NO156546B - Immunologisk reagens for bestemmelse av svangerskap, samt fremgangsmaate for bestemmelsen. - Google Patents
Immunologisk reagens for bestemmelse av svangerskap, samt fremgangsmaate for bestemmelsen. Download PDFInfo
- Publication number
- NO156546B NO156546B NO800426A NO800426A NO156546B NO 156546 B NO156546 B NO 156546B NO 800426 A NO800426 A NO 800426A NO 800426 A NO800426 A NO 800426A NO 156546 B NO156546 B NO 156546B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hcg
- chain
- aqueous solution
- latex
- partially purified
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 54
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 9
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 10
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 10
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 claims description 3
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 claims description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229920003048 styrene butadiene rubber Polymers 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical group N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 1
- JZUFKLXOESDKRF-UHFFFAOYSA-N Chlorothiazide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC2=C1NCNS2(=O)=O JZUFKLXOESDKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-N'-(2-(4-morpholinyl)ethyl)carbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NCCN1CCOCC1 XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N butadiene-styrene rubber Chemical compound C=CC=C.C=CC1=CC=CC=C1 MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- LBVWYGNGGJURHQ-UHFFFAOYSA-N dicarbon Chemical compound [C-]#[C+] LBVWYGNGGJURHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M methacrylate group Chemical group C(C(=C)C)(=O)[O-] CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- GBCAVSYHPPARHX-UHFFFAOYSA-M n'-cyclohexyl-n-[2-(4-methylmorpholin-4-ium-4-yl)ethyl]methanediimine;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1CCCCC1N=C=NCC[N+]1(C)CCOCC1 GBCAVSYHPPARHX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002717 polyvinylpyridine Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009974 thixotropic effect Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Non-Silver Salt Photosensitive Materials And Non-Silver Salt Photography (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Tires In General (AREA)
Description
Anvendelsen av humant koriongonadotropin (i det etterfølgende kalt HCG) for fremstilling av Latexreagens for bestemmelse av svangerskap er lenge kjent. Således beskriver f.eks. US-patent nr. 3.857.931 som ble publisert 31. desember 1974 fremstilling og anvendelse av slike reagenser. Videre finnes det en rekke reagenser for bestemmelse av svangerskapet i handelen som tilsvarer Latex-HCG-typen.
De i handelen tilgjengelige Latex HCG svangerskapsbestemmelser benytter som regel HCG i en delvis renset form som er bundet til en serologisk inert Latex polymerbærer. Ved bruk av be-stemmelsen legges en dråpe urin fra en kvinne på et renset objektglass, blandes med en dråpe anti-HCG serum og blandes så med en dråpe av en vandig suspensjon av en Latexbærer hvor til HCG er bundet. Etter få minutter undersøkes deretter ob-jektglasset med hensyn til om en agglutinering har funnet sted, hvilket betyr et negativ resultat. Dette er imidlertid bare en meget generell angivelse av metoden, for det forefinnes va-rianter både med hensyn til teknikk og de anvendte materialer.
Flere midler for påvisning av svangerskap på HCG latex-basis er markedsført, og det er stadig bestrebelser på dette konkurranseområde å forbedre bestemmelsene med hensyn til sensibilitet, mate-rialeomkostninger, fremstilling og lett operasjon og anvendelse. Under søken etter mer spesifikke bestemmelser ble det funnet at ved oppspaltningen av HCG i dets a- og 3-kjede med etterfølgende rensning av 3-kjeden,kan et meget spesifikt reagens fremstilles [Morgan and Canfield, Endocrinology, Vol. 88, p. 1045 (1971)].
Det fins kjente metoder for rensning av 3-kjeden til HCG, men de hittil kjente metoder er imidlertid svært dyre og derfor - selv om et reagens med forbedret spesifisitet kan oppnås med ren 3-kjede av HCG - er kommersialiseringen praktisk talt uteluk-ket av en bestemmelse på Latex-basis. Det eneste produkt på Latex-basis som befinnner seg på markedet og som anvender 3_ kjedemateriale er et produkt som benytter 3-kjede antiserum og ikke noe renset 3-kjede av HCG antigen, hvilket vel må til-bakeføres til den dyre rensingen av 3~kjeden av HCG.
Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ble det nå funnet at urenset HCG som er handelsvare uten ytterligere kom-plisert rensing kan behandles slik at 3-kjede av HCG erholdes, hvilken - uventet - er immunologisk meget reaktiv. 3~ kjeden av HCG ifølge foreliggende oppfinnelse kan lett bindes til immunologisk inerte latex-partikler hvorved man får et reagens som er 2 til 4 ganger mer sensitivt enn lignende kjente reagenser som anvender kommersielt tilgjengelig HCG. Den store sensibiliteten til reagens ifølge foreliggende oppfinnelse er meget fordelaktig når man tar hensyn til at det kan fremstilles fra urent HCG uten vanskelige renseope-rasjoner, hvilke hittil ble ansett som nødvendig' ved anvendelsen av 3_kjeden av HCG.
