DK153590B - Immunologisk diagnostisk reagens til paavisning af svangerskab, fremgangsmaade til fremstilling af dette reagens samt anvendelse deraf til paavisning af svangerskab - Google Patents

Description

DK 153590B

i

Den foreliggende opfindelse angår et immunologisk diagnostisk reagens til påvisning af svangerskab ved hjælp af HCG-bestemmelse og latex-agglutination, en fremgangsmåde til fremstilling af dette reagens samt en fremgangsmåde til påvisning af svangerskab.

5 Anvendelsen af humant choriongonadotropin (herefter benævnt HCG) til fremstilling af latexreagenser til påvisning af svangerskab har været kendt længe. Således er der f.eks. i USA patentskrift nr. 3.857.931, som blev offentligt tilgængeligt den 31. december 1974, beskrevet fremstilling og anvendelse af sådanne reagenser. Der fore-10 kommer endvidere i handelen en række reagenser til påvisning af svangerskab, hvilke reagenser svarer til latex-HCG-typen. Et lignende reagens er beskrevet i fransk patentskrift nr. 2.234.789.

De kommercielt tilgængelige latex-HCG-svangerskabstests anvender i reglen HCG i en delvis renset form, som er bundet på en serologisk 15 inert latexpolymerbærer. Ved udførelse af testen anbringes en dråbe af kvindens urin på et renset objektglas, blandes med en dråbe anti-HCG-serum og blandes derefter med en dråbe af en vandig suspension af et latex bærestof, hvortil der er bundet HCG. Efter nogle minutter undersøges objektglasset for at se, om en agglutination 20 har fundet sted, hvilket angiver et negativt resultat. Dette er kun en meget almen angivelse af metoden, idet der eksisterer varianter, både med hensyn til teknik og med hensyn til anvendte materialer.

Da flere kommercielle svangerskabstests er baseret på HCG-latex, er der inden for dette konkurrenceområde konstante bestræbelser på at 25 forbedre disse tests, nemlig med hensyn til sensibilitet, materialeomkostninger, fremstilling og bekvemmelighed ved håndtering og anvendelse. I efterforskningen efter mere specifikke tests har det vist sig, at der ved opspaltning af HCG i dettes a- og β-kæde og påfølgende rensning af β-kæden kan fremstilles et i højeste grad specifikt rea-30 gens [Morgan & Canfield, Endocrinology, bind 88, side 1045 (1971)].

Der kendes metoder til rensning af β-kæden fra HCG, men de hidtil kendte metoder er yderst kostbare, hvorfor - selv om der kan fremstilles et reagens med forbedret specificitet med en ren β-kæde fra

DK 153590B

2 HCG - kommercialiseringen som test på latexbasis i praksis er udelukket. Det eneste produkt på latexbasis, som er på markedet, og hvori β-kædematerialet anvendes, er et produkt, hvori β-kæde-antiserum og ikke renset β-kæde fra HCG-antigen benyttes, hvilket vel sagtens 5 skyldes den kostbare rensning af β-kæden fra HCG.

Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse er der nu fundet en metode, ifølge hvilken råt HCG, som er kommercielt tilgængeligt, uden yderligere kostbar rensning kan behandles, så at der fra HCG fås β-kæden, som - overraskende nok, immunologisk er meget reaktiv.

10 β-Kæden fra HCG ifølge den foreliggende opfindelse kan på simpel måde bindes til immunologisk inerte latexpartikler, hvorved der fås et reagens, som er 2 - 4 gange mere sensitivt end lignende, kendte reagenser, i hvilke der anvendes kommercielt tilgængeligt HCG. Den store sensibilitet, som udvises af reagenset ifølge den foreliggende 15 opfindelse, er meget fordelagtig, når man betænker, at det kan fremstilles ud fra relativt urent HCG uden kostbare rensningsteknikker, der hidtil har været anset for at være nødvendige ved anvendelse af β-kæden fra HCG.

Den foreliggende opfindelse angår et immunologisk diagnostisk reagens 20 til påvisning af svangerskab ved hjælp af HCG-bestemmelse og latex-agglutination, hvilket reagens indeholder adskilte partikler af en immunologisk inert latexpolymer med en partikelstørrelse på 0,01-0,9 ym og en massefylde på 1,01-1,1, hvortil humant choriongona-dotropin CHCG) er bundet covalent med et carbodiimid-koblingsmiddel 25 ved en pH-værdi på 5-8 via en amidbro, hvilket reagens er ejendommeligt ved, at HCG anvendes i form af sin β-kæde, som er i det væsentlige fri for α-kæden, og hvor denne β-kæde er skilt fra a-kæ-den ved 1/2-2 timers behandling af delvis renset HCG indeholdende 2000-5000 ΙΕ/mg HCG ved en pH-værdi på 4-5,5 og en temperatur på 30 20-50°C med et chaotropisk middel, nemlig med en 7-10 molær vandig opløsning af urinstof, en 7-10 molær vandig opløsning af lithiumbro-mid, en 4,5-6 molær vandig opløsning af guanidinhydrochlorid eller en 2-3 molær vandig opløsning af ammoniumthiocyanat, påfølgende indstilling af pH-værdien i reaktionsblandingen på 7,5 og adskillelse af 35 blandingen af HCG og chaotropisk middel ved ionbytning og/eller 3

