JPH0894621A - 抗体検出材料及びこれを用いた抗体検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 １種類の抗原を酸無水物基を介して共有結合
により固定化した高分子成形体を基材上に複数設けたこ
とを特徴とする抗体検出材料及びこれを用いた抗体検出
方法。 【効果】 特別な分析装置を必要とせず、検体中の複数
の抗原、特に病原因子に対する抗体を極めて迅速・簡便
に鑑別・検出することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査の分野で利用
される抗原固定化高分子材料及びそれを用いた抗体検出
法に関し、詳しくは高分子成形体表面で複数の病原因子
に対する抗体を特別な分析装置を必要とせず、極めて迅
速に直接肉眼により鑑別・検出できる抗原固定化高分子
材料及びそれを用いた抗体検出方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】生体内の抗体産生系において、患者の免
疫状態の検査、各種病原因子の感染、免疫細胞の性質、
薬剤の作用，副作用等を調べるためには、検体中あるい
は培養細胞上清中に存在するこれら抗原に対する抗体を
検出，定量する必要がある。抗体を検出する方法として
は、一般的に抗体を産生する細胞数を測定する方法や、
酵素免疫測定法等が挙げられる（今井康之「新生化学実
験講座１２ 分子免疫学Ｉ」東京化学同人，１９８９）
が、このうち酵素免疫測定法を用いた方法は抗原ー抗体
反応を利用するため特異性、迅速性、簡便性等の点で優
れ、しかも直接検体を検索でき、極めて迅速な検出が可
能となり得るものとして期待される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】近年、これら酵素免疫
測定法を用いた抗体の検出方法は盛んに研究されてきて
おり、その一つにラテックス粒子に抗原を非特異的に吸
着させ抗原抗体反応に伴うラテックスの凝集反応を調べ
る方法（ラテックス凝集法）があるが、感度が比較的低
く検査時間がかかり、判定が難しく安定した結果が得ら
れにくい等、取り扱いに関する問題点も有していた。

【０００４】また、現在多く用いられてきている方法の
１つに、病原因子等の抗原をタンパク質と高分子材料と
の間の疎水的相互作用により物理的に吸着させる方法が
ある。その代表的なものとしてポリスチレンからなるマ
イクロプレートやポリスチレン、ナイロン、アガロー
ス、ガラス等のビーズを用いて、これと検体を反応させ
た後酵素標識抗原または抗体を加え、プレートやビーズ
に回収された酵素活性を測定する方法がある。この時、
反応液中の基質が分解して生ずる生成物が近紫外(190〜
400nm)または可視(400〜800nm)領域における吸収をもつ
かあるいは蛍光物質を生ずるとき分光機器を用いて検出
測定を行っている。

【０００５】しかし、上記２つの免疫学的方法は一つの
抗体に対して一つの反応液から検出する反応系をとって
おり、複数の病原因子に対する抗体を一つの反応液より
同時に検出することは不可能であった。また、この検出
系で複数の病原因子に対する抗体を同時に検出するため
には検出したい抗体の種類の数だけの検体、試薬が必要
となり、検出反応の系列数、検出時間、検体数等が共に
増加するために、簡便性、迅速性、コストの点で大きな
問題点があった。

【０００６】このように複数の病原因子に対する抗体を
同時に、簡便かつ迅速に、鑑別・検出するためには、一
つの材料にそれぞれの病原因子すなわち抗原を固定化し
た固相を複数組合わせ、さらに抗原を固定化した固相自
体に発色等の可視的変化を起こさせる方法が考えられ
る。また、一つの材料に、抗原を固定化した固相を複数
組合わせるためには、それぞれの抗原を固定化した固相
を短時間でも乾燥条件下に置く必要がある。

【０００７】現在、広く一般に用いられている抗原タン
パクと固相の固定化方法としては物理的吸着による方法
があるが、この方法で得られた抗原固定化高分子成形体
を用いて抗体を検出する場合、タンパク質と高分子成形
体とが非特異的な疎水的相互作用により結合しているた
め、結合が不安定で、乾燥条件下に置くと固相に結合さ
せた抗体が容易に脱離し、その結果感度が低くなった
り、再現性が悪い等の問題が生じた。このため抗原タン
パクを物理的吸着させた固相は乾燥条件下に置くことは
不可能であった。

