JPH02168162A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高怒度で非特異反応が少ない免疫測定法に関す
る。

（従来の技術） 各種生体成分から特定の被測定物質を検出もしくは定量
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば、抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテツクスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては、上記のような凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法。

酵素免疫測定法（ＥＩＡ）　、放射免疫測定法（Ｒ［Ａ
）など各種方法が知られている。

これらの免疫反応の測定法において、抗原抗体反応を促
進させ、あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば９反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のポリマーであり、これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば、これらの化合物を加えることによりラテックス試薬
の凝集反応が促進される。しかし、これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため、バ
ックグラウンド値が上がる。

そのため、バックグラウンド値を越える量の測定値でな
いと検出することができない、つまり多量の試料を必要
とする。従って、この方法は、短時間で反応を進行させ
ることは可能であるが、非特異反応を抑制するには充分
な方法とはいえない。

免疫反応における特異性を高めるために、塩化コリン、
ホルムアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸塩（ＩＯＴ
Ａ）などの添加剤を測定系に加える方法も採用されてい
る。しかし、これらの化合物を添加すると、非特異反応
を抑制するとともに所望の抗原抗体反応をも抑制するた
め測定感度が低くなるという欠点を有する。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定用試薬。

および免疫反応測定法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明はＰ試料中の被測定物質である抗原または抗体を
免疫反応により測定する方法であって；不活性担体にカ
チオン性の官能基が導入された。

もしくはカチオン性の官能基を有する化合物を吸着させ
たカチオン性不活性担体を調製する工程；該カチオン性
不活性担体に該被測定物質である抗原または抗体に対す
る抗体または抗原を担持させて、固相化抗体または固相
化抗原を調製する工程；該固相化抗体または固相化抗原
をポリアニオンと接触させ、該ポリアニオンを咳固相化
抗体または固相化抗原に担持させる工程；および該ポリ
アニオンを担持した固相化抗体または固相化抗原と該試
料とを混合し、免疫反応により該試料中の被測定物質を
測定する工程；を包含し５そのことにより上記目的が達
成される。

本発明方法に用いられる不活性担体としては疎水性の表
面を有する。あるいは部分的に疎水性の表面を有する不
活性担体がいずれも利用され得る。例えば、ラテックス
、プラスチ・ツクビーズ。

プラスチックプレートなどの合成高分子化合物でなる材
料、タンニン酸で処理した赤血球などの有機材料；およ
びシリカなどの無機材料が挙げられる。特に、工業的に
安定した品質で大量生産しうるラテックス；またはプラ
スチックビーズ、プラスチックプレートなどのプラスチ
ック成形品が好適に使用される。

カチオン性の官能基もしくはそれを有する化合物は、上
記不活性担体への抗体または抗原（被測定物質である抗
原または抗体に対応する）の担持効率を上げる目的で、
該不活性担体に導入もしくは吸着される。このような不
活性担体に導入もしくは吸着させるカチオン性の官能基
には、１ｍ。

