JPH08503066A

JPH08503066A - 固相への化学的結合方法

Info

Publication number: JPH08503066A
Application number: JP6504913A
Authority: JP
Inventors: エルスナー、ヘンリック; モーリトセン、ソレン
Original assignee: モーリトセン・アンド・エルスナー・エー／エス
Priority date: 1992-08-10
Filing date: 1993-08-10
Publication date: 1996-04-02
Also published as: US5874569A; WO1994003530A1; US6262256B1; EP0654061A1; AU4698693A; CA2142011A1; DK100592D0

Abstract

(57)【要約】表面が活性化多糖類の溶液で処理されることを特徴とする、求核基が存在する固相の表面の結合特性を修正する方法；固定された活性化多糖類が存在する固相の表面に化合物を固定し、それによって、化合物が固相の表面と接触され、本発明の方法によりその結合特性が修正される方法；活性化デキストラン又は活性化アガロースのような活性化多糖類がその表面に固定されている製品、及び固相アッセイ、固相ペプチド合成、固相ヌクレオチド合成、固相酵素プロセス、及び生体表面への連結における固相反応に使用される製品の用途。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称固相への化学的結合方法技術分野本発明は、求核基が存在する固相の表面の結合性を修正する方法、化合物を固相の表面に固定化する方法、及びその方法により修正された製品の形の固相、及び固相反応におけるその用途に関する。技術分野様々の化合物を、ガラス、プラスチック又は他の固体材料のような固相の表面に固定化することは、この位置において、他の化合物との固相反応の一部を形成し得るために、化合物が固相の表面に結合される、様々の化学的及び生化学的技術に使用されている。そのような固相反応は、例えば、バイオセンサー、及び固相ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成を含む、クロマトグラフィー、固相検定において生じ、それらはまたバイオリアクターにおいて使用される。更に、固相反応は、例えば、そこに成形体を接着させる際の１つの工程として、歯のような生体表面の化学的表面処理において生ずる。化合物を固相表面に固定する方法は、目的物に応じて、多岐にわたり、しかし、以下に示す応用分野においては、例えば、固定化されたタンパク質の耐久性が改善され、官能価が保持され、ペプチドを認識／固定化することが可能であるので、発明は、現行の技術の明確な改良を構成する。公知技術の説明エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＥｎｇｖａｌｌＥ．及びＰｅｒｌｍａｎｎＰ．“エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ、ＥＬＩＳＡ．、抗原被覆チューブにおける酵素抗免疫グロブリンによる特定の抗体の定量化”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０９：１２９−３５，１９７２）及び固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が、近年、抗原及び抗体両方の濃度の決定に多く使用されるようになっている。更に、固相検定及び放射性または非放射性検出システムが、遺伝子プローブに基づく雑種形成検定及びバイアオセンサーにおいて使用されている。従来のＥＬＩＳＡ又は固相ＲＩＡ法によると、抗原／抗体は、頻繁に受動的吸着により固相に固定される。所定のタンパク質、ペプチド、多糖類、ハプテン、及びオリゴ／ポリヌクレオチドは、しかし、この方法では固定又は検出され得ず、他の化合物が吸着プロセスにおいて変性され、破壊される（ＫｕｒｋｉＰ．及びＶｉｒｔａｎｅｎＩ．“細胞骨格成分に対するヒト抗体の検出”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７：２０９−２３，１９８４）。更に、固相への固定化後の抗原の配列は、ある場合には、例えば抗体との相互作用に対向し、ある部分が立体的に妨害されるようなものである。最終的に、幾つかの場合には、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ法における次の（恐らく酵素又はアイソトープのラベルが付された）化合物の非特異的（不所望の）結合の多数の重大な問題があるであろう。この問題の幾つかは、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｒｅ− ｐｌａｔｅ）が官能基により化学的に修正され、その後、非吸着分子が通常の架橋技術により共有結合され得る（例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ，ＡＲ及びＳｔｒｉｃｋ，Ｎ“ポリスチレン板に共有結合されたベーターガラクトシダーゼ及び抗体を用いたエンザイムリンクトフルオレセンスイムノアッセイ”Ｊ．Ｖｉｔｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３：１５５−６５，１９８１，及び例えばＧｌｕｅＴｅｃｈＡｐｓ“固相への分子の共有固定法”１ｗ０８９／０５３２９）。しかし、疎水性固体表面がやはり存在するので、この方法は、固定化されたオリゴ／ポリペプチド又はオリゴ／ポリヌクレオチドの質の変性及びその結果の劣化び問題を解決しない。更に、この技術は、二官能性架橋剤を使用しなければならないので、実行者の側に化学の専門家を必要とする。このことはまた、問題が、固相に吸着される前により大きなタンパク質に合抱されているペプチドのような非吸着分子により解決されるならば、そうである。この場合、本発明の方法と比較して、比較的大きな量のペプチドを用いることが必要である。例えば抗原のようなタンパク質の共有固定化は、アフィニティークロマトグラフィーとの関連で良く知られている。このアフィニティークロマトグラフィーでは、問題の分子が、例えばアガロース又はデキストランのような、架橋された不溶解性の活性化された親水性ポリマーからなる固相に結合される（Ｐｈａｒａｍａｓｉａ“アフィニティークロマトグラフィー．原理及び方法”１９８６）。そのような表面は、生物的機能又はその構造が影響されることなく、大量の分子を効果的に共有結合し得る。更に、前記ポリマー内の多くの親水基（例えばエーテル基及びアルコール基）が、表面を疎水性にし、それによって、次の、目的としない例えばタンパク質の吸着が避けられる。言い換えると、その表面は、その官能基（例えばアミノ基）を介して生ずるタンパク質の共有結合に関する以外は、“ノンバインダー”特性を有している。このように、架橋したデキストラン及びアガロースは、都合のよい結合特性を有しており、それは、固相技術にはよく適合しているが、これらの物質の欠点は、第１には、例えばマイクロタイタープレートのように成形することが出来ず、第２には全体として不透明であり、光学検出方法が採用されるアッセイにはその材料を用いることが出来ないことである。公開された国際出願Ｎｏ．Ｗ０９１／０９８７７は、タンパク反応性基を示す非イオン性ポリマーからなる疎水性表面にタンパク質を共有結合する方法を開示している。それによると、不所望の生成物の低い自然吸着が同時に得られる。本発明によると、それ自体公知の方法でキャリアに結合されている非イオン性ポリマーは、その後タンパク質がその表面に効果的に結合され得るように、少なくとも５゜である曇点をも示す。その温度以上では、疎水性表面はタンパク質に固定化されるはずである。それによって、高温で非イオン性固定化されたポリマーは、タンパク質への結合をすすんで確立するようになることが、意図的に達成される。アニオン性表面への結合が、特に記載されている。公開された国際出願Ｎｏ．Ｗ０９０／０６９５４は、ポリサルフェイト化された多糖類を認めるモノクローン性抗体について記載している。活性化ポリ塩化ビニル−イムノアッセイ板を、それに硫酸デキストランがイオン結合で結合しているポリ−Ｌ−リシンでコートすることが、特に記載されている。合成オリゴヌクレオチド及びペプチドの両方は、今日、いわゆる樹脂上に、固相化学合成により典型的に製造される（例えば、Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ“固相ペプチド合成：実用的アプローチ”ＩＲＬＰｒｅｓｓ）。