【０００８】一方、化学的に高分子材料と抗原タンパク
を固定化する方法を用いた場合、得られた抗原固定化高
分子成形体は、上記物理的吸着により固定化した場合と
比較して、抗体と高分子成形体が安定に結合しているに
もかかわらず、溶液中に保存しなければならず、その保
存期間も４週間程度と比較的短いものであった。また、
化学的に固定化した抗体固定化高分子成形体を用いて検
出を行った場合、抗体結合量に比べて検出感度が低いと
いう問題があった。このため、化学的固定化方法は、効
率的に抗原を固定化する方法、安定な状態で保存可能な
抗原固定化高分子成形体を得るための方法として必ずし
も適した方法ではなかった。現在知られている化学的固
定化方法の代表的なものには、ヒドラジド基を導入した
ポリスチレンをグルタルアルデヒド処理したものに抗体
等の免疫物質を固定化する方法（石井 勝：臨床検査、
vol.34、759 (1990)）、アルキルアミノ基を導入したポ
リスチレンをグルタルアルデヒド処理したものに抗体等
の免疫物質を固定化する方法（石川栄治監訳「エンザイ
ムイムノアッセイ」東京化学同人、１９８９年）、サン
ガー試薬を導入したポリスチレンをグルタルアルデヒド
処理したものに抗体等の免疫物質を固定化する方法（Sa
nger: Biochem. J.,39, 507 (1945)）、部分加水分解し
たナイロンをグルタルアルデヒドまたはカルボジイミド
処理したものに固定化する方法（Hendry, Herrmann: J.
Immunol.Methods, 35,285 (1980)）、アルキルアミノ基
を導入したポリスチレンに無水コハク酸を作用させ、得
られたカルボキシル基と抗原タンパクのもつアミノ基と
をカルボジイミドを用いて結合させる方法（石井 勝：
臨床検査、vol.34、759 (1990)）等がある。しかし、こ
れらの方法は高分子成形体表面上の１つの反応基に対し
て１分子の抗原タンパクを結合させるものであり、また
比較的厳しい反応条件下で抗原溶液と反応させなければ
ならないので、固定化反応に際して多量の抗原タンパク
が必要である等の問題点があり、効率的な固定化方法で
はない。

【０００９】本発明は特別な分析装置を必要とせず、検
体中の複数の抗原、特に病原因子、に対する抗体を極め
て迅速・簡便に、しかも安定に鑑別・検出することが可
能な抗体検出材料及びそれを用いた抗体検出方法を提供
することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決する手段】本発明者らは上記のごとき問題
点を解決するために鋭意検討した結果、１種類の抗原、
特に病原因子を酸無水物基を介して共有結合により固定
化した高分子成形体を病原因子に対する抗体ごとに作製
し、これらを複数組合わせて得られる抗体検出材料を用
いて、検体中の病原因子に対する抗体を抗原抗体反応に
より検出することにより、直接肉眼で複数の病原因子に
対する抗体を同時に検出することができることを見出
し、本発明に到達した。

【００１１】すなわち、本発明は１種類の抗原を酸無水
物基を介して共有結合により固定化した高分子形成体を
基材上に複数設けたことを特徴とする抗体検出材料、及
び、１種類の抗原を酸無水物基を介して共有結合により
固定化した高分子成形体を基材上に複数設けた抗体検出
材料を用いて病原因子に対する抗体を抗原抗体反応によ
り検出するに際し、上記高分子成形体に固定化された抗
原に抗体を捕捉した後、上記抗体に標識酵素を有する抗
体を結合させ、その標識酵素の基質と反応させて、不溶
性生成物を生成させることを特徴とする抗体検出方法を
要旨とするものである。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おける抗原とは、生体内で抗体を産生させ得る物質であ
り、一般的にはペプチド、タンパク質、多糖類、糖タン
パク等の物質であるが、本発明に適した物質としては、
例えば結核菌等の細菌、カンジダ等の真菌、肝炎ウィル
ス，エイズウィルス，ヘルペスウイルス，ポリオウイル
ス等のウィルス等の病原微生物、ボツリヌス毒素，破傷
風毒素，テトロドトキシン等の毒素等の病原因子が挙げ
られる。

【００１３】本発明における抗体検出材料は抗原を固定
化した高分子成形体と、これらを複数設けた基材とから
なる。抗原を固定化する高分子成形体の形状としてはフ
イルム、シート、チューブ、繊維、スティック等の形状
が挙げられる。また、材質としては例えばエチレン−酢
酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポ
リエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエステル、
ポリカーボネート等の合成高分子、デンプン、グルテ
ン、セルロース、天然ゴム等の天然高分子及びそれらの
誘導体が挙げられる。また、疎水基を持ったアガロース
誘導体、キチン、ニトロセルロースや、それらの誘導体
等も挙げられる。

