック溶液をＰＢＳで１／１００に希釈したＰＧＡ標識ヤギ抗マウス抗 体）。混合液を３４．５℃で更に１０分間インキュベートした。混合液の１００ μｌアリコートを固相材料に添加し、次いで各７５μｍの希釈液で３回洗浄した 。最後に、酵素基質溶液（１００ｍＭ　ＡＭＰ、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、０．１％ 　ＮａＮ３及び４．０ｍＭ　テトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ４− メチルウンベリフェリルホスフェートを含む溶液７０μｌ）を固相に加え、生じ た蛍光量を測定した。実験結果を表９に示す。結果から、抗プロゲステロン試験 試料濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／被分析物貢／指示薬結合体の形 成が増加し、従って固相に付着する検出可能な標識の量が増加したことが判る。

表９ マウスモノクローナル抗プロゲステロン抗体のイオン捕獲アッセイ捕獲剤：　Ｐ ＧＡ標識ヤギ抗マウス抗体指示薬：アルカリ性ホスファターゼ標識プロゲステロ ン１．００　４４１ ５００　、　２７２１ 実施例７ プロゲステロンの間接競合イオン捕獲イムノアッセイ実質的に実施例１に記載の 方法に従って固相を調製した。

ＰＢＳ中の種々の濃度のプロゲステロンの試料６０μｌを、プロゲステロン標識 アルカリ性ホスファターゼ指示薬（実施例４のＴｒｉｓ緩衝液中０．４μｇ／ｍ １）２０μｌ及び補助特異的結合メンバーとしてのマウス抗プロゲステロン抗体 （ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍ＋）２０μｌと混合した。

混合液を３４．５℃で１ｏ分間インキュベートした後、上記実施例６に記載のご と（、ＰＧＡ標識ヤギ抗マウス抗体捕獲剤２０μｌを加えた。得られた混合液を ３４．５℃で更に１０分間インキュベートした。混合液の１００μｍアリコート を固相材料に添加し、次いで希釈液で３回洗浄した。最後に、酵素基質溶液（１ ００ｍＭ　ＡＭＰ、１ｍＭＭｇＣ１ｚ、０．１％ＮａＮ３及び４．０ｍＭ　テト ラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ４−メチルウンベリフェリルホスフェ ートを含む溶液７０μｌ）を固相に加え、生じた蛍光量を測定した。アッセイ結 果を表１０に示す。結果から、プロゲステロン試験試料濃度が増加すると、それ に対応して捕獲剤／補助特異的結合メンバー／指示薬結合体の形成が減少し、従 って固相に付着する検出可能な標識の量が減少したことが判る。

表１０ プロゲステロンのイオン捕獲間接競合アッセイ捕獲剤：　ＰＧＡ標識ヤギ抗マウ ス抗体指示薬、アルカリ性ホスファターゼ標識プロゲステロン補助特異的結合メ ンバー：マウス抗プロゲステロン抗体１、８８　２７７ 実施例８ アニオン性捕獲剤形成のためのポリ−Ｌ−グルタミン酸の活性化 以下の一連のステップは、負電荷を有する捕獲剤を形成するためのタンパク質− ＰＧＡ結合体のバルク調製に使用される化学機構を説明するものである。

ａ、ＰＧＡナトリウム塩の遊離酸形態への変換ＰＧＡのナトリウム塩（１００ｍ ｇ　：　７．３５Ｘ１０−’モル：平均ＭＷＩ　３．６００　：　Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ）を、水素形態カチオン交換樹脂（５０当量／グルタメート残基；ＡＧ５０Ｗ −Ｘ８　；　Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ）と−緒に一晩撹拌した。樹脂は予め蒸留水で 膨潤及び洗浄し、最終的に蒸留水中に再懸濁させておいた（２０ｍｌ／７ｇ乾燥 重量ビーズ）。上清を除去し、凍結乾燥すると、収率９０％で白色粉末状の遊離 酸形態のＰＧＡ　（ＰＧＡＦＡ）（８０ｍｇ　；平均ＭＷ１１．６２０）が得ら れた。遊離酸形態は、有機溶剤中で可溶性とするために使用した。

ｂ、ＩＴＣ−ＰＧＡＦＡの調製 ＰＧＡＦＡを溶剤中に溶解した（ＤＭＦＭＦ中ｍｇ／ｍ■）。この溶液にプロト ン吸収剤（４−メチルモルホリン）を、滴定可能遊離カルボン酸当たり約１当量 の量で加えた。次いで、約１００モル過剰量のアミン反応性修飾剤（溶解するの に十分なりＭＦ中の１．４−フェニレンジイソチオシアネート〔ＤＩＴＣ〕）を 溶液に加えた。反応混合液を室温で一晩撹拌した。反応混合液を回転蒸発してほ ぼ乾固し、塩化メチレン（２５ｍｌ）を加えてＩ　ＴＣ−ＰＧＡＦＡを沈澱させ た。凝集沈澱物を遠心し、塩化メチレン及び未反応のＤＩＴＣを除去した。沈澱 ／遠心過程を、検出可能なりＩＴＣが実質的に残留しなくなるまで繰り返した。

ＤＩＴＣは、塩化メチレン中で展開するシリカスライドにおける薄層クロマトグ ラフィーを使用して検出した。

ＩＴＣ−ＰＧＡＦＡは起点に残り、ＤＩＴＣは溶剤前線と共に移動する。残りの 固体を真空乾燥し、黄色粉末状の■ＴＣ−ＰＧＡＦＡを得た。

ｃ、ＩＴＣをタンパク質に結合することによる捕獲剤の調製 （タンパク質に対して約１〜約２０モル過剰量の）ＩＴＣ−ＰＧＡＦＡを０．２ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８゜５中に、容積を出来る限り小さく維持して溶 解した。必要に応じてｐＨを８゜５に調整した。所望のタンパク質をこの溶液に 加え、３７℃で一晩インキユベートした。次いで調製液を、１〜２ｍｇタンパク 質の調製に対しては分析用ＴＳＫ　４００　Ｂｉｏ−Ｒａｄカラム（７，５Ｘ３ ００ｍｍ、流量１ｍｌ／分）、また２〜１０ｍｇタンパク質の調製に対してはＴ ＳＫ　４０００　Ｂｅｃｋｍａｎカラム（３１，５Ｘ　３００ｍｍ、流量５ｍ１ ／分）におけるＨＰＬＣを使用して画分化した。溶出緩衝液は、０．１Ｍリン酸 ナトリウム及び０．３Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ６，８を含んだ。両分を試験し、適当 に混合した。種々の結合比における種々の含むかかるフラクションのアミノ酸含 有量を測定した。測定の結果を表１１に与える。

表１１ 種々のタンパク質を用いたＩ　ＴＣ−ＰＧＡＦＡの結合効率抗ＣＥ＾抗体　１　 ０．７７　７７ モノクローナル１．０ｍｇ　５　１．７　３４１０　３．１　３１ ２０　８．６　４３ ヤギ抗ウサギ抗体　５　１．８　３７ モノクローナル１．Ｏｍｇ 抗β−ｈＣＧ抗体　１０　４．６　４６、モノクローナル１．０ｍｇ　１５　５ ．２　３６モノクローナル１０ｍｇ　１５　７．８　５２抗ジゴキシン抗体 モノクローナル１．０ｍｇ　１５　８．１　５４モノクローナル５．０ｍｇ　１ ５　５．５　３７ヤギ抗マウス抗体 ポリクローナル１．ｈｇ　１５　４．３　２９抗Ｔ４抗体 モノクローナル１．０ｍｇ　１５　６．９　４６抗月抗体 ポリクローナル７．０ｍｇ　１５　１３．８　９２テオフイリン標識した　１５ 　７．８　５２ウサギ血清アルブミン 表１１の第１列は、種々の捕獲剤を形成するために反応に使用したタンパク質の 量を示しており、第２列は、第１列のタンパク質と反応させた活性化ＩＴＣ−Ｐ ＧＡＦＡのモル過剰量を示しており、第３列は、平均分子量４０．０００及び反 復グルタメート残基数３０５を基準にアミノ酸分析することにより計算された、 反応によって１抗体当たりに結合したＰＧＡ鎖の数を示しており、第４列は、反 応に使用した活性化ＰＧＡのモル過剰量を基準にしたＰＧＡ鎖の置換効率の計算 値を示す。

