JPH07191034A - 病原因子検出材料及びこれを用いた病原因子検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 １種類の病原因子に対する抗体を酸無水物基
を介して共有結合により固定化した高分子成形体を基材
上に複数設けたことを特徴とする病原因子検出材料及び
これを用いた病原因子検出方法。 【効果】 特別な分析装置を必要とせず、検体中の複数
の病原因子を極めて迅速・簡便に鑑別検出することが可
能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野で利用される病原因子検出材料及びそれを用いた
病原因子検出方法に関し、詳しくは高分子成形体表面で
複数の病原因子を、特別な分析装置を必要とせず、極め
て迅速に直接肉眼により鑑別・検出できる病原因子検出
材料及びそれを用いた病原因子検出方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】病気の正しい診断、治療に際してはその
原因となる病原因子の検査が正確にかつ、迅速に行われ
る必要がある。病原因子が微生物である場合、一般的に
行われている培養検査法では検査に熟練を要する上、10
〜16時間の増菌培養、18〜24時間の分離培養が必要で検
査成績が判明するためには長時間を要し、臨床医の治療
に際する要求に必ずしも応えられていないのが現状で、
病原因子の検査においては臨床で適確に役立つ検査法の
開発が望まれている。

【０００３】これらの問題を解決する手段として最近、
ＤＮＡプローブ法や免疫学的方法が開発され研究が進め
られているが、このうち免疫学的方法は抗原抗体反応を
利用するため特異性、迅速性、簡便性などの点で優れ、
しかも直接検体を検索でき、極めて迅速に診断が可能と
なり得るものとして期待される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】近年、これら免疫学的
手法を用いた病原因子の検出方法は盛んに研究されてき
ており、その一つにラテックス粒子に毒素に対する抗体
を非特異的に吸着させ抗原抗体反応に伴うラテックスの
凝集反応を調べる方法（ラテックス凝集法）があるが、
感度が比較的低く検査時間がかかり、判定が難しく安定
した結果が得られにくい等、取り扱いに関する問題点も
有していた。

【０００５】また、現在多く用いられてきている方法
に、病原因子に対する抗体をタンパク質と高分子成形体
との間の疎水的相互作用により物理的に吸着させる方法
があり、その代表的なものとしてポリスチレンからなる
マイクロプレートやポリスチレン、ナイロン、アガロー
ス、ガラスなどのビーズを用いて、これと検体を反応さ
せた後酵素標識抗体を加え、プレートやビーズに回収さ
れた酵素活性を測定する方法（サンドイッチ ELISA法）
がある。この時、反応液中の基質が分解して生ずる生成
物が近紫外(190〜400nm)または可視(400〜800nm)領域に
おける吸収をもつかあるいは蛍光物質を生ずるとき分光
機器を用いて検出測定を行っている。

【０００６】しかし、上記２つの免疫学的方法は、一つ
の抗原を一つの反応液から検出する反応系をとってお
り、複数の抗原を一つの反応液より同時に検出すること
は不可能であった。また、この検出系で複数の抗原を同
時に検出するためには検出したい抗原の数だけ検体が必
要となり、検出反応の系列数、検出時間、検体数等が共
に増加するために、簡便性、迅速性、コストの点で大き
な問題点があった。

【０００７】このように複数の抗原を同時に、簡便かつ
迅速に鑑別・検出するためには、一つの材料にそれぞれ
の抗原に対する抗体を固定化した固層を複数組合わせ、
さらに抗体を固定化した固層自体に発色などの可視的変
化を起こさせる方法が考えられる。また、一つの材料
に、抗原に対する抗体を固定化した固層を複数組合わせ
るためには、それぞれの抗体を固定化した固層を短時間
でも乾燥条件下に置く必要がある。

【０００８】現在、広く一般に用いられている抗体と固
層の固定化方法としては物理的吸着による方法がある
が、この方法で得られた抗体固定化高分子成形体を用い
て抗原を検出する場合、抗体であるタンパク質と高分子
成形体とが非特異的な疎水的相互作用により結合してい
るため、結合が不安定で、乾燥条件下に置くと固層に結
合させた抗体が容易に脱離し、その結果感度が低くなっ
たり、再現性が悪い等の問題が生じた。このため抗体を
物理的吸着させた固層は乾燥条件下に置くことは不可能
であり、 Okuらの報告（Microbiol. Immunol. 32, 807-
816(1988) ）では、抗体を物理的吸着により固定化した
ポリスチレンビーズを溶液中に保存している。