【００１４】本発明における基材の形状としては、ステ
ィック状、スリップ状、チューブ状等が挙げられる。基
材の材質としては有機高分子材料、無機高分子材料を問
わないが、例えば有機高分子材料としては、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン等の材料表面に反応性官能基を持た
ない材料が好ましい。

【００１５】抗原を固定化した高分子成形体（以下、抗
原固定化高分子形成体）と基材との組合わせ方は、複数
の抗体を同時に鑑別・検出することができる組合わせで
あればいかなるものでもよい。高分子成形体と基材との
組合わせ方の例を図面を用いて説明する。

【００１６】図１は円筒状チップを基材とし、複数のシ
ート状の抗原固定化高分子成形体を有する抗体検出材料
の例である。基材１の端部の複数箇所に抗原固定化高分
子成形体３、４、５をそれぞれ接着または挟み込むこと
により抗体検出材料が形成されている。この抗体検出材
料は、軸部２をつまみ、抗原固定化高分子成形体３、
４、５を検体と反応させた後、標識酵素を有する抗体を
用いることにより、複数の病原因子に対する抗体を鑑別
・検出することができる。

【００１７】図３は円筒状チップを基材とし、複数のロ
ッド状の抗原固定化高分子成形体を有する抗体検出材料
の例である。基材１の端部の複数箇所に抗原固定化高分
子成形体６、７、８をそれぞれ接着または挟み込むこと
により抗体検出材料が形成されている。この抗体検出材
料は、軸部２をつまみ、抗原固定化高分子成形体６、
７、８を検体と反応させた後、酵素標識抗体を用いるこ
とにより、複数の病原因子に対する抗体を鑑別・検出す
ることができる。

【００１８】図５はスリップ状の基材に、複数のシート
状の抗原固定化高分子成形体を有する抗体検出材料の例
である。基材９の複数箇所に抗原固定化高分子成形体１
０、１１、１２をそれぞれ平面的に接着することにより
抗体検出材料が形成されている。この抗体検出材料は、
基材９をつまみ、抗原固定化高分子成形体１０、１１、
１２を検体と反応させた後、酵素標識抗体を用いること
により、複数の病原因子に対する抗体を鑑別・検出する
ことができる。

【００１９】その他の例として、ロッド状の抗原固定化
高分子材料を数本縦に積み重ねることにより得られる１
本のスティック状の抗体検出材料、１本の円筒状の基材
に繊維状の抗原固定化材料をホウキ状に束ねることによ
り得られる抗体検出材料等が挙げられる。

【００２０】本発明では高分子成形体表面に抗原が酸無
水物基を介して共有結合により固定化されているが、こ
れは酸無水物基と抗原の有するアミノ基、チオール基等
との間で共有結合が起きるためである。酸無水物基を介
して抗原を高分子成形体に固定化する方法としては、高
分子成形体表面に存在する酸無水物基と抗原を結合させ
てもよいし、高分子成形体表面に存在する他の反応性官
能基に酸無水物基を導入し、この酸無水物基を介して化
学的に抗原を固定化することもできる。また、酸無水物
基、反応性官能基のいずれも高分子成形体表面にない場
合には、成形体表面に直接酸無水物基を導入して抗原を
固定化してもよいし、あるいは反応性官能基を導入した
後、酸無水物基を導入して抗原を固定化してもよい。

【００２１】高分子成形体表面に存在する酸無水物基以
外の反応性官能基としてはカルボキシル基、ホルミル
基、アミノ基、アジド基、イソシアネート基、クロロホ
ルミル基、エポキシ基等が挙げられる。

【００２２】高分子成形体表面に反応性官能基を導入す
る方法としては、例えばエチレン−酢酸ビニル共重合体
にカルボキシル基を導入する場合は、エチレン−酢酸ビ
ニル共重合体をケン化した後、カルボキシメチル化する
ことにより導入される。また、カルボキシル基はヒドラ
ジル基を経てアジド基に誘導することができるエチレン
−酢酸ビニル共重合体にアミノ基を導入するには、例え
ばケン化したエチレン−酢酸ビニル共重合体をアミノア
セタール化すればよい。ナイロンに大量のアミノ基を導
入するには、例えばナイロンを酸処理し、表面を加水分
解して、カルボキシル基を露出した後、ポリエチレンイ
ミン等のポリアミンを作用させればよい。

【００２３】また、反応性官能基が存在しない高分子化
合物はアンモニア−プラズマ処理やγ線、電子線等の放
射線処理によりアミノ基等の目的とする反応性官能基を
導入することが可能である。ポリウレタン等のポリアミ
ンについては予めアミノ基が存在するので、そのまま酸
無水物基を有する高分子化合物と反応させることができ
る。