Urent HCG, som er handelsvare, spaltes med et kaotropisk middel (som defineres i det følgende) i a- og 3-kjeden, hvilke
så skilles ved vanlige metoder, f.eks. ionebyggerkromatogra-fi. Den derved erholdte 3-kjede av HCG viser en høy immunologisk sensitivitet, selv om den stadig inneholder en stor mengde av protein, f.eks. urinproteiner, som stammer fra urenset utgangsmateriale, og anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse som immunologisk reagens for bestemmelse av svangerskap som angitt i krav l's karakteriserende del.
Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes et urent HCG som utgangsmateriale, hvilket er normalt for handelsvare. Dette materiale inneholder HCG i nærvær av proteinholdig materiale. Innholdet av HCG i slike kommersielt tilgjengelige preparater varierer normalt mellom 2 000 og 5 000 internasjonale enheter/mg (IU/mg). Det proteinholdige materiale som er tilstede i slike preparater forurenser ikke HCG immunologisk, men bare "fortynner" det. Innenfor rammen av foreliggende beskrivelse betegnes slike HCG preparater som "delvis renset "HCGY
I motsetning til det forannevnte "delvis rensede" HCG forstår fagmannen med renset HCG sådant med 10 000 til 20 000 iu/mg. Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ble det nå funnet at "delvis renset" HCG, dvs. HCG som altså inneholder fra 2 000 til 5 000 iu/mg, kan behandles med kaotropisk middel og at den utfra dette isolerte B-kjede - selv om det også i vesentlig grad inneholder proteinholdig materiale av "delvis renset" HCG - kan anvendes for fremstilling av en ytterst sensitiv latex-svangerskapsreagens. Selvfølgelig kan også preparater anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse som utgangs-HCG, hvilket betraktes som "delvis renset" eller "urenset" selv om de muligens inneholder mer enn 5- 000 i u/mg HCG, Området fra 2 000 IU/mg til 5 000 iu/mg an-gis som indikasjon for de handelspreparater man kan få og som betegnes som "rå" eller "delvis rensede". Om kommersielle preparater som har signifikante høyere konsentrasjoner av HCG kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, vil av-henge av prisen på slike preparater.
Ved uttrykket "kaotropisk middel" ifølge foreliggende beskrivelse forstås et middel som er i stand til å spalte hydrogen-bindinger til et polypeptid molekyl. Karakteristisk er at kaotropiske midler ikke spalter kovalente bindinger i slike molekyler. Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse forstås at det kaotropiske middel virker mer eller mindre på overflaten av HCG molekylet og bryter hydrogenbindingen og spalter molekylet i a- og B-kjeden. Selv om den nøyaktige me-kanisme hvorved det kaotropiske middel gjør "delvis renset" HCG mer sensitivt, ikke er kjent, antas det at det kaotropiske middel avdekker mer immunologisk aktive områder på overflaten av HCG molekylet. Ved dette fenomenet blir HCG
mer immunospesifikt og derfor mer sensitivt uten at det er nødvendig å måtte ty til en dyr rensing.
Egnede kaotropiske midler som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelsen er f.eks. en vandig løsning av urea, 7-10 molar, i en vandig løsning av litiumbromid i lignende konsentrasjon, en vandig løsning av guanidinhydroklorid i en konsentrasjon på 4,5 - 6 mol og vandig løsning av ammoniumtio-
cyanat, 2-3 mol. Urealøsningen er foretrukket.
Det er funnet at betydelig høyere konsentrasjoner enn de ovenfor angitte av de kaotropiske midler ikke forbedrer be-handlingens virksomhet. Videre må bemerkes at en større øk-ning av konsentrasjonen til det kaotropiske middel i visse tilfeller kan ha en negativ innflytelse på det ønskede resultat. Generelt anvendes de kaotropiske midler for behandling av "delvis renset" HCG ifølge foreliggende oppfinnelse i et pH område på 4 - 5,5, fortrinnsvis ca. 5. En uorganisk syre, fortrinnsvis saltsyre, anvendes for å innstille det foretrukne pH-område til det kaotropiske middel. Den foretrukne pH kan variere litt for de enkelte kaotropiske midler. Således er f.eks. det foretrukne pH-område ved anvendelse av urea som kaotropisk middel ca. 4,5.
Generelt lar man det kaotropiske middel innvirke 1/2 til 2 timer, fortrinnsvis ca. 1 time, i vandig løsning på det "delvis rensede" HCG. Etter denne tiden blir pH i reaksjonsblandingen innstilt litt høyere enn nøytralt, f.eks. på 7,5. I alminnelighet anvendes en temperatur på 20 - 50°C, fortrinnsvis 37°é. Man må sørge for at pH ikke heves til et område hvor HCG kan denaturere, dvs. en pH på ca. 9,5 eller høyere. Likeledes bør man for å unngå denaturering av tilste-stedeværende urinproteiner unngå temperaturer som er vesentlig over 60°C. For å innstille pH i HCG-løsningen litt høyere enn nøytralt etter adskillelsen anvendes en egnet uorganisk base så som f.eks.et alkalimetallhydroksyd som natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd.
