JPH0564742B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液からなり、ラテツクス凝集反応
において非特異的凝集反応がなく、且つ、凝集反
応の判定が容易であると共に、保存安定性にすぐ
れる免疫学的診断試薬に関する。 （従来の技術） 近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の
状態の医学的診断のために、血液、尿その他の体
液中の生理活性物質が有する免疫活性を利用する
免疫学的診断方法が広く用いられている。この方
法は、免疫学的な反応を起こす抗原又は抗体のい
ずれか一方、又は両者を組合せて体液等の被検液
と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対応する
抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によ
つて、上記のような免疫活性成分の存在を決定す
る方法である。この場合、肉眼による観察を容易
にするために、一般に、抗原又は抗体は微粒子状
の担体、例えば、ラテツクス、赤血球等に担持さ
れて診断試薬とされ、このような粒子の凝集反応
を利用して、血清等の体液中の被検成分が測定さ
れる。 例えば、ラテツクスからなる診断試薬の凝集反
応について説明すると、抗原又は抗体を担持させ
たラテツクスを含有する水性分散液からなる診断
試薬を被検液と混合すると、上記抗原又は抗体に
対応する被検液中の抗体又は抗原は、ラテツクス
上の抗原又は抗体と特異的に反応し、ラテツクス
凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒子の凝
集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗体又は抗原が存在しない場合は、肉眼的に観察
し得る凝集は起こらない。このようにして、抗原
又は抗体を固定化した微粒子の凝集反応の有無に
よつて、被検液中の抗体又は抗原の存在を測定す
ることができる。 このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物
質、即ち、抗原又は抗体が微量にでも被検液中に
存在すれば、これを検出し得る高い感度と、目的
とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性を
有することが要求される。更に、長期間の保存に
よつても、高い感度及び特異性を保持することが
要求される。 このような免疫学的診断試薬としては、従来、
ポリスチレンラテツクス粒子表面に抗原及び抗体
を物理吸着により固定化してなる診断試薬や、カ
ルボキシル化ラテツクス粒子にカルボジイミド、
ジアルデヒド等を用いて共有結合により固定化し
てなる診断試薬等が提案されている。しかし、従
来のかかる診断試薬は、いずれも、血清と反応さ
せたとき、対応する抗体又は抗原を含む陽性血清
のみならず、対応する抗体又は抗原を含まない陰
性血清に対しても凝集反応を起こすことがある。
このような凝集反応は非特異的反応と呼ばれてお
り、しばしば診断を誤まらせることがある。この
ような非特異的凝集反応が起こる理由は必ずしも
明らかではないが、一つには血清中に含まれる補
体等の因子によるものと考えられる。 従つて、従来、ラテツクス粒子の非特異的凝集
を防ぐことを目的として、ラテツクス凝集反応の
有無の判定を行なう際に、血清をグリシン等の緩
衝液で希釈したり、或いは血清中の補体を失活さ
せる非働化処理を施すことが行なわれている。し
かし、このような処理によつては、非特異的凝集
を十分に抑制することは困難であり、また、手間
を要して、診断に時間がかかるという問題があ
る。 このようなラテツクス診断試薬における問題を
解決するために、従来より、非特異的凝集反応を
抑制することを目的として、添加剤を添加するこ
とが一般に行なわれており、かかる添加剤とし
て、例えば、グリコール類や、ゼラチン、アルブ
ミン等のタンパク質、或いはポリアニオン等が知
られている。しかし、これらの添加剤の効果は一
般に十分ではないので、近年、添加剤として、例
えば、シヨ糖及び塩化コリン（特開昭54−026327
号公報）、グアニジン、グアニジン塩酸塩、グア
ニジニウムチオシアン酸塩、尿素等を代表とする
ケイオトロピツク剤（特開昭56−158947号公報）、
Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミドやジ低級アルキルスル
ホキシド（特開昭55−160853号公報）等が提案さ
れているが、これらの添加剤も非特異的凝集を抑
制する効果は十分ではない。 （発明の目的） 本発明者らは、免疫学的診断試薬における上記
した問題を解決するために鋭意研究した結果、免
疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体粒
子水性分散液にジメチルスルホンを共存させるこ
とにより、非特異的凝集が起こらず、且つ、凝集
反応の有無の判定が容易であると共に、保存安定
性にすぐれる免疫学的診断試薬を得ることができ
ることを見出して、本発明に至つたものである。 従つて、本発明は、血清を希釈することなく、
しかも、非働化処理も行なわずに、非特異的凝集