【００２４】高分子成形体表面に導入する酸無水物基を
有する高分子化合物としてはスチレン−無水マレイン酸
共重合体、エチレン−無水マレイン酸共重合体、メチル
ビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体等が挙げられ
る。また、例えばポリウレタンに無水マレイン酸をγ線
や電子線によりグラフト重合させ酸無水物基を直接導入
することもできる。

【００２５】抗原の固定化処理を行う際、例えば抗原を
含む溶液を用いて処理できるが、この時使用する抗原溶
液としては、抗原を好ましくは水、生理食塩水あるいは
緩衝液に、好ましくは10〜1000倍の濃度に希釈した溶液
を用いることができる。抗原溶液中には必要に応じて抗
菌剤、安定化剤等を含んでいても良く、また抗原溶液で
処理を行うに際しての温度、時間の条件は、好ましくは
常温以下の温度で、好ましくは１時間以上である。

【００２６】本発明は抗原を固定化した高分子成形体を
用いて抗体を直接捕捉するが、その検出法として例えば
サンドイッチ ELISA法を用いる。これは、目的とする抗
体を捕捉するための抗原を固定化した高分子成形体に、
検出する抗体を含む試料を作用させ、次いで、抗体を補
足した高分子成形体に、酵素を標識した免疫反応体、例
えば抗原や捕捉したイムノグロブリンに対する抗体，プ
ロテインＡ，プロテインＧ等を作用させた後、目的とす
る抗体に結合した免疫反応体に標識された酵素の活性
を、酵素に対する基質を用いて検出する方法である。

【００２７】検出に用いられる酵素としてはペルオキシ
ダーゼ、βーガラクトシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ等が挙げられる。一方、酵素以外に検出
に用いられる標識体として金コロイド粒子、銀コロイド
粒子等が挙げられる。また、アビジン−ビオチンを用い
たり抗体結合性を持つプロテインＡ，プロテインＧやレ
クチンを介して標識体を導入させる方法等も用いられ
る。

【００２８】本発明に用いる不溶性生成物を生ずる酵素
の基質については、例えば標識酵素としてペルオキシダ
ーゼを使用する場合には４−クロロ−１−ナフトールや
３，３’−ジアミノベンジジン，ρ−フェニレンジアミ
ン塩酸とピロカテコールからなるHanker-Yates（ＨＹ）
試薬，３−アミノ−９−エチルカルバゾール，３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジン等の基質が用
いられ、アルカリフォスファターゼを使用する場合には
ニトロブルーテトラゾリウムやβ−ナフチルリン酸と５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸やｍ−フ
ェナジンメトサルフェート等を混合した基質等が用いら
れる。グルコースオキシダーゼを使用する場合にはニト
ロブルーテトラゾリウムとｍ−フェナジンメトサルフェ
ートを混合した基質等が用いられる。

【００２９】本発明の抗体検出材料を用いて複数の抗体
を検出するには、まず検体と反応させる前に、材料表面
の非特異的に抗体等と結合する部分を抗血清や非干渉性
のタンパク質でブロックする操作（ブロッキング）を行
うことが好ましい。ブロッキングに使用されるタンパク
質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、
ヘモグロビン、ゼラチン等が挙げられ、これらタンパク
質を 0.9％塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝
液(pH7.2) あるいはリン酸緩衝液(pH7.2) に溶解して、
37℃,1.5時間または４℃, 一晩材料と反応させればよ
い。反応後は材料を0.05％ポリエチレンソルビタンモノ
ラウレート(Tween 20), 0.9％塩化ナトリウムを含む10
mMトリス−塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液にて２〜６回
洗浄する。

【００３０】本発明に用いる検体としては、血液，血
清、体液等のヒト患者由来の材料、または抗体を産生す
る細胞の培養液等を用いることができる。患者材料を直
接検体とする場合は、検体を0.05％Tween 20, 0.9％塩
化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液等で２〜５
０倍に希釈して用いることが好ましい。また、抗体その
ものを検体として用いる場合には、抗体を蒸留水、緩衝
液等で希釈したものを用いればよい。

【００３１】抗体を捕捉した高分子成形体は、次にそれ
ぞれの捕捉された検体と同じ動物種のイムノグロブリン
に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
の標識物を 500〜2000倍希釈した 0.9％塩化ナトリウム
を含む10mMトリス−塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液等に
作用させる。この時の反応条件は室温〜37℃で10〜90分
間が好ましい。上記ポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体の標識物の代わりに、捕捉したそれぞれの抗
体に対する抗原に直接標識酵素を結合させたものを作用
させてもよい。また、抗体を捕捉した高分子成形体に、
捕捉した抗体と同じ動物種のイムノグロブリンに対する
抗体を作用させた後に、上記標識抗体を作用させてもよ
い。反応後は材料を0.05％ポリエチレンソルビタンモノ
ラウレート, 0.9％塩化ナトリウムを含む10mMトリス−
塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液にて２〜６回洗浄する。