２級、３級または４級のアミノ基およびそれらの塩が挙
げられる。カチオンとして作用しうるｐＨ範囲が広い４
級アミノ基およびその塩が好適に使用される。

担体に上記カチオン性の官能基を導入する方法としては
、■！旦体として使用するプラスチ・ツクを合成する際
にカチオン性の官能基を含むモノマーを同時に反応させ
て該基を有する担体を調製する方法；■担体を成形した
後に、その表面に化学修飾によりカチオン性の官能基を
結合させる方法；および■カチオン性の官能基を含む化
合物（例えば、アミン類またはカチオン性ポリマー）を
担体表面に物理的に吸着させる方法がある。■の方法と
しては２例えば１重合時にアミノ基を有する七ツマ−を
同時に重合させる（ナイロンもしくはその誘導体を調製
する）方法が挙げられる。■の方法としては９例えば、
シリカのような無機の材料を不活性担体として用い、該
シリカの０１１基を化学的に修飾する方法がある。■の
方法に用いられる化合物として、低分子量化合物として
はドデシルアミン、ヘキサデシルトリメチルアミンなど
の各種アミン類が、高分子量化合物としては疎水性部分
を含むカチオン性ポリマーが用いられる。該ポリマーの
疎水性部分は、アルキル基、アルキレン基、フェニル基
などから成る。該アルキル基およびアルキレン基の炭素
数は、１〜１５個の範囲内にあるものが適当である。こ
れよりも大きな炭素数では　ポリマーが水に溶解しにく
くなり、担体を処理するのが困難となる。ポリマーの分
子量は１　、０００〜４００，０００が適当である。こ
れよりも小さい分子量では、担体との疎水性相互作用が
十分ではなくなり、担体に効果的に吸着されない。４０
０．０００を上回る分子量では、ポリマーの粘度が高く
なってしまい、担体を処理するのが困難となる。

このようなポリマーとしては、ポリアリルアミン（１級
アミノ基を有する；日東紡績■製）、ポリエチレンイミ
ン（２級アミノ基を有する）、ポリ塩化ジアリルジメチ
ルアンモニウム、ポリアミンスルホン（４級アミノ基を
有する）、核酸などがある。例えば１次式（１）で示さ
れる４級アミン基を有するポリマーが好適である： ここで、Ｒ１〜ＲＩＯは水素またはアルキル基。

ＹｌおよびＹ２はアルキル基またはアルキレン基であり
、該ｙ、およびＹ２にはＳ、Ｎまたは０が含まれていて
もよい。

特に１次の構造式（ＩＩ）で示されるポリアミンスルホ
ン（日東紡、　ＰＡＳ−Ａ−５，平均分子量２．０００
〜５．０００　＞が好適である： （以下余白） 本発明方法で用いられるアニオン性ポリマーとしては、
解離してアニオンを生じるような基を有するポリマーが
いずれも使用され得る。ポリマー主鎖としては、セルロ
ース、アルキルセルロースデキストランなどの多糖類；
ポリエチレングリコールなどのポリエーテル類；ポリア
ルコール類などが挙げられる。これらの主鎖に結合する
アニオン性の基としては、カルボキシル基、スルホン酸
基、硫酸エステル基、リン酸エステル基などがある。ア
ニオン性ポリマーの例としては、カルボキシメチルセル
ロース、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリ
アクリル酸、それらの塩などがある。アニオン性ポリマ
ーの分子量は１０００〜５００．０００が適当であり、
該ポリマーの溶解度、粘度などを考慮して適宜選択され
る。これらのポリマーは適当に組みあわせて用いられ得
る。

本発明方法で測定される被測定物質としては。

α−フェトプロティン、　ＨＢｓ抗原、ＣＥＡ（癌胎児
性抗原）、抗トレボネーマ　パリダム、抗カルジオライ
ピン抗原、抗ＨＢｓ抗体、抗１１Ｂｃ抗体、抗＋１１Ｖ
抗体など、免疫反応を用いて測定され得るほとんどすべ
ての物質があげられる。

上記担体上に固定化され、固相化抗体または固相化抗原
を形成し得る物質としては、上記被測定物質と免疫反応
を行ない得る物質が適宜選択される。末法は、特にこの
ような物質の固定化時に界面活性剤が存在するような場
合に好適に利用される。界面活性剤の存在下では７通常
、固定化効率が悪いが１本法においては効果的にこのよ
うな物質を固定化することが可能となる。従って、抽出
。

安定化などのために界面活性剤を必要とする物質。

例えば、ウィルス抗原（例えば、　Ｈ［ｌｓ抗原、　Ｈ
Ｂｃ抗原、　Ｈ８ｅ抗原、　）ＩＩＶ抗原、　ＡＴＬＶ
抗原）；梅毒トレボネーマなどの菌体の表面抗原；細胞
膜上に存在する各種抗原、膜タンパク、リセプターなと
も効果的に担体上に固定化される。