ペプチド合成のためにしばしば使用される樹脂は、ポリアクリルアミドでグラフトされたケイソウ土により構成されるが、それらは架橋ポリスチレン（メリフィールドの樹脂）により構成されていてもよい（例えば、“ペプチド化学の将来”Ｅｄｓ．Ｅ．Ｅｂｅｒｌｅ，Ｒ．Ｇｅｉｇｅｒ，及びＴ．Ｗｉｅｌａｎｄ，１９８１，１０１頁における、Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ“固相ペプチド合成における固相”参照）。しかし、その樹脂が、ポリスチレンとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコポリマーからなるＰＥＧ樹脂のように、疎水性を有するということは、有利な合成法であることがわかった（例えば、Ｊｉａｎｇ，Ｙｉｎｇ；Ｌｉａｎｇ，Ｘｕｎ；Ｃｈｅｎ，Ｗｅｉｚｈｕ；Ｈｅ，Ｂｉｎｇｌｉｎ“ポリスチレンでサポートされたポリエチレングリコールの合成及びペプチド合成におけるその特性の研究”ＨｕａｘｕｅＸｕｅｂａｏ，４５（１１），１１１２−１８）。定型的には、そのような表面はまた疎水性であるので、ペプチド合成は、アミノ基が修正された、不溶性の架橋アガロース又はデキストラン上で実施され得る。しかし、それらは圧縮性であり、もろいので、これらの物質は機械的な理由からこの目的には相応しくない。ことに、ＤＭＦのような有機溶媒中の流動及び膨潤特性は、劣っている。その結果、現存する樹脂の利点と例えばデキストランのような疎水性とを結合する技術を有することは、便利であろう。産業上の用途では、しばしば様々の酵素の固定化が使用される。１つの例は、発酵可能な炭水化物の製造のために、ビール中の発酵可能ではない炭水化物を固定されたアミログリコシダーゼで処理することである。酵素を固定するとき、それらがその生体活性を保持することが重要である。酵素の固定は、そのため、架橋したアガロースまたはデキストラン上でうまくなされ得る。しかし、架橋したアガロースまたはデキストランは比較的低い過圧で圧縮されるので、これらの物質の上述の不幸な機械的特性は、それらをこの用途に不適切なものとする。その結果、機械的に安定な、光学的に透明であり、変性したり機能性が損なわれることなく、すべての型の分子が固定される固相の表面に、所望の結合特性を提供し得る要求が存在する。２．発明の説明本発明の目的は、求核基が存在する固相の表面の結合特性を修正し、それによってオリゴ／ポリペプチド、オリゴ／多糖類またはポリヌクレオチドのような分子が共有結合する方法を提供することにある。更に、本発明の目的は、同時に劣った非特異的結合特性（ノンバインダー特性）を得ることにある。また、本発明の目的は、生体分子の構造及び機能を破壊することなく、そのような固相の表面に生体分子を固定する方法を提供することにある。最後に、本発明の目的は、固相アッセイ又は固相合成のような固相合成に使用される、製品の形の固相を提供することにある。驚くべきことに、活性デキストラン又は活性アガロースのような活性多糖類が、ＮＨ₂−基、ＳＨ−基のような求核基が存在する固相の表面に共有結合するとき、上述の特性を有する新しい表面が得られることが見出だされた。その結果、上述の目的は、求核基が存在する固相の表面の結合特性を修正する方法を提供することにより達成され、その方法は、請求項１の特徴部分に記載の特徴により特徴づけられる。本発明の方法によると、その表面が、適切な種類の化合物と反応させるための改善された能力を有する、ある場合にはそのような化合物を改善された耐久性と結合させるための改善された能力を有する固相が得られる。更に、固相アッセイに容易に使用し得る機能的な透明表面を達成することが可能であり、この固相アッセイでは、例えばマイクロタイタープレート又はストリップは固相を構成している。本発明によると、セルロースエーテルではない、活性多糖類が使用され、これは“曇点”を有しておらず、例えば抗原又は抗体を固相に接続する、一種の多官能性架橋剤として機能する。多糖類は活性基が共有結合を形成するように活性化される。そのような多糖類の例は、活性デキストラン及び活性アガロースである。デキストラン及びアガロースの代わりに、他の変性又は合成ポリ又はオリゴ多糖類のような、ＯＨ基を含む他のポリマー、例えば、ポリビニルアルコール又はポリヒドロキシメチルメタクリレートのようなキサンタンガム又はポリアルコールの相当量を使用することが出来る。第１アミノ基を含むマイクロタイタープレートは、例えばペルジョデイト（ｐｅｒｊｏｄａｔｅ）又はトレシル（ｔｒｅｓｙｌ）活性化されたデキストラン及びアガロースにより処理されてもよく、それによって表面は、全く新規な、改良された結合特性を獲得している。タンパク質を固相に共有結合させる公知の問題（ＷＯ９１／０９８７７）は、本発明により、結合プロセスにおいて溶液中のポリエチレングリコールを含むことにより解決し得る。本発明の驚くべき利点は、マイクロタイタープレートが、アフィニティークロマトグラフィーに使用される物質から知られている、都合のよい物理化学的特性を特に簡単な方法で付与され得るということである。ここで、前記ポリマー中の過剰の疎水性基（例えばエーテル基及びアルコール基）は、その表面を疎水性とし、言い換えれば、同じノンバインダー特性を処理する。更に、生体分子の機能及び構造は、表面への結合後も保持される。以後、この方法を“ハイドロコーティング”と呼ぶ。本発明の方法によると、例えばペプチド合成のための樹脂を活性デキストランと結合することにより、更にその疎水性を改善することが可能であり、それによってより有効なペプチド合成を達成することが可能である。同様の改善が固相オリゴヌクレオチド合成にそのような樹脂を用いることにより期待され得る。合成ペプチドのある用途、即ちいわゆる任意の合成ペプチド実験室では、このように追加された樹脂ボールの疎水性ノンバインダー特性は、とりわけ重要である（ＬａｍＫＳ；ＳａｌｍｏｎＳＥ；ＨｅｒｓｈＥＭ；ＨｒｕｂｙＶＪ；ＫａｚｍｉｅｒｓｋｉＷＭ；ＫｎａｐｐＲＪ“配位子結合活性を同定するための新しい型の合成ペプチド実験室”ネイチャー、３５４，８２−４）。以下の実施例は、ハイドロコートされた表面が固定された生体分子の質を保持することを示す。その結果、恐らくハイドロコーティングは、上述のように例えば“固相”酵素プロセスに使用されるある“固相”物質を改善し得ることが期待されるに違いない。同時に、これらの物質の都合のよい公知の機械的特性が保持される。例えば破損した歯の根元にセラミック充填剤を接着する技術は、Ｍｕｎｋｓｇａａｄ，Ｅ．Ｃ．及びＡｓｍｕｓｓｅｎ，Ｅ．“Ｄｅｎｔｉｎ−ｐｏｌｙｍｅｒｂｏｎｄｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ／ＨＥＭＡ”，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，９３（５），４６３−６，１９８５に記載されている。ここでは、はの表面は最初に弗酸で処理され、それによって歯のアミノ基が露出する。次の処理は、グルタルアルデヒド及びメチルメタクリレートによるものであり、その後、紫外光により後者の重合が開始される。それによって、歯の根元にセラミック充填剤がポリメタクリレートを用いて接着され、アミノ基への共有結合が架橋剤であるグルタルアルデヒドを用いて確立される。しかし、グルタルアルデヒドは、多くの作業環境における欠点を伴っている。更に、毒性のあるメタクリレートモノマーは、患者に拡散しないことがしばしば見られる。従って、あるいは、弗酸で処理された歯の表面を前処理するために、ペルジョデイト活性のデキストランが使用されることが示されている。それによって、公知の生体適合性物質によるコーティングが行われ、デキストラン上のアルデヒド基が、その後のメチルメタクリレート−重合に対するグルタルアルデヒドと同じ重合開始効果を有するであろうことが期待されるに違いない。更に、親水性デキストラン層が、疎水性メチルメタクリレートモノマーの患者への浸透を防止することが期待される。このように、明らかにハイドロコートされた表面が、Ｎ−ヒドロキシ− スクシンイミド−ビオチンの炭水化物層中の浸透を防止することが示される（実施例１１）。好ましい態様は、請求項に記載されている。３．図面の簡単な説明以下、本発明について、図面を参照してより詳細に説明する。図１は、ＰＯＤを有する（●）、有しない（〇）マイクロタイタープレートへのビオチン−ＭＰ７の結合、ＰＯＤを有する（▼）、有しない（▽）マイクロタイタープレートへのビオチン−ＭＰ９の結合、及びＰＯＤを有する（■）、有しない（□）マイクロタイタープレートへのビオチン−ペプチドＴの結合を示す。