JP2565548B2 - カルバモイルオニウム化合物を用いてポリマー粒子に化合物を結合させる方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリマー粒子に結合している化合物を有す
るポリマー粒子の製造方法に関する。具体的には、カル
バモイルオニウム化合物を用いてポリマー粒子に反応性
アミン含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合
物を結合させることによるかかる物質の製造に関する。
この得られる物質は、診断過程で使用することができ
る。

〔従来の技術〕

ポリマー粒子のような不溶性担体物質に結合されてい
る生理活性ポリペプチドまたはタンパクは、多様な方面
で使用されてきている。例えば、人間および動物におけ
る病理学上のまたは他の状態の診断は、人間または動物
の体液中の免疫反応性種、例えば抗体または抗原の検出
のために免疫学上の原理を用いてしばしば実施されてい
る。一般に外来物質として知られている抗原、例えば医
薬、ハプテン、毒素、レクチン、ポリペプチドまたはタ
ンパクは、それらを体内に導入した場合、抗体として知
られている一定の可溶性タンパクの産生を惹起する。

他のタンパクおよびアミン含有化合物、例えば酵素、
アビジン、ビオチンまたは多糖類が、アフィニティー・
クロマトグラフィー、酵素反応、特異的バインディング
反応およびイムノアッセイにおける使用のために種々の
担体物質に共有結合されている。有用な担体物質の中に
は、ヒツジおよびヒトの赤血球、細菌の細胞、ラテック
ス粒子、樹脂の粒子ならびに微細なジアゾ化アミノセル
ロースがある。例えば、乳化剤の不存在下でわずかに水
溶性のモノマー（例えば、エポキシ基含有モノマー）か
ら製造される担体粒子は、当該技術分野で既知である。
他の化合物、例えばジアミン、ジヒドラジド、メルカプ
トアルキルアミンおよびジメルカプタンは、医薬、酵素
または他の反応性種をその後に結合するための結合部分
として担体物質に結合されている。

また、カルボキシル化ラテックス粒子が、例えば米国
特許第4,181,636号明細書に記載されるように、診断試
薬を調製するために使用されている。そこに記載されて
いるところでは、表面カルボキシル基を有する粒子に免
疫反応性種を共有結合させるための手段として、水溶性
カルボジイミドの使用を含む。

〔発明が解決しようとする課題〕

有用な試薬が提供されているとはいえ、前述の既知の
手段は、免疫反応性種の露出した反応性基ならびに担体
表面のカルボキシル基を活性化することに向けられてい
る。その結果、免疫反応性種の分子内および分子間の架
橋または重合が生じ、従って、前記種の主要部分は受容
体分子との複合体化を害される。反応性種、例えば抗体
は一般に非常に高価であるので、この問題は重大な経済
的損失を意味する。また、担体粒子にタンパクを結合す
るためのカルボジイミドの使用は、一定のタンパクレベ
ルでは記載されるほど効率的でないことが明らかにされ
た。

そこで、カルボキシル化したポリマー粒子に反応性ア
ミン含有化合物を効率よく、そして結合する化合物に悪
影響を及ぼすことなく結合するための迅速な方法を手に
することが望まれるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、 A.（１）ポリマー粒子表面にカルボキシル基を有してお
り、かつ少なくとも１つはペンダントカルボキシル基を
含む１以上のエチレン系不飽和重合性モノマーから調製
されるポリマー粒子の水性懸濁液と、（２）カルバモイ
ルオニウム化合物を接触させてペンダント中間体反応性
基を有する反応性中間体ポリマー粒子を製造する工程、
ならびに B.工程Ａで製造される反応性中間体ポリマー粒子と、こ
の粒子の中間体反応性基と反応する反応性アミン基また
はスルフヒドリル基をそれぞれ有する反応性アミン含有
化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を接触さ
せて、前記粒子と前記反応性化合物との共有結合を形成
する工程、 を含んでなるペンダントカルボキシル基を介してポリマ
ー粒子に反応性アミン含有化合物または反応性スルフヒ
ドリル含有化合物を結合させる方法であって、 前記カルバモイルオニウム化合物が、次式 ｛上式中、 Ｚは、置換されているかもしくは置換されていない５
−もしくは６−員の複素環式芳香環を完成するために必
要な原子を表し、 ｍおよびｎは、独立して０または１であり、 R¹およびR²は、相互に独立して、置換されているかも
しくは置換されていないアルキル、置換されているかも
しくは置換されていないアリール、または置換されてい
るかもしくは置換されていないアラルキルであるか、ま
たはR¹およびR²は一緒になって、置換されているかもし
くは置換されていないピペリジン環、ピペラジン環また
はモルホリン環を完成するのに必要な原子を表し、 R³は、水素原子、置換されているかもしくは置換され
ていないアルキルであるか、または （上式中、Ａは、ホモポリマーまたはコポリマーの分子
量が1000以上であるような１以上のエチレン系不飽和重
合性化合物から形成されるホモポリマーまたはコポリマ
ーの重合ビニル主鎖を表す） で示される基であり、 R⁴は、水素原子、置換されているかもしくは置換され
ていないアルキルであるか、またはＺがピリジニウム環
を完成するのに必要な原子を表し、かつｎが０である場
合には、R⁴は、次の基 （ａ）−NR⁶−CO−R⁷（基中、R⁶は、水素または置換さ
れているかもしくは置換されていないアルキルであり、
R⁷は、水素または置換されているかもしくは置換されて
いないアルキルであるか、または−NR⁸R⁹〔基中、R⁸お
よびR⁹は、独立して水素または置換されているかもしく
は置換されていないアルキルである〕である）、 （ｂ）−（CH₂）_ｑ−NR¹⁰R¹¹（基中、R¹⁰は、−CO−R¹²
であり、R¹¹は、水素または置換されているかもしくは
置換されていないアルキルであり、R¹²は、水素、置換
されているかもしくは置換されていないアルキル、また
は−NR¹³R¹⁴〔基中、R¹³は、置換されているかもしくは
置換されていないアルキル、または置換されているかも
しくは置換されていないアリールであり、R¹⁴は、水
素、置換されているかもしくは置換されていないアルキ
ル、または置換されているかもしくは置換されていない
アリールである〕であり、そしてｑは、１〜３であ
る）、 （ｃ）−（CH₂）_ｒ−CONR¹⁵R¹⁶（基中、R¹⁵は、水素、
置換されているかもしくは置換されていないアルキル、
または置換されているかもしくは置換されていないアリ
ールであり、R¹⁶は、水素または置換されているかもし
くは置換されていないアルキルであるか、またはR¹⁵とR
¹⁶は一緒になって、５−または６員の脂肪環を完成する
のに必要な原子を表し、そしてｒは、０〜３である）、 （基中、R¹⁷は、水素、置換されているかもしくは置換
されていないアルキルであり、Ｙは、オキシまたは−NR
¹⁹−であり、R¹⁸は、水素、置換されているかもしくは
置換されていないアルキル、−CO−R²⁰または−CO−NHR
²¹〔基中、R¹⁹、R²⁰およびR²¹は、独立して水素または
置換されているかもしくは置換されていないアルキルで
ある〕であり、そしてｔは、２または３である）、なら
びに （ｅ）−R²¹X′ （基中、R²¹は、置換されているかも
しくは置換されていないアルキレンであり、そしてＸ′
は、ピリジニウム環と分子内塩を形成するような共有
結合の陰イオン性の基である）、 から選ばれ、 R⁵は、置換されているかもしくは置換されていないア
ルキル、置換されているかもしくは置換されていないア
リール、または置換されているかもしくは置換されてい
ないアラルキルであるが、但し、R⁵が結合している窒素
原子が二重結合を介して環の残りの部分と結合している
場合には、ｍが０であり、 Ｘは、陰イオンであり、そして ｖは、０または１であるが、但し、R⁴が−R²¹X′ で
ある場合には、ｖは０だけを示す｝ で示されることを特徴とする方法により解決される。

