JPS61274261A

JPS61274261A - 免疫学的診断試薬

Info

Publication number: JPS61274261A
Application number: JP11858685A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Kihara; 木原　康夫; Takashi Kawasaki; 隆志川崎; Kenjiro Mori; 健二郎森; Keiichi Ushiyama; 敬一牛山
Original assignee: Nitto Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1985-05-30
Filing date: 1985-05-30
Publication date: 1986-12-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液からなり、ラテックス凝集反応において非特異的凝集
反応がなく、且つ、凝集反応の判定が容易であると共に
、保存安定性にすぐれる免疫学的診断試薬に関する。

（従来の技術）近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の状態の医
学的診断のために、血液、尿その他の体液中の生理活性
物質が有する免疫活性を利用する免疫学的診断方法が広
く用いられている。この方法は、免疫学的な反応を起こ
す抗原又は抗体のいずれか一方、又は両者を組合せて体
液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対
応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集■止反応によって、
上記のような免疫活性成分の存在を測定する方法である
。この場合、肉眼による観察を容易にするために、一般
に、抗原又は抗体は微粒子状の担体、例えば、ラテック
ス、赤血球等に担持されて診断試薬とされ、通常、ｐＨ
を中性近傍とした水性媒体中でのこのような粒子の凝集
反応の有無を利用して、血清等の体液中の被検成分が測
定される。

例えば、微粒子がラテックスからなる診断試薬の凝集反
応について説明すると、抗原又は抗体を担持させた微粒
子を含有する水性分散液からなる診断試薬を被検液と混
合すると、上記抗原又は抗体に対応する被検液中の抗体
又は抗原は、微粒子上の抗原又は抗体と特異的に反応し
、ラテックス凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒
子の凝集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗体又は抗原が存在しない場合は、肉眼的に観察し得る
凝集は起こらない。このようにして、抗原又は抗体を担
持させた微粒子の凝集反応の有無によって、被検液中の
抗体又は抗原の存在を決定することができる。

このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質、即ち、
抗原又は抗体が微量にでも被検液中に存在すれば、これ
を検出し得る高い感度と、目的とする免疫活性物質との
み反応する高い特異性を有することが要求される。更に
、長期間の保存によっても、高い検出感度及び特異性を
保持することが要求される。

このような免疫学的診断試薬としては、従来、ポリスチ
レンラテックス粒子表面に抗原及び抗体を物理吸着によ
り固定化してなる診断試薬や、カルボキシル化ラテック
ス粒子にカルボジイミド、ジアルデヒド等を用いて共有
結合により固定化してなる診断試薬等が提案されている
。しかし、従来のかかる診断試薬は、いずれも、血清と
反応させたとき、対応する抗体又は抗原を含む陽性血清
のみならず、対応する抗体又は抗原を含まない陰性血清
に対しても凝集反応を起こすことがある。

このような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれており
、しばしば診断を誤まらせることがある。

このような非特異的凝集反応が起こる理由は必ずしも明
らかではないが、一つには血清中に含まれる補体等の因
子によるものと考えられる。

一方、従来からラテックス粒子の非特異的凝集を防ぐこ
とを目的として、ラテックス凝集反応の有無の判定を行
なう際に、血清をグリシン等の緩衝液で希釈したり、或
いは血清中の補体を失活させる非動化処理を施すことが
行なわれている。しかし、このような処理によっては、
非特異的凝集を十分に抑制することは困難であり、また
、手間を要して、診断に時間がかかるという間坦がある
。

このような免疫学的診断試薬における問題を解決するた
めに、従来より、非特異的凝集反応を抑制することを目
的として、診断試薬に添加剤を添加することが一般に行
なわれており、かかる添加剤として、例えば、グリコー
ル類や、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、或いは
ポリアニオン等あり知られている。しかし、これらの添
加剤の効果は一般に十分ではないので、近年、添加剤と
して、例えば、ショ糖及び塩化コリン（特開昭５４−０
２６３２７号公報）　、Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミドやジ
低級アルキルスルホキシド（特開昭５５−１６０８５３
号公報）等が提案されている。

更に、近年になって、種々の無機塩類が非特異的凝集を
抑制する効果をもつ添加剤として提案されている。例え
ば、特開昭５６−１５８９４７号公報には、グアニジン
、グアニジン塩酸塩、グアニジニウムチオシアン酸塩、
尿素等を代表例とするケイオトロビツク（ｃｈａｏｔｒ
ｏｐｔｃ）剤と共に、似ケイオトロビツク剤として塩化
リチウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウ
ム、ヨウ化リチウムのようなハロゲン化アルカリ金属や
、塩化カルシウムのようなハロゲン化金属が記載されて
おり、また、特開昭５７−３５’７５４号公報にも同様
にハロゲン化アルカリ金属が記載されている。

