JPS63222265A - リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法 - Google Patents
リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は特異的な結合アッセイの分野そして詳細にはダ
ラム陰性細菌のリポ多糖類（以下ＬＰＳと略記する）を
検出するためのサンドイッチアッセイ、および生物医学
的または化粧用途用物質からのＬＰＳの除去に関する。
ラム陰性細菌のリポ多糖類（以下ＬＰＳと略記する）を
検出するためのサンドイッチアッセイ、および生物医学
的または化粧用途用物質からのＬＰＳの除去に関する。
ダラム陰性細菌、およびいくつかの原生動物はリポ多糖
類（ＬＰＳ）と呼ばれる細胞表面糖脂質物質を産生ずる
ことが知られている。リポ多糖類はヒト組織の成分でも
グラム陽性細菌の成分でもない。従ってこのものはダラ
ム陰性細菌および少数の病原性原生動物に特異的なマー
カーである。
類（ＬＰＳ）と呼ばれる細胞表面糖脂質物質を産生ずる
ことが知られている。リポ多糖類はヒト組織の成分でも
グラム陽性細菌の成分でもない。従ってこのものはダラ
ム陰性細菌および少数の病原性原生動物に特異的なマー
カーである。
さらに、細胞１個当り１００万分子の概算でこのものは
ダラム陰性細菌の細胞表面上に最も豊富にある成分であ
る。すべてのリポ多糖類は２種の機能的に区別される構
造領域を有する。１つは「脂質Ａ」と呼ばれる脂肪性部
分そしてもう１つは少くて３個、そして多くて３５０個
まで、時にはそれ以上の糖残基を含有する炭水化物区分
である。
ダラム陰性細菌の細胞表面上に最も豊富にある成分であ
る。すべてのリポ多糖類は２種の機能的に区別される構
造領域を有する。１つは「脂質Ａ」と呼ばれる脂肪性部
分そしてもう１つは少くて３個、そして多くて３５０個
まで、時にはそれ以上の糖残基を含有する炭水化物区分
である。
ＬＰＳの炭水化物部分はそれ自体２種の構造部分に分け
られうる。１つは個々の属のすべての構成員が共通して
有する、一般的に８〜１１個の糖残基からなるコア、そ
してもう１つは特定の種または特定の種の個々の抗原性
サブ群に独特の〇−側鎖である。ＬＰＳ上の大多数の抗
原部位は前記コアの炭水化物および〇−側鎖中に存在す
る。
られうる。１つは個々の属のすべての構成員が共通して
有する、一般的に８〜１１個の糖残基からなるコア、そ
してもう１つは特定の種または特定の種の個々の抗原性
サブ群に独特の〇−側鎖である。ＬＰＳ上の大多数の抗
原部位は前記コアの炭水化物および〇−側鎖中に存在す
る。
ＬＰＳ構造のそれぞれの部分に特異的な抗体が開発され
た。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） Ｌ Ｐ Ｓ
のコア領域に特異的な抗体はそれの超厚である種に関わ
りなくサルモネラＬＰＳと反応しようが、種々のエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｃｒｌｃｈｌａ）種のような他の細菌
からのＬＰＳとは反応しないであろう。サルモネラの個
々の種の〇−側鎖に特異的な抗体はその種の構成員との
みしか反応せず、サルモネラの他の種または他のダラム
陰性細菌からのＬＰＳとは反応しない°であろう。
た。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） Ｌ Ｐ Ｓ
のコア領域に特異的な抗体はそれの超厚である種に関わ
りなくサルモネラＬＰＳと反応しようが、種々のエシェ
リヒア（Ｅｓｃｈｃｒｌｃｈｌａ）種のような他の細菌
からのＬＰＳとは反応しないであろう。サルモネラの個
々の種の〇−側鎖に特異的な抗体はその種の構成員との
みしか反応せず、サルモネラの他の種または他のダラム
陰性細菌からのＬＰＳとは反応しない°であろう。
ＬＰＳの脂質Ａ部分はＬＰＳの生理学的活性の大多数を
有している。脂質Ａのかかる活性の２種が臨床的に特に
重要である。それらは熱を誘発しうる能力（発熱原性）
および全身的な血管崩壊（敗血症性または内毒素性ショ
ック）を誘発しうる能力である。治療における改良によ
り多くのショック罹患者の予後が良くなってきているが
、内毒素ショックの罹患者はなお死亡率が７０〜８０％
である（Ｒｏｂｌｎｓ、 Ｃｏｔｒａｎ、 ｒＰａｔ
ｈｏｌｏｇｉｅ Ｂａ５ｉｓｏｆ ＤｉｓｃａｓｅＪ
Ｗ、 Ｂ、 ５ａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ、製米国Ｐｈ１
ｌａｄｅｌｐｈｉａ、 ＰＡ、 １４０ （１９７９）
） 、脂質Ａは内毒素ショックの強力な誘発物質である
。ヒトの臨床的な症候は代表的には血液１ｍｌ当りＬＰ
Ｓ中の脂質Ａ３〜４ｐｇなる低いレベルからでも生ずる
（Ｅｌｉｎ氏他−ｒＢａｃｔｅｒｌａｌ Ｅｎｄｏｔｏ
ｘｉｎｓ ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 、 １３１ｏｍｅｄ
ｌｃａｌ ５１ｇｎ１ｆ’１ｃａｎｃｅ、 ａｎｄＤｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｌｌｍｕｌｕｓ
Ａｉｅｂｏｃｙｔｅ ＬｙｓａｔｅＴｅｓｔＪ 、
Ｃａｔｅ氏他編、 Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 Ｉｎｃ
、、 ＮｅｗＹｏｒｋ、 ３０７−３２４ （１９８５
）） 、 リムルス（Ｌｌｍｕｌｕｓ）変形細胞（アメ
ーバ細胞）溶解物試験についての論議は以下の記載を参
照されたい。かくの如く、ＬＰＳの構造は抗原分析およ
び細菌同定によく適した炭水化物領域、および抗原性は
乏しいが強力な生理学的活性を有する高度に保存された
脂質Ａ区分を有すると総括されうる。
有している。脂質Ａのかかる活性の２種が臨床的に特に
重要である。それらは熱を誘発しうる能力（発熱原性）
および全身的な血管崩壊（敗血症性または内毒素性ショ
ック）を誘発しうる能力である。治療における改良によ
り多くのショック罹患者の予後が良くなってきているが
、内毒素ショックの罹患者はなお死亡率が７０〜８０％
である（Ｒｏｂｌｎｓ、 Ｃｏｔｒａｎ、 ｒＰａｔ
ｈｏｌｏｇｉｅ Ｂａ５ｉｓｏｆ ＤｉｓｃａｓｅＪ
Ｗ、 Ｂ、 ５ａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ、製米国Ｐｈ１
ｌａｄｅｌｐｈｉａ、 ＰＡ、 １４０ （１９７９）
） 、脂質Ａは内毒素ショックの強力な誘発物質である
。ヒトの臨床的な症候は代表的には血液１ｍｌ当りＬＰ
Ｓ中の脂質Ａ３〜４ｐｇなる低いレベルからでも生ずる
（Ｅｌｉｎ氏他−ｒＢａｃｔｅｒｌａｌ Ｅｎｄｏｔｏ
ｘｉｎｓ ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 、 １３１ｏｍｅｄ
ｌｃａｌ ５１ｇｎ１ｆ’１ｃａｎｃｅ、 ａｎｄＤｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｌｌｍｕｌｕｓ
Ａｉｅｂｏｃｙｔｅ ＬｙｓａｔｅＴｅｓｔＪ 、
Ｃａｔｅ氏他編、 Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 Ｉｎｃ
、、 ＮｅｗＹｏｒｋ、 ３０７−３２４ （１９８５
）） 、 リムルス（Ｌｌｍｕｌｕｓ）変形細胞（アメ
ーバ細胞）溶解物試験についての論議は以下の記載を参
照されたい。かくの如く、ＬＰＳの構造は抗原分析およ
び細菌同定によく適した炭水化物領域、および抗原性は
乏しいが強力な生理学的活性を有する高度に保存された
脂質Ａ区分を有すると総括されうる。
内毒素ショックに加え、ダラム陰性細菌はしばしば髄膜
炎、尿路感染、嫌気性膿瘍、尿道炎、食物中毒、および
その他のヒトまたは動物の病気の原因物である。これら
状態のすべてにとって、それ以上の感染の拡大を抑制し
そして適正な治療を確保せんがためには正確で好時機的
な診断を下す必要がある。一般に、患者から採取した検
体は最終的な診断が下されうるまでに１８〜１２０時間
培養される必要がある。しばしば、医師は培養結果が出
るのを待たずに患者の治療を開始せねばならない。治療
開始と培養結果を受取るまでの間にこのような遅延が存
在するということは、培養結果は仮定した診断を確認す
るかまたは異論を出すのに役立ちはするが、しかし当初
の患者治療の選択には影響しないことを意味する。医師
の医療過誤保険の費用の高さ、および政府の診断関連団
体（ＤＲＧＳ）により課せられる費用抑制策により、医
療現場に対し不必要なそして有害な可能性もある薬剤で
の治療を排除するような圧力が高くなっている。かくの
如く、感度が良く、特異的で、そして治療剤の初期選択
決定を補助することになろう時間の枠内で、診断を下す
ための情報を提供しつる試験が必要とされる。主要な要
求はダラム陰性細菌により産生されたＬＰＳの存在を検
出することおよび続く属／８の同定であろう。
炎、尿路感染、嫌気性膿瘍、尿道炎、食物中毒、および
その他のヒトまたは動物の病気の原因物である。これら
状態のすべてにとって、それ以上の感染の拡大を抑制し
そして適正な治療を確保せんがためには正確で好時機的
な診断を下す必要がある。一般に、患者から採取した検
体は最終的な診断が下されうるまでに１８〜１２０時間
培養される必要がある。しばしば、医師は培養結果が出
るのを待たずに患者の治療を開始せねばならない。治療
開始と培養結果を受取るまでの間にこのような遅延が存
在するということは、培養結果は仮定した診断を確認す
るかまたは異論を出すのに役立ちはするが、しかし当初
の患者治療の選択には影響しないことを意味する。医師
の医療過誤保険の費用の高さ、および政府の診断関連団
体（ＤＲＧＳ）により課せられる費用抑制策により、医
療現場に対し不必要なそして有害な可能性もある薬剤で
の治療を排除するような圧力が高くなっている。かくの
如く、感度が良く、特異的で、そして治療剤の初期選択
決定を補助することになろう時間の枠内で、診断を下す
ための情報を提供しつる試験が必要とされる。主要な要
求はダラム陰性細菌により産生されたＬＰＳの存在を検
出することおよび続く属／８の同定であろう。
この要求に合致する一つの方法は臨床的な検体中の抗原
を検出するためのイムノアッセイを開発することであっ
た。理想的には、脂質Ａの構造は高度に保存されている
ゆえに脂質Ａに対する抗体を利用することが希望される
であろうが、イムノアッセイに使用できるに充分に高い
親和性および交差反応性を有する抗体は何ら見出されて
いない。
を検出するためのイムノアッセイを開発することであっ
た。理想的には、脂質Ａの構造は高度に保存されている
ゆえに脂質Ａに対する抗体を利用することが希望される
であろうが、イムノアッセイに使用できるに充分に高い
親和性および交差反応性を有する抗体は何ら見出されて
いない。
炭水化物〇−側鎖は抗原部位のコピーを多く含有してお
りそれゆえ多くの抗体分子を結合できる。
りそれゆえ多くの抗体分子を結合できる。
このことによりサンドイッチ イムノアッセイにおける
これら抗原の捕捉および検出が容易かつ非常に高感度と
なる。しかしながら、〇−側鎖はそれらが微生物種の中
でも極端に抗原的に異種性であるのでそれらの有用性が
制限される。内部コアの炭水化物はそれらの構造がより
保存されているのでより有用性が大きいかも知れないが
、一般的にそのコア構造は１個の抗体を結合できるのみ
であってサンドイッチ イムノアッセイは実質上不可能