〔実施態様〕

本発明の方法に従って製造される物質は、多様な化学
的および生物学的過程で使用することができる。例え
ば、アフィニティー・クロマトグラフィー、酵素により
促進される反応、水の精製、被分析物が結合したポリペ
プチドまたはタンパクに対して特異的なバインディング
親和性を有する免疫反応性種である場合のイムノアッセ
イ、および当業者に既知の他の方法に使用することがで
きる。ある場合には、本発明を、使用してさらに生物学
上興味深い化合物、例えば医薬、ホルモン、酵素、抗体
もしくは他のタンパクまたは多糖類と反応し得る中間体
的な結合性部分を結合することができる。

本発明により製造される物質の用途の１つは、被分析
物または検出される物質が、免疫学上の相対物（または
レセプター）として入手できるか、または提供され得る
生理学上の流体、ヒトまたは動物の細胞または組織抽出
物中に見い出される免疫反応性種である場合の凝集アッ
セイにおける凝集性免疫化学試薬にある。該試薬を使用
して検出することができる代表的な免疫反応性種は、限
定されるものでないが、微生物（バクテリア、プロトゾ
ア、カビ、ウイルスおよびリケッチア）、臓器特異性抗
原を含む組織抗原、ホルモン、酵素、血液細胞抗原もし
くは血液中に見い出される他の物質、血漿タンパク、乳
タンパク、唾液タンパク、尿タンパク、病理学上のタン
パク、自己抗体を含む抗体および医薬を包含する。かか
る態様では、本発明の方法において使用される反応性ア
ミン含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物
は、興味の対象である被分析物のレセプター、例えば抗
原または抗体であるような免疫学上の化合物である。

他の態様では、本明細書に記載される物質は、前記粒
子に結合されている酵素を有することができる。この態
様で結合され得る酵素は、酵素活性を損なうことなく粒
子上の活性ペンダント基と本発明に従って反応し得る反
応性アミン基または反応性スルフヒドリル基を有するも
のを包含する。

さらに他の態様では、本発明により製造される物質
は、溶液形式かまたは乾燥形式（すなわち、乾式分析要
素）のいずれかの競合的バインディングアッセイにおい
て、あるいはイムノメトリックアッセイ、例えば「サン
ドイッチ」アッセイとして当業者に知られている方法に
使用することができる。

本発明の方法は、カルバモイルオニウム化合物を用い
て、反応性カルボキシル基を有するポリマー粒子に、反
応性アミン基または反応性スルフヒドリル基をそれぞれ
有する反応性アミン含有化合物または反応性スルフヒド
リル含有化合物を結合させることを含む２段階工程であ
る。

一般に、本発明の方法に有用なポリマー粒子は、粒子
サイズが0.01〜５μｍ、好ましくは0.1〜３μｍの水不
溶性ラテックス粒子である。それらは、全体が同一のポ
リマーから構成されることを意味する均一ポリマー粒子
であるか、または１以上のポリマーから構成される、例
えば米国特許第3,700,609号明細書に記載されるような
グラフト・コポリマーおよび例えば米国特許第4,401,76
5号明細書に記載されるようなコアー・シェル（core−s
hell）ポリマーであることができる。なお、ポリマー粒
子は、反応性アミン含有化合物または反応性スルフヒド
リル含有化合物の結合に利用し得る表面カルボキシル基
を有することが必須である。このような基は、ポリマー
中にかかる基を含むモノマー（例えば、アクリル酸、メ
タクリル酸およびイタコン酸等）を取り込ませるか、ま
たはカルボキシル基に転化し得る他の反応性基を有する
ポリマーのさらなる化学反応（例えば、マレイン酸無水
物のような無水物の加水分解もしくは表面メチロールも
しくは末端アルデヒド基の酸化）により該粒子に付加す
ることができる。

ポリマー粒子は、乳化重合法（回分式、半連続式およ
び連続式を含む）、懸濁重合法、グラフト共重合法、な
らびに高分子化学の技術分野における当業者に既知の他
の方法を含む、いずれかの適当な重合法を用いて製造す
ることができる。乳化重合を使用すれば、例えば米国特
許第4,415,700号明細書（前記）およびResearch Disclo
sure publication15963（1977年７月）に記載されてい
るように界面活性剤または乳化剤の使用をすることな
く、一般に小さな粒子を提供することができるのでそれ
が好ましい。前記のResearch Disclosure publication
に記載されているような連続乳化重合が最も好ましい方
法である。

有用なカルボキシル化粒子は、カルボキシル化スチレ
ンおよびその誘導体（カルボキシル化スチレン−ブタジ
エンのコポリマー）、アクリル酸ポリマーおよびメタク
リル酸ポリマーならびに他の物質から製造され、その多
くは商業的に入手可能である。

好ましくは、ポリマー粒子は、次の構造式 Ａ_ｘＢ_100-x （上式中、Ａは、カルボン酸基またはその基の塩もしく
は前駆体を含有する１以上のエチレン系不飽和重合性モ
ノマーに由来する反復単位を表し、そしてＢは、１以上
のエチレン系不飽和重合性モノマーに由来する反復単位
を表す）で示されるポリマーから成る。

Ａを誘導することができるモノマーは、限定されるも
のでないが、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、
アコニット酸、フマル酸、マレイン酸、アクリル酸β−
カルボキシエチル、メタクリル酸β−カルボキシエチ
ル、ｍ−およびｐ−カルボキシメチルスチレン、メタク
リルアミドヘキサン酸ならびにＮ−（２−カルボキシ−
1,1−ジメチルエチル）アクリルアミドあるいはそれら
の塩または無水前駆体を包含する。本発明の実施におい
ては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アコニ
ット酸、フマル酸、マレイン酸、アクリル酸β−カルボ
キシエチル、メタクリル酸β−カルボキシエチルあるい
はそれらの塩または無水前駆体が好ましい。Ｂを誘導す
ることができるモノマーは、限定されるものではない
が、スチレンおよびスチレン誘導体（例えば、ビニルト
ルエン、４−ｔ−ブチルスチレン、ジビニルベンゼンお
よび２−クロロメチルスチレン）、アクリル酸およびメ
タクリル酸エステル（例えば、アクリル酸メチル、メタ
クリル酸エチル、アクリル酸酸ｎ−ブチル、メタクリル
酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸メチル、メタクリ
ル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリルアミド、ジメタ
クリル酸エチレンおよびアクリル酸２−ヒドロキシエチ
ル）、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸ナトリウム、３−アクリロイルオキシプロパンスル
ホン酸ナトリウム、ｐ−スチレンスルホン酸塩、または
アクリロニトリルを包含する。好ましくは、Ｂは、スチ
レンまたはスチレン誘導体あるいはアクリル酸またはメ
タクリル酸エステルに由来するものである。