実施例９ テオフィリンイオン捕獲競合アッセイ：抗原捕獲形式ａ、テオフィリン捕獲剤の 調製 テオフィリン−ブチラード（１０ｍｇ　：　ＭＷ２８０．２９　；　３．５７Ｘ 　１０−５モル）を塩化メチレン（３，０ｍ１）中に溶解することによりテオフ ィリンを活性化した。３モル過剰量のジシクロへキシルカルボジイミド（２２ｍ ｇ＋ＭＷ２０６．３）及び３モル過剰量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１２ ，３ｍｇ；ＭＷ１１５．０９）を加え、反応混合液を室温で一晩撹拌した。混合 液を濾過してジシクロへキシルウレアを除去し、回転蒸発乾固し、１０ｍｇのＮ −スクシンイミジルテオフィリンーブチラード（テオフィリンーブヂラートーｏ Ｓｕ）を得た。

ポリグルタミン酸の遊離酸（ＮＨ！　ＰＧＡＦＡ　；　１．４ｍｇ　；ＭＷＩＩ 、７９８　；　１．１９ｘｌＯ−’モル）をＤＭＦ　（０，５ｍ１）及びＮＭＭ 　（１，１ｍｇ　；ＭＷｌｏｌ、１５　：　１．０７Ｘ１０−’モル）中に溶解 した。テオフィリン−ブチラード−ｏＳｕ　（１０ｍｇ　；　１ｍｇ１０．５ｍ ｌＤＭＦ）を加え、反応混合液を室温で一晩撹拌した。ｐＨ７゜０の０．１Ｍリ ン酸ナトリウム緩衝液に透析することにより、未結合のテオフィリンを除去した 。得られた捕獲剤のテオフィリン含有量を分析すると、ＩＰＧＡ鎖当たり３゜９ 個のテオフィリン分子が結合していることが判った。次いで、抗テオフィリン抗 体と結合し得るテオフィリン−ＰＧＡ捕獲剤を、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍ Ｍ　ＮａＣ１゜１ｍＭ　ＭｇＣ１２＋　０．１ｍＭ　ＺｎＣ＋！、０．１％Ｎａ Ｎ３及び１％魚ゼラチンを含むアッセイ緩衝液、ｐＨ７，２で３μｇ／ｍｌに希 釈した。

ｂ、固相の調製 ファイバーマトリックスを第四級ポリマー化合物で被覆し、正電荷を有する固相 を得た。水溶性セルロース誘導体であるＣｅ１ｑｕａｔ　（登録商標）Ｌ−２０ ０ポリマー化合物を使用した。１０ｍＭ　ＮａＣ１（５０μｌ）を含むＣｅ１ｑ ｕａｔ　（登録商標）Ｌ−２００ポリマー化合物（５０μＩ）の０．５％水溶液 を固相材料に添加した。

Ｃ１指示薬の調製 指示薬は、実質的に実施例３．ｂに記載の方法に従って調製した、アルカリ性ホ スファターゼ及び抗テオフィリン抗体の結合体からなった。指示薬をアッセイ緩 衝液で（力価曲線によって決定されるように）適正に希釈し０．１７μｇ抗体／ 　ｍ　１を得た。

ｄ、イムノアッセイ方法 指示薬（２００μＩ）を一連の反応試験管に入れた。テオフィリン標準溶液（２ ００μｌ；テオフィリン−ブチラードを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ　Ｎａ Ｃ１及び０゜１％ＮａＮ５．ｐＨ７，２を用いて０，６．１．２．２．５．４． ９．９．９．９９．２及び９９２　ｕ　ｇ／ｍ　ｌに希釈した溶液）を各試験管 に加えた。混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。捕獲剤（２００μｍ ）を各試験管に加え、反応混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。

各反応混合液のアリコート（２００μｍ）を固相材料に添加し、希釈液（７５μ ｍ）で１回洗浄した。酵素基質（７０ｔｔ　Ｉ　；　１００ｍＭ　ＡＭＰ、１． ０ｍＭ　ＭｇＣＬ、ｏ。

１％　ＮａＮ、及び４．０ｍＭテトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ　 ４−メチルウンベリフェリル−ホスフェートを含む溶液）を３２℃で加えて指示 薬と反応させ、生じた蛍光量を測定した。アッセイ結果を表１２に示す。結果か ら、テオフィリン類縁体試験試料濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／指 示薬結合体の形成が減少し、従って面相に付着する検出可能な標識の量が減少し たことが判る。

表１２ テオフィリンイオン捕獲競合アッセイ：抗原捕獲形式捕獲剤：テオフィリン−Ｐ ＧＡ ０、６　２５０ １、２　２１２ ２、５　２０２ ４、９　１９６ ９・９１６８ ９９、２　６８ 実施例１０ フェニルジクリジンイオン捕獲競合アッセイ：抗原捕獲形式 ａ、フェニルジクリジン捕獲剤の調製 ４−ヒドロキシ−フェニルジクリジン（１，１ｍｇ　；ＭＷ２５９．３７　；　 ４．２４Ｘ１０−’モル）をテトラヒドロフ５７　（ＴＨＦ　；　０．５ｍ１） 中に溶解した。ベンゼン中１０％ホスゲンを１／２ｍｌ加えた（１３０モル過剰 量）。

室温で２．５時間反応させた。溶剤を窒素流下に蒸発させ、フェニルジクリジン −４−クロロホルメートの残渣を得た。

フェニルジクリジンー４−クロロホルメート（１，１ｍｇ）をＴＨＦ　（０，５ ｍ１）中に溶解した。これに、１−メチル−２−ピロリジノン（０，５ｍ１）中 に溶解したＮＨ２−ＰＧＡＦＡ　（１，７ｍｇ　；ＭＷＩ　１，７９８　：１． １９ｘｉｏ−’モル）を加えた。室温で一晩反応させ、回転蒸発乾固した。生成 物を０．１Ｍリン酸ナトリウム（１，５ｍｇ。

ｐＨ７，０）中に溶解した。沈澱物を濾過し、不透明な水性濾液を透明になるま で塩化メチレンで抽出した。抗フェニルジクリジン抗体と結合し得るフェニルジ クリジン−ＰＧＡ捕獲剤を、実施例９に記載のごときアッセイ緩衝液で５μｇ　 ／　ｍ　ｌに希釈した。

ｂ、固相の調製 実質的に実施例９に記載の方法に従って固相を調製した。

Ｃ３指示薬の調製 指示薬は、アルカリ性ホスファターゼ及び抗フェニルジクリジン抗体の結合体か らなった。指示薬を、実施例９に記載のごときアッセイ緩衝液で１／２５０に希 釈した。

ｄ、イムノアッセイ方法 指示薬（１４０μｍ）を、既知量のフェニルジクリジン（ヒト尿中０．０．２５ ．６０．１２０．２５０及び５００ｎｇ／ｍｌ）を含む一連の試料（各々５０μ ｌ）と混合し、混合液を３２℃で１０分間インキュベートした。フェニルジクリ ジン−ＰＧＡ捕獲剤（１００μｌ）を加え、反応混合液を１０分間インキュベー トした。各反応混合液のアリコート（２００μｌ）を固相試料に添加した。次い で固相を２回洗浄した。酵素基質（７０μｌ；実施例９に記載のもの）を加え、 生じた蛍光量を測定した。アッセイ結果を表１３に示す。結果から、フェニルジ クリジン試験試料濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／指示薬結合体の形 成が減少し、従って固相に付着する検出可能な標識の量も低下したことが判る。

表１３ フェニルジクリジンイオン捕獲競合アッセイ：抗原捕獲形式 捕獲剤：フェニルジクリジンーＰＧＡ 実施例１１ ジゴキシンイオン捕獲競合アッセイ：抗原捕獲形式ａ、ジゴキンン−１ｇＧ−Ｐ ＧＡ捕獲剤の調製実質的に実施例８．ｃに記載の方法に従って、ジゴキシン−Ｉ 　ｇＧ−ＰＧＡ捕獲剤を調製した。但し、以下の点を変更した。ＩＴＣ−ＰＧＡ 　（５ｍｇ　；　１．２５ｘｌＯ−’モル：０．ＩＭリン酸ナトリウム１．０ｍ １．ｐＨ８，５中）をウサギＩｇＧジゴキシン（１ｍｇ　；　６．２５Ｘ１０− ’モル；０．ＩＭリン酸ナトリウム及び０．３Ｍ　ＮａＣ１１，４４９３ｍ１． ｐＨ８，５中）の緩衝溶液に加えて捕獲剤を形成した。溶液を撹拌し、３７℃で 一晩インキユベートした。