For å forhindre gjenforening av a- og B-kjeden av HCG etter behandlingen med det kaotropiske middel, adskilles blandingen HCG/kaotropisk middel ved konvensjonelle metoder, f.eks.
ved ionebytte (sjikt eller kolonne), elektroforese og/eller videre vanlige metoder, ifølge hvilke molekyler kan separeres på grunn av forskjeller i elektrostatisk ladning. Ione-byttekromatografi foretrekkes. Alle konvensjonelle ione-byttematerialer kan anvendes for separasjon av a- og B-kjeden av HCG. Et foretrukket materiale er en hydrofil, vann-
uløselig, fornettet dekstranpolymergel. Dette materiale og metoden til fremstilling av dette er kjent fra britisk pa-tent nr. 85 4.715. Det foretrukne gelmateriale "Sephadeks" består av et tredimensjonalt makroskopisk nettverk av deks-transubstanser som er kryssbundet med hverandre. Disse materialer er i stand til å adsorbere vann under svelling. Ge-lens evne til vannopptak er omvendt proposjonal med fornet-tingsgraden til dekstransubstansene. Gelmaterialet kan fås i mange forskjellige grader med hensyn til porøsitet. Lignende materialer som er kjent for fagmannen kan likeledes anvendes. Gjennom anvendelsen av denne separasjonsteknikk får man B-kjeden av HCG som i det vesentlige er fri for den forurensede a-kjede. Det ble vist at denne teknikk tillater en gjenvinning på vesentlig mer enn 80 % av HCg antigen egen-skapene. Den "delvis rensede" B-kjeden av HCG bindes derpå til en egnet immunologisk inert latex-bærer.
Uttrykkene "immunologisk inert latexpolymerer"eller "immunologisk inerte latexpolymerbærerpartikler" omfatter vannuløse-lige latexpolymerer med en partikkelstørrelse på 0,01 til 0,9 ^im og en spesifikk vekt som omtrent svarer til vannets. Derav følger at avhengig av bindingen til 3_kjeden til HCG ligger partiklenes spesifikke vekt omtrent som vannets eller litt høyere, dvs. 1,01 til 1,1., hvorved oppnås at par-tiklene forblir i en vandig suspensjon. Latexpartiklene må ha en tilstrekkelig ladningstetthet på overflaten for at deres frastøtende krefter etter bindingen med B-kjeden til HCG er store nok til å forhindre en agglutinering. Latexpartiklene må være inerte ved de immunologiske diagnostiske bestemmelser og fortrinnsvis ha reaktive grupper som er i stand til å danne en kovalent binding med 3-kjeden til HCG. Slike grupper er f.eks. karboksylgrupper, aminogrupper eller grupper som kan omvandles i disse. Typiske grupper av la-texpartikler for formålet ved foreliggende oppfinnelse er spesielt sådanne som har et aktivt hydrogenatom som f.eks.
-C00H, -C0NH2 eller en primær aminogruppe.
Særlig egnede latexbærerpartikler er slike som fås i handelen i form av en vandig latexsuspensjon med en fast konsentrasjon på normalt 50 - 60 %. For formålet ved foreliggende oppfinnelse er mange typer latexpolymerer egnet, forutsatt at de oppfyller de forut nevnte kriterier.
Ifølge foreliggende oppfinnelse kan B-kjeden til HCG bindes fysikalsk og/eller kjemisk til de immunologiske inerte latexpolymerer. Ifølge en foretrukken utførelsesmåte bindes B-kjeden til HCG med et vannløselig karbodiimidkoplingsmiddel kovalent gjennom en amidbinding til latexpolymermaterialer.
Eksempler på egnede latexpolymerer er karboksylholdige poly-merer og kopolymerer som polystyren, polyvinylpyridin, sty-renbutadienkopolymerer, vinylacetat/akrylatkopolymerer, vinyl-klorid-akrylat-kopolymer og lignende. Karboksylgruppene kan innarbeides ved vanlig emulsjonspolymerisasjonsteknikk i la- : texen eller etterpå ved omsetning av den allerede fremstilte latexpolymer eller kopolymer på allerede kjent måte. Således kan f.eks. en monomer så som akrylsyre, metakrylsyre, itakon-syre, maleinsyre eller lignende settes til monomerblandingen. På den annen side kan karboksylgruppene dannes på latexens overflate på vanlig måte, f.eks. ved oksydasjon av hydrok-sylgrupper, hydrolyse av akrylat eller metaakrylatgrupper på overflaten og lignende. Gitrene kan fremstilles ved mange vanlige emulsjonspolymerisasjonsteknikker så som f.eks. emul-sjonspolymerisasjon i satsoperasjonen, emulsjonspolymerisasjonen med poding, halvkontinuerlig eller kontinuerlig emul-sjonspolymerisasjon. For innføring av karboksylgruppe foretrekkes emulsjonspolymerisasjonen med poding ved hvilken,
før reaksjonen oppstartes, en podingslatex settes til reak-sjonsbeholderen for å kontrollere antallet partikler. I dette tilfelle polymeriseres en monomer som inneholder en karboksylgruppe på overflaten av podingslatexpartiklen. Polymergitte-re som er egnet for formålet ved foreliggende oppfinnelse er f.eks. karboksylerte styren-butadien-kopolymerer som "Dow 816' og "Dow 421".
