WO2004089977A1 - 固定化タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

固定化タンパク質及びその製造方法 Download PDF

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general formula
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represented
carrier
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Masahiro Iwakura
Kiyonori Hirota
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof

Definitions

  • the present invention relates to an immobilized protein and a method for producing the immobilized lignin protein.
  • the main method of protein immobilization has been to chemically bind to an insoluble carrier by utilizing the reactivity of the side chains of the amino acids constituting the protein.
  • an immobilization reaction utilizing such a side chain functional group is used, in a protein having a plurality of side chains used for the immobilization reaction, controlling the immobilization site and controlling the It is difficult to prevent immobilization of the protein and to maintain the homogeneity of the immobilized protein.
  • these difficulties also lead to a decrease in the function of the immobilized protein, and improvements have been desired.
  • the immobilized protein binds via the main chain at one position of the carboxy terminus, so that the obtained immobilized protein is immobilized in an orientation-controlled manner, and Completely uniform. Furthermore, by maintaining the uniformity of orientation control, the reversibility of denaturation of the immobilized protein can be improved, which is excellent in terms of utilization such as heat sterilization of the immobilized protein. Characteristics can be added (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-45798, Japanese Patent No. 3047020).
  • the present inventors have conducted intensive studies to develop a means for further increasing the amount of immobilization in the case where the orientation is immobilized at one position of the carboxy terminus of the protein main chain, and as a result, a primary amino group such as polyallylamine was found. Is introduced into the surface of the carrier to increase the content of primary amino groups available for the immobilization reaction, so that the protein immobilization density is extremely high and the protein Experiments have revealed that the orientation can be fixed at certain locations, and the present invention has been completed.
  • the present invention involves the following configurations (1) to (8).
  • a method for producing an immobilized protein comprising immobilizing a protein represented by the formula:
  • R represents an arbitrary amino acid sequence
  • R 2 is a strongly negatively charged substance near neutrality
  • carboxyl terminal of the protein main chain represented by the general formula (I) is immobilized by a peptide bond to a primary amino group of the polymer compound bound to a carrier.
  • a hardened protein is immobilized by a peptide bond to a primary amino group of the polymer compound bound to a carrier.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the input protein and the amount of immobilized protein when green fluorescent protein is immobilized on various carriers.
  • the present invention relates to a method for immobilizing a protein on a carrier by bonding a polymer compound having a primary amino group in a repeating structure to the surface of the carrier and bonding the carboxy terminus of the protein main chain to the primary amino group of the polymer compound. Is what you do.
  • the protein to be immobilized is not limited, and it is possible to immobilize any protein such as an in vivo protein, an enzyme, an antigen protein, and an antibody. Accordingly, the present invention provides, for example, a method for preparing an enzyme reactor by immobilizing an enzyme, and a separation carrier utilizing specific intermolecular interactions such as affinity for other compounds possessed by the immobilized protein. It can be applied to a very wide range of applications, such as preparing a carrier on which a diagnostic antigen or antibody is immobilized using an antigen-antibody reaction by immobilizing a specific antigen or antibody and further immobilizing a specific antigen or antibody. .
  • the present invention is characterized in that a carrier having an increased content of a primary amine which can be used for an immobilization reaction is used by bonding a polymer compound having a primary amino group in a repeating structure to the surface of an insoluble carrier.
  • the means for bonding the carrier and the polymer compound in the present invention may be any means capable of stably holding the polymer compound on the surface of the carrier, for example, ionic bond, covalent bond, hydrophobic bond or adsorption. Chemical and physical bonding means, such as bonding, coating, and the like.
  • Polymer compounds having a primary amino group in a repeating structure include those having a polyalkylene chain as a main chain, those having a polyamide chain, those having a polyester chain. Examples thereof include those having a ren chain, and have a repeating structure represented by the general formula (IV).
  • X represents, for example, one monomer residue constituting a polyalkylene chain, a polyamide chain, a polyester chain, a polystyrene chain, or the like.
  • the NH 2 group may be a group contained in the monomer residue, or may be a group contained in a side chain branched from the main chain of these polymer compounds.
  • those having a polyalkylene chain include, for example, polyallylamine, and this polymer compound has a high primary amine content per unit mass, It can be used preferably in the present invention.
  • the present invention is not limited to this, and for example, a copolymer of a vinyl compound having a primary amino group in a side chain and another vinyl compound, or various polymer compounds such as polylysine can be used.
  • Cellulophine grafted with polyallylamine is known as a carrier in which a polymer compound having a primary amino group in a repeating structure is introduced on the surface. 283-289 (2002)), but a carrier similar to this can be easily prepared by bonding a polymer compound having a primary amino group in a repeating structure to the carrier.
  • a carrier for example, a carrier chemically reactive with a primary amino group, such as CNBr-activated Sepharose FF and NHS-activated Sepharose FF, and a primary amino group such as polyarylamine are known.
  • a carrier in which the polymer compound is bonded to the carrier by a covalent bond can be produced.
  • the polymer carrier can be used for the immobilization reaction of the protein in the produced polymer-binding carrier.
  • the content of primary amino groups can be varied.
  • R 1 represents an arbitrary amino acid sequence.
  • R 2 is any amino acid residue which is strongly negatively charged near neutrality and which can make the isoelectric point of the substance of the general formula (III) acidic. Represents a chain of ] The protein having the sequence shown in is synthesized.
  • the amino acid sequence R 2 is strongly negatively charged near neutrality, and has the above-mentioned primary amino group which is positively charged under neutral conditions in the repeating structure. An electrostatic interaction occurs with the polymer compound.
  • the protein represented by the general formula (III) has a lipoxyl terminal side adsorbed to the primary amino group side of the polymer compound on the carrier, thereby forming a peptide (amide) bond formation reaction described below.
  • a lipoxyl terminal side adsorbed to the primary amino group side of the polymer compound on the carrier, thereby forming a peptide (amide) bond formation reaction described below.
  • the carboxy terminal of the above general formula (III) may contain an amino acid sequence to be a linker peptide.
  • the protein in this case is represented by the following general formula (V).
  • R a is a linker peptide between the protein and the polymer first compound binding carrier to be cane immobilized It represents an amino acid sequence.
  • Ra is arbitrary and its amino acid type and number are not limited. For example, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly is one of the simplest sequences.
  • such a protein can be easily produced by a technique known in genetic engineering.
  • the synthesized DNA is appropriately expressed in an expression vector.
  • a host such as Escherichia coli, expressed in a transformed host, and then isolated and purified from the expressed protein.