【０００９】一方、化学的に高分子成形体と抗体を固定
化させる方法を用いた場合、得られた抗体固定化高分子
成形体は、上記物理的吸着により固定化した場合と比較
して、抗体と高分子成形体が安定に結合しているにもか
かわらず、溶液中に保存しなければならず、その保存期
間も４週間程度と非常に短いものであった。また、化学
的に固定化した抗体固定化高分子成形体を用いて検出を
行った場合、抗体結合料に比べて検出感度が低いという
問題があった。このため、化学的固定化方法は、効率的
に抗体を固定化する方法、安定な状態で保存可能な抗体
固定化高分子成形体を得るための方法として必ずしも適
した方法ではなかった。

【００１０】また、現在知られている化学的固定化方法
の代表的なものには、ヒドラジド基を導入したポリスチ
レンをグルタルアルデヒド処理したものに抗体を固定化
する方法（石井 勝：臨床検査、vol.34、759 (199
0)）、アルキルアミノ基を導入したポリスチレンをグル
タルアルデヒド処理したものに抗体を固定化する方法
（石川栄治監訳「エンザイムイムノアッセイ」東京化学
同人、１９８９年）、サンガー試薬を導入したポリスチ
レンをグルタルアルデヒド処理したものに抗体を固定化
する方法（Sanger: Biochem. J.,39, 507 (1945)）、部
分加水分解したナイロンをグルタルアルデヒドまたはカ
ルボジイミド処理したものに抗体を固定化する方法（He
ndry, Herrmann: J.Immunol.Methods, 35,285 (198
0)）、アルキルアミノ基を導入したポリスチレンに無水
コハク酸を作用させ、得られたカルボキシル基と抗体の
もつアミノ基とをカルボジイミドを用いて結合させる方
法（石井 勝：臨床検査、vol.34、759 (1990)）等があ
る。しかし、これらの方法は高分子成形体表面上の１つ
の反応基に対して１分子の抗体を結合させるものであ
り、また比較的厳しい反応条件下で抗体の固定化反応を
行うので、固定化に際して多量の抗体が必要である等の
問題点がある。

【００１１】本発明は特別な分析装置を必要とせず、検
体中の複数の病原因子を極めて迅速・簡便に、しかも安
定に鑑別・検出することが可能な病原因子検出材料及び
それを用いた病原因子検出方法を提供することを目的と
する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記のごと
き問題点を解決するために鋭意検討した結果、１種類の
病原因子に対する抗体を酸無水物基を介して共有結合に
より固定した高分子成形体を病原因子ごとに作製し、こ
れらを複数組合わせて得られる病原因子検出材料を用い
て、検体中の病原因子を抗原抗体反応により検出するこ
とにより、直接肉眼で複数の病原因子を同時に検出する
ことができることを見出し、本発明に到達した。

【００１３】すなわち、本発明は１種類の病原因子に対
する抗体を酸無水物基を介して共有結合により固定化し
た高分子成形体を基体上に複数設けたことを特徴とする
病原因子検出材料、及び１種類の病原因子に対する抗体
を酸無水物基を介して共有結合により固定化した高分子
成形体を基材上に複数設けた病原因子検出材料を用いて
病原因子を抗原抗体反応により検出するに際し、上記高
分子成形体に固定化された抗体に病原因子を捕捉した
後、上記病原因子に標識酵素を有する抗体を結合させ、
その標識酵素を基質と反応させて、不溶性生成物を生成
させることを特徴とする病原因子検出方法を要旨とする
ものである。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おける病原因子とは病気の原因物質であり、例えば結核
菌，ブドウ球菌，レンサ球菌，淋菌，梅毒菌，百日咳
菌，破傷風菌，大腸菌，肺炎球菌，緑膿菌，赤痢菌，ジ
フテリア菌，腸チフス菌，パラチフス菌，セレウス菌，
エルシニア菌，カンピロバクター，ウエルシュ菌，ディ
フィシル菌，サルモネラ菌，腸炎ビブリオ，コレラ菌等
の細菌，真菌，肺炎ウィルス，エイズウィルス，ロタウ
ィルス，クラミジアウイルス，ヘルペスウィルス，ＲＳ
ウィルス，インフルエンザウィルス，麻疹ウィルス，日
本脳炎ウイルス等のウィルスなどの病原微生物、および
ボツリヌス菌の産生するボツリヌス毒素，ブドウ球菌の
エンテロトキシン，ＴＳＳ毒素，腸炎ビブリオの溶血
毒，コレラ菌のコレラエンテロトキシン，赤痢菌の志賀
毒素，毒素原性大腸菌のエンテロトキシン，ジフテリア
菌のジフテリア毒素，破傷風菌の破傷風毒素，百日咳菌
の百日咳毒素，ディフィシル菌のトキシンＡ，緑膿菌の
エクソトキシンＡ，ウエルシュ菌のホスホリパーゼＣ
（α−毒素）やエンテロトキシンなどの微生物が産生す
る毒素や定着因子等が挙げられる。