しかし、上記した添加剤を含有する免疫学的診断試薬も
、依然として非特異的凝集を抑制する効果が満足すべき
ものではなく、特に、血清を希釈することなく、原血清
を免疫学的診断試薬と混合したとき、非特異的凝集が往
々にして起こる。特に、上記したような塩類を添加剤と
して用いるとき、このような傾向が著しい。更に、免疫
学的診断試薬は、一般に室温又はそれ以上の温度での保
存安定性に劣り、特に、添加剤として無機塩類を用いる
ときにこの傾向が強いので、免疫学的診断試薬は、従来
、１０℃以下の温度で保存されることが多い。しかし、
このような場合、使用に際しては、再び室温に戻す煩瑣
な手間を必要とするので、従来より室温で保存すること
ができ、且つ、この室温での保存によって、自然凝集を
起こすことなく、しかも、診断への使用に当たっては、
高い検出感度を保持しているように、保存安定性にすぐ
れた免疫学的診断試薬が強く要望されている。

このように、従来、種々の添加剤が提案されているが、
尚、非特異的凝集を抑制する効果が劣ると共に、診断試
薬が保存安定性に劣る問題がある。

（発明の目的）本発明者らは、免疫学的診断試薬における上記の問題を
解決するために鋭意研究した結果、免疫活性物質を固定
化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液からなる
免疫学的診断試薬において、これにある種のアミノカル
ボン酸はアミノスルホン酸又はこれらの塩を溶解共存さ
せることにより、前記無機塩類系の添加剤を含めて、従
来より知られている添加剤に比較して、非特異的凝集を
抑制する効果に格段にすぐれ、且つ、凝集反応の有無が
容易であると共に、保存安定性にも格段にすぐれる免疫
学的診断試薬を得ることができることを見出して、本発
明に至ったものである。

従って、本発明は、血清を希釈することなく、しかも、
非動化処理も行なわずに、非特異的凝集反応が抑制され
、且つ、凝集反応の有無の判定が容易であると共に、低
温のみならず、室温又はそれ以上の高い温度での保存安
定性にすぐれた免疫学的診断試薬を提供することを目的
とする。

（発明の構成）本発明による第１の免疫学的診断試薬は、免疫活性物質
が固定化された水分散型高分子重合体粒子の水性分散液
からなる免疫学的診断試薬において、上記水性分散液に
一般式％式％（）（但し、Ａは水素又は置換基を有していてもよいアルキ
ル基、Ｂは置換基を有していてもよいアルキレン基、ｍ
は１又は２を示す。但し、ｍが２のとき、Ａは同時には
水素ではない。）で表わされる第２級又は第３級アミノ基を有するアミノ
カルボン酸又はその塩が配合されてなることを特徴とす
る。

また、本発明による第２の免疫学的診断試薬は、免疫活
性物質が固定化された水分散型高置、子重合体粒子の水
性分散液からなる免疫学的診断試薬において、上記水性
分散液に一般式（但し、Ｘ及びＹは水素又は置換基を有していてもよい
アルキル基、シクロアルキル基又は相互に結合してなる
環状アミノ基残基を示し、Ｚは置換基を有していてもよ
いアルキレン基を示す。但し、Ｘ及びＹは同時には水素
ではない。）で表わされる第２級又は第３級アミノ基を有するアミノ
スルホン酸又はその塩が配合されてなることを特徴とす
る。

本発明による免疫学的診断試薬において、免疫活性物質
を固定化するための担体である水分散型高分子重合体粒
子の平均粒径は、好ましくは０．０３〜２μｍ、特に好
ましくは０．１〜１μｍである。

平均粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定化した水
分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による凝集を肉
眼で観察することが困難であり、一方、大きすぎるとき
は、重合体粒子に安定な分散状態を保持させるのが困難
となるからである。また、重合体粒子の比重は、０．９
〜１．５の範囲にあることが好ましく、更に、後述する
ように、免疫活性物質を固定化した後の比重が１．０〜
１．３の範囲にあることが好ましい。重合体粒子が免疫
活性物質の固定化の前後に上記範囲よりも小さい比重を
有するときは、重合体粒子がその水性分散液における水
性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るようになり、
一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子が分散液の水
性媒体中に沈降し、凝集しやすくなって、同様に分散安
定性に劣るようになるからである。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、通
常、不飽和二重結合を有する単量体の−又は、二基上の
乳化重合によって調製される。かかる単量体としては、
例えば、エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量体
、酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチレ
ン、メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単
量体、アクリル酸メチル等のアクリル酸エステル系単量
体、メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エステル系単
量体、ブタジェン等のジエン系単量体等が用いられる。

また、これら単量体の単独重合体又は共重合体粒子に官
能基やイオン性基を与え、又は粒子の水性媒体中での分
散安定性を高める等を目的とする重合体粒子の改質のた
めに、アクリル酸、メタクリル酸、アクリロニトリル、
メタクリロニトリル、アクリルアミド、スチレンスルホ
ン酸ナトリウム、スルホプロピル（メタ）アクリレート
ナトリウム塩、Ｎ−ビニルピロリドン等の単量体を前記
単量体と共重合させることもできる。