  • the protein can be produced by a combination of a genetic engineering technique and a conventional protein synthesis technique, or only by a protein synthesis technique.
  • R 2 in the above general formulas (III) and (V) is preferably a sequence containing a large amount of aspartic acid or glutamic acid.
  • aspartic acid or glutamic acid is selected so that the isoelectric point of the cyanated protein represented by the following general formula ( ⁇ ) or (VII) is a value between 4 and 5. What is necessary is just to design a sequence containing many.
  • a preferred class of such sequences is alanyl-polyaspartic acid.
  • a primary amino group of a polymer compound having a primary amino group repeated in a structure bonded to an insoluble carrier and a carboxy terminal carboxy terminal group of the protein main chain are composed of a peptide (amide). ) Having a structure linked by a bond.
  • R 2 is formula (III), are each with R 2 equal, the 3 ⁇ 4 any Amino acid sequences, R 2 is a strong negative charge around the neutral and having the general formula (II ) Represents an amino acid sequence capable of making the isoelectric point of the compound acidic.
  • the cyanated protein obtained by the cyanation of the general formula (V) is a protein represented by the following general formula (VII).
  • RR 2 is R a is, 3 ⁇ 4 of formula (V), are each identical with R 2 and R a,, is charged to any amino acid sequence, R 2 is strong negative around neutral And an amino acid sequence capable of making the isoelectric point of the compound of the general formula (II) acidic.
  • Ra represents an amino acid sequence serving as a linker peptide between the protein to be immobilized and the polymer compound-bound carrier.
  • This cyanation reaction can be carried out using a commercially available cyanation reagent.
  • NTCB 2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid
  • NTCB 2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid
  • Cyanation using NTCB can be performed efficiently in a 10 mM phosphate buffer at pH 7.0. After this cyanation reaction, the immobilization reaction proceeds by making the solvent weak alkaline. That is, an amide bond is formed between the carboxyl group of the amino acid residue immediately before the cyanocysteine residue and the primary amino group of the carrier. This can be achieved, for example, by replacing the buffer with a 10 mM borate buffer at pH 9.5.
  • the conversion of the cyanocysteine of the sulfhydryl group of the cysteine residue required for the above-mentioned immobilization reaction can be carried out before or after the protein is adsorbed to the carrier for immobilizing the protein, as already clarified by the present inventors. Alternatively, it may be performed simultaneously with the adsorption (see JP-A-2003-344396). Since the proteins after cyanation represented by the general formulas (II) and (VII) also have a strongly negatively charged amino acid sequence near neutrality, the proteins after cyanation can be adsorbed on a carrier even if they are adsorbed on a carrier.
  • the carboxy terminal side of the protein main chain is oriented to the primary amino group side of the polymer compound on the carrier, and the carboxy terminal side of the protein main chain is bonded to the primary amino group by the amide formation reaction described above.
  • the immobilized enzyme of the present invention obtained by the above means has a repeating structural portion represented by the general formula (VII) or ( ⁇ ), and binds to the polymer compound on the carrier at one carboxy terminal of the protein.
  • the polymer compound is bonded to the insoluble carrier by chemical or physical bonding means such as ionic bond, covalent bond, hydrophobic bond or adsorption, adhesion, coating or the like.
  • the protein is oriented at a density that is at least twice as high as that of the conventional method already invented by the present inventors (see Japanese Patent Application No. 2003-344396 and Japanese Patent No. 3047020). Control can be fixed.
  • insoluble carrier used in this example as a polymer having a primary amino group corresponding to the general formula (1), L-type polyallylamine commercially available from Nitto Boseki is a commercially available insoluble carrier CNBr.
  • Activated Sepharose purchased from Pharmacia
  • polyallylamine-bound Sepharose this is called polyallylamine-bound Sepharose.
  • the proteins prepared for use in the immobilization were labeled with the green fluorescent protein (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of the linker peptide portion, respectively.
  • Al-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp is a protein (SEQ ID NO: 2) which is sequentially added.
  • the protein to be immobilized is a protein obtained by adding a linker peptide to a green fluorescent protein. is there. It has been already clarified that the protein immobilized in the present invention does not depend on the type of protein (Japanese Patent Application No. 2003-344396, Japanese Patent No. 3047020).
  • CNBr-activated Sepharose 5 g was suspended in 20 ml of ImM hydrochloric acid, swollen for 30 minutes, and washed with 50 ml of ImM hydrochloric acid.
  • the insoluble portion was collected, suspended in 20 ml of a 0.1% L-type polyallylamine solution, mixed gently for 12 hours, and a binding reaction was performed. Thereafter, the insoluble portion was suspended in 20 ml of a 1 M monoethanolamine solution, and the active group on the unreacted carrier was masked by gentle stirring at room temperature for 4 hours.
  • washing with 50 mM glycine / HC1 buffer (pH 3.5) containing 20 ml of IM NaCl and washing with 50 mM Tris / HC1 buffer (pH 8.0) containing 20 ml of IM NaCl were alternately performed 8 times.
  • the obtained insoluble portion was collected and used for the subsequent immobilization of the protein.
  • the content of the primary amine introduced into the polyallylamine-bound cepharose obtained in this manner was adjusted to 1, and the coloring reaction using 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) (Reference: Robert Fields, Methods in Enzymology. Clear compared to EAH-Sepharose 4B and Lysine-Sepharose 4B (sold in Amersham Fulmasia), Affigel 102 (sold in Biorad), Porus 20 NH (sold in Beilingermannheim) It showed a strong coloring reaction and a high primary amine content.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid
  • a DNA sequence that encodes the amino acid sequence linked to the DNA sequence is chemically synthesized, and a DNA sequence that encodes the eight amino acid sequence portions on the amino-terminal side of the green fluorescent protein is chemically synthesized.
  • a PCR reaction was performed to prepare a gene DNA encoding the amino acid sequence corresponding to the green fluorescent protein for immobilization (SEQ ID NO: 2) to which the linker peptide was added, and EcoHI and Hindlll of the expression vector pUC18 were prepared.
  • Recombinant plasmid was prepared by incorporation into the site. This was introduced into E. coli strain JM109, expressed, and then separated and purified as described below.
  • the gene encoding the green fluorescent protein (SEQ ID NO: 1) was purchased from QUANTUM and used, but the present invention is not limited by the method of obtaining the gene.