図２は、ＴＡＤを有する（●）、有しない（○）マイクロタイタープレートへのビオチン−ＭＰ７の結合、ＴＡＤを有する（▼）、有しない（▽）マイクロタイタープレートへのビオチン−ＭＰ９の結合、及びＴＡＤを有する（■）、有しない（□）マイクロタイタープレートへのビオチン−ペプチドＴの結合を示す。図３は、ＰＯＤと結合した、及び結合しないマイクロタイタープレートの表面へのペルオキシダーゼの標識が付されたブタ免疫グロブリン（ＰＭＳ）の結合を示し、ＰＯＤで処理された表面にＰＭＳが加えられた場合を（●）、処理されない表面にＰＭＳが加えられた場合を（○）で示す。図４は、ＰＯＤで処理された表面へのペルオキシダーゼの標識が付されたブタ免疫グロブリンを結合するときのＰＥＧに対する依存性を示す。図５は、捕捉抗体（ヤギアンチ−マウス免疫グロブリン）を、それぞれＰＯＤ処理された表面（○）、未処理のマイクロタイタープレート表面（●）に固定した場合の、ムライン（ｍｕｒｉｎｅ）免疫グロビリンの濃度決定のためのサンドイッチ−ＥＬＩＳＡの結果を示す。図６は、捕捉抗体（ヤギアンチ−マウス免疫グロブリン）を、それぞれＰＯＤ処理された表面（○）、未処理のマイクロタイタープレート表面（●）に固定した場合の、ムライン（ｍｕｒｉｎｅ）免疫グロビリンの検出のためのサンドイッチ−ＥＬＩＳＡの結果を示す。捕捉抗体を結合する能力は、その滴定を行うことにより、及び同時にムラインＩｇＧ（ＯＸ６）を含む中間層の量を保持することにより、試験された。図７は、ＰＢＳにおける（▽）、及びカーボネートバッファーにおける（●）ＰＯＤ処理された表面へのビオチン−ＭＰ７の結合を示す。ＰＯＤは様々な程度に酸化された（０，１／２，１と１・２，２及び２と１／２）。それによって、酸化中のデキストラン及びペルジョデイト上のＯＨ基間のモル比がそれぞれ０，１／２，１と１・２，２及び２と１／２であることが意味される。図８は、ＰＢＳにおける（■）、及びカーボネートバッファーにおける（□）ＰＯＤ処理された表面へのビオチン−ＭＰ７の結合を示す。ＰＯＤを製造するために使用されたデキストランは、１０，０００、７０，０００及び２０００，０００のＭＷを有していた。図９は、処理されていない（○）、１０，０００（●）、７０，０００（▽）及び２０００，０００（▼）のＭＷを有る様々な量のＰＯＤで処理された、ポリ −Ｌ−リシンコートされた表面へのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの結合を示す。図１０は、ＮａＢＨ₄の濃度を変化させて還元されたＰＯＤ処理された表面へのビオチン複合ウシ血清アルブミンの結合を示す。図１１は、ＰＯＤで処理されていない（０）、ポリ−Ｌ−リシンコートされた表面、及びＰＯＤ７００００で処理され、その後、０．１ＭのＮａＯＨ（１）、１ＭのＮａＯＨ（２）、０．１ＭのＨＣｌ（３）及び１ＭのＨＣｌ（４）、ｐＨ７．２のＰＢＳ（５）、ｐＨ９．６の０．１Ｍカーボネートバッファー（６）、ｐＨ７．２の洗浄バッファー（７）、及び水（８）でそれぞれ処理された表面へのビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの結合を示す。図１２は、ＰＯＤを伴う、及びＰＯＤを伴わないマイクロタイタープレートに固定されたヤギ−アンチ−マウスの耐久性の比較を示す。４．発明の詳細な説明簡単に言うと、「ハイドロコーティング」の原理は、一種の「二重接着」テープとして作用する活性多糖類と固相を結合することである。この技術によると、通常のマイクロタイタープレートに吸着しない分子を固定化することが可能である。それは、ペプチド、ハプテン、二重らせんＤＮＡ、オリゴヌクレオチド等の場合であり、例えばこれらの成分への抗体の測定を可能とする。本発明の目的は、実施例３、４、及び９に示されている。ある場合にはプラスチックへの受動吸着によりみられ得る生体分子の構造及び機能の破壊は、ハイドロコートされた表面への結合の際には生じない。結合された生体分子の質は、別の言葉では良好である。これは、実施例３、４、５、７、及び８に示されている。結合中のＰＥＧの存在は、それをかなり改善しており、このことは実施例６に示されている。最後に、ハイドロコートされた表面の共有結合のための能力は、簡単な方法で除去され、それによって表面は特に効果的な非結合（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｅｒ）に変換される。このように、この表面は、そうでなければ、洗浄剤の存在にもかかわらず、通常のマイクロタイタープレートに非特異的に結合する膜分子に向かって、拒絶している。通常、本発明の方法により処理されることが望まれる固相の表面にヌクレオチド基を有することが必要である。いくつかのマイクロタイタープレートは既に市販されており、そこでは、例えばプレートの表面に第１又は第２アミノ基が共有結合されている（例えばＣｏｖａＬｉｎｋｆｒｏｍＡ／ＳＮｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ，ｏｒＣｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）。あるいは、コーティングは、例えばタンパク質、ポリアミン、又はポリ−Ｌ−リシンの固相への受動吸着により行われ、それによってアミノ基はその表面に共有結合的に導入される。この、最後に述べた方法は、共有力が含まれないにもかかわらず、特に安定な修正に導くことは良く知られている。述べた官能基を含む他のポリマーは、そのような基が様々の化学的方法により導入されるように、同様にその表面に吸着され得る（例えば“Ｒａｄｉａｔｉｏｎｇｒａｆｔｉｎｇ”，ＥＰ−Ａ−１５５２５２参照）。示された実施例では、多糖類としてデキストランが使用されている。しかし、例えばアガロースのような他のオリゴ糖又は多糖類が使用可能である。示された実施例の多くでは、ペルジョデイト活性のデキストランが使用されるが、デキストランにトレシル基が供給された実施例もまた示されている。このことは、驚くべきことに、デキストランが非プロトン性溶媒であるヘキサメチルホスホラストリアミド（ＨＭＰＴＡ）又はＮ−ピロリジノン中に可溶であり、そこではトレシルクロリドとデキストランとの間の特異的反応生ずるということが見いだされたので、可能である。デキストランをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することも可能であるが、ＤＭＳＯはスルホン酸クロリドと反応するので、その後のトレシルクロリドとの反応を不可能とする。デキストランに他の活性基を導入することも可能であり、それによって、ある場合にはプレートは、生体分子の結合においてより選択的ですらあるであろう。親水性ポリマーには、例えばアルデヒド、ケトン、ビニルスルホン、シアン、活性エステル、エポキシド、ジスルフィド、及びカルボン酸、燐酸及びスルホン酸の他の活性化合物を使用してもよい。活性基は、例えば“スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ−ａｒｍ）”により付着、分離され、それによって立体的問題が緩和され得る。５．実施例実施例１ポリ−Ｌ−リシンによる前処理及びそれに引き続くペルジョデイト活性デキストランの固定によるポリスチレン表面の結合特性の修正（ａ）ペルジョデイト活性デキストラン（ＰＯＤ）の製造デキストラン（１００ｍｇ，分子量（ＭＷ）＝７０，０００シグマＤ４７５１）を５０ｍｌの水に溶解し、次いでペルジョデイトナトリウム（３９８ｍｇ、３．３モルＡｌｄｒｉｃｈ３１１４４８）を追加した。２時間撹拌後、５リットルの純水で３回透析した。デキストランの代わりに、アガロース、又はキサンタンガム（シグマ、Ｇ１２５３）のような、他の天然又は合成のオリゴ糖又は多糖類、又はポリブニルアルコール又はポリヒドロキシメチルメタクリレートのようなポリアルコールの相当量が使用される。（ｂ）マイクロタイタープレートへのＰＯＤの固定ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に対し、カーボネートバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ９．６）中のポリ−Ｌ−リシン（シグマＰ１２７４，５０μｇ）がそれぞれのウエルに添加され、２時間インキュベートされた。その後、ウエルを水で３回洗浄した。次いで、それぞれのウエルに１００μｌのＰＯＤ溶液を加え（１００μｌのＰＢＳ中５０μｇ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ）、２時間放置し、その後、再び水で３回洗浄した。使用したマイクロタイタープレートは、第１アミノ基を含まず、そのためポリ −Ｌ−リシンで前処理された。