JPS61155957A - 免疫学的診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液からなり、ラテックス凝集反応において非特異的凝集
反応がなく、且つ、凝集反応の判定が容易であると共に
、保存安定性にすぐれる免疫学的診断試薬に関する。

（従来の技術） 近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の状態の医
学的診断のために、血液、尿その他の体液中の生理活性
物質が有する免疫活性を利用する免疫学的診断方法が広
く用いられている。この方法は、免疫学的な反応を起こ
す抗原又は抗体のいずれか一方、又は両者を組合せて体
液等の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対
応する抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によって、
上記のような免疫活性成分の存在を測定する方法である
。この場合、肉眼による観察を容易にするために、一般
に、抗原又は抗体は微粒子状の担体、例えば、ラテック
ス、赤血球等に担持されて診断試薬とされ、このような
粒子の凝集反応を利用して、血清等の体液中の被検成分
が測定される。

例えば、微粒子がラテックスからなる診断試薬の凝集反
応について説明すると、抗原又は抗体を担持させた微粒
子を含有する水性分散液からなる診断試薬を被検液と混
合すると、上記抗原又は抗体に対応する被検液中の抗体
又は抗原は、微粒子上の抗原又は抗体と特異的に反応し
、ラテックス凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒
子の凝集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗体又は抗原が存在しない場合は、肉眼的に観察し得る
凝集は起こらない、このようにして、抗原又は抗体を担
持させた微粒子の凝集反応の有無によって、被検液中の
抗体又は抗原の存在を決定することができる。

このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質、即ち、
抗原又は抗体が微量にでも被検液中に存在すれば、これ
を検出し得る高い感度と、目的とする免疫活性物質との
み反応する高い特異性を有することが要求される。更に
、長期間の保存によっても、高い検出感度及び特異性を
保持することが要求される。

このような免疫学的診断試薬としては、従来、ポリスチ
レンラテックス粒子表面に抗原及び抗体を物理吸着によ
り固定化してなる診断試薬や、カルボキシル化ラテック
ス粒子にカルボジイミド、ジアルデヒド等を用いて共有
結合により固定化してなる診断試薬等が提案されている
。しかし、従来のかかる診断試薬は、いずれも、血清と
反応させたとき、対応する抗体又は抗原を含む陽性血清
のみならず、対応する抗体又は萩原を含まない陰性血清
に対しても凝集反応を起こすことがある。

このような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれており
、しばしば診断を誤まらせることがある。

このような非特異的凝集反応が起こる理屯は必ずしも明
らかではないが、一つには血清中に含まれる補体等の因
子によるものと考えられる。

従って、従来、ラテックス粒子の非特異的凝集を防ぐこ
とを目的として、ラテックス凝集反応の有無の判定を行
なう際に、血清をグリシン等の緩衝液で希釈したり、或
いは血清中の補体を失活させる非動化処理を施すことが
行なわれている。しかし、このような処理によっては、
非特異的凝集を十分に抑制することは困難であり、また
、手間を要して、診断に時間がかかるという問題がある
。

このような免疫学的診断試薬における問題を解決するた
めに、従来より、非特異的凝集反応を抑制することを目
的として、診断試薬に添加剤を添加することが一般に行
なわれており、かかる添加剤として、例えば、グリコー
ル類や、ゼラチン、アルブミン等のタンパク買、或いは
ポリアニオン等が知られている。しかし、これらの添加
剤の効果は一般に十分ではないので、近年、添加剤とし
て、例えば、ショ糖及び塩化コリン（特開昭５４−０２
６３２７号公報）　、Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミドやジ低
級アルキルスルホキシド（特開昭５５−１６０８５３号
公報）等が提案されている。

更に、近年になって、種々の無機塩類が非特異的凝集を
抑制する効果をもつ添加剤として提案されている。例え
ば、特開昭５６−１５８９４７号公報には、グアニジン
、グアニジン塩酸塩、グアニジニウムチオシアン酸塩、
尿素等を代表例とするケイオトロピック　（ｃｈａｏｔ
ｒｏｐｉｃ）剤と共に、似ケイオトロピック剤として塩
化リチウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリ
ウム、ヨウ化リチウムのようなハロゲン化アルカリ金属
や、塩化カルシウムのようなハロゲン化金属が記載され
ており、また、特開昭５７−３５７５４号公報にも同様
にハロゲン化アルカリ金属が記載されている。