  • the recombinant E. coli expressing the green fluorescent protein for immobilization was incubated at 37 ° C in 2 liters of medium (containing 20 g of sodium chloride, 20 g of yeast extract, 32 g of tryptone, and 100 mg of ampicillin sodium). After overnight culture at, the culture was centrifuged at a low speed (5000 rpm) for 20 minutes to obtain about 5 g of wet cells.
  • Ammonium sulfate was added to the obtained supernatant to a final concentration of 40%, stirred at 41:20 for 20 minutes, and centrifuged for 20 minutes (20,000 rpm) to separate the supernatant.
  • ammonium sulfate was added to a final concentration of 90%, and the mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes, centrifuged for 20 minutes (20,000 rpm), and the precipitate was separated.
  • the precipitate was dissolved in 40 ml of buffer 1 and dialyzed against 41 buffers 1 three times.
  • the dialyzed protein solution was applied to a column (200 ml) of DEAE Toyopearl (purchased from Tosoichi Co., Ltd.), which had been equilibrated with buffer 1 containing 50 mM KC1, and 500 ml of buffer 1 containing 50 mM KC1. After that, the protein was eluted by applying a KC1 concentration gradient of 50 mM to 500 mM using buffer solution 1, and the fraction containing the green fluorescent protein for immobilization was separated.
  • DEAE Toyopearl purchased from Tosoichi Co., Ltd.
  • the separated fraction was dialyzed against buffer 1 and applied to a column (200 ml) of SuperQ Toyopearl (purchased from Tosoichi Co., Ltd.) previously equilibrated with buffer 1 containing 50 mM KC1. After flowing buffer solution 1 containing 50 mM of KC1, the protein was eluted by applying a gradient of 50 mM to 500 mM KC1 using buffer solution 1 to elute the protein, and the fraction containing the green fluorescent protein for immobilization was separated. separated. At this stage, the protein was homogenized, and about 100 mg of the uniform green fluorescent protein for immobilization was obtained.
  • the obtained protein was stored against buffer solution 1, and the dialyzed sample was stored at 4 ° C and used for the subsequent experiments.
  • the above-mentioned green fluorescent protein for immobilization (SEQ ID NO: 2) obtained in the above step was previously converted to a 10 mM phosphate buffer ( ⁇ 7. ⁇ ) containing 1000 volumes of 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (buffer 2) Dialysis was performed at least three times. The dialyzed protein was diluted with buffer solution 2 to prepare various concentrations of the above green fluorescent protein solution for immobilization.
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • the colored insoluble portion was suspended in a buffer solution 2 containing 5 mM of 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTCB), and subjected to a cyanation reaction at room temperature for 4 hours with gentle stirring and mixing. Thereafter, the plate was washed 5 times with 1 ml of buffer 2.
  • the obtained insoluble portion was suspended in 1 ml of a 10 mM borate buffer (pH 9.5) containing 5 mM EDTA, and an immobilization reaction was carried out at room temperature for 24 hours with gentle stirring and mixing.
  • the insoluble portion was washed 5 times with 1 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M KCL to remove unreacted substances and side reaction products of the immobilization reaction.
  • the amount of green fluorescent protein immobilized on polyallylamine-bound Sepharose was determined by measuring the fluorescence in the visible part.
  • the insoluble portion obtained in the above-mentioned immobilization reaction was suspended in 3 ml of buffer solution 2, and the fluorescence spectrum from 485 nm to 600 nm was measured at 25 ° C. .
  • the fluorescent spectrum in which the insoluble portion obtained by adsorbing the above-described immobilized green fluorescent protein of lOnmoles on lOl polyarylamine-binding sepharose was suspended in 3 ml of buffer solution 2 was measured at 25 ° C. (Reference spectrum).
  • Each fluorescence spectrum showed the maximum fluorescence intensity at 511 nm. The fluorescence was measured in exactly the same manner, and the mass of the immobilized green fluorescent protein was determined using the fluorescence intensity of 511 nm.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the amount of protein used in the immobilization reaction (the amount of input protein) and the amount of immobilized protein when 1 ml of the carrier was used.
  • ⁇ indicates polyallylamine-bound cepharose of the present invention
  • ⁇ indicates aminocepharose (commercially available)
  • ⁇ indicates aminocell mouth fine (commercially available)
  • ⁇ indicates aminotoyopearl (commercially available).
  • the maximum amount of immobilization per 1 ml of the carrier is about 0.4 moles for aminotolamine aminocell mouth phain and about 0.4 II moles for aminoaminosepharose, and the maximum immobilization indicated by the polyarylamine-bound sepharose of the present invention.
  • the immobilization amount is about 1 imoles, and the protein can be immobilized two to three times that of a conventional carrier.
  • the immobilization method via cyanocysteine used in the present invention is also a method for immobilizing a protein while controlling the orientation. As described above, it is apparent that the use of a polymer compound having a primary amino group in a repeating structure as an insoluble carrier is advantageous. Therefore, it is considered that the high-density protein controlled by the orientation, which is the aim of the present invention, has been achieved.
  • proteins can be immobilized on a carrier at extremely high density while controlling the orientation as compared with the conventional method.
  • the insoluble carrier that can be used for introducing a polymer compound having a primary amino group is not particularly limited, and any insoluble carrier capable of creating a chemical bond forming ability for a polymer compound having a primary amino group can be used. Anything may be used, and there is no restriction on the protein to be immobilized.
  • the present invention relates to the fields of enzyme utilization, antigens and antibodies, in vivo biologically active substances, medical fields for diagnosis and the like using enzymes, etc., and separation and purification fields utilizing the specific affinity of these substances. It provides a useful tool that can be applied to a very wide range of fields.