ちょうど例えばポリエチレングリコールテレフタレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル及びポリメタクリレートのような物質からなる、マイクロタイタープレート、マイクロタイターストリップ、粒子、膜、試験管、テストストリップ又は測定ピンに対してポリミンのようなポリアミンによりなされたように、この前処理は、ポリペプチドのような、第１アミノ基を含む他のポリアミノ酸によってもなされた。マイクロタイタープレートの表面に共有結合的に第１アミノ基を導入することは知られており、既に市販されている、その表面にアミノ基を有するポリスチレンマイクロタイタープレートがある（例えば、Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）。言及したすべての表面は、上述のようにＰＯＤにより処理可能である。実施例２ポリ−Ｌ−リシンによる前処理及びそれに引き続くトレシル活性デキストランの固定によるポリスチレン表面の結合特性の修正（ａ）トレシル活性デキストラン（ＴＡＤ）の製造デキストラン（１００ｍｇ，分子量（ＭＷ）＝７０，０００シグマＤ４７５１）を水（１０ｍｌ）に溶解し、一昼夜凍結乾燥して、遊離の水の含量を低下させた。次の日、デキストラン（１０ｍｇ）を、シカペント（ｓｉｃａｐｅｎｔ）を有する塩化カルシウム管に取付けられた１００ｍｌの丸底フラスコ内で、１２０℃でＨＭＰＴＡ（２０ｍｌ）シグマＨ４００６）中に溶解した。２時間後、デキストランをエタノールで析出した。水中で再溶解を行い、再びエタノールで析出した。その後、活性デキストランを一昼夜凍結乾燥した。デキストランの代わりに、アガロース又はキサンタンガムのような、他の天然又は合成の多糖類又はオリゴ糖類、又はポリブニルアルコール又はポリヒドロキシメチルメタクリレートのようなポリアルコールのような、ＯＨ基を含む他のポリマーの相当量が使用される。（ｂ）マイクロタイタープレートへのＴＡＤの固定ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に対し、カーボネートバッファー（１００ｍｌ，０．１Ｍ，ｐＨ９．６）中のポリ− Ｌ−リシン（５０μｇ）がそれぞれのウエルに添加され、その後、室温で２時間インキュベートされた。その後、水で３回洗浄した。その後、それぞれのウエルに１００μｌのＴＡＤ溶液を加え（１００μｌのＰＢＳ中５０μｇ、０．１Ｍ）、追加の２時間インキュベートし、その後、再び水で３回洗浄した。使用したマイクロタイタープレートは、第１アミノ基も第２アミノ基も含まず、そのためポリ−Ｌ−リシンで前処理された。ちょうど例えばポリエチレングリコールテレフタレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル及びポリメタクリレートのような物質からなる、マイクロタイタープレート、マイクロタイターストリップ、粒子、膜、試験管、テストストリップ又は測定ピンに対してポリミンのようなポリアミンによりなされたように、この前処理は、第１及び／又は第２アミノ基を含む他のポリアミノ酸及びポリペプチドによってもなされた。マイクロタイタープレートの表面に様々な方法で共有結合的に第１又は再２アミノ基もまた導入されており、既に市販されている、その表面にアミノ基を有するポリスチレンマイクロタイタープレートがある（例えば、第１アミノ基を含有するＣｏｓｔａｒ，ＵＳＡ，又は第２アミノ基を含有するＣｏｖａＬｉｎｋ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。言及したすべての表面は、上述のようにＴＡＤにより処理可能である。実施例３固定されたペルジョデイト活性デキストランを有するポリスチレン表面へのペプチドの固定化（ａ）ペルジョデイト活性デキストラン（ＰＯＤ）の製造実施例１に記載の手順（ｂ）マイクロタイタープレートへのＰＯＤの固定ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に対し、カーボネートバッファー（０．１Ｍ，ｐＨ９．６）中のポリ−Ｌ−リシン（１００μｌ，５０μｇ）が、列１−６におけるそれぞれのウエルに添加され、２時間インキュベートされた。その後、水で３回洗浄した。次いで、列１−１２におけるそれぞれのウエルに１００μｌのＰＯＤ溶液を加え（１００μｌのＰＢＳ中５０μｇ、ｐＨ７．１、０．１Ｍ）、２時間放置し、その後、再び水で３回洗浄した。（ｃ）ＰＯＤが固定されたマイクロタイタープレートへのぺプチドの固定ペプチドビオチン−ＭＰ７、ビオチン−ＭＰ９、及びビオチンペプチド−Ｔを、燐酸塩をバッファーとする食塩水（ＰＢＳ，０．１Ｍ、１００μｌ／ウエル）中１００μｇ／ｍｌの濃度で出発し、１．６μｇ／ｍｌの濃度で終わる７工程で、２重決定（ｄｏｕｂｌｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）において２回滴定（２−ｆｏｌｄｔｉｔｒａｔｉｏｎ）した。ペプチドは、ポリ−Ｌ−リシンでコートされたマイクロタイタープレートの半分と、及びコートされない半分の両方において２重決定で滴定された。２時間後、ウエルを吸引で空にし、洗浄バッファ（ＮａＣｌ２９，２ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄Ｈ₂Ｏ、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００１００ｍｌ、蒸留水１０００ｍｌまで）で３回洗浄された。ペプチドビオチン−ＭＰ７（ビオチン−ＰＥＬＦＥＡＬＱＫＬＦＫＨＡＹ）、ビオチン−ＭＰ９（ビオチン−ＦＡＱＫＥＰＡＦＬＫＥＹＨＬＬ）、及びビオチン−ペプチド−Ｔ（ビオチン−ＧＧＧＡＳＴＴＮＹＴ）を、十分に自動化されたペプチド合成マシーン（ＮｏｖａＳｙｎ，Ｃｒｙｓｔａｌ）により、Ｆｍｏｃアミノ酸Ｐｆｐエステルから合成し、その後、分取クロマトグラフィーにより精製した。ペプチド合成の西郷の工程において、ビオチンをＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドの形で結合した。（ｃ）ビオチンを有する、及び有しない固定ペプチドの検出次いで、１００μｌのアビジン−ペルオキシダーゼ（２５μｌのアビジン−ペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ））、１００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）、１０ｍｌの洗浄バッファー）を加え、その後、このプレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、１００μｌの基質をウエルあたり（１ｍｌのクエン酸塩／燐酸塩バッファー（クエン酸７．３ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ１１．８６ｇ、蒸留水１リットルまで）あたり１μｌ／ｍｌの３５％Ｈ₂Ｏ₂及び１ｍｇのＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）加えた。１００μｌのＨ₂ＳＯ₄により１−３分後に呈色反応は停止し、吸着度（光学密度、ＯＤ）がＤｙｎａｔｅｃｈＥＬＩＳＡ−ｒｅａｄｅｒにより読まれた。結果及び議論図１から、ビオチン−ＭＰ７、ビオチン−ＭＰ９が、ＰＯＤで処理されたマイクロタイタープレート上に検出され得ることがわかる。しかし、ビオチンペプチド−Ｔは検出されなかった。更に、ＰＯＤを加えたにもかかわらず、ポリ−Ｌ− リシンを加えることなしに、ビオチンＭＰ７／ＭＰ９の結合／検出は、見られないか又はわずかに見られるのみであった。ビオチンＭＰ７／ＭＰ９は、リシンを含み、その結果、第１アミノ基を含まない。しかし、リシンを含まないビオチン −ペプチド−Ｔについてはそうではない。このように、その結果は、ＰＯＤで処理された表面へのペプチドの結合が、ＰＯＤ表面にある過剰のアルデヒド基及びケトン基への共有結合によるものであることを示している。もし、その表面がアミンを含まないならば、ＰＯＤ７，０００は結合せず、その結果、ペプチドはその表面にごくわずかしか、又は全く検出されない。しかし、非常に高分子のＰＯＤ（ＭＷ＞１００００００）が使用されるならば、ＰＯＤはあらかじめアミノ基をそこに導入することなしに、プラスチック表面に低い程度しか結合され得ない（データは示されない）。しかし、恐らく、これはその表面へのＰＯＤの吸着によるものである。アルデヒド及びケトンは、第１アミンと安定な結合を形成する（イミン）が、第２及び第３アミンとは安定な結合を形成しない。