ＡおよびＢモノマーとも、使用される特定のモノマー
およびそれらの割合は、粒子に水不溶性を付与するよう
に選ぶことが重要である。前記に示した構造において、
Ｘは0.1〜70、そして好ましくは１〜20のモルパーセン
トである。

ポリマー粒子を構成する代表的なポリマーは、コポリ
（スチレン−塩化ビニルベンジル−アクリル酸）（モル
比、85:10:5）、コポリ（スチレン−アクリル酸）（モ
ル比、99:1）、コポリ（スチレン−メタクリル酸）（モ
ル比、90:10）、コポリ（スチレン−アクリル酸−ｍ−
およびｐ−ジビニルベンゼン）（モル比、89:10:1）、
コポリ（スチレン−アクリル酸２−カルボキシエチル）
（モル比、90:10）およびコポリ（メタクリル酸メチル
−アクリル酸）（モル比、70:30）を包含する。

ある態様では、前記粒子は、コアー（core）が第１の
ポリマーから成り、シェル（shell）が第２のポリマー
から成るコアー・シェル粒子である。第２のポリマー
は、反応性カルボキシル基か、またはポリペプチドもし
くはタンパクの結合に先立ってカルボキシル基に転化す
ることができる基を有していなければならない。コアー
・シェルポリマー粒子の代表例は、以下の例２に示され
る。

本発明の実施においては、ポリマー粒子に反応性アミ
ン含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を
共有結合するためにカルバモイルオニウム塩が使用され
る。これらの塩は、米国特許第4,421,847号明細書にい
くつか記載されており、一般には、次式（Ｉ） の構造で示される。

なお、式（Ｉ）において、Ｚは、融合炭素環式環を有
する複素環を含む置換されているかもしくは置換されて
いない５−もしくは６−員の複素環式芳香環（例えば、
ピリジニウム、イミダゾリウム、チアゾリウム、イソキ
サゾリウムまたはキノリニウム環）を完成するために必
要な原子を表す。好ましくは、Ｚは、置換されている６
員の複素環式芳香環を完成するのに必要な原子を表す。

さらに、ｍおよびｎは、独立して０または１であり、 R¹およびR²は、相互に独立して、置換されているかま
たは置換されていないアルキル（一般に、１〜６の炭素
原子、例えばメチル、エチル、イソプロピルまたはクロ
ロメチル）あるいは置換されているかまたは置換されて
いないアリール（一般に、６〜10の炭素原子、例えばフ
ェニル、ｐ−メチルフェニル、ｍ−クロロフェニルまた
はナフチル）、あるいは置換されているかまたは置換さ
れていないアラルキル（一般に、７〜12の炭素原子、例
えばアリール基において同様に置換されていてもよいベ
ンジルまたはフェネチル）である。

他方、R¹およびR²は一緒になって、ピペリジン環、ピ
ペラジンまたはモルホリン環を完成するのに必要な原子
を表し、そしてこれらの環は、それぞれ１〜３の炭素原
子を有する１以上のアルキル基またはハロゲン原子によ
り置換されていてもよい。

R₃は、水素原子、前記R¹について定義したような置換
されているかまたは置換されていないアルキルである
か、あるいは式 （式中、Ａは、ホモポリマーまたはコポリマーの分子量
が1000以上であるような１以上のエチレン系不飽和重合
性化合物から形成されるホモポリマーまたはコポリマー
の重合ビニル主鎖を表す）で示される基である。有用な
エチレン系不飽和重合性化合物は、高分子化学の技術分
野の当業者に既知である。ポリマー〔Ａ〕は、式（Ｉ）
により示される化合物に由来する追加の部分を含んでい
てもよい。

R⁴は、水素原子、置換されているかまたは置換されて
いないアルキル（R¹について前記に定義されるような）
であるか、あるいはＺがピリジニウム環を完成するのに
必要な原子を表し、かつｎが０である場合には、R⁴は、
次の（ａ）〜（ｅ）の基から選ばれる。

（ａ）−NR⁶−CO−R⁷〔基中、R⁶は、水素または置換さ
れているかもしくは置換されていないアルキル（一般
に、１〜４の炭素原子、例えばメチル、エチル、ｎ−ブ
チル、クロロメチル）であり、R⁷は、水素、置換されて
いるかもしくは置換されていないアルキル（R⁶について
前記に定義されるような）であるか、あるいは−NR⁸R⁹
（基中、R⁸およびR⁹は、相互に独立して水素または置換
されているかもしくは置換されていない、R⁶について前
記に定義されるようなアルキル基である）である〕、 （ｂ）−（CH₂）_ｑ−NR¹⁰R¹¹〔基中、R¹⁰は、−CO−R¹²
であり、R¹¹は、水素または置換されているかもしくは
置換されていないアルキル（R⁶について前記に定義され
るような）であり、R¹²は水素、置換されているかもし
くは置換されていないアルキル（R⁶について前記に定義
されるような）または−NR¹³R¹⁴（基中、R¹³は、R⁶につ
いて前記に定義されるような置換されているかもしくは
置換されていないアルキルまたはR¹について前記に定義
されるような置換されているかもしくは置換されていな
いアリールであり、R¹⁴は水素、R⁶について前記に定義
されるような置換されているか置換されていないアルキ
ルまたはR¹について定義されるような置換されているか
もしくは置換されていないアリールである）であり、そ
してｑは１〜３である〕、 （ｃ）−（CH₂）_ｒ−CONR¹⁵R¹⁶〔基中、R¹⁵は、水素、
置換されているかもしくは置換されていないアルキル
（R⁶について前記に定義されるような）または置換され
ているかもしくは置換されていないアリール（R¹につい
て前記に定義されるような）であり、R¹⁶は、水素また
は置換されているかもしくは置換されていないアルキル
（R⁶について前記に定義されるような）であり、あるい
はR¹⁵とR¹⁶は一緒になって、５−または６員の脂肪環を
完成するのに必要な原子を表し、そしてｒは０〜３であ
る〕、 〔基中、R¹⁷は、水素、置換されているかもしくは置換
されていないアルキル（R⁶について前記に定義されるよ
うな）であり、Ｙは、オキシまたは−NR¹⁹−であり、R
¹⁸は水素、置換されているかもしくは置換されていない
アルキル（R⁶について前記に定義されるような）、−CO
−R²⁰または−CO−NHR²¹（基中、R¹⁹、R²⁰およびR
²¹は、相互に独立して水素またはR⁶について前記に定義
されるような置換されているかもしくは置換されていな
いアルキルである）であり、そしてｔは２または３で
あ〕、ならびに （ｅ）−R²¹X′ 〔基中、R²¹は、１〜６の炭素原子の
置換されているかもしくは置換されていないアルキレン
（例えば、メチレン、トリエチレンまたはイソプロピレ
ン）であり、そしてＸ′ は、共有結合性の陰イオン性
の基、例えばピリジニウム核と分子内塩を形成するよう
なスルホネートまたはカルボキシレートである〕。