である。
これら抗原の捕捉および検出が容易かつ非常に高感度と
なる。しかしながら、〇−側鎖はそれらが微生物種の中
でも極端に抗原的に異種性であるのでそれらの有用性が
制限される。内部コアの炭水化物はそれらの構造がより
保存されているのでより有用性が大きいかも知れないが
、一般的にそのコア構造は１個の抗体を結合できるのみ
であってサンドイッチ イムノアッセイは実質上不可能
である。
内毒素（ＬＰＳ）汚染を監視するための最も古い試験の
一つはウサギ発熱誘発力試験である。試験すべき物質の
検体を連続希釈しそして各希釈物の一部分をウサギに注
射する。次にウサギの体温を監視する。ウサギの体温が
上昇したら、その検体は汚染されていると考えられる。
一つはウサギ発熱誘発力試験である。試験すべき物質の
検体を連続希釈しそして各希釈物の一部分をウサギに注
射する。次にウサギの体温を監視する。ウサギの体温が
上昇したら、その検体は汚染されていると考えられる。
ＬＰＳ汚染の量の概算はウサギで何ら有量な体温上昇が
観察されない希釈度の逆数として得られる。このアッセ
イは不正確で、多数の動物を必要とし、そして診断操作
としてはあまり有用性がない、何故ならこれはＬＰＳま
たはＬＰＳの起源である細菌の性質に関する情報を何ら
提供しないからである。工業的製造者にとってルーチン
に実施するには高価でもあり、そして液体１ｍｌ当りＬ
ＰＳの検出限界１１００ｎにも達する。
観察されない希釈度の逆数として得られる。このアッセ
イは不正確で、多数の動物を必要とし、そして診断操作
としてはあまり有用性がない、何故ならこれはＬＰＳま
たはＬＰＳの起源である細菌の性質に関する情報を何ら
提供しないからである。工業的製造者にとってルーチン
に実施するには高価でもあり、そして液体１ｍｌ当りＬ
ＰＳの検出限界１１００ｎにも達する。
ＬＰＳの存在に関する迅速かつ高感度の試験はＬｃｖｌ
ｎおよびＢａｎｇ氏の業績に基づくリムルス変形細胞溶
解物（ＬＡＬ）試験である（Ｔａ１氏他。
ｎおよびＢａｎｇ氏の業績に基づくリムルス変形細胞溶
解物（ＬＡＬ）試験である（Ｔａ１氏他。
ｒＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、Ｊ ２５２．２１７
８−２１８１ （１９７７））。
８−２１８１ （１９７７））。
カブトガニ〔リムルス・ポリフェムス（Ｌｌｎ＋ｕｌｕ
ｓｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ） ）はダラム陰性細菌に対し
て原始的ではあるがしかし効果的な防御を育する。侵入
する細菌のＬＰＳが一連の反応を刺激し、それにより浸
入者の囲りに凝血が形成される。この凝血を形成させる
のに必要な酵素および凝固誘発タンパり質はカブトガニ
の血液中を循環している変形細胞の細胞内顆粒中に存在
している。これらの変形細胞を遠心分離により血液から
分離し、洗浄しそして溶解させると、生成物は透明で液
体状の細胞溶解物である。ＬＡＬ試験においては、この
細胞溶解物をピコグラム量のＬＰＳに露出した場合です
らもそのものは混濁してゼラチン状凝血塊を形成する。
ｓｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ） ）はダラム陰性細菌に対し
て原始的ではあるがしかし効果的な防御を育する。侵入
する細菌のＬＰＳが一連の反応を刺激し、それにより浸
入者の囲りに凝血が形成される。この凝血を形成させる
のに必要な酵素および凝固誘発タンパり質はカブトガニ
の血液中を循環している変形細胞の細胞内顆粒中に存在
している。これらの変形細胞を遠心分離により血液から
分離し、洗浄しそして溶解させると、生成物は透明で液
体状の細胞溶解物である。ＬＡＬ試験においては、この
細胞溶解物をピコグラム量のＬＰＳに露出した場合です
らもそのものは混濁してゼラチン状凝血塊を形成する。
前記ＬＡＬ試験の改良物はＬＡＬ色原体アッセイである
。このアッセイは、ＬＡＬ試験におけるゲル化がセリン
プロテアーゼのカスケードの作用の結果であるという事
実に基づくものである。これらプロテアーゼは、哺乳動
物血液凝固酵素の監視に使用されるような色原体基質を
反応混合物に添加しそして色の生成を観察することによ
り非−ＬＡＬ凝固試験フォーマットで直接監視されうる
。
。このアッセイは、ＬＡＬ試験におけるゲル化がセリン
プロテアーゼのカスケードの作用の結果であるという事
実に基づくものである。これらプロテアーゼは、哺乳動
物血液凝固酵素の監視に使用されるような色原体基質を
反応混合物に添加しそして色の生成を観察することによ
り非−ＬＡＬ凝固試験フォーマットで直接監視されうる
。
一般に、このアッセイはＬＡＬ凝固試験より高い感度を
示しそしてヒトの観察者よりむしろ分析器具を用いて監
視されうる。
示しそしてヒトの観察者よりむしろ分析器具を用いて監
視されうる。
ＬＡＬに基づく前記の２種の試験はいずれもＬＰＳに対
して、そしてＬＰＳに対してのみ、それゆえダラム陰性
細菌の存在に対して極度に感度が高いが、ＬＰＳまたは
そのＬＰＳが由来する細菌の性質に関する情報は何ら提
供しない。事実、リムルス変形細胞溶解物のＬＰＳに対
する異例に高い感度ゆえにＬＡＬ試験におけるその有用
性は問題のＬＰＳを含有する検体、または任意のＬＰＳ
の存在のみが関心がある検体に限定される。
して、そしてＬＰＳに対してのみ、それゆえダラム陰性
細菌の存在に対して極度に感度が高いが、ＬＰＳまたは
そのＬＰＳが由来する細菌の性質に関する情報は何ら提
供しない。事実、リムルス変形細胞溶解物のＬＰＳに対
する異例に高い感度ゆえにＬＡＬ試験におけるその有用
性は問題のＬＰＳを含有する検体、または任意のＬＰＳ
の存在のみが関心がある検体に限定される。
多くの臨床的な試料、例えば、のどまたは直腸の綿棒標
本では、共生ダラム陰性細菌が存在しようから、それゆ
え陽性リムルス溶解物試験が必ずしも病原体の存在を示
すものではなかろう。さらに、リムルス溶解物試験はセ
リンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ阻害剤のい
ずれかを含有するすべての検体、例えば血小板集合およ
び血液凝固が包含される検体には実施できない、何故な
らかかる酵素は凝血塊生成を妨害するからである。
本では、共生ダラム陰性細菌が存在しようから、それゆ
え陽性リムルス溶解物試験が必ずしも病原体の存在を示
すものではなかろう。さらに、リムルス溶解物試験はセ
リンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ阻害剤のい
ずれかを含有するすべての検体、例えば血小板集合およ
び血液凝固が包含される検体には実施できない、何故な
らかかる酵素は凝血塊生成を妨害するからである。
商業的に入手しうる酵素製剤が内毒素で汚染されている
か否かを判定する研究において、１３ｒｙａｎｔ氏他Ｃ
ｒＪ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、 Ｊ １
７゜１０５０ （１９８８） ）はリムルス変形細胞溶
解物のミクロ滴定プレートへの固定について報告してい
る。
か否かを判定する研究において、１３ｒｙａｎｔ氏他Ｃ
ｒＪ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、 Ｊ １
７゜１０５０ （１９８８） ）はリムルス変形細胞溶
解物のミクロ滴定プレートへの固定について報告してい
る。
前記溶解物はｐＨ９，８の標準的な炭酸塩−重炭酸塩緩
衝液を用いてポリスチレン ウェルに吸着させることに
より固定された。この著者らはもし酵素力Ｌ Ａ Ｌ−
被覆ウェル中に保持されるが、ブランクの非被覆ウェル
中には保持されないならば、その保持は検体中に存在す
るＬＰＳ汚染と酵素との間に形成された複合物の捕捉の
結果のみでありうると推定した。酵素は事実保持されて
いることが判明し、そして著者らはＬＰＳによる汚染を
推定した。
衝液を用いてポリスチレン ウェルに吸着させることに
より固定された。この著者らはもし酵素力Ｌ Ａ Ｌ−
被覆ウェル中に保持されるが、ブランクの非被覆ウェル
中には保持されないならば、その保持は検体中に存在す
るＬＰＳ汚染と酵素との間に形成された複合物の捕捉の
結果のみでありうると推定した。酵素は事実保持されて
いることが判明し、そして著者らはＬＰＳによる汚染を
推定した。
ＬＰＳ結合性タンパク質はまたタキプレウス争トリデン
タツス（Ｔａｃｈｙｐｌａｕｓ ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕ
ｓ）、タキブレウスーギガス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ
ｇｌｇａｓ） 。
タツス（Ｔａｃｈｙｐｌａｕｓ ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕ
ｓ）、タキブレウスーギガス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ
ｇｌｇａｓ） 。
およびカルシノスコルビウス・ロッンジヵウダ（Ｃａｒ
ｃｉｎｏｓｃｏｒｐｌｕｓ ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ
）の血液中に存在する変形細胞から単離されることも知
られている。これら変形細胞からの溶解物はリムルス変
形細胞溶解物にとって代わることができる（ Ｎａｋａ
ｍｕｒａ氏他、 ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａＪ 、 ７０７． ２
１７−２２５ （１９８２） ） 。
ｃｉｎｏｓｃｏｒｐｌｕｓ ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ
）の血液中に存在する変形細胞から単離されることも知
られている。これら変形細胞からの溶解物はリムルス変
形細胞溶解物にとって代わることができる（ Ｎａｋａ
ｍｕｒａ氏他、 ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａＪ 、 ７０７． ２
１７−２２５ （１９８２） ） 。
環境中にダラム陰性細菌が遍く存在することは生物医学
的供給物および化粧品の製造業者にとっては挑戦を受け
ることでもある。ＬＰＳ汚染の影響力および臨床上の重
要性ゆえに、かかる生成物はＬＰＳ不含であることを保
証されることが必要となる。この必要性ゆえに、内毒素
検出のための速やかで、信頼できて、かつ高価でないア
ッセイに対する要求が生じた。また、汚染された生成物
からＬＰＳを除去する必要も存在している。
的供給物および化粧品の製造業者にとっては挑戦を受け
ることでもある。ＬＰＳ汚染の影響力および臨床上の重
要性ゆえに、かかる生成物はＬＰＳ不含であることを保
証されることが必要となる。この必要性ゆえに、内毒素
検出のための速やかで、信頼できて、かつ高価でないア
ッセイに対する要求が生じた。また、汚染された生成物
からＬＰＳを除去する必要も存在している。
本発明のリポ多糖類検出のためのサンドイッチアッセイ
は下記工程からなる、すなわち、（Ａ） 捕捉試薬を
固定させて、実質的にＩ）水不溶性支持体、および １１）該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 （Ｂ） リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、 （Ｃ） 工程（Ｂ）で形成された活性支持体−リポ多