しかし、ハロゲン化アルカリ金属は、一般に陰性血清に
対する非特異的凝集が顕著であり、また、塩化カルシウ
ムも陰性血清に対する非特異的凝集が顕著であるのみな
らず、診断に際して、例えば、陰性血清と混合して数分
後の初期の凝集の程度が疑陽性であるとき、時間の経過
につれて非特異的凝集が強くなり、凝集の程度が時間に
よって変動するので、正確な診断を行なうことが不可能
である。更に、塩化カルシウムを添加剤として含有する
免疫学的診断試薬は、長期間にわたって保存するとき、
診断試薬に沈殿を生じ、使用に際しては診断試薬を十分
に震盪して均一にする必要がある等、保存性や使用性に
劣る。このように、従来、種々の無機塩が添加剤として
提案されているが、尚、非特異的凝集を抑制する効果が
劣ると共に、診断試薬が保存安定性に劣る問題がある。

（発明の目的） 本発明者らは、免疫学的診断試薬における上記の問題を
解決するために鋭意研究した結果、共有結合により免疫
活性物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性
分散液からなる免疫学的診断試薬において、これに臭化
カルシウムを共存させることにより、前記無機塩類系の
添加剤を含めて、従来より知られている添加剤に比較し
て、非特異的凝集を抑制する効果に格段にすぐれ、且つ
、凝集反応の有無が容易であると共に、保存安定性にも
格段にすぐれる免疫学的診断試薬を得ることができるこ
とを見出して、本発明に至ったものである。

従って、本発明は、血清を希釈することなく、しかも、
非動化処理も行なわずに、非特異的凝集反応が抑制され
、且つ、凝集反応の有無の判定が容易であると共に、保
存安定性にすぐれた免疫学的診断試薬を提供することを
目的とする。

（発明の構成） 本発明による免疫学的診断試薬は、免疫活性物質が共有
結合にて固定化された水分散型高分子重合体粒子の水性
分散液からなる免疫学的診断試薬において、上記水性分
散液に臭化カルシウムが配合されてなることを特徴とす
る。

本発明による免疫学的診断試薬において、免疫活性物質
を固定化するための担体である水分散型高分子重合体粒
子の平均粒径は、好ましくは０．０３〜２μｍ、特に好
ましくは０．１〜１μｍである。

平均粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定化した水
分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による凝集を肉
眼で観察することが困難であり、一方、大きすぎるとき
は、重合体粒子に安定な分散状態を保持させるのが困難
となるからである。また、重合体粒子の比重は、０．９
〜１．５の範囲にあることが好ましく、更に、後述する
ように、免疫活性物質を固定化した後の比重が１．０〜
１．３の範囲にあることが好ましい０重合体粒子が免疫
活性物質の固定化の前後に上記範囲よりも小さい比重を
有するときは、重合体粒子がその水性分散液における水
性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るようになり、
一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子が分散液の水
性媒体中に沈降し、凝集しやすくなって、同様に分散安
定性に劣るようになるからである。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、後
述するように、免疫活性物質を共有結合にて結合するた
めの官能基を有することが必要である。また、所謂スペ
ーサ基を介して重合体粒子に免疫活性物質を固定化する
場合にも、重合体粒子は官能基を有することが必要であ
る。かかる官能基としては、例えば、カルボキシル基、
アミノ基、水酸基、グリシジル基、ヒドラジド基等が好
ましい。従って、例えば、カルボキシル基を有する水分
散型高分子重合体粒子の水性分散液は、アクリル酸、メ
タクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、フ
マル酸、モノアルキルマレイン酸、モノアルキルフマル
酸、モノアルキルイタコン酸等の一塩基酸や多塩基酸等
のようなカルボキシル基を有するビニル単量体を必要に
応じてこれら単量体とラジカル共重合性を有するその他
の単量体と乳化共重合させることにより得ることができ
る。また、例えば、水酸基やグリシジル基を有する水分
散型高分子重合体粒子の水性分散液は、例えば、ヒドロ
キシエチルアクリレート、２−ヒドロキシメチルメタク
リレートのような水酸基を有する単量体、又はグリシジ
ルメタクリレートのようなグリシジル基を有する単量体
を必要に応じて他のラジカル共重合性単量体と乳化共重
合させることによって得ることができる。