R⁵は、置換されているかもしくは置換されていないア
ルキル（R⁶について前記に定義されるような）、置換さ
れているかもしは置換されていないアリール（R¹につい
て前記に定義されるような）、または置換されているか
もしくは置換されていないアラルキル（R¹について前記
に定義されるような）であり、R⁵が結合している窒素原
子が二重結合を介して環の残りの部分と結合している場
合には、ｍが０であることを示す。

Ｘは、陰イオン、例えばハライド、テトラフルオロボ
ーレート、ニトレート、スルフェート、ｐ−トルエンス
ルホネート、ペルクロレート、メトスルフェートまたは
ヒドロキシドイオンであり、そしてｖは、０または１で
あり、R⁴が−R²¹X¹ である場合にはｖは０だけを示
す。

本発明の実施に際して使用されるカルバモイルオニウ
ム化合物は、好ましくは、前記式（Ｉ）のR¹およびR²が
一緒になってモルホリン環を完成するのに必要な原子を
表し、Ｚがピリジニウム環を完成するのに必要な原子を
表し、R⁴が−R²¹X¹ （例えば、−CH₂CH₂SO₃ ^-）であ
り、そしてm,nおよびｖがそれぞれ０を表すものであ
る。

代表的なカルバモイルオニウム化合物は、１−（４−
モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチル）−
ピリジニウムヒドロキシド、分子内塩、および１−（４
−モルホリノカルボニル）ピリジニウムクロリドを包含
する。

最も好ましくは、１−（４−モルホリノカルボニル）
−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロキシ
ド、分子内塩である。

すべての反応性アミン含有化合物または反応性スルフ
ヒドリル含有化合物は、ポリマー粒子上のカルボキシル
基とカルバモイルオニウム化合物の反応によって形成さ
れる中間体と反応し得る、反応性アミン基または反応性
スルフヒドリル基をそれぞれ含む化合物である限り、本
発明に従うポリマー粒子に結合することができる。かか
る化合物は、限定されるものでないが、モノアミン、モ
ノヒドラジド、ジアミン、ジヒドラジド、酵素、ビオチ
ンもしくはそれらの誘導体、アビジンもしくはそれらの
誘導体、アミン酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパ
ク、多糖類、および当業者に明白であるはずの他の化合
物を包含する。特定の態様によれば、反応性アミン含有
化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物は、生理
活性を有するポリペプチドまたはタンパクである。「生
理活性」とは、生理学上の流体中に見い出される可能性
がある他の成分との相互作用に対するその能力をいう。
かかる相互作用は、物質が酵素である場合には、触媒活
性であることができる。さらに、相互作用は、相互に親
和性を有する物質、例えばビオチンとアジピンまたは抗
原と抗体等との間で生じる複合体形成性であることがで
きる。他の態様では、反応性アミン含有化合物または反
応性スルフヒドリル含有化合物は、ポリマー粒子に第２
の化合物を結合するための結合性部分であり得る、ジア
ミン、多糖類、アミン酸、ペプチドまたはタンパクであ
る。第２の化合物は、限定されるものでないが、酵素、
抗体、抗原、医薬、ビオチンまたはそれらの誘導体およ
び当業者に極めて明白な他のものを包含する。

好ましくは、免疫反応性種である反応性アミン含有化
合物または反応性スルフヒドリル化合物は、限定される
ものでないが、前記に列挙した生物学上の化合物および
化学化合物を包含する。より好ましくは、それは、抗
体、例えば医薬、ホルモン、ストレプトコッカス（Stre
ptococcus）Ａ抗原、クラミジア（Chlamydia）抗原、ゴ
ノコッカ（Gonococca）抗原、ヒトの繊毛性性腺刺激ホ
ルモン、ヒトの黄体形成ホルモンまたはヘルペスウイル
スに対して向けられる抗体である。他方、免疫反応性種
は、HTLV−ＩまたはHIV−Ｉの抗原のような抗原である
ことができる。

一定の態様では、本発明の方法により製造される物質
は、それらに取り込まれているトレーサーを有すること
ができる。トレーサーは、試薬の検出を可能にする検出
可能な種である。有用なトレーサーとしては、放射性同
位体、発色化合物、蛍光化合物、酵素、化学発光化合
物、燐光化合物および当業者に既知の他の物質が挙げら
れる。トレーサーは、いずれかの適当な方法で試薬に取
り込ませることができる。例えば、トレーサーは、生理
活性ポリペプチドまたはタンパクに、例えば共有結合的
にか、またはイオン結合的に取り込ませることができ
る。他方、好ましくは、トレーサーはポリマー粒子に、
例えば外面かまたはその容積の一部分かもしくは全体に
分布する内部か、あるいは両方に結合（共有結合的にか
または吸収的に）されて、ポリマー粒子に取り込まれ
る。

ある態様では、トレーサーは、ポリマー粒子の全体か
またはその表面のいずれかに、発色成分としてかまたは
カラーカプラー成分としてポリマー粒子中に分布され
る。発色成分は、ポリマー粒子が構成されるポリマーの
主鎖に結合される。カラーカプラー成分は、発色現像化
合物（color developing compound）と酸化的にカップ
リングして、染料を提供することができる。これらの成
分もまた、ポリマー主鎖に結合され、そしてモノマーに
結合されている該成分を有するエチレン系不飽和重合性
モノマーの反応により付与される。

かかるモノマーの例は、ヨーロッパ特許出願公開第22
7,173号公報に記載されている。特に有用なモノマー
は、次式 CH₂＝CR−CONH−COUP （上式中、Ｒは水素、ハロゲンまたは低級アルキルであ
り、そしてCOUPは、カラーカプラー成分であり、その多
くは当該技術分野で既知である）で示される。２つの代
表的モノマーとしては、 が挙げられる。

かかるモノマーから製造されるポリマーは、コポリ
〔スチレン−アクリル酸ブチル−Ｎ−（3,5−ジクロロ
−４−エチル−２−ヒドロキシフェニル）アクリルアミ
ド−メタクリル酸〕（重量比、50:20:20:10）、コポリ
〔アクリル酸ブチル−Ｎ−（3,5−ジクロロ−４−エチ
ル−２−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド−クロロ
メチルスチレン−メタクリル酸〕（重量比、20:20:40:2
0）およびコポリ｛アクリル酸ブチル−Ｎ−〔１−（2,
4,6−トリクロロフェニル）−1,2,4−トリアゾリン−５
−オン−２−イル〕アクリルアミド−クロロメチルスチ
レン−メタクリル酸｝（重量比、20:20:40:20）を包含
する。

本発明の方法は、２工程で実施され、その第１工程
は、前記のカルバモイルオニウム化合物と前記のポリマ
ー粒子の水性懸濁液を接触させてカルボキシル基の代わ
りに中間体反応性基を有する反応性中間体ポリマー粒子
を製造することを包含する。この工程は、所望のpHを与
えるために適当な酸または緩衝剤を用いて適当なpHを実
施される。一般に、pHは６未満であるが、反応が進行す
る限り臨界的でない。より好ましくは、pHは3.5と６の
間である。ポリマー粒子表面のカルボキシル基に対する
カルバモイルオニウム化合物のモル比は、1:100〜10:1
であり、好ましくは1:10〜2:1である。