DK 153590B

andre sædvanlige metoder, ved hvilke molekyler kan adskilles på grund af forskelle i den elektrostatiske ladning, og hvor hverken det delvis rensede HCG eller β-kæden deraf er renset yderligere. Den således vundne β-kæde fra HCG udviser en høj immunologisk sensitivi-5 tet, selv om den stadig endnu indeholder en stor mængde proteiner, fx urinproteiner, som stammer fra urenset udgangsmateriale.

Opfindelsen omfatter tillige en fremgangsmåde til fremstilling af dette reagens, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes HCG i form af dens β-kæde, som fås ved, at delvis renset HCG 10 indeholdende 2000-5000 ΙΕ/mg HCG behandles i 1/2-2 timer ved en pH-værdi på 4-5,5 og ved en temperatur på 20-50°C med et chaotro-pisk middel, nemlig med en 7-10 molær vandig opløsning af urinstof, en 7-10 molær vandig opløsning af lithiumbromid, en 4,5-6 molær vandig opløsning af guanidin-hydrochlorid eller en 2-3 molær vandig 15 opløsning af ammoniumthiocyanat, hvorved der fås adskillelse af a-kæden og β-kæden, β-kæden isoleres fri for a-kæden ved indstilling af pH-værdien i reaktionsblandingen på 7,5 og adskillelse af blandingen af HCG og chaotropisk middel ved ionbytning og/eller andre sædvanlige metoder, 20 ved hvilken molekyler adskilles på grund af forskelle i den elektrostatiske ladning, uden at β-kæden underkastes yderligere rensning. Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til påvisning af svangerskab ved bestemmelse af tilstedeværelse af choriongonadotropin i legemsvæsker, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en 25 prøve af denne væske blandes med choriongonadotropin-antiserum, hvorefter denne blanding bringes i kontakt med en vandig suspension af det immunologiske diagnostiske reagens ifølge opfindelsen, og de opnåede resultater iagttages.

β-Kæden fra HCG, som fås ved fremgangsmåden ifølge den foreliggen-30 de opfindelse, kan let på i og for sig kendt måde bindes til immunologisk inerte latexbærepartikler. Det har vist sig, at det vundne reagens har en 2 - 4 gange så stor immunologisk sensitivitet som kommercialiserede præparater, som har kommercielt tilgængeligt HCG bundet til en egnet latex.

DK 153590B

4

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes som udgangsmateriale et relativt urent HCG i den form, hvori det sædvanligvis forekommer i handelen. Dette materiale indeholder HCG i nærværelse af protein hol digt materiale. Indholdet af HCG i sådanne kom-5 mercielt tilgængelige præparater svinger sædvanligvis mellem ca. 2000 og ca. 5000 internationale enheder/mg. Det proteinholdige materiale, som forekommer i sådanne præparater, forurener ikke HCG immunologisk, men "fortynder" det blot. I nærværende beskrivelse betegnes sådanne HCG-præparater som "delvis renset" HCG.

10 I modsætning til det ovenfor omtalte "delvis rensede" HCG forstår fagmanden ved renset HCG et sådant materiale, som indeholder ca.

10.000 - ca. 20.000 ΙΕ/mg. Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse har det nu vist sig, at "delvis renset" HCG, dvs. altså HCG indeholdende ca. 2.000 - ca. 5.000 ΙΕ/mg, kan behandles med et 15 chaotropisk middel, og at den derfra isolerede β-kæde - omend den endnu indeholder en væsentlig andel proteinholdigt materiale af "delvis renset" HCG - kan anvendes til fremstilling af et yderst sensitivt latex-svangerskabsreagens.

Ved udtrykket "chaotropisk middel" forstås i nærværende beskrivelse 20 et middel, som er i stand til at spalte hydrogenbroer i et polypeptid-molekyle. Chaotropiske midler spalter karakteristisk ikke covalente bindinger i sådanne molekyler. Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse forstås, at det chaotropiske middel mere eller mindre virker på HCG-molekylets overflade og bryder hydrogenbroerne og 25 spalter molekylet i a- og β-kæden.