上記したラジカル共重合性単量体としては、例えば、エ
チレン、プロピレン等のα−オレフィン系単量体、酢酸
ビニル、塩化ビニル等のビニル系ｊＢｔ体、スチレン、
メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系単量体
、アクリル酸メチル等のアクリル酸エステル系単量体、
メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エステル系単量体
、ブタジェン、イソプレン等のジエン系単量体、アクリ
ロニトリル、メタクリレートリル、アクリルアミド、メ
タクリルアミド等の単量体を挙げることができる。

また、所要の単量体成分を重合させた後、得られた水分
散型高分子重合体粒子に官能基を導入することもできる
。このための方法としては、例えば、アクリル酸エステ
ルを単量体成分として重合させて得た重合体粒子を加水
分解することにより、カルボキシル基を有する重合体粒
子を得ることができる。

また、アミノ基やヒドラジド基を有する水分散型高分子
重合体粒子を調製するには、例えば、アクリルアミドの
ようなアミド基を有する単量体、又はアクリル酸メチル
のようなメチルエステル基を有する単量体をそれぞれ他
の単量体と乳化共重合し、得られた共重合体中のアミド
基をホフマン分解し、又はメチルエステル基をヒドラジ
ンと反応させることにより得ることができる。

更に、上記単量体と共に、単量体成分として多官能性単
量体を内部架橋剤として乳化共重合させて、架橋させた
水分散型高分子重合体粒子を得ることもできる。内部架
橋剤は、重合体に架橋構造を導入するので、診断試薬中
に含まれれば好ましくない水溶性重合体の生成を抑制す
ると共に、得らりる重合体粒子のガラス転移温度を高め
ることができる。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中で
の分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートが好ま
しく用いられる。具体例として、例えば、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタ
クリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート
、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１．３−
ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリ
メタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレ
ート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等が
好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、Ｎ
’−メチレンビスアクリルアミド等も内部架橋剤として
用いることができる。

尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる水分散型
高分子重合体粒子が免疫活性物質を固定化した診断試薬
として、保存時に融着、凝集を起こさないように、所要
のガラス転移点を有するように選ばれる。重合体粒子の
ガラス転移点は、診断試薬の保存温度及び診断試薬の使
用温度を考慮して、好ましくは１０℃以上、特に室温以
上である。

本発明による免疫学的診断試薬においては、免疫活性物
質は、水分散型高分子重合体粒子に共有結合にてスペー
サ基を介して固定化されていることが好ましい。即ち、
重合体粒子に共有結合によってスペーサ基が結合され、
このスペーサ基に共有結合によって免疫活性物質が固定
化されているのが好ましい。スペーサ基を介さずに、直
接に免疫活性物質を重合体粒子に固定化し、この水性分
散液に臭化カルシウムを添加するときは、免疫活性物質
によっては、その活性を殆ど失ない、陽性血清に対して
も凝集反応を示さない場合があるからである。

上記スペーサ基として用い得る化合物は、少なくとも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
るものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖基を
有する二官能性の有機化合物が好ましい。このようなス
ペーサ基として機能する化合物の具体例として、例えば
、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、
キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−ア
ミノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロ
ン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカルボ
ン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギニ
ン、グリシルグリシルグリジン等のアミノ酸類等が好ま
しく用いられるが、これらに限定されるものではない。

このスペーサ基は、予め重合体粒子に結合させ、この後
にこのスペーサ基と免疫活性物質とを結合させてもよく
、或いはスペーサ基を予め免疫活性物質に結合させ、こ
れを重合体粒子に結合させてもよい。更に、必゛　要に
応じて、重合体粒子及び免疫活性物質の両方に予めスペ
ーサ基を結合させ、これらを相互に結合させることもで
きる。

但し、免疫活性物質を共有結合にて直接に固定化した水
分散型高分子重合体粒子の水性分散液に所定濃度の臭化
カルシウムを配合したとき、免疫活性物質が所期の活性
を有する場合には、水分散型高分子重合体粒子に免疫活
性物質を直接に固定化してもよいのはいうまでもない。

前記した官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に直
接に免疫活性物質を共有結合にて固定化し、又は重合体
粒子にスペーサ基を結合し、また、このスペーサ基に免
疫活性物質を共有結合にて固定化するための方法は、特
に制限されず、従来より知られている任意の方法による
ことができる。