本発明の方法の第２工程では、第１工程で形成された
反応性中間体が、該反応性中間体の中間体反応性基と反
応し得る、それぞれ反応性アミン基または反応性スルフ
ヒドリル基を有する反応性アミン含有化合物または反応
性スルフヒドリル含有化合物と接触される。これによ
り、ポリマー粒子と反応性化合物とが共有結合を形成す
る。ポリマー粒子に対する反応性化合物の重量比は、一
般に1:100〜1:1であり、好ましくは1:100〜1:10であ
る。この第２工程は、早期の凝集を伴うことなく所期の
反応が生じるように、適当なpHにて実施することができ
る。pH値は、含まれる反応体および反応媒体中のそれら
の濃度に応じて多様であることができる。殆どのタンパ
クおよびポリペプチドに対しては、このpHは６より大き
いであろう。

本発明の方法は、一般に10〜60℃、好ましくは15〜30
℃の温度で実施される。２つの工程の方法のための温度
は同一であるか、または相違するものであってもよい。

本発明の方法に関するさらに詳細な事項は、次の代表
例から当業者にとって容易に明瞭となるであろう。

例1:コポリ（スチレン−塩化ビニルベンジル−アクリル
酸）粒子へのタンパクの結合 蒸留水45.71g中、カルバモイルオニウム化合物１−
（４−モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチ
ル）ピリジニウムヒドロキシド（分子内塩）5.29g（0.0
0932モル）の溶液を、50mlのコポリ（スチレン−塩化ビ
ニルベンジル−アクリル酸）（モル比、85:10:5）粒子
（平均サイズ、約0.66μｍ）の４％懸濁液（pH3.6）に
添加した。得られた混合物は、約pH5.0であった。

ポリマー100mg（乾燥重量）を含有する前記活性化ラ
テックスの一部を、室温（約22℃）下で１時間インキュ
ベーションし、そして同量の第２試料を３時間インキュ
ベーションした。それぞれを、標識化（トリチウム化）
ウシγ−グロブリン（³H BGG）5mgで処理し、次いで50m
lの遠心管中で0.1モルのリン酸カリウム（pH7.0）を用
いて、最終容量を30mlにした。反応物を、45゜の角度に
固定されている回転盤に設置すると同時に、30〜35rpm
の回転数で回転させながら室温下に５時間維持した。

対照混合物（対照１）は、カルバモイルオニウム化合
物による活性化を行わなかったことを除き、コポリ（ス
チレン−塩化ビニルベンジル−アクリル酸）（モル比、
85:10:5）粒子の同量のバッチを前記と全く同様にイン
キュベーションすることにより調製し、非特異的バイン
ディング（吸着）について試験した。該ポリマーの活性
クロロメチル基とタンパクにおけるアミノ基の選択的な
反応を介するポリマー粒子へのウシγ−グロブリンタン
パクの共有結合は、低温ではたとえあるとしても少ない
ことが事前の実験からわかっていた。この後者の反応
は、効率を高めるためには加熱および反応時間を延ばす
ことが必要である。

第２の対照混合物（対照２）は、カルバモイルオニウ
ム化合物で活性化していないラテックス100mg（乾燥重
量）を37℃で24時間前記のような回転数で回転しながら
0.1モルのホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）30ml中でト
リチウム化したウシγ−グロブリン5mgと一緒に処理す
ることにより調製した。

前述したインキュベーション時間の終わりに、過剰の
ウシ血清アルブミン（100mg、20mg/ml適当な緩衝液中）
を添加して反応を停止した。該アルブミンを添加した後
さらに試料を４〜18時間インキュベーションした。

ポリマー粒子へ結合したタンパクの総量は、（ａ）反
応混合物の既知小量1ml中の総cpm（１分当たりのカウン
ト）を測定し、（ｂ）反応混合物の試料1mlを遠心した
後の上澄に残存するcpmを測定し、次いで（ｃ）（ｂ）
で得られたペレットの繰り返し洗浄後のラテックス試薬
のcpmを測定することにより定量した。ポリマー粒子に
共有結合したタンパク画分は、界面活性剤１％のドデシ
ル硫酸ナトリウムの存在下、37℃で24時間回転させなが
らインキュベーションした後に測定した。結合タンパク
の総量の測定に対する前記と同じ方法を用いて共有結合
したタンパク量を定量した。結果を次の第Ｉ表および第
II表に示す。

この試験は、周囲反応条件下で、対照１および２の他
の反応様式に比し、短い反応時間で、かつより優れたバ
インディング効率でカルボキシル化粒子にウシγ−グロ
ブリンを共有結合することができることを示す。

例2:試薬の調製および使用 ２種のモノクローナル抗テオフィリン抗体を、例１で
使用したカルバモイルオニウム化合物で活性化したカル
ボキシル化ポリマー粒子および官能基クロロメチルスチ
レンを含有する粒子の双方と反応させた。使用した抗体
は、（１）Kallested Laboratories,Inc.（Catalog No.
046,Lot No.WO729,Fill No.WO854,clone number9−49−
7A,A8）により販売されているテオフィリンに対するモ
ノクローナル抗体、および（２）テオフィリン−ウシ血
清アルブミンで免疫した雌のBalb/Cマウスに由来する脾
リンパ球と骨髄腫細胞SP2/0−Ag14の融合により調製さ
れるテオフィリンに対して特異的なモノクローナ抗体で
あり、そしてこのものは、室温におけるリン酸緩衝溶液
中で約５×10⁷M^-1のKaを有するカッパイソタイプ、γ₂b
である。ポリマー粒子に結合する抗体の量は、³Hウシγ
−グロブリンを抗テオフィリン抗体で置換するパラレル
な試験により測定した。粒子に結合した活性な抗体の量
は、次に記載する酵素標識バインディング試験において
比較した。

ポリマー500mg（乾燥重量）および脱イオン水10mlに
溶解したカルバモイルオニウム化合物250mgを含有する
ラテックスを50mlの蒸留水にpH5で懸濁させることによ
り、カルボキシル化ラテックス・コポリ（スチレン−ア
クリル酸）（モル比、99:1）粒子を、カルバモイルオニ
ウム化合物で活性化した。ラテックスを室温で30分間撹
拌し、次いで遠心した。上澄を廃棄し、そしてラテック
スを約10mlの蒸留水に再懸濁した。得られた試薬の分別
した試料（乾燥重量で100mgのポリマー）を、緩衝液
（0.05モル濃度のリン酸カリウム、pH7.0）30ml中の前
記２つのタイプの抗体の１の試料3.16mgとそれぞれ混合
した。反応物を、約24時間室温下で回転させながらイン
キュベーションした。反応を、ウシ血清アルブミン（10
0mg、20mg/ml）の添加により停止し、次いで約４時間イ
ンキュベーションを続けた。反応物を遠心し、上澄を廃
棄し、そして非イオン界面活性剤TRITON X−100〔ロー
ム・アンド・ハース社（Rohm and Haas,Co）により販売
されているオクチルフェノキシ・ポリエトキシ・エタノ
ール〕の１％を含有するリン酸緩衝溶液（pH7.4）30ml
にラテックスを再懸濁した。インキュベーションを37℃
で約18時間継続した。その後、ラテックスを遠心し、上
澄を廃棄し、そして得られたペレットをリン酸緩衝溶液
で２度洗浄した後、その溶液で再懸濁した。