Egnede chaotropiske midler, som kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter f.eks. en vandig opløsning af urinstof, ca. 7 -ca. 10 molær, en vandig opløsning af lithiumbromid i lignende koncentration, en vandig opløsning af guanidin-hydrochlorid i en koncentra-30 tion på ca. 4,5 - ca. 6 mol, og en vandig opløsning af ammoniumthio-cyanat, ca. 2 - 3 molær. Urinstofopløsningen foretrækkes.

De chaotropiske midler til behandling af "delvis renset" HCG ifølge den foreliggende opfindelse anvendes i et pH-område på fra ca. 4 til 5

DK 153590B

5,5, fortrinsvis ca. 5. En uorganisk syre, fortrinsvis saltsyre, anvendes til indstilling af det chaotropiske middels foretrukne pH-områ-de. For de enkelte chaotropiske midler kan det foretrukne pH-område let variere. Således ligger f.eks. det foretrukne pH-område ved 5 anvendelse af urinstof som chaotropisk middel på ca. 4,5.

Det chaotropiske middel lades indvirke i ca. 1/2 til ca. 2 timer, fortrinsvis i ca. 1 time, i vandig opløsning på det "delvis rensede" HCG. Derefter indstilles pH-værdien i reaktionsblandingen på 7,5.

Der anvendes en temperatur på ca. 20 - 50°C, fortrinsvis ca. 37°C.

10 Til indstilling af pH-værdien i HCG-opløsningen efter opspaltningen anvendes en egnet uorganisk base, f.eks. et alkalimetalhydroxid såsom natriumhydroxid eller kaliumhydroxid.

For at forhindre en genforening af a- og (5-kæden fra HCG efter behandlingen med det chaotropiske middel, skilles blandingen af HCG 15 og chaotropisk middel ved ionbytning (lag eller kolonne), elektrofore-se og/eller andre sædvanlige metoder, ifølge hvilke molekyler kan skilles på grund af forskelle i den elektrostatiske ladning, lonbyt-ningschromatografi foretrækkes. Ethvert sædvanligt ionbytningsmateriale kan anvendes til spaltning af a- og β-kæden fra HCG. Et fore-20 trukket materiale er en hydrofil, vanduopløselig, tværbundet dextran-polymergel. Dette materiale og metoden til fremstilling deraf er beskrevet i britisk patentskrift nr. 854.715. Det foretrukne gelmateriale, som er kommercielt tilgængeligt fra Firma Pharmacia Fine Chemi-cals, Uppsala, Sverige, under varemærket "Sephadex" , består af et 25 tredimensionalt, makroskopisk netværk af dextranstoffer, som er forbundet eller tværbundet med hinanden. Dette materiale er i stand til at absorbere vand under opkvældning. Gelens evne til vandoptagelse er omvendt proportional med dextranstoffernes tværbindingsgrad. Gelmaterialet kan fås i mange forskellige grader med hensyn til 30 porøsitet. Lignende kendte stoffer inden for området kan også anvendes. Ved anvendelse af denne adskillelsesteknik fås β-kæden fra HCG, som er i det væsentlige fri for den forurenende α-kæde. Det har vist sig, at denne teknik tillader en genvinding af væsentligt mere end 80% af HCG-antigenegenskaberne. Den "delvis rensede" 35 β-kæde fra HCG bindes derefter til et egnet immunologisk inert latex-bærestof.

DK 153590B

6

Udtrykket "immunologisk inerte latexpolymerer" og "immunologisk inerte latexpolymerbærestofpartikler" omfatter vanduopiøselige latexpolymerer med en partikelstørrelse på ca. 0,01 - 0,9 og en massefylde, der omtrentlig svarer til vands. Dette medfører, at partiklernes 5 massefylde efter bindingen af β-kæden fra HCG svarer omtrentlig til vands eller ligger lidt derover, dvs. på 1,01 - ca. 1,1, hvorved det opnås, at partiklerne forbliver i vandig suspension. Latexpartikierne skal have en tilstrækkelig ladningstæthed på overfladen, for at deres frastødende kræfter er store nok til at forhindre en agglutination 10 efter binding med β-kæden fra HCG. Latexparti kierne skal være inerte i forhold til de immunologiske diagnostiske tests og fortrinsvis have reaktive grupper, som er i stand til at danne en covalent binding med β-kæden fra HCG. Sådanne grupper er f.eks. carboxygrup-per, aminogrupper og grupper, som kan omdannes dertil. Typiske, til 15 formålet ifølge opfindelsen særlig velegnede grupper på latexpartikler er sådanne, som indeholder et aktivt hydrogenatom, f.eks. -COOH, -CONH2 og primære aminogrupper.