が抑制され、且つ、凝集反応の有無の判定が容易
であると共に、保存安定性にすぐれる免疫学的診
断試薬を提供することを目的とする。 （発明の構成） 本発明による免疫学的診断試薬は、免疫活性物
質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性
分散液中にジメチルスルホンが配合されてなるこ
とを特徴とする。 本発明による免疫学的診断試薬において、免疫
活性物質を固定化するための担体である水分散型
高分子重合体粒子の平均粒径は、好ましくは0.03
〜2μm、特に好ましくは0.1〜1μmである。平均
粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定化した
水分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による
凝集を肉眼で観察することが困難であり、一方、
大きすぎるときは、重合体粒子に安定な分散状態
を保持させるのが困難となるからである。また、
重合体粒子の比重は、0.9〜1.5の範囲にあること
が好ましく、更に、後述するように、免疫活性物
質を固定化した後の比重が1.0〜1.3の範囲にある
ことが好ましい。重合体粒子が免疫活性物質の固
定化の前後に上記範囲よりも小さい比重を有する
ときは、重合体粒子がその水性分散液における水
性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るように
なり、一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子
が分散液の水性媒体中に沈降し、凝集しやすくな
つて、同様に分散安定性に劣るようになるからで
ある。 本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、通常、不飽和二重結合を有する単量体の一
又は二以上の乳化重合によつて調製される。かか
る単量体としては、例えば、エチレン、プロピレ
ン等のオレフイン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビ
ニル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチ
レン、クロロスチレン等のスチレン系単量体、ア
クリル酸メチル等のアクリル酸エステル系単量
体、メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エステ
ル系単量体、ブタジエン等のジエン系単量体等が
用いられる。 また、これら単量体の単独重合体又は共重合体
を改質するために、アクリル酸、メタクリル酸、
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリ
ルアミド等の単量体を前記単量体と共重合させる
こともできる。 更に、上記単量体と共に、単量体成分として多
官能性単量体を内部架橋剤として乳化共重合させ
て、架橋させた水分散型高分子重合体粒子を得る
こともできる。内部架橋剤は、重合体に架橋構造
を導入するので、診断試薬中に含まれれば好まし
くない水溶性重合体の生成を抑制すると共に、得
られる重合体粒子のガラス転移温度を高めること
ができる。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒
体中での分散安定性を高めるのに効果がある。 かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例
えば、脂肪族多価アルコールのポリ（メタ）アク
リレートが好ましく用いられる。具体例として、
例えば、エチレングリコールジメタクリレート、
ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエ
チレングリコールジメタクリレート、ジプロピレ
ングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパ
ントリメタクリレート、トリメチロールプロパン
トリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等が好ましく用いられる。また、
ジビニルベンゼンやＮ，N′−メチレンビスアク
リルアミド等も内部架橋剤として用いることがで
きる。 尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子重合体粒子が融着、凝集を起こさ
ないように、所要のガラス転移点を有するように
選ばれるがガラス転移点は、診断試薬の保存温度
及び診断試薬の使用温度を考慮して、通常、10℃
以上、好ましくは室温以上である。 免疫活性物質が共有結合にて上記水分散型高分
子重合体粒子に固定化される場合は、重合体粒子
はその表面に官能基を有することが必要である。
このような官能基としては、例えばカルボキシル
基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ヒドラジ
ド基等を挙げることができる。従つて、これらの
官能基を有する重合体粒子を調製するには、単量
体成分として、例えば、アクリル酸、メタクリル
酸のようなカルボキシル基を有する単量体、例え
ば、ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロ
キシメチルメタクリレートのような水酸基を有す
る単量体、例えば、グリシジルメタクリレートの
ようなグリシジル基を有する単量体を、必要に応
じて、他の共重合性単量体と乳化共重合させるこ
とによつて得ることができる。 また、所要の単量体成分を重合させた後、得ら
れた水分散型高分子重合体粒子に官能基を導入す
ることもできる。このための方法としては、例え
ば、アクリル酸エステルを単量体成分として重合
させて得た重合体粒子を加水分解することによ
り、カルボキシル基を有する重合体粒子を得るこ
とができる。また、アミノ基やヒドラジド基を有
する水分散型高分子重合体粒子を調製するには、
例えば、アクリルアミドのようなアミド基を有す
る単量体、又はアクリル酸メチルのようなメチル
エステル基を有する単量体をそれぞれ他の単量体
と乳化共重合し、得られた共重合体中のアミド基
をホフマン分解し、又はメチルエステル基をヒド
ラジンと反応させることにより得ることができ
る。 しかし、このように官能基を有する水分散型高
分子重合体粒子に免疫活性物質を共有結合にて固
定化するための方法は、特に制限されず、従来よ
り知られている任意の方法によることができる。
例えば、好ましい方法の一つとして、水溶性カル
ボジイミドの存在下に、免疫活性物質の有するア
ミノ基と水分散型高分子重合体粒子の有するカル
ボキシル基とを反応させ、アミド結合を形成させ
ることにより結合することができる。水溶性カル
ボジイミドとしては、例えば、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエ
ンスルホネート等を挙げることができる。このよ
うな水溶性カルボジイミドを用いる免疫活性物質
の共有結合による重合体粒子への固定化は、従来
より知られている通常の条件下で行なうことがで
き、重合体粒子の水性分散液に免疫活性物質と共
に適宜量、例えば、水性分散液の単位容量当りに
0.01〜10mg／mlとなるように水溶性カルボジイミ
ドを添加し、通常の条件、例えばPHを４〜10に保
持して、５〜60℃程度の温度で数分乃至数十時
間、通常、１〜５時間程度反応させればよい。 また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン
法により、また、アミノ基であるときはジアルデ
ヒドと反応させ、これら官能基を活性化すること
によつて、タンパク質の共有結合による固定化の
常法を用いて固定化することができる。 更に、本発明による免疫学的診断試薬において
は、水分散型高分子重合体粒子に免疫活性物質を
共有結合によつて固定化するに際して、必要に応
じて、免疫活性物質の重合体粒子上での自由度を
高めるために、重合体粒子と免疫活性物質とをス
ペーサ基を介在させて共有結合にて結合させるこ
とができる。このスペーサ基は、予め重合体粒子
に結合させ、この後にこのスペーサ基と免疫活性
物質とを結合させてもよく、或いはスペーサ基を
予め免疫活性物質に結合させ、これを重合体粒子
に結合させてもよい。更に、必要に応じて、重合
体粒子及び免疫活性物質の両方に予めスペーサ基
を結合させ、これらを相互に結合させることもで
きる。 スペーサ基として用い得る化合物は、少なくと
も二官能性の有機化合物であり、具体例として、
例えば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレ
ンジアミン、キシリレンジアミン等のジアミン
類、グリシン、β−アミノプロピオン酸、γ−ア
ミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等のアミノアル
キルカルボン酸、アミノ酸類等が好ましく用いら
れるが、これらに限定されるものではない。 尚、本発明においては、水分散型高分子重合体
粒子に免疫活性物質を固定化するに際して、前述
したような共有結合法によらずに、物理吸着法や
イオン結合法によつて重合体粒子に固定してもよ
いことはいうまでもない。 本発明において用いる免疫活性物質としては、
特に制限はなく、抗原、抗体及びハプテン等いず
れを用いてもよい。例えば、ヒト及び動物免疫グ
ロブリン、変性免疫グロブリン、α−フエトプロ
テイン、Ｃ反応性タンパク（CRP）や肝炎ウイ
ルス関連抗原、風疹HA抗原等の各種ウイルス抗
原、トキソプラズマ、マイコプラズマ、梅毒トレ
ポネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生物
抗原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパ
ク成分、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（HCG）等の各種ホルモン等が挙げられ、ま
た、これらの抗原成分に対する抗体等も使用する
ことができる。 本発明による免疫学的診断試薬は、上記のよう
に固定化した免疫活性物質の失活が起こらないよ
うに、水分散型高分子重合体粒子が適当なPH及び
濃度のグリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液等の緩衝液に分散されていると共に、この重
合体粒子の水性分散液に粒子の非特異的凝集を抑
制するための添加剤としてジメチルスルホンが配