【００１５】本発明における病原因子検出材料は抗体を
固定化した高分子成形体と、これらを複数設けた基材と
からなる。抗体を固定化する高分子成形体の形状として
はフイルム、シート、チューブ、繊維、スティック等の
形状が挙げられる。また、材質としては例えばエチレン
−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタ
ン、ポリエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエス
テル、ポリカーボネートなどの合成高分子、デンプン、
グルテン、キチン、セルロース、天然ゴム等の天然高分
子及びそれらの誘導体が挙げられる。また、疎水基を持
ったアガロース誘導体、ニトロセルロースや、それらの
誘導体等も挙げられる。

【００１６】基材の形状としては、スティック状、スリ
ップ状、チューブ状等が挙げられる。基材の材質として
は有機高分子材料、無機高分子材料を問わないが、例え
ば有機高分子材料としては、ポリエチレン、ポリプロピ
レン等の材料表面に反応性官能基を持たない材料が好ま
しい。

【００１７】抗体を固定化した高分子成形体（以下、抗
体固定化高分子成形体）と基材との組合わせ方は、複数
の病原因子を同時に鑑別・検出することができる組合せ
であればいかなるものでもよい。高分子成形体と基材と
の組合せ方の例を図面を用いて説明する。

【００１８】図１は円筒状チップを基材とし、複数のシ
ート状の抗体固定化高分子成形体を有する病原因子検出
材料の例である。基材１の端部の複数箇所に抗体固定化
高分子成形体３、４、５をそれぞれ接着又は挟み込むこ
とにより病原因子検出材料が形成されている。この病原
因子検出材料は、軸部２をつまみ、抗体固定化高分子成
形体３、４、５を検体と反応させた後、標識酵素を有す
る抗体を用いることにより、複数の病原因子を鑑別・検
出することができる。

【００１９】図３は円筒状チップを基材とし、複数のロ
ッド状の抗体固定化高分子成形体を有する病原因子検出
材料の例である。基材１の端部の複数箇所に抗体固定化
高分子成形体６、７、８をそれぞれ接着又は挟み込むこ
とにより病原因子検出材料が形成されている。この病原
因子検出材料は、軸部２をつまみ、抗体固定化高分子成
形体６、７、８を検体と反応させた後、酵素標識抗体を
用いることにより、複数の病原因子を鑑別・検出するこ
とができる。

【００２０】図５はスリップ状の基材に、複数のシート
状の抗体固定化高分子成形体を有する病原因子検出材料
の例である。基材９の複数箇所に抗体固定化高分子成形
体６、７、８をそれぞれ平面的に接着又は挟み込むこと
により病原因子検出材料が形成されている。この病原因
子検出材料は、基材９の端部をつまみ、抗体固定化高分
子成形体１０、１１、１２を検体と反応させた後、酵素
標識抗体を用いることにより、複数の病原因子を鑑別検
出することができる。

【００２１】その他の例として、ロッド状の抗体固定化
高分子成形体を数本縦に積み重ねることにより得られる
１本のスティック状の病原因子検出材料、１本の円筒状
の基材に繊維状の抗体固定化材料をホウキ状に束ねるこ
とにより得られる病原因子検出材料等が挙げられる。