他の実験は、ＰＯＤを結合することは不可能であり、それによって第２アミノ基を含む表面にペプチドを結合することは不可能であることを示している（Ｃｏｖａｌｉｎｋマイクロタイタープレートデータなし）。このことは、更に、ビオチンＭＰ７／ＭＰ９の固定化は、ポリ−Ｌ−リシン上及びペプチド上の第１アミノ基と、ＰＯＤ上のカルボニル基との化学的架橋によるものである。未処理のマイクロタイター面上には、すべてのペプチドについて、非常に劣ったシグナルが見られたか又はシグナルは全く見られなかった。これは、ａ）ペプチドが結合しないため、又はｂ）マイクロタイタープレートへのペプチドの結合が、アビジンとビオチンとの反応を妨げるためのいずれかの理由による。我々は、他の実験において、ＭＰ７が、ＰＯＤで処理されていないプレートに明らかに結合していることを示した。このように、我々は、上述のように、非ビオチン化ＭＰ７を、部分的にＰＯＤに固定した。これらはその後、モノクローン抗ＭＰ７抗体であるＭＰ７．４でインキュベートされ、その後ペルオキシダーゼの標識が付されたウサギアンチ−マウスＩｇでインキュベートされた。ここで再び、コーティングがわずかウエルあたり０．０５０μｇのＭＰ７によりなされたときでさえ、強いシグナルがＰＯＤで処理されたプレート上に見られた。全く新しくＭＰ７によりコートされたマイクロタイタープレートが使用されるならば、もし少なくとも１０μｇ／ウエルでコートされるならば、ＭＰ７．４を有する表面に結合されたＭＰ７を検出することも可能である。しかし、この信号は、数日後に消滅し、このことはＭＰ７がＭＰ７．４抗体を結合することができないように、コンホメーションをゆっくり変えることを示している（データは示されない）。しかし、ＰＯＤプレート上のシグナルは、全テスト期間中（数週間）は完全に不変のままである。この例は、ＰＯＤで処理された表面がペプチドの構造及び受容性を保持し、そのため、それらは抗体又はストレプタビジンにより認識され得るという事実を立証している。更に、通常のマイクロタイタープレートを使用するときに必要な量と比べて、ＰＯＤ表面に固定するときに非常に少量のペプチドが必要であるに過ぎない。実施例４トレシル活性デキストランによるペプチドの結合（ａ）トレシル活性デキストランの製造実施例２に記載された手順（ｂ）マイクロタイタープレートへのＴＡＤの固定ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に対し、カーボネートバッファー（１００μｌ）０．１Ｍ，ｐＨ０．６）中のポリ− Ｌ−リシン（５０μｇ）が、列１−６におけるそれぞれのウエルに添加され、２時間静置された。その後、水で３回洗浄した。次いで、列１−１２におけるそれぞれのウエルに１００μｌのＴＡＤ溶液を加え（０．１ＭのＰＢＳ１００μｌ中５０μｇ）、２時間放置し、その後、水で３回洗浄した。（ｄ）ＴＡＤで処理された表面へのペプチドの固定及び検出ビオチン−ＭＰ７、ビオチン−ＭＰ９、及びビオチン−ペプチド−Ｔを、ポリ −Ｌ−リシンを持つ及び持たない表面に加え、その固定化を実施例３のように検出した。結果及び議論図２から、ビオチン−ＭＰ７／−ＭＰ９はＴＡＤで処理された表面に強く結合され、ビオチン−ペプチド結合は見られないことがわかる。ポリ−Ｌ−リシンなしには、その表面へのペペプチドの何らかの又はわずかな結合も見られなかった。ビオチン−ペプチド−Ｔではなく、ビオチン−ＭＰ７／−ＭＰ９は、フリーのＮＨ₂を含んでいるので、ペプチドの結合は、デキストラン上のトレシル基による共有結合的固定化によるものである。アルデヒド及びケトンとは反対に、トレシル基は第２アミント安定な結合を形成することが出来る。このように、我々は、第２アミノ基を有する、いわゆるＣｏｖａｌｉｎｋマイクロタイタープレート（Ａ／ＳＮｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＯＤではなくＴＡＤにより処理することが可能であることも示した（データはない）。これは、ペプチドの固定は、特異的共有結合によるものであることを立証している。ＴＡＤは、付加的に、ＴＡＤで処理された表面上の過剰のトレシル基が塩基により加水分解され、それによって疎水性ＯＨ基がマイクロタイタープレート上に再確立されるという利点を有している。それによって、その表面は、実施例１２に記載されたノンバインダー特性を得る。これらのＯＨ基は、任意に、例えばヘキサン中のシアノゲンブロミド又はトレシルクロリドにより、マイクロタイタープレートの光学特性なしに、更に活性化され、それによって破壊される（データなし）。ＴＡＤで処理された表面は、更に、実施例３に記載のペプチドの結合及び構造の保持に対する有用な効果に関し、ＰＯＤで処理された表面と同一の特性を有している。実施例５免疫グロブリン実施例３のように、幾つかのウエルがＰＯＤで処理され、他のウエルは処理されないマイクロタイタープレートが使用された。（ａ）ペルオキシダーゼの標識が付されたブタ免疫グロブリン（ＰＭＳ）の固定化実施例３のように、ＰＯＤで処理されたマイクロタイタープレートに対して、１５％のＰＥＧ（分子量４０００を有するポリエチレングリコール）が加えられたＰＢＳ中のＰＭＳ（ＤＡＫＯ）の１１の工程において、２重決定で２回滴定が行われた（１００μｌ／ウエル）。同一の２重決定の滴定がＰＯＤ処理のないウエルで、しかしＰＥＧのないＯＢＳで行われた。２時間後、ウエルを吸引により空にし、洗浄バッファーで３回洗浄した。（ｂ）固定ＰＭＳの検出これは、実施例３に記載のように、ＯＰＤにより行われた。結果及び議論図３から、未処理表面に対してこれを行う最適な方法に比較して、ＰＯＤで処理された表面上に、一般に比較的より多いブタ免疫グロブリンが固定化／検出され得ることがわかる。これは、低い濃度領域において顕著であり、そこでは約１０倍のＰＭＳが固定化／検出される。変性のため、時間とともにペルオキシダーゼがプラスチック表面への受動吸着によりその酵素活性を失うこと、及びこの現象は長引いたインキュベーション期間後に、より顕著になることがよく知られている。示された装置は、このように、より大きな範囲にわたってペルオキシダーゼを保持するＰＯＤ処理表面によるものであろう。これは、長引いたインキュベーション後に、より顕著になることがあり得る。通常のマイクロタイタープレートへのＰＭＳの固定化の下でのＰＥＧの追加は、その結果を損なう（データなし）が、一方、ＰＯＤ（及びＴＡＤ）で処理された表面に固定化するときには全く反対である（実施例４参照）。このことは、２つの方法が基礎とする基本的に異なるメカニズムを強調している。実施例６免疫グロブリンの結合に対するＰＥＧの影響実施例３に示すように、ウエルがＰＯＤで処理されたマイクロタイタープレートが使用された。（ａ）ペルオキシダーゼの標識が付されたブタ免疫グロブリン（ＰＭＳ）の固定化１２本の試験管のそれぞれに５００μｌ（７）ＰＢＳを加えた。その１１本で、３０％から０．０２％まで、ＰＥＧ４０００の滴定を準備し、その後、１２本のそれぞれにＰＭＳ（５Ｍｌ中５μｇ）を加えた。その後、１００μｌのそれぞれの溶液を、２重決定における別々のウエルに加えた。２時間後、吸引によりウエルを空にし、洗浄バッファーで３回洗浄した。（ｂ）固定ＰＭＳの検出実施例３におけるように、ＯＰＤによりなされた。結果及び議論図４から、ＰＭＳの検出が１０％未満のＰＥＧの使用により実質的に低下することがわかる。ＰＥＴが、例えばビニルスルホンで活性化されたセファロースへのタンパク質の結合を改善することも知られている。この知見の背後にあるのは、おそらく同じメカニズムである。これに対し、マイクロタイタープレートへのタンパク質の受動吸着は、ＰＥＧが存在するならば損なわれるに至る（データなし）。ＰＥＧ４０００を使用可能である（そしてペプチドビオチンＭＰ７を固定するのに最適である）が、他の値のＰＥＧもまた我々の方法において機能することが見いだされた。これは、固定される化合物に依存して最適化され得る。実施例７マウス免疫グロブリンの濃度決定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるハイドロコーティングの使用実施例３におけるように、列１及び２がＰＯＤで処理され、列３及び４は処理されないマイクロタイタープレートが使用された。（ａ）ヤギアンチ−マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）の固定化１００μｌのヤギアンチ−マウス免疫グロブリンＩｇ（ＴＡＧＯ）（０．２μ ｇ，０．３Ｍの１５％ＰＥＧ４０００を有するカーボネートバッファー）を、列１及び２にあるウエルに加え、１００μｌのヤギアンチ−マウスＩｇ（０．２μ ｇ，０．３Ｍの１５％カーボネートバッファー）を、列３及び４にあるウエルに加えた。その後、室温で２時間インキュベートし、次いで水で３回洗浄した。