Ifølge en utførelsesform bindes den "delvis rensede" B-kjeden til HCG kovalent gjennom en amidbinding til det foran nevnte polymergitter, idet man som koblingsmiddel anvender et vannløselig karbodiimid.
Foretrukne koblingsmidler kan være l-cykloheksyl-3-(2-mor-folinoetyl)-karbodiimidmeto-p-toluensulfonat og l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydroklorid. Reaksjonen til den "delvis rensede" B-kjede av HCG og den egnede latex-bærer utføres fortrinnsvis i nærvær av karbodiimid-koblingsr midlet i vandig medium, fortrinnsvis ved romtemperatur (20-25°C). Temperaturen kan dog også ligge mellom 5°C og 40°C. For å være sikker på at B-kjeden til HCG ble virksomt bundet til latexbæreren, anvendes en mengde vannløselig karbodiimid som er fra 0,05 til 2 % basert på vekten av bærepartiklene. Ytterligere foretrukket anvendes ca. 1 vekt-% koblingsmiddel (basert på vekten av bærepartiklene). Andelen av karbo-diimidkoblingsmiddel kan imidlertid variere sterkt, men er dog avhengig f.eks. av antallet karboksylgrupper og nærværet av ytterligere negative ladede grupper som f.eks. sulfonat-grupper på latexpartiklenes overflate.
Koblingsreaksjonens pH er viktig og bør ligge mellom 5 og 8, fortrinnsvis mellom 6 og 7. Det foretrekkes å bringe latex-suspensjonens pH i det ønskede pH området, dvs. altså mellom 6 og 7, før den settes til reaksjonsblandingen.
Reaksjonen er ferdig etter 5 minutter til 24 timer. I alminnelighet er 1 1/2 til 2 1/2 time nok. Det erholdte produktet er et vannuløselig materiale som er oppslemmet i et vandig medium og har en pH på 7 til 8,5, fortrinnsvis 8. Materialets spesifikke vekt tilsvarer omtrent vannets, hvilket fører til at suspensjonen av produktet er stabilt. Produktet kan f.eks. isoleres ved sentrifugering og er hvitt, litt tiksotropt, viskøst og leiraktig materiale. Kjemisk sett består produktet av et monomolekylært sjikt av "delvis renset" B-kjede av HCG som fysikalsk og/eller kjemisk er bundet gjennom en amidbinding til adskilte partikler av et immunologisk inert bæremateriale. Eventuelt tilstedeværende kontaminerende proteiner påvirker ikke ømtfintligheten av 3-kjeden til HCG serologisk som forut nevnt.
I motsetning til kjemisk binding kan proteinene bindes gjennom hydrofob binding av reaksjonspartnerne på latexen. For en sådan binding anvendes fortrinnsvis en latex som har et sammenligningsvis lite antall av reaktive hydrofile grupper som f.eks. karboksylgrupper. Vanlige polystyrenpolymerer er f.eks. egnet. Bindingen av slike hydrofobe bindinger begun-stiges videre ved binding i et buffersystem med en høy pH verdi som en dikarbonbuffer på pH 10 til 11 og/eller ved behandling av proteinet for å fjerne sure sukker- eller neura-minsyregrupper fra 3-kjeden for å gjøre molekylet mindre hydrofilt. Dette kan skje ved oppvarming av proteinet til ca. 80°C eller ved behandling av proteinet med et enzym som er neuramidase eller et proteolytisk enzym som spalter pep-tider hvilke inneholder sure sukkergrupper. Eksempel på slike enzymer er trypsin, papain og bromelin.
For kommersielle formål bringes reagenset som erholdes iføl-ge foreliggende oppfinnelse i form av en vandig løsning som inneholder 0,5 til 3,5 vekt-% av 3-kjeden til HCG, hvilken ,ér bundet til den immunologiske inerte bærer. Spesielt inneholder slike suspensjoner fra 1 til 2,5 vekt-% slike partikler. Ifølge et foretrukket aspekt er 3-kjeden til HCG bundet gjennom en amidbinding til karboksylert butadien-styren-kopolymer, hvilket har et monomer-forhold på ca. 45 % butadien og 55 % styren og har 1-5 vekt-%, normalt 3 vekt-% karboksylgrupper.