【００２２】本発明では高分子成形体表面に抗体が酸無
水物基を介して共有結合により固定化されているが、こ
れは酸無水物基と抗体の有するアミノ基、チオール基等
の間で共有結合が起きるためである。酸無水物基を介し
て抗体を高分子成形体に固定化する方法としては、高分
子成形体表面に存在する酸無水物基と抗体を結合させて
もよいし、高分子成形体表面に存在する他の反応性官能
基に酸無水物基を導入し、この酸無水物基を介して化学
的に抗体を固定化することもできる。また、酸無水物
基、反応性官能基のいずれも高分子成形体表面にない場
合には、成形体表面に直接酸無水物基を導入して抗体を
固定化してもよいし、あるいは反応性官能基を導入した
後、無水物基を導入して抗体を固定化してもよい。

【００２３】高分子成形体表面に存在する酸無水物基以
外の反応性官能基としてはカルボキシル基、ホルミル
基、アミノ基、アジド基、イソシアネート基、クロロホ
ルミル基、エポキシ基等が挙げられる。

【００２４】高分子成形体表面に反応性官能基を導入す
る方法としては、例えばエチレン−酢酸ビニル共重合体
にカルボキシル基を導入する場合は、エチレン−酢酸ビ
ニル共重合体をケン化した後、カルボキシメチル化する
ことにより導入される。また、カルボキシル基はヒドラ
ジル基を経てアジド基に誘導することができるエチレン
−酢酸ビニル共重合体にアミノ基を導入するには、例え
ばケン化したエチレン−酢酸ビニル共重合体をアミノア
セタール化すればよい。ナイロンに大量のアミノ基を導
入するには、例えばナイロンを酸処理し表面を加水分解
して、カルボキシル基を露出させた後、ポリエチレンイ
ミンなどのポリアミンを作用させればよい。

【００２５】また、反応性官能基が存在しない高分子化
合物はアンモニア−プラズマ処理やγ線、電子線などの
放射線処理によりアミノ基等の目的とする反応性官能基
を導入することが可能である。ポリウレタンなどのポリ
アミンについては予めアミノ基が存在するので、そのま
ま酸無水物基を有する高分子化合物と反応させることが
できる。

【００２６】高分子成形体表面に導入する酸無水物基を
有する高分子化合物としてはスチレン−無水マレイン酸
共重合体、エチレン−無水マレイン酸共重合体、メチル
ビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体等が挙げられ
る。また、例えばポリウレタンに無水マレイン酸をγ線
や電子線によりグラフト重合させ酸無水物基を直接導入
することもできる。

【００２７】抗体の固定化処理を行う際、例えば抗体溶
液を用いて処理できるが、この時使用する抗体溶液とし
ては、抗体を好ましくは水あるいは生理食塩水に、好ま
しくは10〜1000倍の濃度に希釈した溶液を用いることが
できる。抗体溶液中には必要に応じて抗菌剤、安定化剤
等を含んでいても良く、また抗体溶液で処理を行うに際
しての温度、時間の条件は、好ましくは常温以下の温度
で、好ましくは１時間以上である。

【００２８】本発明における感染症の病原因子に対する
抗体は、例えばモノクローナル抗体の場合は、精製した
病原因子すなわち毒素や菌体等を免疫したマウスの脾細
胞とミエローマ細胞との融合細胞のクローンを用いてマ
ウス腹水を誘導したものを用いる。またポリクローナル
抗体は毒素や菌体等の抗原を用いてウサギ、ヤギ、ラッ
ト、ヒツジ、ニワトリ、ブタ、ロバ、モルモット、イ
ヌ、ウシなどを免疫して得られる血清より精製したもの
を用いる。

【００２９】本発明は病原因子に対する抗体を固定化し
た高分子成形体を用いて抗原すなわち病原因子を直接捕
捉するが、その検出法として例えばサンドイッチ法を用
いる。これは高分子成形体に固定化した抗体とは別種の
動物で調製した抗体を、病原因子を捕捉した高分子成形
体と反応させ、次いで酵素などを標識した抗体を反応さ
せる方法である。また、病原因子を捕捉した高分子成形
体に、直接酵素などを標識した抗体を反応させてもよ
い。検出に用いられる酵素としてはペルオキシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウ
レアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラー
ゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ等が挙げられる。一方、酵素以外に検出に用い
られる標識体として金コロイド粒子、銀コロイド粒子等
が挙げられる。また、アビジンービオチンを用いたり抗
体結合性を持つプロテインＡ，プロテインＧやレクチン
を介して標識体を導入させる方法等も用いられる。

