FI72822C - Immunologisk reagens foer bestaemning av graviditet, foerfarande foer framstaellning av detta och foerfarande foer bestaemning av graviditet. - Google Patents

Description

ΓΒ1 ««KUULUTUSjULKAISU π λ n o o

•$SF® ^ 11 UTLÄGGN,NGSSKRIIFT / ^ O Z Z

C (45) Γ~ t::..' U Uy

(51) Kv.lk.*/lnt.CI.* G 01 N 33/76, 33/5A

gUQJVJI^pjl^LAND (21) Patenttihakemus — Patennn»6kning 8 0 0A 58 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 1 5.0 2.8 0 (Fl) ' * (23) Alkupäivä — Glltlghetsdag 15.02.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivlt offentlig 17.08.80

Patentti- ja rekisterihallitus Nihtäväksipanon ja kuul.julkalsun pvm. -

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publlcerad 31.03.87 (86) Kv. hakemus —Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prloritet 16.02.79 USA(US) 12629 (71) F. Hoffmann-La Roche S Co. Aktiengesel1schaft, Basel, Sveitsi-Schweiz(CH) (72) Hans John Hansen, Allendale, New Jersey, USA(US) (7^) Oy Kolster Ab (5M Raskauden määrittämiseen käytettävä immunologinen reagenssi, menetelmä sen valmistamiseksi ja menetelmä raskauden määrittämiseksi -Immunologisk reagens för bestämning av graviditet, förfarande för framstä 1 1 ning av detta och förfarande för bestämning av graviditet

Keksintö koskee immunologista, diagnostista reagenssia, jota käytetään raskauden määrittämiseksi HCG-määrityksen ja lateksi-agglutinaation avulla. Keksintö koskee myös menetelmää tällaisen reagenssin valmistamiseksi ja menetelmää raskauden määrittämiseksi.

On tunnettua käyttää ihmisen koriongonadotropiinia (jäljempänä käytetään nimitystä HCG) raskaudenmääritykseen soveltuvien lateksireagenssien valmistuksessa. Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 3 857 931 kuvataan tällaisten reagenssien käyttöä ja valmistusta. Lisäksi myynnissä om useita raskaudenmääritysreagensseja, jotka vastaavat lateksi-HCG-tyyppiä.

Kaupallisesti saatavissa olevissa lateksi-HCG-raskauden-määritysreagensseissa käytetään tavallisesti sellaista HCG:tä, joka on osittain puhdistettua, ja joka on sidottu serologisesti inerttiin lateksipolymeeriseen kantaja-aineeseen. Koetta suoritet- 72822 2 taessa laitetaan tippa naisen virtsaa lasilevylle, siihen sekoitetaan ensin tippa anti-HCG-seerumia ja sen jälkeen tippa sellaisen lateksikantaja-aineen vesisuspensiota, johon on sidottu HCG. Muutaman minuutin kuluttua tarkastetaan, onko tapahtunut aggluti-noitumista, jolloin agglutinoituminen merkitsee negatiivista tulosta. Tämä on vain hyvin yleisluontoinen selostus menetelmästä, sillä on olemassa muunnelmia sekä käytetyn toimintatavan että käytettyjen materiaalien suhteen.

Koska on olemassa useita kaupallisia raskaudenmäärityskokei-ta, jotka perustuvat HCG-lateksiin, pyritään tällä alueella jatkuvasti parantamaan määritysmenetelmiä varsinkin herkkyyden, aine-kustannusten, valmistusmenetelmien sekä käyttömukavuuden kannalta. Herkempiä määritysmenetelmiä etsittäessä havaittiin, että voitiin valmistaa erittäin herkkä reagenssi, kun HCG jaettiin CÄ-ketjuun ja^ -ketjuun ja sen jälkeen ^-ketju puhdistettiin (Morgan ja Canfield, Endocrinology, voi. 88, s. 1045 (1971)).

HCG:n /^-ketjun puhdistusmenetelmiä tunnetaan, mutta tähän mennessä tiedossa olevat menetelmät ovat erittäin kalliita, vaikka puhtaan HCG:n /3 -ketjun avulla saadaankin spesifisempi reagenssi, ja näin ollen sen käyttö kaupalliseen lateksipohjaiseen määritykseen on käytännöllisesti katsoen pois suljettu. Ainoa markkinoilla oleva lateksipohjäinen tuote, jossa käytetään /<3 -ketjua, sisältää -ketjun antiseerumia eikä lainkaan puhdistettua HCG-antigee-nin /b -ketjua, mikä on ilmeinen osoitus HCG:n /^»-ketjun puhdistuksen kalleudesta.

Nyt on havaittu, että kaupallisesti saatavissa olevaa epäpuhdasta HCG:tä voidaan käsitellä niin, että saadaan ilman monimutkaista puhdistusta HCG:n /2>-ketju, joka yllättäen on immunolo-gisesti erittäin reaktiivinen.

Keksintö koskee immunologista, diagnostista reagenssia, jota käytetään raskauden määrittämiseksi HCG-määrityksen ja latek-si-agglutinaation avulla, jolloin reagenssi sisältää immunologi-sesti inertin lateksipolymeerin erillisiä hiukkasia, joiden hiuk-kaskoko on 0,01-0,9yum ja ominaispaino on 1,01-1,1, ja joihin on koventtisesti sidottu ihmisen koriongonadotropiinia. (HCG) amidi-sillan välityksellä karbodi-imidikytkentäarneella pH-arvossa 5-8.