次いで調製液を、ＢｉｏＳｉｌ　４００　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ３００ｍｍｘ７．５ ｍｍゲル濾過カラム）において０．１Ｍリン酸ナトリウム及び０．３Ｍ　ＮａＣ １，りＨ６，８を１ｍ１／分で溶出するＨＰＬＣによって画分化した。抗ジゴキ シン抗体に結合し得るジゴキシン−Ｉ　ｇＧ−ＰＧＡ捕獲剤を、実施例９に記載 のごときアッセイ緩衝液で３μｇ／ｍｌに希釈した。

ｂ、固相の調製 実質的に実施例９に記載の方法に従つて固相を調製した。

Ｃ９指示薬の調製 指示薬は、アルカリ性ホスファターゼ及びマウス抗ジゴキシン抗体の結合体［１ ｍｍｕｎｏＳｅａｒｃｈ　；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９ ４６０８］からなった。指示薬を、実施例９に記載のごときアッセイ緩衝液で３ ３．３ｎｇ／ｍｌに希釈した。

ｄ、イムノアッセイ方法 指示薬（２００μｍ）を、既知量のジゴキシン（正常ヒト血清中０．５、■、０ ．２．５．５．０及び５０．０　ｎ　ｇ／ｍ＋）を含む一連の試料（各々２００ μｌ）と混合した。

混合液を３７℃で１５分間インキュベートした。ジゴキシン−１ｇＧ−ＰＧＡ捕 獲剤（２００μｌ）を加え、反応混合液を１５分間インキュベートした。各反応 混合液のアリコート（２００μｌ）を固相材料に添加し、次いで洗浄した。酵素 基質（７０μｍ；実施例９に記載のもの）を加え、生じた蛍光量を測定した。ア ッセイ結果を表１４に示す。

結果から、ジゴキシン試験試料濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／指示 薬結合体の形成が減少し、従って固相に付着する検出可能な標識の量も減少した ことが判る。

表１４ ジゴキシンイオン捕獲競合アッセイ：抗原捕獲形式捕獲剤：ジゴキシン−Ｉ　ｇ Ｇ−ＰＧＡ指示薬：アルカリ性ホスファターゼ標識抗ジゴキシン抗体５、０　６ ０ ５０、０　１４ 実施例１２ ジゴキシンイオン捕獲競合アッセイニ抗体捕獲形式ａ、指示薬の調製 指示薬は、アルカリ性ホスファターゼ及びジゴキシンの結合体［ＩｍｍｕｎｏＳ ｅａｒｃｈ］からなった。指示薬を、実施例９に記載のごときアッセイ緩衝液で １／１００に希釈した。

ｂ、イムノアッセイ方法 抗ジゴキンンーＰＧＡ捕獲剤（２００μｌ、実質的に実施例８．ｃに記載の方法 に従って調製したもの）を、実施例１１に記載のごとき既知量のジゴキシンを含 む一連の試料（各々２００μｌ）と混合した。混合液を３７℃で１５分間インキ ュベートした。指示薬（２００μｍ）を加え、反応混合液を１５分間インキュベ ートした。各反応混合液のアリコー）（２００μｍ）を固相（実施例９に記載の ごとく調製したもの）に添加し、次いで洗浄した。酵素基質（７０μＩ：実施例 ９に記載のもの）を加え、生じた蛍光量を測定した。アッセイ結果を表１５に示 す。結果から、ジゴキシン試験試料濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／ 指示薬結合体の形成が減少し、従って固相に付着する検出可能な標識の量も減少 したことが判る。

表１５ ジゴキシンイオン捕獲競合アッセイ：抗体捕獲形式捕獲剤：抗ジゴキシン抗体− ＰＧＡ 指示薬：アルカリ性ホスファターゼ標識ジゴキシン実施例１３ 別のｈＣＧイオン捕獲サンすイッチアッセイａ、捕獲剤の調製 実質的に上記実施例８．ｃに記載の方法に従って抗ｈｃＧ抗体−ＰＧＡ捕獲剤を 調製した。

ｂ、固相の調製 ファイバーマトリックスを緩衝液（８０μｍ；３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ 　Ｔｒ　ｉ　ｓ及び０．１％ＮａＮ、を含む溶液、ｐＨ７，５）で濡らした。マ トリックスを、Ｃｅ１ｑｕａｔ（登録商標）Ｌ−２００ポリマー化合物の０゜５ ％水溶液＜５０ｕ　１　；　１０ｍＭ　ＮａＣＩを含む）を用いて被覆し、次い で緩衝液で２回目の洗浄を行なった。

Ｃ０指示薬の調製 指示薬は、アルカリ性ホスファターゼ及びヤギ抗ｈＣＧ抗体の結合体（実質的に 実施例３．ｂに記載の方法に従って調製したもの）からなった。指示薬を、２５ ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　Ｚｎ Ｃ１ｚ、０．１％ＮａＮ３．５％ヤギ血清及び１％魚ゼラチンを含むアッセイ緩 衝液、ｐＨ７，２で（力価曲線によって決定されるように）適正に希釈した。

ｄ、イムノアッセイ方法 指示薬（１４０μｍ）を、ヒト正常血清中に既知量のｈＣＧを含む一連の試料（ ５０μＩ）と混合した。混合液を３１〜３２℃で１０分間インキュベートした。

抗ｈＣＧ抗体−ＰＧＡ捕獲剤（１００μｍ）を加え、反応混合液を１０分間イン キュベートした。各反応混合液のアリコート（２００μｌ）を固相材料に添加し 、次いで洗浄した。酵素基質（７０μ１．実施例９に記載のもの）を加え、生じ た蛍光量を測定した。アッセイ結果を表１６に示す。結果から、ｈＣＧ試験試料 濃度が増加すると、それに対応して捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体の形成が 増加し、従って固相に付着する検出可能な標識の量も増加したことが判る。

表１６ ｈＣＧイオン捕獲サンドイッチアッセイ捕獲剤；抗ｈＣＧ抗体−ＰＧＡ ｈＣＧ特異的捕獲剤 ２００、０００　２０５８ 実施例１４ ２ステップｈＣＧアッセイ用イオン捕獲流通装置ａ、固相の調製 試験試料添加パッド（ガラスファイバーマトリックス）を、種々の濃度のＭｅｒ ｑｕａｔ−１００（登録商標）ポリマーアンモニウム化合物水溶液、１００ｍＭ 　Ｔｒｉｓ。

１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％魚ゼラチン、０．１％スクロース及び０． １％アジ化ナトリウムを用いて処理した。添加パッドを乾燥し、吸収剤材料層上 に重ねた。実質的に同じ方法で、Ｃｅ１ｑｕａｔ　（登録商標）Ｌ−２００ポリ マー化合物で処理した流通固相装置を製造した。使用直前に添加パッドをＭ　ｅ 　ｒ　ｑ　ｕ　ａ　ｔ。−１００（登録商標）第四級アンモニウムポリマー化合 物（ジメチルジアリルアンモニウムクロリドのカチオン性ホモポリマー、水中０ ゜５％）で処理することにより、別の装置を製造した。

ｂ　指示薬の調製 指示薬は、１％Ｂｒ１ｊ（登録商標）−３５ポリオキシエチレン（２３）ラウリ ルエーテル（Ｓｉｇｍａ）、１００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、５００ｍＭ　ＮａＣ１ ，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２．０．１％　Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ及 び０．５％脱脂粉乳、　’Ｉ）　Ｈ７、２で希釈した、ヤギ抗β−ｈＣＧ抗体及 びアルカリ性ホスファターゼの結合体であった。指示薬は、使用前に０．２２μ ｍフィルターで濾過した。

別の指示薬の調製においては、非特異的結合遮断薬として硫酸デキストラン（Ｍ Ｗ５，０００）またはヘパリンを含めた。遮断薬は、標識抗体の非被分析物質へ の結合を阻害することにより信号雑音比を増大するために使用した。

Ｃ６捕獲剤の調製 実質的に上記実施例８．ｃに記載の方法に従って、モノクローナル抗β−ｈＣＧ 抗体−ＰＧＡ捕獲剤を調製した。

結合反応混合液を５ｍｌずつ、ゲル濾過クロマトグラフィーカラム（２，４ｘ　 ５４　ｃｍ、流量０．４ｍｌ／分）において画分化した。溶出液は、０．１Ｍリ ン酸ナトリウム、０゜３Ｍ　ＮａＣｌ及び０．０５％ＮａＮ５．ｐＨ８，５を含 んだ。ポリマーアニオン／抗体結合体を、２５ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，１ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、０．１ｍＭＺｎＣＩｚ、０．１％ＮａＮ３．１０％ 正常マウス血清及び１％魚ゼラチン、ｐＨ７，２で希釈した。捕獲剤は、使用前 に０．２２μｍフィルターで濾過した。