【００３２】上記の様に反応させて得られた高分子成形
体は、酵素反応後に可溶性生成物または不溶性生成物を
生ずる酵素基質溶液に反応させるが、水溶液に対する溶
解度の低い基質を用いる場合はジメチルスルホキサイド
（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタ
ノール、エタノール等の有機溶媒に予め溶解した後に水
溶液に混合したものを用いる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。 実施例１ 腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒（ＴＤＨ）、コレラ菌のコ
レラ毒素（ＣＴ）、毒素原性大腸菌の定着因子（ＣＦＡ
／III ）をそれぞれ固定化した３枚のナイロンスリップ
を組合わせた病原因子検出材料を用いて腸炎ビブリオの
耐熱性溶血毒（ＴＤＨ）を鑑別・検出した結果を以下に
示した。

【００３４】腸炎ビブリオのＴＤＨは、次の方法で得
た。すなわち Vibrio parahaemolyticusT-4750（この微
生物は大阪大学微生物病研究所の保有菌であり、「健康
又は環境に対し害を及ぼし、又は及ぼす恐れのある性質
を有する微生物」として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託することができないものである。）をペプト
ン食塩培地（１％ペプトン（Difco 社製），３％塩化ナ
トリウム）で37℃，20時間振盪培養し 10,000rpm，20分
間の遠心分離により培養上清を得た。上清に56ｇ／100m
l の硫酸アンモニウムを加え生じた沈殿を10mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.2 ）に溶解した。同緩衝液で透析した
後、２ｇの臭化シアン活性化 Sepharose 4B （Pharmaci
a 社製）に10mgの精製した抗ＴＤＨイムノグロブリンを
結合させることにより得られるイムノアフィニティカラ
ムにかけ 0.5Ｍ塩化ナトリウムを含む 0.2Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（pH2.7 ）で溶出させることによりＴＤＨの
精製を行った。コレラ菌のＣＴは SIGMA社より購入した
ものを用いた。毒素原性大腸菌の定着因子ＣＦＡ／III
は次の方法で得た。すなわち、Escherichia coli 260-1
（この微生物は大阪大学微生物病研究所の保有菌であ
り、「健康又は環境に対し害を及ぼし、又は及ぼす恐れ
のある性質を有する微生物」として工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託することができないものであ
る。）をＣＦＡ寒天培地（１％ Casamino Acids （Difc
o 社製），0.15％酵母抽出物（Difco 社製）， 0.005％
硫酸マグネシウム，0.0005％塩化マンガン，２％寒天）
で37℃，20時間培養した後、遠心分離により菌体を回収
し、１mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.4 ）に懸濁し、
ホモジナイザー（Ultra Turrax，Janke ＆Kunkel KG 社
製）にて冷却しながら３分間ホモジネートした。得られ
たホモジネートは15,000×ｇ，20分間，４℃遠心分離す
ることにより上清を得て、更に50,000×ｇ，60分間遠心
分離したものを、粗液とした。粗液は、1mM リン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.8 ）で平衡化させたSepharose 4B
（2.2 ×75cm : Pharmacia社製）カラムにかけた後、４
Ｍの濃度になるように塩化ナトリウムを加え、フェニル
-Sepharose CL-4B（Pharmacia 社製）を４Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む２mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）で平
衡化させたカラムにかけ、4.0 〜０Ｍまでの塩化ナトリ
ウムの直線濃度勾配を含む２mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.8 ）で溶出させることによりＣＦＡ／III の精製
を行った。

【００３５】腸炎ビブリオのＴＤＨ、コレラ菌のＣＴ、
毒素原性大腸菌のＣＦＡ／III に対するそれぞれのポリ
クロナール抗体は以下の方法により得た。すなわち、精
製毒素を25μｇ／mlになる様に 0.9％塩化ナトリウムを
含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2 ：以下ＰＢＳと略す）に
溶解し、これに等量の Freund completeアジュバント
（Difco 社製）を加えたものを用いて体重約２kgのウサ
ギに免疫し、25日後再び先に調製した精製毒素溶液と等
量のFreund incomplete アジュバント（Difco 社製）を
加えたものを免疫させ、抗血清を得た。これに50％の硫
酸アンモニウムを加え沈殿を生じさせるが、これを２回
繰り返し得られた沈殿を10mMリン酸緩衝液（pH7.2)に溶
解し、同緩衝液で透析した後、得られた免疫グロブリン
をそれぞれの毒素のポリクローナル抗体として用いた。