72822

Reagenssille on tunnusomaista, että HCG on /3-ketjunsa muodossa ja oleellisesti vapaa οΛ-ketjusta, ja että -ketju on erotettu C*v-ketjusta käsittelemällä osittain puhdistettua HCG:tä, joka sisältää 2000-5000 IU/mg HCG:tä, 0,5-2 tuntia pH-arvossa 4-5,5 ja lämpötilassa 20-50°C kaotrooppisella aineella, nimittäin krean 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, litiumbromidin 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, granidiinihydrokloridin 4,5-6 molaarisella vesipitoisella liuoksella tai ammoniumtiosya-naatin 2-3 molaarisella vesipitoisella liuoksella, minkä jälkeen reaktioseoksen pH säädetään arvoon 7,5 ja HCG:n ja kaotrooppisen aineen seos erotetaan ioninvaihdolla ja/tai muilla tavanomaisilla menetelmillä, joilla molekyylejä voidaan erottaa elektrostaatti-sessa varauksessa esiintyvien erojen perusteella, ja ettei osittain puhdistettua HCG:ta eikä sen ή -ketjua ei ole edelleen puhdistettu.

Keksintö koskee myös menetelmää tällaisen reagenssin valmistamiseksi, jolloin ihmisen koriongonadotropiinia sidotaan pH-arvossa 5-8 karbodiniimidikytkentäaineella immunologisesti inertin lateksipolymeerin erillisiin hiukkasiin, joiden hiukkaskoko on 0,01-0,9^um ja ominaispaino on 1,01-1,1. Menetelmälle on tunnusomaista, että HCG:tä käytetään B-ketjunsa muodossa, joka käsittelemällä osittain puhdistettua HCG:tä, joka sisältää 2000-5000 IU/ mg HCG:tä 0,5-2 tuntia pH-arvossa 4-5,5 ja lämpötilassa 20-50°C kaotrooppisella aineella, nimittäin krean 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, litiumbromidin 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, granidiinihydrokloridin 4,5-6 molaarisella vesipitoisella liuoksella tai ammoniumtiosyanaatin 2-3 molaarisella vesipitoisella liuoksella, jolloin c{ -ketju ja/3-ketju erottuvat toisistaan, minkä jälkeen ^-ketjusta vapaa/S -ketju otetaan talteen säätämällä reaktioseoksen pH arvoon 7,5 ja HCG:n ja kaotrooppisen aineen seos erotetaan ioninvaihdolla ja/tai muilla tavanomaisilla menetelmillä, joilla molekyylejä voidaan erottaa elektro-staattisessa varauksessa esiintyvien erojen perusteella, jolloin ^-ketjulle ei suoriteta lisäpuhdistusta.

Keksintö koskee lisäksi menetelmää raskauden määrittämiseksi määrittämällä kehonnesteissä oleva koriongonadotropiini. Menetelmälle on tunnusomaista, että kehonnesteeseen sekoitetaan 4 72822 koriongonadotropiini-antiseerumia ja saatu seos saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen immunologisen, diagnostisen reagenssin vesipitoisen suspension kanssa ja saatu tulos todetaan.

Edellä kuvatulla tavalla valmistettu HCG:n /»»-ketju voidaan sitoa yksinkertaisella tavalla immunologisesti inerttiin lateksiin, ja näin saadaan reagenssi, joka on 2-4 kertaa herkempi kuin vastaavat tunnetut reagenssit, joissa käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa HCGrtä. Tämän keksinnön mukaisen reagenssin suuri herkkyys on erittäin edullinen, kun ajatellaan, että se voidaan valmistaa suhteellisen epäpuhdasta HCG:tä ilman monimutkaista puhdistusta, jota tähän mennessä on pidetty välttämättömänä, kun on haluttu käyttää HCG:n -ketjua.

Keksinnön mukaisesti hajotetaan kaupallisesti saatavissa oleva suhteellisen epäpuhdas HCG kaotrooppisen aineen avulla oi -ja fit -ketjuksi, jotka voidaan eristää toisistaan tavanomaisilla menetelmillä, esim. ioninvaihtoehtokromatografisesti. Näin saatu HCG:n /3-ketju on immunologisesti erittäin herkkä, vaikka se sisältääkin vielä suuren määrän proteiineja, esim. virtsan proteiineja, jotka ovat peräisin epäpuhtaasta lähtöaineesta.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatu HCG:n /3-ketju voidaan tunnetulla tavalla helposti liittää immunologisesti inerttiin lateksikantaja-aineeseen. Näin saadun reagenssin immunologinen herkkyys havaittiin 2-4-kertaiseksi verrattuna niihin markkinoilla oleviin preparaatteihin, jotka on valmistettu kaupallisesti saatavissa olevasta sopivaan lateksiin sidostusta HCGrstä.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään lähtöaineena tavallista markkinoilla olevaa, suhteellisen epäpuhdasta HCG:tä. Tämä materiaali sisältää proteiinipitoista materiaalia HCG:n lisäksi. Tällaisen kaupallisen valmisteen HCG-pitoisuus on tavallisesti välillä noin 2000-5000 kansainvälistä yksikköä milligrammaa kohti. Valmisteen sisältämä proteiinipitoinen materiaali ei tee HCG:tä immunologisesti epäpuhtaaksi, vaan ainoastaan "laimentaa" sitä. Tällaisia HCG-valmisteita nimitetään "osittain puhdistetuksi" HCG-.ksi.

Vastakohtana edellä mainitulle "osittain puhdistetulle" HCG:lie ymmärtää ammatti-ihminen puhdistetulla HCG:llä sellaista, joka sisältää noin 10 000 - 20 000 IU/mg. On havaittu, että 72822 5 "osittain puhdistettua" HCG:tä, joka sisältää HCG:tä noin 2000 -5000 IU/mg, voidaan käsitellä kaotrooppisella aineella ja saadusta hajoamistuotteesta erotettua /^-ketjua, joka tosin vielä sisältää huomattavan määrän "osittain puhdistetusta" HCG:stä peräisin olevaa proteiinipitoista materiaalia, voidaan käyttää erittäin herkän lateksipohjaisen raskaudenmääritysreagenssin valmistukseen.