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Abstract

　一級アミノ基を繰り返し構造中に有するポリマー化合物を担体表面に導入することにより、固定化反応に利用できる一級アミノ基の含量を増大させ、タンパク質をカルボキシ末端の一箇所で高密度に固定化する。

Description

明細書 固定化夕ンパク質及びその製造方法 技術分野
本発明は、 固定化タンパク質および該固定ィヒタンパク質の製造方法に関する。 背景技術
従来、 可溶性のタンパク質を、 例えばァガロースゲル等の不溶性担体と結合させ、 固定 化タンパク質として利用することが試みられていた。 例えば、 酵素タンパク質を不溶性担 体に結合した固定化酵素を開発し、 それを利用して酵素反応器を作製すること等が行われ ていた。 このような固定化タンパク質の品質としては、 タンパク質の性質 ·機能が均一で あること、 固定化されていない可溶性タンパク質と同等の性質 ·機能を保持していること、 更に、 担体あたりの固定化タンパク質の量が多ければ多いほど良いことが望まれるが、 そ れはタンパク質の固定化方法に依存している。
タンパク質固定化の方法としては、 タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖の反応性を利 用して、 不溶性担体と化学的に結合することが主に行われていた。 しかし、 このような側 鎖の官能基を利用する固定化反応を用いる限りにおいては、 固定化反応に使用される側鎖 を複数有するタンパク質においては、 固定化部位を制御すること、 複数の箇所での固定化 を防ぐこと、 更に固定化されたタンパク質の均一性を保つことが困難である。 また、 これ らの困難さの要因は、 固定化されたタンパク質の機能低下にもつながるものであり、 改善 が望まれていた。
これらの問題を解消するために、 タンパク質の主鎖を介した固定化反応の開発について 検討が行われ、 既に、 本発明者らにより、 シァノシスティン残基を介したアミド結合形成 反応を利用した、 タンパク質のカルボキシ末端のカルポキシル基を、 一級アミンを有する 担体とペプチド （アミド） 結合を介して固定化する方法が開発されている (特開平 1 0— 4 5 7 9 8号公報、 特許第 3047020号公報参照）。
このことにより、 固定化されたタンパク質がカルポキシ末端の一箇所で主鎖を介して結 合するため、 得られる固定化された夕ンパク質は配向制御された形で固定化されており、 且つ、 完全に均一となる。 さらに、 配向制御均一性が保たれることで、 固定化されたタン パク質の変性の可逆性を髙めることができ、 固定化タンパク質の熱殺菌を可能にするなど の利用面で優れた特性を付加することができる （特開平 1 0— 4 5 7 9 8号公報、 特許第 3047020号公報参照）。
上記のように、 このような優れた性能を有する固定化夕ンパク質が作製されているが、 更に、 担体当たりの固定化量を増やすことは、 固定化タンパク質の利用面で重要であり、 更なる改良が必要であると考えられた。 発明の開示 本発明は、 上記従来技術の実情に鑑み、 担体に固定化したタンパク質が均一に配向して いるのみでなく、 さらに、 担体当たりのタンパク質の固定化量を顕著に増大させる手段を 提供することをその課題とするものである。
本発明者らは、 タンパク質主鎖のカルポキシ末端の一箇所で配向固定化する場合におい て、 固定化量をさらに増大させるための手段を開発すべく鋭意研究した結果、 ポリアリル ァミン等の一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物を担体表面に導入して、 固定化反応に利用できる一級ァミノ基の含量を増大させることにより、 タンパク質の固定 化密度が極めて大で、 かつタンパク質をカルポキシ末端の一箇所で配向固定化できるにこ とを、 実験により明らかにし、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は以下 （1 ) 〜 （8 ) の構成を伴うものである。
( I ) 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を介して、 担体に一般式 (I)
Figure imgf000004_0001
[上記式中、 は任意のアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質を固定し、 固定化タンパク質を製造する方法であって、 担体に結合 した該ポリマー化合物の一級アミノ基に、 一般式 （I) で示されるタンパク質主鎖のカル ボキシ末端をべプチド結合により固定化することを特徴とする、 固定化夕ンパク質の製造 方法。
( 2 ) 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物がポリアリルァミンである ことを特徴とする上記 （1 ) に記載の固定化タンパク質の製造方法。
( 3 ) 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物がポリリジンであることを 特徴とする上記 ( 1 ) に記載の固定化タンパク質の製造方法。
( 4 ) 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を介して、 担体に一般式 (I)
NHi-RrCOOH · · · (I)
[上記式中、 ¾は任意のアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質を固定化し、 固定化タンパク質を製造する方法であって、 担体に結 合させた該ポリマー化合物と、 一般式 (II)
NH2-Ri-CONH-CH(CH2-SCN) -CO-NH-R2-COOH · · · (II)
[上記式中、 R,は任意のアミノ酸配列を、 R2は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式
(II) の化合物の等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。 ]
で示される夕ンパク質とを反応させることにより、 該ポリマ一化合物の一級ァミノ基に、 一般式 （I) で示されるタンパク質主鎖のカルポキシ末端をペプチド結合により結合させ ることを特徴とする、 固定ィヒタンパク質の製造方法。
( 5 ) 一般式 IIの化合物が、 一般式 （III)
NH2-RrCONH-CH(CH2-SH) -CO-NH-R2-COOH · · · (III) [上記式中、 、 ¾は、 上記一般式 (III) と同じ意味を表す。〕 で示される化合物にシァノ化試薬を作用させることにより形成されたものである上記 ( 4 ) に記載の製造方法。
( 6 ) 一般式 （I) で示されるタンパク質が、 さらにリンカ一ペプチドのアミノ酸配列を 有する、 請求項 1〜4に記載の固定化タンパク質の製造方法
( 7 ) 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を介して、 担体に一般式 (I)
Figure imgf000005_0001