Særlig egnede latexbærestoffer er sådanne, som forekommer i handelen i form af en vandig latexsuspension med en faststofkoncentration på 20 sædvanligvis 50 - 60%. Til den foreliggende opfindelses formål er mange arter latexpolymerer egnede, når blot de opfylder de ovennævnte kriterier. Den foreliggende opfindelse omfatter anvendelse af alle egnede latexpolymerer.

Ifølge den foreliggende opfindelse bindes β-kæden fra HCG med et 25 vandopløseligt carbodiimid-koblingsmiddel covalent til latexpolymerpar-tiklerne via en amidbro.

Eksempler på egnede latexpolymerer omfatter carboxylholdige polymerer og copolymerer såsom polystyren, polyvinylpyridin, styrenbuta-dien-copolymerer, vinylacetat/acrylat-copolymerer og vinylchlorid-30 acrylat-copolymerer. Carboxylgrupperne kan ved sædvanlig emulsionspolymerisationsteknik indarbejdes i latexen, eller de kan indarbejdes senere ved reaktion af den allerede fremstillede latexpolymer eller -copolymer på kendt måde. Således kan f.eks. en monomer såsom acrylsyre, methacrylsyre, itaconsyre, maleinsyre eller lignende sættes 7

DK 153590B

til monomerblandingen. På den anden side kan carboxylgrupperne dannes på sædvanlig måde på latexens overflade, f.eks. ved oxidation af hydroxylgrupper eller ved hydrolyse af acrylat- eller methacrylat-grupper på overfladen. Latexerne kan fremstilles ved mange sædvan-5 lige emulsionspolymerisationsteknikker, f.eks. batchvis emulsionspolymerisation, emulsionspolymerisation ved podning eller halvkontinuerlig eller kontinuerlig emulsionspolymerisation. Til indføring af en carbox-ylgruppe foretrækkes emulsionspolymerisation med podning, ved hvilken en podelatex - før reaktionen startes - sættes til reaktionsbe-10 holderen til regulering af antallet af partikler. I dette tilfælde poly-meriseres en carboxygruppeholdig monomer på overfladen af podela-texpartiklerne.

Kommercielt tilgængelige latexer, som er egnede til den foreliggende opfindelses formål, omfatter f.eks. carboxylerede styrenbutadien-co-15 polymerer, som fås under mærkerne "Dow" 816 og "Dow" 421 fra Dow Chemical Company.

Som koblingsmiddel anvendes et vandopløseligt carbodiimid med den almene formel

R-N=C=N-R

20 hvor R betegner en 5- eller 6-leddet cycloalkylgruppe; en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 2-12 carbonatomer, f.eks. ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek. butyl, tert. butyl, amyl, hexyl, octyl, nonyl, undecyl eller dodecyl; en monoarylsubstitueret lavere alkylgruppe, f.eks. benzyl eller a- eller β-phenylethyl; en monoaryl-25 gruppe såsom phenyl, morpholinyl eller piperidyl; en morpholinylsub-stitueret lavere alkylgruppe, f.eks. morpholinoethyl; en di(lavere alkyl)amino-lavere alkylgruppe eller en pyridylsubstitueret lavere alkylgruppe såsom o-, β- eller ϊ-methyl- eller -ethylpyridyl; samt syreadditionssalte og kvaternære aminer deraf.

30 Foretrukne koblingsmidler ifølge den foreliggende opfindelse er 1-cyc-lohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluensulfonat og

DK 153590B

8 l-ethyl-3-(3-dimethyiaminopropy()-carbodiimid-hydrochlorid. Reaktionen mellem den "delvis rensede" β-kæde fra HCG og det egnede latexbærestof udføres fortrinsvis i nærværelse af carbodiimid-koblingsmidlet i vandigt medium, fortrinsvis ved stuetemperatur (ca. 20 5 -25°C). Temperaturen kan dog også ligge mellem 5 og 40°C. For at sikre sig, at β-kæden fra HCG bindes virksomt til latexbærestoffet, anvendes en sådan mængde vandopløseligt carbodiimid, som ligger på ca. 0,05 - ca. 2 vægtprocent, beregnet på bærestofpartiklernes vægt.

Det foretrækkes især at anvende ca. 1 vægtprocent koblingsmiddei 10 (beregnet på bærestofpartiklernes vægt). Carbodiimid-koblingsmidlets andel kan variere inden for vide grænser, men er dog afhængig af f.eks. antallet af carboxylgrupper og tilstedeværelsen af yderligere negativt ladede grupper (f.eks. sulfonatgrupper) på latexpartikiernes overflade.

15 pH-Værdien ved koblingsreaktionen er vigtig og skal ligge mellem ca.

5 og 8, fortrinsvis mellem ca. 6 og 7. Det foretrækkes at bringe pH-værdien i latexsuspensionen til det ønskede område, dvs. altså mellem 6 og 7, før den sættes til reaktionsblandingen.