ｄ、イムノアッセイ方法 捕獲剤（８０μｍ）を、正常ヒト血清中に既知量のｈｃＧを含む同量の試験試料 と混合した。混合液を約３１〜３２℃で約１２分間インキュベートした。特異的 結合反応の結果、捕獲剤／被分析物質結合体が形成された。

各反応混合液（８０μｌ）を流通装置に添加し、次いでＴｒｉｓ緩衝塩水溶液（ ７５μｌ）で洗浄した。次いで指示薬（５０μｌ）を固相に添加し、１２分間イ ンキュベートした。次いで固相を２回洗浄した。

酵素基質（７０μｍ　；　１００ｍＭ　ＡＭＰ、０．０１％ＥＤＴＡ、０．１％ 　ＮａＮ３及び４．０ｍＭ　テトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ　４ −メチルウンベリフェリル−ホスフェートを含む溶液）を加え、生じた蛍光量を 測定した。結果を表１７〜１９に示す。結果から、ｈＣＧ試験試料濃度が増加す ると、それに対応して捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体の形成が増加し、従っ て固相に付着する検出可能な標識の量も増加したことが判る。またこの結果から 、指示薬中に非特異的結合遮断薬を含めることにより、信号雑音比が向上するこ とが判る。更に、ジメチルジアリルアンモニウムクロリドのカチオン性ホモポリ マーは、装置を２回以上洗浄する２ステツプアツセイに使用する固相の製造に好 ましいポリマーカチオンであり、例えばＭｅｒｑｕａｔ−１００（登録商標）ア ンモニウムポリマー化合物は窒素含有量が約１０％（対イオンは除（）であり、 Ｃ６１ｑｕａｔ　（登録商標）Ｈ−１００ポリマー化合物の窒素含有量は約１％ （対イオンは除く）である。

表１７ ｈＣＧイオン捕獲２ステップサンドイッチアッセイホスファターゼ標識抗β−ｈ ＣＧ抗体 固相　：使用直前にジメチルジアリルアンモニウムクロリドのカチオン性ポモポ リマーで被覆したもの ０　６ｇ　２５５ ＋００　１０２８　１１０４ 表１８ ｈＣＧイオン捕獲２ステップサンドイッチアッセイ捕獲剤・抗β−ｈＣＧ抗体− ＰＧＡ　（０，５μｇ／試験）指示薬：　（遮断薬を含む）アルカリ性ホスファ ターゼ標識抗β−ｈＣＧ抗体 固相　：種々の濃度のカチオン性ポリマーを含む表１９ ｈＣＧイオン捕獲２ステップサンドイッチアッセイ捕獲剤：抗β−ｈＣＧ抗体− ＰＧＡ 指示薬：アルカリ性ホスファターゼ標識抗β−ｈＣＧ抗体固相：０．１２５％Ｃ ｅ１ｑｕａｔ　（登録商標）Ｈ−１００ポリマー化合物を含むもの 蛍光量（カウント／秒／秒） 捕獲抗体の量（μｇ／試験） ｈＣＧ（ｍＩＵ／ｍｌ）　０．２６８　０．４０２　０．６５２実施例１５ 甲状腺刺激ホルモン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）アッセイ用イオン捕獲流通装置 ａ、固相の調製 実質的に実施例１４．ａに記載の方法に従って、添加パッド（ガラスファイバー マトリックス）を、Ｍ　ｅ　ｒ　ｑ　ｕ　ａ　ｔ−１００（登録商標）ポリマー アンモニウム化合物の水溶液で処理した。次いでパッドを吸収材料層上に重ね、 流通固相装置を完成した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、１％　Ｂｒ１ｊ（登録商標）−３５ポリオキジエチレン（２３）ラウ リルエーテル、１％魚ゼラチン。

１００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、５００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ＋　０ ．１ｍＭ　ＺｎＣＩｔ、０．１％　Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ及び０゜５％脱脂粉乳、ｐＨ ７，２で希釈した、ヤギ抗β−ｈＣＧ抗体及びアルカリ性ホスファターゼの結合 体であった。指示薬は、使用前に０．２２μｍフィルターで濾過した。非特異的 結合遮断薬として硫酸デキストラン（０，５％２ＭＷ５，０００＞を加えた。

Ｃ８捕獲剤の調製 プロティンＡ精製モノクローナル抗ＴＳＨ抗体をカルボキシメチルアミロース（ ＣＭＡ；Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ） に結合することにより捕獲剤を調製した。結合は、実質的に以下の方法に従って 、水溶性カルボジイミド剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル） カルボジイミド、ＥＤＣ■）を使用して行った。

結合混合液は、抗体溶液（２ｍｌ　；ＭＥＳ緩衝液［２５ｍＭ２−（Ｎ−モルホ リノ）エタンスルホン酸］　ｐＨ５゜５中１ｍｇ／ｍｌ）及びＣＭ　Ａ　（１、 ６ｍ　Ｉ　；　Ｍ　Ｅ　Ｓ緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ）を含んでいた。この溶液に 、新たに調製したＥＤＣＩ溶液（４０μ１．ＭＥＳ緩衝液中１００ｍｇ／ｍｌ） を撹拌しながら加えた。反応混合液を室温で４０分間撹拌した。２５％グリシン 溶液（６７μｍ）を加えることにより反応を停止し、次いで生成物を、ＴＳＫガ ードカラムＳＷ　（２，１５ｃｍＸ７．５ｃｍ；ＡｎｓｐｅｃＣｏ、、Ａｎｎ　 Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を取り付けたＴＳＫゲルＧ４０００ＳＷカラム （２，１５ｃｍｘ３０ｃｍ）を使用したゲル濾過クロマトグラフィーによって画 分化した。カラムはＰＢＳ　（０，１Ｍリン酸ナトリウム、０．３Ｍ　ＮａＣ＋ 及び０．０５％アジ化ナトリウム。

ｐＨ６，８）で溶出した。精製した抗体／ＣＭＡ捕獲剤を、５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ 　ｓ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ウシ血清アルブミン、２．５％魚ゼラチン及 び０．１％ＮａＮ、を含む希釈液ｐＨ７，５で希釈した。

ｄ、イムノアッセイ方法 捕獲剤（３０，ｃｚｌ）及びＴｒｉｓ緩衝塩水溶液（１００μｌ　；５００ｍＭ 　Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ　ＮａＣ１及び０゜１％ＮａＮ５）を、正常ヒト血清中 に既知量のｈＣＧを含む試験試料（５０μｍ）と混合した。反応混合液を約３３ 〜３４℃で約１０分間インキュベートした。特異的結合反応の結果、捕獲剤／被 分析物質結合体が形成された。

各反応混合液のアリコート（１４０μｍ）を固相装置に添加し、次いでＴｒｉｓ 緩衝塩水溶液（１５０μｌ）で洗浄した。指示薬（７０μＩ）を装置に添加し、 約１０分間インキュベートした。次いで装置を緩衝液（各１００μｍ）で２回洗 浄した。酵素基質（７０μｌ　；　１００ｍＭ　ＡＭＰ、０．０１％　ＥＤＴＡ 、０．１％　ＮａＮ５及び４．０ｍＭテトラミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ ｍＭ　４−メチルウンベリフェリル−ホスフェートを含む溶液）を加え、生じた 蛍光量を測定した。

アッセイ結果を表２０に示す。結果から、試験試料中のＴＳＨｍ度が増加すると 、それに対応して捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体の形成が増加することが判 った。従って、被分析物質の濃度が増加すると、固相に付着する検出可能な標識 の量も増加した。またこの結果から、Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（登録商標）ポリ マーアンモニウム化合物をポリアクリル酸またはカルボキシメチルアミロースと 組み合わせると、装置を１回以上洗浄または操作する２ステツプアツセイに有利 に使用される固相及び捕獲剤が提供されることが判った。

表２０ ＴＳＨイオン捕獲２ステップサンドイッチアッセイ（ポリアクリル酸またはカル ボキシメチルアミロースポリアニオン使用） 蛍光量（カウント／秒／秒） カルボキシメチル ０、５　１３．３　１２．１ ２、０　３４．７　２８．７ １０、０　１４７．５　１１９．８ ４０、０　５１３．９　４４２．６ １００、０　１１２１．６　９９５．５ｅ、ＴＳＨ捕獲効率 放射性ヨウ素化ＴＳＨを実施例１５．ｄに記載のごとくアッセイに使用すると、 ＴＳＨは、ポリアスパラギン酸及びポルグルタミン酸結合抗体よりもＣＭＡ結合 抗体に効率的に結合することが判った。抗体のポリアニオンへの結合は、実質的 に上記方法（実施例１５．ｃ）に従って実施した。アッセイ終了時に蛍光量を測 定した後、固相材料上に捕獲されたＴＳＨの放射能を、シンチレーション分析計 （Ａｕｔｏ−Ｌｏｇｉｃ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔ ｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）によって測定した。この結果を表２０（ａ）に示す 。