上記菌体の表面抗原、膜タンパクなどの抽出や安定化の
ために用いられる界面活性剤としては。

非イオン性２両性およびカチオン性の界面活性剤が使用
され得る。非イオン性の界面活性剤としては１例えば、
トリトンＸ、ツイーン２０．ツイーン８０、オクチルグ
ルコシド、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグル
コシド、　ＭＥＧＡ−８（オクタノイル−Ｎ−メチルグ
ルカミド：　ＯｃＬａｎｏｙｌ−Ｎ−ｓｅｔｂｙｌｇｌ
ｕ−ｃａｍｉｄｅ）　、　ＭＥＧＡ−９（ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミ　　ド　：　　Ｎｏｎａｎｏｙｌ−
Ｎ−ｓｅｔｈｙＪｇｌｕｃａｓ＋ｉｄｅ　　　）　　　
、　　　ＭＥＧＡ−１０（デカノイル−Ｎ−メチルグル
カミド：　Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｓ＋ｅｔｈｙｌ−ｇ
ｌｕｃａｓｉｄｅ）などが挙げられる。両性の界面活性
剤としては９例えば、　Ｃ）ＩＡＰＳ　　（３−（（３
−：１ラミドブロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プ
ロパンスルホネート：　３−　（（３−Ｃｈｏｌａｍｉ
ｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
　）　−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）　、
　ＣＨＡＰＳＯ（３−（（３−コラミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスル
ホネート：３−　（（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐ
ｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｎ＋ｏｎｉｏ）　−２ｈｙ
ｄｒｏｘｙ−−１−ｐｒｏｐａｎｅ−５ｕｌｆｏｎａｔ
ｅ　）などが挙げられる。カチオン性の界面活性剤とし
ては、ドデシルアミン、ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムブロマイドなどが挙げられる。

本発明方法によれば、まず、上記不活性担体に上記方法
によりカチオン性の官能基が導入された。

もしくはカチオン性の官能基を有する化合物を吸着させ
たカチオン性不活性担体が調製される。このカチオン性
不活性担体に、被測定物質である抗原または抗体に対す
る抗体または抗原を担持させて、固相化抗体または固相
化抗原を調製する。例えば、緩衝液、生理食塩水または
精製水に上記抗体または抗原を溶解した溶液をカチオン
性担体に接触させることにより行われる。このことによ
り上記抗体または抗原はまず、イオン的相互作用により
担体表面のカチオン性官能基に引き寄せられ。

次いで担体との疎水性相互作用により該担体表面に固定
化される。このときに使用される緩衝液としては、当業
者に公知のいずれの緩衝液も使用できるが、イオン強度
が０．１Ｍを下回るものが望ましい。上記抗体または抗
原の固定化の最初のステップとしてイオン的な相互作用
を利用しているので。

イオン強度が高いと効果が得られない。緩衝液のＤＨは
、担体上のカチオンが解離しており、固定化される抗体
または抗原が該緩衝液中で安定に存在し得、かつ負に荷
電するようなｐＨに調整される。

ただし、担体上のカチオンとして４級アミノ基を用いる
場合には、とのｐＨにおいても担体上のカチオンは解離
しているので比較的広いｐｉ＋範囲の緩衝液が使用され
得る。

このようにして得られる固相化抗体または固相化抗原を
、必要に応じて、後述の免疫反応に関与しないタンパク
と処理し、担体上の未結合部位のブロッキングを行なう
。次に、固相化抗体または固相化抗原をポリアニオンと
接触させる。例えば。

上記アニオン性ポリマーを含む水溶液もしくは緩衝溶液
に該固相化抗体または固相化抗原を浸漬する。このとき
に、抗体もしくは抗原を安定化するために、アルブミン
などのタンパク、あるいはシシ糖などの多糖類を添加剤
として加えることも可能である。使用される緩「ｊ液と
しては、ポリアニオンが解離した状態で安定に存在でき
るものであればよい０例えば、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液などが挙げられ、ｐ旧よ５〜９の範囲が適切で
ある。ポリアニオン接触時のポリアニオンの’ｆＡ度は
９分子量や粘度により異なるが２通常約０．１から１０
％の範囲である。