Den vandige suspensjonen av "delvis renset" 3-kjede av HCG som er bundet til den immunologiske inerte bærer bringes ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis i form av en bestemmelsessats som i en andre beholder inneholder det egnede antiserum, dvs. anti HCG serummet. Det nevnte antiserum kan fremstilles på i og for seg kjent måte. Således kan kaniner eller geit med sterkt renset HCG eller renset B-kjede av HCG immuniseres, hvoretter antiserummet samles, styrken deres prøves og de lagres deretter.
De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
EKSEMPEL 1
100 mg urenset handels-HCG som inneholder ca. 2 700 IU/mg spaltes etter metoden til Morgan and Canfield in Endocrinology, bind 88, side 1045 (1971). Ifølge denne metode løses det urensede HCG i 15 ml av en 10 M vandig løsning urea, hvorpå pH av den resulterende løsning innstilles med saltsyre på 4,5. Løsningen inkuberes i 1 time ved 37°C, så tilsettes 3 ml av en 0,3 M vandig løsning av glycin, hvorpå
pH innstilles på 7,5 med natriumhydroksyd.
En slik løsning som inneholder den adskilte a- og B-kjede
av HCG ionebyttekromatograferes for å fysikalsk adskille a- og 3-kjeden og unngå en gjenforening. Kromatografien ut-føres på en 2,5 x 40 cm kromatografisøyle som er fylt opp til en høyde på 20 cm med "Sephadex A-50". Produktet har en par-tikkelstørrelse (tørr) på 40-120 ^um, et massevolum/ml/g
av tørr gel på 25-33 <g>g en kapasitet på ca. 3 g hemoglobin/g av gelen. Kolonnen ekvilibreres med en vandig løsning av glycin (0,03 M) og urea (8M) ved pH 7,5. Gjennomløpshastigheten innstilles på 60 ml/t, hvorpå løsningen som inneholder a-
og 3-kjeden av HCG settes på kolonnen. Kolonnen elueres så med 500 ml glycin/urealøsning, og eluatet, som inneholder a-kjeden av HCG, oppsamles under ett og kastes.
Kolonnen elueres en andre gang med 500 ml av en vandig løs-ning glycin (0,2 M) , natriumklorid (1,0 :M) og urea (8 M)
ved pH 7,5. Eluatene samles i en sats, fortynnes med samme mengde destillert vann og fortynnes så ved ultrafiltrering til 20 ml. Fraksjonen som inneholder 3-kjeden av HCG, ekvilibreres så med 0,1 M natriumboratbuffer med pH 8,0, som inneholder 0,02 vekt-% natriuméizid.
Gjennom analytisk plateelektroforese av prøver fra første
og andre eluat, kunne man vise at det andre eluatet, som inneholdt 3-kjeden av HCG, men var fritt for a-kjeden, likevel stadig inneholdt urinproteiner, mens derimot det første eluatet inneholdt a-kjeden kontaminert med en bestemt
mengde B-kjede HCG og urinproteiner. Gjennom latexagglutinering kunne vises at mer enn 80 % HCG aktivitet av det urensede utgangsmateriale kunne gjenvinnes.
EKSEMPEL 2
Ifølge eksempel 1 fremstilt B-kjede av HCG ut fra urenset handelsvare, bindes HCG gjennom-den etterfølgende metode kovalent på immunologisk inert latexbærepartikler: 5 ml av en latex av en karboksylert styrenbutadienkopolymer ("Dow nr. 816") vaskes, males, innstilles på en konsentrasjon på 78-82 mg/ml og plasseres så i en egnet beholder-med rører. Under røring tilsettes 1 ml B_kjede av HCG fremstilt ifølge eksempel 1 og bringes til en konsentrasjon på 3 000 HJ HCG/ml.
Når B-kjeden av HCG i latexen er godt dispergert, tilsettes dråpevis under røring 3 ml av en 1%-ig løsning av 1-cyklo-heksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbodiimidmeto-p-toluensulfonat i destillert vann. Når tilsetningen av koblingsmidlet er ferdig, rører man videre 2 timer.
Den koblede latex sentrifugeres så 30 minutter ved 5-10°C ved 1 500 omdreininger/min slik at latexen fullstendig adskilles fra suspensjonsmediet. Supernatanten analyseres for å bestemme HCG-aktiviteten og kastes deretter. Resten vaskes med 10 ml destillert vann, sentrifugeres som forut beskrevet, hvoretter supernatanten analyseres med hensyn til HCG aktivitet og kastes. Resten vaskes med 10 ml av en buffer med pH 8 - 8,2, som inneholder 0,1 M Tris-HCl og 0,01 % mer-tiolat. Latexen sentrifugeres på nytt på foran nevnte måte, hvoretter supernatanten undersøkes med hensyn til HCG-aktivitet og kastes. Resten vaskes igjen med foran nevnte buffer og resuspenderes så i 10 ml av denne bufferen. Rekkefølgen sentrifugering, undersøkelse av supernatanten, vaskingen og resuspenderingen gjentas inntil 2 påfølgende superna-tanter etter vasking med buffer er fri for HCG aktivitet. Den koblede, vaskede latex er da klar til å bringes i en diagnostisk reagenssats og resuspenderes i 20 ml av den nevnte buffer.