表２０（ａ） カチオン性固相材料における放射性標識ＴＳＨの捕獲ポリアニオン結合　蛍光量 ポリアスパラギン酸　１．５　３７ ポリグルタミン酸　２．０　５７ 実施例１６ １ステップｈＣＧアッセイ用イオン捕獲流通装置ａ、固相の調製 実質的に上記実施例１４．ａに記載の方法に従って、ファイバーガラスマトリッ クスを、Ｍ　ｅ　ｒ　ｑ　ｕ　ａ　ｔ　−１００（登録商標）ポリマーアンモニ ウム化合物の水溶液で処理した。次いでパッドを吸収材料層上に重ね、装置を完 成した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、３．３３％Ｂｒ１ｊ（登録商標）−３５ポリオキシエチレン（２３） ラウリルエーテル、５ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ、１ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、０．１ｍＭ　Ｚ ｎＣＩｓ、０．１％ＮａＮ３及び０．５％魚ゼラチン、ｐＨ７，２で希釈した、 アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗β−ｈＣＧ抗体であった。指示薬は 、使用前に０．２μｍフィルターで濾過した。別の指示薬調製物においては、非 特異的結合遮断薬としてカルボキシメチルセルロース（ＭＷ２５０．０００）ま たはカルボキシメチルデキストランを含めた。

Ｃ０捕獲剤の調製 実質的に上記実施例１５．０に記載の方法に従って、モノクローナル抗ｈＣＧ抗 体−ＰＧＡ捕獲剤を調製した。ポリマーアニオン／抗体結合体を、３．３３％Ｂ ｒ１ｊ（登録商標）−３５ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、５ｍ Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、５００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭＭｇＣＩｚ、０．１ｍＭ　Ｚ ｎＣ＋２．０．１％　ＮａＮ、及び０５％魚ゼラチン、ｐＨ７，２で希釈した。

酵素基質は、１００ｍＭ　ＡＭＰ、０．０１％　ＥＤＴＡ、０．１％ＮａＮ３及 び４．０ｍＭテトラミソールの溶液、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ４−メチルウ ンベリフェリル−ホスフェートを含む溶液であった。

ｄ、イムノアッセイ方法 捕獲剤（５０μｍ）、指示薬（５５μｌ）及び試料希釈緩衝液（３５μＩ；使用 前に０．２２μｍフィルターで濾過した、７５％正常ウシ血清、２５％正常ヤギ 血清及び０゜２％ＮａＮ５）を、正常ヒト血清中に既知量のｈＣＧを含む試験試 料（３０μｍ）と混合した。混合液を約３３〜３４℃で約１４分間インキュベー トした。特異的結合反応の結果、捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体が形成され た。

各反応混合液のアリコート（１１０μｍ）を固相装置に添加し、次いでＴｒｉｓ 緩衝塩水溶液（７５μｌ）で２回洗浄した。酵素基質（６５μｍ）を加え、生じ た蛍光量を測定した。

アッセイ結果を表２０に示す。結果から、ｈＣＧ試験試料濃度が増加すると、そ れに対応して捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体の形成が増加し、従って、固相 に付着する検出可能な標識の量も増加したことが判る。またこの結果から、指示 薬中に非特異的結合遮断薬として遊離ポリアニオン性基質を含めると、捕獲剤が ポリマーアニオン／抗体結合体であっても、信号雑音比が向上することが判る。

表２１ ｈＣＧイオン捕獲サンドイッチアッセイ捕獲剤：抗ｈＣＧ抗体−ＰＧＡ 指示薬：アルカリ性ホスファターゼ標識抗ｈＣＧ抗体０　３７．２　２３．８　 １？、２　１３．３１０　７６．８　５８．４　４８．８　４２．１１０００　 １８０３．６　１６６５．４　１６９２．２　１５０７．２蛍光量（カラ２５フ 秒／秒） ０　３５．６　３０．（１１７，８１４，８１０７５，２６８，４５４，７４９ ，８１０００１８２６，６１８５１，２１７３９，５１６４６，６実施例１７ ｈＣＧサンドイッチアッセイ用イオン捕獲試験ストリップａ、固相の調製 ニトロセルロースのストリップ（孔径５μｍ；５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ ｈｕｅｌｌ；Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の中央部分の長方形ゾーンを、０ ，０５％Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（登録商標）ポリマーアンモニウム化合物及び １０ｍＭＴｒｉＳの水溶液で処理し、正電荷に帯電した捕獲または検出ゾーンを 形成した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、マウスモノクローナル抗ｈＣＧ抗体で被覆したセレンコロイド粒子で 製造した。指示薬を、５０　ｍ　ＭＴｒｉｓ、２％ラクトース、２％カゼイン、 １％ヤギ血清及び１％マウス血清を含むアッセイ緩衝液ｐＨ８，４で（力価曲線 によって決定されるように）適正に希釈した。

Ｃ８捕獲剤の調製 実質的に上記実施例１５．０に記載の方法に従って１−エチル−３−（３−ジメ チルアミノプロピル）−力ルポジイミドを使用し、ヤギβ−ｈＣＧ抗体をポリ− Ｌ−グルタミン酸に結合した。次いで捕獲剤を指示薬と同じ希釈液で適正に希釈 した。

ｄ、イムノアッセイ方法 指示薬（５０μｌ）を同容量の捕獲剤と混合した。混合液を、ヒト正常尿中に既 知量のｈＣＧを含む一連の試料（０，５０，１００及び２５０ｍ１Ｕ／ｍｌ　； 各々１５０μＩ）と混合した。得られた反応混合液を室温で５分間インキュベー トした。特異的結合反応の結果、捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体が形成され た。

各反応混合液（２５０μｌ）を、調製したニトロセルロースストリップの一端に 添加した。混合液は、ストリップ中を捕獲ゾーンに浸透し、更に該ゾーンを通過 した。捕獲剤及びその結合体が捕獲ゾーンに保持され、そこで、保持された捕獲 剤に結合している指示薬によって、試験試料中の被分析物質の量及び試験試料中 の被分析物質の存在が示された。０ｍ１Ｕ／ｍ＋の試験試料では捕獲ゾーンは着 色しなかった。５０．１００及び２５０ｍ１Ｕ／ｍｌの試験試料では捕獲ゾーン が視認し得る着色を示した。

実施例１８ ｈＣＧアッセイ用イオン捕獲試験ストリップ装置ａ、固相の調製 ニトロセルロースのストリップ（孔径５μｍ；５Ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ ｈｕｅｌｌ）の中央部分の長方形ゾーンを、１％Ｃｅ１ｑｕａｔ　（登録商標） Ｌ−２００ポリマー化合物で処理し、正電荷に帯電した捕獲ゾーンを形成した。

０．５インチ／秒の速度で動く＃２９ゲージ試験管（ＭＩＣＲＯＩｎｃ、、Ｅｌ ｍｈｕｒｓｔ、ＮＹ）を使用し、カチオン性ポリマーを流量Ｑ、Ｑ５ｍｌ／分で 分配した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、マウスモノクローナル抗ｈＣＧ抗体で被覆したセレンコロイド粒子で 製造した。指示薬を、５ＱｍＭＴｒｉｓ、２％ラクトース、２％カゼイン、１％ ヤギ血清及び１％マウス血清を含むアッセイ緩衝液ｐＨ８，４で（力価曲線によ って決定されるように）適正に希釈しｔ二。

Ｃ１捕獲剤の調製 実質的に上記実施例８．ｃに記載の方法に従って、抗β−ｈＣＧ抗体をポリ−グ ルタミン酸に結合した。

ｄ、アッセイ装置の製造 パッド状吸収材料（孔径４０μガラスファイバー材料；Ｌｙｄａｌｌ　Ｉｎｃ、 、Ｈａｍｐｔｏｎｖｉｌｌｅ、ＮＣ）に、Ｔｒｉｓ緩衝塩水溶液（０，ＩＭ　Ｔ ｒ　ｉ　ｓ、０゜９％ＮａＣＩ、ｐＨ７，８）、１．０％カゼイン中に捕獲剤（ ２０μｇ／ｍ＋）及び指示薬（抗体濃度０．０２４ｍｇ／ｍ＋、セレン濃度０． ３ｍｇ／ｍｌ）を含む混合液を浸漬させることにより、指示薬パッドまたは試験 試料添加パッドを製造した。次いでパッドを空気乾燥した。試験試料添加パッド とニトロセルロースストリップを接触させ、少な（とも捕獲ゾーンからはずれた ニトロセルロースストリップの端部で添加パッドが一部重なり合うようにパッド とニトロセルロースとを二層化することにより、試験ストリップ装置を構築した 。