例えば、好ましい方法の一つとして、架橋剤として水溶
性カルボジイミドを用いる方法を挙げることができる。

例えば、ジアミンをスペーサ基として用いる場合であれ
ば、水溶性カルボジイミドの存在下に、ジアミンの有す
るアミノ基と水分散型高分子重合体粒子の有するカルボ
キシル基とを反応させ、アミド結合を形成させることに
より、スペーサ基を重合体粒子に結合させ、次いで、同
様に水溶性カルボジイミドを用いてこのスペーサ基の有
するアミノ基に免疫活性物質を共有結合にて固定化する
ことができる。

かかる方法において用いる水溶性カルボジイミドとして
は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−
ｐ−１−ルエンスルホネート等を挙げることができる。

このような水溶性カルボジイミドを用いて、スペーサ基
を介して、又は介さずして直接に、共有結合によって免
疫活性物質を重合体粒子に固定化するには、従来より知
られている通常の方法及び条件によることができる。例
えば、スペーサ基を用いる場合であれば、重合体粒子の
水性分散液にスペーサ基と共に適宜量、例えば、水性分
散液の単位容量当りに０．０１〜１０ｍｇ／ｎ＋１とな
るように水溶性カルボジイミドを添加し、通常の条件、
例えばｐＨを４〜ｌＯに保持して、５〜６０℃程度の温
度で数分乃至数十時間、通常、１〜５時間程度反応させ
ればよい。　　。

次いで、このスペーサ基を結合させた重合体粒子に同様
にして免疫°活性物質を固定化すればよい。

また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン法により
、また、アミノ基であるときはジアルデヒドと反応させ
、これら官能基を活性化することによって、スペーサ基
を結合させ、次いで、上記と同様にして免疫活性物質を
重合体粒子に共有結合にて固定化することができる。ま
た、重合体粒子に直接に免疫活性物質を固定化すること
もできる。

本発明において用いる免疫活性物質としては、特に制限
はなく、抗原、抗体及び／％ブテン等いずれを用いても
よい。例えば、ヒト及び動物免疫グロブリン、変性免疫
グロブリン、α−フェトプロティン、Ｃ反応性タンパク
（ＣＲＰ）や肝炎ウィルス関連抗原、風疹ＨＡ抗原等の
各種ウィルス抗原、トキソプラズマ、マイコプラズマ、
梅毒トレボネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生
物抗原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパク成
分、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ
）等の各種ホルモン等が挙げられ、また、これらの抗原
成分に対する抗体等も使用することができる。

本発明による免疫学的診断試薬は、上記のように固定化
した免疫活性物質の失活が起こらないように、水分散型
高分子重合体粒子が適当なｐＨ及び濃度のグリシン緩衝
液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液に分散され
ていると共に、この重合体粒子の水性分散液に粒子の非
特異的凝集を抑制するための添加剤として臭化カルシウ
ムが配合されてなる。

臭化カルシウムは、免疫活性物質を固定化した水分散型
高分子重合体粒子の水性分散液において、０．０１〜１
．５モル／ｌ、好ましくは０．１〜１．２５モル／１の
濃度で含有される。水性分散液における臭化カルシウム
の濃度が０．０１モル／ｌよりも少ないときは、陰性血
清に対する非特異的凝集の抑制効果が乏しく、一方、濃
度が１．５モル／１を越えるときは、却って陽性血清に
対する特異的凝集が抑制されることとなるからである。

更に、本発明による免疫学的診断試薬において、上記緩
衝液の濃度は、通常、ｏ、　ｏ　ｏ　ｓ〜０．２Ｍの範
囲が適当であり、好ましくは０．０１〜０．１　Ｍの範
囲である。また、緩衝液のｐｎは、水分散型高分子重合
体粒子の分散安定性及び抗原抗体反応の活性を考慮して
、通常、６〜９、好ましくは７〜８．５の範囲である。

また、診断試薬における重合体粒子の濃度は、通常、０
．０１〜５重量％の範囲であるが、好ましくは０．１〜
３重量％の範囲である。尚、本発明による免疫学的診断
試薬には、防腐効果を与えるために、アジ化ナトリウム
等の防腐剤を添加してもよい。

本発明による免疫学的診断試薬は、臭化カルシウムを緩
衝液に溶解含有させ、ｐＨを調整した後、免疫活性物質
を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液に
添加混合し、必要に応じて更にｐＨを調整することによ
り得ることができる。