Termillä "kaotrooppinen aine" ymmärretään sellaista, joka kykenee rikkomaan polypeptidimolekyylin vetysiltoja. Kaotrooppi-sille aineille on tunnusomaista se, että ne eivät pilko tällaisten molekyylien sisältämiä kovalenttisia sidoksia. Kaotrooppinen aine vaikuttaa enemmän tai vähemmän HCG-molekyylin pintaan pilkkoen vetysiltoja niin, että molekyyli hajoaa o( - ja/3-ketjuksi.

Vaikka sitä mekanismia jolla kaotrooppinen aine tekee "osittain puhdistetun" HCG:n herkemmäksi, ei tarkkaan tunneta voidaan olettaa, että kaotrooppinen aine paljastaa HCG-molekyylin pinnasta enemmän immunologisesti aktiivisia kohtia. Tämän ilmiön ansiosta tulee HCG immunospesifisemmäksi ja herkemmäksi tarvitsematta käyttää kalliita puhdistusmenetelmiä.

Tämän keksinnön mukaisesti käytettäviä kaotrooppisia aineita ovat urean 7-10 M vesiliuos, litiumbromidin 7-10 M vesiliuos, guanidiinihydrokloridin 4,5-6 M vesiliuos ja ammoniumtiosyanaatin 2-3 M vesiliuos, joista ureaa pidetään edullisena.

On havaittu, että edellä mainittuja huomattavasti korkeammat väkevyydet eivät paranna käsittelyn tehoa. Suurella kaotroop-pisen aineen väkevyydellä saattaa tietyissä tapauksissa olla negatiivinen vaikutus haluttuun tulokseen. Kun "osittain puhdistettua" HCGrtä käsitellään kaotrooppisella aineella tämän keksinnön mukaisesti, käytetään pH:ta, joka on välillä noin 4-5,5, edullisesti noin 5. pH-arvon säätämiseen kaotrooppisen aineen vaatimalle alueelle käytetään epäorgaanista happoa, edullisesti suolahappoa. Jokainen yksittäinen kaotrooppinen aine saattaa vaatia oman edullisen pH-arvonsa. Esimerkiksi ureaa kaotrooppisena aineena käytettäessä on edullisin pH-arvo noin 4,5.

Kaotrooppisen aineen annetaan vaikuttaa vesiliuoksessa "osittain puhdistettuun" HCG:hen noin 0,5-2 tuntia, edullisesti noin 1 tunti. Tämän jälkeen reaktioseoksen pH säädetään arvoon 72822 6 7,5 ja käytetään lämpötilaa, joka on välillä noin 20-50°C., edullisesti noin 37°c. On huomattava, että HCG denaturoituu pH-arvossa noin 9,5 ja läsnäolevat virtsaproteiinit denaturoituvat lämpötilassa noin 60°C HCG-liuoksen pH:n säätämiseksi voidaan käyttää sopivaa epäorgaanista emästä, kuten alkalimetallihydroksi-dia, esim. natriumhydroksidia tai kaliumhydroksidia.

Jotta kaotrooppisella aineella tapahtuneen käsittelyn jälkeen eivät HCG:n - ja (3 -ketju yhdistyisi takaisin toisiinsa, erotetaan kaotrooppisen aineen ja HCG:n seos komponentteihinsa tavanomaisella menetelmällä, esim. ioninvaihdolla (ohutkerros tai pylväs), elektroforeesilla ja/tai jollakin muulla tavallisella menetelmällä, jolla molekyylit saadaan toisistaan erilleen elek-trostaattisen varauksensa perusteella. Ioninvaihtokromarografiaa pidetään edullisena. HCG:n o( - ja 0) -ketjun erottamiseen toisistaan voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista ioninvaihtomateri-aalia. Edullinen materiaali on hydrofiilinen, veteenliukenematon ristisilloitettu dekstraanipolymeerigeeli. Tätät materiaalia ja sen valmistusmenetelmää on kuvattu GB-patenttijulkaisussa 854 715. Edullinen geelimateriaali, jota valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi, kauppanimellä "Sephadex", koostuu kolmiulotteisesta makroskooppisesta dekstraanimolekyyliverkosta, jossa yksiköt on sidottu toisiinsa ristisidoksilla. Tämä materiaali kykenee vettä imemällä turpoamaan. Geelin vedenimeniskyky on kääntäen verrannollinen dekstraanin ristisilloitusasteeseen. Huokoisuus-asteeltaan hyvin erilaisia geelimateriaaleja on saatavissa. Ammatti-ihmisten tuntemia vastaavia materiaaleja voidaan käyttää yhtä hyvin. Tätä erotustekniikkaa käyttämällä saadaan HCG:n C3 -ketju, joka on oleellisesti ottaen puhdas (X -ketjusta. Voitiin osoittaa, että tällä menetelmällä saadaan talteen yli 80% HCG-antigeeniominaisuuksista. Tämän jälkeen "osittain puhdistettu" HCG:n /3-ketju sidostaa sopivaan immunologisesti inert-tiin lateksikantaja-aineeseen.

7 72822 "Immunologisesti inerteillä lateksipolymeereillä" tai "immunologisesti inerteillä lateksipolymeerikantaja-aineilla" tarkoitetaan veteenliukenemattomia lateksipolymeereja, joiden hiukkas-koko on noin 0,01-0,9 ja ominaispaino vastaa suurinpiirtein veden ominaispainoa. Tästä seuraa, että sen jälkeen kun HCG:n /3-ketju on sidottu, on hiukkasen ominaispaino suurin piirtein sama kuin veden tai vähän suurempi, so. noin 1,01 - 1,1, mistä seuraa, että hiukkaset pysyvät vesisuspensiossa. Lateksipartikkelien pinnassa pitää olla tarpeeksi suuri varaustiheys, jotta HCG:n/^-ketjun sitomisen jälkeen työntövoimat olisivat tarpeeksi suuret agglutinoitu-misen estymiseksi. Lateksihiukkasten pitää olla inerttejä immunologisissa kokeissa ja niiden tulee mielellään sisältää sellaisia reaktiivisia ryhmiä, jotka muodostavat kovalenttisen sidoksen HCG:n fi-ketjun kanssa. Tällaisia ryhmiä ovat esim. karboksiryhmät, aminoryhmät tai ryhmät, jotka voidaan muuntaa näiksi. Nyt käsillä olevan keksinnön sisältämien lateksihiukkasten tyypillisiä hyviä ryhmiä ovat sellaiset, joissa on aktiivinen vetyatomi, kuten -COOH, -CONH2 tai primäärinen aminoryhmä.