【００３０】本発明に用いる不溶性生成物を生ずる酵素
の基質については、例えば標識酵素としてペルオキシダ
ーゼを使用する場合には４−クロロ−１−ナフトールや
３，３’−ジアミノベンジジン，ρ−フェニレンジアミ
ン塩酸とピロカテコールからなるHanker-Yates（ＨＹ）
試薬，３−アミノ−９−エチルカルバゾール，３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジンなどの基質が
用いられ、アルカリフォスファターゼを使用する場合に
はニトロブルーテトラゾリウムやβ−ナフチルリン酸と
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸やｍ−
フェナジンメトサルフェートなどを混合した基質などが
用いられる。グルコースオキシダーゼを使用する場合に
はニトロブルーテトラゾリウムとｍ−フェナジンメトサ
ルフェートを混合した基質などが用いられる。

【００３１】本発明の病原因子検出材料を用いて複数の
病原因子を検出するには、抗原である病原因子と反応さ
せる前に、材料表面の非特異的に抗体等と結合する部分
を抗血清や非干渉性のタンパク質でブロックする操作
（ブロッキング）を行うことが好ましい。ブロッキング
に使用されるタンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ），オボアルブミン，ヘモグロビン，ゼラチン等が挙
げられ、これらタンパク質を0.9%塩化ナトリウムを含む
10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.2）あるいはリン酸緩衝液
(pH7.2）に溶解して、37℃,1.5時間または４℃，一晩材
料と反応させればよい。反応後は材料を0.05% ポリエチ
レンソルビタンモノラウレート(Tween 20), 0.9%塩化ナ
トリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液またはリン酸緩
衝液にて２〜６回洗浄する。

【００３２】本発明に用いる検体としては下痢便，痰，
体液等のヒト患者材料を直接用いるか、患者材料より分
離した菌体の培養上清を用いればよい。患者材料を検体
とする場合は、検体を直接用いるか、検体を 0.1〜10%
BSA(ウシ血清アルブミン), 0.05% Tween 20, 0.9% 塩化
ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液で２〜５０倍
に希釈して用いることが好ましい。一方、患者材料より
分離した菌体の培養上清を用いる場合、例として腸炎ビ
ブリオVibrio parahaemolyticus を挙げると、患者材料
より分離された菌株をヘプトン−食塩培地（１% ポリヘ
プトン(Difco社製) ，３% 塩化ナトリウム，0.5%リン酸
水素二ナトリウム）あるいはＳＰＰ培地（１% ポリペプ
トン(Difco社製)，0.5%塩化ナトリウム，0.2%グルコー
ス，0.5%リン酸水素二ナトリウム）を用いて３時間〜一
晩培養した後、得られた遠心分離（5,000rpm 15 分間）
上清を検体とする。また、コレラ菌 Vibrio choleraeの
場合、患者材料より分離された菌株を２%Casamino acid
(Difco 社製), 0.6% yeast extract(Difco 社製), 0.25
%塩化ナトリウム, 0. 871% リン酸水素二カリウム, 0.2
5% グルコース, ５% 塩化マグネシウム, 0.5%塩化マン
ガン, 0.5%塩化第三鉄, 0.001%硫酸を用いて３時間〜一
晩培養した後、得られた遠心分離(5,000rpm 15分間) 上
清を検体とする。

【００３３】検体を作用させた病原因子検出材料は、次
にそれぞれの病原因子に対するポリクローナル抗体を 5
00〜2000倍希釈、混合した0.9%塩化ナトリウムを含む10
mMトリス−塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液に作用させ
る。この時の反応条件は室温〜37℃で10〜90分間が好ま
しい。また、それぞれの病原因子に対する抗体に直接標
識酵素を結合させたものを用いてもよい。反応後は材料
を0.05% ポリエチレンソルビタンモノラウレート, 0.9%
塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液またはリ
ン酸緩衝液にて２〜６回洗浄する。

【００３４】次いで高分子成形体を、病原因子に対する
ポリクローナル抗体を得た同じ動物種のイムノグロブリ
ンに対する抗体と標識酵素が結合した酵素標識抗体を50
0 〜2000倍希釈した0.05% ポリエチレンソルビタンモノ
ラウレート, 0.9%塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩
酸緩衝液またはリン酸緩衝液に反応させる。この時の反
応条件は室温〜37℃で10〜90分間が好ましい。反応後は
材料を0.05% ポリエチレンソルビタンモノラウレート,
0.9%塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液また
はリン酸緩衝液にて２〜６回洗浄する。