合されてなる。 本発明による免疫学的診断試薬において、上記
緩衝液の濃度は、通常、0.005〜0.2Mの範囲が適
当であり、好ましくは0.01〜0.1Mの範囲である。
また、緩衝液のPHは、水分散型高分子重合体粒子
の分散安定性及び抗原抗体反応の活性を考慮し
て、通常、６〜９、好ましくは７〜8.5の範囲で
ある。また、診断試薬における感作重合体粒子の
濃度は、通常、0.01〜５重量％の範囲であるが、
好ましくは0.1〜３重量％の範囲である。 ジメチルスルホンは、免疫活性物質を固定化し
た水分散型高分子重合体粒子の水性分散液におい
て、３〜15重量％、好ましくは５〜10重量％の濃
度で含有される。水性分散液におけるジメチルス
ルホン濃度が３重量％よりも少ないときは、陰性
血清に対する非特異的凝集の抑制効果が乏しく、
一方、濃度が15重量％を越えるときは、却つて陽
性血清に対する特異的凝集が抑制されることとな
るからである。尚、本発明による免疫学的診断試
薬には、防腐効果を与えるために、アジ化ナトリ
ウム等の防腐剤を添加してもよい。 本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫
学的診断は、例えば、診断試薬と被検液とをガラ
ス板又はプラスチツク板の窪み又は平面板上又は
マイクロプレート上において混合し、肉眼又は顕
微鏡観察によつて、重合体粒子の凝集の有無を判
定することにより行なわれる。また、凝集の有無
を光学的な変化として判定することもできる。 （発明の効果） 以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液からなると共に、ジメチルスル
ホンを含有し、この結果、その理由は必ずしも明
らかではないが、重合体粒子の非特異的凝集が完
全に阻止されるので、診断に際して、血清を緩衝
液で希釈したり、或いは非働化処理しなくとも、
迅速に正確な判定を行なうことができる。更に、
本発明による診断試薬は、例えば、血清と均一に
混じりやすく、凝集の有無判定が容易である。ま
た、従来の診断試薬に比較して、その保存安定性
に著しくすぐれる。 また、免疫活性物質の担体として用いる水分散
型高分子重合体粒子は、粒径を含む品質が均一で
あるうえに、それ自体は免疫活性をもたないの
で、固定化操作が容易であると共に、固定化重合
体粒子は高い検出感度と高い特異性とを有し、か
くして、高精度での診断を可能とする診断試薬を
与える。 （実施例） 以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 実施例 １ (a) 水分散型高分子重合体粒子の調製 500ml容量の四つ口重合フラスコ内にメタクリ
ル酸メチル7.7ｇ、メタクリル酸イソブチル7.7
ｇ、アクリル酸1.0ｇ、メタクリロニトリル2.8ｇ
及びトリエチレングリコールジメタクリレート
0.7ｇ、蒸留水380ｇ及び過硫酸カリウム0.1ｇを
仕込み、窒素気流下、75℃の温度で攪拌速度
190rpmで攪拌しつつ、８時間重合を行なつた。
重合率99％にて平均粒径0.28μmの水分散型高分
子重合体粒子を含む水性分散液を得た。 この重合体粒子の水性分散液を最初、蒸留水に
て４回遠心分離し、次いで、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）にて２回遠心分離して、水相中の水溶性
高分子を除去し、重合体粒子を精製した後、この
重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）に固
形分が５重量％となるように再分散させた。 (b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合 上で得た水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液100mlとε−アミノカプロン酸水溶液（0.02M）
100mlとを混合し、1N水酸化ナトリウム水溶液
にてPH7.5に調製した。0.01Mホウ酸緩衝液（PH
7.5）に溶解させた１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液
（25mg／ml）20mlを上記水性分散液に加え、室温
で３時間、攪拌下に反応させた。一夜、冷蔵庫に
放置した後、0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）にて
３回遠心洗浄して、スペーサ基を結合した重合体
粒子を得、これを0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）
に固形分５重量％になるように再分散させた。 (c) ウサギIgGの固定化 上で得たスペーサ基を有する水分散型高分子重
合体粒子の水性分散液5ml、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）2ml及び蒸留水11mlを混合し、これに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（５mg／ml）2mlを
加え、10分後にウサギIgG水溶液（５mg／ml）を
5ml添加し、15℃で２時間反応させた。次に、反
応混合物中の余剰の水溶性カルボジイミドを消費
するために、10重量％Ｌ−アルギニン水溶液（PH