本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫学的診断
は、例えば、診断試薬と被検液とをガラス板又はプラス
チック板の窪み又は平面板上又はマイクロプレートにお
いて混合し、肉眼又は顕微鏡観察によって、重合体粒子
の凝集の有無を判定することにより行なわれる。また、
凝集の有無を光学的な変化として判定することもできる
。

（発明の効果） 以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、免疫活性
物質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液からなると共に、臭化カルシウムを含有し、この結果
、その理由は必ずしも明らかではないが、重合体粒子の
非特異的凝集が完全に阻止されるので、診断に際して、
血清を緩衝液で希釈したり、或いは非動化処理しなくと
も、迅速に正確な判定を行なうことができる。更に、本
発明による診断試薬は、例えば、ガラス板上で血清と均
一に混じりやすく、また、流動性にすぐれるので、凝集
の有無判定が容易で且つ正確である。

また、診断試薬が臭化カルシウムを含むために、その比
重が大きくなって、粒子の比重に近くなるためとみられ
るが、従来の診断試薬に比較して、長期間にわたって何
らの沈殿を生じることなく、重合体粒子の均一分散性が
保持され、その保存安定性に著しくすぐれる。

また、免疫活性物質の担体として用いる水分散型高分子
重合体粒子は、粒径を含む品質が均一であるうえに、そ
れ自体は免疫活性をもたないので、固定化操作が容易で
あると共に、固定化粒子は高い検出感度と高い特異性と
を有し、かくして、高精度での診断を可能とする診断試
薬を与える。

（実施例） 以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。尚、以
下においては、重合体粒子に免疫活性物質を固定化した
後、必要に応じて濾紙（隘５）にて濾過し、得られた分
散液に添加剤を添加して、診断試薬とした。

実施例１ （ａ）　　水分散型合成高分子重合体粒子の調製メタク
リル酸メチル８．０ｇ、メタクリル酸イソブチル５．０
ｇ、アクリル酸１．０ｇ、メタクリロニトリル３．０ｇ
及びトリエチレングリコールジメタクリレート０．７　
ｇを蒸留水３７０ｇに加え、更に蒸留水１０ｇに過硫酸
カリウム０．１ｇを溶解させた重合開始剤水溶液を加え
た後、窒素気流下、７５℃の温度で攪拌速度１９０ｒｐ
ｍで攪拌しつつ、８時間重合を行なった。重合率９９％
にて平均粒径０．３０ｐｍの水分散型高分子重合体粒子
を含む水性分散液を得た。

この重合体粒子の水性分散液を最初、蒸留水にて４回遠
心洗浄し、次いで、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，
５）にて２回遠心洗浄して、水相中の水溶性高分子を除
去し、重合体粒子を精製した後、この重合体粒子を０．
０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐ）Ｉ　７．５　）に固形分が５
重量％となるように再分散させた。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合上で得た水
分散型高分子重合体粒子の水性分散ｆｉ１００ｎ＋１と
ε−アミノカプロン酸水溶液（０，０２Ｍ）１００ｍｌ
とを混合し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７，
５に調製した。０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ρ）１７．５
）に溶解さ妊た１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２５ｍｇ／ｍ
ｌ）　２０ｍ夏を上記水性分散液に加え、室温で３時間
、攪拌下に反応させた。−夜、冷蔵庫に放置した後、０
．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）にて３回遠心洗浄
して、スペーサ基を結合された重合体粒子を得、これを
０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）に固形分５重量
％になるように再分散させた。

（Ｃ）　　ウサギＩｇＧの固定化 上で得たスペーサ基を有する水分散型高分子重合体粒子
の水性分散液５ｍｌ、Ｑ、ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８
，２）　２ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混合し、これに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを加え、
１０分後にウサギｒｇｃ水溶液（５ｎ＋ｇ／ｒａ　１　
）を５ｍｌ添加し、１５℃で２時間反応させた。

次に、反応混合物中の余剰の水溶性カルポジ゛イミドを
消費するために、１０重量％Ｌ−アルギニン水溶液（ｐ
Ｈ７，５）　５ｍｌを加え、１時間インキュベートした
。次いで、０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８゜２）にて
遠心洗浄を３回行なった後、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，２）に分散させて全量１０ｍ１に調整し、かく
して、ウサギＩｇＧを前記スペーサ基を介して共有結合
にて固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液
を得た。固定化量は重合体粒子１ｇ当り約５０＋ｗｇで
あった。