ｅ、イムノアッセイ方法 正常ヒト尿中に既知量のｈＣＧを含む試験試料（０，５０及び２５０ｍ１Ｕ／ｍ ｌ；各々５０μｌ）をアッセイ装置の試験試料添加パッドに添加するか、または 添加パッドを試験試料中に浸漬した。試験試料、再可溶化されたアッセイ試薬及 びこれらの結合体は添加パッドからニトロセルロースストリップに浸透し、更に その中を移動した。室温で５分後、特異的結合反応及びイオン捕獲反応によって 捕獲剤／被分析物質／指示薬結合体が形成され、それが試験ストリップの捕獲ゾ ーンに固定された。未結合の指示薬及び試験試料成分は捕獲ゾーンを通過した。

０ｍ１Ｕ／ｍｌ試験試料は捕獲ゾーンに検出可能なシグナルを生成しなかった。

５９ｍ１Ｕ試験試料は、捕獲ゾーンに僅かに検出可能な可視シグナルを生成した 。２５０ｍ１Ｕ／ｍｌ試験試料は、捕獲ゾーンに明らかな検出可能な可視シグナ ルを生成した。アッセイ結果は、均一特異的結合反応が固相試験ストリップ装置 において反応する間、３成分結合体を形成し得ることを示している。

実施例１９ フェニルンクリジン（ＰＣＰ）アッセイ用イオン捕獲試験ストリップ装置 ａ、固相の調製 細長いニトロセルロースストリップ（幅３ｍｍ）の中央部分の長方形ゾーンを、 ０．５％Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（登録商標）ポリマーアンモニウム化合物で処 理し、正電荷に帯電した捕獲ゾーンを形成した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、ＰＣＰ抗体で被覆したセレンコロイド粒子で製造した。

Ｃ１捕獲剤の調製 実質的に上記実施例１０．ａに記載の方法に従って、ＰＣＰ抗原をポリ−グルタ ミン酸に結合した。

ｄ、アッセイ装置の調製 吸収材料（Ｗｈａｔｍａｎ　ＰＤＯ７５ガラスファイバーフィルター；Ｗｈａｔ ｍａｎ　５ｐｅｃｔａｌｔｙ　Ｐａｐｅｒｓ、Ｃ１１ｆｔｏｎ、ＮＪ）に試薬（ ２，５ｍｇ／ｍｌ　；０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ中の４％カゼイン、４％スクロース 、１％ポリエチレングリコール（ＭＷ１５．０００〜２５．０００３）を浸漬さ せることにより、アッセイ試薬パッド（幅３ｍｍ）または試験試料添加パッドを 調製した。次いでパッドを空気乾燥した。添加パッドとニトロセルロースとを、 試薬パッドがニトロセルロースの一端と約１ｍｍ重なり合うように組み立てた。

ｅ、イムノアッセイ方法 捕獲剤（１５μｌ）と、蒸留水で既知倍率に希釈したＰＣＰ（１：１０．１　： 　１００．１　：　１０００．１：１００００）を含む同容量の試験試料とを混 合した。混合液を試験試料添加パッドに添加した。混合液をパッド及びストリッ プを通して少なくとも１０〜５分間移動させた。競合結合反応の結果、捕獲剤／ 指示薬結合体及び指示薬／被分析物質結合体が形成された。試験試料中の被分析 物質の量が増加するにつれて、捕獲剤／指示薬結合体の量は減少した。

高分子電解質反応の結果、捕獲剤／指示薬結合体が試験ストリップの捕獲ゾーン 内に固定された。未結合の指示薬及び未反応の試験試料成分、並びに指示薬／被 分析物質結合体は捕獲ゾーンを通過した。アッセイ結果から、試験試料中のＰＣ Ｐの量が高いほど、捕獲ゾーンにおいて検出可能なシグナルは少なくなることが 判った。更にアッセイ結果から、固相試験ストリップ層において均一な特異的結 合反応が起こり得ることが判った。

実施例２０ ｈＣＧアッセイ用イオン捕獲流通装置 ａ、固相の調製 ガラスファイバーフィルター材料を、０．１２５％　ＣｅＩｑｕａｔ　（登録商 標）Ｌ−２００ポリマー第四級アンモニウム化合物の水溶液で処理し、正電荷に 帯電した捕獲ゾーンを形成した。次いでガラスファイバーフィルターを、帯電検 出ゾーンを含む層を通過する過剰な試薬及び試験試料を吸い取るよう作用する第 ２吸収材料層上にセットした。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、アフィニティー精製ヤギ抗β−ｈＣＧ抗体で被覆した金コロイド粒子 で製造した。蒸留水（５１０ｍｌ）中に塩化金（１００ｍｇ）を含む溶液を加熱 して沸騰し、１％クエン酸ナトリウム（８，０ｍ１）と混合した。溶液の色が黄 色から暗赤色に変化したとき（約３分後）加熱を止めた。水道水の流れにさらす ことにより溶液を室温に冷ました。得られた金コロイドの一部（１０ｍｌ）に１ ５０ｍｍｏｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）を滴定してｐＨ７゜０に調整した。

５０μｍのヤギ抗β−ｈＣＧ抗体（９ｍｇ／ｍｌ）を金コロイドに加え、室温で １分間混合した。次いで混合液を１０％ウシ血清アルブミン（３００μｌ）で処 理し、１４゜００Ｏｒｐｍで１分間遠心した。指示薬として使用するため、コロ イド／抗体混合液の底層（約３２０μｌ）を回収した。

Ｃ０捕獲剤の調製 実質的に上記実施例６及び８に記載の方法に従つて、精製モノクローナル抗ｈＣ Ｇ抗体をＩ　ＴＣ−ＰＧＡを用いて修飾した。

ｄ、イムノアッセイ方法 全ての試薬を、５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣ］。

ｐＨ７，５及び３％カゼインを含むアッセイ緩衝液で適正に希釈した。正常ヒト 尿中に既知量のｈＣＧ　（０，２５，５０，１００及び２５０ｍ１Ｕ／ｍｌを含 む試験試料（５０ｕ　ｌ　）を同容量の指示薬と混合し、混合液を室温で５分間 インキュベートした。次いで捕獲剤（５０μｍ）を混合液に加えた。得られた混 合液を、緩衝液（８０μｌ）で予め濡らしておいた固相に移した。次いで流通装 置を緩衝液で２回濯いだ。ｈＣＧを含む反応混合液を受容した装置においては視 認し得る紫色が検出されたが、０ｍ１Ｕ／ｍｌ＋試験試料は捕獲ゾーンにおいて 検出可能なシグナルを生成しなかった。ｈＣＧ濃度の増加に伴って、捕獲ゾーン のシグナルはより濃くなった。

実施例２１ イオン捕獲使用の競合ジゴキシンアッセイａ、固相の調製 試験試料添加パッド（ガラスファイバーマトリックス）を、種々の濃度のＭｅｒ ｑｕａｔ−１００（登録商標）ポリマーアンモニウム化合物水溶液、１００ｍＭ 　Ｔｒ　ｉ　ｓ。

１．００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％魚ゼラチン、０．１％スクロース及び０ ．１％アジ化ナトリウムを用いて被覆した。添加パッドを乾燥し、吸収材料層上 に重ねて流通装置を作製した。

ｂ、指示薬の調製 ５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、１００ｍＭ　ＮａＣ］、１ｍＭ　ＭｇＣ１２，０，１ ｍＭ　ＺｎＣＩｚ＋　０．１％　ＮａＮ３及び０゜１％ウシ血清アルブミン、ｐ Ｈ７，５で希釈したジゴキシンジアルデヒド及びアルカリ性ホスファターゼの結 合体であった。

Ｃ１捕獲剤の調製 第１捕獲剤として、１．４−フェニレン　ジイソチオシアネート活性化ポリ−Ｌ −アスパラギン酸（ＩＴＣ−ＦＡＡ）に結合したヤギ抗ジゴキシン抗体を、実質 的に上記実施例８、ｃに記載の方法に従って調製した。ポリ−Ｌ−グルタミン酸 に代えて、ポリーＬ−アスパラギン酸を使用した。