7.5）5mlを加え、１時間インキユベートした。次
いで、0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）にて遠心洗
浄を３回行なつた後、0.01Mホウ酸緩衝液（PH
8.2）に分散させて全量10mlに調整し、かくして、
ウサギIgGを前記スペーサ基を介して共有結合に
て固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分
散液を得た。 (d) 免疫学的診断試薬の調製 ジメチルスルホンを0.01Mホウ酸緩衝液（PH
8.2）に６，10，15，20及び30重量％濃度にそれ
ぞれ溶解し、1N塩酸水溶液でPH8.2に調整した。
この水溶液と前記したウサギIgG固定化粒子分散
液とを１：１容に混合し、本発明による免疫学的
診断試薬を得た。 (e) 免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質としてウサギIgGを固定化した本
試薬は、リウマチ因子検出試薬として用いること
ができる。 この診断試薬とリウマチ因子陽性血清及び陰性
血清を原液のままそれぞれガラス板上にて等容量
混合攪拌し、２分後に凝集状態を肉眼判定した。
その結果を第１表に示す。本発明による診断試薬
においては、非特異的凝集反応が起こらないが、
ジメチルスルホンを含有しない対照診断試薬で
は、非特異的凝集が顕著である。

【表】 また、ジメチルスルホン濃度が7.5重量％であ
る上記リウマチ診断試薬について、10℃の温度に
て経日安定性を調べた。評価方法は上記の例と同
である。結果を第２表に示す。本発明の診断試薬
によれば、６か月後にも均一な外観を有すると共
に、陰性血清に対して何ら非特異的な凝集を起こ
さず、保存安定性にすぐれることが明らかであ
る。しかし、ジメチルスルホンを含有しない対照
診断試薬によれば、早期に沈澱が生じ、また、非
特異的凝集が認められる。

【表】

【表】 実施例 ２ (a) 水分散型高分子重合体粒子の調製 500ml容量の四つ口重合フラスコ内にメタクリ
ル酸メチル50ｇ、アクリロニトリル８ｇ、アクリ
ル酸2.5ｇ、トリエチレングリコールジメタクリ
レート３ｇ、蒸留水340ｇ及び過硫酸カリウム0.3
ｇを仕込み、窒素気流下、温度75℃で攪拌速度
190rpmで攪拌しつつ、８時間重合を行なつて、
重合率100％にて平均粒径0.45μmの水分散型高分
子重合体粒子を含む水性分散液を得た。 この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得
られた重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）
に固形分濃度５重量％となるように分散させて、
水分散型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。 (b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合 実施例１と同様にして、上で得た重合体粒子に
スペーサ基を結合させた。 (c) 抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体の固定化 上で得たスペーサ基を結合した重合体粒子５重
量％を含む水性分散液5ml、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）2ml及び蒸留水11mlを混合し、これに１
−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩水溶液（５mg／ml）2mlを加え
た後、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体溶液
（抗HCG、５mg／ml）を5ml添加し、15℃で３時
間反応を行なつた。 この後、実施例１と全く同様に処理して、重合
体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）に分散さ
せて、全量10mlに調製し、抗HCG固定化水分散
型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。 (d) 免疫学的診断試薬の調製 実施例１と同様の方法により、ジメチルスルホ
ン7.5％濃度の免疫学的診断試薬を得た。 (e) 免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質として抗HCGを固定化した本試
薬は妊娠診断試薬として用いることができる。 この診断試薬と血清を原液のままガラス板上に
て等量混合し、３〜５分後の凝集の有無を判定し
たところ、血清1ml中に１国際単位のHCGがあ
れば凝集が起こり、容易に且つ正確に妊娠の有無
を判定することができた。非特異的凝集は全く起
こらなかつた。 他方、ジメチルスルホンを含有しない診断試薬
によれば、妊娠していないヒト血清の場合も、疑
陽性と判定される非特異的凝集が生じた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重
   合体粒子の水性分散液中にジメチルスルホンが配
   合されてなることを特徴とする免疫学的診断試
   薬。