更に、上記単量体と共に、単量体成分として多官能性単
量体を内部架橋剤として乳化共重合させて、架橋させた
水分散型高分子重合体粒子を得ることもできる。内部架
橋剤は、重合体に架橋構造を導入するので、診断試薬中
に含まれれば好ましくない水溶性重合体の生成を抑制す
ると共に、得られる重合体粒子のガラス転移温度を高め
ることができる６更に、内部架橋剤は、水分散型高分子
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中で
の分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ　（メ
タ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メ
タ）アクリレート等が好ましく用いられる。

また、ジビニルベンゼンやＮ、　Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミド等も内部架橋剤として用いることができる
。

尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる水分散型
高分子重合体粒子が免疫活性物質を固定化した診断試薬
として、保存時に融着、凝集を起こさないように、所要
のガラス転移点を有するように選ばれる。重合体粒子の
ガラス転移点、は、診断試薬の保存温度及び診断試薬の
使用温度を考慮して、好ましくは１０℃以上、特に室温
以上である。

免疫活性物質を共有結合にて上記水分散型高分子重合体
粒子に固定化する場合や、後述するように、所謂スペー
サ基を介して水分散型高分子重合体粒子に免疫活性物質
を固定化する場合には、重合体粒子はその表面に官能基
を有することが必要である。このような官能基としては
、例えばカルボキシル基、水酸基、グリシジル基、アミ
ノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシアナー
ト基、アジドカルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物基
等を挙げることができる。従って、これらの官能基を有
する重合体粒子を調製するには、単量体成分として、例
えば、アクリル酸、メタクリル酸のようなカルボキシル
基を有する単量体、例えば、ヒドロキシエチルアクリレ
ート、２−ヒドロキシメチルメタクリレートのような水
酸基を有する単量体、例えば、グリシジルメタクリレー
トのようなグリシジル基を有する単量体を、必要に応じ
て、他の共重合性単量体と乳化共重合させることによっ
て、それぞれカルボキシル基、水酸基及びグリシジル基
を有する水分散型高分子重合体粒子を得ることができる
。

また、所要の単量体成分を重合させた後、得られた水分
散型高分子重合体粒子に官能基を導入することもできる
。このための方法としては、例えば、アクリル酸エステ
ルを単量体成分として重合させて得た重合体粒子を加水
分解することにより、カルボキシル基を有する重合体粒
子を得ることができる。また、アミノ基やヒドラジド基
を有する水分散型高分子重合体粒子を調製するには、例
えば、アクリルアミドのようなアミド基を有する単量体
、又はアクリル酸メチルのようなメチルエステル基を有
する単量体をそれぞれ他の単量体と乳化共重合し、得ら
れた共重合体中のアミド基をホフマン分解し、又はメチ
ルエステル基をヒドラジンと反応させることにより得る
ことができる。

しかし、このように官能基を有する水分散型高分子重合
体粒子に免疫活性物質を共有結合にて固定化するための
方法は、特に制限されず、従来より知られている任意の
゛方法によることができる。

更に、本発明による免疫学的診断試薬においては、水分
散型高分子重合体粒子に免疫活性物質を共有結合によっ
て固定化するに際して、必要に応じて、免疫活性物質の
重合体粒子上での自由度を高めるために、重合体粒子と
免疫活性物質とをスペーサ基を介在させて共有結合にて
結合させることができる。このスペーサ基は、予め重合
体粒子に結合させ、この後にこのスペーサ基と免疫活性
物質とを結合させてもよく、或いはスペーサ基を予め免
疫活性物質に結合させ、これを重合体粒子に結合させて
もよい。更に、必要に応じて、重合体粒子及び免疫活性
物質の両方に予めスペーサ基を結合させ、これらを相互
に結合させることもできる。

上記スペーサ基として用い得る化合物は、少なくとも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
るものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖基を
有する二官能性の有機化合物が好ましい。このようなス
ペーサ基として機能する化合物の具体例として、例えば
、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、
キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−ア
ミノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロ
ン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカルボ
ン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギニ
ン、グリシルグリシルグリシン等のアミノ酸類等が好ま
しく用いられるが、これらに限定されるものではない。

このスペーサ基は、予め重合体粒子に結合させ、この後
にこのスペーサ基と免疫活性物質とを結合させてもよく
、或いはスペーサ基を予め免疫活性物質に結合させ、こ
れを重合体粒子に結合させてもよい。更に、必要に応じ
て、重合体粒子及び免疫活性物質の両方に予めスペーサ
基を結合させ、これらを相互に結合させることもできる
。

前記した官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に直
接に免疫活性物質を共有結合にて固定化し、又は重合体
粒子にスペーサ基を結合し、また、このスペーサ基に免
疫活性物質を共有結合にて固定化するための方法は、特
に制限されず、従来より知られている任意の方法による
ことができる。