クロロメチルスチレン誘導ラテックス〔コポリ（スチ
レン−ジビニルベンゼン）（モル比、99.2:0.8）のコア
ーおよびコポリ（塩化ビニルベンジル−ジビニルベンゼ
ン）（モル比、98.8:1.2）を有するコアー・シェル・コ
ポリマー〕の２つの試料を、pH8.5における0.1モル濃度
のホウ酸ナトリウム緩衝液30ml中の前記抗体の１方の試
料3.16mgとインキュベーションした。始めのインキュベ
ーションを室温よりむしろ37℃で実施する以外は、カル
ボキシル化ラテックスに対する前記したものと同様に反
応物を処理した。

各ラテックス調製物に結合した抗体の量は、平行して
実施した試料が有するコポリ（スチレン−ジビニルベン
ゼン）のコアーおよびコポリ（塩化ビニルベンジル−ジ
ビニルベンゼン）のシェルを有するコアー・シェル粒
子、ならびに前記に示したのとまったく同様に処理し、
そして同じ量のコポリ（スチレン−アクリル酸）の粒子
に結合した³Hウシγ−グロブリンについてのカウント数
をアッセイすることにより定量した。各調製物における
活性な抗体の相対量は、ラテックスの連続的な希釈物
（結合した抗体の質量に基づく理論的なテオフィリンの
バインディング部位の3.16×10^-10モル濃度〜１×10^-6
モル濃度）を、固定した濃度のテオフィリン−グルコー
スオキシダーゼ標識（５×10^-10モル濃度）と混合すア
ッセイにより定量した。遠心後溶液に残存するテオフィ
リン−グルコースオキシダーゼ標識の量を測定し、そし
て該酵素標識の50％を結合するに要求されるテオフィリ
ンバインディング部位の濃度を決定した。結果を以下に
まとめた。

この試験は、本発明による周囲反応条件を用いるカル
ボキシル化粒子に、高い温度で活性ハロゲン基を介して
粒子に結合することができるものとほぼ同等に抗体が結
合し得ることを示す。さらに活性ハロゲン基を介してポ
リマー粒子に抗体が直接結合する他のプロトコールによ
り示されるものと同様な抗体活性の保存度を有してお
り、活性化カルボキシル化粒子に抗体が結合し得ること
を示す。いくつかの事前の試験では、本明細書に記載し
た方法により活性ハロゲン粒子に結合される抗体の質量
の50％以上が滴定したテオフィリンに対して残存するこ
とを示した。従って、同じことが活性化カルボキシル粒
子に結合する抗体について観察されるであろうと予測さ
れる。

例3:カルボジイミド結合との比較 この例は、既知のカルボジイミドの化学的性質を用い
て粒子にタンパクを結合させる方法と本発明の方法を比
較し、そしてまたフェノバルビタールのアッセイにおい
て得られる試薬の使用を比較する。

フェノバルビタールに対するモノクローナル抗体は、
フェノバルビタール−ヒト血清アルブミンの抱合体を用
いるBalb/Cマウスの免疫によりイーストマン・コダック
社（Eastman Kodack Co）で調製された。免疫マウスの
脾を骨髄腫（SP2/0−Ag14）細胞と融合させてハイブリ
ドーマを生成した。この調製方法は、既知の方法を用い
た。

かくして調製した抗体を、外表面上のペンダントカル
ボキシル基を有するポリマー粒子に共有結合させた。こ
の粒子は、コポリ（スチレン−メタクリル酸）（モル
比、90:10）から成っている。粒子へ結合した抗体の質
量は、抗フェノバルビタール抗体に代えトリチウム化し
たウシγ−グロブリンを用いるパラレルな試験で定量し
た。粒子に結合した活性タンパク量を、前記例２に記載
したような酵素標識バインディング試験で比較した。

前記のポリマー粒子の１の試料（乾燥重量30mg）は、
0.1モル濃度の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸緩衝液（pH6）10ml中の１−（４−モルホリノカルボ
ニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロ
キシド（分子内塩）（16mg、1.5mmol e/g粒子）と10分
間混合し、次いで抗フェノバルビタール抗体（0.3mg）
を添加した。該ポリマーラテックスの第２の試料は、同
じ分子内塩と混合し、次いで抗フェノバルビタール抗体
1.5mgを添加した。

同一のラテックスの第３の試料は、１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メ
ト−ｐ−トルエンスルホネート（19.1mg、1.5mmol e/g
粒子）と10分間混合し、次いで抗フェノバルビタール抗
体0.3mgを添加した。

該ラテックス粒子の第４の試料は、前記カルボジイミ
ドと混合し、次いで抗体1.5mgを添加した。これらの試
料を、第III表および第IV表において対照１および対照
２と称した。

結合反応は、室温下で回転させながら24時間それらの
混合物をインキュベーションすることにより実施した。
反応は、ウシ血清アルブミン（30mg、30mg/ml）を添加
することにより停止し、その後４時間さらにインキュベ
ーションを続けた。反応混合物を遠心し、上澄を廃棄
し、そしてペレットをリン酸緩衝溶液（pH7.4）で１度
洗浄し、次いでその溶液で再懸濁した。

各ラテックス調製物に結合した抗体の質量は、例１に
記載したように、パラレルに実施した試料が有している
粒子に結合したトリチウム化ウシγ−グロブリンについ
ての放射性のカウント数をアッセイすることにより定量
した。共有結合量／総量の割合は、例１に記載したよう
に界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウムでインキュベーシ
ョンした後に計算した。質量バインディング試験の結果
を、以下の第III表および第IV表にまとめた。

各調製物における活性抗体の相対量は、例２に記載し
たものと同様な酵素標識バインディング試験で定量し
た。この例は、抗フェノバルビタール抗体が非常に高い
効率でカルバモイルオニウム化合物を使用しているポリ
マー粒子に共有結合し得ることを示している。またさら
に、その抗体は、有用な免疫学上の試薬の成形品に結合
できることを示す。抗体／ポリマー粒子の比率が低いと
ころでは、標識化抗原の50％を結合するために、対照の
試薬に対するよりも４部低い濃度の本発明の固定化抗体
試薬が必要であった（0.3mgのタンパクが添加された場
合、対照の86nmolの理論的なフェノバルビタールバイン
ディング部位が、本発明の19nmolに対応する）。このこ
とは、先行技術のカルボジイミドの化学的作用よりも本
発明の方法についての抗体活性の残率が４倍以上である
ことを示唆する。

例4:ポリマー粒子へのジアミンの結合 この例は、カルバモイルオニウム化合物を用いるカル
ボキシル化ポリマー粒子へのジアミンの結合により本発
明の実施について説明するものである。本発明のこの特
徴の重要性は、アミン含有モノマーの既知の重合方法を
用いて外表面に反応性アミン成分を有する粒子を製造す
ることが困難であるとの事実にある。