Erittäin edullisia lateksikantaja-aineita ovat sellaiset, joita on markkinoilla saatavissa vesipitoisina lateksisuspensioina, joiden kiinteän aineen pitoisuus on tavallisesti 50-60 %. Tämän keksinnön tarkoitukseen sopivat monentyyppiset lateksipolymeerit edellyttäen, että ne täyttävät edellämainitut vaatimukset. Tämä keksintö kattaa kaikkien sopivien lateksipolymeerien käytön.

Käsillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan HCG:n β-ketju sitoa fysikaalisesti ja/tai kemiallisesti immunologisesti inerttiin lateksipolymeeriin. Edullisessa toteutustavassa sidotaan HCG:n β-ketju vesiliukoisen karbodi-imidikytkentäreagenssin avulla amidi-sillalla lateksipolymeeriin.

Sopivia lateksipolymeerejä ovat esimerkiksi karboksyyliryhmiä sisältävät polymeerit ja kopolymeerit kuten polystyteeni, poly-vinyylipyridiini, styreenibutadieenikopolymeerit, vinyyliasetaatti/ akrylaattikopolymeerit, vinyylikloridi/akrylaattikopolymeerit jne. Karboksyyliryhmät voidaan liittää lateksiin tavanomaisilla emulsio-polymerointimenetelmillä tai jälkikäteen jo valmistettuun polymee s 72822 riin, kuten alan ammatti-ihmiset tietävät. Niinpä voidaan raono-meeriseoksessa käyttää monomeerinä akryylihappoa, metakryylihappoa, itakonihapoa, maleiinihappoa tms. Toisaalta voidaan karboksyyli-ryhmät muodostaa lateksin pintaan tavanomaisella menetelmällä esim. hapettamalla hydroksyyliryhmiä tai hydrolysoimalla akrylaatti- tai metakrylaattiryhmiä pinnasta. Lateksit voidaan valmistaa useilla tavanomaisilla emulsiopolymerointimenetelmillä, esimerkiksi emulsio-polymeroimalla panoksina, emulsiopolymeroimalla ymppäämällä tai puolijatkuvalla tai jatkuvalla emulsiopolymeroinnilla. Karboksyyli-ryhmän liittämistä varten on emulsiopolymerointi ymppäämällä edullinen siten, että ennen reaktion aloitusta reaktioastiaan laitetaan ymppäyslateksi hiukkasten lukumäärän säätämistä varten. Tässä tapauksessa polymeroidaan ymppäyslateksin pintaan monomeeri, joka sisältää karboksyyliryhmän. Markkinoilla olevia tämän keksinnön mukaiseen tarkoitukseen sopivia latekseja ovat esimerkiksi karbok-syloidut styreenibutadieenikopolymeerit, joita Dow Chemical Company valmistaa kauppanimillä "Dow 816" ja "Dow 421".

Tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa sidotaan HCG:n "osittain puhdistettu" {3 -ketju amidisillalla kovalenttisesti edellä mainittuun lateksipolymeeriin käyttämällä kondensointiaineena seu-raavan yleisen kaavan mukaista vesiliukoista karbodi-imidiä

R-N=C*N-R

jossa R on 5 tai 6 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyliryhmä, suora-tai haaraketjuinen 2-12 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, kuten etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, sek.-butyyli, tert.-bu-tyyli, amyyli, heksyyli, oktyyli, nonyyli, undekyyli, dodekyyli tms., yhdellä aryyliryhmällä substituoitu alempi alkyyliryhmä, kuten bentsyyli, oC - tai /3 -fenyylietyyli tms., monoaryyliryhmä, kuten fenyyli, morfolinyyliryhmä, piperidinyyliryhmä, morfolinyyli-ryhmällä substituoitu alempi alkyyliryhmä, kuten morfolinoetyyli, alempi alkyyliryhmä, joka on substituoitu dialempialkyyliaminoryh-mällä, ja pyridinyyliryhmällä substituoitu alempi alkyyliryhmä, kuten oC~, /3- tai P^-metyyli- tai -etyylipyridinyyliryhmä, sekä näiden happoadditiosuolat ja kvaternääriset amiinit.

Edullisia tämän keksinnön mukaisia kondensointiaineita ovat 9 72822 l-sykloheksyyli-3-(2-morfolinoetyyli)-karbodi-imidin metyyli-p-tolueenisulfonaatti ja l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbo-di-imidin hydrokloridi. HCG:n "osittain puhdistetun" ^-ketjun ja sopivan lateksikantaja-aineen välinen reaktion on edullista suorittaa karbodi-imidikondensointiaineen läsnäollessa vesipitoisessa väliaineessa mielellään huoneenlämpötilassa (noin 20-25°C). Lämpötila voi olla myös välillä 5-40°C. Jotta voitaisiin olla varmoja, että HCG:n /?-ketju liittyy tehokkaasti lateksikantaja-aineeseen, käytetään vesiliukoista karbodi-imidiä noin 0,05-2 paino-% kantaja-aineen painosta. Vielä edullisempaa on käyttää kondensointiainetta noin 1 paino-% (kantaja-aineen painosta). Karbodi-imidikondensointi-aineen määrä voi vaihdella laajoissa rajoissa riippuen mm. karbok-syyliryhmien lukumäärästä sekä muista läsnäolevista negatiivisesti varatuista ryhmistä, kuten sulfonaattiryhmistä, joita on lateksi-partikkelin pinnassa.