ポリアニオンと接触させた後の固相化抗体または固相化
抗原を緩衝液で洗浄し、適当な緩衝液中に保存する。洗
浄あるいは保存のための緩衝液中には、咳固相化抗体ま
たは固相化抗原の安定性を高める目的で添加剤が含有さ
れていてもよ（、アニオン性のポリマーが含有されてい
てもよい。

本発明方法においては、上記のように、カチオン性の不
活性担体に、被測定物質である抗原または抗体に対する
抗体もしくは抗原が結合される。

従って、該抗体または抗原はイオン性相互作用および疎
水性相互作用により効果的に担体上に結合する。界面活
性剤の存在下においても該結合は効果的になされ得る。

このことにより後述の免疫反応の感度が上昇する。この
ようにして形成された固相化抗体または固相化抗原に、
上記のようにポリアニオンを接触させると、１亥ポリア
ニオンはｊ亥固相化抗体または固相化抗原上に固定化さ
れる。

ポリアニオンの結合により、固相化抗体または固相化抗
原上に残留しているカチオン性の電荷が相殺される。こ
のことにより１後述の免疫反応において担体上のカチオ
ン基と試料中のアニオン性物質が結合するのが阻害され
る。つまり、免疫反応における非特異反応が防止される
。ポリアニオンの代わりに低分子量のアニオン（例えば
、硫酸イオン、塩素イオン）を利用しても同様の効果が
得られると考えられる。しかし、担体上に吸着した上記
低分子量アニオンは、検体中のアニオン性物質（通常、
オリゴマーあるいはポリマーである）と置換する。その
ため、非特異反応の抑制が効果的に行なわれ得ない。

上記のようにポリアニオンが担持された固相化抗体また
は固相化抗原に、被測定物質を含む試料を接触させると
、抗原抗体反応が進行する。その結果得られる生成物を
測定することにより被測定物質が測定される。測定方法
としては、　ＥＩＡ、　ＲＩＡ。

ラテ・７クス法などが挙げられ、被測定物質が、上記の
ように、感度よく、かつ非特異反応を抑制した状態にお
いて測定することが可能となる。本発明方法において抗
原抗体反応による測定系の特異性を高めたり測定感度を
上げたりするために、塩化コリン、　ＥＤＴＡ、　ｅｌ
ｆ　（多糖類、デキストランなど）、ポリエチレングリ
コールのような親水性ポリマーなどを反応系に添加する
ことも可能である。

本発明方法に類似した技術として、特開昭５７１８２１
６９号公報には、非特異反応を防止するために。

被測定物質を含む検体を免疫反応時に使用される媒体に
可溶なポリアニオンで処理し、得られた処理後の試料を
用いて（ポリアニオンの存在あるいは不存在下で）免疫
反応を行なうことが開示されている。しかし、このよう
な方法においては、免疫反応に用いる固相化抗体または
固相化抗原の調製時に界面活性剤が存在すると固定化効
率が低く。

充分な感度が得られない。これに対して１本法において
は、界面活性剤の存在下においても固定化効率が高いた
め充分な感度が得られる。例えば本性はＨＢｓ抗原、　
ＩＩＢｃ抗原、　ＨＢｅ抗原、梅毒抗原（トレポネーマ
抗原および脂質抗原）、ＨＩＶ抗原。

＾几Ｖ抗原などの抗原を本発明方法により担体上に固定
し、これらの抗原に対する抗体を測定するのＧこ利用さ
れる。本発明方法は、疾病の診断および治療のための臨
床検査などの分野に広く利用され得る。