【００３５】上記の様に反応させて得られた高分子成形
体は、酵素反応後に不溶性生成物を生ずる酵素基質溶液
に反応させるが、水溶液に対する溶解度の低い基質を用
いる場合はジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ），ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ），メタノール，エタノール
などの有機溶媒に予め溶解した後に水溶液に混合したも
のを用いる。

【００３６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。 実施例１ 腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒（ＴＤＨ）、コレラ菌のコ
レラ毒素（ＣＴ）、毒素原性大腸菌の易熱性エンテロト
キシン（ＬＴ）に対する抗体をそれぞれ固定化した３枚
のナイロンスリップを組合わせた病原因子検出材料を用
いて腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒（ＴＤＨ）を鑑別検出
した結果を以下に示した。

【００３７】腸炎ビブリオの精製ＴＤＨは、次の方法で
得た。すなわち Vibrio parahaemolyticus T-4750（大
阪大学 微生物病研究所 保有菌）をペプトン食塩培地
（１％ペプトン（Difco 社製），３％塩化ナトリウム）
で37℃，20時間振盪培養し10,000rpm ，20分間の遠心分
離により培養上清を得た。上清に56g ／100ml の硫酸ア
ンモニウムを加え生じた沈殿を10mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.2 ）に溶解した。同緩衝液で透析した後、２g の
臭化シアン活性化 Sepharose 4B （Pharmacia社製）に1
0mgの精製した抗ＴＤＨイムノグロブリンを結合させる
ことにより得られるイムノアフィニティカラムにかけ
0.5M 塩化ナトリウムを含む 0.2M グリシン−塩酸緩衝
液（pH2.7 ）で溶出させることによりＴＤＨの精製を行
った。コレラ菌の精製ＣＴ、毒素原性大腸菌の精製ＬＴ
は SIGMA社より購入したものを用いた。

【００３８】ＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴに対するそれぞれのポ
リクロナール抗体は以下の方法により得た。すなわち、
精製毒素を25μg ／mlになる様に0.9 ％塩化ナトリウム
を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0 ：以下PBS と略す）に
溶解し、これに等量の Freund completeアジュバント
（Difco 社製）を加えたものを用いて体重約２kgのウサ
ギに免疫し、25日後再び先に調製した精製毒素溶液と等
量のFreund incompleteアジュバント（Difco 社製）を
加えたものを免疫させ、抗血清を得た。これに50％の硫
酸アンモニウムを加え沈殿を生じさせるが、これを２回
繰り返し得られた沈殿を10mMリン酸緩衝液（pH7.0)に溶
解し、同緩衝液で透析した後、得られた免疫グロブリン
をそれぞれの毒素のポリクローナル抗体として用いた。

【００３９】ＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴに対するそれぞれのモ
ノクローナル抗体は以下の方法により得た。すなわち、
ＰＢＳにて25μg ／mlに溶解した精製毒素0.5ml を等量
のFreund complete アジュバントと共に用いて６〜８週
齢 BALB ／c マウスに免疫し、21日後更に、先に調製し
た精製毒素溶液に等量のFreund incomplete アジュバン
トを加えたものを免疫し、32日目にマウスの脾細胞を得
た。得られた脾細胞はSP2 ／o ミエローマ細胞とそれぞ
れ約１×10⁸ 個ずつポリエチレングリコール（PEG1500
，Boehringer Mannheim 社製）にて融合させ、2.5 ％
ウシ血清，１×10⁴Mヒポキサンチン，４×10^-7M アミノ
プテリン，1.6 ×10^-5M チミジンを含むCelgrosser-H培
地（住友製薬社製）でハイブリドーマを選択した。得ら
れたハイブリドーマはBALB／c マウス腹腔に２×10⁶ 個
注入し７〜14日で腹水が著明になった時点で腹水を回収
し、2,500rpm，10分間遠心分離して得た上清をそれぞれ
の毒素のモノクローナル抗体として用いた。