糖類複合物を標識された検出試薬と接触させ、そして （Ｄ） 結合されたかまたは結合されてない標識のい
ずれかを検出する。
は下記工程からなる、すなわち、（Ａ） 捕捉試薬を
固定させて、実質的にＩ）水不溶性支持体、および １１）該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 （Ｂ） リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、 （Ｃ） 工程（Ｂ）で形成された活性支持体−リポ多
糖類複合物を標識された検出試薬と接触させ、そして （Ｄ） 結合されたかまたは結合されてない標識のい
ずれかを検出する。
検体からリポ多糖類を除去するための本発明による方法
は下記工程からなる、すなわち、（Ａ） 捕捉試薬を
固定させて、実質的にｉ）水不溶性支持体、および １１）該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 （Ｂ） リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、そして （Ｃ） 活性支持体に結合されたＬＰＳを検体から分
離する。
は下記工程からなる、すなわち、（Ａ） 捕捉試薬を
固定させて、実質的にｉ）水不溶性支持体、および １１）該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 （Ｂ） リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、そして （Ｃ） 活性支持体に結合されたＬＰＳを検体から分
離する。
リポ多糖類結合性タンパク質の支持体への結合は、その
ＬＰＳ結合性タンパク質を約９．０より低いｐｌ＋で固
形支持体に吸着させることにより行われる。
ＬＰＳ結合性タンパク質を約９．０より低いｐｌ＋で固
形支持体に吸着させることにより行われる。
本発明は、リムルス変形細胞溶解物（Ｌ Ａ Ｌ）のよ
うな捕捉試薬が固形支持体上に固定されると、ＬＡＬが
なおＬＰＳを結合しうるのみならず結合されたＬＰＳも
抗原的に完全無欠でなお抗体に接近しうるという驚くべ
き発見を利用するものである。このことはリムルスおよ
びタキプレウス変形細胞溶解物中に見出される成分のＬ
ＰＳに対する幅広い反応性が一般的なＬＰＳの捕捉およ
び固定手段として使用されうろことを意味する。これに
よりＬＰＳの存在の検出も抗原分析も可能となる。
うな捕捉試薬が固形支持体上に固定されると、ＬＡＬが
なおＬＰＳを結合しうるのみならず結合されたＬＰＳも
抗原的に完全無欠でなお抗体に接近しうるという驚くべ
き発見を利用するものである。このことはリムルスおよ
びタキプレウス変形細胞溶解物中に見出される成分のＬ
ＰＳに対する幅広い反応性が一般的なＬＰＳの捕捉およ
び固定手段として使用されうろことを意味する。これに
よりＬＰＳの存在の検出も抗原分析も可能となる。
本発明方法はその種類にかかわりなくすべての種類のＬ
ＰＳの存在を検出することが重要である場合に多くの異
なる種類のＬＰＳを捕捉することができる。さらに、本
発明方法は病原性ダラム陰性細菌からの特定のＬＰＳ種
を検出および特異的に同定する能力を維持しつつ、一方
で関係のないかまたは共生する細菌からのＬＰＳを無視
する必要がある分析検体において特に有用である。まだ
さらに、本発明はセリンプロテアーゼによってもセリン
プロテアーゼ阻害剤によっても影響されず、かかる検体
で使用されつる。また、本発明方法では３０分内で病原
体について細菌特異性の確認が得られつる。これは医師
が初期治療剤を選択するに際し、それを補助するために
好時機的に与えられる重要な情報であると言えよう。
ＰＳの存在を検出することが重要である場合に多くの異
なる種類のＬＰＳを捕捉することができる。さらに、本
発明方法は病原性ダラム陰性細菌からの特定のＬＰＳ種
を検出および特異的に同定する能力を維持しつつ、一方
で関係のないかまたは共生する細菌からのＬＰＳを無視
する必要がある分析検体において特に有用である。まだ
さらに、本発明はセリンプロテアーゼによってもセリン
プロテアーゼ阻害剤によっても影響されず、かかる検体
で使用されつる。また、本発明方法では３０分内で病原
体について細菌特異性の確認が得られつる。これは医師
が初期治療剤を選択するに際し、それを補助するために
好時機的に与えられる重要な情報であると言えよう。
リムルス・ポリフェムス（Ｌｌｓｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐ
ｈｅｍｕｓ）、タキプレウスやトリデンタッス、カルシ
ノスコルピウス・ロツンジカウダおよびタキブレウス会
ギガスのような種々の細菌から得られるリポ多糖類（Ｌ
ＰＳ）結合性タンパク質がＬＰＳを固形支持体に結合さ
せるための特異的な、非免疫学的捕捉試薬として使用さ
れうる。これらの捕捉試薬はこれら微生物からの変形細
胞の溶解物の形態であるかまたはかかる溶解物から得ら
れる特異的なタンパク質であることができる。Ｃ因子お
よび抗ＬＰＳ因子が好ましいと予想される。これらは特
異的なＬＰＳ結合活性を有すると現在認められている溶
解物内の２種のタンパク質である。支持体のＬＰＳ結合
容量および特異的な活性は精製されたＬＰＳ結合性タン
パク質を用いることにより増大させることができる。あ
るいはまた、純粋なＬＰＳ結合性タンパク質は組み換え
ＤＮＡ技術を用いて製造することもできる。
ｈｅｍｕｓ）、タキプレウスやトリデンタッス、カルシ
ノスコルピウス・ロツンジカウダおよびタキブレウス会
ギガスのような種々の細菌から得られるリポ多糖類（Ｌ
ＰＳ）結合性タンパク質がＬＰＳを固形支持体に結合さ
せるための特異的な、非免疫学的捕捉試薬として使用さ
れうる。これらの捕捉試薬はこれら微生物からの変形細
胞の溶解物の形態であるかまたはかかる溶解物から得ら
れる特異的なタンパク質であることができる。Ｃ因子お
よび抗ＬＰＳ因子が好ましいと予想される。これらは特
異的なＬＰＳ結合活性を有すると現在認められている溶
解物内の２種のタンパク質である。支持体のＬＰＳ結合
容量および特異的な活性は精製されたＬＰＳ結合性タン
パク質を用いることにより増大させることができる。あ
るいはまた、純粋なＬＰＳ結合性タンパク質は組み換え
ＤＮＡ技術を用いて製造することもできる。
本発明方法で用いられつる支持体は多くの形態をとるこ
とができ、そして多くの異なる材料を用いて構成されう
る。好ましい支持体は一般に固形であり、最も好ましく
はポリスチレンのような重合体物質である。支持体の形
状は限定的でなく、一般に意図される適用により決定さ
れよう。支持体の表面積もアッセイ性能に影響しうる。
とができ、そして多くの異なる材料を用いて構成されう
る。好ましい支持体は一般に固形であり、最も好ましく
はポリスチレンのような重合体物質である。支持体の形
状は限定的でなく、一般に意図される適用により決定さ
れよう。支持体の表面積もアッセイ性能に影響しうる。
支持体は多孔質または非多孔質であることができる。支
持体のいくつかの好都合な形態をあげればミクロ滴定プ
レートのウェル、小球、およびミクロン以下の寸法をし
た不規則な粒子である。
持体のいくつかの好都合な形態をあげればミクロ滴定プ
レートのウェル、小球、およびミクロン以下の寸法をし
た不規則な粒子である。
ＬＰＳ結合性タンパク質は多数の方法で支持体に結合さ
れつる。論議のためには、ＬＰＳ結合性タンパク質が結
合される支持体は活性支持体と呼ばれる。結合性タンパ
ク質を支持体表面に吸着させるのが一般的に好ましいが
、共有結合も用いら゛ れうる。グルタルアルデヒドの
ようなホモ２官能性試薬、またはへテロ２官能性試薬が
使用されうる。選択される結合の様式に関係なく、結合
操作に使用される緩衝液のｐＨは約９より下、好ましく
は約８より下、そして最も好ましくは７付近に維持され
るべきである。中性付近の［）Ｈ値を有する緩衝液が好
ましい、何故ならそれより高いｐＨ値を有する緩衝液は
ＬＰＳ結合性タンパク質の実質上すべてのＬＰＳ結合活
性を破壊するからである。このことは、結合がｐＨ９，
８で完成されると報告されているＢｒｙａｎｔ氏他の前
記文献中の報告を正に対照的である。ミクロ滴定プレー
トのウェルをｐ）１７．４のＰＢＳまたはｐＨ９，８の
炭酸塩中のＬＡＬで被覆し次に室温で２時間インキュベ
ーションした。
れつる。論議のためには、ＬＰＳ結合性タンパク質が結
合される支持体は活性支持体と呼ばれる。結合性タンパ
ク質を支持体表面に吸着させるのが一般的に好ましいが
、共有結合も用いら゛ れうる。グルタルアルデヒドの
ようなホモ２官能性試薬、またはへテロ２官能性試薬が
使用されうる。選択される結合の様式に関係なく、結合
操作に使用される緩衝液のｐＨは約９より下、好ましく
は約８より下、そして最も好ましくは７付近に維持され
るべきである。中性付近の［）Ｈ値を有する緩衝液が好
ましい、何故ならそれより高いｐＨ値を有する緩衝液は
ＬＰＳ結合性タンパク質の実質上すべてのＬＰＳ結合活
性を破壊するからである。このことは、結合がｐＨ９，
８で完成されると報告されているＢｒｙａｎｔ氏他の前
記文献中の報告を正に対照的である。ミクロ滴定プレー
トのウェルをｐ）１７．４のＰＢＳまたはｐＨ９，８の
炭酸塩中のＬＡＬで被覆し次に室温で２時間インキュベ
ーションした。
被覆用緩衝液のｐＨにおける相違以外は、すべてのウェ
ルをアッセイにおいて同一の方法で淋菌（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｌａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）細胞およびモノクロ
ーナル抗体−酵素接合体で処理した。ｐＨ７，４のＰＢ
Ｓ中のＬＡＬのみを含有するウェルは６３０ｎｗで０．
１１０±０．０１４に相当する背景光学濃度（ＯＤ）を
示しこれに対しアッセイ試験用ウェルの６３０ｎｍでの
ＯＤは０．４３８±０．０１７であった（シグナル対ノ
イズ比４，０）。これに対し、ｐＨ９，８の炭酸塩緩衝
液中のＬＡＬのみを含有するウェルは６３０ｎｍで０．
１１８±０．０１３に相当する背景ＯＤを示しこれに対
しアッセイ試験用ウェルは６３０ｎｍで０．１２３土０
．０２０なるＯＤを示した（シグナル対ノイズ比−１，
０）。これらの結果は、本発明のサンドイッチアッセイ
ではｐｌ！約９またはそれ以下の活性支持体製造用緩衝
液を用いなければならないことを示している。
ルをアッセイにおいて同一の方法で淋菌（Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｌａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）細胞およびモノクロ
ーナル抗体−酵素接合体で処理した。ｐＨ７，４のＰＢ
Ｓ中のＬＡＬのみを含有するウェルは６３０ｎｗで０．
１１０±０．０１４に相当する背景光学濃度（ＯＤ）を
示しこれに対しアッセイ試験用ウェルの６３０ｎｍでの
ＯＤは０．４３８±０．０１７であった（シグナル対ノ
イズ比４，０）。これに対し、ｐＨ９，８の炭酸塩緩衝
液中のＬＡＬのみを含有するウェルは６３０ｎｍで０．
１１８±０．０１３に相当する背景ＯＤを示しこれに対
しアッセイ試験用ウェルは６３０ｎｍで０．１２３土０
．０２０なるＯＤを示した（シグナル対ノイズ比−１，
０）。これらの結果は、本発明のサンドイッチアッセイ
ではｐｌ！約９またはそれ以下の活性支持体製造用緩衝