Reaktionen er til ende på mellem ca. 5 minutter og ca. 24 timer.

20 Generelt er det tilstrækkeligt med 1,5 - 2,5 timer. Det vundne produkt er et vanduopløseligt materiale, som er suspenderet i et vandigt medium og opviser en pH-værdi på ca. 7 - ca. 8,5, fortrinsvis 8. Materialets massefylde svarer ca. til vands, hvilket medfører, at suspensionen af produktet er stabil. Produktet kan f.eks. isoleres 25 ved centrifugering og er et hvidt, let thixotropt, viskost og leragtigt materiale. Kemisk set består produktet af et monomolekylært lag af "delvis renset" β-kæde fra HCG, som fysisk og/eller kemisk via en amidbro er bundet til adskilte partikler af et immunologisk inert bærestof. Eventuelt tilstedeværende kontaminerende proteiner har, som 30 ovenfor omtalt, ingen serologisk indflydelse på sensitiviteten af β-kæ-den fra HCG.

Til kommercielle formål bringes det ifølge den foreliggende opfindelse vundne reagens i form af en vandig opløsning, som indeholder ca.

0,5 - ca. 3,5 vægtprocent β-kæde fra HCG, som er bundet til det 9

DK 153590B

immunologisk inerte bærestof. Det foretrækkes især, at sådanne suspensioner indeholder mellem ca. 1 og ca. 2,5 vægtprocent af sådanne partikler. Ved et foretrukket aspekt er (5-kæden fra HCG via en amidbro bundet til en carboxyleret butadien-styren-copolymer, som 5 har et monomerforhold på ca. 45% butadien og 55% styren, og som indeholder ca. 1 - 5 vægtprocent, sædvanligvis 3 vægtprocent, carbox-ylgrupper.

Den vandige suspension af den "delvis rensede" (5-kæde fra HCG, som er bundet til det immunologisk inerte bærestof, bringes ifølge den 10 foreliggende opfindelse fortrinsvis i form af et testsæt, som i en anden beholder indeholder det egnede antiserum, dvs. anti-HCG-se-rum. Det omtalte antiserum kan fremstilles på i og for sig kendt måde. Således kan kaniner eller geder immuniseres med stærkt renset HCG eller renset β-kæde fra HCG, hvorefter antiseraene samles, og 15 deres titer bestemmes, hvorefter de oplagres.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

100 mg kommercielt tilgængeligt, råt HCG indeholdende ca. 2700 lE/mg spaltes ved den af Morgan & Canfield i Endocrinology, rbind 88, side 20 1045 (1971) angivne metode. Ifølge denne metode opløses det rå HCG i 15 ml af en 10M vandig opløsning af urinstof, hvorefter pH-værdien i den resulterende opløsning indstilles på 4,5 ved hjælp af saltsyre. Opløsningen inkuberes i 1 time ved 37°C, hvorefter der tilsættes 3 ml af en 0,03M vandig opløsning af glycin, hvorefter pH-værdien indstil-25 les på 7,5 ved hjælp af natriumhydroxid.

En således vunden opløsning indeholdende den adskilte a- og β-kæde fra HCG underkastes ionbytningschromatografi for fysisk at adskille a- og β-kæden og undgå en genforening. Chromatografien udføres på en 2,5 x 40 cm chromatografisøjle, som til en højde på 20 cm er fyldt 30 med "Sephadex" A-50 (Pharmacia). Produktet har en partikelstørrelse (tør) på ca. 40 - 120 mikron, et lagvolumen/ml/g i den tørre gel på

DK 153590B

ίο 25 - 33 og en kapacitet på ca. 3 g hæmoglobin/g gel. Søjlen ækvili-breres med en vandig opløsning af glycin (0,03M) og urinstof (8M) med pH-værdi 7,5. Gennemstrømningshastigheden indstilles på 60 ml /time, hvorefter opløsningen indeholdende a- og β-kæden fra HCG 5 anbringes på søjlen. Søjlen elueres derefter med 500 ml glycin/urin-stofopløsning, og eluatet, som indeholder α-kæden fra HCG, opsamles på én gang og kasseres.

Søjlen elueres endnu en gang med 500 ml 0,2M glycin, 1,0M natrium-chloridopløsning og 8M urinstofopløsning med pH-vaerdi 7,5. Eluaterne Ί0 samles i én batch, som fortyndes med en lige så stor mængde destilleret vand og derefter ved ultrafiltering bringes på 20 ml. Den fraktion, som indeholder β-kæden fra HCG, ækvilibreres derefter med 0,1M natriumboratpuffer med pH-værdi 8,0, som indeholder 0,02 vægtprocent natriumazid.