[上記式中、 は任意のアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質を固定した固定化タンパク質であって、 担体に結合した該ポリマ一 化合物の一級アミノ基に、 一般式 （I) で示されるタンパク質主鎖のカルポキシ末端がぺ プチド結合により固定化されていることを特徴とする、 固牢化タンパク質。
( 8 ) 一般式 （I) で示されるタンパク質が、 さらにリンカ一ペプチドのアミノ酸配列 を有する、 上記 （7 ) に記載の固定化タンパク質 図面の簡単な説明
第 1図は、 各種担体に緑色蛍光蛋白質を固定化させた場合における、 投入タンパク質と 固定化されたタンパク質量との関係を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 担体表面に一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を結合させ、 該ポリマー化合物の一級アミノ基とタンパク質主鎖のカルボキシ末端をペプチド結合させ ることにより、 担体にタンパク質固定化するものである。
本発明においては、 固定化させるタンパク質は限定されず、 生体内タンパク質、 酵素、 抗原タンパク質、 抗体等あらゆるタンパク質を固定化することが可能である。 したがって、 本発明は、 例えば、 酵素を固定化させて酵素反応器を作製すること、 固定化したタンパク 質が有する他の化合物に対する親和性等の特異的分子間相互作用を利用した分離用担体を 作製すること、 あるいは、 更に、 特定の抗原または抗体を固定化させて抗原抗体反応を利 用した診断用抗原または抗体を固定化した担体を作製すること等の極めて広い用途に適用 が可能である。
1 . 固定化に供される担体及びポリマー化合物
本発明においては、 一級アミノ基を繰り返し構造中に有するポリマー化合物を不溶性担 体表面に結合することにより、 固定化反応に利用できる一級ァミンの含量が増大した担体 を用いることに特徴を有する。 本発明における担体と上記ポリマ一化合物との結合手段は、 上記ポリマ一化合物を安定的に担体表面に保持しうるものであればいずれでもよく、 例え ば、 イオン結合、 共有結合、 疎水結合あるいは吸着、 接着、 被覆等の化学、 物理的結合手 段が挙げられる。
一級ァミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物としては、 主鎖としてポリアルキ レン鎖を有するもの、 ポリアミド鎖を有するもの、 ポリエステル鎖を有するものポリスチ レン鎖を有するもの等が挙げられ、 一般式 （IV) で表される繰返し構造を有する。
【化 1】 X j— · · · · ( 匪 2
〔 上記式 （IV) 中、 Xは、 例えば、 ポリアルキレン鎖、 ポリアミド鎖、 ポリエステル鎖、 ポリスチレン鎖等を構成するモノマ一残基を表す。 また、 NH2基は、 該モノマー残基中に 含まれる基であってもよいし、 これらポリマー化合物の主鎖から分枝した側鎖中に含まれ る基であってもよい。〕 本発明においては、 これらのポリマ一化合物のうち、 ポリアルキレン鎖を有するものと して、 例えば、 ポリアリルアミンを挙げることができるが、 このポリマー化合物は単位質 量当たりの一級アミン含量が高く、 本発明において好ましいものとして用いることができ る。 しかし、 本発明はこれに限定されず、 例えば、 一級アミノ基を側鎖に有するビニル化 合物と他のビニル化合物との共重合体、 あるいはポリリジンなど各種のポリマ一化合物が 利用できる。
一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を表面に導入した担体としては、 ポリアリルアミンをグラフトしたセルロフアインが知られている （参考論文： Ung- Jin Kim, Shigenori Kuga, Journal of Chromatography A, 946, 283-289 (2002)参照） が、 これに類する担体は、 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物を、 担体に結 合することにより容易に作製することができる。 このような担体としては、 例えば、 CNBr 活性化セファロ一ス FF、 NHS活性化セファロース FF等の化学的に一級アミノ基と反応性 を有する担体が知られており、 これにポリァリルァミンなどの一級アミノ基を繰返し構造 中に有するポリマ一化合物を作用させることにより、 ポリマ一化合物が担体に共有結合に より結合した担体を作製できる。
この作成においては、 一級アミンを繰り返し有するポリマ一化合物と活性化担体との混 合比を適度に調製することにより、 作製されるポリマ一化合物結合担体において、 タンパ ク質の固定化反応に利用できる一級アミノ基の含量を変化させることができる。
2 . 固定化に供されるタンパク質
本発明においては、 一般式 (I)
NH2-ErC00H · · · · (I)
(式 1中、 R 1は任意のアミノ酸配列を表す。）
で示されるタンパク質の固定化において、 まず、
一般式 (III)
NH2-RrCO-NH-CH(CH2-SH) -C0-NH-R2-C00H - · · (III) 〔式 (III)中、 I ま任意のアミノ酸配列、 R2は、 中性付近で強く負に荷電し、 且つ上記 一般式 (III)の物質の等電点を酸性にできる任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。〕 で示され る配列の夕ンパク質を合成する。
この一般式 （III) で表されるタンパク質の構造中、 アミノ酸配列 R2は中性付近で強く負 に荷電しており、 中性条件では正に帯電する上記一級アミノ基を繰り返し構造中に有する ポリマー化合物と静電相互作用が生じる。
したがって、 一般式 （III) で表されるタンパク質は、 その力ルポキシル末端側が、 担体 上のポリマ一化合物の一級アミノ基側に吸着されることにより、 以下に説明するべプチド (アミド） 結合生成反応により、 タンパク質主鎖の力ルポキル末端を該一級アミノ基と効 率よく結合させることができることができる （特開 2003-344396号公報、 特許第 3047020 号公報参照)。
さらに、 本発明においては、 上記一般式 （III) のカルポキシ末端側にリンカ一ぺプ チドとなるアミノ酸配列を含んでいてもよい。 この場合のタンパク質は以下の一般式 (V) で表される。
NH2-Ri-CO-NH-Ra-CO-NH-CH(CH2-SH) -CO-NH-R2-COOH - · - (V)
(式中、 及び R2 は、 前記一般式 （III) の 及び R2とそれぞれ同一であり、 Raは、 固定化しょうとするタンパク質と上記ポリマ一化合物結合担体との間のリンカーペプチド となるアミノ酸配列を表す。） Raは任意でありそのアミノ酸の種類、 数ともに限られない が、 例えば Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly等が最も単純な配列の一つである。
本発明において、 このようなタンパク質は、 遺伝子工学的に公知の技術により容易に作 製することができる。
例えば、 上記一般式 (V)で示される融合タンパク質をコードする遺伝子 D N Aを調製す る場合には、
一般式 ( 1 ) で表されるタンパク質をコードする遺伝子 D N Aと 一般式 (VI)