【００３６】ナイロン６（ユニチカ株式会社製）からな
る縦10mm，横３mm, 厚さ0.2mm のシートを３Ｎ塩酸中に
３０℃，３０分間浸漬した後、蒸留水にて洗浄した。乾
燥後10％(w/v) のポリエチレンイミン水溶液とメタノー
ルとの１：５混合液に室温で３０分間浸漬した後、２倍
量の５％ジシクロヘキシルカルボジイミドのメタノール
溶液を加え、引き続き室温で２時間浸漬した。メタノー
ルにて洗浄、乾燥後２％(w/v) 無水マレイン酸−メチル
ビニルエーテル共重合体の脱水アセトン溶液中に室温で
１時間浸漬し、アセトンにて洗浄後真空乾燥したシート
を抗原の固定化に用いた。固定化はこのスリップをそれ
ぞれ 100μg/mlのＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦＡ／III を含む10
mM酢酸緩衝液(pH4.0) に浸漬することにより行った。

【００３７】ＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦＡ／III をそれぞれ固
定化した３枚のナイロンシートはプラスチック用接着剤
（住友スリーエム社製）を用いて８mm径の円筒上のポリ
プロピレン製チップの下端部に６０゜間隔でくし状に接
着し、これを抗ＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦＡ／III 抗体検出材
料とした。

【００３８】このようにして得た病原因子検出材料は抗
体固定化高分子成形体の部分を１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むＰＢＳに浸漬することによりブロッキ
ングを行った後、１μg/mlのウサギ抗ＴＤＨ抗体を含む
ＰＢＳに１５分間浸漬した。抗原固定化材料部分に捕捉
された抗体の検出に際しては，0.05％ポリエチレンソル
ビタンモノラウレートを含むＰＢＳにて洗浄後、アルカ
リフォスファターゼ標識抗ウサギIgG(Cappel社製) を 5
00倍希釈した0.05％Tween 20を含むＰＢＳにて常温で１
５分間反応させ、洗浄後 0.25mM ニトロブル−テトラゾ
リウム、0.25mM 5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルリン酸を含む 0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液(pH8.5) に37
℃，１０分間浸漬することにより行った。

【００３９】このように反応させた抗体検出材料はＴＤ
Ｈを固定化したナイロンシートの部分のみに濃青色の発
色が認められ、ＣＴ、ＣＦＡ／III を固定化したナイロ
ンシート部分には発色は認められなかった。また、抗体
の含まれていないＰＢＳを検体とした以外は先の操作と
全く同じ操作を行った抗体検出材料の抗原固定化シート
部分のいづれにも発色は認められなかった。

【００４０】実施例２ 実施例１と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＴ抗体を含むＰＢＳを検体として実施例１と同
様にして抗体の検出反応を行なった。その結果、抗体検
出材料のうち、ＣＴを固定化したナイロンシートの部分
のみに濃青色の発色が認められ、ＴＤＨ、ＣＦＡ／III
を固定化したナイロンシート部分には発色は認められな
かった。

【００４１】実施例３ 実施例１と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＦＡ／III 抗体を含むＰＢＳを検体として実施
例１と同様にして抗体の検出反応を行なった。その結
果、抗体検出材料のうち、ＣＦＡ／III を固定化したナ
イロンシートの部分のみに濃青色の発色が認められ、Ｔ
ＤＨ、ＣＴを固定化したナイロンシート部分には発色は
認められなかった。

【００４２】実施例４ ナイロン６（ユニチカ株式会社製）からなる縦５mm, 横
３mm, 厚さ0.2mm のシートに実施例１と全く同じ方法に
てＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦＡ／III をそれぞれ固定化し、得
られた３枚のナイロンシートを縦50mm, 横８mm, 厚さ１
mmのポリプロピレン製シートの下端部より３mm間隔にて
並列に接着し、これを抗ＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦＡ／III 抗
体検出材料とした。

【００４３】この抗体検出材料を用いて実施例１と同様
の操作を行い、１μg/mlのウサギ抗ＴＤＨ抗体を含むＰ
ＢＳを検体として抗ＴＤＨ抗体の鑑別・検出した。その
結果、抗体検出材料のうち、ＴＤＨを固定化したナイロ
ンシートの部分のみに濃青色の発色が認められ、ＣＴ、
ＣＦＡ／III を固定化したナイロンシート部分には発色
は認められなかった。