（以下余白） （実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

災施拠上 ［梅毒トレボネーマ抗原の固定化による抗トレボネーマ
抗体の測定］ （Ａ）試薬および検体の調製 以下の試薬および検体を調製して用いた。

リン酸緩衝液ニリン酸−ナトリウム（２水和物）リン酸
二ナトリウム（２水和物）および塩化ナトノウムを、リ
ン酸および塩化ナトリウムの終４変がそれぞれ０．０２
Ｍおよび０．１５Ｍ　、　　そしてｐＨが７．４となる
ように混合して調製した。

リン酸−クエン酸緩衝液：　０．２Ｍリン酸二ナトリウ
ムと０．１Ｍクエン酸とを混合し、ｐＨ５，５に調整し
た。

１％ポリアミンスルホン水溶液：ポリアミンスルホン（
日東紡、　ＲＡＳ−Ａ−５、平均分子ｉ２，０００〜５
．０００　）を水に溶解して１％水溶液とした。このポ
リアミンスルホンの構造式は明細書中の（ｎ）式で示さ
れる。

１ａ＋Ｍ塩酸：塩酸を精製水で希釈して１ａＭ塩酸水溶
液とした。

１％ＢＳＡ　　ニリン酸緩衝液に牛血清アルブミンを１
％となるように溶解した。

ＣＭＣ溶液：カルボキシメチルセルロースを精製水に０
．１〜０．３％となるように溶解した。

ＤＳ溶液：デキストランサルフェートを精製水に０．１
〜０゜３％となるように溶解した。

１％トリトンＸ−１００ニリン酸緩衝液にトリトンＸ−
１００を１％となるように溶解した。

梅毒抗原液二家兎事大中でｌＯ〜１４日間培養したトレ
ポネーマ　パリダム「「」μ咀懸　Ｌ旦可朋。

ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ、　Ｐｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉ
ｃｅ、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅ
ａｌｔｈ、　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒ
ｅ　、　Ａｔ１ａｎｔａ　、　Ｇｅｏｒｇｉａ　）より
入手したものを家兎事大に接種し、ｉａ代培養したもの
を用いた］を生理食塩水中に１０’個菌体／ｍｌとなる
ように懸濁した菌体懸濁液１ｍｌを採り、リン酸緩衝液
中で遠心分Ｍ　（６，０００μｌｍｘ　５分、３回）す
ることにより洗浄した。次いで、得られた沈澱に１≠ト
リトンＸ−１００を１ｍｌ添加し、３７℃にて３０分間
インキエベートした。その後、これを超遠心分離機にか
けて（５０，０００μｌｍ　Ｘ　１時間）上清を採取し
。

１％トリトンＸ−１００で１　、０００倍希釈して使用
した。

梅毒陽性家兎血清：！ｌ丸にトレポネーマ　パリダムを
接種後、４５日間飼育した家兎から血清を採取した。市
販のＴＰＨＡキット（セロディアＴＰ（富士レビオ）、
およびセロクリットＴＰ（化血研））を用いてタイター
（力価）を測定したところ、いずれのキットにおいても
２，５６０タイターを示した。

この血清を１％ＢＳＡで５０倍に希釈して使用した。

正常家兎血清：トレボネーマ　パリダムが接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。上記と同様に市販
のＴＰ）ＩＡキットを用いてタイターを測定したところ
、結果は陰性を示した。この血清を１％ＢＳＡで５０倍
に希釈して用いた。

ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ　　：ペルオキシ
ダーゼ標識抗つサギＩｇＧ　　（マイルズ・ラボラトリ
ーズ社）を１％ＢＳＡで１　、０００倍に希釈して用い
た。

マイクロタイタープレート：プラスチック製の９６穴（
ウェル）マイクロタイタープレート（ヌンク社）を用い
た。

ペルオキシダーゼｉｉ：ｏ−フェニレンジアミン（２塩
酸塩）および過酸化水素水を、リン酸−クエン酸緩衝液
にそれぞれ２■／ｄと０．０３％となるように溶解した
。基質の調製は使用直前に行った。