（ｄ）　　免疫学的診断試薬の調製 種々の量の臭化カルシウムを０．０１Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，２）に溶解させた後、ＩＮ水酸化ナトリウム水
溶液を加えて、緩衝液のｐＨを約８．２に調整した。

これらの臭化カルシウムを含有する緩衝液と前記したウ
サギＩｇＧ固定化粒子分散液とを混合して、臭化カルシ
ウムを種々異なる濃度にて含有すると共に、重合体粒子
濃度１．０重量％の免疫学的診断試薬を調製した。

（ｅ）　　免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質としてウサギＩｇＧを固定化した本試薬は
、リウマチ因子検出試薬として用いることができる。

この診断試薬と関節リウマチ因子陽性血清及び陰性血清
を原液のままそれぞれガラス板上にて等容量混合攪拌し
ながら、２分後に凝集状態を肉眼判定した。その結果を
第１表に示す。

第１表 （注）判定の基準は以下による。以下の判定においても
同じである。

−二顕微鏡観察（１００倍）によっても凝集が認められ
ない。

一゛：肉眼にては凝集が認められないが、顕微鏡観察（
１００倍）によって僅 かに凝集が認められる。

±　　：肉眼にて少し凝集が認められる。

＋　　：肉眼にて凝集が明らかに認められる。

＋＋：少し強い凝集が認められる。

＋＋＋：激しい凝集が認められる。

本発明による診断試薬においては、非特異的凝集反応が
起こらないが、臭化カルシウムを含有しない対照診断試
薬では非特異的凝集が生じた。

また、臭化カルシウム濃度がそれぞれ０．８５モル／ｌ
及び０．１モル／ｌである上記リウマチ因子検出試薬に
ついて、４℃の温度にて経口安定性を調べた。評価方法
は上記と同じである。結果を第２表に示す。

本発明の診断試薬によれば、６か刃径にも均一な外観を
有すると共に、陰性血清に対して何ら非特異的な凝集を
起こさず、保存安定性にすぐれることが明らかである。

更に、本発明の診断試薬によれば、凝集の程度は反応時
間によらずに実質的に一定している。しかし、臭化カル
シウムを含有しない診断試薬によれば、早期に沈殿が生
じ、また、非特異的凝集が認められる。

また、添加剤として塩化カルシウムを含有する対照診断
試薬によれば、陰性血清に対して非特異的凝集反応が生
じるのみならず、早期に沈殿を生じて、保存安定性に著
しく劣る。但し、この沈殿は粒子が沈降して生じるもの
であり、粒子が凝集するのではないので、・十分に震盪
して均一にするれば、診断試薬として使用することがで
きる。更に、塩化カルシウムを含有する診断試薬によれ
ば、陰性血清と混合して数分後の初期の凝集の程度が（
±）、即ち、疑陽性であるとき、時間の経過につれて非
特異的凝集が強くなり、例えば、約１０分後には凝集の
程度が（＋＋）程度となって、凝集の程度が時間によっ
て変動し、かくして、正確な診断が不可能である。

更に、上記リウマチ因子検出試薬を４℃の温度で保存し
たときの陽性活性の変化を調べた。結果を第３表に示す
。凝集の判定基準は前記と同じである。

次に、前記（ａ）の方法にて調製した水分散型高分子重
合体粒子にスペーサ基を結合させず、直接に（Ｃ１の方
法に従ってウサギＩｇＧを固定化した後、（ｄ）の方法
に従って種々の濃度で臭化カルシウムを含有する対照診
断試薬Ａを調製した。また、臭化カルシウムを含有しな
いほかは、本発明診断試薬と同じ対照診断試薬Ｂを調製
した。

本発明による診断試薬及びこれらの対照診断試薬を（ｅ
）の方法に従って活性を判定した。結果を第４表に示す
。本発明による診断試薬によれば、非特異的凝集が起こ
らず、且つ、検出感度も高いが、スペーサ基を介してウ
サギＩｇＧが固定化されていない対照診断試薬Ａは陽性
血清に対しても明瞭な凝集反応を示さず、また、対照診
断試薬Ｂは非特異的凝集が顕著である。