En typisk reagenssats (reagens garnitur) som inneholder B-kjeden av HCG fremstilt ifølge foregående fremgangsmåte,
ville inneholde anti-HCG serum i en separat beholder, slike antisera fremstilles ved vanlige metoder i geiter, f.eks.
ved immunisering av dyrene med meget rent HCG eller den rensede 3-kjede av HCG, samling av antisera og undersøkelse av styrken. For å eliminere kryssreaksjoner av anti-HCG med urinproteiner, anvendes den subtraktive affinitetskromato-grafi .
For denne metoden aktiveres 150 ml vasket "Sepharose 4 B" ifølge metoden til Primus et al. i J. of Immuno., Vol. 188,
p 55 (1977). 0,5%-ig urinproteiner i 200 ml 0,1 M natriumboratbuffer med pH 8,0 blandes med den aktiverte "Sepharose 4 B" 18 timer ved 4°C for å koble proteinene til dette. Produktet vaskes med 1 1 0,1 M natriumboratbuffer med pH 8,0
for å fjerne ikke-bundet protein, vaskes så med 500 ml av en 1,5 M vandig løsning av 2-aminoetanol med pH 8,0 for å redusere de aktiverte gruppene til "Sepharose 4 B" gelen, hvorpå man reekvilibrerer med natriumboratbuffer på pH 8,0. Det erholdte urinproteinadsorbat bringes i en kromatografisøyle med 4,5 cm diameter. Til denne kolonnen setter man i rekke-følge 10 ml normalt geiteserum, (1:2 i 0,1 M natriumboratbuffer med pH 8,0), 300 ml 0,1 M natriumboratbuffer på pH
8,0 og 100 ml 3,0 M ammoniumtiocyanat i 0,1 M natriumfos-
fat på pH 7,0. Kolonnen reekvilibreres så med 500 ml 0,1 M natriumboratbuffer.
Anti-HCG serummet fortynnes med like store del 0,1 M na-triumboratbuf f er på pH 8,0 og settes på kolonnen. For å kontrollere adsorpsjonsprosessen anvendte man en automatisk affinitetskromatograf med recyklisering. De fortynnede antisera ble sendt automatisk gjennom apparatet inntil alt var kromatografert. En prøve på 15 ml ble kromatografert ved en gjennomløpshastighet på 60 ml/t. Kolonneeluatet ble kontinuerlig kontrollert gjennom absorbans og - før protein fore-kom i eluatet - ble strømmen avbrutt i 1 time, slik at prø-ven kunne reagere med adsorbenten. Med 100 ml 3 M ammoniumtiocyanat ble først ikke-adsorbert protein (spesifikt antiserum til HCG), og deretter adsorbert protein som inneholdt antistoffer til urinproteiner, eluert. De ikke adsorberte fraksjoner ble slått sammen og konsentrert gjennom utrafil-<: trering til prøvens opprinnelige volum.
Gjennom latexagglutinering ble det påvist at etter adsorp-sjon var gjenvinningen av antistoffaktivitet mer enn 90%. Spesifisiteten av antisera ble bestemt ved immunodiffusjon og fastslått gjennom immunoelektroforese.
EKSEMPEL 3
Sensitiviteten til B-kjeden av HCG fremstilt ifølge eksempel 1 ble vist som følger: Et antiserum til HCG, geiteserum, adsorbert med urinproteiner, ble titrert i et medium bufret med fysiologisk kok-saltløsning. I nærvær av konstante mengder latexkonjugater ble anti-HCG fortynnet, og den siste fortynningen ble bestemt ved hvilken fremdeles agglutinering eller flokkulering kunne observeres etter en inkubasjon på 120 minutter. Den siste fortynning betraktes som sluttpunkt og styrke av dette antiserum og det tilsvarende antigen. Resultatene er sammen-fattet i den etterfølgende tabell I. Latexkonjugatene som ble sammenlignet er B-kjede-latex ifølge eksempel 2, et lignende fremstilt a-kjede-latex og en kommersiell svangerskapsbestemmelse som inneholdt nativt HCG bundet til en latex.
Et resultat på 3-4 betyr sterk reaksjon, 3 middels reaksjon, 2 middels til svak reaksjon, spor meget svak reaksjon og neg. ingen reaksjon.
Jo høyere fortynningen av antiserum er, desto mindre HCG tren-ges for nøytralisering av dette. De verdier som finnes i oven-stående tabell for nativt HCG tilsvarer omtrent en sensitivitet på 1,0 til 1,25 iu. HCG/ml urin. Sensitiviteten, dvs. den siste bestembare mengde av 3-kjedelatex er omtrent 0,25 iu./ ml urin.