ＩＮ硫酸：濃硫酸を精製水で希釈してＩＮ硫酸水溶液と
した。

（Ｂ）マイクロタイタープレートの処理マイクロタイタ
ープレートの各ウェルに、１％ポリアミンスルホン水溶
液を５０μｍずつ分注し。

室温にて１時間放置した。その後、アスピレータ−を用
いてポリアミンスルホン水溶液を除去し。

各ウェルを２００μｌの精製水で３回３次いで１ｍＭ塩
酸２００μｌで１回、最後にリン酸緩衝液２００μｍで
１回吸引洗浄した。このマイクロタイタープレートのウ
ェルに梅毒抗原液５０μｌを添加し、室温にて１時間イ
ンキュベートした。対照として、梅毒抗原液の代わりに
１％ＢＳＡを５０μｍ分注したウェルを用意した。イン
キ工ベートの後、梅毒抗原液および１％ＢＳＡを吸引除
去し、２００μｌの１％ＢＳＡで３回吸引洗浄した。次
いで、２００μｌの１％ＢＳＡを添加し、室温にて１時
間放置してブロンキングを行った。その後、１％ＢＳ＾
を吸引除去し。

ＣＭＣ溶液またはＤＳ溶液を２００μｌずつ分注し、室
温で１時間放置した。次に該ＣＭＣ溶液またはＤＳ溶液
を吸収除去した。このような処理を終えたプレートは直
ちにＥＬＩＳＡ分析に使用した。

（Ｃ）　ＥＬＩＳＡ分析 第１抗体として上記の梅毒陽性家兎血清１００ｕｌを使
用した。これを上述のように調製した梅毒抗原固定化マ
イクロタイタープレートの各ウェルに分注した。対照の
ウェル（梅毒抗原の代わりに１％ＢＳＡで処理した）に
も同様に梅毒陽性家兎血清を分注した。別に、血清中の
非特異的吸着を示す物質の存在の有無を調べるために、
上記の正常家兎血清を上記梅毒陽性家兎血清と同様にウ
ェルに分注した。これらのウェルを室温にて１時間イン
キュベートした後、液を吸引除去し、　２００　ｕｌ　
（７）１％ＢＳＡで３回吸引洗浄した。次いで、第２抗
体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギ■ｇＧを１００
μｍずつ各ウェルに分注し、室温にて１時間インキユヘ
ートした。その後、ウェル内の液を吸引除去し。

上記と同様にウェルを２００μｍの１％ＢＳＡで３回吸
引洗浄した後、各ウェルにペルオキシダーゼ基質を１０
０μ！添加し、室温にて正確に１５分間インキュベート
した。基質ブランクとして、第１抗体および第２抗体の
いずれも添加していないウェルを用意し、同様に基質液
を添加してインキュベートした。その後、　ＩＮ硫酸１
００μｍを添加することによって酵素反応を停止させた
。反応停止後、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍ
ＴＰ−１００、コロナ社）を用いて、基質ブランクを対
照として４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を
表１に示す。

表１における数値は、ｎ＝４の平均値である。

ル較拠上 実施例１（Ａ）項における家兎血清の希釈時に。

１％　ＢＳＡまたは従来の非特異反応抑制剤として塩化
コリン緩衝液（塩化コリンを１％ＢＳＡに０．０５〜０
．３Ｍとなるように溶解したもの）を用いた。

さらに（Ｂ）項においてＣＭＣ溶液またはＤＳ溶液の代
わりに１％ＢＳＡを用いた。上記以外は実施例１と同様
に操作して測定を行なった。結果を実施例１の結果とと
もに表１に示す。

（以下余白） 表１から本発明方法により、カチオン性官能基が導入さ
れた担体を用いた場合において非特異的反応が抑制され
特異性が高く、かつ高感度の測定が可能となることがわ
かる。

夫旌炭斐 〔梅毒トレボネーマ抗原ラテックス試薬による抗トレポ
ネーマ抗体の測定］ （＾）試薬および検体の調製 特に指示されないかぎり、実施例１と同一名の試薬およ
び検体は実施例１と同様に調製した。