液を用いなければならないことを示している。
緩衝液を含めたすべての試薬、および結合性タンパク質
を支持体に結合させる際に用いられる装置が実質的に挟
雑ＬＰＳを含有しないことが重要である。このことは粗
製溶解物が固形支持体に結合される場合は特に重要であ
る。少量のＬＰＳ汚染はＬＰＳ結合性タンパク質が固定
された後では受容されうる、何故なら試薬の凝固はもは
や問題ではないからである。それにも関わらずＬＰＳ汚
染は回避されるべきである。結合および洗浄工程中に導
入された外部ＬＰＳが活性支持体の結合容量を低下させ
うるし、またもし挟雑ＬＰＳが標識された検出試薬と反
応しうる場合は誤った陽性結果を惹起しうる。ＬＰＳア
ッセイに使用される試薬がＬＰＳを含有しないことを保
証するには、パイロジエン不含の水として得られつるか
または既知方法により精製されうるＬＰＳ不含水を使用
する必要がある。水および試薬がＬＰＳを含有しないこ
とを保証するためにそれらをＬＡＬ凝固アッセイで周期
的に検査することが賢明であると考えられる。
を支持体に結合させる際に用いられる装置が実質的に挟
雑ＬＰＳを含有しないことが重要である。このことは粗
製溶解物が固形支持体に結合される場合は特に重要であ
る。少量のＬＰＳ汚染はＬＰＳ結合性タンパク質が固定
された後では受容されうる、何故なら試薬の凝固はもは
や問題ではないからである。それにも関わらずＬＰＳ汚
染は回避されるべきである。結合および洗浄工程中に導
入された外部ＬＰＳが活性支持体の結合容量を低下させ
うるし、またもし挟雑ＬＰＳが標識された検出試薬と反
応しうる場合は誤った陽性結果を惹起しうる。ＬＰＳア
ッセイに使用される試薬がＬＰＳを含有しないことを保
証するには、パイロジエン不含の水として得られつるか
または既知方法により精製されうるＬＰＳ不含水を使用
する必要がある。水および試薬がＬＰＳを含有しないこ
とを保証するためにそれらをＬＡＬ凝固アッセイで周期
的に検査することが賢明であると考えられる。
緩衝液および試薬が実質的に界面活性剤を含有しないこ
とも重要である。ポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレート、ポリエチレン グリコールｐ−インオクチ
ルフェニルエーテルおよびデオキシコリートのような界
面活性剤は固定された変形細胞溶解物への高レベルの非
特異的結合を阻止するのでではなく惹起することが見出
された。ミクロ滴定プレートウェルをＰＢＳ中のＬ Ａ
Ｌ （２３８ｇ／ ｍｌ ） １００μＱで被覆し
た。４個のウェルをＰＢＳで洗いそして他の４個のウェ
ルをＰ Ｂ Ｓ ＋０．０５％ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートで洗った。固定されたＬＡＬとは
何らＬＰＳも細菌細胞もインキュベーションしなかった
。抗−淋菌ＬＰＳ−特異的特異クモツクローナル抗体接
合体をウェル中でインキュベートしそしてウェルをＰＢ
Ｓを用いてまたはポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレートを含有するＰＢＳを用いて洗った。基質を添
加しそして６３０ｎｍでのＯＤを測定した。ＰＢＳで洗
ったウェルはＯＤ−０，０９３±ｏ）ｏｏｅであったが
界面活性剤含有ＰＢＳで洗ったウェルはＯＤ−０，８５
３±０．０４２を示した。これはシグナル対ノイズ比７
．０であった。
とも重要である。ポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレート、ポリエチレン グリコールｐ−インオクチ
ルフェニルエーテルおよびデオキシコリートのような界
面活性剤は固定された変形細胞溶解物への高レベルの非
特異的結合を阻止するのでではなく惹起することが見出
された。ミクロ滴定プレートウェルをＰＢＳ中のＬ Ａ
Ｌ （２３８ｇ／ ｍｌ ） １００μＱで被覆し
た。４個のウェルをＰＢＳで洗いそして他の４個のウェ
ルをＰ Ｂ Ｓ ＋０．０５％ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートで洗った。固定されたＬＡＬとは
何らＬＰＳも細菌細胞もインキュベーションしなかった
。抗−淋菌ＬＰＳ−特異的特異クモツクローナル抗体接
合体をウェル中でインキュベートしそしてウェルをＰＢ
Ｓを用いてまたはポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレートを含有するＰＢＳを用いて洗った。基質を添
加しそして６３０ｎｍでのＯＤを測定した。ＰＢＳで洗
ったウェルはＯＤ−０，０９３±ｏ）ｏｏｅであったが
界面活性剤含有ＰＢＳで洗ったウェルはＯＤ−０，８５
３±０．０４２を示した。これはシグナル対ノイズ比７
．０であった。
この結果は、界面活性剤含有ＰＢＳ中における淋菌の不
顕性生育に続く特異的な抗体相互作用のせいではありえ
ない、何故なら淋菌は人体内または特別に配合された生
育培地上でのみ生育しうる偏性のヒト病原体だからであ
る。これらのデータは、ＬＰＳ結合性タンパク質の支持
体への吸着に高いｐＨを有する緩衝液が使用されても、
Ｂｒｙａｎｔ氏他がなぜ明らかな結合活性の保持を観察
したかを示すものと考えられる。
顕性生育に続く特異的な抗体相互作用のせいではありえ
ない、何故なら淋菌は人体内または特別に配合された生
育培地上でのみ生育しうる偏性のヒト病原体だからであ
る。これらのデータは、ＬＰＳ結合性タンパク質の支持
体への吸着に高いｐＨを有する緩衝液が使用されても、
Ｂｒｙａｎｔ氏他がなぜ明らかな結合活性の保持を観察
したかを示すものと考えられる。
ＬＰＳ結合性タンパク質が支持体表面に結合したのち、
支持体上の余分のタンパク質結合性部位は、それが存在
するとすれば、支持体への検出試薬の非特異的結合を避
けるために遮蔽されなければならない。これは活性支持
体をカゼインまたはウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略記する）溶液とインキュベートすることにより達成さ
れつる。
支持体上の余分のタンパク質結合性部位は、それが存在
するとすれば、支持体への検出試薬の非特異的結合を避
けるために遮蔽されなければならない。これは活性支持
体をカゼインまたはウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略記する）溶液とインキュベートすることにより達成さ
れつる。
標識された検出試薬を妨害しないために、選択されたＢ
ＳＡを他のタンパク質で代えることができる。
ＳＡを他のタンパク質で代えることができる。
活性支持体調製が完了したのち、このものをＬＰＳを含
有することが疑われる試験検体と接触させる。この試験
検体は前記したＬＡＬアッセイのいずれかによって現在
アッセイされるどの物質でもよい。さらに、検体は動物
またはヒト超厚の生理学的液体、組織または排出物であ
ることもできる。検体は周囲温度から上の広い温度範囲
で活性支持体と接触でき、３７℃が好ましい。検体は検
体からの実質上すべてのＬＰＳの捕捉が確保されるに充
分な時間、活性支持体上の固定された捕捉試薬と接触し
ていなければならない。この期間は。
有することが疑われる試験検体と接触させる。この試験
検体は前記したＬＡＬアッセイのいずれかによって現在
アッセイされるどの物質でもよい。さらに、検体は動物
またはヒト超厚の生理学的液体、組織または排出物であ
ることもできる。検体は周囲温度から上の広い温度範囲
で活性支持体と接触でき、３７℃が好ましい。検体は検
体からの実質上すべてのＬＰＳの捕捉が確保されるに充
分な時間、活性支持体上の固定された捕捉試薬と接触し
ていなければならない。この期間は。
支持体の寸法、形状および性質ならびに用いられる温度
の如何によろう。周囲温度においては、必要な時間は約
１時間から約４時間であり、２時間が好ましい。３７℃
では、この時間は約１５分〜２時間で、３０分が好まし
い。
の如何によろう。周囲温度においては、必要な時間は約
１時間から約４時間であり、２時間が好ましい。３７℃
では、この時間は約１５分〜２時間で、３０分が好まし
い。
検体と接触したのち、結合されたＬＰＳを有する活性支
持体は例えば界面活性剤を含有しない緩衝液で洗浄する
ことにより非結合物質から分離されうる。次にこの複合
物を標識された検出試薬とインキュベーションする。分
離工程を含むこの連続添加操作が好ましいが、分離工程
を排除（交互添加操作）しそして活性支持体を検体およ
び標識された検出試薬と実質上同時に接触させるような
他の操作を用いることもできる。これらの代替操作によ
り、アッセイ遂行に要する時間が短縮されうるが、しか
しながらアッセイ感度が低下しつる。
持体は例えば界面活性剤を含有しない緩衝液で洗浄する
ことにより非結合物質から分離されうる。次にこの複合
物を標識された検出試薬とインキュベーションする。分
離工程を含むこの連続添加操作が好ましいが、分離工程
を排除（交互添加操作）しそして活性支持体を検体およ
び標識された検出試薬と実質上同時に接触させるような
他の操作を用いることもできる。これらの代替操作によ
り、アッセイ遂行に要する時間が短縮されうるが、しか
しながらアッセイ感度が低下しつる。
標識された検出試薬と複合物との反応温度およびそれに
要する時間は第一工程において用いられているのと同様
でありうる。一般的には、それに要する反応時間を減少
させるには比較的高い温度が好ましい。しかしながら、
高められた温度での標識された検出試薬の安定性が最適
反応温度の判定に際して考慮される必要がある。
要する時間は第一工程において用いられているのと同様
でありうる。一般的には、それに要する反応時間を減少
させるには比較的高い温度が好ましい。しかしながら、
高められた温度での標識された検出試薬の安定性が最適
反応温度の判定に際して考慮される必要がある。
標識された検出試薬は特異的な結合性タンパク質と標識
との接合体である。特異的な結合性タンパク質はイムノ
グロブリン（類）、レクチン（類）、あるいはリムルス
またはタキブレウス変形細胞溶解物からの精製ＬＰＳ結
合性タンパク質（類）であることができる。適当な特異
性または反応性を有する検出試薬は特定の適用に関する
要求に合致するように選択されそして抗体の混合物に基
づくもののような混合物であることができる。
との接合体である。特異的な結合性タンパク質はイムノ
グロブリン（類）、レクチン（類）、あるいはリムルス
またはタキブレウス変形細胞溶解物からの精製ＬＰＳ結
合性タンパク質（類）であることができる。適当な特異
性または反応性を有する検出試薬は特定の適用に関する
要求に合致するように選択されそして抗体の混合物に基
づくもののような混合物であることができる。
特異性は例えば、淋菌からのＬＰＳに特異的な抗体を用
いることにより個々の種に限定することができるし、ま
た結合性タンパク質は精製ＬＰＳ結合性タンパク質にお
けるように広く反応性であることもできる。アッセイ目
的を達成しうるためには、検出試薬がＬＰＳ分子の限定
されたセットにとって特異的であることが重要である。
いることにより個々の種に限定することができるし、ま
た結合性タンパク質は精製ＬＰＳ結合性タンパク質にお
けるように広く反応性であることもできる。アッセイ目
的を達成しうるためには、検出試薬がＬＰＳ分子の限定
されたセットにとって特異的であることが重要である。
例えば、糞便検体が淋菌を含有するか否か判定するため
には、検出試薬（類）は淋菌ＬＰＳに特異的でなければ