脱イオン化蒸留水（100ml）に懸濁したコポリ（スチ
レン−アクリル酸）（モル比、90:10）の１部（乾燥重
量3g）を、脱イオン化蒸留水に溶解した１−（４−モル
ホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジ
ニウムヒドロキシド（分子内塩）を合わせ、脱イオン化
蒸留水で容量を300mlにした。反応混合物を室温で30分
間撹拌し、その後10℃、6000rpmにて30分間遠心した。
上澄を廃棄し、粒子を脱イオン化蒸留水90mlに再懸濁し
た。このようにして活性化したポリマー粒子を含有する
ラテックスを３つの部分に分け、そして各部を以下に記
載する３種のジアミンの１の過剰と反応させた。

反応A:ジアミンＡ、ヘキサンジアミン（567mg）を0.1モ
ルのホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8）30mlに溶解し、pH8
に調節した。この溶液を活性化ラテックス30mlに添加
し、ホウ酸塩緩衝液で容量を100mlにした。

反応B:ジアミンＢ、Ｌ−リジン・1HCl（548mg）を、反
応Ａに記載したように溶解しそして反応させた。

反応C:ジアミンＣ、Ｌ−リシル−Ｌ−リジン・2HCl（26
0mg）を、また、反応Ａに記載したように溶解しそして
反応させた。

前記の３種の反応を、室温および回転させながら４時
間続けた。各反応混合物を透析袋に入れ、そして脱イオ
ン化蒸留水に対して約24時間透析した。次に、これらを
6000rpmで30分間遠心し、そして上澄を廃棄した。その
後、各反応生成物を脱イオン化蒸留水100mlに再懸濁
し、次いで遠心および再懸濁工程を２度以上繰り返し
た。得られた反応生成物は、それぞれラテックス粒子に
共有結合したジアミンを含んでいた。

前記で製造した各反応生成物を、次の方法で酸化した
アルデヒド基を有するIgGタンパクと反応させた。

まず最初に、IgGを塩化ナトリウム（0.15モル濃度）
を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（0.01モル濃度、pH
6）中に透析した。用いたIgGは、トリチウム化ウシγ−
グロブリン（³H BGG）であった。そのタンパクの炭水化
物を、室温にて１時間、最終濃度として30mmolのNaIO₄
を用いて酸化した。最終濃度として100mmolのグリセロ
ールを添加して反応を停止し、次いでその反応物を商業
的に入手し得るファルマシア（Pharmacia）PD−10脱塩
カラムを介して製造者の使用説明書に従って通過させる
ことにより過剰の試薬を除去した。

前記した３種の反応生成物のそれぞれの１部（乾燥重
量30mg）を、酸化したタンパク1.5mgと合わせ、そして1
5mlの遠心管中で0.15モル濃度の塩化ナトリウムを含有
する0.01モル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（pH6）を
用いて9mlの最終容量にした。得られた反応物を、回転
させながら室温下に５時間維持した。各反応物にNaBH₃C
N（100mmol）溶液1mlを添加し、さらに室温下で16時間
回転を続けた。

対照物質（対照１）は、ジアミン成分を含有するラテ
ックを原料のカルボキシル化ラテックスの１部で置換す
ることにより同様に製造した。追加の対照（２〜４）
は、それぞれのジアミンラテックスとの反応における酸
化したタンパクを酸化していないトリチウム化ウシγ−
グロブリンで置換することにより同様に製造した。ま
た、対照５では、原料カルボキシル化ラテックスに酸化
していないトリチウム化ウシγ−グロブリンを付加し
た。

記載した反応の終了時に、過剰のウシ血清アルブミン
（30mg、30mg/ml、緩衝液中）を添加してそれぞれの反
応を停止した。これらの試料は、タンパク停止剤を添加
した後、さらに４時間インキュベーションした。

ラテックスに結合した抗体の総量は、前記例２に記載
した方法により定量した。粒子に共有結合している³H B
GGの画分は、前記例２に記載したように１％のドデシル
硫酸ナトリウムの存在下でインキュベーションした後測
定した。結果を次の第Ｖ表に示す。

ジアミンＡ〜Ｃに関するこれらの結果は、本発明に従
うカルバモイルオニウム化合物による活性化後、ポリマ
ー粒子のカルボキシル基とジアミンが反応することを示
す。その後、粒子上の得られたアミン成分は、トリチル
化したIgGの酸化したアルデヒド基と反応した。データ
により示されるように、粒子上のアミン成分に十分バイ
ンディングするためには、タンパク上にアルデヒド基が
存在していなければならない。それらの基が酸化されて
いない場合（対照２〜５）には、粒子にほんの少画分の
タンパクが共有結合しただけである。さらに、有意な共
有結合のためには粒子上に十分なアミン成分が存在して
いなければならない。小さな共有結合がカルボキシル化
粒子単独についても見られる（対照１）。

例5:カラーカプラー・モノマーに由来する粒子へのタン
パクの結合 コポリ〔スチレン−アクリル酸ブチル−Ｎ−（3,5−
ジクロロ−４−エチル−２−ヒドロキシフェニル）アク
リルアミド−メタクリル酸〕（重量比、50:20:20:10）
のポリマー粒子は、次の方法で製造された。

撹拌器、冷却器および窒素供給口を装備したフラスコ
に、窒素でパージした蒸留水を添加し、そのフラスコを
60℃に加熱した湯浴中に設置した。スチレン（50g）、
アクリル酸ｎ−ブチル（20g）およびＮ−（3,5−ジクロ
ロ−４−エチル−２−ヒドロキシフェニル）アクリルア
ミド（20g）ならびにアセトン（200ml）を混合し、フラ
スコに添加した。K₂S₂O₈（2g）およびK₂S₂O₅（1g）の組
み合わせ開始剤を、フラスコに添加し、15分間反応を続
けた。次に、メタクリル酸（20g）を添加し、18時間反
応を続けてポリマー粒子のラテックスを得た。

ポリマー粒子のカラーカプラー成分を発色させるため
に、10％のK₂S₂O₈溶液200mlと共に次の組成〔トリエタ
ノールアミン（11ml）、ベンジルアルコール（14.2m
l）、塩化リチウム（2.1g）、臭化カリウム（0.6g）、
硫酸ヒドロキシルアミン（3.2g）、亜硫酸カリウム（45
％の溶液、2.8ml）、１−ヒドロキシエチレン−1,1−ジ
−リン酸（60％、0.8ml）、４−アミノ−３−メチル−
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）
アニリン硫酸ヒドレート（4.35g）、炭酸カリウム（無
水物、28g）、スチルベン蛍光増白剤（0.6g）、界面活
性剤（1ml）および水で１にした（pH10.8）〕の発色
現像剤を添加した。得られた着色粒子を連続透析浴中で
蒸留水に対して24時間透析し、次いで80℃にてロータリ
ー・エバポレーターを用い残存モノマーを除去した。