例えば、好ましい方法の一つとして、結合試薬として水
溶性カルボジイミドを用いる方法を挙げることができる
。例えば、アミノアルキルカルボン酸をスペーサ基とし
て用いる場合であれば、水溶性カルボジイミドを用いて
、アミノアルキルカルボン酸を水分散型高分子重合体粒
子に結合させ、次いで、この重合体粒子に結合されたア
ミノアルキルカルボン酸に水溶性カルボジイミドを用い
て同様にして、免疫活性物質を共有結合にて固定化する
ことができる。

かかる方法において用いる水溶性カルボジイミドとして
は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−
ｐ−）ルエンスルホネート等を挙げることができる。こ
のような水溶性カルボジイミドを用いて、スペーサ基を
介して、又は介さずして直接に、共有結合によって免疫
活性物質を重合体粒子に固定化するには、従来より知ら
れている通常の方法及び条件によることができる。例え
ば、スペーサ基を用いる場合であれば、重合体粒子の水
性分散液にスペーサ基と共に適宜量、例えば、水性分散
液の単位容量当りに０，０１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに水溶性カルボジイミドを添加し、通常の条件、例え
ばｐＨを４〜１０に保持して、５〜６０℃程度の温度で
数分乃至数十時間、通常、１〜５時間程度反応させれば
よい。

次いで、このスペーサ基を結合させた重合体粒子に同様
にして免疫活性物質を固定化すればよい。

また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン法により
、また、アミノ基であるときはジアルデヒドと反応させ
、これら官能基を活性化することによって、スペーサ基
を結合させ、次いで、上記と同様にして免疫活性物質を
重合体粒子に共有結合にて固定化することができる。ま
た、重合体粒子に直接に免疫活性物質を固定化すること
もできる。

勿論、本発明においては、免疫活性物質を上記した共有
結合性以外の従来より知られている任意の方法、例えば
、物理吸着法やイオン結合法等によって固定化してもよ
い。よく知られているように、物理吸着法による場合は
、担体としての水分散型高分子重合体粒子は、前記した
単量体が適宜に選ばれて、単独若しくは共重合されて、
表面が疎水性であるように調製され、また、イオン結合
法による場合は、水分散型高分子重合体粒子はイオン性
基を有するように調製される。

しかし、このように免疫活性物質が物理吸着法やイオン
結合法によって水分散型高分子重合体粒子に固定化され
ている場合は、免疫学的診断試薬の水性媒体のイオン強
度によっては、免疫活性物質の水分散型高分子重合体粒
子との結合状態が影響を受けて、例えば、特異凝集性の
低下や保存安定性に欠けることがあるので、本発明にお
いては、免疫活性物質は好ましくは共有結合法によって
水分散型高分子重合体粒子に固定化される。但し、上記
した問題が生起しないときは、免疫活性物質を物理吸着
法やイオン結合法によって水分散型高分子重合体粒子に
固定化してもよいのは当然である。

本発明において用いる免疫活性物質としては、特に制限
はなく、抗原、抗体及びハプテン等いずれを用いてもよ
い。例えば、ヒト及び動物免疫グロブリン、変性免疫グ
ロブリン、α−フェトプロティン、Ｃ反応性タンパク（
ＣＲＰ）や肝炎ウィルス関連抗原、風疹ＨＡ抗原等の各
種ウィルス抗原、トキソプラズマ、マイコプラズマ、梅
毒トレボネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生物
抗原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパク成分
、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（、ＨＣＧ
）等の各種ホルモン等が挙げられ、また、これらの抗原
成分に対する抗体等も使用することができる。

本発明による免疫学的診断試薬は、上記のように固定化
した免疫活性物質の失活が起こらないように、水分散型
高分子重合体粒子が適当なｐＨ及び濃度のグリシン緩衝
液、リン酸緩衝液１．ホウ酸緩衝液等の緩衝液に分散さ
れていると共に、この重合体粒子の水性分散液に粒子の
非特異的凝集を抑制するための添加剤として、前記一般
式（Ｉ）で表わされる第２級又は第３級アミノ基を有す
るアミノカルボン酸Ａ３−１ＩＮ（Ｂ−ＣＯＯＨ）ｌＩ（Ｉ　）又は前記一
般式（ｎ）で表わされる第２級又は第３級アミノ基を有するアミノ
スルホン酸を含有する。

先ず、本発明による免疫学的診断試薬において、上記緩
衝液の濃度は、通常、０．００５〜０．２Ｍの範囲が適
当であり、好ましくは０．０１〜０．１Ｍの範囲である
。

次に、上記一般式（１）で表わされるアミノカルボン酸
において、アミノ基は第２級又は第３級であることを必
要とし、第１級の場合は、これを添加剤として用いても
、非特異的凝集を抑制する効果は殆ど得られない。