ならない。検出試薬が腸内グラム陰性細菌からのＬＰＳ
とも反応すべき場合はそのものは淋菌ＬＰＳと正常な細
菌叢のＬＰＳとの間を区別する必要はない。しかしなが
らその超厚にかかわりなくすべてのＬＰＳの検出を意図
する場合またはＬＰＳ挟雑物の除去を意図する場合は、
検出試薬（または試薬類）は広く反応性である必要があ
り、ＬＰＳ種のサブセットに限定されるべきでない。
には、検出試薬（類）は淋菌ＬＰＳに特異的でなければ
ならない。検出試薬が腸内グラム陰性細菌からのＬＰＳ
とも反応すべき場合はそのものは淋菌ＬＰＳと正常な細
菌叢のＬＰＳとの間を区別する必要はない。しかしなが
らその超厚にかかわりなくすべてのＬＰＳの検出を意図
する場合またはＬＰＳ挟雑物の除去を意図する場合は、
検出試薬（または試薬類）は広く反応性である必要があ
り、ＬＰＳ種のサブセットに限定されるべきでない。
検出試薬接合体中の標識は通常アッセイに用いられる任
意のレポータ一部分であることができる。
意のレポータ一部分であることができる。
好ましい標識には放射性同位元素、その活性がアッセイ
されうる酵素、および蛍光性分子でありうる。標識は直
接結合、リンカ−アームによる結合または抗イムノグロ
ブリン抗体またはタンパク質Ａのような二次試薬を用い
る結合を含む知られた化学的方法を利用することにより
特異的な結合性タンパク質に結合されつる。二次試薬が
用いられる場合は、これらは特異的な結合性タンパク質
を活性支持体／ＬＰＳ複合物と接触させる前または後に
特異的な結合タンパク質と結合されうる。
されうる酵素、および蛍光性分子でありうる。標識は直
接結合、リンカ−アームによる結合または抗イムノグロ
ブリン抗体またはタンパク質Ａのような二次試薬を用い
る結合を含む知られた化学的方法を利用することにより
特異的な結合性タンパク質に結合されつる。二次試薬が
用いられる場合は、これらは特異的な結合性タンパク質
を活性支持体／ＬＰＳ複合物と接触させる前または後に
特異的な結合タンパク質と結合されうる。
これら代替例をあげれば、抗体−酵素接合体の使用、お
よびはじめに抗体の使用とそれに続くタンパク質入−酵
素接合体の結合である。
よびはじめに抗体の使用とそれに続くタンパク質入−酵
素接合体の結合である。
インキュベーション後、固相を分離しそして界面活性剤
を含有しないＰＢＳで洗浄しうる。次に結合された検出
試薬は、その接合体に用いられている個々の標識に対し
て適切に検出されうる。標識および検出方法に基づき、
定性的または定量的結果が得られうる。
を含有しないＰＢＳで洗浄しうる。次に結合された検出
試薬は、その接合体に用いられている個々の標識に対し
て適切に検出されうる。標識および検出方法に基づき、
定性的または定量的結果が得られうる。
特異的な結合アッセイに有用であることに加え、本発明
の活性支持体は生物医学または化粧品適用のような種々
の他の適用に意図される水性試薬からＬＰＳを除去する
のにも用いられうる。これらの適用に有用な活性支持体
は特異的な結合アッセイに有用なものとは異なる形態、
例えば比較的広い表面積および比較的大きい結合容量を
とりうる。
の活性支持体は生物医学または化粧品適用のような種々
の他の適用に意図される水性試薬からＬＰＳを除去する
のにも用いられうる。これらの適用に有用な活性支持体
は特異的な結合アッセイに有用なものとは異なる形態、
例えば比較的広い表面積および比較的大きい結合容量を
とりうる。
これら活性支持体はフィルター、小さい磁性粒子等の形
態で好都合に構成されうる。
態で好都合に構成されうる。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例 １
淋菌ＬＰＳについてのサンドイッチアッセイ淋菌（Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）をチョコレ
ート寒天プレート上３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で生育
させた。淋菌の純粋な培養物を、商業的に入手しつる栄
養補充物（ＩｓｏＶｉｔａｌｃ Ｘ Ｅｎｒｉｃｈｍｅ
ｎｔ、 ＢＢＬＭｉｃｒｏｂｉｏ！ｏｇｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、 Ｂｃｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｃｒｓｏｎａｎｄ
Ｇｏ、製、Ｃｏｃｋｃｙｓｖｌｌｌｅ、 ＭＤ） １％
を補充した、プロテアーゼペプトンＮｏ、３（米国Ｄｉ
ｆ’ｃ。
ｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）をチョコレ
ート寒天プレート上３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で生育
させた。淋菌の純粋な培養物を、商業的に入手しつる栄
養補充物（ＩｓｏＶｉｔａｌｃ Ｘ Ｅｎｒｉｃｈｍｅ
ｎｔ、 ＢＢＬＭｉｃｒｏｂｉｏ！ｏｇｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、 Ｂｃｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｃｒｓｏｎａｎｄ
Ｇｏ、製、Ｃｏｃｋｃｙｓｖｌｌｌｅ、 ＭＤ） １％
を補充した、プロテアーゼペプトンＮｏ、３（米国Ｄｉ
ｆ’ｃ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）１５ｇを含有する１ｇの
シェーカーフラスコに移し、そして３７℃でブロス培養
物として生育させた。１８時間生育させたのち検体をと
り出した。この検体を連続希釈しそしてチョコレート寒
天プレートに接種して生存能力のある細菌数／ｍｌを測
定した。生きた培養物の残余を加熱処理により殺した。
シェーカーフラスコに移し、そして３７℃でブロス培養
物として生育させた。１８時間生育させたのち検体をと
り出した。この検体を連続希釈しそしてチョコレート寒
天プレートに接種して生存能力のある細菌数／ｍｌを測
定した。生きた培養物の残余を加熱処理により殺した。
殺された細胞を遠心分離により収穫し、滅菌培地で洗い
、少量の滅菌培地中に再懸濁させ、そして必要時まで凍
結させた。
、少量の滅菌培地中に再懸濁させ、そして必要時まで凍
結させた。
凍結乾燥されたリムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ。
Ｐｙｒｏｇｅｎｔ、 Ｍａｉｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、 Ｉ
ｎｃ、製、 Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ。
ｎｃ、製、 Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ。
Ｎｏ）をＬＰＳを含有しない燐酸塩緩衝食塩水ＣＰ Ｂ
Ｓ）を用いタンパク質濃度４４０■／ｍｌに再構成し
た。再構成したリムルス溶解物のＰＢＳ中の１１５およ
び１／１０希釈物を調製した。ｐＨは７．２〜７，４で
あった。
Ｓ）を用いタンパク質濃度４４０■／ｍｌに再構成し
た。再構成したリムルス溶解物のＰＢＳ中の１１５およ
び１／１０希釈物を調製した。ｐＨは７．２〜７，４で
あった。
活性支持体を調製するには、下記のもの、すなわちＰＢ
Ｓ中の０．５％（ｖ／ｖ） Ｂ Ｓ Ａ ｔｏｏμ＋！
、および４４０．８８および４４μｇ／ｍｌ濃度のリム
ルス溶解物１００μｇをミクロ滴定プレートの異なるウ
ェルに添加した。この溶液をウェル中室温で２時間放置
した。プレートをＰＢＳ中で６回洗浄した。非特異的結
合を遮蔽するために、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）Ｂ
ＳＡ２００μｇを各ウェルに添加しそしてプレートを室
温で１時間放置した。このプレートをＰＢＳで６回洗っ
た。次にすべてのウェルに１×１０７ＣＦＶ／ｍｌ濃度
の淋菌の懸濁液１００μｇを加えた。
Ｓ中の０．５％（ｖ／ｖ） Ｂ Ｓ Ａ ｔｏｏμ＋！
、および４４０．８８および４４μｇ／ｍｌ濃度のリム
ルス溶解物１００μｇをミクロ滴定プレートの異なるウ
ェルに添加した。この溶液をウェル中室温で２時間放置
した。プレートをＰＢＳ中で６回洗浄した。非特異的結
合を遮蔽するために、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）Ｂ
ＳＡ２００μｇを各ウェルに添加しそしてプレートを室
温で１時間放置した。このプレートをＰＢＳで６回洗っ
た。次にすべてのウェルに１×１０７ＣＦＶ／ｍｌ濃度
の淋菌の懸濁液１００μｇを加えた。
このプレートを再び室温で１時間放置した。このプレー
トをＰＢＳで６回洗浄した。次にすべてのウェルに、ヘ
テロ２官能性結合剤Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）を介してセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼに接合した淋菌ＬＰＳ特異的なモノクローナル抗体
Ｎ（Ｌｉ２Ｑ（ＩｇＧ抗体）の１／４０希釈物１００μ
ｇを加えた。
トをＰＢＳで６回洗浄した。次にすべてのウェルに、ヘ
テロ２官能性結合剤Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）を介してセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼに接合した淋菌ＬＰＳ特異的なモノクローナル抗体
Ｎ（Ｌｉ２Ｑ（ＩｇＧ抗体）の１／４０希釈物１００μ
ｇを加えた。
このモノクローナル抗体およびその酵素接合体は現在よ
く知られている慣用の方法により得られた。
く知られている慣用の方法により得られた。
このプレートを室温で４５分間放置した。このプレート
をＰＢＳで６回洗浄した。次にすべてのウェルに新たに
調製された色原体基質である１、５μＭテトラメチルベ
ンジジン（ＴＢＭ）溶液１００μｇを加え、そして室温
で１５分間放置した。光学濃度は、参照光線を４９０ｎ
１１に設定してミクロ滴定プレート用読み取り装置（Ｍ
ｌｃｒｏｐｌａｔｅ ＲｅａｄｅｒＭＲ８００，米国ｏ
ｙｎａｔｅｃｈ社製）を用いＢ３０ｎｍで読み取った。
をＰＢＳで６回洗浄した。次にすべてのウェルに新たに
調製された色原体基質である１、５μＭテトラメチルベ
ンジジン（ＴＢＭ）溶液１００μｇを加え、そして室温
で１５分間放置した。光学濃度は、参照光線を４９０ｎ
１１に設定してミクロ滴定プレート用読み取り装置（Ｍ
ｌｃｒｏｐｌａｔｅ ＲｅａｄｅｒＭＲ８００，米国ｏ
ｙｎａｔｅｃｈ社製）を用いＢ３０ｎｍで読み取った。
その結果を第１表に示す。これは４回測定した平均であ
る。
る。
第１表
淋菌ＬＰＳの検出
ウェルに添加されたＬＡＬ 光学濃度（μｇ／
ｍｌ ） （６３０ｎａ＋）なしく０
．５％Ｂ Ｓ Ａ） ０．０１７±０．００
４４４ ０．２Ｂ４±０．０２４８８
０．５１５±０．０４３４４０
１．１２３±０．０７８ＬＡＬで被覆されたウ
ェルは淋菌からのＬＰＳを捕促し、洗浄工程を通してそ
のＬＰＳを保有しており、そしてそのものを抗原的に完
全無欠でサンドイッチアッセイ用の淋菌ＬＰＳ特異的な
モノクローナル抗体に接近しうる形態で提示した。
ｍｌ ） （６３０ｎａ＋）なしく０
．５％Ｂ Ｓ Ａ） ０．０１７±０．００
４４４ ０．２Ｂ４±０．０２４８８