次いで、マイクロタイタープレート上の過剰の部位をＢＳＡ（１００μｌ）カーボネートバッファー中１０ｍｇ／ｍｌ）でブロックした。１時間後、洗浄バッファーにより洗浄を３回行った。（ｂ）ＯＸ−６の添加モノクローンマウス抗体であるＯＸ−６をＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウエルからすべてのウエルにおいて２回滴定した。追加の１時間のインキュベーションの後、洗浄バッファーにより３回洗浄を行った。（ｃ）固定ＯＸ−６の検出ペルオキシダーゼの標識が付されたウサギアンチ−マウスＩｇ（ＤＡＫＯ）（１：１０００，１００ｍｇＢＳＡ，１０ｍｌの洗浄バッファー）をすべてのウエルに加え、次いで室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、固定されたペルオキシダーゼの存在を、実施例３におけるように検出した。結果および議論捕捉抗体（ヤギアンチ−マウスＩｇ）がＰＯＤで処理された表面に固定されたとき、未処理表面に比べ、より高い、急な曲線が見られた（図５）。アッセイの精度、及び恐らく感度も、言い換えると、ＰＯＤ表面において良好であった。このことは、親水姓ＰＯＤ表面への共有固定化による捕捉抗体の質は、受動吸着によるよりも良好である。しかし、この差が、未処理表面よりも捕捉抗体を結合するＰＯＤ表面によるものであることは、無視することが出来ない。実施例８ヤギアンチ−マウスＩｇの量を変化させた場合の表面へのマウス免疫グロブリンの結合実施例３に示すように、列１及び２がＰＯＤにより処理され、列３及び４が処理されないマイクロタイタープレートが使用された。（ａ）変化する量のヤギアンチ−マウスＩｇの固定１５％のＰＥＧ４０００を伴う１００μｌの０．３Ｍカーボネートバッファーを列１及び２に加え、１００μｌの０．３Ｍカーボネートバッファーを列３及び４に加えた。次いで、１００μｌのヤギアンチ−マウスＩｇ（１０μｇ，１５％ＰＥＧ４０００を伴う０．３Ｍのカーボネートバッファー）を、ウエル１Ａ及び２Ａに加え、１００μｌのヤギアンチ−マウスＩｇ（１０μｇ，０．３Ｍのカーボネートバッファー）を、ウエル３Ａ及び３Ｂに加えた。その後、２重決定において２回滴定を、ＰＥＧを伴い又は伴わずにカーボネートバッファー内で５回行った。その後、室温で２時間インキュベートし、次いでＢＳＡ（１００μｌ、カーボネートバッファー中１０ｍｇ／ｍｌ）でブロックした。１時間後、洗浄バッファーにより洗浄を３回行った。（ｂ）ＯＸ−６の添加ヤギアンチ−マウスＩｇを有する４つの列にあるすべてのウエルに、１００μ ｌのＯＸ−６（１μｇ、１００μｌＰＢＳ）を加えた。室温で１時間後、洗浄バッファーにより洗浄を行った。（ｃ）固定ＯＸ−６の検出これは、実施例７に記載されているようになされた。結果および議論所定のシグナルを得るために、ＰＯＤで処理された表面に、未処理表面と比較して、約１／３のヤギアンチ−マウスＩｇを加えることが必要なだけであることが、図６からわかる。これは、より効果的に捕捉抗体（ヤギアンチ−マウスＩｇ）を固定するＰＯＤ表面によるものであること、及び／又は固定された抗体の質が、通常の受動吸着に比較してこれらの表面に対しより良好であることのいずれかであろう。実施例９表面への結合のためのＰＯＤの酸化度の影響（ａ）異なった酸化度によるＰＯＤの製造５０ｍｌの蒸留水に溶解されたデキストラン（１００ｍｇ，ＭＷ：７０，０００）を含む６本の管に、それぞれ０，１／２，１と１／２，２、２と１／２のデキストラン及びペルジョデイト上のＯＨ基間のモル比に対応する、それぞれ０ｍｇ，１３２ｍｇ，２６３ｍｇ，３９８ｍｇ，５３０ｍｇ，及び６６３ｍｇのナトリウムペルジョデイトを加えた。２時間拡販した後、５リットルの純水で３回、透析を行った。（ｂ）マイクロタイタープレートへのＰＯＤの固定実施例３に示すようにポリ−Ｌ−リシンでコートされたマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に対し、異なった酸化度の１００ｍｌのＰＯＤ（ＰＢＳ中５０μｌ）を加えた。その後、２時間インキュベーションを行い、次いで水で３回洗浄した。（ｃ）ビオチンＭＰ７の固定ＰＢＳに一部溶解され、カーボネートバッファーに一部溶解された１００μｌのビオチンＭＰ７を加え、その後、２時間インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄した。（ｄ）ビオチンＭＰ７の検出これは、実施例３に記載されているように検出された。結果及び議論ＭＰ７の結合の増加が見られた。ここでは、１／２〜１と１／２のデキストラン及びペルジョデイト上のＯＨ基間のモル比に対応する、デキストラン５０ｍｇあたり１３２〜３９８ｍｇのペルジョデイトが使用された。その後、増加は見られなかった（図７）。このことは、もちろん、１付近のモル比では酸化され得るＯＨ基はもはや存在しないためである。ペルジョデイトなしのデキストランの場合には、それぞれカーボネートバッファー及びＰＢＳでは０．７〜１．４の結合が見られた。これは、ビオチンＭＰ７とポリ−Ｌ−リシン層間の非特異的イオン性相互作用によるものである。デキストラン上のアルデヒド基及びケトン基の多数がその表面にＰＯＤを固定するために使用され、それによってポリ−Ｌ−リシンへのビオチンＭＰ７の接近をブロックするので、低い酸化度のＰＯＤの添加により、この結合はより低くなる。より高い酸化度のデキストランの場合には、ますます多くのフリーのアルデヒド基及びケトン基がその表面へのビオチンＭＰ７の結合を可能とするようになるであろう。１と１／２を越える酸化度では、ＰＯＤは流体“二重接着テープ”として働く。それは、部分的にデキストランをポリ −Ｌ−リシンに結合し、部分的にデキストランをビオチンＭＰ７に結合する。このことは、ＰＢＳにおいてかなり良好に機能するように思われる（図７）。実施例１０表面への結合のためのＰＯＤのＭＷの影響（ａ）異なるＭＷのペルジョデイト活性デキストラン（ＰＯＤ）の製造１００ｍｇのデキストラン（それぞれ１０，０００、７０，０００及び２，０００，０００）を収容する３本の管に、５０ｍｌの蒸留水を加えて溶解し、その後、３９８ｍｇのペルジョデイトナトリウムをそれぞれの管に加えた。２時間撹拌後、５リットルの純水で３回透析した。（ｂ）マイクロタイタープレートへのＰＯＤの固定実施例３に示すようにポリ−Ｌ−リシンでコートされたマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に対し、異なったＭＷの１００ｍｌのＰＯＤ（１００μｌのＰＢＳ中５０μｌ、０．１Ｍ）を加えた。その後、２時間後、水で３回洗浄した。（ｃ）ビオチンＭＰ７の固定ＰＢＳ又はカーボネートバッファーで希釈された１００μｌのビオチンＭＰ７（１μｇ／ｍｌ）を加え、その後、２時間後、吸引によりウエルを空にし、洗浄バッファーで３回洗浄した。（ｄ）ビオチンＭＰ７の検出これは、実施例３に記載されているように検出された。結果及び議論ビオチンＭＰ７がカーボネートバッファー中で、ＭＷ２，０００，０００を有するデキストランからＰＯＤに固定されるときを除いて、ビオチンＭＰ７の結合は、ＰＯＤのＭＷにもかかわらず同一のレベルであった（図８）。ここで、結合の劣化が見られた。これは恐らく立体的妨害のためであろう。ＭＷ７０，０００のデキストランは、このように多くの目的に満足し得るものである。ＭＷ＞１，０００，０００のデキストランが使用されるならば、ＰＯＤは、例えばポリ−Ｌ−リシンで処理される必要なしに、或る程度マイクロタイタープレートに結合され得る（データなし）。しかし、より低いＭＷのＰＯＤは、第１アミンを含まない表面に結合しない。実施例１１ポリ−Ｌ−リシンで処理された表面をブロックするためにどれほど多くのＰＯＤが使用されるべきか。ポリ−Ｌ−リシンを有するマイクロタイタープレートが、実施例３に記載されたように製造された。（ａ）マイクロタイタープレートへのＰＯＤの固定マイクロタイタープレートに対し、１０，０００、７０，０００、２，０００，０００のＭＷの１００ｍｌのＰＯＤ（１００μｌのＰＢＳ中５０μｌ、０．１Ｍ）を加えた。残りのウエルに対し、１００μｌのＰＢＳを加えた。その後、２回滴定を準備した。２時間後、水で３回洗浄した。（ｂ）ブロックされていないアミノ基に対するビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＮＨＳ−エステル）の結合それぞれのウエルに、１００μｌのビオチン−ＮＨＳ−エステル（ＰＢＳ中１０μｇ、シグマ）を加え、その後、２時間インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄した。