50mlのポリエチレン製遠心管における0.1モルの２−
（４−モルホリン）エタンスルホン酸（pH6）30ml中の
前記着色粒子100mgに、カルバモイルオニウム化合物１
−（４−モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエ
チル）ピリジニウムヒドロキシド（分子内塩）（0.15mm
ol）を添加した。この懸濁液を、45゜の角度で回転盤に
固定しながら30〜35rpmにて10分間回転させた。反応混
合物にトリチウム化ウシγ−グロブリン（1mg）を添加
し、さらに24時間回転を続けた。反応を、過剰のウシ血
清アルブミン（100mg、50mg/ml緩衝液中）の添加により
停止し、そして試料をさらに24時間インキュベーション
した。

粒子に結合した抗体の総量は、反応物の試料1mlの遠
心後の上澄に残存する放射性同位体に由来する１分当た
りのカウントを測定することにより定量し、そして１分
当たりの総理論カウントからこの量を差し引いて各反応
物にインプットした。粒子に93％のタンパクが結合した
ことが測定された（ポリマーの1g当たり9.3mgのタンパ
クが結合した）。

〔発明の効果〕

本発明は、反応性アミン含有化合物または反応性スル
フヒドリル化合物、例えば生理活性ポリペプチドまたは
タンパクを迅速に結合するための方法を提供し、それに
よって、イムノアッセイ、診断試験、アフィニティー・
クロマトグラフィー、酵素反応および他の生物学的また
は化学的過程のために有用な物質を形成する。結合は、
結合される反応性化合物に悪影響を及ぼすことなく達成
される。すなわち、該粒子のペンダントカルボキシル基
との共有結合の形成に関係する反応性アミン基または反
応性スルフヒドリル基の架橋または失活は極微である。

これらの利点は、特殊な結合剤の使用によって達成さ
れる。これらの薬剤は、かつて当該目的に使用されたこ
とのないカルバモイルオニウム化合物である。初めのう
ちは、かかる化合物も従来使用されているカルボジイミ
ドのように、反応性化合物の反応性アミン基または反応
性スルフヒドリル基を無差別に失活するであろうと予測
された。意外にも、本発明者等は事実はそうでないこと
を見い出し、このことによって本明細書に開示される非
常に有用でかつ非常に効率的な結合方法を発明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/00 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ (72)発明者 プラナブ バグチ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，ハンツマン ウェイ ３

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】A.（１）ポリマー粒子表面にカルボキシル
   基を有しており、かつ少なくとも１つはペンダントカル
   ボキシル基を含む１以上のエチレン系不飽和重合性モノ
   マーから調製されるポリマー粒子の水性懸濁液と、
   （２）カルバモイルオニウム化合物を接触させてペンダ
   ント中間体反応性基を有する反応性中間体ポリマー粒子
   を製造する工程、ならびに B.工程Ａで製造される反応性中間体ポリマー粒子と、こ
   の粒子の中間体反応性基と反応する反応性アミン基また
   はスルフヒドリル基をそれぞれ有する反応性アミン含有
   化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を接触さ
   せて、前記粒子と前記反応性化合物との共有結合を形成
   する工程、 を含んでなるペンダントカルボキシル基を介してポリマ
   ー粒子に反応性アミン含有化合物または反応性スルフヒ
   ドリル含有化合物を結合させる方法であって、 前記カルバモイルオニウム化合物が、次式 ｛上式中、 Ｚは、置換されているかもしくは置換されていない５−
   もしくは６−員の複素環式芳香環を完成するために必要
   な原子を表し、 ｍおよびｎは、独立して０または１であり、 R¹およびR²は、相互に独立して、置換されているかもし
   くは置換されていないアルキル、置換されているかもし
   くは置換されていないアリール、または置換されている
   かもしくは置換されていないアラルキルであるか、また
   はR¹およびR²は一緒になって、置換されているかもしく
   は置換されていないピペリジン環、ピペラジン環または
   モルホリン環を完成するのに必要な原子を表し、 R³は、水素原子、置換されているかもしくは置換されて
   いないアルキルであるか、または （上式中、Ａは、ホモポリマーまたはコポリマーの分子
   量が1000以上であるような１以上のエチレン系不飽和重
   合性化合物から形成されるホモポリマーまたはコポリマ
   ーの重合ビニル主鎖を表す） で示される基であり、 R⁴は、水素原子、置換されているかもしくは置換されて
   いないアルキルであるか、またはＺがピリジニウム環を
   完成するのに必要な原子を表し、かつｎが０である場合
   には、R⁴は、次の基 （ａ）−NR⁶−CO−R⁷（基中、R⁶は、水素または置換さ
   れているかもしくは置換されていないアルキルであり、
   R⁷は、水素または置換されているかもしくは置換されて
   いないアルキルであるか、または−NR⁸R⁹〔基中、R⁸お
   よびR⁹は、独立して水素または置換されているかもしく
   は置換されていないアルキルである〕である）、 （ｂ）−（CH₂）_ｑ−NR¹⁰R¹¹（基中、R¹⁰は、−CO−R¹²
   であり、R¹¹は、水素または置換されているかもしくは
   置換されていないアルキルであり、R¹²は、水素、置換
   されているかもしくは置換されていないアルキル、また
   は−NR¹³R¹⁴〔基中、R¹³は、置換されているかもしくは
   置換されていないアルキル、または置換されているかも
   しくは置換されていないアリールであり、R¹⁴は、水
   素、置換されているかもしくは置換されていないアルキ
   ル、または置換されているかもしくは置換されていない
   アリールである〕であり、そしてｑは、１〜３であ
   る）、 （ｃ）−（CH₂）_ｒ−CONR¹⁵R¹⁶（基中、R¹⁵は、水素、
   置換されているかもしくは置換されていないアルキル、
   または置換されているかもしくは置換されていないアリ
   ールであり、R¹⁶は、水素または置換されているかもし
   くは置換されていないアルキルであるか、またはR¹⁵とR
   ¹⁶は一緒になって、５−または６員の脂肪環を完成する
   のに必要な原子を表し、そしてｒは、０〜３である）、 （基中、R¹⁷は、水素、置換されているかもしくは置換
   されていないアルキルであり、Ｙは、オキシまたは−NR
   ¹⁹−であり、R¹⁸は、水素、置換されているかもしくは
   置換されていないアルキル、−CO−R²⁰または−CO−NHR
   ²¹〔基中、R¹⁹、R²⁰およびR²¹は、独立して水素または
   置換されているかもしくは置換されていないアルキルで
   ある〕であり、そしてｔは、２または３である）、なら
   びに （ｅ）−R²¹X′ （基中、R²¹は、置換されているかも
   しくは置換されていないアルキレンであり、そしてＸ′
   は、ピリジニウム環と分子内塩を形成するような共有
   結合の陰イオン性の基である）、 から選ばれ、 R⁵は、置換されているかもしくは置換されていないアル
   キル、置換されているかもしくは置換されていないアリ
   ール、または置換されているかもしくは置換されていな
   いアラルキルであるが、但し、R⁵が結合している窒素原
   子が二重結合を介して環の残りの部分と結合している場
   合には、ｍが０であり、 Ｘは、陰イオンであり、そして ｖは、０または１であるが、但し、R⁴が−R²¹X′ であ
   る場合には、ｖは０だけを示す｝ で示されることを特徴とする方法。