０．５１５±０．０４３４４０
１．１２３±０．０７８ＬＡＬで被覆されたウ
ェルは淋菌からのＬＰＳを捕促し、洗浄工程を通してそ
のＬＰＳを保有しており、そしてそのものを抗原的に完
全無欠でサンドイッチアッセイ用の淋菌ＬＰＳ特異的な
モノクローナル抗体に接近しうる形態で提示した。
捕促されたＬＰＳ抗原の量はウェルに吸着されたＬＡＬ
濃度が増大するに伴い増加した。
濃度が増大するに伴い増加した。
実施例 ２
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ ｃｏｌ
、１） （大腸菌）ＬＰＳについてのサンドイッチ ア
ッセイ大腸菌菌性に２３５から精製されたリポ多糖類を
ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇ１ｃａ１社から購入した。凍結乾
燥されたリムルス変形細胞溶解物（Ｐｙｒｏｇｅｎｔ）
を滅菌蒸留水中に５ 、４ ｔｎｇ／ｍｌ濃度に再構成
し、０．３９ｍ１ずつに分け、使用時まで一２０℃で冷
凍した。使用直前に、ＬＡＬを解凍し、そしてＬＰＳを
含まないＰＢＳ８ｍｌを添加してＬＡＬ濃度２５０■／
ｍｌとした。
、１） （大腸菌）ＬＰＳについてのサンドイッチ ア
ッセイ大腸菌菌性に２３５から精製されたリポ多糖類を
ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇ１ｃａ１社から購入した。凍結乾
燥されたリムルス変形細胞溶解物（Ｐｙｒｏｇｅｎｔ）
を滅菌蒸留水中に５ 、４ ｔｎｇ／ｍｌ濃度に再構成
し、０．３９ｍ１ずつに分け、使用時まで一２０℃で冷
凍した。使用直前に、ＬＡＬを解凍し、そしてＬＰＳを
含まないＰＢＳ８ｍｌを添加してＬＡＬ濃度２５０■／
ｍｌとした。
ミクロ滴定プレートの異なるウェルにＬＡＬ１００μｇ
を添加しそしてこのプレートを室温で２時間放置した。
を添加しそしてこのプレートを室温で２時間放置した。
このプレートをＰＢＳで６回洗った。
次にこのウェルをＰＢＥ中の０．５％（ｗ／ｖ） Ｂ
Ｓ Ａ２００μｇで遮断しそしてプレートを室温で１時
間放置した。このプレートを再びＰＢＳで６回洗ったＬ
ＡＬで被覆されたウェルを大腸菌に２３５からのＬＰＳ
（各ウェル当りそれぞれ１０．５０および２５０ｎｇ
）と室温で１時間接触させた。このプレートを再びＰＢ
Ｓで６回洗った。次にすべてのウェルにウサギの抗−大
腸菌Ｋ ２３５ＬＰＳ （ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中
に１／ １００に希釈）１００μＱを加え、室温で１時
間放置した。このプレートをＰＢＳで６回洗浄した。
Ｓ Ａ２００μｇで遮断しそしてプレートを室温で１時
間放置した。このプレートを再びＰＢＳで６回洗ったＬ
ＡＬで被覆されたウェルを大腸菌に２３５からのＬＰＳ
（各ウェル当りそれぞれ１０．５０および２５０ｎｇ
）と室温で１時間接触させた。このプレートを再びＰＢ
Ｓで６回洗った。次にすべてのウェルにウサギの抗−大
腸菌Ｋ ２３５ＬＰＳ （ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中
に１／ １００に希釈）１００μＱを加え、室温で１時
間放置した。このプレートをＰＢＳで６回洗浄した。
次に各ウェルに、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中に１ ：
２０００に希釈したセイヨウワサビ ペルオキシダー
ゼ−タンパク質入接合体の溶液１００μａずつを添加し
た。これを室温で１時間放置した。このプレートをＰＢ
Ｓで６回洗い、次に新たに調製された色原体基質１．５
μＭ ＴＭＢ溶液１００μｇをすべてのウェルに加え
た。基質溶液の光学濃度を、参照光線を４９０ｎｌｌに
設定してＭＲ−６００ミクロ滴定プレート読み取り装置
を用い１０分後に６３０ｎｍで読み取った。その結果を
第２表に示す。
２０００に希釈したセイヨウワサビ ペルオキシダー
ゼ−タンパク質入接合体の溶液１００μａずつを添加し
た。これを室温で１時間放置した。このプレートをＰＢ
Ｓで６回洗い、次に新たに調製された色原体基質１．５
μＭ ＴＭＢ溶液１００μｇをすべてのウェルに加え
た。基質溶液の光学濃度を、参照光線を４９０ｎｌｌに
設定してＭＲ−６００ミクロ滴定プレート読み取り装置
を用い１０分後に６３０ｎｍで読み取った。その結果を
第２表に示す。
０ ０．００７±０．００２１０
０．０４５±０．００６５０ ０．１９０
±０．００４２５０ ０．４０３±０．０２
３この実施例により、大腸菌に２３５ＬＰＳが固定され
たＬＡＬにより捕捉されることおよび検体中のわずか１
０ｎｇのＬＰＳが特異的な抗体を用いるサンドイッチ
アッセイにおいて免疫学的に検出されうろことが示され
る。何らアッセイ最適化が行われておらず、しかも未精
製ポリクローナルウサギ抗血清が使用されているゆえに
、このアッセイ感度は特に驚くべきものであった。
０．０４５±０．００６５０ ０．１９０
±０．００４２５０ ０．４０３±０．０２
３この実施例により、大腸菌に２３５ＬＰＳが固定され
たＬＡＬにより捕捉されることおよび検体中のわずか１
０ｎｇのＬＰＳが特異的な抗体を用いるサンドイッチ
アッセイにおいて免疫学的に検出されうろことが示され
る。何らアッセイ最適化が行われておらず、しかも未精
製ポリクローナルウサギ抗血清が使用されているゆえに
、このアッセイ感度は特に驚くべきものであった。
実施例 ３
種々の菌株からの淋菌ＬＰＳについてのサンドイッチ
アッセイ血清型特異性が異なる９種類の淋菌菌株を生育
させ、収穫しそして実施例１記載のようにして熱不活性
化した。細菌懸濁液をＩ×１０６ＣＦ Ｕ／ｍｌの濃度
に調製した。実施例２記載のＬＡＬの一部分を解凍し、
ＰＢＳ中２１５ｑ／ｍｌに調製し、そして１００μｇず
つをミクロ滴定プレートのウェル中に入れた。このプレ
ートを室温で２時間放置し、次にＰＢＳ中で６回洗った
。次に各ウェルにＰＢＳ中の０，５％Ｂ５Ａ２００μｇ
ずつを加え、室温で１時間放置した。このプレートを再
びＰＢＳ中で６回洗った。次に各ウェルに柾々の不活性
淋菌懸濁液１００μｇずつを加えた。対照には、ＬＰＳ
を含まないＰＢＳが用いられた。このプレートを室温で
１時間放置し、次にＰＢＳ中で６回洗った。次にウェル
内容物を、Ｑ、１％ＢＳＡ中１／２００に希釈された淋
菌特異的なモノクローナル抗体［０６Ｂ４１ｇＭクラス
、Ｒ，Ｍａｎｄｒｅｌ１氏他。
アッセイ血清型特異性が異なる９種類の淋菌菌株を生育
させ、収穫しそして実施例１記載のようにして熱不活性
化した。細菌懸濁液をＩ×１０６ＣＦ Ｕ／ｍｌの濃度
に調製した。実施例２記載のＬＡＬの一部分を解凍し、
ＰＢＳ中２１５ｑ／ｍｌに調製し、そして１００μｇず
つをミクロ滴定プレートのウェル中に入れた。このプレ
ートを室温で２時間放置し、次にＰＢＳ中で６回洗った
。次に各ウェルにＰＢＳ中の０，５％Ｂ５Ａ２００μｇ
ずつを加え、室温で１時間放置した。このプレートを再
びＰＢＳ中で６回洗った。次に各ウェルに柾々の不活性
淋菌懸濁液１００μｇずつを加えた。対照には、ＬＰＳ
を含まないＰＢＳが用いられた。このプレートを室温で
１時間放置し、次にＰＢＳ中で６回洗った。次にウェル
内容物を、Ｑ、１％ＢＳＡ中１／２００に希釈された淋
菌特異的なモノクローナル抗体［０６Ｂ４１ｇＭクラス
、Ｒ，Ｍａｎｄｒｅｌ１氏他。
ｒｌｎｒｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ １ｍｎ＋ｕｎｉｔｙＪ
、 ５４． ［１３−８９（１９８８））ｉｏｏμｇ
で、またはｌ／ｌｏｏに希釈された口６１３４の５０μ
ｇおよび０．ＯＩ％ＢＳＡ中１／２５０に希釈されたモ
ノクローナル抗体１７９の５０μｑを含有する、２種の
モノクローナル抗体の混合物で別々に処理した。
、 ５４． ［１３−８９（１９８８））ｉｏｏμｇ
で、またはｌ／ｌｏｏに希釈された口６１３４の５０μ
ｇおよび０．ＯＩ％ＢＳＡ中１／２５０に希釈されたモ
ノクローナル抗体１７９の５０μｑを含有する、２種の
モノクローナル抗体の混合物で別々に処理した。
室温で１時間インキュベーションしたのち、ウェルをＰ
ＢＳで６回洗い、次にタンパク質入−セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体（Ｍｉｌｅｓ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） １００μＲで処理した。室
温で１時間インキュベーションしたのち、プレートをＰ
ＢＳ中で６回洗い、そして新たに調製した１、５μＭ
ＴＭＢ溶液１００μｇで処理した。参照光線を４９０
ｎｍに設定してＭＲ−１３００ミクロ滴定プレート読み
取り装置を用い、室温で１０分後に６３０ｎｍでの吸収
を読み取った。
ＢＳで６回洗い、次にタンパク質入−セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体（Ｍｉｌｅｓ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） １００μＲで処理した。室
温で１時間インキュベーションしたのち、プレートをＰ
ＢＳ中で６回洗い、そして新たに調製した１、５μＭ
ＴＭＢ溶液１００μｇで処理した。参照光線を４９０
ｎｍに設定してＭＲ−１３００ミクロ滴定プレート読み
取り装置を用い、室温で１０分後に６３０ｎｍでの吸収
を読み取った。
別の実験で、Ｌ Ａ Ｌ （２３Ｇｔ１ｇ／ ｍｌ ）
をミクロ滴定プレートのウェル上に被覆しそして同じ９
種の淋菌菌株（血清型１〜９）を高濃度（８Ｘ １０”
〜Ｉ Ｘｌ０９ＣＦ Ｕ／ｍｌ）で活性支持体とインキ
ュベーションした。洗浄後、抗体１７９とＨＲＰとの接
合体、次に基質を細胞に添加した。光学濃度は前記した
ようにして８３０ｎ１１で測定した。これら別々の実験
の結果を第３表に示す。
をミクロ滴定プレートのウェル上に被覆しそして同じ９
種の淋菌菌株（血清型１〜９）を高濃度（８Ｘ １０”
〜Ｉ Ｘｌ０９ＣＦ Ｕ／ｍｌ）で活性支持体とインキ
ュベーションした。洗浄後、抗体１７９とＨＲＰとの接
合体、次に基質を細胞に添加した。光学濃度は前記した
ようにして８３０ｎ１１で測定した。これら別々の実験
の結果を第３表に示す。
（以下余白）
第 ３ 表
ブランク ０．０２５ ０．０２５ ０．０
Ｂ７１ ０．０４１０．０３７ ２ ０．０８１０．２０２ ３ ０．０１９０．０００ ４ ０．０３００．０００ ５ ０．０５１１．００５ ０．２８１６ ０．１２９
０４６８ ７ ０．１３４０．１７５ ８ ０．０７４０．：（８５０，１７３９０，０９１０
，９２６０，３７７ この表から判るように、抗体０６Ｂ４は例えば血清型６
および７とよく反応するが、一方抗体１７９は血清型５
，８および９とは強く反応するが例えば血清型２． ３
．４および７とは弱くかまたは全熱反応しない。従って
、この実験は検出試薬の特異性を拡大させるために検出
試薬として多重抗体を使用することの可能性を示し、Ｌ
ＡＬにより捕捉されたＬＰＳが大きいイムノグロブリン
分子（０８Ｂ４はＩｇＭ抗体）にすらも接近可能なまま
であることを示し、そして本発明の方法が種々のそして
多数の細菌血清型を検出しうろことを示している。
Ｂ７１ ０．０４１０．０３７ ２ ０．０８１０．２０２ ３ ０．０１９０．０００ ４ ０．０３００．０００ ５ ０．０５１１．００５ ０．２８１６ ０．１２９
０４６８ ７ ０．１３４０．１７５ ８ ０．０７４０．：（８５０，１７３９０，０９１０