Denne korrelasjon kan vises som følger:
For en prøve av antiserum ble det bestemt med hvilken mengde HCG i internasjonale enheter den reagerer. En rekke fortynnin-ger av denne prøven i ovenfor nevnte buffer ble satt til urin-prøvene som skulle undersøkes. I hvert tilfelle ble 2 ml bufret antiserum slått sammen med 1 ml urin i et prøverør. 100 ^ul av latexen som skulle undersøkes ble satt til hver prøve, og dette ble blandet ved å snu det. Den nedre enden av prøverøret ble oppvarmet 2 timer ved 37°C. Etter denne tiden skulle man kunne se agglutinering eller flokkulering hvis tilstrekkelig HCG er tilstede i urinen til å inhibere reaksjonen. Sammenlig-ningen ble utført mellom en svangerskapsbestemmelse som inneholdt<*>" nativt HCG og et B-kjedeprodukt ifølge eksempel 2. Resultatene er angitt i tabell II. Anmerkningene har samme be^ tydning som for tabell I.
Disse tallene viser den forbedrede sensiviteten til 3-kjede latex ifølge eksempel 2 sammenlignet med svangerskapsunder-søkelsen som inneholdt nativt HCG.
Claims (2)
1. Immunologisk reagens for bestemmelse av svangerskap ved hjelp av humant choriongonadotropin (HCG) og latex agglutinering inneholdende diskrete partikler av en immunologisk inert latex polymer med en partikkelstørrelse på 0,01 - 0,9 um og en egenvekt på 1,01 - 1,1 hvorpå HCG har blitt kovalent bundet via en amidbro med et carbo-diimid koblingsreagens ved enpHpå5-8karakterisert ved at HCG anvendes i hovedsak i form av f! >-kjeden, hvor fh -kjeden har blitt separert fra ^-kjeden ved å behandle delvis renset HCG inneholdende 2000 - 5000 IU/mg i 1/2 - 2 timer ved pH 4 - 5,5 og en temperatur på 20 - 50°C med et kaotropisk middel, det vil si med en 7 - 10 M vandig oppløsning av urea, en 7 - 10 M vandig oppløsning av litiumbromid, en 4,5 - 6 M vanndig oppløsning av guanidin hydroklorid eller en 2 - 3 M vandig oppløsning av ammonium tiocyanat, for derpå å justere pH i reaksjonsblandingen til 7,5 og separere blandingen av HCG/kaotropisk middel ved ionebytting og/eller ytterligere konvensjonelle metoder hvorved molekylene kan separeres på bakgrunn av sine elektro-statiske ladningsforskjeller, og hvorved hverken det delvis rensede HCG eller ^ -kjeden derav har blitt ytterligere renset.
2. Fremgangsmåte ved bestemmelse av svangerskap gjennom påvisning av tilstedeværelse av choriongonadotropin i kroppsvæsker, karakterisert ved at en prøve av en slik væske blandes med choriongonadotropin antiserum og deretter kontakter denne blandingen med en vandig suspensjon av det immunologisk diagnostiske reagens ifølge krav 1 og observerer eventuell agglutinering eller flokkulering.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US1262979A | 1979-02-16 | 1979-02-16 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO800426L NO800426L (no) | 1980-08-18 |
NO156546B true NO156546B (no) | 1987-06-29 |
NO156546C NO156546C (no) | 1987-10-07 |
Family
ID=21755912
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO800426A NO156546C (no) | 1979-02-16 | 1980-02-15 | Immunologisk reagens for bestemmelse av svangerskap, samt fremgangsmaate for bestemmelsen. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0014965B1 (no) |
JP (1) | JPS55160854A (no) |
AT (2) | ATE10034T1 (no) |
AU (1) | AU532375B2 (no) |
CA (1) | CA1119924A (no) |
DE (1) | DE3069477D1 (no) |
DK (1) | DK153590C (no) |
ES (1) | ES489277A0 (no) |
FI (1) | FI72822C (no) |
NO (1) | NO156546C (no) |
NZ (1) | NZ192872A (no) |
ZA (1) | ZA80887B (no) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL63855A (en) * | 1981-09-16 | 1984-10-31 | Teva Pharma | Method and kit for detecting pregnancy |
US4543339A (en) * | 1982-03-16 | 1985-09-24 | Oneill Christopher | Early pregnancy detection by detecting enhanced blood platelet activation |
JPS6157856A (ja) * | 1984-08-29 | 1986-03-24 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ホルモンの測定方法 |
JPS63305251A (ja) * | 1987-06-05 | 1988-12-13 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | ラテツクス凝集反応を利用する免疫学的測定方法 |
JPS64169U (no) * | 1987-06-22 | 1989-01-05 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3992514A (en) * | 1972-07-17 | 1976-11-16 | Istituto Farmacologico Serono S.P.A. | Radioimmunoassay method for human chorionic gonadotropin in the presence of luteinizing hormone |