また、上記一般式（Ｈにおいて、Ａは水素又は置換基を
有していてもよい直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を示し
、アルキル基の場合、その炭素数は好ましくは１〜５で
ある。ｍは１又は２である。但し、ｍが２のとき、Ａは
同時には水素ではない。Ａにおける置換基として、例え
ば、水酸基やカルバモイル基を挙げることができる。従
って、Ａの好ましい具体例として、例えば、ヒドロキシ
メチル基、ヒドロキシエチル基、トリ　（ヒドロキシメ
チル）メチル基、カルバモイルメチル基等を挙げること
ができる。

また、Ｂは置換基を有していてもよいアルキレン基、好
ましくは炭素数１〜３のアルキレン基を示す。従って、
Ｂの好ましい具体例として、メチレン基、エチレン基等
のようなアルキレン基を挙げることができる。このアル
キレン基も水酸基のような置換基を有していてもよい。

従って、上記アミノカルボン酸の好ましい具体例として
、例えば、（１）　　　　（ＨＯＣＨｚＣＨｚ）　ＪＣＨｚＣＯＯ
Ｈ（２）　　　　（ＨＯＣ）Ｉｔ）　ｆｆｃＮＨｃＨ２
ｃＯＯＨ（３）　　　　ＨＪＣＯＣ）ＩＪ（Ｃ）ｌｚｃ
ＯＯＨ）ｚ等を挙げることができる。

次に、前記一般式（ＩＩ）で表わされるアミノスルホン
酸においても、アミノ基は第２級又は第３級であること
を必要とし、第１級の場合は、これを添加剤として用い
ても、非特異的凝集を抑制する効果は殆ど得られない。

一般式（ＩＩ）において、Ｘ及びＹは水素又は置換基を
有していてもよい鎖状又は分岐鎖状アルキル基、シクロ
アルキル基又は相互に結合してなる環状アミノ基残基を
示し、好ましくは１換基を有していてもよい炭素数１〜
５の鎖状又は分岐鎖状アルキル基、炭素数５〜８のシク
ロアルキレン基又は５〜６員環の環状アミノ基残基を示
す。従って、Ｘ及びＹの好ましい具体例として、例えば
、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒトｏ−
１−ジプロピル基、トリ　（ヒドロキシメチル）メチル
基、カルバモイルメチル基、シクロヘキシル基等の置換
基を有していてもよいアルキル基やシクロアルキル基、
以下に示すようなモルホリノ基等の環状アミノ基残基を
挙げることができる。但し、Ｘ及びＹは同時には水素で
はない。

また、一般式（ＩＩ）におけるＺは、置換基を有してい
てもよいアルキレン基を示し、好ましくは置換基を有し
ていてもよい炭素数１〜４の鎖状又は分岐鎖状アルキレ
ン基を示す。置換基としては、例えば、水酸基を挙げる
ことができる。Ｚの好ましい具体例として、例えば、エ
チレン基、プロピレン基、ヒドロキシプロピレン基等を
挙げることができる。

従って、アミノスルホン酸の好ましい具体例として、例
えば、（４”）　　　　　（ＨＯＣＩｈＣＩＩＺ）　ｚＮｃｔ
ｈｃＨｚｓＯＪ（５）　　　　ＣＩ（ＯＣ８２Ｃ）１２
）２ＮＣＩ（２Ｃ１１（Ｏｌｌ）ＣＩｈＳＯ３）１（６
”）　　　　　（ＨＯＣＨｚＣＨｚ）　ＩＣＮＨＣ）１
２ｃＨ２ｓ（ｈＨ（７）　　　　　（ＨＯＣ８２Ｃ１１
□）　３ＣＮＴＩＣＨｚＣＨｚＣＨｚＳＯｓＨ（８）　
　　　　（ＨＯＣＨ２ＣＨ２）ｆｆＣＮ）１ｃＨ２ｃＨ
（Ｏ）ｌ）Ｃ）１２ｓＯＪ（９”）　　　　　Ｈ２ＮＣ
０ＣＨ２ＮＨＣ）１２ｃＨ，５ＯｆｆＨ等を挙げること
ができる。

本発明においては、上記アミノカルボン酸又はアミノス
ルホン酸はナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ
金属塩やアンモニウム塩等の塩としても用いることがで
きる。

このようなアミノカルボン酸又はアミノスルホン酸又は
これらの塩は、免疫活性物質を固定化した水分散型高分
子重合体粒子の水性分散液において、０．０５〜３モル
／ｌ、好ましくは０．１〜２．５モル／１の濃度で含有
される。水性分散液における上記添加剤の濃度が０．０
５モル／１よりも少ないときは、陰性血清に対する非特
異的凝集の抑制効果が乏しく、一方、濃度が３モル／ｌ
を越えるときは、却って陽性血清に対する特異的凝集が
抑制されることとなるからである。

更に、本発明による免疫学的診断試薬は、水分散型高分
子重合体粒子の分散安定性及び抗原抗体反応の活性を考
慮して、そのｐＨを通常、６〜９、好ましくは７〜８．
５の範囲に調整するために、アンモニア又は前記アミノ
カルボン酸及びアミノスルホン酸以外の有機アミンをｐ
Ｈ調整剤として溶解含有する。このようなｐｔ＋調整剤
の使用量は、用いる添加剤アミノカルボン酸やアミノス
ルホン酸によっても異なるので、特に限定されないが、
通常、０．１〜３０倍モル、好ましくは０．５〜２倍モ
ルの範囲である。かかる有機アミンとしては、特に、限
定されるものではないが、トリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン）（以下、単にトリスという。）や、ビス（２
−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル
）メタン（以下、単にビストリスという。）等が好まし
く用いられる。

また、診断試薬における重合体粒子の濃度は、通常、診
断試薬の総重量に基づいて０．０１〜５重量％の範囲で
あるが、好ましくは０．１〜３重量％の範囲である。尚
、本発明による免疫学的診断試薬には、防腐効果を与え
るために、アジ化ナトリウム等の防腐剤を添加してもよ
い。

本発明による免疫学的診断試薬は、例えば、一つの方法
として、血清を希釈し、これを用いて免疫学的診断を行
なう場合に、アンモニア又は有機アミンを添加溶解させ
ることによってｐＨを調整した希釈液に上記アミノカル
ボン酸、アミノスルホン酸又はこれらの塩を緩衝液に溶
解含有させ、次いで、これを免疫活性物質を固定化した
水分散型高分子重合体粒子の水性分散液に添加混合する
ことにより調製することができる。また、免疫活性物質
を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液に
、アンモニア又は有機アミンを添加溶解させて、ｐＨを
調整した上記アミノカルボン酸、アミノスルホン酸又は
これらの塩の水溶液を添加混合して、免疫学的診断試薬
を調製し、これを保存することができる。但し、本発明
による免疫学的診断試薬の調製方法は、これに限定され
るものではない。

更に、本発明による免疫学的診断試薬は、従来より知ら
れている添加剤を含有させることもできる。かかる添加
剤としては、例えば、前記したよな塩化カルシウム等の
金属塩、ヒト、ウシ、ウマ、ウサギ等の動物血清や血清
アルブミン、ゼラチン、糖類、ポリビニルピロリドン、
ポリエチレーングリコール等を挙げることができる。こ
れらの添加剤を通常、診断試薬の総重量に基づいて０．
１〜２重景重量範囲で本発明によるアミノカルボン酸や
アミノスルホン酸と併用することによって、多くの場合
、免疫学的診断試薬の非特異的凝集の抑制効果を高める
ことができ、また、沈降現象を抑制して、診断時の凝集
の有無判定を容易ならしめることができる。

本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫学的診断
は、例えば、診断試薬と被検液とをガラース板又はプラ
スチック板の富み又は平面板上又はマイクロプレートに
おいて混合し、肉眼又は顕微鏡観察によって、重合体粒
子の凝集の有無を判定することにより行なわれる。また
、凝集の有無を光学的な変化として判定することもでき
る。

マイクロプレートを用いる方法は、診断に要する液量を
減じて、短時間に検出を行なう高感度検出法であり、一
般に、高濃度の血清は、微粒子を凝集させる傾向が強い
ので、検体血清はこれを高度に希釈して用いる必要があ
る。しかしながら、本発明によって、凝集反応液中にｐ
Ｈ＠調整したアミノカルボン酸又はアミノスルホン酸を
溶解含有させることにより、非特異的凝集が抑制される
のみならず、特異凝集活性が高められるので、検体血清
の濃度にかかわらずに、高い検出感度を得ることができ
る。

（発明の効果）以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液に、前記した特定のアミノカルボン酸、アミノスルホ
ン酸又はこれらの塩を含有させてなり、この結果、その
理由は必ずしも明らかではないが、重合体粒子の非特異
的凝集が完全に阻、止されるので、診断に際して、血清
を緩衝液で希釈したり、或いは非動化処理しなくとも、
迅速に正確な判定を行なうことができる。更に、本発明
による診断試薬は、従来の診断試薬に比較して、長期間
にわたる保存安定性にすぐれ、特に、低温のみならず、
室温又はそれ以上の比較的高い温度においても、保存安
定性にすぐれて、しかも、かかる保存後の使用に際して
も高検出感度を示す。

また、免疫活性物質の担体として用いる水分散型高分子
重合体粒子は、粒径を含む品質が均一であるうえに、そ
れ自体は免疫活性をもたないので、固定化操作が容易で
あると共に、固定化粒子は高い検出感度と高い特異性と
を有し、かくして、高精度での診断を可能とする診断試
薬を与える。