，９２６０，３７７ この表から判るように、抗体０６Ｂ４は例えば血清型６
および７とよく反応するが、一方抗体１７９は血清型５
，８および９とは強く反応するが例えば血清型２． ３
．４および７とは弱くかまたは全熱反応しない。従って
、この実験は検出試薬の特異性を拡大させるために検出
試薬として多重抗体を使用することの可能性を示し、Ｌ
ＡＬにより捕捉されたＬＰＳが大きいイムノグロブリン
分子（０８Ｂ４はＩｇＭ抗体）にすらも接近可能なまま
であることを示し、そして本発明の方法が種々のそして
多数の細菌血清型を検出しうろことを示している。
実施例 ４
アッセイ能に及ぼす反応温度の影響
血清型５を有する淋菌を生育させ、収穫しそして実施例
１記載のようにして不活化した。この実験においては、
アッセイが行われる温度が本発明のＬＡＬ捕捉アッセイ
に及ぼす影響について検査した。２つの別々のミクロ滴
定プレートを使用した。全工程は一方のプレートでは室
温でそしてもう一方のプレートでは３７℃で行われた。
１記載のようにして不活化した。この実験においては、
アッセイが行われる温度が本発明のＬＡＬ捕捉アッセイ
に及ぼす影響について検査した。２つの別々のミクロ滴
定プレートを使用した。全工程は一方のプレートでは室
温でそしてもう一方のプレートでは３７℃で行われた。
プレートをＰＢＳ中２５０回ｇ／ ｍｌのＬ Ａ Ｌ
１００μＲで被覆し、放置し、次にＰＢＳで洗い、ＰＢ
Ｓ中の０，５％Ｂ５Ａ２００μａで遮断しそして再びＰ
ＢＳで洗った。
１００μＲで被覆し、放置し、次にＰＢＳで洗い、ＰＢ
Ｓ中の０，５％Ｂ５Ａ２００μａで遮断しそして再びＰ
ＢＳで洗った。
次に両方のプレートに加熱して殺した淋菌（血清型５）
の種々の希釈物１００μｇを添加し、一方対照ウエルに
はＰＢＳ１００μｇを添加した。１方のプレートは室温
で１時間そしてもう一方は３７℃で３０分間放置した。
の種々の希釈物１００μｇを添加し、一方対照ウエルに
はＰＢＳ１００μｇを添加した。１方のプレートは室温
で１時間そしてもう一方は３７℃で３０分間放置した。
両方のプレートをＰＢＳで６回洗いそして次に０．１％
ＢＳＡ中に１１５００に希釈したウサギ抗淋菌ポリクロ
ーナル抗体ｌｏｏμＱを加えた。このプレートをそれぞ
れ室温で１時間および３７℃で３０分間放置した。両方
のプレートを洗浄し、次いて” １／２０００に希釈し
たセイヨウワサビ−タンパク質Ａ接合体１００μ２をす
べてのウェルに添加した。ここでまたプレートを前述の
ようにしてインキュベートし、ＰＢＳで６回洗い、続い
て新たに調製した１、５μＭ ＴＭＢ溶液１００μｇ
ずつをすべてのウェルに加えた。参照光線を４９８Ｏｎ
−に設定してＭＲ−６００ミクロ滴定プレート読み取り
装置を用い室温で（両方のプレート共）１０分後に６３
０ｎｍでのＯＤを読み取った。その結果を第４表に示す
。
ＢＳＡ中に１１５００に希釈したウサギ抗淋菌ポリクロ
ーナル抗体ｌｏｏμＱを加えた。このプレートをそれぞ
れ室温で１時間および３７℃で３０分間放置した。両方
のプレートを洗浄し、次いて” １／２０００に希釈し
たセイヨウワサビ−タンパク質Ａ接合体１００μ２をす
べてのウェルに添加した。ここでまたプレートを前述の
ようにしてインキュベートし、ＰＢＳで６回洗い、続い
て新たに調製した１、５μＭ ＴＭＢ溶液１００μｇ
ずつをすべてのウェルに加えた。参照光線を４９８Ｏｎ
−に設定してＭＲ−６００ミクロ滴定プレート読み取り
装置を用い室温で（両方のプレート共）１０分後に６３
０ｎｍでのＯＤを読み取った。その結果を第４表に示す
。
シグナル／ノイズ比は細胞の存在下と非存在下における
吸収比でありそしてアッセイ感度を表示するものである
。
吸収比でありそしてアッセイ感度を表示するものである
。
細 胞 ｉ イン手ュベーシ３ノ 光 学 濃
度 （シグナル）／（’Ｃ／分） （８３０
ｎｍ） ノイズ−２５／６０ ０．０１９
±０．００５ −−ＩＸＬＯ２５／６０ ０．０
１３±０．００３ ０．７５Ｘ１０ ２５／
１３０ ０．０１５±ｏ、ｏｏｔ ｏ、ａｌＸ
ｌ０ ２５／８０ ０．０２１±０．００４
１．１５ｘ１０ ２５／ｎｏ ０．０４
８±０．００２ ２．５ｌＸｌ０ ２５／６
０ ０．０８２±０．００２ ４．３ｌＸｌ０
２５／ＧＯ０，２７４±０．０１４ １４．
４ｌＸｌ０ ２５／６０ ０Ｊ７１±０．０１
３ １９．５− ３７／３０ ０．００
４±０．００４ −−ｌＸｌ０ ３７／３０
０．０２９±０．００７ ７．３５Ｘ１０
３７／３０ ０．０４５±０．０１９ １１
．２ｌＸｌ０ ３７／３０ ０．０３０±０．
０１０ ７．５５Ｘ １０’ ３７／３
０ ０．０９１±０．００７ ２２．８第
４ 表 細胞数 インキュベーション 光学 濃 度
（シグナル）／（’Ｃ／分） （６３０ｎｍ
） ノイズＬＸ １０ ３７／３０
０．１７７±０．０１６ ４４．３ＬＸｌｏ
３７／３０ ０．７９６±０．０５５ １９
９．０ｌＸｌ０ ３７／３０ １．１７９±０
．０３７ ２９４．８本発明のサンドイッチ アッセ
イにおけるインキュベーション工程を室温で１時間の代
りに３７℃で３０分間行うと、アッセイ感度が大きく改
善されそしてまたアッセイ実施に要する時間も短縮する
ことができた。２５℃では、２をこえるシグナル／ノイ
ズ比を達成するには５ Ｘ １０’個の細胞を必要とす
るが、一方３７℃ではＩ Ｘ ｔｏ”個の細胞で７より
大きいシグナル／ノイズ比を生じ、感度が５０倍増大し
ている。
度 （シグナル）／（’Ｃ／分） （８３０
ｎｍ） ノイズ−２５／６０ ０．０１９
±０．００５ −−ＩＸＬＯ２５／６０ ０．０
１３±０．００３ ０．７５Ｘ１０ ２５／
１３０ ０．０１５±ｏ、ｏｏｔ ｏ、ａｌＸ
ｌ０ ２５／８０ ０．０２１±０．００４
１．１５ｘ１０ ２５／ｎｏ ０．０４
８±０．００２ ２．５ｌＸｌ０ ２５／６
０ ０．０８２±０．００２ ４．３ｌＸｌ０
２５／ＧＯ０，２７４±０．０１４ １４．
４ｌＸｌ０ ２５／６０ ０Ｊ７１±０．０１
３ １９．５− ３７／３０ ０．００
４±０．００４ −−ｌＸｌ０ ３７／３０
０．０２９±０．００７ ７．３５Ｘ１０
３７／３０ ０．０４５±０．０１９ １１
．２ｌＸｌ０ ３７／３０ ０．０３０±０．
０１０ ７．５５Ｘ １０’ ３７／３
０ ０．０９１±０．００７ ２２．８第
４ 表 細胞数 インキュベーション 光学 濃 度
（シグナル）／（’Ｃ／分） （６３０ｎｍ
） ノイズＬＸ １０ ３７／３０
０．１７７±０．０１６ ４４．３ＬＸｌｏ
３７／３０ ０．７９６±０．０５５ １９
９．０ｌＸｌ０ ３７／３０ １．１７９±０
．０３７ ２９４．８本発明のサンドイッチ アッセ
イにおけるインキュベーション工程を室温で１時間の代
りに３７℃で３０分間行うと、アッセイ感度が大きく改
善されそしてまたアッセイ実施に要する時間も短縮する
ことができた。２５℃では、２をこえるシグナル／ノイ
ズ比を達成するには５ Ｘ １０’個の細胞を必要とす
るが、一方３７℃ではＩ Ｘ ｔｏ”個の細胞で７より
大きいシグナル／ノイズ比を生じ、感度が５０倍増大し
ている。
実施例 ５
連続的交互および同時アッセイ
本実施例においては、種々の試薬添加順序について検査
した、すなわち本発明のサンドイッチアッセイを実施す
るに際しての連続法、交互法および同時法である。
した、すなわち本発明のサンドイッチアッセイを実施す
るに際しての連続法、交互法および同時法である。
ミクロ滴定プレートのウェルをＬ Ａ Ｌ （２５０■
／ｍＬ実施例２参照）で被覆しそして３７℃で２時間放
置した。次にウェルをＰＢＳで６回洗いそしてＰＢＳ中
の０．５％Ｂ５Ａ２００μｇで遮断した（３７℃、１時
間）。検出試薬としてはウサギのポリクローナル抗淋菌
抗体が用いられた。
／ｍＬ実施例２参照）で被覆しそして３７℃で２時間放
置した。次にウェルをＰＢＳで６回洗いそしてＰＢＳ中
の０．５％Ｂ５Ａ２００μｇで遮断した（３７℃、１時
間）。検出試薬としてはウサギのポリクローナル抗淋菌
抗体が用いられた。
連続添加法は実施例１−４に記載されている。
加熱により殺された淋菌細胞の懸濁液（５０μＱ１細胞
５Ｘ１０６個）をＰＢ３５０μＱと共にウェルに添加し
た。これをインキュベー）Ｌ（３７℃、３０分）そして
次にＰＢＳで６回洗った。かくして形成されたＬＡＬ−
ＬＰＳ複合物を各ウェル中抗血清（１１５００に希釈）
１００μ９で処理し、そして３７℃で３０分間インキュ
ベーションした。抗体の結合は実施例４記載の操作に従
いＨＲＰ−タンパク質Ａ接合体を用いて測定された。
５Ｘ１０６個）をＰＢ３５０μＱと共にウェルに添加し
た。これをインキュベー）Ｌ（３７℃、３０分）そして
次にＰＢＳで６回洗った。かくして形成されたＬＡＬ−
ＬＰＳ複合物を各ウェル中抗血清（１１５００に希釈）
１００μ９で処理し、そして３７℃で３０分間インキュ
ベーションした。抗体の結合は実施例４記載の操作に従
いＨＲＰ−タンパク質Ａ接合体を用いて測定された。
同時添加法は淋菌懸濁液（細胞５ Ｘ １０６個）およ
び抗体（１１５００希釈物、１００μｇ）の両方をＬＡ
Ｌ被覆されたウェル（活性支持体）に同時に添加するこ
とにより行われた。３７℃で３０分インキュベーション
したのち、プレートをＰＢＳで６回洗いそして前記した
ようにしてＨＲＰ−タンパク質Ａ接合体を用いて抗体結
合を測定した。
び抗体（１１５００希釈物、１００μｇ）の両方をＬＡ
Ｌ被覆されたウェル（活性支持体）に同時に添加するこ
とにより行われた。３７℃で３０分インキュベーション
したのち、プレートをＰＢＳで６回洗いそして前記した
ようにしてＨＲＰ−タンパク質Ａ接合体を用いて抗体結
合を測定した。
交互添加アッセイはＬＡＬ被覆されたウェルに淋菌細胞
懸濁液（細胞５ Ｘ １０８個）を添加し、３７℃で１
５分間インキュベートし、そして次に抗体添加に先立つ
分、！ｉＩ／洗浄工程を行うことなく抗体（１１５００
希釈、１００μＱ）を添加した。３７℃でさらに１５分
間インキュベートしたのち、ウェルをＰＢＳで６回洗い
そして前記したＨＲＰ−タンパク質Ａ接合体を用いて抗
体結合について測定した。
懸濁液（細胞５ Ｘ １０８個）を添加し、３７℃で１
５分間インキュベートし、そして次に抗体添加に先立つ
分、！ｉＩ／洗浄工程を行うことなく抗体（１１５００
希釈、１００μＱ）を添加した。３７℃でさらに１５分
間インキュベートしたのち、ウェルをＰＢＳで６回洗い
そして前記したＨＲＰ−タンパク質Ａ接合体を用いて抗
体結合について測定した。
それぞれの方法についての対照ウェルは淋菌細胞の代り
にＰＢＳが添加される他は試験ウェルと同様に処理され
た。結果を第５表に示す。
にＰＢＳが添加される他は試験ウェルと同様に処理され
た。結果を第５表に示す。
第 ５ 表
試 薬 試 料 光学濃度（６３０ｎｍ） ′グｆ′
′／添 加 ノイズ連続め 対
照 ０．０１１±０．００１ −細胞 ０．３
１３±０．００９ ２８．５同、ｊｊ対照 ０．０２４
±０．川 −細胞 ０．１６７±０．００７ ’７．
０交互対照 ０．０１７±０．００２ ＝細胞 ０．
２０５±０．００７ １２．１これらの結果は、連続的
操作が生成される総シグナルおよびシグナル／ノイズ比
の両方に関して最良の性能をもたらすことを示している
。アッセイ時間は種々のアッセイ工程を組み合せること
により短縮できるが、アッセイ性能は付随して低下した
。交互操作は同時操作に比較して総シグナルおよびシグ
ナル／ノイズ比を改善した。同時添加操作では連続添加
の４７．４％の特異的なシグナル（細胞を含有するウェ
ルと対照との吸収値の差）が生じ、一方交互添加では特
異的なシグナルの６２．３％を生じた。