（ｃ）ビオチンの検出固定されたビオチンの量は、実施例３に記載されているように検出された。結果及び議論図９から、ＰＯＤのＭＷにかかわらず、ウエルあたり５μｇより少ないＰＯＤを用いることにより、表面におけるビオチンの検出において強い増加が見られているように思われる。これは、ＰＯＤへの観察された結合が特異的であり、ポリ −Ｌ−リシンへの非特異的結合によるものではないという追加の証拠である。この層は、このようにＰＯＤにより効果的にシールドされている。実施例１２ＮａＢＨ₄は、ノンバインダー特性を提供する。ＰＯＤで処理されたマイクロタイタープレートが、実施例３に記載されたように製造された。（ａ）ＮａＢＨ₄の添加ウエル１Ａ及び１Ｂに対し、２００μｌのＮａＢＨ₄（蒸留水中１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、その後水で２回滴定を生成した。２時間後、水で３回の洗浄を行った。（ｂ）ビオチンの標識を付されたＢＳＡの製造及び添加ビオチン−ＮＨＳ−エステルをＤＭＦ（１．７ｍｇ／ｍｌ，５μモル／ｍｌ）に溶解し、ＢＳＡをＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．２、５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。その後、４５μｌのビオチン−ＮＨＳ−エステル溶液を１ｍｌのＢＳＡ溶液に加えた。１２時間後、混合物をＰＢＳ中に１００μｇＢＳＡ／ｍｌ）まで希釈した。このインキュベーション期間の後、すべてのフリーのビオチン−ＮＨＳ−エステルは加水分解された。両方の列のすべてのウエルに対し、１００μｌの溶液を加え、１時間室温でインキュベーションを行った。（ｃ）ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）されたＢＳＡの検出固定されたビオチン化されたＢＳＡの量は、実施例３に記載されているように検出された。結果及び議論図１０から、ウエルあたり０．２ｍｇより多いＮａＢＨ₄を用いることにより、ＢＳＡの結合が最大限妨害されることがわかる。ＮａＢＨ₄がアルデヒド及びケトンをアルコールに還元することが出来ることは知られている。それによって、ＰＯＤ表面は多くの親水性ＯＨ基を含み、ノンバインダー特性を提供する。アルデヒド−／ケトン−と第１アミノ基との間の反応後に形成されたイミンは、同時に第２アミンに還元され、それによってデキストランとポリ−Ｌ−リシン上の第１アミノ基の間の結合は、不可逆的となる。実施例１３ＰＯＤ表面の安定性ＰＯＤで処理されたマイクロタイタープレートは、実施例３に記載されているように製造された。（ａ）例えばＰＯＤ表面への酸及び塩基の付与１００μｌの、０．１ＮのＮａＯＨ、１ＮのＮａＯＨ、０．１ＮのＨＣｌ、１ＮのＨＣｌ、ｐＨ７．２のＰＢＳ、ｐＨ９．６のカーボネートバッファー、洗浄バッファー、及び水をウエルに加えた。その後、これらを室温で１時間放置し、水で３回洗浄した。（ｂ）ブロックされていないアミノ基に対するビオチン−ＮＨＳ−エステルの結合これは、実施例１１に記載されているようになされた。（ｃ）固定されたビオチンの検出実施例３に記載されている手順結果及び議論図１１から、様々な強酸及び塩基で処理された後の、ビオチン−ＮＨＳ−エステルを有する表面上に検出可能なアミノ基の量は、水で処理後の量と比べて、変らず低かった。もしＰＯＤが存在しないならば、ポリ−Ｌ−リシン層の第１アミノ基に対するビオチン−ＮＨＳ−エステルの強い結合が見られた。このことは、ＰＯＤがやはり表面上に存在し、上記処理により除去され得ないことを意味する。このように、ＰＯＤ表面は特に安定である。他の実験（図示せず）では、我々は、様々な温度でのＰＢＳ中のＰＯＤの耐久性をも調査した。これは、数週間に及ぶ全テスト期間にわたって、変化せず、良好であることが見出だされた。実施例１４通常のヒトの血液ドナーからの血清が、ブロックされたＰＯＤ表面と特異的に反応するかどうかの調査（ａ）実施例１に記載されているように、ＰＯＤ処理されたマイクロタイタープレートを製造し、次いで、１５％のＰＥＧ４０００が加えられたＰＢＳ中１％ＢＳＡ２００μｌにより、１時間ブロックした。しかし、ウエルＡ−Ｂ、１−３には、そのかわりに１５％のＰＥＧ４０００が加えられたＰＢＳ中アフィニティー精製されたヒトＩｇＧの１０ｇ／ｍｌを加えた。対応するＢＳＡ及びＩｇＧで処理されたプレートを、通常の（ＰＯＤではない）処理されたマイクロタイタープレートから製造した。しかし、後者のコーティングのためには、ＰＥＧは使用されなかった。次いで、このプレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。（ｂ）通常のドナー血清の添加両性の健康な血液ドナーからの６０の血清を、希釈バッファー（１％のＢＳＡが加えられた洗浄バッファー）で１：１００に希釈し、それぞれＰＯＤ処理された、又は未処理のマイクロタイタープレートに加えた。これは、ウエルＡ−Ｃ、１−３を除いて３回なされた。室温で１時間インキュベートした後、洗浄バッファーにより３回洗浄を行った。（ｃ）固定されたヒトＩｇＧの検出すべてのウエルに対し、希釈バッファーで１：１０００に希釈されたウサギアンチ−ＩｇＧ（ＤＡＫＯ）の１００μｌが加えられ、室温で１時間インキュベーションがなされた。その後、洗浄バッファーにより、３回洗浄が行われた。次いで、固定されたペルオキシダーゼが、実施例３に記載されているように検出された。結果及び議論ヒトＩｇＧが加えられたウエルに対し、２．１及び１．８の平均ＯＤ値が、ＰＯＤで処理された、及び未処理のマイクロタイタープレートについて測定された。両方の型のマイクロタイタープレートについてヒトの血清が加えられたウエルに、０．０５未満のＯＤ値が見られた。このように、ＰＯＤ処理されたプレートは、非特異的結合に関し、通常の未処理のマイクロタイタープレートに匹敵する特性を示した。実施例１５サンドイッチ−ＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体の耐久性捕捉抗体（０．００２ｍｇ／ｍｌ、１００μｌのヤギ−アンチ−マウス（ＴＡＧＯ））を、実施例８に記載されているように、それぞれＰＯＤなしの４つのマイクロタイタープレート及びＰＯＤを伴う４つのマイクロタイタープレートに固定した。ＰＯＤ表面への固定のため、ＰＥＧが使用された。固定した後、プレートを水で洗浄し、空にし、フィルムでシールし、４０℃で放置した。それぞれ０、５、１０、２０日後、ＰＯＤなしのマイクロタイタープレート及びＰＯＤを伴うマイクロタイタープレートを取り出した。その後、１００μｌの抗体（腹水からタンパク質−Ａカラムにより精製されたマウスＯＸ３からのモノクローン抗体）を２回滴定に加え、濃度０．２ｍｇ／ｍｌから出発した。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄バッファーで洗浄し、ＨＰＲの標識が付されたウサギ−アンチ−マウス（ＤａｋｏｐａｔｓＡ／ＳＤｅｎｍａｒｋ）１：１０００で加え、その後の発展は、実施例８に記載されている通りである。結果及び議論０．２ｍｇ／ｍｌないし０．００１６ｍｇ／ｍｌの滴定において、ＰＯＤを伴うマイクロタイタープレート上に固定されたヤギ−アンチ−マウスは、０、５、１０、２０日において、１．０〜１．８のＯＤを得た。ＰＯＤを伴なわないマイクロタイタープレートでは、０．２〜０．００１６ｍｇ／ｍｌのインターバルの滴定において、０日で１．０〜１．８のＯＤが達成され、５日では、同じ滴定において、０．６〜０．２のＯＤが見られ、１０及び２０日では、０．５〜０．１のＯＤが見られた。このことから、ＰＯＤを伴うマイクロタイタープレート上の捕捉抗体の耐久性は、ＰＯＤを伴なわないマイクロタイタープレート上の捕捉抗体の耐久性とは反対に、０、５、１０、２０日において同一であった。そこでは、５日で既に抗体を結合する捕捉抗体の能力は、８０％低下し、１０日後では、高濃度で抗体を結合し得る困難性を伴う。同様の実験は、ＰＯＤ表面への捕捉抗体の耐久性は、少なくとも９０日変らないことを示した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月９日【補正内容】請求の範囲１．デキストランをトレシル化剤と反応させるトレシル−活性化デキストランの製造方法であって、デキストランを、ヘキサメチル燐酸トリアミド及び／又はＮ−メチルピロリジノンを含む溶媒中でトレシル化剤と反応させることを特徴とする方法。２．前記トレシル化剤は、トレシルクロリドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記トレシル化剤は、更にピリジンを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。