Kytkentäreaktion pH-arvo on tärkeä, ja sen pitäisi olla noin 5-8, mielellään alueella 6-7. On edullista, jos lateksisuspension pH säädetään halutulle alueelle, so. välille noin 6-7, ennen kuin se lisätään reaktioseokseen.

Reaktioaika on 5 minuutin ja 24 tunnin välillä. Tavallisesti riittää 1 1/2 - 2 1/2 tuntia. Saatu tuote on veteenliukenematon materiaali, joka muodostaa vesisuspension, jonka pH on noin 7 - 8,5, mielellään 8. Materiaalin ominaispainon vastaa suurinpiirtein veden ominaispainoa, ja tästä seuraa, että tuotteen suspensio on stabiili. Tuote voidaan erottaa esimerkiksi sentrifugoimalla, jolloin saadaan valkoinen, hieman tiksotrooppinen, viskoosi ja savimainen materiaali. Kemiallisesti ajatellen tuote sisältää paksuudeltaan yhdestä molekyylistä HCG:n "osittain puhdistettua" /^-ketjua muodostuneen kerroksen, joka on liittynyt fysikaalisesti ja/tai kemiallisesti amidisillan avulla erillisiin immunologisesti inertin kantaja-aineen hiukkasiin. Mahdolliset läsnäolevat proteii-niepäpuhtaudet eivät vaikuta HCG:n ^-ketjun serologiseen herkkyyteen, kuten jo edellä mainittiin.

Vastakohtana kemialliselle sidokselle voidaan proteiinit sitoa lateksiin hydrofobisella sidoksella. Tällaiseen sidokseen on edullista käyttää sellaista lateksia, joka sisältää suhteellisen pienen määrän reaktiivisia, hydrofiilisia ryhmiä, kuten karboksyyli- 10 72822 ryhmiä. Esimerkiksi tavalliset polystyteenipolymeerit ovat sopivia. Tällaisilla hydrofobisilla sidoksilla tapahtuvan sitoutumisen kannalta on edullista, jos käytetään puskurisysteemiä, jolla on korkea pH-arvo, kuten dikarbonaattipuskuria, pH 10-11, ja/tai ^-ketjusta poistetaan happamat sokeri- tai neuramiinihapporyhmät niin, että molekyylistä saadaan vähemmän hydrofiilinen. Tämä voi tapahtua siten, että proteiini lämmitetään noin 80°C:een, tai käsittelemällä proteiini entsyymillä, kuten neuramidaasilla, tai sellaisella proteolyyttisellä entsyymillä, joka lohkaisee sokeriryhmiä sisältäviä peptidejä. Tällaisia entsyymejä ovat mm. trypsiini, papiini ja bromeliini.

Kaupallisia tarkoituksia varten tehdään tämän keksinnön mukaisesta reagenssista vesiliuos, joka sisältää noin 0,5-3,5 paino-% immunologisesti inerttiin kantaja-aineeseen sidottua HCG:n -ketjua. Erittäin edullisia ovat sellaiset suspensiot, jotka sisältävät 1 - 2,5 paino-% edellä mainittua materiaalia. Edullisessa toteutustavassa on HCG:n fi -ketju sidottu amidisillalla karboksyyliryh-miä sisältävään butadieeni-styreenikopolymeeriin, jonka monomeeri-suhde on noin 45 % butadieeniä ja 55 % styreeniä, ja joka sisältää noin 1-5 paino-%, tavallisesti 3 paino-% karboksyyliryhmiä.

HCG:n "osittain puhdistettu" fö -ketju, joka on sidottu immunologisesti inerttiin kantaja-aineeseen, on tämän keksinnön mukaisesti edullista saattaa koepakkauksen muotoon, joka sisältää toisessa säiliössä olevan tarvittavan antiseerumin eli anti-HCG-seerumin. Mainittu antiseerumi voidaan valmistaa ennestään tunnetulla tavalla. Niinpä voidaan kaniinit tai vuohet immunisoida erittäin puhtaalla HCG:llä tai puhdistetulla HCG:n -ketjulla, ja sen jälkeen antiseerumit voidaan kerätä talteen, määrittää titterit ja sen jälkeen varastoida.

Tätä keksintöä valaistaan seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 100 mg markkinoilla olevaa, epäpuhdasta HCGttä, joka sisältää noin 2700 IU/mg, erotetaan Morganin ja Canfieldin menetelmällä (Endocrinology, voi. 88, s. 1045 (1971)). Tämän menetelmän mukaisesti liuotetaan epäpuhdas HCG 15 mitään ureaan 10 M vesi-liuosta ja sen jälkeen liuoksen pH säädetään suolahapolla arvoon 4,5. Liuosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa, sitten lisätään 3 ml n 72822 glysiinin 0,03 M vesiliuosta ja sen jälkeen pH säädetään natrium-hydroksidilla arvoon 7,5.

Näin saadulle liuokselle, joka sisältää toisistaan erillään olevia HCGtnc^- ja β “ketjua, suoritetaan ioninvaihtokromarografi-nen erotus niin, että oi - ja β -ketju saadaan fysikaalisesti toisistaan erilleen ja vältetään niiden yhdistyminen toisiinsa uudestaan. Kromatografinen erotus suoritetaan pylväässä (2,5 x 40 cm), joka on täytetty 20 cm:n korkeuteen "Sephadex A-50:llä" (Pharmacia). Tuotteen hiukkaskoko (kuivana) on noin 40-120 y, imu-tilavuus ml/g kuivaa geeliä 25-33 ja kapasiteetti noin 3 g hemoglo-biinia/g geeliä. Pylväs tasapainotetaan vesiliuoksella, joka sisältää glysiiniä (0,03 M) ja ureaa (8 M), ja jonka pH on 7,5. Läpivirtausnopeudeksi säädetään 60 ml/h ja sen jälkeen laitetaan pylvääseen liuos, joka sisältää HCG:n oi- ja -ketjua. Eluointi tapahtuu 500 ml:lla glysiini/urealiuosta, ja eluaatti, joka sisältää HCG:n oi-ketjun, kerätään kerralla ja heitetään pois.