実施例２ （ａ）　　水分散型合成高分子重合体粒子の調製単量体
としてメタクリル酸メチル１５．０ｇ、アクリル酸１．
０ｇ及びトリエチレングリコールジメタクリレート０．
７　ｇを用いた以外は、実施例１と同様にして、重合率
９８％にて平均粒径０．３６μｍの水分散型高分子重合
体粒子の水性分散液を得た。

この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得られた重
合体粒子を０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に固
形分濃度５重量％となるように分散させて、水分散型高
分子重合体粒子の水性分散液を得た。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合実施例１と
同様にして、上で得た重合体粒子にスペーサ基を結合さ
せた。

（Ｃ１ウサギＩｇＧの固定化 上で得たスペーサ基を結合した重合体粒子に実施例１と
同様にして、ウサギＩｇＧを共有結合にて固定化し、こ
の後、実施例１と全く同様に処理して、重合体粒子を０
．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）に分散させて、全
量１０ｍ１に調製し、ウサギＩｇＧを固定化した水分散
型高分子重合体粒子分散液を得た。ウサギＩｇＧの固定
化量は、重合体粒子１ｇ当り４６■であった。

（ｄｌ　　免疫学的診断試薬の調製 上で得たウサギＩｇＧ固定化水分散型高分子重合体粒子
分散液を用いて、実施例１と同様にして、種々の濃度で
臭化カルシウムを含有する本発明による免疫学的診断試
薬を調製した。

比較のために、臭化カルシウムに代えて、添加剤として
臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、塩化カ
ルシウム又は酢酸カルシウムを用いて、対照免疫学的診
断試薬を調製した。

、（ｅ）免疫学的診断試薬の評価 上で得た各種の免疫学的診断試薬について、実施例１と
同様にして活性の判定を行なった。結果を第５表に示す
。本発明による診断試薬によれば、非特異的凝集は全く
起こらないが、対照診断試薬の場合は、非特異的凝集が
顕著に認められる。

実施例３ 実施例２において調製したスペーサ基を有する水分散型
高分子重合体粒子に、実施例１と同様にしてカルボジイ
ミドを用いてヒ）ＩｇＧを固定化した後、臭化カルシウ
ム０．７５モル／ｌを含有する本発明による免疫学的診
断試薬Ａを調製した。重合体粒子１ｇ当りのヒト■ｇＧ
固定化量は５５■であった。

次に、実施例２において調製した水分散型高分子重合体
粒子にスペーサ基を結合させず、カルボジイミドを用い
て直接にヒトＩｇＧを固定化し、この重合体粒子の水性
分散液に臭化カルシウムを０゜５モル／１濃度にて溶解
させて、本発明による免疫学的診断試薬Ｂを調製した。

尚、この診断試薬におけるヒトＩｇＧの固定化量は、重
合体粒子１ｇ当り６２■であった。

このように、ヒトＩｇＧを固定化しても、リウマチ因子
検出試薬として用いることができる。

これらの本発明による診断試薬Ａ及びＢを何らの処理も
していない種々の血清と混合攪拌し、２分後の凝集状態
を判定した結果を第６表に示す。

臭化カルシウムを含有しない対照診断試薬についての結
果も併せて示す。本発明の診断試薬は非特異的凝集がな
く、且つ、検出感度も高い。

実施例４ （ａｌ　　水分散型合成高分子重合体粒子の調製メタク
リル酸メチル５０ｇ、アクリロニトリル８．０ｇ及びメ
タクリル酸２．５ｇを用いた以外は、実施例１と同様に
して、重合率９９．５％にて平均粒径０．２８μｍの水
分散型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。

この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得られた重
合体粒子を０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５）に固
形分濃度５重量％となるように分散させて、水分散型高
分子重合体粒子の水性分散液を得た。

（ｂｌ　　重合体粒子へのスペーサ基の結合スペーサ基
化合物としてグルタミン酸を用い、カルボジイミド法に
より、実施例１と同様にして、上で得た重合体粒子にス
ペーサ基を結合させた。

（Ｃ）　　抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体の固定化
　　　　　　　上で得たスペーサ基を結合した重合体粒
子５重量％を含む水性分散液５ｍｌ、０．１　Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ７，５）　２ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混
合し、これにｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）
　２ＩＩ１１を加えた後、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモ
ン抗体溶液（抗ＨＣＧ、５■ｇ／閣１）を５ｍｌ添加し
、１５℃で３時間反応を行なった。