４．表面をトレシル−活性化デキストランで処理することを特徴とする、求核基が存在する固相の表面の結合特性を修正する方法。５．表面は、ポリ−Ｌ−リシンで前処理されているポリスチレン表面である請求項４に記載の方法。６．表面をトレシル−活性化デキストランで処理し、化合物を処理された表面と接触させることを特徴とする、求核基が存在する固相の表面に化合物を固定する方法。７．前記表面は、ポリ−Ｌ−リシンで前処理されているポリスチレン表面である請求項６に記載の方法。８．求核基は、アミノ基、カルボキシル基、燐酸基、カルボニル基、チオール基、又はイソシアネート基である請求項７に記載の方法。８．ｉ）ポリ−Ｌ−リシンのようなポリアミノ酸、及びウシ血清アルブミンのようなポリペプチド、及びｉｉ）ポリエチレンイミンのようなポリアミンからなる群から選ばれた１種又はそれ以上のポリマーで処理することにより、アミノ基又はチオール基のような求核基が固相の表面に加えられることを特徴とする請求項７に記載の方法。１０．処理された表面は、更に、ナトリウムボロテトラハイドライド、エタノールアミン、亜硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、及び塩酸のような、酸化剤、還元剤、酸、又は塩基により処理される請求項７に記載の方法。１１．トレシル−活性化ＯＨ−基を含むポリマーは、アルデヒド、ケトン、ビニルスルホン、シアン、活性エステル、エポキシド、ジスルフィド、及びカルボン酸、燐酸及びスルホン酸の他の活性化合物から選ばれた活性基を示すように更に活性化される請求項７に記載の方法。１２．前記固相は、ポリスチレン、ポリエチレンブリコールテトラフタレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリジノン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレン−ブタジエンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラス、木材、及び金属からなる群から選ばれたものである請求項７に記載の方法。１３．前記固相は、マイクロタイタープレート、マイクロタイターストリップ、粒子、膜、試験管、テストストリップ、測定ピン、又は他の類似の製品の形である請求項１２に記載の方法。１４．表面をトレシル−活性化ＯＨ−基を含むポリマーで処理し、化合物を処理された表面と接触させることを特徴とする、求核基が存在する固相の表面に化合物を固定する方法。１５．固定されるべき化合物は、ｉ）オリゴ−及びポリペプチド、例えば免疫グロブリン、抗体及び抗原；一重及び二重らせんＤＮＡのような、モノ−、オリゴ−、及びポリヌクレオチド；ハプテン、オリゴ−及び多糖類、微生物、真核細胞、及び原核細胞のような固相アッセイに使用される生体分子、ｉｉ）ｐｆｐ活性化Ｆｍｏｃ−アミノ酸のようなペプチド合成のためのアミノ酸及びアミノ酸誘導体、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド合成のためのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド誘導体、及びｉｖ）アミログリコシダーゼのような、酵素プロセスのためのの酵素からなる群から選ばれたものである請求項１３に記載の方法。１６．化合物の固定は、ポリエチレングリコールの同時相互作用の下で生ずる、請求項１４に記載の方法。１７．トレシル−活性化ＯＨ−基を含むポリマーは、その表面に共有結合的に固定されている製品。１８．マイクロタイタープレ−ト、マイクロタイターストリップ、粒子、膜、試験管、テストストリップ、測定ピン、又は他の類似の製品の形である請求項１６に記載の製品。１９．固相アッセイ、固相ペプチド合成、固相ヌクレオチド合成、固相酵素プロセス、及び生体表面への連結における固相反応に使用される、請求項１７に記載の製品の用途。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．求核基が存在する固相の表面の結合特性を修正する方法であって、前記表面は、セルロースエーテルではない活性化多糖類の溶液で処理されることを特徴とする方法。２．前記活性化多糖類は、活性化デキストラン又は活性化アガロースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記活性化多糖類の活性化基は、アルデヒド、ケトン、ビニルスルホン、シアン、活性エステル、エポキシド、ジスルフィド、及びカルボン酸、燐酸及びスルホン酸の他の活性化合物から選ばれたものである請求項１に記載の方法。４．前記多糖類は、ぺルオキシダーゼの酸化又はトレシルクロリドの処理により活性化される請求項１に記載の方法。５．前記多糖類は、水のようなプロトン性溶媒内で活性化される請求項１に記載の方法。６．ヘキサメチルフォスホトリアミド、ジメチルスルホキシド、及びＮ−メチルピロリジノンのような非プロトン性溶媒内で活性化される請求項１−４のいずれかの項に記載の方法。７．求核基は、アミノ基、カルボキシル基、燐酸基、カルボニル基、チオール基、又はイソシアネート基である請求項１−６のいずれかの項に記載の方法。８．ｉ）ポリ−Ｌ−リシンのようなポリアミノ酸、及びウシ血清アルブミンのようなポリペプチド、及びｉｉ）ポリエチレンイミンのようなポリアミンからなる群から選ばれた１種又はそれ以上のポリマーで処理することにより、アミノ基又はチオール基のような求核基が固相の表面に加えられることを特徴とする請求項１−７のいずれかの項に記載の方法。９．処理された表面は、更に、ナトリウムボロテトラハイドライド、エタノールアミン、亜硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、及び塩酸のような、酸化剤、還元剤、酸、又は塩基により処理される請求項１−８のいずれかの項に記載の方法。１０．活性化多糖類は、アルデヒド、ケトン、ビニルスルホン、シアン、活性エステル、エポキシド、ジスルフィド、及びカルボン酸、燐酸及びスルホン酸の他の活性化合物から選ばれた活性基を示すように更に活性化される請求項１−９のいずれかの項に記載の方法。１１．前記固相は、ポリスチレン、ポリエチレンブリコールテトラフタレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリジノン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレン−ブタジエンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラス、木材、及び金属からなる群から選ばれたものである請求項１−１０のいずれかの項に記載の方法。１２．前記固相は、マイクロタイタープレート、マイクロタイターストリップ、粒子、膜、試験管、テストストリップ、測定ピン、又は他の類似の製品の形である請求項１１に記載の方法。１３．化合物が、請求項１−１２のいずれかの項に記載の方法によりその結合特性が修正される固相表面と接触せしめられる、固定された活性化多糖類が存在する固相の表面に化合物を固定する方法。１４．固定されるべき化合物は、ｉ）オリゴ−及びポリペプチド、例えば免疫グロブリン、抗体及び抗原；一重及び二重らせんＤＮＡのような、モノ−、オリゴ−、及びポリヌクレオチド；ハプテン、オリゴ−及び多糖類、微生物、真核細胞、及び原核細胞のような固相アッセイに使用される生体分子、ｉｉ）ｐｆｐ活性化Ｆｍｏｃ−アミノ酸のようなペプチド合成のためのアミノ酸及びアミノ酸誘導体、ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド合成のためのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド誘導体、及びｉｖ）アミログリコシダーゼのような、酵素プロセスのためのの酵素からなる群から選ばれたものである請求項１３に記載の方法。１５．化合物の固定は、ポリエチレングリコールの同時相互作用の下で生ずる、請求項１３及び１４のいずれかの項に記載の方法。１６．活性化デキストラン又は活性化アガロースのような、セルロースエーテルではない、活性化多糖類が、その表面に固定される製品。１７．マイクロタイタープレート、マイクロタイターストリップ、粒子、膜、試験管、テストストリップ、測定ピン、又は他の類似の製品の形である請求項１６に記載の製品。１８．固相アッセイ、固相ペプチド合成、固相ヌクレオチド合成、固相酵素プロセス、及び生体表面への連結における固相反応に使用される、請求項１６又は１７に記載の製品の用途。