15 Ved analytisk skiveelektroforese på prøver fra første og andet eluat kan det vises, at det andet eluat indeholder β-kæden fra HCG fri for α-kæde, men dog stadig indeholdende urinproteiner, hvorimod det første eluat indeholder α-kæde forurenet med en bestemt andel β-kæde HCG og urinproteiner. Ved latexagglutination kan det vises, at mere 20 end 80% HCG-aktivitet fra det rå udgangsmateriale kan genvindes.

Eksempel 2.

Ifølge eksempel 1 ud fra "råt" kommercielt tilgængeligt HCG fremstillet β-kæde fra HCG bindes ved nedenstående fremgangsmåde covalent til immunologisk inerte latexbærestofpartikler: g 25 5 ml af en latex af carboxyleret styren-butadien-copolymer ("Dow" nr. 816) vaskes, formales, indstilles på en koncentration på ca. 78 -82 mg/ml og hældes derefter i en egnet beholder med røreværk.

Under omrøringen tilsættes 1 ml β-kæde fra HCG fremstillet ifølge eksempel 1, og der indstilles på en koncentration på 3.000 IE 30 HCG/ml.

, DK 153590B

11 Når β-kæden fra HCG er godt dispergeret i latexen, tildryppes under omrøring 3 ml af en 1%'s opløsning af 1-cyclohexyl-3-(2-morpholino-ethyI)carbodiimid-metho-p-toluensulfonat i destilleret vand. Når tilsætningen af koblingsmidlet er endt, omrøres der i yderligere 2 timer.

5 Den koblede latex centrifugeres derefter i 30 minutter ved 5 - 10°C og 1500 omdrejninger/minut, hvorved latexen helt skilles fra suspensionsmediet. Den overstående væske analyseres til bestemmelse af HCG-aktivitet og kasseres derefter. Remanensen vaskes med 10 ml destilleret vand og centrifugeres som ovenfor beskrevet, hvorefter 10 den overstående væske analyseres for HCG-aktivitet og kasseres. Remanensen vaskes med 10 ml af en puffer med pH-værdi 8 - 8,2, som indeholder 0,1M tris-HCI og 0,01% Merthiolat. Latexen centrifugeres igen på den ovenfor beskrevne måde, hvorefter den overstående væske undersøges for HCG-aktivitet og kasseres. Remanensen vaskes 15 igen med den ovennævnte puffer og resuspenderes derefter i 10 ml af denne puffer. Cyclen med centrifugering, analyse af den overstående væske, vask og resuspendering gentages, indtil den overstående væske i to på hinanden følgende cycler efter vask med puffer er fri for HCG-aktivitet. Den koblede, vaskede latex er derefter klar til at 20 blive anbragt i et diagnostisk reagenssæt og resuspenderes i 20 ml af den omtalte puffer.

Et typisk reagenssæt (reagensgarniture) indeholdende β-kæden fra HCG fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse vil i en separat beholder indeholde anti-HCG-serum. Sådanne anti-sera dannes på 25 sædvanlig måde i geder, f.eks. ved immunisering af dyrene med stærkt renset HCG eller den rensede β-kæde fra HCG, opsamling af antisera og kontrol af titeren. For at eliminere krydsreaktion mellem anti-HCG og urinproteiner anvendes den subtraktive affinitetschroma-tog raf i.

30 Til denne fremgangsmåde aktiveres 150 ml vasket "Sepharose" 4 B (Pharmacia) ved den af Primus et al. i J. of Immuno., bind 188, side 55 (1977) angivne metode. 0,5 g% urinprotein i 200 ml 0,1M natrium-boratpuffer med pH-værdi 8,0 blandes med den aktiverede Sepharose 4 B i 18 timer ved 4°C for at koble proteinet dertil. Produktet vaskes

DK 153590B

12 med 1 liter 0,1M natriumboratpuffer med pHværdi 8,0 for at fjerne ubundet protein og vaskes derefter med 500 ml 1,5M vandig 2-amino-ethanolopløsning med pH-værdi 8,0 for at reducere de aktiverede grupper i Sepharose 4 B-gelen, hvorefter der genækvilibreres med 5 natri umboratpuff er med pH-værdi 8,0. Det vundne urinproteinadsorbat hældes i en chromatografisøjle med en diameter på 4,5 cm. Til denne kolonne hældes i anførte rækkefølge: 10 ml normalt gedeserum (1:2 i 0,1M natri umboratpuff er med pH-værdi 8,0), 300 ml 0,1M natriumbo-ratpuffer med pH-værdi 8,0 og 100 ml 3,OM ammoniumthiocyanat i 0,1M 10 natriumphosphat med pH-værdi 7,0. Kolonnen genækvilibreres derefter med 500 ml 0,1M natriumboratpuffer.