（実施例）以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。尚、以
下においては、重合体粒子に免疫活性物質を固定化した
後、必要に応じて濾紙（丸５）にて濾過し、得られた分
散液に添加剤を添加して、診断試薬とした。

実施例１（ａ）　　水分散型合成高分子重合体粒子の調製メタク
リル酸メチル８．０ｇ、メタクリル酸イソブチル５６０
ｇ、アクリル酸１．Ｏｇ、メタクリロニトリル３．０ｇ
及びトリエチレングリコールジメタクリレート０．７　
ｇを蒸留水３７０ｇに加え、更に蒸留水Ｌｏｇに過硫酸
カリウム０．１ｇを溶解させた重合開始剤水溶液を加え
た後、窒素気流下、７５°Ｃの温度で攪拌速度１９０ｒ
ｐｍで攪拌しつつ、８時間重合を行なった０重合率９９
％にて平均粒径０．３０μｍの水分散型高分子重合体粒
子を含む水性分散液を得た。

この重合体粒子の水性分散液を最初、蒸留水にて４回遠
心洗浄し、次いで、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，
５）にて２回遠心洗浄して、水相中の水溶性高分子を除
去し、重合体粒子を精製した後、この重合体粒子を０．
ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に固形分が５重量％
となるように再分散させた。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合上で得た水
分散型高分子重合体粒子の水性分散液１００ｍ１とε−
アミノカプロン酸水溶液（０，０２Ｍ）１００ｍｌとを
混合し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７，５に
調製した。０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶
解させた１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）２
０ｍｌを上記水性分散液に加え、室温で３時間、攪拌下
に反応させた。−夜、冷蔵庫に放置した後、０．ＯＩＭ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて３回遠心洗浄して、ス
ペーサ基を結合された重合体粒子を得、これを０．０１
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に固形分５重量％になる
ように再分散させた。

（Ｃ１ウサギＩｇＧの固定化上で得たスペーサ基を有する水分散型高分子重合体粒子
の水性分散液５ｍｌ、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，
５）　２ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混合し、これに１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　　２＋ｎｌを加
え、１０分後にウサギＩｇＧ水溶液（５ｍｇ／ｌ）を５
ｍｌ添加し、１５℃で２時間反応させた。

次に、反応混合物中の余剰の水溶性カルボジイミドを消
費するために、１００重量Ｌ−アルギニン水溶液（ｐＨ
７，５）　５ｍｌを加え、１時間インキュベートシた。

次いで、０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８゜２）にて遠
心洗浄を３回行なつ起後、０、ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐ
）１８゜２）に分散させて全量１０ｍ１に調整し、か（
して、ウサギＩｇＧを前記スペーサ基を介して共有結合
にて固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液
を得た。固定化量は重合体粒子１ｇ当り約４０ｍｇであ
った。

（ｄ）　　免疫学的診断試薬の調製種々の濃度にて前記アミノスルホン酸（４）を含有し、
トリスにてｐＨを８．０に調整した水溶液と、前記ウサ
ギｉｇｃを固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性
分散液とを混合して、上記アミノスルホン酸を種々の濃
度にて含有する重合体粒子濃度１．０重量％の本発明に
よる免疫学的診断試薬を調製した。

ｔｅｉ　　免疫学的診断試薬の評価免疫活性物質としてウサギＩｇＧを固定化した本試薬は
、リウマチ因子検出試薬として用いることができる。

この診断試薬と関節リウマチ因子陽性血清及び陰性血清
を原液のままそれぞれガラス板上にて等容量混合攪拌し
ながら、２分後に凝集状態を肉眼判定した。その結果を
第１表に示す。

第１表（注）判定の基準は以下による。以下の判定においても
同じである。

−二顕微鏡観察（１００倍）によっても凝集が認められ
ない。

一゛：肉眼にては凝集が認められないが、顕微鏡観察（
１００倍）−によって僅かに凝集が認められる。

±　　：肉眼にて少し凝集が認められる。

＋　　：肉眼にて凝集が明らかに認められる。

＋＋：少し強い凝集が認められる。

＋＋＋：激しい凝集が認められる。

本発明による診断試薬においては、非特異的凝集反応が
起こらないが、対照診断試薬では非特異的凝集が生じた
。

また、上記リウマチ因子検出試薬について、４℃及び４
０℃の温度にて経口安定性を調べた。評価方法は上記と
同じである。結果を第２表に示す。

本発明の診断試薬によれば、４０週間後にも陰性血清に
対して、何ら実用上支障となるような非特異的な凝集を
起こさず、且つ、低温のみならず、高温における保存安
定性にすぐれることが明らかである。これに対して、対
照診断試薬は、非特異的凝集が著しく、また、高温での
保存安定性に欠ける。また、添加剤として塩化カルシウ
ムを含有する対照診断試薬によれば、初期の特性はすぐ
れるが、保存によって安定性が著しく低下し、非特異的
凝集が生じる。