第２捕獲剤は、実質的に上記実施例１５．０に記載の結合方法に従って、ＥＤＣ Ｉを使用してポリーＬ−アスパラギン酸に結合したウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体で作 製した。被分析物質特異的補助結合メンバー（ヤギ抗ジゴキシン抗体）をこの捕 獲剤と一緒に使用し、被分析物質を固相に結合した。１つの実施態様においては 、捕獲剤は、予め形成した負電荷を有する抗ヤギ抗体及びヤギ抗ジゴキシン抗体 の結合体であった。第１及び第２捕獲剤の両方を、使用前に、５０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ、５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１％ＮａＮ３及び０．１％ウシ血清アルブミン、 ｐＨ７，５を用いて適正に希釈した。

ｄ、イムノアッセイ方法 第１捕獲剤、即ち直接捕獲系を使用するアッセイにおいては、捕獲剤（６０μｍ ）を、既知量のジゴキシンを含む試験試料（１８μｍ）と混合した。反応混合液 を約３３〜３４℃で約１０分間インキュベートした。特異的結合反応の結果、捕 獲剤／被分析物質結合体が形成された。次いで指示薬（６０μｌ）を反応混合液 に加え、混合液を更に約１１分間インキュベートした。特異的結合反応の結果、 試験試料中に存在する被分析物質の量に比例して捕獲剤／指示薬結合体が形成さ れた。各反応混合液の一部（８０μｍ）を固相に添加し、次いでＴｒｉｓ緩衝塩 水溶液（７５μｌ）で２回洗浄した。酵素基質（７０μｌ　；　１００ｍＭ　Ａ ＭＰ、０．０１％　ＥＤＴＡ、０．１％　ＮａＮ３及び４．０ｍＭテトラミソー ル、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ　４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート を含む溶液）を加え、生じた蛍光量を測定した。

第２捕獲剤を使用する間接アッセイにおいては、予め形成した捕獲剤／補助結合 メンバー結合体（５０μｌ）と、指示薬（５５μｌ）と、ジゴキシン試験試料（ ２５μｌ）とを、試料希釈緩衝液（９１μＩ）と混合した。混合液を約９分間イ ンキュベートした。特異的結合反応の結果、捕獲剤／補助特異的結合メンバー／ 被分析物質結合体及び捕獲剤／補助結合メンバー／指示薬結合体が、試験試料中 に存在する被分析物質の量に比例して形成された。反応混合液のアリコート（１ ８０μｍ）を固相に添加し、次いでＴｒｉｓ緩衝塩水溶液（７５μｍ）で２回洗 浄した。酵素基１（７０μｌ）を加え、生じた蛍光量を測定した。　アッセイ結 果を表２２に示す。結果から、ジゴキシン試験試料濃度が増加すると、それに従 って指示薬を含む結合体の形成が減少することが判った。即ち、試験試料中のジ ゴキシンが増加すると、固相に付着する検出可能な標識の量は低下した。

表２２ ジゴキシンイオン捕獲競合アッセイ 方法　半順次１ステップ　１ステツプ 予備被覆固相　０．２％Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（ＩＩＨ）　０．２％Ｍｅｒｑ ｕａｔ−１００（ｉｉｌｉｌ）抗体濃度／試験　１６２ｎｇヤギ抗ジゴキシン　 ９０ｒ＋ｇウサギ抗ヤギ／６４ｎｇヤギ抗ジゴキシン 指示薬　アルカリ性ホスファターゼ／　アルカリ性ホスファターゼ／ジゴキシン 結合体　ジゴキシン結合体 直接　間接 実施例２２ 全Ｔ３（トリョードチロニン）競合アッセイ用イオン捕獲流通装置 ａ、固相の調製 試験試料添加パッド（ガラスファイバーマトリックス）を、種々の濃度のＣｅ１ ｑｕａ、ｔ（登録商標’）Ｌ−２００ポリマー第四級アンモニウム化合物または Ｍｅｒｑｕａｔ−１００（登録商標）ポリマーアンモニウム化合物水溶液。

１００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０゜１％魚ゼラチン、 ０．１％スクロース及び０．１％アジ化ナトリウムを用いて被覆した。添加パッ ドを乾燥し、吸収材料層上に重ねて個々のアッセイ装置を作製した。

ｂ、指示薬の調製 指示薬は、５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、１００ｍＭ　ＮａＣ＋。

１．０ｍＭ　ＭｇＣｌ□、０．１ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ及び１．０％ウソ血清アルブ ミン、ｐＨ７，５で希釈した、Ｔ３及びアルカリ性ホスファターゼの結合体であ った。非特異的結合遮断薬として硫酸デキストラン（ＭＷ５，０００）を含めた 。遮断薬は、標識抗体の非被分析物質への結合を阻害することにより信号雑音比 を増大するために使用した。

Ｃ１捕獲剤の調製 捕獲剤として、抗Ｔ３抗体を、ボリアスノくラギン酸（ＰＡＡ−抗Ｔ３抗体）、 ポリアクリル酸（ＰＡｃＡ−抗Ｔ３抗体）またはカルボキシメチルセルロース（ ＣＭＡ−抗Ｔ３抗体）アニオン性ポリマー分子と結合した結合体を、実質的に実 施例１５．ｃのＥＤＣＩ結合法に従って、但し捕獲剤のクロマトグラフィー濾過 は行わずに作製した。捕獲剤を、８００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、５０ｍＭ　ＮａＣ １，０，１％　Ｎ　ａ　Ｎ３．　０．０１％フロセミド、０，１％Ｔｗｅｅｎ− ２０，１，０％ウシ血清アルブミン及び０．０８ｍｇ／ｍＩヤギＩｇＧ、ｐＨ７ ，４で希釈した。

ｄ、イムノアッセイ方法 捕獲剤（５０μＩ）を、既知量の全Ｔ３を含む同容量の試験試料及び試料希釈緩 衝液（１５０μＩ）と混合した。

反応混合液を約１５分間インキュベートした。特異的結合反応の結果、捕獲剤／ 被分析物質結合体が形成された。

次いで各反応混合液（１５０μｍ）を固相に添加した。

更に指示薬（６０μｍ）を固相に添加し、８分間インキュベートした。装置を２ 回洗浄した。酵素基質（５０μｌ）を加え、生じた蛍光量を測定した。

別のアッセイ形式においては、指示薬を添加する前に固相を洗浄した。更に別の アッセイ形式においては、捕獲剤と試験試料を混合し、インキュベートしてから 、指示薬を添加し、更にインキュベートしてから、反応混合液のアリコートを固 相に添加した。

捕獲剤と反対の電荷を有する固相との高分子電解質相互作用の結果、捕獲剤及び 補獲剤結合体が固相装置上に固定された。酵素基質（７０μＩ　；　１００ｍＭ 　ＡＭＰ、０．０１％　ＥＤＴＡ、０．１％　ＮａＮ３及び４．ＱｍＭ　テトラ ミソール、ｐＨ１０，３中に１．２ｍＭ４−メチルウンベリフェリル−ホスフェ ートを含む溶液）を加え、生じた蛍光量を測定した。

各アッセイにおいて、結果から、全Ｔ３試験試料濃度が増加すると、それに対応 して捕獲剤／被分析物質結合体の形成が増加し、従って、固相に付着する検出可 能な標識の量が減少したことが判る。更にこの結果から、指示薬中に非特異的結 合遮断薬として硫酸デキストランを含めることにより、信号雑音比が向上するこ とが判る。

表２３ 全Ｔ３競合アッセイ １ステツプアツセイ法及び２ステツプアツセイ法の較正デ方法　１ステツプ　２ ステツプ 予備被覆固相　０．５％Ｃｅ１ｑｕａｔ（ｌｌｉｌｌ）　０．２％１ｉｅｒｑｕ ａｔ−１００（ｌｌｉｉｌ）捕獲抗体　ＩＴＣ−ＰＧＡ抗Ｔ３抗体　ＥＤＡＣ− ＰＡ＾抗Ｔ３抗体（１試験当たり）　（０，２５μｇ）　（０，０２＋ｇ）指示 薬　遮断薬なし　０．１％硫酸デキストラン含む較正濃度 ｎｇ／ｍｌ全Ｔ３　蛍光量（カウント／秒／秒）０、５　３８６　５１３ １、０　３１０　４０３ ２、０　２１８　２６０ ４、０　１２３　１０９ 全Ｔ３競合２ステップアッセイ 捕獲抗体　ＥＤＡＣ−ＰＡＡ抗Ｔ３抗体　ＥＤＡＣ−ＰＡＡ抗Ｔ３抗体（１試験 当たり）　（０，０２ｇｇ）　（０，０２μｇ）指示薬（Ｔ３アルｉｌ＋性本ス フアタ−り遮断薬なし　０．１％硫酸デキストラン含む希釈度　に４００　１　 ：１５０ 較正濃度 ２、０　３６１　２２０ 表２５ 全Ｔ３競合アッセイ 較正濃度 ｎｇ／ｍｌ全Ｔ３　蛍光量（カウント／秒／秒）０、５　４０１　４４３　３９ ４ １、０　３３２　３４４　３２２ ２、０　２０３　２１９　２０４ ４、０　９４　１０７　９９ 実施例２３ イオン捕獲サンドイッチアッセイによるＨＩＶ−１抗ｐ２４抗体の検出 ガラスファイバーマトリックスをポリカチオン性基質でり、固相装置を作製した 。ポリアニオン性基質を精製組換えｐ２４抗原に共有結合することにより捕獲剤 を調製した。