NH2-Ra-CO-NH-CH(CH2-SH) -CO-NH-R2-COOH · · · (VI)
(式中、 I ま上記一般式 （V) の Raとそれぞれ同一であり、 R2は、 中性付近で強く負に 荷電し、 且つ上記一般式 (III)の物質の等電点を酸性にできる任意のアミノ酸残基の連鎖を 表す。）
で示されるぺプチド配列をコ一ドする遺伝子 D N Aとを結合することにより、 上記一般式 (V)で示される融合タンパク質をコードする遺伝子 D N Aを合成し、 合成した D N Aを適 切な発現べクタ一に組み込み、 これを大腸菌などの宿主に形質導入し、 形質転換した宿主 において発現させ、 その後、 発現したタンパク質を分離精製することにより得ることがで さる。
あるいは、 上記タンパク質は、 遺伝子工学的手法と慣用のタンパク質合成技術との組み 合わせ、 または、 蛋白合成技術のみによっても作製することができる。
一方、 上記一般式 (III)および (V)における R2としては、 ァスパラギン酸やグルタミン酸 を多く含む配列が好適である。 好ましくは、 下記一般式 (Π)あるいは （VII) で表されるシ ァノ化タンパク質の等電点を 4〜5の間の値になるように、 ァスパラギン酸やグルタミン酸 を多く含む配列をデザィンすればよい。 そのような配列のうち好適な列としてァラニル- ポリアスパラギン酸をあげることができる。 その理由は、 シァノシスティン残基の次のァ ミノ酸残基をァラニンにすることにより、 シァノシスティン残基を介したアミド結合形成 反応が生じやすいことと、 アミノ酸側鎖の中でァスパラギン酸の力ルポキシル基が最も酸 性であるからである。
3 . タンパク質の固定化
本発明において調製される固定化タンパク質は、 不溶性担体に結合した、 一級アミノ基 を繰り返し構造中に有するポリマー化合物の一級アミノ基とタンパク質の主鎖のカルポキ シ末端の力ルポキシル基とがペプチド （アミド） 結合で結合した構造を有する。
この結合を達成させるためには、 上記一般式 (III)あるいは一般式 （V) のタンパク質中 のシスティン残基のスルフヒドリル基をシァノ化しシァノシスティンに変換する必要があ り、 一般式 （ΙΠ) のシァノ化により得られるシァノ化タンパク質は以下の一般式 （II) で 表されるタンパク質である。
NHrRrCONH-CH (CH SCN) -CO-NH-Rs-COOH · · · (II)
[上記式中、 、 R2は一般式 （III) の 、 R2とそれぞれ同じであり、 ¾は任意のァミノ 酸配列を、 R2は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式 （II) の化合物の等電点を酸性にし 得るアミノ酸配列を表す。 ]
また、 一般式 (V) のシァノ化により得られるシァノ化タンパク質は以下の一般式 (VII) で表されるタンパク質である。
NH2-Ri-CO-NH-Ra-CO-NHCH (CHa-SCN) -CO- H-R2-COOH - · · (VII)
〔式中、 R R2 は Raは、 前記一般式 (V) の ¾、 R2及び Raとそれぞれ同一であり、 , は任意のアミノ酸配列を、 R2は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式 （II) の化合物の等 電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。 また、 Raは、 固定化しようとするタンパク質と 上記ポリマー化合物結合担体との間のリンカ一ぺプチドとなるアミノ酸配列を表す。） このシァノ化反応は、 市販のシァノ化試薬を用いて行うことができる。 シァノ化試薬と しては、 通常、 2-二ト口- 5-チオシァノ安息香酸 (2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Biochemistry, 13,1-11 (1974)参照）または、 1ーシァ ノ -4-ジメチルァミノピリジニゥムテトラフルォロ硼酸
( 1 -cyano- 4 imetliyiaminopyridmium tetrafluoroborate (CDAP) )なと 用いる方法力 S簡 便である。
NTCBを用いたシァノ化は、 pH7.0の 10mM燐酸緩衝液中で効率よく行うことができる。 このシァノ化反応の後、 溶媒を弱アルカリにすることにより、 固定化反応が進行する。 即 ち、 シァノシスティン残基直前のアミノ酸残基のカルボキシル基と担体の一級ァミノ基と の間にアミド結合が形成される。 このことは、 緩衝液を pH9.5の 10mM硼酸緩衝液に換え ること等で可能である。
上記固定化反応に必要なシスティン残基のスルフヒドリル基のシァノシスティンの変換 は、 既に本発明者らが明らかにしているように、 タンパク質を固定化する担体に吸着させ る前でも、 後でも、 あるいは吸着と同時に行ってもよい （特開 2003-344396参照）。 一般式 （II) 及び （VII) で表されるシァノ化後のタンパク質も中性付近で強く負に帯電 するアミノ酸配列を有しているため、 シァノ化後のタンパク質を担体を吸着させてもタン パク質主鎖のカルポキシ末端側が担体上のポリマ一化合物の一級アミノ基側に配向し、 上 記アミド形成反応により、 タンパク質主鎖のカルポキシ末端側が該一級アミノ基と結合す る。
本発明で用いるシァノシスティンが関与する反応には、 副反応として加水分解反応が起 こりうる力 このような副反応から生成する反応物は全て溶媒に溶けるため， 反応後、 固 定化担体を適当な溶媒で洗うことにより副反応生成物を取り除くことができる。
以上の手段により得られる本発明の固定化酵素は、 一般式 (VII)あるいは （νιπ) で表 される繰り返し構造部分を有し、 タンパク質のカルボキシ末端一箇所で担体上のポリマ一 化合物と結合し、 該ポリマ一化合物は、 イオン結合、 共有結合、 疎水結合あるいは吸着、 接着、 被覆等の化学的あるいは物理的結合手段等により不溶性担体に結合しているもので ある。
【化 2】
Figure imgf000009_0001
*■、 γ. ' ,- ·=.".. w
J>J Η uli — ϋ ί— H 2
【化 3】
Figure imgf000009_0002
NH - CO— R — NH— CO一 Ri -丽 2
〔上記式 Vin、 IX中、 R iおよび R aは一般式 （I) の 及び一般式 （V) の R aとそれぞれ 同一であり、 Xは、 一般式 （IV) の Xと同一である。）
本発明に従うと、 本発明者らが既に発明している従来の方法 （特願 2003-344396号公報、 特許第 3047020号公報参照） に比較して 2倍以上の高密度で夕ンパク質を配向制御固定化 することができる。 実施例
以下、 実施例により本発明を説明するが、 本発明はこれらの実施例により限定されない。 本実施例において用いる不溶性担体としては、 一般式（1)に該当する一級アミノ基を有 するポリマ一として、 日東紡で市販している L型ポリアリルアミンを市販されている不溶 性担体である CNBr活性化セファロ一ス （フアルマシアより購入） に作用させることによ り結合させたもの （これをポリアリルアミン結合セファロ一スと称する） である。
本実施例において固定化に用いるために調整されたタンパク質は、 それぞれ緑色蛍光夕 ンパク質 （配列番号 1) に、 リンカ一ペプチド部分のアミノ酸配列
(GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly) , システィン （Cys) 及び中性付近で強く負に帯電し、 かつ 得られるタンパク質の等電点を酸性にするためのァミノ酸配列
(Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp) を順次付加したタンパク質 （配列番号 2 ) であり、 固 定化されるタンパク質は、 緑色蛍光タンパク質にリンカ一ペプチドが付加されたタンパク 質である。 なお、 本発明において固定化されるタンパク質が、 タンパク質の種類に依存し ないことは、 既に明らかにされている （特願 2003-344396号公報、 特許第 3047020号公報
〔実施例 1〕
〔ポリァリルァミン結合セファロースの作製〕
5gの CNBr活性化セファロースを、 20mlの ImMの塩酸に懸濁し、 30分間膨潤後、 50ml の ImMの塩酸で洗浄した。 不溶性部分を集め、 20mlの 0.1% L型ポリアリルアミン溶液に 懸濁し、 緩やかに 12時間混合し、 結合反応を行わせた。 その後、 不溶性部分を 20mlの 1M のモノエタノールァミン溶液に懸濁し、 4時間、 室温で穩やかに攪拌することにより、 未 反応の担体上の活性基をマスクした。 さらに、 20mlの IM NaClを含む 50mMグリシン/ HC1 緩衝液 (pH3.5) での洗浄と 20mlの IM NaClを含む 50mMトリス/ HC1緩衝液 (pH8.0) で の洗浄を交互に 8回行い、 得られた不溶性部分を集め、 以降のタンパク質の固定化に用い た。
このようにして得られたポリアリルアミン結合セファロ一スの導入された一級アミンの 含量を 1、リニトロベンゼンスルホン酸（TNBS; 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid)を用い た着色反応 （参考文献： Robert Fields, Methods in Enzymology,25, p464-468(l97l) ) で調べたところ、 一級ァミンを含む担体として市販されているアミノーセル口ファイン (生化学工業で販売）、 AF-ァミノトヨパール (TOSOHで販売）、 EAH-セファローズ 4 B 及びリジン-セファロ一ズ 4 B (アマシャムフアルマシアで販売）、 ァフィゲル 102 (バイ ォラッドで販売）、 ポラス 2 0 NH (ベ一リンガーマンハイムで販売) と比較して明らかに 強い着色反応を示し、 高い一級アミン含量をしめした。
〔タンパク質の調製〕
緑色蛍光タンパク質 （配列番号 1) のカルポキシ末端側の 8個のアミノ酸配列と
'酸配列と を結合したアミノ酸配列をコードする DNA配列を化学合成し、 これと、 緑色蛍光タンパク 質のアミノ末端側の 8個のアミノ酸配列部をコードする DNA配列を化学合成したものを、 それぞれをプライマ一 DNAとして PCR反応を行うことで、 リンカ一ペプチドが付加され た固定化用緑色蛍光タンパク質 （配列番号 2 ) に対応するアミノ酸配列をコードする遺伝 子 D N Aを調製し、 発現べクタ一 pUC18の EcoHIと Hindlll部位に組み込み、 組み換えプ ラスミドを調製した。 これを大腸菌株 JM109株に導入し、 発現させた後、 以下に述べる様 にして分離精製した。
なお、 緑色蛍光タンパク質 （配列番号 1) をコードする遗伝子は、 QUANTUM社より市 販されているものを購入し用いたが、 遺伝子の入手方法により本発明は限定されない。 上記固定化用緑色蛍光タンパク質を発現する組み換え大腸菌を、 2リツ夕一の培地 （20g の塩化ナトリウム、 20gの酵母エキス、 32gのトリプトン、 lOOmgのアンピシリンナトリウ ムを含んでいる） で、 37°Cで一晩培養した後、 培養液を 20分間低速遠心 （毎分 5000回転） することにより、 湿重量約 5gの菌体を得た。 これを、 40mlの ImMのエチレンジァミン 4酢 酸 (EDTA)を含む 10mM燐酸緩衝液 (pH7.0) (緩衝液 1 ) に懸濁し、 フレンチプレスに 菌体を破砕した後、 20分間遠心分離し （毎分 20,000回転)、 上清を分離した。 得られた上 清に、 最終濃度が 2%になるようにストレプトマイシン硫酸を加え、 4 °Cで 2 0分間撹拌後、 20分間遠心分離し （毎分 20,000回転)、 上清を分離した。 得られた上清に、 最終濃度が 40%になるよう硫酸アンモニゥムを加え、 41：で 2 0分間撹拌後、 20分間遠心分離し （毎 分 20,000回転)、 上清を分離した。 得られた上清に、 最終濃度が 90%になるよう硫酸アンモ 二ゥムを加え、 4 °Cで 30分間撹拌後、 20分間遠心分離し （毎分 20,000回転）、 沈殿を分離 した。 沈殿を 40mlの緩衝液 1に溶解し、 41の緩衝液 1に対して、 3回透析した。
透析した夕ンパク質溶液を、あらかじめ 50mMの KC1を含む緩衝液 1で平衡化した DEAE トヨパール (柬ソ一株式会社より購入) のカラム（200ml)にアプライし 500mlの 50mM の KC1を含む緩衝液 1を流した後、 緩衝液 1を用いて、 50mMから 500mMの KC1濃度勾配 をかけることにより、 タンパク質を溶出させ、 上記固定化用緑色蛍光タンパク質を含む画 分を分離した。 分離した画分を、 緩衝液 1に対して透析した後、 あらかじめ 50mMの KC1 を含む緩衝液 1で平衡化した SuperQトヨパール （東ソ一株式会社より購入） のカラム (200ml)にアプライし、 500mlの 50mMの KC1を含む緩衝液 1を流した後、 緩衝液 1を用い て、 50mMから 500mMの KC1濃度勾配をかけることにより、 タンパク質を溶出させ、 上記 固定化用緑色蛍光タンパク質を含む画分を分離した。 この段階で、 タンパク質は均一化で き、 約 lOOmgの均一な、 上記固定化用緑色蛍光タンパク質が得られた。
得られたタンパク質を、 緩衝液 1に対して保存し、 透析済みサンプルを 4 °Cで保存し、 以後の実験に用いた。 上記固定化用緑色蛍光タンパク質の濃度は、 配列番号 1で示される 緑色蛍光タンパク質の分子吸光係数 =22，000を用いて、 280nmの吸光度より決定した。
〔タンパク質の固定化〕
上記工程で得た上記固定化用緑色蛍光タンパク質 （配列番号 2) を、 あらかじめ 1000倍 量の 5mMのェチレンジアミン 4酢酸 (EDTA)を含む 10mM燐酸緩衝液 (ρΗ7.θ) (緩衝液 2) に対して 3回以上透析を行った。 透析済みタンパク質を、 緩衝液 2で希釈することにより、 各種濃度の上記固定化用緑色蛍光夕ンパク質溶液を調製した。
10 lのポリアリルァミン結合セファ口一スと 990 lの上記固定化用録色蛍光夕ンパク 質を混合し、 2時間以上室温で穏やかに攬拌混合した後、 1000回転で数秒間遠心し、 不溶 性部分を集めた。 ほとんどすべての蛍光物が不溶性部分 （すなわち、 ポリアリルアミン結 合セファロ一ス） に移行し、 上記固定化用緑色蛍光タンパク質がポリアリルアミン結合セ ファロースに吸着することが明らかとなった （この段階のサンプルを、 吸着サンプルとい 。）