Pylväs eluoidaan toisen kerran 500 ml :11a vesiliuosta, joka sisältää glysiiniä (0,2 M), natriumkloridia (1,0 M) ja ureaa ( 8 M ), ja jonka pH on 7,5. Eluaatti kerätään yhtenä eränä, laimennetaan yhtä suurella määrällä tislattua vettä ja sen jälkeen väkevöidään ultrasuodatuksella 20 mlrksi. Jae, joka sisältää HCG:n -ketjun, tasapainotetaan sen jälkeen 0,1 M natriumboraat-tipuskurilla, pH 8,0, joka sisältää 0,02 paino-% natriumatsidia.

Ensimmäiselle ja toiselle eluaatille suoritetussa levy-elektroforeesianalyysissä voitiin havaita, että toinen eluaatti sisälsi HCG:n /3-ketjun, jossa ei ollut ci -ketjua, mutta sen sijaan kyllä hieman virtsan proteiinia, ja ensimmäinen eluaatti sisälsi o6~ketjun, jossa oli epäpuhtautena HCG:n ^-ketjua ja virtsan proteiinia. Lateksiagglutinaatiolla voitiin osittaa, että epäpuhtaan lähtöaineen HCG aktiivisuudesta oli saatu talteen yli 80 %.

Esimerkki 2

Epäpuhtaasta markkinoilla olevasta HCG:stä esimerkin 1 mukaisesti valmistettu HCG:n β -ketju sidotaan seuraavassa esitetyllä tavalla kovalenttisesti immunologisesti inerttiin lateksikanta-ja-aineeseen.

5 ml karvoksyloitua styreenibutadieenikopolymeeriä ("Dow Nr. 816") pestään, jauhetaan, säädetään väkevyyteen noin 78-82 mg/ml 72822 ja laitetaan sen jälkeen sopivaan sekoittajalla varustettuun astiaan. Sekoituksen alaisena lisätään 1 ml esimerkin 1 mukaisesti valmistettua HCG:n β-ketjua ja väkevyys säädetään arvoon 3000 IU/HCG/ml.

Kun (h -ketju on dispergoitunut hyvin lateksiin, lisätään tipoittain ja samalla sekoittaen 3 ml l-sykloheksyyli-3-(2-morfo-linoetyyli)karbodi-imidin metyyli-p-tolueenisulfonaatin 1 % vesi-liuosta (tislattu vesi). Kondensointiaineen lisäyksen jälkeen sekoitusta jatketaan vielä 2 tuntia.

Liitännäistä sisältävää lateksia sentrifugoidaan sen jälkeen 30 min. 5-10°C:ssa nopeudella 1500 r/min, ja tänä aikana lateksi erottuu täysin suspensioväliaineesta. Pintaliuoksesta analysoidaan HCG-aktiivisuus ja sen jälkeen se heitetään pois. Sakka pestään 10 ml :11a tislattua vettä, sentrifugoidaan edellä kuvatulla tavalla, ja pintaliuoksesta analysoidaan HCG-aktiivisuus ja se heitetään pois. Sakka pestään 10 ml:lla puskuria, pH 8-8,2, joka sisältää 0,1 M Tris-HCl ja 0,01 % "Merthiolaattia". Lateksi sentrifugoidaan vielä edellä kuvatulla tavalla, pintaliuoksesta analysoidaan HCG-aktiivisuus ja se heitetään pois. Sakka pestään vielä edellä-mainitulla puskurilla ja sen jälkeen se suspendoidaan vielä 10 ml:aan tätä puskuria. Sentrifugointi, pintaliuoksen analyysi, pesu ja uudelleensuspendointi suoritetaan niin monta kertaa, kunnes kaksi puskurilla pestäessä saatua perättäistä pintaliuosta on vailla HCG-aktiivisuutta. Tämän jälkeen on liitännäistä sisältävä, pesty lateksi valmis diagnostiseen reagenssipakkaukseen laitettavaksi ja se suspendoidaan uudelleen 20 ml:aan edellämainittua puskuria .

Tyypillinen reagenssipakkaus sisältää tämän keksinnön mukaisesti valmistetun HCG:n /3-ketjun lisäksi erillisessä säiliössä anti-HCG-seerumia. Tällaiset antiseerumit valmistetaan tunnetuilla menetelmillä, esim. siten, että vuohet immunisoidaan erittäin puhtaalla HCG:llä tai puhdistetulla HCG:n ^-ketjulla, anti-seerumit otetaan talteen ja mitataan titterit. Anti-HCG:n ja virtsan proteiinien välisten ristikkäisreaktioiden välttämiseksi käytetään substraktiivista affiniteettikromatografiaa.