指示薬は、アルカリ性ホスファターゼと、被分析物質特異的補助特異的結合メン バーによりて被分析抗体に結合する抗ビオチン抗体、即ちビオチニル化ｐ２４抗 原との結合体であった。酵素基質は４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート であった。

捕獲剤を試験試料と反応させて捕獲剤／被分析物質結合体を形成した。過剰な試 薬及び試験試料成分を除去し、反対の電荷を有する固相に通すことにより結合体 を固定した。

次いで、捕獲された被分析物質の量を、補助特異的結合メンバー、指示薬及び酵 素基質を順次加えることにより判定した。

実施例２４ 処理対照を含むイオン捕獲装置 別の実施態様においては、実施例１７の固相反応マトリックスを、２種類のアッ セイ試薬をマトリックス内に一部重なり合った態様で取み込んで検出ゾーンを形 成するように製造した。一方の試薬の反応によって検出可能パターンの一部分が 完成され、第２の試薬の反応によって検出可能パターンの別の部分が完成された 。

例えばアニオン性ポリマー（例えばポルグルタミン酸）を、“十字”形の縦棒を 形成するように固相に添加した。

アニオン性ポリマーは、ポリマーカチオンに結合した被分析物質特異的結合メン バーを含む反対の電荷を有する捕獲剤に引き付けられ且つそれに結合した。捕獲 剤、被分析物質、及び被分析物質に特異的な指示薬の反応の結果、検出可能な結 合体が縦棒部分に固定された。

被分析物質の反応を含まない処理対照反応ゾーンは、十字形検出ゾーンの横棒の 形状に形成した。被分析物質を含む結合体を形成しなかった指示薬と反応し且つ それに固定する試薬を使用した。

例えば指示薬が、アフィニティー精製ヤギ抗β−ｈＣＧ抗体で被覆した金コロイ ド粒子であるならば、十字形検出ゾーンの横棒は、ヤギ抗β−ｈＣＧ抗体に直接 結合する特異的結合メンバー、例えばウサギ抗ヤギ抗体を含む。試験試料中に被 分析部質が存在してもしな（でも、検出可能な標識が横棒部分に固定された。

本発明の概念は、反対の電荷を有する固相材料と捕獲剤を使用することにより全 ての分離技術または均一結合アッセイ（標識のシグナル生成能力が結合反応の間 に変化しない）に同等に適用可能であることは当業者には理解されよう。本明細 書に詳述した実施態様は、高分子電解質反応及びアッセイに制限されるものでは なく、単なる例にすぎない。本発明の説明は、記載した特定の実施態様に本発明 を制限するものではな（、上述の、そして以下の請求の範囲に記載のごとき本発 明の主旨及び範囲内で全ての均等物及び主題を包含するものとする。

フロントページの続き （７２）発明者　フィコ、ロサリオ アメリカ合衆国、イリノイ・６００９９、ジオン、ノース・デラニー・ロード・ ４２２５１（７２）発明者　ショウ、イー−バー アメリカ合衆国、イリノイ・６００４８、リバテイビル、スプリングヘイブン・ ドライブ・９１７ （７２）発明者　ストロウプ、ステイーブン・ディアメリカ合衆国、イリノイ・ ６００４８、リバテイビル、ルーズベルト・ドライブ・６０６

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．試験試料中の被分析物質の存在または量を判定する方法であって、 ａ）（ｉ）ポリマーアニオン性物質に結合した第１結合メンバーを含む捕獲剤、 （ｉｉ）第２結合メンバー及び検出可能な標識を含む指示薬、及び （ｉｉｉ）窒素含有量が約２％以上のポリマーカチオン性物質からなる反応部位 を含む固相材料とを与えるステップであって、前記第１及び第２特異的結合メン バーが、サンドイッチアッセイ、競合アッセイまたは間接アッセイにおいて被分 析物質と一緒に結合体を形成し、それによって試験試料中の被分析物質の存在ま たは量に応じて検出可能な結合体を形成し得る結合メンバーから選択され、 ｂ）前記固相を前記捕獲剤及び試験試料と接触させ、それによって前記固相のポ リマーカチオンが前記捕獲剤のポリマーアニオンを引き付け且つそれに結合し、 それにより前記捕獲剤及びその結合体が固定されるステップと、ｃ）前記固相を 前記指示薬と接触させ、それによって前記指示薬が、試験試料中に存在する被分 析物質の量に応じて固定された前記捕獲剤またはその結合体に結合するステップ と、 ｄ）前記固相に付着した前記指示薬を検出し、試験試料中の被分析物質の存在ま たは量を判定するステップとからなる方法。
2. ２．前記ポリマーカチオン性物質が、窒素含有量が約２％以上のポリマー第四級 アンモニウム化合物である請求項１に記載の方法。
3. ３．前記ポリマーカチオン性物質が、約５％以上の窒素含有量を有する請求項１ に記載の方法。
4. ４．前記ポリマーカチオン性物質が、約１０％以上の窒素含有量を有する請求項 １に記載の方法。
5. ５．前記ポリマーカチオン性物質を、アッセイ実施直前に前記固相中または上に 取り込む請求項１に記載の方法。
6. ６．更に、前記試験試料及び前記捕獲剤を混合して反応混合液を形成し、前記反 応混合液を前記固相と接触させるステップを含む請求項１に記載の方法。
7. ７．更に、補助特異的結合メンバーを添加し、間接アッセイにおいて前記補助特 異的結合メンバーが、前記被分析物質に結合し得ると共に、前記指示薬または前 記捕獲剤からなる群から選択されるメンバーにも結合し得ることを含む請求項１ に記載の方法。
8. ８．試験試料中の被分析物質の存在または量を判定する方法であって、 ａ）（ｉ）ポリマーアニオン性物質に結合した第１結合メンバーを含む捕獲剤、 （ｉｉ）第２結合メンバー及び検出可能な標識を含む指示薬、 （ｉｉｉ）未結合ポリマーアニオン性物質を含む非特異的結合遮断薬、及び （ｉｖ）窒素含有量が約２％以上のポリマーカチオン性物質からなる反応部位を 含む固相材料 とを与えるステップであって、前記非特異的結合遮断薬が、試薬の前記固相への 非特異的結合を阻害し、前記第１及び第２特異的結合メンバーが、サンドイッチ アッセイ、競合アッセイまたは間接アッセイにおいて被分析物質と一緒に結合体 を形成し、それによって該試験試料中の被分析物質の存在または量に応じて検出 可能な結合体を形成し得る結合メンバーから選択され、 ｂ）前記固相を前記捕獲剤及び試験試料と接触させ、それによって前記固相のポ リマーカチオンが前記捕獲剤のポリマーアニオンを引き付け且つそれに結合し、 それにより前記捕獲剤及びその結合体が固定されるステップと、ｃ）前記固相を 洗浄するステップと、 ｄ）前記固相を前記指示薬と接触させ、それによって前記指示薬が、試験試料中 に存在する被分析物質の量に応じて固定された前記捕獲剤またはその結合体に結 合するステップと、 ｅ）前記固相に付着した前記指示薬を検出し、試験試料中の被分析物質の存在ま たは量を判定するステップとからなる方法。
9. ９．更に、前記試験試料及び前記捕獲剤を混合して反応混合液を形成し、前記反 応混合液を前記固相と接触させるステップを含む請求項８に記載の方法。
10. １０．更に、補助特異的結合メンバーを添加し、間接アッセイにおいて前記補助 特異的結合メンバーが、前記被分析物質に結合し得ると共に、前記指示薬まだは 前記捕獲剤からなる群から選択されるメンバーにも結合し得ることを含む請求項 ８に記載の方法。