【００４４】実施例５ 実施例４と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＴ抗体を含むＰＢＳを検体として実施例１と同
様にして抗体の検出反応を行なった。その結果、抗体検
出材料のうち、ＣＴを固定化したナイロンシートの部分
のみに濃青色の発色が認められ、ＴＤＨ、ＣＦＡ／III
を固定化したナイロンシート部分には発色は認められな
かった。

【００４５】実施例６ 実施例４と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＦＡ／III 抗体を含むＰＢＳを検体として実施
例１と同様にして抗体の検出反応を行なった。その結
果、抗体検出材料のうち、ＣＦＡ／III を固定化したナ
イロンシートの部分のみに濃青色の発色が認められ、Ｔ
ＤＨ、ＣＴを固定化したナイロンシート部分には発色は
認められなかった。

【００４６】実施例７ ナイロン６（ユニチカ株式会社製）からなる 1.5mm径,
長さ10mmのロッドに実施例１と全く同じ方法にてＴＤ
Ｈ、ＣＴ、ＣＦＡ／III をそれぞれ固定化し、得られた
３本のナイロンロッドを８mm径の円筒上のポリプロピレ
ン製チップの下端部に６０゜間隔でくし状に接着し、こ
れを抗ＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦＡ／III 抗体検出材料とし
た。

【００４７】この抗体検出材料を用いて実施例１と同様
の操作を行い、１μg/mlのウサギ抗ＴＤＨ抗体を含むＰ
ＢＳを検体として抗ＴＤＨ抗体を鑑別・検出した。その
結果、抗体検出材料のうち、ＴＤＨを固定化したナイロ
ンシートの部分のみに濃青色の発色が認められ、ＣＴ、
ＣＦＡ／III を固定化したナイロンシート部分には発色
は認められなかった。

【００４８】実施例８ 実施例７と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＴ抗体を含むＰＢＳを検体として実施例１と同
様にして抗体の検出反応を行なった。その結果、抗体検
出材料のうち、ＣＴを固定化したナイロンシートの部分
のみに濃青色の発色が認められ、ＴＤＨ、ＣＦＡ／III
を固定化したナイロンシート部分には発色は認められな
かった。

【００４９】実施例９ 実施例７と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＦＡ／III 抗体を含むＰＢＳを検体として実施
例１と同様にして抗体の検出反応を行なった。その結
果、抗体検出材料のうち、ＣＦＡ／III を固定化したナ
イロンシートの部分のみに濃青色の発色が認められ、Ｔ
ＤＨ、ＣＴを固定化したナイロンシート部分には発色は
認められなかった。

【００５０】実施例１０ 実施例１と全く同じ方法で得られたＴＤＨ、ＣＴ、ＣＦ
Ａ／III をそれぞれ固定化した３枚のナイロンシートと
円筒上のポリプロピレン製チップで構成された抗体検出
材料を用いて実施例１と同様の操作を行い、１μg/mlの
ウサギ抗ＴＤＨ抗体とウサギ抗ＣＴ抗体を含むＰＢＳを
検体として両抗体を鑑別・検出した。その結果、病原因
子検出材料のＴＤＨを固定化したナイロンシート部分と
ＣＴを固定化したナイロンシート部分のみに濃青色の発
色が認められ、ＣＦＡ／IIIを固定化したナイロンシー
ト部分には発色は認められなかった。また、抗体の含ま
れていないＰＢＳを検体とした以外は先の操作と全く同
じ操作を行った抗体検出材料の抗原固定化シート部分に
はいづれにも発色は認められなかった。

【００５１】実施例１１ 実施例１と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＴ抗体とウサギ抗ＣＦＡ／III 抗体を含むＰＢ
Ｓを検体として実施例１と同様にして抗体の鑑別・検出
を行なった。その結果、病原因子検出材料のＣＴに対す
る抗体を固定化したナイロンシート部分とＣＦＡ／III
に対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみに濃
青色の発色が認められ、ＴＤＨに対する抗体を固定化し
たナイロンシート部分には発色は認められなかった。

【００５２】実施例１２ 実施例１と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＦＡ／III 抗体とウサギ抗ＴＤＨ抗体を含むＰ
ＢＳを検体として実施例１と同様にして抗体の鑑別・検
出を行なった。その結果、病原因子検出材料のＣＦＡ／
III に対する抗体を固定化したナイロンシート部分とＴ
ＤＨに対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみ
に濃青色の発色が認められ、ＣＴに対する抗体を固定化
したナイロンシート部分には発色は認められなかった。