【００４０】ナイロン６（ユニチカ社製）からなる縦10
mm, 横3mm,厚さ0.2mm のシートを３N 塩酸中に３０℃，
３０分間浸漬した後、蒸留水にて洗浄した。乾燥後10%
(w/v)のポリエチレンイミン水溶液とメタノールとの
１：５混合液に室温で３０分間浸漬した後、２倍量の５
％ジシクロヘキシルカルボジイミドのメタノール溶液を
加え、引き続き室温で２時間浸漬した。メタノールにて
洗浄、乾燥後、２％(w/v)無水マレイン酸−メチルビニ
ルエーテル共重合体の脱水アセトン溶液中に室温で１時
間浸漬し、アセトンにて洗浄後真空乾燥したシートを抗
体の固定化に用いた。固定化はこのスリップをＴＤＨ、
ＣＴ、ＬＴに対するマウス腹水より得られたそれぞれの
モノクローナル抗体を50倍希釈した10mM酢酸緩衝液(pH
4.0) に浸漬することにより行った。

【００４１】ＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴに対するモノクローナ
ル抗体をそれぞれ固定化した３枚のナイロンシートはプ
ラスチック用接着剤（住友スリーエム社製）を用いて８
mm径の円筒上のポリプロピレン製チップの下端部に６０
゜間隔でくし状に接着し、これをＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴ検
出材料とした。

【００４２】このようにして得た病原因子検出材料のう
ち抗体固定化高分子成形体の部分を１% ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含む0.9%塩化ナトリウムを含む10mMリ
ン酸緩衝液（pH7.2, 以下ＰＢＳと略す）に浸漬するこ
とによりブロッキングを行った後、500ng/ml精製ＴＤＨ
を含むＰＢＳに１５分間浸漬した。抗体固定化材料部分
に捕捉された毒素の検出に際しては，0.05% ポリエチレ
ンソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳにて洗浄後、
ＰＢＳにて500 倍希釈したＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴに対する
ウサギポリクローナル抗体の混合液を常温で１５分間反
応させ、再び洗浄後アルカリフォスファターゼ標識抗マ
ウスIgG(Cappel社製) を500 倍希釈した0.05% Tween 20
を含むＰＢＳにて常温で１５分間反応させ、洗浄後 0.2
5mM ニトロブルーテトラゾリウム、0.25mM 5−ブロモ−
4−クロロ−３−インドリルリン酸を含む 0.1M トリス
−塩酸緩衝液(pH8.5) に37℃，１０分間浸漬することに
より行った。

【００４３】このように反応させた病原因子検出材料は
ＴＤＨに対する抗体を固定化したナイロンシートの部分
のみに濃青色の発色が認められ、ＣＴ、ＬＴに対する抗
体を固定化したナイロンシート部分には発色は認められ
なかった。また、毒素の含まれていないＰＢＳを検体と
した以外は先の操作と全く同じ操作を行った結果、病原
因子検出材料の抗体固定化シート部分のいづれにも発色
は認められなかった。

【００４４】実施例２ ナイロン６（ユニチカ社製）からなる縦5mm ，横3mm ，
厚さ0.2mm のシートに実施例１と全く同じ方法にてＴＤ
Ｈ、ＣＴ、ＬＴに対するモノクローナル抗体をそれぞれ
固定化し、得られた３枚のナイロンシートを縦50mm，横
8mm ，厚さ1mmのポリプロピレン製シートの下端部より3
mm 間隔にて並列に接着し、これをＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴ
検出材料とした。

【００４５】この病原因子検出材料を用いて実施例１と
同様の操作を行い、100ng ／mlの精製ＴＤＨを鑑別検出
した。

【００４６】このように反応させた病原因子検出材料は
ＴＤＨに対する抗体を固定化したナイロンシートの部分
のみに濃青色の発色が認められ、ＣＴ、ＬＴに対する抗
体を固定化したナイロンシート部分には発色は認められ
なかった。また、毒素の含まれていないＰＢＳを検体と
した以外は先の操作と全く同じ操作を行った結果、病原
因子検出材料の抗体固定化シート部分のいづれにも発色
は認められなかった。

【００４７】実施例３ ナイロン６（ユニチカ社製）からなる1.5mm 径，長さ10
mmのロッドに実施例１と全く同じ方法にてＴＤＨ、Ｃ
Ｔ、ＬＴに対するモノクローナル抗体をそれぞれ固定化
し、得られた３本のナイロンロッドを８mm径の円筒上の
ポリプロピレン製チップの下端部に６０間隔でくし状に
接着し、これをＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴ検出材料とした。