Tätä tarkoitusta varten aktivoidaan 150 ml pestyä "Sepharose 4 B:tä" (Pharmacia) (Primus et ai., J. of Immunol., voi. 188, s. 55 13 72822 (1977)). Seosta, jossa on 0,5 g virtsan proteiinia 200 ml:ssa 0,1 M natriumboraattipuskuria, pH 8,0, sekoitetaan aktivoidun "Sepharose 4 B:n" kanssa 18 tuntia 4°C:ssa, jotta proteiini saadaan liitetyksi siihen. Tuote pestään 1 litralla 0,1 M natrium-boraattipuskuria, pH 8,0, jotta sitoutumaton proteiini poistuu, sen jälkeen pestään 500 ml:lla 2-aminoetanolin 1,5 M vesiliuosta, pH 8,0, jotta "Sepharose 4B"-geelin aktivoituneet ryhmät pelkistyvät, ja sen jälkeen tasapainotetaan vielä natriumboraattipusku-rilla, pH 8,0. Saatu virtsan proteiiniadsorbaatti laitetaan kroma-tografiapylvääseen (halkaisija 4,5 cm). Tähän pylvääseen laitetaan perättäisesti 10 ml normaalia vuohenseerumia (1:2 0,1 M natrium-boraattipuskurissa, pH 8,0), 300 ml 0,1 M natriumboraattipuskuria, pH 8,0, ja 100 ml 3,0 M ammoniumtiosyanaattia 0,1 M natriumfos-faatissa, pH 7,0. Pylväs tasapainotetaan sitten 500 ml :11a 0,1 M natriumboraattipuskuria.

Anti-HCG-seerumi laimennetaan samalla määrällä 0,1 M natriumboraattipuskuria, pH 8,0 ja laitetaan pylvääseen. Adsorptioproses-sin valvontaan käytettiin automaattista affiniteettikromatografia, jossa oli uudelleenkierrätys. Laimennetut antiseerumit kuljetettiin automaattisesti laitteen läpi, kunnes kaikki oli kromatografoitu.

15 ml:n näyte kromatografoitiin läpivirtausnopeudella 60 ml/h. Pylvään läpi tapahtuvaa virtausta tarkkailtiin jatkuvasti, ja virtaus katkaistiin 1 tunniksi, ennenkuin eluaatissa havaittiin proteiinia, jotta näyte sai aikaa reagoida adsorboivan aineen kanssa. 100 ml :11a 3 M ammoniumtiosyanaattia eluoitiin ensin adsorboituma-ton proteiini (HCG:n spesifinen antiseerumi) ja sen jälkeen adsorboitunut proteiini, joka sisälsi virtsan proteiinin vasta-ainetta. Adsorboitumattomat jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin ultrasentri-fugoinnilla näytteen alkuperäiseen tilavuuteen.

Lateksiagglutinaatiolla osoitettiin, että adsorption jälkeisessä talteenotossa saatiin vasta-aineaktiiisuudesta talteen yli 90 %. Antiseerumien spesifisyys määritettiin immunodiffuusiolla ja varmistettiin immunoelektroforeesilla.

Esimerkki 3

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettujen HCG :n (b -ketjujen herkkyys osoitettiin seuraavalla tavalla: 14 72822 HCG:n antiseerumi, joka oli samalla vuohenseerumia, ja joka oli adsoeboitu virtsan proteiineilla, titrattiin ruokasuolaliuok-sella puskuroidussa väliaineessa. Anti-HCG laimennettiin käyttämällä vakiomäärää lateksikonjugaatteja, ja määritettiin viimeinen laimennus, jossa 120 minuutin inkuboinnin jälkeen voitiin havaita agglu-tinaatio tai flokkuloituminen. Viimeinen laimennus katsotaan päätepisteeksi ja tämän antiseerumin ja vastaavan antigeenin titterik-si. Saadut tulokset on esitetty taulukossa I. Toisiinsa verratut lateksikonjugaatit olivat esimerkin 2 mukaisesti valmistettu (!) - ket julateksi, samalla tavoin valmistettu oi--ket julateksi ja markkinoilla oleva raskaudenmäärityskoe, joka sisälsi luonnonmukaista HCGrtä, joka oli sidottu lateksiin.

Taulukko I

Laimennus Lateksikonjugaatti

Anti-HCG HCG Alpha Beta 1:2,000 3-4 3-4 2-3 1:4,000 3-4 3 3-4 1:8,000 3-4 neg. 3-4 1:16,000 neg. neg. 3-4 1:32,000 neg. neg. 2 1:64,000 neg. neg. jälkiä

Arvio 3-4 tarkoittaa voimakasta reaktiota, 3 tarkoittaa keskimääräistä reaktiota, 2 keskimääräisen ja heikon välillä olevaa reaktiota, jäljet hyvin herikkoa reaktiota ja neg. sitä, ettei reaktiota ole lainkaan tapahtunut.

Mitä suurempi antiseerumin laimennus on, sitä vähemmän HCG:tä tarvitaan sen neutraloimiseen. Edellä olevassa taulukossa annetut luonnonmukaisen HCG:n arvot vastaavat herkkyydeltään noin 1,0-1,25 IU HCG/ml virtsaa. /&-ketjulateksin herkkyys, so. pienin määritettävissä oleva määrä, on noin 0,25 IU/ml virtsaa.

Tämä korrelaatio voidaan osoittaa seuraavalla tavalla: Antiseeruminäytteestä määritettiin, kuinka suuren kansainvälisen HCG.yksikkömäärän kanssa se reagoi. Tästä näytteestä tehtiin edellä is 72822 mainittuun puskuriin useita laimennuksia, jotka sekoitettiin mitattaviin virtsanäytteisiin. Joka kerta yhdistettiin 2 ml puskuroitua antiseerumia 1 ml:aan virtsaa koeputkessa. Testattavaa lateksia laitettiin jokaiseen näytteeseen 100 mikrolitraa ja sekoitettiin kääntämällä putkea ylösalaisin. Koeputken alapäätä kuumennettiin 2 tuntia 37°C:ssa. Tämän ajan kuluessa pitäisi ilmetä agglutionoitu-minen tai flokkuloituminen, jos virtsa sisältää niin paljon HCG:tä, että se pystyy inhiboimaan reaktion. Koe suoritettiin vertaamalla toisiinsa luonnonmukaista HCG:tä sisältävää raskaudenmäärityskoetta ja esimerkin 2 mukaisesti valmistettua fi -ketjutuotetta. Tulokset on esitetty taulukossa II. Arviot tarkoittavat samaa kuin taulukossa I.