US4123509A (en) * | 1974-12-19 | 1978-10-31 | American Home Products Corporation | Pregnancy test |
US4140662A (en) * | 1977-03-25 | 1979-02-20 | Ortho Diagnostics, Inc. | Attachment of proteins to inert particles |
CA1101330A (en) * | 1977-09-19 | 1981-05-19 | Ernst A. Fischer | Immunological material bonded to carboxylated latex polymer and process for making it |
US4138214A (en) * | 1977-12-19 | 1979-02-06 | American Home Products Corporation | Diagnostic test utilizing human chorionic gonadotropin |
US4234561A (en) * | 1978-02-06 | 1980-11-18 | Research Corporation | Antigen for early pregnancy test and contraceptive vaccine |
-
1980
- 1980-02-14 AT AT80100755T patent/ATE10034T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-14 CA CA000345609A patent/CA1119924A/en not_active Expired
- 1980-02-14 EP EP80100755A patent/EP0014965B1/de not_active Expired
- 1980-02-14 NZ NZ192872A patent/NZ192872A/xx unknown
- 1980-02-14 DE DE8080100755T patent/DE3069477D1/de not_active Expired
- 1980-02-15 ZA ZA00800887A patent/ZA80887B/xx unknown
- 1980-02-15 NO NO800426A patent/NO156546C/no unknown
- 1980-02-15 ES ES489277A patent/ES489277A0/es active Granted
- 1980-02-15 AU AU55610/80A patent/AU532375B2/en not_active Ceased
- 1980-02-15 DK DK068480A patent/DK153590C/da active
- 1980-02-15 FI FI800458A patent/FI72822C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-02-15 AT AT0083880A patent/AT365201B/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-15 JP JP1669980A patent/JPS55160854A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS55160854A (en) | 1980-12-15 |
AT365201B (de) | 1981-12-28 |
ATA83880A (de) | 1981-05-15 |
DK153590B (da) | 1988-07-25 |
NO800426L (no) | 1980-08-18 |
CA1119924A (en) | 1982-03-16 |
FI800458A (fi) | 1980-08-17 |
DK68480A (da) | 1980-08-17 |
ES8103843A1 (es) | 1981-03-16 |
AU5561080A (en) | 1980-08-21 |
AU532375B2 (en) | 1983-09-29 |
FI72822B (fi) | 1987-03-31 |
JPS6253773B2 (no) | 1987-11-12 |
EP0014965A1 (de) | 1980-09-03 |
ATE10034T1 (de) | 1984-11-15 |
ZA80887B (en) | 1981-02-25 |
DK153590C (da) | 1988-12-12 |
NO156546C (no) | 1987-10-07 |
EP0014965B1 (de) | 1984-10-24 |
ES489277A0 (es) | 1981-03-16 |
NZ192872A (en) | 1983-03-15 |
DE3069477D1 (en) | 1984-11-29 |
FI72822C (fi) | 1987-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4347311A (en) | Enzyme immunoassay for determining antigen specific antibodies and test kit for carrying out this assay | |
Jagendorf et al. | Use of antibody bound to modified cellulose as an immunospecific adsorbent of antigens | |
US4343896A (en) | Method and test pack for the demonstration and determination of an antigen or antibody | |
EP0871658B1 (en) | Modified avidin and streptavidin molecules and use thereof | |
US20090215198A1 (en) | Immunological Latex Turbidimetry Method and Reagent Therefor | |
EP0064318B1 (en) | A method and a kit for the assay of antibodies to soluble antigens | |
JPH0566399B2 (no) | ||
JP2000206115A (ja) | 抗体断片を用いた免疫凝集反応試薬 | |
NO159820B (no) | Fremgangsmaate ved bestemmelse av antigen-antistoff-reaksjoner. | |
US3992517A (en) | Detection of hepatitis B surface antigen by latex agglutination | |
JPH0731197B2 (ja) | 低級アルコールスルフェート洗浄液,試験キットおよび免疫リガンドの測定方法 | |
NO156546B (no) | Immunologisk reagens for bestemmelse av svangerskap, samt fremgangsmaate for bestemmelsen. | |
JP3186831B2 (ja) | 血液型試薬としての凝集複合体 | |
JPH028271B2 (no) | ||
JPH05223821A (ja) | 歯周疾患に伴う微生物の検出方法及びそれらに有用なキット | |
US5055395A (en) | Latex agglutination method for the detection of anti-streptococcal deoxyribonuclease b | |
JP3479073B2 (ja) | 抗hpa抗体の検出 | |
US5474900A (en) | Process for preparing purified syphilis antigen from Treponema palljdum | |
JP2997520B2 (ja) | 血栓及び凝固亢進状態の診断及び検査のための生物学的試料からのd―ダイマーの直接化学結合的方法 | |
EP0271554A1 (en) | Preparation for immunoassay and method for producing the preparation | |
NO138394B (no) | Fremgangsmaate for aa fastslaa naervaer av australia-antigen i en blodproeve | |
JPH11125634A (ja) | 免疫測定用固相 | |
JPH0720129A (ja) | 免疫学的凝集反応試薬 | |
JP2001264334A (ja) | 梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びその製造方法 | |
JP4104219B2 (ja) | 抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法、測定試薬及び測定方法 |