【００４８】この病原因子検出材料を用いて実施例１と
同様の操作を行い、100ng ／mlの精製ＴＤＨを鑑別検出
した。

【００４９】このように反応させた病原因子検出材料は
ＴＤＨに対する抗体を固定化したナイロンロッドの部分
のみに濃青色の発色が認められ、ＣＴ、ＬＴに対する抗
体を固定化したナイロンロッド部分には発色は認められ
なかった。また、毒素の含まれていないＰＢＳを検体と
した以外は先の操作と全く同じ操作を行った結果、病原
因子検出材料の抗体固定化ナイロンロッド部分のいづれ
にも発色は認められなかった。

【００５０】実施例４ 実施例１と全く同じ方法で得られたＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴ
に対するモノクローナル抗体をそれぞれ固定化した３枚
のナイロンシートと円筒上のポリプロピレン製チップで
構成された病原因子検出材料を用いて実施例１と同様の
操作を行い、100ng ／mlの精製ＴＤＨと100ng ／mlの精
製ＣＴの混合液より両毒素を鑑別検出した。

【００５１】このように反応させた病原因子検出材料の
ＴＤＨに対する抗体を固定化したナイロンシート部分と
ＣＴに対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみ
にのみに濃青色の発色が認められ、ＬＴに対する抗体を
固定化したナイロンシート部分には発色は認められなか
った。また、毒素の含まれていないＰＢＳを検体とした
以外は先の操作と全く同じ操作を行った病原因子検出材
料の抗体固定化シート部分のいづれにも発色は認められ
なかった。

【００５２】実施例５ 実施例１と全く同じ方法で得られたＴＤＨ、ＣＴ、ＬＴ
に対するモノクローナル抗体をそれぞれ固定化した３枚
のナイロンシートと円筒上のポリプロピレン製チップで
構成された病原因子検出材料を用いて実施例１と同様の
操作を行い、100ng ／mlの精製ＣＴと100ng ／mlの精製
ＬＴの混合液より両毒素を鑑別検出した。

【００５３】このように反応させた病原因子検出材料は
ＣＴに対する抗体を固定化したナイロンシート部分とＬ
Ｔに対する抗体を固定化したナイロンシート部分のみに
のみに濃青色の発色が認められ、ＴＤＨに対する抗体を
固定化したナイロンシート部分には発色は認められなか
った。また、毒素の含まれていないＰＢＳを検体とした
以外は先の操作と全く同じ操作を行った結果、病原因子
検出材料の抗体固定化シート部分のいづれにも発色は認
められなかった。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、特別な分析装置を必要
とせず、検体中の複数の病原因子を極めて迅速・簡便に
鑑別検出することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の病原因子検出材料の一例を示す正面図
である。

【図２】図１をＡ方向から見た図である。

【図３】本発明の病原因子検出材料の一例を示す正面図
である。

【図４】図３をＡ方向から見た図である。

【図５】本発明の病原因子検出材料の一例を示す正面図
である。

【図６】図５をＡ方向から見た図である。

【符号の説明】

１ 基材 ２ 軸部 ３ 抗体固定化ナイロンシート ４ 抗体固定化ナイロンシート ５ 抗体固定化ナイロンシート ６ 抗体固定化ナイロンロッド ７ 抗体固定化ナイロンロッド ８ 抗体固定化ナイロンロッド ９ 基材 10 抗体固定化ナイロンシート 11 抗体固定化ナイロンシート 12 抗体固定化ナイロンシート

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 花田 正子 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １種類の病原因子に対する抗体を酸無水
   物基を介して共有結合により固定化した高分子成形体を
   基材上に複数設けたことを特徴とする病原因子検出材
   料。
2. 【請求項２】 １種類の病原因子に対する抗体を酸無水
   物基を介して共有結合により固定化した高分子成形体を
   基材上に複数設けた病原因子検出材料を用いて病原因子
   を抗原抗体反応により検出するに際し、上記高分子成形
   体に固定化された抗体に病原因子を捕捉した後、上記病
   原因子に標識酵素を有する抗体を結合させ、その標識酵
   素を基質と反応させて、不溶性生成物を生成させること
   を特徴とする病原因子検出方法。