Anti-HCG-serummet fortyndes med en lige så stor mængde 0,1M natri-umboratpuffer med pH-værdi 8,0 og hældes på søjlen. Til kontrol af adsorptionsprocessen anvendes en automatisk affinitetschromatograf 15 med recyclisering. De fortyndede antisera føres automatisk gennem apparatet, til alt er chromatograferet. En prøve på 15 ml chromato-graferes ved en gennemstrømningshastighed på 60 ml/time. Kolonne-eluatet undersøges kontinuerligt ved adsorbans, og - før der dukker protein op i eluatet - afbrydes strømmen i 1 time, så at prøven kan 20 reagere med adsorbanset. Med 100 ml 3M ammoniumthiocyanat elueres først ikke-adsorberet protein (specifikt antiserum til HCG) og derefter adsorberet protein indeholdende antistoffer mod urinproteiner. De ikke-adsorberede fraktioner sammenhældes og koncentreres efter ultrafiltrering til det oprindelige prøvevolumen.

25 Ved latexagglutination vises det, at genvindingen af antistofaktivitet efter adsorptionen ligger på mere end 90%. Antiseraenes specificitet bestemmes ved immunodiffusion og bekræftes ved immunoelektroforese.

Eksempel 3.

Sensiviteten af den ifølge eksempel 1 fremstillede β-kæde fra HCG 30 vises på følgende måde: 13

DK 153590B

Et antiserum mod HCG, gedeserum, adsorberet med urinproteiner ti-treres i et med fysiologisk kogsaltopløsning puf ret medium. I nærværelse af konstante mængder latex kon jugater fortyndes anti-HCG, og den sidste fortynding, ved hvilken der efter en inkubation på 120 5 minutter stadig kan iagttages agglutination eller flokkulering, bestemmes. Den sidste fortynding betragtes som slutprodukt og titer for dette antiserum og det korresponderende antigen. Resultaterne er sammenfattet i nedenstående tabel I. De latexkonjugater, der sammenlignes, er β-kæde-latex ifølge, eksempel 2, en på lignende måde frem-10 stillet α-kæde-latex og en kommerciel svangerskabstest indeholdende nativt HCG bundet til en latex.

Tabel I

Fortynding Latexkonjugat

Anti-HCG HCG α β 15 __ 1:2.000 3-4 3-4 2-3 1:4.000 3-4 3 3-4 1:8.000 3 - 4 neg. 3 - 4 1:16.000 neg. neg. 3-4 20 1:32.000 neg. neg. 2 1:64.000 neg. neg. spor

En værdi på 3 - 4 betyder kraftig reaktion, 3 angiver middel reaktion, 2 angiver middel til svag reaktion, spor angiver meget svag reaktion, og "neg." angiver ingen reaktion.

25 Jo højere fortyndingen af antiserum er, des mindre HCG er der nødvendigt til neutralisation deraf. De i tabel I angivne værdier for nativt HCG svarer omtrentligt til en sensivitet på 1,0 - 1,25 IE HCG/ml urin. Sensiviteten, dvs. den sidste bestemmelige mængde β-kæde-latex, er ca. 0,25 ΙΕ/ml urin.

DK 153590B

14

Denne korrelation kan vises på følgende måde:

Af en antiserumprøve bestemmes det, med hvilken mængde HCG i internationale enheder, den reagerer. En række fortyndinger af denne prøve i den ovennævnte puffer sættes til de urinprøver, der skal 5 testes. I hvert tilfælde sammenhældes 2 ml pufret antiserum med 1 ml urin i et reagensglas. 100 mikroliter af den latex, der skal afprøves, sættes til hver prøve, og der blandes ved vending. Den nedre ende af reagensglasset opvarmes i 2 timer til 37°C. Derefter skulle agglutination eller flokkulering kunne ses, medmindre der er tilstrækkeligt 10 HCG i urinen, som kan inhibere reaktionen. Sammenligningen udføres mellem en svangerskabstest indeholdende nativt HCG og et β-kæde-produkt ifølge eksempel 2. Resultaterne er anført i nedenstående tabel II. Bemærkningerne hertil er de samme som til tabel I.

Tabel II

15 Koncentration Latexkonjugat af HCG i prøven (lE/ml) HCG β 0,0 3-4 3-4 20 0,1 - 2 0,2 - ± 0,25 3 - 4 neg.

0,3 — neg.

0,4 -- neg.

25 0,5 3 - 4 neg.

0,75 2 - 3 1,0 2 1,25 neg.

Disse tal viser den ifølge eksempel 2 fremstillede β-kæde-latexs for-30 bedrede sensivitet i forhold til svangerskabstesten indeholdende nativt HCG.