更に、上記リウマチ因子検出試薬を４℃及び４０°Ｃの
温度で保存したときの陽性活性の変化を調べた。結果を
第３表に示す。凝集の判定基準は前記と同じである。

実施例２ｆａ）　　水分散型合成高分子重合体粒子の調製単量体
としてメタクリル酸メチル１５．０ｇ、アクリル酸１．
０ｇ及びトリエチレングリコールジメタクリレート０．
７　ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、重合率
９８％にて平均粒径０．３６μｍの水分散型高分子重合
体粒子の水性分散液を得た。

この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得られた重
合体粒子を０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐ）＋７．５）に
固形分濃度５重量％となるように分散させて、水分散型
高分子重合体粒子の水性分散液を得た。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合実施例１と
同様にして、上で得た重合体粒子にスペーサ基を結合さ
せた。

ｆｃｌ　　ウサギＩｇＧの固定化上で得たスペーサ基を結合した重合体粒子に実施例１と
同様にして、ウサギＩｇＧを共有結合にて固定化し、こ
の後、実施例１と全く同様に処理して、重合体粒子を０
．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）に分散させて、全
量１０ｍ１に調製し、ウサギＩｇＧを固定化した水分散
型窩分子重合体粒子分散液を得た。ウサギＩｇＧの固定
化量は、重合体粒子１ｇ当り３８■であった。

（ｄ）　　免疫学的診断試薬の調製上で得たウサギＩｇＧ固定化水分散型高分子重合体粒子
分散液を用いて、実施例１と同様にして、種々の濃度で
第４表に示すアミノカルボン酸又はアミノスルホン酸を
含有する本発明による免疫学的診断試薬を調製した。

比較のために、本発明で規定するアミノカルボン酸又は
アミノスルホン酸に代走で、添加剤として次式で示され
るｅｄｉｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＯＯＣＣＨｚ）　ＪＣＩ
Ｉ□ＣＨ□Ｎ　（ＣＨｚＣＯＯＨ）　を又はグリシンを
用いて、対照免疫学的診断試薬を調製した。

（ｅｌ　　免疫学的診断試薬の評価上で得た各種の免疫学的診断試薬について、実施例１と
同様にして活性の判定を行なった。結果を第４表に示す
。本発明による診断試薬によれば、非特異的凝集は全く
起こらないが、対照診断試薬の場合は、非特異的凝集が
顕著に認められる。

実施例３実施例１において得たウサギＩｇＧ固定化水分散型高分
子重合体粒子を用いて、トリスにてｐＨ８゜０に調製し
たアミノカルボン酸（３）を種々の濃度テ含有する重合
体粒子濃度１．２５重量％の本発明による免疫学的診断
試薬を調整した。

この免疫学的診断試薬について、実施例１と同様にして
活性の判定を行った。結果を第５表に示す。

第５表

Claims

【特許請求の範囲】

（１）免疫活性物質が固定化された水分散型高分子重合
体粒子の水性分散液からなる免疫学的診断試薬において
、上記水性分散液に一般式Ａ＿３＿−＿ｍＮ（Ｂ−ＣＯＯＨ）＿ｍ（ I ）（但し
、Ａは水素又は置換基を有していてもよいアルキル基、
Ｂは置換基を有していてもよいアルキレン基、ｍは１又
は２を示す。但し、ｍが２のとき、Ａは同時には水素で
はない。）で表わされる第２級又は第３級アミノ基を有
するアミノカルボン酸又はその塩が配合されてなること
を特徴とする免疫学的診断試薬。
（２）アミノカルボン酸又はその塩が０．０５〜３モル
／ｌの範囲の濃度で配合されてなることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。
（３）水性分散液のｐＨ調整剤としてアンモニア又は有
機アミンが配合されていることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。
（４）ｐＨが６〜９であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。
（５）免疫活性物質が固定化された水分散型高分子重合
体粒子の水性分散液からなる免疫学的診断試薬において
、上記水性分散液に一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）（但し、Ｘ及びＹは水素又は置換基を有していてもよい
アルキル基、シクロアルキル基又は相互に結合してなる
環状アミノ基残基を示し、Ｚは置換基を有していてもよ
いアルキレン基を示す。但し、Ｘ及びＹは同時には水素
ではない。）で表わされる第２級又は第３級アミノ基を
有するアミノスルホン酸又はその塩が配合されてなるこ
とを特徴とする免疫学的診断試薬。
（６）アミノスルホン酸又はその塩が０．０５〜３モル
／ｌの範囲の濃度で配合されてなることを特徴とする特
許請求の範囲第５項記載の免疫学的診断試薬。
（７）水性分散液のｐＨ調整剤としてアンモニア又は有
機アミンが配合されていることを特徴とする特許請求の
範囲第５項記載の免疫学的診断試薬。
（８）ｐＨが６〜９であることを特徴とする特許請求の
範囲第５項記載の免疫学的診断試薬。