着色した不溶性部分を、 5mMの 2-二ト口- 5-チオシァノ安息香酸 (NTCB)を含む緩衝液 2 に懸濁し、 穏やかに攪拌混合しながら室温で 4時間シァノ化反応を行わせた。 その後、 1ml の緩衝液 2で 5回洗浄した。 得られた不溶性部分を lmlの、 5mMの EDTAを含む 10mM硼 酸緩衝液 (pH9.5)に懸濁し、 穏やかに攪拌混合しながら室温で 24時間固定化反応を行つた。 不溶性部分を、 lmlの 1MKCLを含む 10mM燐酸緩衝液 (pH7.0)で 5回洗浄し、 未反応物及 ぴ固定化反応の副反応生成物を除去した。
ポリアリルアミン結合セファロ一スに固定化した緑色蛍光タンパク質の固定化量は、 可 視部での蛍光を測定することにより求めた。
分光蛍光光度計 (FP-750； JASCO) を用いて、 上記固定化反応で得られた不溶性部分 を 3mlの緩衝液 2で懸濁し 485nm〜600nmまでの蛍光スぺクトルを 25°Cで測定した。 参照 実験として、 lO lのポリァリルァミン結合セファロースに lOnmolesの上記固定化用緑色 蛍光タンパク質を吸着させて得られる不溶性部分を 3mlの緩衝液 2で懸濁した蛍光スぺクト ルを 25°Cで測定した (参照スぺクトル)。 いずれの蛍光スペクトルも 511nmに最大蛍光強 度を示した。 蛍光の測定を全く同一で行うことにより 511nmの蛍光強度を用いて、 固定化 された緑色蛍光タンパク質の質量を求めた。
また、 比較のために、 他の担体としてァミノセル口ファイン、 ァミノトヨパール、 アミ ノセファロ一スを用い、 同様な実験を行った。
得られた結果を図 1に示した。 図 1は、 担体 lmlを用いたとした場合の、 固定化反応に 用いたタンパク質量 （投入タンパク質量） と固定化されたタンパク質量との関係を示す図 である。 図中、 誊は本発明のポリアリルアミン結合セファロ一ス、 〇はアミノセファロ一 ス （市販)、 ▲はァミノセル口ファイン （市販)、 △はァミノトヨパール (市販） を示す。 図で示されるように、 担体 lml当たりの最大固定化量は、 アミノトョパールで約 O moles ァミノセル口フアイン及びァミノセファロースでは約 0.4 II molesであり、 本発明のポリア リルアミン結合セファロースが示す最大固定化量約 1 i molesであり、 従来の担体を用いる 場合の 2から 3倍のタンパク質を固定化できる。 また、 本発明に用いられるシァノシステ インを介した固定化方法は、 タンパク質を配向制御しながら固定化する方法でもある。 こ のように、 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物を不溶性担体として利用 すること有利性が明らかである。 従って、 本発明が目指す、 配向制御しながら且つ高密度 なタンパク質が達成されたものと考えられる。
産業上の利用可能性 以上説明したように、 本発明によれば、 従来法に比べ、 タンパク質を配向制御しながら 極めて高密度で担体に固定化することができる。 また、 一級アミノ基を有するポリマ一化 合物を導入するために利用できる不溶性担体としては、 特に制限が無く、 一級アミノ基を 有するポリマー化合物に対する化学結合形成能力を創成できるものであればどのようなも のでもよく、 固定化されるタンパク質に制限は全くない。
したがって、 本発明は、 酵素利用分野、 抗原 抗体、 生体内生理活性物質、 酵素等を使 用して診断等を行う医療分野、 あるいはこれら物質の特異的親和性を利用した分離精製分 野等、 極めて幅広い分野に適用できる有用な手段を提供するものである。

Claims

請求の範囲
1 . 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物を介して、 担体に一般式 (I)
Figure imgf000014_0001
[上記式中、 I ま任意のアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質を固定し、 固定化タンパク質を製造する方法であって、 担体に結合 した該ポリマ一化合物の一級アミノ基に、 一般式 （I) で示されるタンパク質主鎖のカル ポキシ末端をべプチド結合により固定化することを特徴とする、 固定化タンパク質の製造 方法。
2 . 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物がポリァリルァミンであるこ とを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の固定化夕ンパク質の製造方法。
3 . 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物がポリリジンであることを特 徵とする請求の範囲第 1項に記載の固定化夕ンパク質の製造方法。
4 . 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を介して、 担体に一般式
(I) ,
Figure imgf000014_0002
[上記式中、 は任意のアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質を固定化し、 固定化タンパク質を製造する方法であって、 担体に結 合させた該ポリマ一化合物と、 一般式 (II)
NH2-RrCONH-CH (CH -SCN) -CO-NH-R2 -COOH · · · (II)
[上記式中、 I ま任意のアミノ酸配列を、 R2は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式
(II) の化合物の等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質とを反応させることにより、 該ポリマー化合物の一級アミノ基に、 一般式 (I) で示されるタンパク質主鎖のカルボキシ末端をペプチド結合により結合させ ることを特徴とする、 固定化タンパク質の製造方法。
5 . 一般式 (II) の化合物が、 一般式 (III)
NHs-RrCONH-CH (CH2-SH) -CO-NH-R3-COOH - · - (III)
[上記式中、 R,、 ま、 上記一般式 (II) と同じ意味を表す。〕
で示される化合物にシァノ化試薬を作用させることにより形成されたものである請求の範 囲第 4項に記載の製造方法。
6 . 一般式 （I) で示されるタンパク質が、 さらにリンカ一ペプチドのアミノ酸配列を 有する、 請求の範囲第 1〜 4のいずれかに記載の固定化タンパク質の製造方法
7 . 一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマ一化合物を介して、 担体に一般式 ( 1 )
NHs-RrCOOH · · · (I)
[上記式中、 は任意のアミノ酸配列を表す。 ]
で示されるタンパク質を固定した固定化夕ンパク質であって、 担体に結合した該ポリマー 化合物の一級アミノ基に、 一般式 （I) で示されるタンパク質主鎖のカルポキシ末端がぺ プチド結合により固定化されていることを特徴とする、 固定化タンパク質。
8 . 一般式 （I) で示されるタンパク質が、 さらにリンカ一ペプチドのアミノ酸配列を 有する、 請求の範囲第 5項に記載の固定化タンパク質。
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