【００５３】実施例１３ 実施例４と全く同じ抗体検出材料を用いて、実施例１と
同様の操作を行い、１μg/mlのウサギ抗ＴＤＨ抗体とウ
サギ抗ＣＴ抗体を含むＰＢＳを検体として両抗体を鑑別
・検出した。その結果、病原因子検出材料のＴＤＨを固
定化したナイロンシート部分とＣＴを固定化したナイロ
ンシート部分のみに濃青色の発色が認められ、ＣＦＡ／
IIIを固定化したナイロンシート部分には発色は認めら
れなかった。また、抗体の含まれていないＰＢＳを検体
とした以外は先の操作と全く同じ操作を行った抗体検出
材料の抗原固定化シート部分にはいづれにも発色は認め
られなかった。

【００５４】実施例１４ 実施例４と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＴ抗体とウサギ抗ＣＦＡ／III 抗体を含むＰＢ
Ｓを検体として、実施例１と同様にして抗体の鑑別・検
出を行なった。その結果、病原因子検出材料のＣＴに対
する抗体を固定化したナイロンシート部分とＣＦＡ／II
I に対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみに
濃青色の発色が認められ、ＴＤＨに対する抗体を固定化
したナイロンシート部分には発色は認められなかった。

【００５５】実施例１５ 実施例７と全く同じ抗体検出材料を用いて実施例１と同
様の操作を行い、１μg/mlのウサギ抗ＴＤＨ抗体とウサ
ギ抗ＣＴ抗体を含むＰＢＳを検体として両抗体を鑑別・
検出した。その結果、病原因子検出材料のＴＤＨを固定
化したナイロンシート部分とＣＴを固定化したナイロン
シート部分のみに濃青色の発色が認められ、ＣＦＡ／II
Iを固定化したナイロンシート部分には発色は認められ
なかった。また、抗体の含まれていないＰＢＳを検体と
した以外は先の操作と全く同じ操作を行った抗体検出材
料の抗原固定化シート部分にはいづれにも発色は認めら
れなかった。

【００５６】実施例１６ 実施例７と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＴ抗体とウサギ抗ＣＦＡ／III 抗体を含むＰＢ
Ｓを検体として実施例１と同様にして抗体の鑑別・検出
を行なった。その結果、病原因子検出材料のＣＴに対す
る抗体を固定化したナイロンシート部分とＣＦＡ／III
に対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみに濃
青色の発色が認められ、ＴＤＨに対する抗体を固定化し
たナイロンシート部分には発色は認められなかった。

【００５７】実施例１７ 実施例７と同様の抗体検出材料を作製し、１μg/mlのウ
サギ抗ＣＦＡ／III 抗体とウサギ抗ＴＤＨ抗体を含むＰ
ＢＳを検体として実施例１と同様にして抗体の鑑別・検
出を行なった。その結果、病原因子検出材料のＣＦＡ／
III に対する抗体を固定化したナイロンシート部分とＴ
ＤＨに対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみ
に濃青色の発色が認められ、ＣＴに対する抗体を固定化
したナイロンシート部分には発色は認められなかった。

【００５８】

【発明の効果】本発明によれば、特別な分析装置を必要
とせず、検体中の複数の抗原、特に病原因子、に対する
抗体を極めて迅速・簡便に鑑別・検出することが可能で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抗体検出材料の一例を示す正面図であ
る。

【図２】図１をＡ方向から見た図である。

【図３】本発明の抗体検出材料の一例を示す正面図であ
る。

【図４】図３をＡ方向から見た図である。

【図５】本発明の抗体検出材料の一例を示す正面図であ
る。

【図６】図５をＡ方向から見た図である。

【符号の説明】

１ 基材 ２ 軸部 ３ 抗原固定化ナイロンシート ４ 抗原固定化ナイロンシート ５ 抗原固定化ナイロンシート ６ 抗原固定化ナイロンロッド ７ 抗原固定化ナイロンロッド ８ 抗原固定化ナイロンロッド ９ 基材 １０ 抗原固定化ナイロンシート １１ 抗原固定化ナイロンシート １２ 抗原固定化ナイロンシート

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 花田 正子 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １種類の抗原を酸無水物基を介して共有
   結合により固定化した高分子成形体を基材上に複数設け
   たことを特徴とする抗体検出材料。
2. 【請求項２】 １種類の抗原を酸無水物基を介して共有
   結合により固定化した高分子成形体を基材上に複数設け
   た抗体検出材料を用いて病原因子に対する抗体を抗原抗
   体反応により検出するに際し、上記高分子成形体に固定
   化された抗原に抗体を捕捉させた後、上記抗体に対する
   標識酵素を有する抗体を結合させ、その標識酵素を基質
   と反応させて、不溶性生成物を生成させることを特徴と
   する抗体検出方法。