Claims (7)

1. Immunologisk diagnostisk reagens til påvisning af svangerskab ved hjælp af HCG-bestemmelse og latexagglutination, hvilket reagens indeholder adskilte partikler af en immunologisk inert latexpolymer med 5 en partikelstørrelse på 0,01-0,9 ym og en massefylde på 1,01-1,1, hvortil humant choriongonadotropin (HCG) er bundet covalent med et carbodiimid-koblingsmiddel ved en pH-værdi på 5-8 via en amidbro, kendeteg n et ved, at HCG anvendes i form af sin β-kæde, som er i det væsentlige fri for α-kæden, og hvor denne β-kæde er 10 skilt fra α-kæden ved 1/2-2 timers behandling af delvis renset HCG indeholdende 2000-5000 ΙΕ/mg HCG ved en pH-værdi på 4-5,5 og en temperatur på 20-50°C med et chaotropisk middel, nemlig med en 7-10 molær vandig opløsning af urinstof, en 7-10 molær vandig opløsning af lithiumbromid, en 4,5-6 molær vandig opløsning af guanidinhydrochlo-15 rid eller en 2-3 molær vandig opløsning af ammoniumthiocyanat, påfølgende indstilling af pH-værdien i reaktionsblandingen på 7,5 og adskillelse af blandingen af HCG og chaotropisk middel ved ionbytning og/eller andre sædvanlige metoder, ved hvilke molekyler kan adskilles på grund af forskelle i den elektrostatiske ladning, og hvor hverken 20 det delvis rensede HCG eller β-kæden deraf er renset yderligere.

2. Reagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at latexen er en carboxyleret styren-butadien-copolymer.

3. Reagens ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at det vandopløselige carbodiimid-koblingsmiddel illustreres ved den almene formel R-N=C=N-R hvor R betegner cycloalkyl med 5-6 carbonatomer, ligekædet eller forgrenet alkyl med 2-12 carbonatomer, monoarylsubstitueret lavere 30 alkyl, monoaryl, morpholino, piperidyl, morpholinosubstitueret lavere alkyl, di(lavere alkyl)amino-lavere alkyl eller pyridylsubstitueret lavere alkyl, eller syreadditionssalte deraf eller kvaternære aminer deraf. DK 153590B

4. Reagens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koblingsmidlet er 1 -cyclohexyl-3-(2-morphoMnoethyl)carbodiimid-metho-p-toluensulfonat eller 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)ca rbodiimid-hydrochlorid.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et højsensitivt immunologisk diag nostisk reagens til konstatering af svangerskab ved hjælp af HCG-bestemmelse og latexagglutination, hvor det humane choriongonadotro-pin (HCG) ved en pH-værdi på 5-8 ved hjælp af et carbodiimid-kob-lingsmiddel bindes til adskilte partikler af en immunologisk inert 10 latexpolymer, som har en partikelstørrelse på 0,01-0,9 ym og en massefylde på 1,01-1,1, kendetegnet ved, at der anvendes HCG i form af dens (5-kæde, som fås ved, at delvis renset HCG indeholdende 2000-5000 ΙΕ/mg HCG behandles i 1/2-2 timer ved en pH-værdi på 4-5,5 og ved 15 en temperatur på 20-50°C med et chaotropisk middel, nemlig med en 7-10 molær vandig opløsning af urinstof, en 7-10 molær vandig opløsning af iithiumbromid, en 4,5-6 molær vandig opløsning af guanidin-hydrochlorid eller en 2-3 molær vandig opløsning af ammoniumthiocy-anat, hvorved der fås adskillelse af α-kæden og (5-kæden, 20 β-kæden isoleres fri for a-kæden ved indstilling af pH-værdien i reaktionsblandingen på 7,5 og adskillelse af blandingen af HCG og chaotropisk middel ved ionbytning og/eller andre sædvanlige metoder, ved hvilken molekyler adskilles på grund af forskelle i den elektrostatiske ladning, uden at β-kæden underkastes yderligere rensning.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at latexen er en carboxyleret styren-butadien-copolymer, og at koblingsmidlet er 1-cyclohexyl-3-(2-mor-pholinoethyi)carbodiimid-metho-p-toluensulfonat eller 1-ethyl-3-(3-di-methylaminopropyl)ca rbodiimid-hydrochlorid.

7. Fremgangsmåde til påvisning af svangerskab ved bestemmelse af tilstedeværelse af choriongonadotropin i legemsvæsker, kendetegnet ved, at en prøve af denne væske blandes med choriongonadotropin-antiserum, hvorefter denne blanding bringes i kontakt med en vandig suspension af det immunologiske diagnostiske 35 reagens ifølge krav 1, og de opnåede resultater iagttages.