Taulukko II

Näytteen HCG-väkevyys Lateksikonjugaatti (IU/ml) HCG Beta 0,0 3-4 3-4 0,1 --- 2 0,2 --- 1/2 0,25 3-4 neg.

0,3 --- neg.

0,4 --- neg.

0,5 3-4 neg.

0,75 2-3 1,0 2 1,25 neg.

Nämä luvut osoittavat, että esimerkin 2 mukaisesti valmistetun (b -ketjulateksin herkkyys on parempi kuin luonnonmukaista HCG:tä sisältävän raskaudenmäärityskokeen.

Claims (7)

16 72822

1. Immonologinen diagnostinen reagenssi, jota käytetään raskauden määrittämiseksi HCG-määrityksen ja lateksi-agglutinaa-tion avulla, jolloin reagenssi sisältää immunologisesti inertin lateksipolymeerin erillisiä hiukkasia, joiden hiukkaskoko on 0,01-0,9^um ja ominaispaino on 1,01-1,1, ja joihin on kovalenttisesti sidottu ihmisen koriongonadotropiinia (HCG) amidisillan välityksellä karbodi-imidikytkentäaineilla pH-arvossa 5-8, tunnettu siitä, että HCG on -ketjunsa muodossa ja oleellisesti vapaa -ketjusta, ja että 7^“ketju on erotettu ^-ketjusta käsittelemällä osittain puhdistettua HCG:tä, joka sisältää 2000-5000 IU/mg HCGrtä, 0,5-2 tuntia pH:arvossa 4-5,5 ja lämpötilassa 20-50°C kaotrooppisella aineella, nimittäin urean 7-10 molaari-sella vesipitoisella liuoksella, litiumbromidin 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, granidiinihydrokloridin 4,5-6 molaarisella vesipitoisella liuoksella tai ammoniumtiosyanaatin 2-3 molaarisella vesipitoisella liuoksella, minkä jälkeen reaktioseoksen pH säädetään arvoon 7,5 ja HCG:n ja kaotrooppisen aineen seos erotetaan ioninvaihtoehdolla ja/tai muilla tavanomaisilla menetelmillä, joilla molekyylejä voidaan erottaa elektrostaattisessa varauksessa esiintyvien erojen perusteella, ja ettei osittain puhdistettua HCG:tä eikä sen (^-ketjua ei ole edelleen puhdistettu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen reagenssi, tunnet-t u siitä, että lateksi on karboksiloitu styreenibutadeenikopoly-meeri.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen reagenssi, tunnet-t u siitä, että karbodi-imidikytkentäaine on vesiliukoinen yhdiste, jonka kaava on R-N=C=N-R jossa R on 5-6 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli, suoraketjuinen tai haarautunut, 2-12 hiiliatomia sisältävä alkyyli, monoaryyli-substituoitu alempi alkyyli, monoaryyli, morfolino, piperidyyli, morfolinosubstituoitu alempi alkyyli, di-alempi-alkyyliamino-alkyyli tai pyridyylisubstituoitu alempi alkyyli, tai sen happo-additiosuola tai kvaternäärinen amiini. 72822

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen reagenssi, tunnet-t u siitä, että kytkentäaine on l-sykloheksyyli-3-(2-morfolino-etyyli)karbodi-imidi-meto-p-tolueenisulfonaatti tai l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidihydrokloridi.

5. Menetelmä herkän immunologisen diagnostisen reagenssin valmistamiseksi, jota reagenssia käytetään raskauden määrittämiseksi HCG-määrityksen ja lateksi-agglutinaation avulla, jolloin ihmisen koriongonadotropiinia sidotaan pH-arvossa 5-8 karbodi-imidikytkentäaineella immunologisesti inertin lateksipolymeerin erillisiin hiukkasiin, joiden hiukkaskoko on 0,01-0,9y.um ja ominaispaino on 1,01-1,1, tunnettu siitä, että HCG:tä käytetään -ketjunsa muodossa, joka saadaan käsittelemällä osittain puhdistettua HCG:tä, joka sisältää 2000-5000 IU/mg HCG:tä, 0,5-2 tuntia pH-arvossa 4-5,5 ja lämpötilassa 20-50°C kaotrooppisella aineella, nimittäin urean 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, litiumbromidin 7-10 molaarisella vesipitoisella liuoksella, granidiinihydrokloridin 4,5-6 molaarisella vesipitoisella liuoksella tai ammoniumtiosyanaatin 2-3 molaarisella vesipitoisella liuoksella, jolloin θ( -ketju ja /^-ketju erottuvat toisistaan, minkä jälkeen (X-ketjusta vapaa -ketju otetaan talteen säätämällä reaktioseoksen pH arvoon 7,5 ja HCG:n ja kaotrooppisen aineen seos erotetaan ioninvaihdolla ja/tai muilla tavanomaisilla menetelmillä, joilla molekyylejä voidaan erottaa elektrostaatti-sessa varauksessa esiintyvien erojen perusteella, jolloin ^-ketjulle ei suoriteta lisäpuhdistusta.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että lateksi on karboksiloitu styreenibutadieenikopoly-meeri ja kytkentäaine on l-sykloheksyyli-3-(2-morfolinoetyyli) -karbodi-imidi-meto-p-tolueenisulfonaatti tai l-etyyli-3-(3-dime-tyyliaminopropyyli)-karbodi-imidihydrokloridi.

7. Menetelmä raskauden määrittämiseksi määrittämällä kehon-nesteissa oleva koriongonadotropiini, tunnettu siitä, että kehonnestenäytteeseen sekoitetaan koriongonadotropiini-anti-seerumia ja saatu seos saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen immunologisen, diagnostisen reagenssin vesipitoisen suspension kanssa ja saatu tulos todetaan. 18 72822