ラテックス：０．２３μｍポリスチレンラテックス（固
形分１０％、積木化学工業■）を用いた。

（Ｂ）　ラテックスの処理 ラテックス１ｍｌと１％ポリアミンスルホン水ン容液５
ｍｌを混合し、室温にて１時間放置した。その後、遠心
分子ＥｉＩ　（１５，０００ｒｐｍ　Ｘ　１時間）する
ことによりポリアミンスルホン水溶液を除去し、１ｍＭ
塩酸５ｍｌで３回遠心洗浄（１５，０００ｒｐｍ　Ｘ　
１時間）した。さらに、精製水５＋１で同様に３回遠心
洗浄した後、ラテックスの固形分が１０％となるように
精製水に懸濁し、この状態で使用するまで保存した。

上記のようにポリアミンスルホン処理したラテックス２
００μｍと梅毒抗原液８００μｌとを混合し。

室温にて１時間撹拌した。その後、１％ＢＳＡ　５ｍｌ
を添加し、　１５．００Ｏｒｐｍにて１時間遠心分離し
た。

得られた沈澱にＣＭＣ溶液またはＯＳＳ溶液５ｍ合加え
。

室温にて１時間撹拌した。次に、　１５．００Ｏｒｐｍ
にて１時間遠心分離し、得られた沈澱に１％ＢＳＡ　５
ａ＋１を添加し、同様に遠心分離することにより沈澱を
洗浄した。この沈澱に１％ＢＳＡ　４ｍｌを添加し、よ
く分散させてラテックス試薬とした。このようにして調
製したラテックス試薬は、４°Ｃにて保存した。

（Ｃ）免疫凝集法による分析 梅毒陽性家兎血清と上述のように調製したラテックス試
薬とをそれぞれ５０ｔＩＩずつガラス板上に採り、撹拌
混合して３分間反応させた。対照として、正常家兎血清
についても同様に反応させた。

反応後、ラテックス試薬の凝集の有無を目視観察するこ
とにより判定し、凝集が観察された場合を陽性（＋）、
十よりも弱い凝集が観察された場合を（±）、そして凝
集が観察されなかった場合を陰性（−）とした。結果を
表２に示す。

止較炎Ｉ 実施例２（Ａ）項における家兎血清の希釈時に。

比較例１と同様に１％ＢＳＡまたは塩化コリン緩衝、夜
を用いた。さらに（８）項においてＣＭＣ溶液またはＯ
５溶液の代わりに１％ＢＳＡを用いた。その結果を実施
例２の結果とともに表２に示す。

表２から１本発明方法によりカチオン性官能基が導入さ
れた担体（ラテックス）を凝集反応に用いた場合でも、
非特異反応が抑制され、特異性が高く、かつ、高感度の
測定が可能となることがわかる。

（以下余白） （発明の効果） 本発明によれば、このように、非特異的反応が抑制され
特異性が高くかつ高感度での測定が行なわれ得る免疫測
定法が提供される。本性は、各種疾病の診断および治療
のための臨床検査などの分野に広く利用され得る。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の被測定物質である抗原または抗体を免疫反
   応により測定する方法であって； 不活性担体にカチオン性の官能基が導入された、もしく
   はカチオン性の官能基を有する化合物を吸着させたカチ
   オン性不活性担体を調製する工程；該カチオン性不活性
   担体に該被測定物質である抗原または抗体に対する抗体
   または抗原を担持させて、固相化抗体または固相化抗原
   を調製する工程； 該固相化抗体または固相化抗原をポリアニオンと接触さ
   せ、該ポリアニオンを該固相化抗体または固相化抗原に
   担持させる工程；および 該ポリアニオンを担持した固相化抗体または固相化抗原
   と該試料とを混合し、免疫反応により該試料中の被測定
   物質を測定する工程； を包含する免疫測定法。