この後、実施例１と全く同様に処理して、重合体粒子を
０．　ＯＩ　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）に分１１シ
させて、全ｆｆ１１０１に調製し、抗ＨＣＧ固定化水分
散型高分子重合体粒子分散液を得た。抗ＨＣＧの固定化
量は重合体粒子１ｇ当り３５ＩＩＩｇであった。

（ｄｌ　　免疫学的診断試薬の調製 実施例１と同様の方法により、臭化カルシウムをそれぞ
れ０．７５モル／ｌ及び０．５０モル／ｌ濃度にて含有
すると共に、重合体粒子濃度１．５重量％である本発明
による免疫学的診断試薬を得た。

＋１ｌｌ）　　免疫学的診断試薬の評価免疫活性物質と
して抗ＨＣＧを固定化した本試薬は妊娠診断試薬として
用いることができる。この診断試薬と血清を原液のまま
ガラス板上にて等量混合し、３〜５分後の凝集の有無を
判定したところ、血清１ｓｌ中に１国際車位のＨＣＧが
あれば凝集が起こり、容易に且つ正確に妊娠の有無を判
定することができた。非特異的凝集は全く起こらなかっ
た。

他方、臭化カルシウムを含有しない対照診断試薬によれ
ば、妊娠していないヒト血清の場合も、疑陽性と判定さ
れる非特異的凝集が生じた。

実施例５ （ａｌ　　水分散型合成高分子重合体粒子の調製グリシ
ジルメタクリレート１０ｇ、スチレン５０ｇ１メタクリ
ル酸メチル１８ｇ、ジビニルベンゼン２．０ｇ及びアク
リロニトリル２０ｇを蒸留水２３０ｇに加え、更に蒸留
水１０ｇに過硫酸カリウム０．３ｇを溶解させた重合開
始剤水溶液を加えた後、窒素気流下、ｐＨを７．０に維
持しつつ、７０℃の温度で攪拌速度１２０ｒｐｍで攪拌
しつつ、８時間重合させて、固形公約３０％、平均粒径
０゜２５μｍの水分散型高分子重合体粒子を含む水性分
散液を得た。尚、凝集物は０．０３％であった。

（ｂｌ　　重合体粒子へのスペーサ基の結合上で得た水
分散型高分子重合体粒子を遠心分離し、０．０５　Ｍ酢
酸ナトリウム−水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１０）　
　１００ｍｌに再分散させ、これにｍ−キシリレンジア
ミン２ｇを添加し、３０℃で２４時間反応させた。この
後、未反応のｍ−キシリレンジアミンを除くために遠心
分離し、次いで、このようにしてスペーサ基の結合され
た重合体粒子を０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）
に固形分濃度５重量％となるように再分散させた。

（Ｃ）　　ウサギＩｇＧの固定化 上で得た重合体粒子に実施例１と同様にしてウサギｒｇ
Ｇを固定化した０重合体粒子１ｇ当りの固定化量は３５
−ｇであった。

１ｄｌ　　免疫学的診断試薬の調製 上で得たウサギＩｇＧ固定化重合体粒子の水性分散液に
実施例１と同様にして臭化カルシウムを添加し、本発明
による免疫学的診断試薬を調製した。

（ｅ）　　免疫学的診断試薬の評価 この診断試薬とリウマチ因子陽性血清及び陰性血清を原
液のままそれぞれガラス板上にて等容量混合攪拌しなが
ら、２分後に凝集状態を判定した。

その結果を第７表に示す。

第７表 また、臭化カルシウムを添加しない対照免疫学的診断試
薬についての結果も併せて示す。

本発明による診断試薬によれば、非特異的凝集反応が起
こらないが、臭化カルシうムを含有しない対照診断試薬
によれば、非特異的凝集が著しい。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫活性物質が共有結合にて固定化された水分散
   型高分子重合体粒子の水性分散液からなる免疫学的診断
   試薬において、上記水性分散液に臭化カルシウムが配合
   されてなることを特徴とする免疫学的診断試薬。
2. （２）免疫活性物質がスペーサ基を介して共有結合にて
   水分散型高分子重合体粒子に固定化されていることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫学的診断試薬
   。
3. （３）臭化カルシウムが０．０１〜１．５モル／ｌの範
   囲の濃度で配合されてなることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。
4. （４）ｐＨが６〜９であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。