′／添 加 ノイズ連続め 対
照 ０．０１１±０．００１ −細胞 ０．３
１３±０．００９ ２８．５同、ｊｊ対照 ０．０２４
±０．川 −細胞 ０．１６７±０．００７ ’７．
０交互対照 ０．０１７±０．００２ ＝細胞 ０．
２０５±０．００７ １２．１これらの結果は、連続的
操作が生成される総シグナルおよびシグナル／ノイズ比
の両方に関して最良の性能をもたらすことを示している
。アッセイ時間は種々のアッセイ工程を組み合せること
により短縮できるが、アッセイ性能は付随して低下した
。交互操作は同時操作に比較して総シグナルおよびシグ
ナル／ノイズ比を改善した。同時添加操作では連続添加
の４７．４％の特異的なシグナル（細胞を含有するウェ
ルと対照との吸収値の差）が生じ、一方交互添加では特
異的なシグナルの６２．３％を生じた。
特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外２名
・アンド・コンパニー 外２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）下記工程、すなわち （Ａ）捕捉試薬を固定させて、実質的に ｉ）水不溶性支持体、および ｉｉ）該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 （Ｂ）リポ多糖類を含有するかまたは含有することが疑
われる検体を前記活性支持体と接触させ、 （Ｃ）工程（Ｂ）で形成された活性支持体−リポ多糖類
複合物を標識された検出試薬と接触させ、そして （Ｄ）結合されたかまたは結合されてない標識のいずれ
かを検出する ことからなるリポ多糖類検出のためのサンドイッチアッ
セイ。 ２）前記リポ多糖類結合性タンパク質が、リムルス・ポ
リフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）
、タキプレウス・トリデンタツス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕ
ｓ ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、カルシノスコルピウス
・ロツンジカウダ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ
ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）またはタキプレウス・ギガ
ス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｇｉｇａｓ）からの変形細
胞の結合性タンパク質から選択される請求項１記載のサ
ンドイッチアッセイ。 ３）前記リポ多糖類結合性タンパク質がリムルス・ポリ
フェムス、タキプレウス・トリデンタツス、カルシノス
コルピウス・ロツンジカウダおよびタキプレウス・ギガ
スの変形細胞溶解物からなる群から選択される請求項１
記載のサンドイッチアッセイ。 ４）前記捕捉試薬がｐＨ９より下で支持体上に固定され
る請求項１または２記載のサンドイッチアッセイ。 ５）前記捕捉試薬が界面活性剤の非存在下に支持体上に
固定される請求項１または２記載のサンドイッチアッセ
イ。 ６）工程（Ｂ）で形成される前記複合物がすべての非結
合物質から分離される請求項１記載のサンドイッチアッ
セイ。 ７）前記活性支持体を検体および標識された検出試薬と
実質上同時に接触させる請求項１記載のサンドイッチア
ッセイ。 ８）前記標識された検出試薬が特異的な結合性タンパク
質と標識との接合体である請求項１記載のサンドイッチ
アッセイ。 ９）前記特異的な結合性タンパク質がイムノグロブリン
、レクチンおよび純粋なリポ多糖類結合性タンパク質か
らなる群から選択される請求項８記載のサンドイッチア
ッセイ。 １０）前記標識が放射性同位元素、酵素および蛍光性分
子からなる群から選択される請求項８記載のサンドイッ
チアッセイ。 １１）下記工程、すなわち （Ａ）捕捉試薬を固定させて、実質的に ｉ）水不溶性支持体、および ｉｉ）該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 （Ｂ）リポ多糖類を含有するかまたは含有することが疑
われる検体を前記活性支持体と接触させ、そして （Ｃ）活性支持体に結合されたリポ多糖類を検体から分
離する ことからなる、検体からのリポ多糖類の除去法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11,327 | 1987-01-21 | ||
| US07/011,327 US4906567A (en) | 1987-01-21 | 1987-01-21 | Non-immunochemical binding of lipopolysaccharides and sandwich assays therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63222265A true JPS63222265A (ja) | 1988-09-16 |
| JPH0782021B2 JPH0782021B2 (ja) | 1995-09-06 |
Family
ID=21749895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63009767A Expired - Fee Related JPH0782021B2 (ja) | 1987-01-21 | 1988-01-21 | リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4906567A (ja) |
| EP (1) | EP0279517B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0782021B2 (ja) |
| CA (1) | CA1303982C (ja) |
| DE (1) | DE3866372D1 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5759774A (en) * | 1988-05-18 | 1998-06-02 | Cobe Laboratories, Inc. | Method of detecting circulating antibody types using dried or lyophilized cells |
| US5594113A (en) * | 1988-06-23 | 1997-01-14 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
| US5187066A (en) * | 1990-02-14 | 1993-02-16 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Methods for detecting amphiphilic antigens |
| US5198339A (en) * | 1990-07-13 | 1993-03-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for detection of gram-negative bacterial lipopolysaccharides in biological fluids |
| JP3322700B2 (ja) * | 1992-09-14 | 2002-09-09 | 生化学工業株式会社 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
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| SG107124A1 (en) * | 1994-08-19 | 2004-11-29 | Univ Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes |
| US5807694A (en) * | 1995-09-07 | 1998-09-15 | Economic Innovation And Technology Council, University Of Manitoba | Detection of salmonella enteritidis and other pathogenic microorganisms and monoclonal antibody useful therefor |
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| EP1166113A1 (en) * | 1999-04-07 | 2002-01-02 | Unilever Plc | Lipopolysaccharide immunoassay and test device |
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| US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
| US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
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| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
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-
1987
- 1987-01-21 US US07/011,327 patent/US4906567A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-01-20 DE DE8888300450T patent/DE3866372D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-20 CA CA000556951A patent/CA1303982C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-20 EP EP88300450A patent/EP0279517B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-21 JP JP63009767A patent/JPH0782021B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0279517B1 (en) | 1991-11-27 |
| DE3866372D1 (de) | 1992-01-09 |
| CA1303982C (en) | 1992-06-23 |
| JPH0782021B2 (ja) | 1995-09-06 |
| EP0279517A1 (en) | 1988-08-24 |
| US4906567A (en) | 1990-03-06 |
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| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |