CN109071680A - 抗体结合纳米原纤维 - Google Patents

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Abstract

本发明实施方案涉及抗体结合纳米原纤维，其能够通过以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体‑Z融合蛋白的共原纤化获得。所述抗体结合纳米原纤维具有极高的抗体结合能力，因此能够用于各种应用，例如抗体纯化以及在护理点或实验室诊断应用中检测生物标记。

Description

抗体结合纳米原纤维
技术领域
本发明的实施方案一般涉及纳米原纤维，尤其涉及抗体结合纳米原纤维。
背景技术
材料特性在亚微米尺度上大幅改变的认识引发了纳米技术的出现。例如，直径小于100nm的纤维或原纤维在其表面积与体积比、各种功能和机械特性方面优于其宏观对应物。纳米原纤维可以从多种材料合成，例如碳、丙烯腈、硅，或从生物来源的分子合成，例如纤维素、几丁质和蛋白质。
蛋白质组装(原纤化)到良好有序的纳米原纤维或纳米纤维中的性质非常复杂。因此，已经进行了大量努力来阐明原纤化动力学的细节并理解纳米原纤维的分子结构。这些研究旨在深入了解生命科学的必要方面，涵盖功能性聚集体和淀粉样蛋白病传播的建立。成熟的原纤维具有交叉β型结构，其极其坚硬并且表现出非凡的物理和化学稳定性。这一事实使得交叉β-原纤维成为探索各种生物技术应用的目标。在这种情况下，另一个有用的特性是蛋白质重折叠和纳米原纤维组装是自我扩展的(self-propagating)，这消除了对聚集、有时表示聚合的连续控制的需要。此外，由于蛋白质工程在遗传水平上实施，因此可以根据纳米原纤维材料的预期目的调整原纤化肽。
对用于诊断目的和医学治疗的抗体的需求日益增长，需要经济有效的纯化方法。通常，通过基于交联琼脂糖珠的基质的亲和色谱法纯化抗体，所述琼脂糖珠覆盖有蛋白A，例如蛋白ACL4B(GE Healthcare)。尽管蛋白A是抗体纯化的主力，但是与培养基的高成本相关的20-50mg/ml的免疫球蛋白G(IgG)结合能力是纯化速率限制因子。该纯化方案所带来的限制促进了基于IgG精确生化特征的替代色谱方法的发展，以避免必须使用蛋白A。另一种旨在提高结合能力的方法是改变用于蛋白A展示的基质。例如，证明聚酯珠PolyBind-ZTM(PolyBatics Ltd.)产生100mg/g排出培养基的结合容量。
使用来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的接种诱导的自组装Sup35蛋白产生双功能蛋白纳米原纤维，所述蛋白与蛋白G或甲基对硫磷水解酶(MPH)基因融合[1]。蛋白G能够与IgG分子结合并用于将纳米原纤维锚定在平板上，所述平板具有固定化抗原，IgG分子对所述固定化抗原具有特异性。与常规酶联免疫吸附测定(ELISA)相比，当用于检测鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)F1抗原时，该免疫测定导致灵敏度提高100倍。
使用Sup35蛋白和人La蛋白生产蛋白质纳米原纤维[26]。这些蛋白质纳米原纤维用于通过与人La蛋白的片段(a.a.179-364)结合来检测抗SSB/La抗体。因此，蛋白质纳米原纤维可用于检测舍格伦综合征的标记。
然而，需要一种对抗体具有高结合能力并且能够用于捕获和/或纯化抗体的技术。
发明内容
目的是提供抗体结合纳米原纤维。
特别目的是提供具有改善的抗体结合能力的这种纳米原纤维。
这些和其他目的通过本文中公开的实施方案得到满足。
实施方案的方面涉及一种抗体结合纳米原纤维，其能够通过以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白的共原纤化获得。
实施方案的另一方面涉及用于检测样品中化学物质的存在的试剂盒。该试剂盒包含根据上述的抗体结合纳米原纤维和特异性结合样品中的化学物质的抗体。抗体结合纳米原纤维的载体-Z融合蛋白能够结合抗体。
实施方案的进一步的方面涉及抗体捕获装置，其包含固定在固体表面上的根据上述的抗体结合纳米原纤维。
实施方案的又一方面涉及产生抗体结合纳米原纤维的方法。该方法包括以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白的共原纤化以形成抗体结合纳米原纤维。
实施方案的抗体结合纳米原纤维具有改善的抗体结合能力。这种改进的抗体结合能力几乎是目前是抗体纯化金标准的蛋白A亲和介质的20倍。
附图说明
通过参考以下描述并结合附图，可以最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：
图1示意性地表示实施例中使用的非功能性和功能性Sup35和Ure2蛋白质构建体。缩写TS指凝血酶切割位点。
图2显示了人IgG与固定的Sup35(1-61)-ZZ(A,E)、ZZ-Ure2(1-80)(B)、Sup35(1-61)-ZZ原纤维(C)、ZZ-Ure2(1-80)原纤维(D)或Z(F)的相互作用的Biacore传感图。通过His6-标签将蛋白质和原纤维固定在NTA芯片上。(A)配体:Sup35(1-61)-ZZ,分析物:人IgG5-40nM(Thermo Scientific)；(B)配体:ZZ-Ure2(1-80),分析物:人IgG 5-40nM；(C)配体:Sup35(1-61)-ZZ原纤维(功能性与非功能性蛋白质的摩尔比为1:0.04),分析物:人IgG 5-40nM；(D)配体:ZZ-Ure2(1-80)原纤维(非功能性与功能性蛋白质的摩尔比为1:0.04),分析物:人IgG 5-40nM；(E)配体:Sup35(1-61)-ZZ,分析物:人IgG 5-40nM(实验室纯化的)；(F)配体:Z,分析物:人IgG 5-40nM。原始数据由从低(实心填充)到高(无填充)浓度的点表示。将数据拟合至1:1结合模型(A、B、E、F)或由实线表示的二价分析物模型(C、D)。
图3显示了使用显示功能结构域ZZ的Sup35(1-60)(A)或Ure2(1-80)(B)纳米原纤维从人血清中纯化IgG。(A)观察到50kDa的人IgG的重链、25kDa的轻链、22kDa的Sup35(1-61)-ZZ和14kDa的Sup35(1-61)。泳道1.人血清；2.离心并与原纤维孵育后的上清液；3.洗涤液；4.洗脱后剩余的不溶物质；5.洗脱液；6.凝胶过滤后洗脱液；7.-11.人IgG 0.0625-1mg/ml(Thermo Scientific)；12.Precision Plus蛋白质未染色标准品(Biorad)。(B)观察到50kDa的人IgG的重链、25kDa的轻链、25kDa的ZZ-Ure2(1-80)和18kDa的Ure2(1-80)。泳道1.人血清；2.离心并与原纤维孵育后的上清液；3.洗涤液；4.洗脱后剩余的不溶物质；5.洗脱液；6.凝胶过滤后洗脱液；7.-10.人IgG0.125-1mg/ml(Thermo Scientific)；11.PrecisionPlus蛋白质未染色标准品(Biorad)。
图4说明了抗体结合原纤维的透射电子显微镜(TEM)图像，其中非功能蛋白与功能蛋白的比例为1:0.16。原纤维用人IgG饱和并用金缀合的二抗标记。图像的指示部分被放大12.5-25倍。黑点代表5nm金颗粒。
图5示意性地说明了共原纤维组合物，即原纤维掺杂频率对IgG结合参数的影响。研究了几种原纤维类型，就非功能性对功能性蛋白质的摩尔比而言覆盖1:0.04-0.65(Sup35共原纤维，A，C，E)或1:0.04-0.9(Ure2共原纤维，B，D，F)。融合蛋白相对于支架蛋白的摩尔频率在x轴上称为“掺杂频率”。(A，B)共原纤维随掺杂频率的变化的IgG结合能力。每mg原纤维的局部最大值为1.8mg(Sup35)和1.7mg(Ure2)IgG，摩尔比分别为1:0.33和1:0.49。(C，D)结合一个抗体分子所需的蛋白质数量。(E，F)如果不考虑具有最低掺杂频率即0.04和0.08的原纤维，则实验测定的IgG结合能力除以理论最大结合能力显示线性降低。所有数据点代表六次独立测量的平均值。
图6是说明了根据一个实施方案的制备抗体结合纳米原纤维的方法的流程图。
具体实施方式
本发明的实施方案一般涉及纳米原纤维(nanofibril)，在本领域中也称为纳米纤维(nanofiber)。特别地，实施方案涉及能够结合抗体的新型纳米原纤维，即抗体结合纳米原纤维。
实施方案的抗体结合纳米原纤维通过两种蛋白质或肽种类、所谓的载体蛋白质或肽和官能化载体蛋白质或肽的共原纤化(即组装)获得。载体蛋白质是可溶性蛋白质单体，其在分子自组装过程中聚集成低聚物并进一步聚集成原纤维和纤维。这意味着载体蛋白自发地或诱导地聚集并组装成更长的结构，从载体蛋白单体开始并生长成低聚物并进一步生成原纤维。原纤维通常具有纳米范围的直径，因此在本文中表示为纳米原纤维。纳米原纤维的典型核心直径在3至20nm之间，尤其取决于特定载体蛋白质和官能化载体蛋白质中的官能团。在原纤化过程中，纳米原纤维可以生长成长度为一微米或几微米的相当长的原纤维。由于微小直径但相对大的纳米纤维长度，纳米原纤维具有优异的表面积与体积比。
两种蛋白质种类即载体蛋白质和官能化载体蛋白质的共原纤化意味着所得的纳米原纤维包含官能化基团，即抗体结合基团或结构域。
通过自组装与蛋白G遗传融合的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sup35蛋白和与MPH遗传融合的Sup35蛋白获得的双功能纳米原纤维是本领域已知的[1]。纳米原纤维的蛋白质G基团与IgG分子结合并用于将纳米原纤维锚定在平板上，所述平板具有固定化抗原，IgG分子对所述固定化抗原具有特异性。通过与人La蛋白片段遗传融合的Sup35蛋白获得抗体结合纳米原纤维[26]。然而，没有针对纳米原纤维的抗体结合能力优化具有如[1,26]中举例说明的抗体结合能力的现有技术纳米原纤维。
本发明的实施方案涉及具有增强的抗体结合能力的抗体结合纳米原纤维。通过使用载体蛋白和功能化载体蛋白之间的选定摩尔比区间来实现这种改善的抗体结合能力。如本文所示的实验数据显示，只有对于通过载体蛋白和本发明的摩尔比区间内的官能化载体蛋白的共原纤化可获得的纳米原纤维以实现抗体结合能力方面的改善。
因此，如果在共同原纤化过程期间功能化载体蛋白的量相对于非功能性载体蛋白的量而言太低，则所得抗体结合纳米原纤维将具有低数量的抗体结合结构域，因此远不具备最大抗体约束力。然而，如果相对于非功能性载体蛋白的量的官能化载体蛋白的量增加超过本发明的摩尔范围区间的上限，则所得纳米原纤维的抗体结合能力下降。如具有更多官能化结构域的纳米原纤维所见，抗体结合能力的这种意外降低可能是由于纳米原纤维内的空间限制导致的功能化结构域的可及性降低。鉴于现有技术的抗体结合纳米原纤维[1,26]，这一发现是非常令人惊讶的，其中每种载体蛋白被功能化，即具有酶促结构域(MPH)或抗体结合结构域(蛋白G或人La蛋白)。
因此，如果载体蛋白和官能化载体蛋白的摩尔比低于本发明的区间，则纳米原纤维将呈现很少的抗体结合结构域，从而与实施方案的抗体结合纳米原纤维相比具有低得多的抗体结合能力。相应地，如果摩尔比反而高于本发明的区间，则纳米原纤维将呈现许多抗体结合结构域。然而，由于空间限制，与实施方案的抗体结合纳米原纤维相比，实际可接近并且可以结合抗体的抗体结合结构域的数量将更低。
实施方案的方面涉及抗体结合纳米原纤维即纳米纤维，其能够通过以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白的共原纤化获得。
因此，抗体结合纳米纤维可通过载体蛋白和功能化载体蛋白(即具有抗体结合能力的载体-Z融合蛋白)的共原纤化即共组装或共聚集而获得。共原纤化意味着两种不同种类的单体将聚集成并形成原纤维结构，通常具有纳米范围内的直径和微米范围内的典型长度。所选择的实施方案的单体物质的摩尔比导致形成具有高抗体结合能力的纳米原纤维，其具有足够大的Z结构域即抗体结合结构域的浓度，但不具有太大浓度的这种Z结构域，以降低Z结构域对抗体的可接近性。
由此，实施方案的抗体结合纳米原纤维包含以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白。
在实施方案中，抗体结合纳米原纤维的抗体结合结构域，即Z结构域，优选分布在抗体结合纳米原纤维的整个长度上。因此，在优选的实施方案中，Z结构域不是存在于抗体结合纳米原纤维的一部分中，而是在抗体结合纳米原纤维的整个长度或至少其主要部分中分布，例如均匀分布。
本文所用的载体-Z融合蛋白表示载体蛋白单体或结构域即原纤化结构域与至少一个Z结构域即抗体结合结构域融合，形成融合蛋白。结构域的融合优选在基因水平上进行，即通过将编码载体蛋白的核苷酸序列与编码至少一个Z结构域的核苷酸序列组合或融合。核苷酸序列的融合产生编码载体-Z融合蛋白的基因。
目前优选的获得载体-Z融合蛋白的方法是在宿主细胞中产生载体-Z融合蛋白，所述宿主细胞包含表达盒，例如质粒，其包含在组成型或诱导型启动子转录控制下的编码载体-Z融合蛋白的基因，或包含在宿主细胞基因组中的启动子的转录控制下的编码载体-Z融合蛋白的基因。然而，实施方案不限于此。产生载体-Z融合蛋白的替代方法是可能的，例如化学连接单独产生的载体蛋白和Z结构域。
在实施方案中，载体蛋白的N末端或C末端可以直接连接至载体-Z融合蛋白中的至少一个Z结构域的C末端或N末端。或者，载体蛋白和至少一个Z结构域可以通过桥或接头互连。这种接头可以是N个氨基酸的短肽形式。在实施方案中，N优选在3至15、优选3至12、更优选3至7、例如约5的区间内选择。在实施方案中，接头的氨基酸优选选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)和其组合。这种基序的实例是A(EAAAK)nA(SEQ ID NO:1)，其中n优选为2-5，更优选为2-3。这种基序将螺旋引入接头。其他螺旋形成基序可用于接头。可以根据实施方案使用的其他接头在[2]中的表3中公开，其中关于可以根据实施方案使用的表3中的接头基序的教导在此引入作为参考。
在实施方案中，载体蛋白和载体-Z融合蛋白之间的摩尔比优选在1:0.30至1:0.90的区间内，更优选在1:0.30至1:0.70的区间内。特别优选的区间为1:0.30至1:0.50，参见表2和3以及图5A和5B。
与前述较宽的区间相比，这些优选的和更有限的摩尔比间隔导致纳米原纤维具有甚至更高的抗体结合能力。
在实施方案中，载体蛋白是Sup35载体蛋白，并且载体-Z融合蛋白是Sup35-Z融合蛋白。在实施方案中，Sup35载体蛋白包含酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的完整氨基酸序列，即685个氨基酸。然而，通常优选仅使用氨基酸序列的一部分，然后使用氨基酸序列的原纤化部分。该原纤化部分构成Sup35蛋白的N末端片段。简而言之，Sup35蛋白由三个结构域组成，即原纤化的N末端(其对应于氨基酸1至123)、中间结构域(M-结构域)(其提供对Sup35蛋白的溶解性)以及对于Sup35蛋白的天然功能至关重要的C末端或结构域。因此，在实施方案中，Sup35载体蛋白是酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的N-末端片段，或者尽管通常不太优选，但是酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的N+M-结构域或结构域片段。然后，Sup35-Z融合蛋白是酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的N末端片段和至少一个Z结构域的融合蛋白。
因此，N末端片段构成Sup35蛋白的完整氨基酸序列的一部分。在具体实施方案中，N末端片段由酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的编号1至61的氨基酸组成，在本文中表示为Sup35(1-61)。在另一实施方案中，N末端片段由酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的编号1至47的氨基酸组成。在进一步的实施方案中，N末端片段由酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的编号1至57的氨基酸组成。
Sup35的这些N末端片段在聚集过程中采用β片层构象，并且可以在原纤化过程中自组装成高度有序的交叉β结构的纳米原纤维[3,4]。
可通过共原纤化获得的抗原结合纳米原纤维，优选包含Sup35(1-61)蛋白，Sup35(1-61)-Z融合蛋白优选具有在1:0.30至1:40的区间内的Sup35(1-61)蛋白和Sup35(1-61)-Z融合蛋白的摩尔比。摩尔比更优选在1:0.30至1:0.35的区间内，例如优选等于约1:0.33。
表2和图5A中所示的实验数据表明，就使用Sup35、特别是Sup35(1-61)作为载体蛋白而言，上述摩尔比的区间或值是优选的。
Sup35(1-61)-Z融合蛋白优选从其N末端到其C末端包含Sup35(1-61)蛋白接着至少一个Z结构域。在另一实施方案中，切换Sup35(1-61)蛋白和至少一个Z结构域的顺序。可选的桥或接头可以存在于Sup35(1-61)-Z融合蛋白中，其将Sup35(1-61)结构域和至少一个Z结构域互连。
在另一实施方案中，载体蛋白是Ure2载体蛋白，并且载体-Z融合蛋白是Z-Sup35融合蛋白。在实施方案中，Ure2载体蛋白包含酿酒酵母脲基琥珀酸转运蛋白的完整氨基酸序列，即354个氨基酸。然而，通常优选仅使用氨基酸序列的一部分，然后使用氨基酸序列的原纤化部分。该原纤化部分构成脲基琥珀酸转运蛋白蛋白的N末端片段。因此，在实施方案中，Ure2载体蛋白是酿酒酵母真核脲基琥珀酸转运蛋白的N末端片段。然后，Z-Ure2融合蛋白是酿酒酵母真核脲基琥珀酸转运蛋白的N末端片段和至少一个Z结构域的融合蛋白。
因此，N末端片段构成Ure2蛋白的完整氨基酸序列的一部分。在具体实施方案中，N末端片段由酿酒酵母脲基琥珀酸转运蛋白的编号1至80的氨基酸组成，在本文中表示为Ure2(1-80)。其他具体实施方案涉及使用酿酒酵母脲基琥珀酸盐转运Ure2的编号为1至93、1至65、1至89和10至39的氨基酸组成的N末端片段。
这些Ure2的N末端片段可以在原纤化过程中自组装成高度有序的交叉β结构纳米原纤维[5]。
可通过共原纤化获得的抗原结合纳米原纤维，优选包含Ure2(1-80)蛋白，Z-Ure2(1-80)融合蛋白优选具有在1:0.45至1:55的区间内的Ure2(1-80)蛋白和Z-Ure2(1-80)融合蛋白的摩尔比。摩尔比更优选在1:0.47至1:0.51的区间内，例如优选等于约1:0.49。
表3和图5B中所示的实验数据表明，就使用Ure2、特别是Ure2(1-80)作为载体蛋白而言，上述摩尔比的区间或值是优选的。
Z-Ure2(1-80)融合蛋白优选从其N末端向其C末端包含至少一个Z结构域接着Ure2(1-80)蛋白。在另一实施方案中，切换Ure2(1-80)蛋白和至少一个Z结构域的顺序。可选的桥或接头可以存在于Z-Ure2(1-80)融合蛋白中，其将Ure2(1-80)结构域和至少一个Z结构域互连。
通常，实施方案可以使用融合蛋白内的载体蛋白和至少一个Z结构域的任何顺序，即，载体蛋白，接着是从N末端到C末端，至少一个Z结构域或者至少一个Z结构域接着载体蛋白。
Sup35和Ure2是抗体结合纳米原纤维的优选载体蛋白。然而，实施方案不限于此。这意味着根据实施方案也可以使用能够进行分子自组装(MSA)的其他蛋白质或蛋白质片段，并用至少一个Z结构域功能化。可根据实施方案使用的此类其他载体蛋白的非限制性但示例性实例包括串联重复SH3结构域[6]、B16[7]、牛乳清蛋白[8]、b-尾肽[9]、α-突触核蛋白[10]、CsgA[11]和Rnq1[12]。
在实施方案中，载体-Z融合蛋白例如Sup35(1-61)-Z融合蛋白或Z-Ure2(1-80)融合蛋白，优选是载体蛋白(例如Sup35(1-61)或Ure2(1-80))和蛋白A的免疫球蛋白G(IgG)结合结构域(在本文中表示为Z结构域)的融合蛋白。
蛋白A是最初在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的42kDa表面蛋白。它由spa基因编码。由于其结合免疫球蛋白的能力，它已被用于生物化学研究。它由折叠成三螺旋束的五个同源的Ig结合结构域组成。每个结构域能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白质，最值得注意的是IgG。在人VH3家族的情况下，它结合大多数免疫球蛋白的Fc区内的重链以及Fab区内的重链。
在实施方案中，融合蛋白的Z结构域可以是蛋白A的任何天然或野生型IgG结合结构域，或蛋白A的这种IgG结合结构域的重组形式。例如，Z结构域可以是蛋白A的8kDa工程改造的B结构域变体[13]。该IgG结合结构域目前用作支架以产生分子，并且以低nM范围内的解离常数(KD)固有地结合IgG的Fc部分。可根据实施方案使用的Z结构域的另一个实例是MabSelectTM中使用的IgG结合结构域。该IgG结合结构域构成在大肠杆菌中产生的重组蛋白A中的Z结构域，并且特异性地工程改造以有利于定向偶联，其提供增强的IgG结合能力。
可根据实施方案使用的IgG结合结构域的其他实例包括蛋白G[14],蛋白A/G[15],蛋白M[16],蛋白L[17],SpA和Sbi[18]和蛋白H[19]。
在具体实施方案中，载体-Z融合蛋白是载体-Z二聚体融合蛋白。因此，在该实施方案中，载体-Z融合蛋白优选包含两个Z结构域，即Z二聚体(ZZ)。因此，优选的载体-Z融合蛋白包括Sup35(1-61)-ZZ和ZZ-Ure2(1-80)。
二价Z，即Z二聚体(ZZ)，通常优于单价Z结构域，因为它对IgG具有更高的亲和力，最可能是由于亲合力效应。ZZ与IgG的结合速率更快并且IgG的释放更慢，参见图2和表1，这对于依赖于完全占据官能团和减少泄漏的应用是潜在有利的。
Z二聚体优选为两个相互连接的Z结构域的形式，即ZZ。在替代实施方案中，Z二聚体是通过桥或接头互连的两个Z结构域的形式。例如，两个Z结构域可以通过结构域间螺旋片段(ZhZ)或通过柔性接头(ZfZ)互连。这种结构域域间螺旋片段的实例是A(EAAAK)nA(SEQID NO:1)，n优选为2-5。柔性接头可以是M个氨基酸的肽形式。在实施方案中，M优选在10至60、优选15至50、更优选20至45的区间内选择。在实施方案中，接头的氨基酸优选选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)，和其组合。可以根据实施方案使用的其他接头在[2]中的表3中公开，其中关于可以根据实施方案使用的表3中的接头基序的教导在此引入作为参考。
可以使用接头赋予将IgG的Fc片段的两侧与Z二聚体结合的能力，然后这将增加亲和力。每个Fc片段具有间隔的两个Z结合位点。如果Z二聚体中的两个Z结构域在没有接头的情况下相互连接，那么只有一个位点可以访问。因此，考虑到接头未完全延伸，接头优选至少能够跨越的距离。通常，每个氨基酸给出因此在接头中优选使用至少25个氨基酸。可根据实施方案使用的完全柔性接头的非限制性实例包括(GGGGS)5-7(SEQ IDNO:2)、(GGGGT)5-7(SEQ ID NO:3)、GSAGSAAGSGEF-GGGGS-GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:4)和GSAGSAAGSGEF-GGGGT-GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:5)。包含螺旋部分和柔性区段的接头或桥包括GGGGSGGGGS-A(EAAAK)2-3A-GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)、GGGGTGGGGT-A(EAAAK)2-3A-GGGGTGGGGT(SEQ ID NO:7)和GSAGSAAGSGEF-A(EAAAK)2-3A-GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:8)。
尽管可以将两个Z结构域与螺旋片段或接头互连，但实验数据表明，与由两个互连的Z结构域域即ZZ组成的Z二聚体相比，这样的Z二聚体即ZhZ和ZfZ对抗体和IgG没有任何增加的亲和力。
实施方案的抗体结合纳米原纤维能够以高亲和力和高容量结合抗体。抗体结合纳米原纤维优选能够结合IgG抗体。
在实施方案中，抗体结合纳米原纤维具有每mg纳米原纤维至少1.5mg IgG的结合能力。在优选的实施方案中，结合抗体的纳米纤维具有每mg纳米原纤维至少1.6mg IgG、更优选每mg纳米原纤维至少1.7mg IgG、例如每mg纳米原纤维至少1.8mg IgG的结合能力。
本文提供的实验数据显示，通过Ure2(1-80)和ZZ-Ure2(1-80)的共原纤化制备的纳米原纤维可以实现每mg纳米原纤维约1.7mg IgG的结合能力，而通过Sup35(1-61)和Sup35(1-61)-ZZ的共原纤化制备的纳米原纤维可以实现每mg纳米原纤维约1.8mg IgG的结合能力。即使没有任何优化结合IgG分子与抗体结合纳米原纤维的Z结构域时使用的结合条件，也已经实现了这些结合能力。
然而，即使在这些非优化的结合条件下，与蛋白A亲和介质(例如蛋白ACL4B(GE Healthcare)，其为如今抗体纯化金标准)相比，实施方案的抗体结合纳米原纤维具有几乎20倍的结合能力。
实施方案的另一个方面涉及根据实施方案的抗体结合纳米原纤维，其包含至少一种结合至抗体结合纳米原纤维的载体-Z融合蛋白的至少一个Z结构域的抗体。在实施方案中，至少一种抗体是至少一种IgG分子。
图6是说明根据实施方案制备抗体结合纳米原纤维的方法的流程图。该方法在步骤S2中包括以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白的共原纤化以形成抗体结合纳米原纤维。
在各种实施方案中，前述中提到的特定摩尔比区间、载体蛋白和Z结构域可用于图6的方法中。
在可选实施方案中，该方法还包括步骤S1。该步骤S1包括通过在水溶液中超声处理载体蛋白来产生种子。该方法然后继续进行步骤S2，在该实施方案中，其包括将种子与载体蛋白和载体-Z融合蛋白以摩尔比孵育以形成抗体结合纳米原纤维。
因此，在步骤S1中形成的种子充当种子，载体蛋白质的单体和载体-Z融合蛋白可以聚集以使抗体结合纳米原纤维生长。
含水原纤化缓冲液可以是任何含水缓冲溶液，其优选pH范围为pH7.0至约8.5，例如约7.0至约8.0。这种含水缓冲溶液的非限制性但示例性实例包括磷酸钾(KPi)缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
原纤化的优选条件包括但不限于0℃至42℃的区间内的温度，3至9的区间内的pH，0mM至200mM的盐浓度，0μM至150μM的洗涤剂浓度，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，0rpm至600rpm的恒定转速，数小时至数天的原纤化时间。这些条件的变化可能影响纤维形态和聚集的完整性。而且，原纤化动力学在很大程度上取决于载体蛋白的浓度。
本实施方案的抗体结合纳米原纤维包含在选定的摩尔比区间内的载体蛋白和载体-Z融合蛋白并由其制成。然后，抗体结合纳米原纤维的功能化结构域是具有抗体结合能力的Z结构域。但是，通过在共原纤化过程中包括其他载体-功能化结构域融合蛋白，也可以在抗体结合纳米原纤维中引入其他功能化结构域。此类其他功能化结构域的非限制性但示例性实例可以是酶、金属结合结构域、细胞色素p450等。然而，此类其他功能化结构域可能对抗体结合纳米原纤维的Z结构域的抗体的可及性具有负面影响。因此，至少在抗体纯化应用中，通常优选使用除Z结构域之外没有任何官能化结构域的抗体结合纳米原纤维。
对用作治疗剂和用于诊断目的的抗体\特别是单克隆抗体的需求稳步增长。因此，越来越需要具有成本效益的高负荷抗体纯化方法。目前的抗体纯化金标准是使用高选择性介质蛋白A然而，蛋白A的有限结合能力使IgG纯化的生产力受限。为了克服设定的边界，可以使用抗体结合纳米原纤维作为展示IgG结合Z-结构域二聚体的支架。由纳米原纤维提供的优异的表面积与体积比非常适合于这种抗体纯化应用。
因此，实施方案的抗体结合纳米原纤维可有利地用于抗体和单克隆抗体纯化应用中。
因此，实施方案的另一方面涉及一种抗体捕获装置，其包含固定在固体表面上的实施方案的抗体结合纳米原纤维。
根据各种实施方案，可以实现将抗体结合纳米原纤维固定在固体表面上。在实施方案中，至少一些载体蛋白、至少一些载体-Z融合蛋白或至少一些载体蛋白和载体-Z融合蛋白在载体蛋白和/或载体-Z融合蛋白的N末端和/或C末端包含His标签，例如Hisn标签。在具体实施方案中，n优选为至少5，更优选至少6，在本领域中通常表示为聚组氨酸标签。n的上限优选为14。例如，His6标签可以连接到Sup35(1-61)和Ure(1-80)载体蛋白的N末端，连接到Sup(1-35)-ZZ融合蛋白的N末端和/或ZZ-Ure2(1-80)融合蛋白的C末端，见图1。
这种His标签使得抗体结合蛋白能够固定在Ni2+或Co2+带电表面上。然后，表面可以是含有结合的二价或钴离子的亲和树脂的表面。这些树脂通常是用螯合剂官能化的或琼脂糖，例如用于镍的亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)和用于钴的羧基甲基天冬氨酸(CMA)。这种螯合剂官能化树脂的实例是HiTrap螯合HP柱(GEHealthcare)。可用于通过His标签与Ni2+或Co2+之间的相互作用固定抗体结合纳米原纤维的固体表面的其他实例是NTA、IDA或CMA芯片或珠。
除His标签–Ni2+/Co2+之外的其他固定化方案也是可能的。例如，生物素-链霉抗生物素蛋白或生物素-抗生物素蛋白可用于将抗体结合纳米原纤维固定在固体表面上。在这种方法中，至少一些载体蛋白的N或C末端和/或至少一些载体-Z融合蛋白直接或间接连接于生物素分子或链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白分子。在这种方法中，固体表面包含固定的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白分子或生物素分子。
此外，有许多方法将纳米原纤维共价偶联到固体表面[20,21]。例如，用作间隔臂的六亚甲基易与在俗名丙烯酸玻璃下的二胺聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的羰基反应更为人所知。然后可以使用碳二亚胺将天冬氨酸或谷氨酸的羧基共价连接到间隔臂上。另一种选择是固定在环氧树脂上。这是通过用氰尿酸活化树脂的羟基来实现的，氰尿酸又与由氨基酸例如赖氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺展示的胺基反应。先前用于蛋白质固定的其他表面包括但不限于用葡聚糖、纤维素、金和聚苯乙烯衍生的PDMS等。然而，这些偶联技术将导致纤维的非特异性附着。
通过使用展示C末端半胱氨酸残基(Sup35(1-61)-Cys或Ure2(1-80)-Cys)的Sup35(1-61)或Ure2(1-80)可以实现与表面的特异性化学偶联。由于载体蛋白Sup35(1-61)或Ure2(1-80)及其功能化对应物中不存在半胱氨酸残基，因此可以在纤维组装期间添加Sup35(1-61)-Cys和Ure2(1-80)-Cys，因此，并入纳米原纤维。仅展示极少数半胱氨酸的载体蛋白的引入确保偶联发生在沿纳米原纤维的非常少的位置、优选一个，赋予在剩余的纳米原纤维上自由水平移动的能力。在任选的实施方案中，载体蛋白和/或载体-Z融合蛋白的N或C末端不一定必须与固定化或锚定标签或分子直接连接。在N或C末端与固定化或锚定标签或分子之间可以具有接头或桥。在这种方法中，接头或桥可以是限制酶切割位点的形式或包含限制酶切割位点，如图1所示，其中蛋白酶切割位点的实例是凝血酶切割位点(TS)。这提供了通过添加特定蛋白酶从表面释放固定化抗体结合纳米原纤维的有效方式。
指示疾病传播早期的生物标记的检测对于患者的成功治疗是至关重要的。因此，通过优化ELISA和开发其先进变体，不断改进免疫测定，目的是降低释放到血清中的疾病特异性蛋白质的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。数字ELISA，即分离捕获被酶标记到50fL反应室中的蛋白质的微珠，已将检测限降低到fM范围以下，但需要先进的实验室设备和经过培训的个人。另一方面，侧向流动免疫测定(LFA)适用于护理点(POC)检测，但未能检测低于10- 11M的生物标记，因为它们具有膜的低抗体结合能力。然而，经常提到的前列腺癌生物标记前列腺特异性抗原(PSA)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等感染性疾病、神经系统疾病等的鉴定通常需要10-12至10-16M的检测限。为了克服这些限制，靶蛋白的预浓缩允许一些改善。降低LFALOD的另一种选择是显著增加膜上捕获抗体的密度。这可以通过使用实施方案的抗体结合原纤维来实现，其将扩大可用的表面积，并因此增加生物标记结合位点的数量。此外，抗体结合纳米原纤维具有改善任何免疫测定或装置的潜力，所述免疫测定或装置将受益于更大的表面积。
对于POC应用和实验室诊断，需要对低浓度生物标记进行高灵敏度测定。
因此，实施方案的又一方面涉及用于检测样品中化学物质的存在的试剂盒。该试剂盒包含根据实施方案的抗体结合纳米原纤维。该试剂盒还包含抗体，例如IgG，其特异性结合样品中的化学物质。抗体结合纳米原纤维的载体-Z融合蛋白能够结合抗体。
化学物质可以是可以被能够结合抗体结合原纤维的Z结构域的抗体例如IgG识别的任何化合物、试剂、分析物或生物标记。非限制性但示例性实例包括心血管疾病的生物标记，例如肌钙蛋白或高敏C反应蛋白(hsCRP)；颅骨损伤或创伤的生物标记，如S100钙结合蛋白B(S100B)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，神经丝蛋白轻蛋白(NFL)，D-二聚体(纤维蛋白降解产物)，脑利钠肽(BNP)；中风生物标记，如S100B，GFAP，NFL；各种癌症类型的生物标记，如PSA，核基质蛋白22号(MP22)，膀胱肿瘤抗原(BTA)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原15-3(CA 15-3)，癌抗原19-9(CA 19-9)；传染病的生物标记，如甲型或乙型流感、HIV的生物标记；用于神经系统疾病例如阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化症，痴呆症的生物标记，例如NFL，淀粉样蛋白-β肽，Tau。
因此，实施方案的试剂盒可用于检测被特异性结合化学物质的抗体、优选IgG分子识别的任何化学物质。
如本文所用，关于抗体与化学物质的结合，即与抗原化学物质的表位的“特异性结合”是本领域熟知的术语，并且确定这种特异性或优先结合的方法是在本领域中也是众所周知的。如果抗体以比与其他化学物质结合的更大亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合，则抗体“特异性结合”化学物质。通常，特异性结合暗示解离常数(KD)<1μM，优选<100nM，更优选<10nM。
当然可以将多于一种类型的抗体结合到实施方案的抗体结合纳米原纤维上。在这种情况下，两种或更多种不同的抗体类型可以具有特异性并结合不同的抗原即化学物质，和/或给定抗原即化学物质上的不同表位。
含有与抗体特异性结合的化学物质的样品可以是任何样品，但优选是来自人体或动物体的体样品。说明性此类样品的实例包括体液样品，例如血液样品、血浆样品或血清样品。身体样品的其他示例包括组织样品、脑脊液样品、尿液样品等。
包含如本文所述的抗体结合纳米原纤维的实施方案的试剂盒由此构成可用于POC和/或实验室诊断的有价值的工具，其中需要检测特定化学物质并且特别是在样品中以低浓度存在的这种化学物质的存在。设计用于最大化或至少显著改善抗体结合能力并具有优异的表面积与体积比的实施方案的抗体结合纳米原纤维使得能够在抗体结合纳米原纤维固定至其的给定体积或表面区域内结合或附着于抗体结合纳米原纤维的极高量或数量的抗体。
例如，与传统ELISA(例如夹心ELISA)的测试(其中捕获抗体附着于固体表面)相比，本实施方案将替代将抗体结合纳米原纤维附着于固体表面，从而显著增加固体表面的给定区域捕获抗体的数量。
因此，即使在低至pM、fM、aM或甚至更低的浓度下，实施方案的试剂盒也可用于检测样品中化学物质的存在。
实施例
在该研究中，旨在用于抗体纯化的纳米原纤维被设计用于实现最大结合能力。为此，通过Z结构域(8kDa)的功能化使纤维重量最小化，Z结构域是蛋白A的工程改造的B结构域变体。Z结构域用作支架以产生分子，但在低nM范围内固有地结合IgG的Fc部分。为了赋予功能单元的最大可接近性和保留的亲和力，Sup35(1-61)-Z-二聚体和Ure2(1-8)-Z-二聚体融合蛋白分别与非功能性Sup35-片段和Ure2片段共组装。该策略允许我们优化原纤维组合物，这导致概念材料超过现有产品的动态结合能力至少一个数量级。
材料与方法
克隆
对Sup35(1-61)、Ure2(1-80)、Sup35(1-61)-ZZ、ZZ-Ure2(1-80)和Z的基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并从GeneArt Strings DNA片段合成(Thermo Scientific)获得DNA片段。用FastDigest限制酶(Thermo Scientific)切割片段，并连接到pET28b(+)载体中。在Uppsala Genome center(Science for Life Laboratory,Uppsala University,Uppsala,瑞典)中心对最终构建体His6-TS-Sup35(1-61)(SEQ ID NO:9)、His6-TS-Ure2(1-80)(SEQ ID NO:10)、His6-TS-Sup35(1-61)-GGGSG接头-Z同二聚体(SEQ ID NO:11)、Z同二聚体-GGGSG接头–Ure2(1-80)-His6(SEQ ID NO:12)和His6-Z(图1)进行了测序。
表达与纯化
各自的基因Sup35(1-61)、Ure2(1-80)、Sup35(1-61)-ZZ或Z转化的携带pET28b(+)表达载体的BL21star(DE3)的过夜(ON)培养物(Lysogeny-broth(LB)培养基；25℃；180rpm)用以1:100稀释到900mL Terrific broth(TB)培养基(30μg/ml卡那霉素)中。培养物在37℃和180rpm下生长直至OD600达到0.6。通过加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至终浓度为1mM诱导蛋白质表达，并将细菌另外在180rpm下37℃孵育4.5小时(Sup35(1-61)、Ure2(1-80)和Z)或在30℃孵育5小时(Sup35(1-61)-ZZ)。为了表达ZZ-Ure2(1-80)，将起子培养物(TB-培养基；37℃；180rpm；5h)以1:180稀释到900mL TB-培养基(30μg/ml卡那霉素)中。使培养物在180rpm下生长直至OD600达到1.0，此时将培养物在冰上冷却，然后加入IPTG至终浓度为0.1mM。蛋白质表达在20℃和180rpm下进行14小时。
使用F9-6x 1000LEX转子，在Sorvall LYNX 6000(Thermo Scientific)离心机中在4℃下以3,500×g收获细胞20分钟。弃去上清液，通过在缓冲液LD[8M尿素,20mM Tris,150mM NaCl,pH 8](Sup35(1-61)和Ure2(1-80))或缓冲液LN[25mM Tris,150mM NaCl,pH8](Sup35(1-61)-ZZ、ZZ-Ure2(1-80)和Z)中温和搅拌将剩余的细胞沉淀重新悬浮，并储存在-20℃。天然条件下的细胞裂解在Cell Disruptor(Constant Systems)中以1.35kba进行。随后，加入1,000U DNAse I(Boehringer Mannheim)和一片完全EDTA游离蛋白酶抑制剂(Roche)。在冰上孵育30分钟后，将裂解物在Sorvall RC 6+(Thermo Scientific)中使用F21-8x50y转子在39,000×g和4℃离心30分钟以除去任何不溶性碎片。将含有尿素的缓冲液中的细胞沉淀再悬浮液解冻并以相同的方式离心60分钟并在环境温度下离心。最后，通过注射器驱动的FiltropurS 0.45μm过滤器(Sarstedt)过滤裂解物。
蛋白质纯化在平台上在4℃(用于天然缓冲条件)或室温下(用于变性条件)进行。在变性条件下，在加载细胞裂解物之前，用缓冲液AD[8M尿素，20mM Tris，pH8]平衡加入Ni2+的5ml HiTrap螯合HP柱(GE Healthcare)。首先用含有30mM咪唑的缓冲液AD洗脱弱结合蛋白。Sup35(1-61)在90mM咪唑洗脱，产生三个连续的峰，而第三个峰含有Sup35(1-61)。Ure2(1-80)在200mM咪唑下洗脱。用缓冲液AD平衡5mL MonoQ柱(AmershamBioscience)，然后加载Sup35(1-61)或Ure2(1-80)并在流穿液中收集纯蛋白质。使用Vivaspin 20 MWCO 5,000Da将Sup35(1-61)浓缩至>1,000μM。
官能化的Sup35(1-61)-ZZ、ZZ-Ure2(1-80)以及Z在天然缓冲液条件下用缓冲液AN[25mM Tris，pH8]纯化。用含有200mM咪唑的天然缓冲液从固定化金属离子亲和层析(IMAC)柱洗脱基本上纯的蛋白质。作为最终纯化步骤，将蛋白质加载到HiLoad 16/600 Superdex75pg(GE Healthcare)凝胶过滤柱上。使用4-20％Mini-protean TGX无染色预制凝胶(Biorad)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认所有蛋白质的纯度和大小。
通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)-飞行时间(TOF)质谱(MS)验证了Sup35(1-61)和Ure2(1-80)中由于存储在8M尿素中而没有任何翻译后修饰。通过测量280nm处的吸光度(Abs280)并使用计算的序列特异性消光系数测定Sup35(1-61)、Sup35(1-61)-ZZ、ZZ-Ure2(1-80)和Z的蛋白质浓度[22]。此外，使用二辛可宁酸测定(Thermo Scientific测定试剂盒)测定Ure2(1-80)和ZZ-Ure2(1-80)的浓度。将蛋白质等分并用液氮快速冷冻，然后在-80℃下长期储存。
功能化纳米原纤维的聚集
在缓冲液FBS[0mM Tris-HCl,200mM NaCl,pH 8.0]和缓冲液FBU[10mM KPi,150mMNaCl,pH 7.4]中分别实施共同原纤化，即Sup35(1-61)与Sup35(1-61)-ZZ和Ure2(1-80)与ZZ-Ure2(1-80)的同时聚集。通过首先将18μg的Sup35(1-61)稀释50倍到缓冲液FBS中来组装功能性Sup35(1-61)原纤维。将该样品在1.5mL Eppendorf小瓶中在Branson 2510超声波浴中超声处理8分钟。然后立即将种子加入含有79μg Sup35(1-61)和10-159μg Sup35(1-61)-ZZ的样品中。考虑到添加的种子的量，获得Sup35(1-61)与Sup35(1-61)-ZZ的最终摩尔比，其对应于1:0.04-1:0.65。以同样的方式，为了获得Ure2(1-80)种子，将蛋白质用Vivaspin 500 MWCO 3,000Da以9,000×g浓缩至约1mM，然后稀释50倍至缓冲液FBU中。接下来，使用步进式微尖端用Vibra Cell VC 505(Sonics)对100μg进行超声处理(2秒开，8秒关，20％振幅，总时间60秒)。将种子立即加入含有71μg Ure2(1-80)和8-169μg ZZ-Ure2(1-80)的样品中，如果还考虑了添加的种子量，得到Ure2(1-80)与ZZ-Ure2(1-80)的最终摩尔比对应于1:0.04-1:0.9。为了完全聚集，将样品在室温下孵育过夜。通过离心以17,000×g沉淀原纤维10分钟测试原纤化的完整性，然后用Nanodrop1000(Thermo Scientific)或SDS-PAGE测量上清液在280nm处的吸光度以证实不存在任何残留的蛋白质。将组装的原纤维在4℃下储存直至使用。
生物分子相互作用
所有相互作用研究使用Biacore X100(GE healthcare)上的表面等离子体共振(SPR)测定在25℃和30μL/min的流速下进行。通过注射10ng/ml Z到镍表面上30秒、40ng/mLSup35(1-61)-ZZ到镍表面上90秒或160ng/mL ZZ-Ure2(1-80)到镍表面上90秒将加His6标签的蛋白质固定在镍(Ni2+)螯合的次氮基三乙酸(NTA)芯片(GE Healthcare)上。通常，达到10个响应单位(RU)至40RU的稳定的最终固定水平。在缓冲液HBS-P[10mM HEPES,150mMNaCl,3mM EDTA,0.05％20,pH 7.4]中以两倍稀释系列制备多克隆人IgG(Pierce)，并在5至40nM之间变化。该分析以多循环设置实施，即在每次注入分析物后完全再生Ni2+表面。监测结合期180秒，解离期600秒。使用Biacore评估软件将数据拟合至1:1结合模型。每个实验一式四份进行。使用类似的设置来记录共原纤维的结合动力学(摩尔比1:0.04)。将共原纤维稀释至160ng/ml(Sup35)或1μg/ml(Ure2)并注射到NTA芯片的镍表面上180秒，产生30RU的固定水平。分析物(多克隆IgG)的浓度在5和40nM之间变化。将获得的传感图拟合至二价分析物模型。
从人血清中纯化IgG
将摩尔比为1:0.16的约680μg Sup35原纤维或摩尔比为1:0.49的530μg Ure2原纤维用缓冲液FBS洗涤两次，并与人血清(3H Biomedical)在室温下孵育30分钟。然后通过在Heraeus Pico17 Table Top离心机(Thermo Scientific)中以17,000×g离心10分钟沉淀原纤维并严格洗涤三次。使用缓冲液EB(0.1M甘氨酸-HCl，pH 3)洗脱结合的IgG，并通过测量280nm处的吸光度估计洗脱的IgG的总量。为了更完美(polishing)，使用缓冲液AN将洗脱的IgG上样到Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)上。使用SDS-PAGE评估IgG的成功纯化。
电子显微镜
使用多克隆人IgG(Thermo Fisher Scientific)作为第一抗体，使展示的ZZ结构域饱和，其比例等于1:0.16原纤维。在室温下孵育30分钟后，将二级山羊抗人IgG 5nm金缀合物(Sigma Aldrich)加入到原纤维中，使每个免疫金颗粒的最终比例为66或400个ZZ结合位点。通过额外的重量，原纤维非常快速地沉降，这允许除去上清液并在新鲜缓冲液EM(5mMTris-HCl，pH 8)中再悬浮。使用缓冲液EM重复洗涤四次。将原纤维加载到碳涂层网格(SPISupplies)上，并用1％铀酸盐进行阴性染色[23]。在SciLife lab BioVis设施(Rudbecklaboratory,Uppsala University,Uppsala,瑞典)拍摄TEM图像。
纳米原纤维的结合能力
测定展示ZZ的共原纤维随掺杂频率的变化的最大IgG结合能力。为此，组装的共原纤维相对于无功能原纤维蛋白具有对应于1:0.04-1:0.65(Sup35)或1:0.04-1:0.9(Ure2)的相对摩尔比。取决于该比例，将7.4-17.8μg Sup35-支架共原纤维或6.6-17.8μg Ure2-支架共原纤维在室温下与人IgG(Pierce)一起孵育60分钟。添加的抗体量在实际原纤维结合能力的1.5-2倍的范围内。在使用之前，从储液中新鲜稀释IgG，并通过一式四份测量280nm处的吸光度(ε_percent＝13.7g/100ml-1cm-1)来确定最终浓度。孵育后，将样品在HeraeusPico17 Table Top离心机(Thermo Scientific)中以17,000×g离心10分钟，并一式三份测定上清液在280nm处的吸光度。上清液在280nm处的吸光度与结合原纤维的IgG量直接相关。每种原纤维类型的结合能力以六份测定。
结果
蛋白质纯化
在变性条件下纯化Sup35(1-61)和Ure2(1-80)，其分别产生10mg和20mg蛋白质/L的大肠杆菌培养物。MALDI-TOF MS证实了Sup35(1-61)(8,995Da)和Ure2(1-80)(10,793Da)的理论质量，这意味着由于在尿素中的储存而没有任何修饰。功能变体Sup35(1-61)-ZZ和ZZ-Ure2(1-80)在天然条件下表达和纯化。在IMAC纯化后，产量估计分别为71mg/L和20mg/L。同样地，在IMAC后纯化Z结构域产生89mg/L纯蛋白质。
生物分子相互作用
设计纳米原纤维以有效结合IgG在组成上取决于功能结构域的选择。Z结构域是为此目的精心挑选的候选者。此外，在先前的研究中已经表明，与单个Z结构域相比，二聚体ZZ对IgG提供增加的结合亲和力[24]。Biacore用于评估ZZ的保留效力，其用于融合蛋白Sup35(1-61)-ZZ和ZZ-Ure2(1-80)作为单个分子和组装的原纤维(图2A和2B)。结果表明(表1)动力学与文献中可获得的数据一致[24,25]。然而，koff比先前报告的值慢大约一个数量级。数据不相似的合理理由是通过His6-标签利用带有Ni2+-的NTA-芯片进行蛋白质固定，以获得功能性ZZ的最佳取向。与该实验设计相反，先前的数据是通过IgG与CM5芯片的胺偶联的非特异性固定获得的，其产生异质表面。然而，可以得出结论，ZZ不受其标签的损害，并且对IgG的有效ZZ结合保持完整，其在高pM范围内提供亲和力。
表1-与不同蛋白质构建体中存在的Z结构域结合的人IgG的结合和解离常数
A.将数据拟合于二价分析物模型。kon和koff的比率代表了IgG-纤维相互作用的主要成分。共原纤维中非功能性相对于功能性蛋白质的摩尔比为1:0.04。
B.将数据拟合于1:1结合模型。
共原纤维的组装和功能
使用种子引发共聚集在不到一天的时间内产生功能性共原纤维，与两个实体的比例无关。因此，通过在共原纤维聚集之后改变Sup35(1-61)-ZZ或ZZ-Ure2(1-80)浓度，可以容易地调节沿原纤维的ZZ密度。通过离心从悬浮液中除去原纤维来评估成功的原纤化。通过吸光度测量或SDS-PAGE证实上清液中完全不存在可溶性蛋白质。
为了评估显示在组装材料上的ZZ的保留功能，再次应用SPR技术测量IgG与共原纤维的动力学结合速率(图2C和2D)。这种相互作用的传感图更复杂，不能拟合于1:1结合模型。该观察结果与基本原理一致，即预期共原纤维固定不能提供所有结合位点的平等可及性。因此，二价分析物模型用于拟合数据。相互作用的主要成分产生的速率与从可溶性嵌合蛋白获得的数据一致，并证明了在Sup35(1-61)以及Ure2(1-80)原纤维上展示的ZZ的功能。为了强调这一发现，尝试从复杂基质中纯化IgG。为此，对于Sup35和Ure2支架共原纤维，掺杂频率分别为1:0.16和1:0.49的ZZ功能化的原纤维与人血清一起孵育。然后通过离心沉淀原纤维，充分洗涤，并用0.1M甘氨酸-HCl，pH 3除去IgG。纯化的SDS-PAGE分析显示功能材料仅结合IgG并且不结合其他高丰度蛋白质(图3A和3B)。洗脱的抗体的纯度与商业上获得的IgG相当，除了存在可能通过离心未除去的小原纤维片段。为了增加纯度并除去小的原纤维碎片，将样品凝胶过滤。总共720μg(Sup35-支架共原纤维)和650μg(Ure2-支架共原纤维)IgG从人血清中纯化，其分别对应于1.06和1.22mg IgG/mg原纤维的产量。通过重复最初用商业上获得的纯IgG进行的SPR测定来验证纯化的抗体的完整性。实验室纯化的IgG与固定的Sup35(1-61)-ZZ相互作用产生结合常数(kon3.30±0.24×105M-1s-1、koff0.82±0.41×10-4s-1和KD0.25±0.12nM)，其实际上与(表1)中列出的比率相同。
还使用TEM验证了共原纤维的功能(图4)。首先原纤维用人IgG完全饱和，然后用金缀合的二抗标记。显然，金标记的抗体均匀分布，并且仅沿着原纤维定位。原纤维宽度的粗略估计显示Sup35(1-61)和Ure2(1-80)支架共原纤维的核心分别为约5nm和6nm。还观察到原纤维周围的扩散云(cloud)，最大宽度为30nm，最可能是由于原纤维两侧存在IgG，考虑到IgG具有12nm的长度，这是合理的。
纳米原纤维的抗体结合能力
原纤维上ZZ结构域的密度升高可能导致IgG的结合能力增加。然而，由于空间限制，这也可能降低每个功能结构域的可访问性。为了鉴定ZZ密度阻碍IgG结合相对于结合能力的掺杂频率，具有增加的功能性非功能性载体蛋白摩尔比的原纤维被精确确定量的IgG饱和。然后，沉淀原纤维并测量上清液在280nm处的吸光度。这允许定量与和不与受原纤维结合的IgG。根据收集的数据，结合能力和纤维组成之间存在明显的相关性(图5A和5B以及表2)。从1:0.04的摩尔比开始，IgG结合能力稳定地增加并且当掺杂频率接近1:0.33(Sup35原纤维)或1:0.49(Ure2原纤维)时达到平台。Sup35原纤维的比例1:0.33也表示最大总结合能力，其等于每mg原纤维1.8mg IgG。共原纤维以1:0.04和1:0.08之比的最大IgG结合能力基本上与嵌合蛋白等摩尔，表明可以获得所有结合位点。如果在Sup35共原纤维中围绕每个栓系的ZZ分子约12个非功能性载体蛋白就是这种情况(图5B)。具有较高ZZ含量的原纤维不能完全进入每个ZZ位点，这是因为只有一小部分理论上可能的IgG结合。随着比例从1:0.16增加到1:0.65/0.9，可及的ZZ结合位点的比例线性降低(图5C)。表达结合一个分子IgG所必需的载体蛋白数量的数据遵循渐近趋势，并且对于Sup35共原纤维接近6.5或对于Ure2共原纤维接近6.0(图5B)。
因此，使用ZZ掺杂的纳米原纤维来纯化IgG能够导致更高的通量，这反过来最小化整个处理时间，并且因此可以提高成本效率。
表2-显示ZZ的Sup35原纤维的IgG结合能力
Sup35:Sup35-ZZ<sup>A</sup> IgG(mg)/原纤维(mg)<sup>B</sup> 理论容量的百分比<sup>C</sup> 蛋白质数量/IgG<sup>D</sup>
1:0.04 0.68±0.07 111±12％ 23.2±2.4
1:0.08 1.14±0.14 101±12％ 13.2±1.5
1:0.16 1.43±0.08 74±4％ 9.7±0.5
1:0.24 1.67±0.06 66±2％ 7.7±0.3
1:0.33 1.77±0.10 59±3％ 6.9±0.4
1:0.41 1.72±0.12 51±4％ 6.8±0.5
1:0.49 1.72±0.08 47±2％ 6.5±0.3
1:0.57 1.67±0.06 43±2％ 6.4±0.2
1:0.65 1.61±0.14 39±3％ 6.5±0.6
A.共原纤维中Sup35(1-61)相对于Sup35(1-61)-ZZ的摩尔比；
B.实验测定的各原纤维的人IgG结合能力的平均值；
C.实验测定的IgG结合能力的平均值除以理论最大结合能力；
D.结合一个IgG分子所必需的蛋白质数量。
指示的误差是标准偏差
表3-显示ZZ的Ure2原纤维的IgG结合能力
Ure2:ZZ-Ure2<sup>A</sup> IgG(mg)/原纤维(mg)<sup>B</sup> 理论容量的百分比<sup>C</sup> 蛋白质数量/IgG<sup>D</sup>
1:0.04 0.53±0.06 102±12％ 25.3±3.3
1:0.08 0.79±0.08 82±8％ 16.3±1.6
1:0.16 1.11±0.06 66±4％ 10.8±0.7
1:0.24 1.31±0.09 59±4％ 8.7±0.6
1:0.33 1.55±0.12 58±5％ 7.0±0.6
1:0.41 1.57±0.07 52±2％ 6.6±0.3
1:0.49 1.67±0.08 51±2％ 6.0±0.3
1:0.57 1.65±0.07 46±2％ 5.9±0.3
1:0.65 1.65±0.07 44±2％ 5.8±0.3
1:0.73 1.62±0.05 41±1％ 5.7±0.2
1:0.81 1.58±0.06 38±1％ 5.8±0.2
1:0.90 1.48±0.06 37±3％ 6.1±0.3
A.共原纤维中Ure2(1-80)相对于ZZ-Ure2(1-80)的摩尔比；
B.实验测定的各原纤维的人IgG结合能力的平均值；
C.实验测定的IgG结合能力的平均值除以理论最大结合能力；
D.结合一个IgG分子所必需的蛋白质数量。
指示的误差是标准偏差
上述实施方案应理解为本发明的一些说明性实例。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对实施例进行各种修改、组合和改变。
特别地，在技术上可行的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可以组合在其他配置中。然而，本发明的范围由所附权利要求限定。
参考文献
1.Men,D.,等,Seeding-induced self-assembling protein nanowiresdramatically increase the sensitivity of immunoassays.Nano letters,2009.9(6):p.2246-50.
2.Cheng,X.,等,Fusion protein linkers:Property,design andfunctionality.Advanced Drug Delivery Reviews,2013.65:p.1357-1369.
3.Paushkin,S.V.,等,Propagation of the yeast prion-like[psi+]determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptidechain release factor.The EMBO journal,1996.15(12):p.3127-34.
4.Glover,J.R.,等,Self-seeded fibers formed by Sup35,the proteindeterminant of[PSI+],a heritable prion-like factor of S.cerevisiae.Cell,1997.89(5):p.811-9.
5.Maddelein,M.L.and R.B.Wickner,Two prion-inducing regions of Ure2pare nonoverlapping.Mol Cell Biol,1999.19(6):p.4516-24.
6.Baldwin,A.J.,等,Cytochrome Display on Amyloid Fibrils.Journal ofthe American Chemical Society,2006.128(7):p.2162-2163.
7.Kodama,H.,等,Construction of a protein array on amyloid-likefibrils using co-assembly of designed peptides.Chemical Communications,2004(24):p.2876-2877.
8.Sasso,L.,等,Versatile multi-functionalization of proteinnanofibrils for biosensor applications.Nanoscale,2014.6(3):p.1629-1634.
9.Hudalla,G.A.,等,Gradated assembly of multiple proteins intosupramolecular nanomaterials.Nature materials,2014.13(8):p.829-36.
10.Padalkar,S.,等,Alpha-synuclein as a template for the synthesis ofmetallic nanowires.Nanotechnology,2007.18(5).
11.Zhong,C.,等,Strong underwater adhesives made by self-assemblingmulti-protein nanofibres.Nature Nanotechnology,2014.9(10):p.858-866.
12.Wickner,R.B.,F.Dyda,and R.Tycko,Amyloid of Rnq1p,the basis of the[PIN+]prion,has a parallel in-register beta-sheet structure.Proc Natl AcadSci U S A,2008.105(7):p.2403-8.
13.Nilsson,B.,等,A Synthetic Igg-Binding Domain Based onStaphylococcal Protein-A.Protein Engineering,1987.1(2):p.107-113.
14.Bjorck,L.and G.Kronvall,Purification and Some Properties ofStreptococcal Protein-G,Protein-a Novel Igg-Binding Reagent.Journal ofImmunology,1984.133(2):p.969-974.
15.Eliasson,M.,等,Chimeric Igg-Binding Receptors Engineered fromStaphylococcal Protein-a and Streptococcal Protein-G.Journal of BiologicalChemistry,1988.263(9):p.4323-4327.
16.Grover,R.K.,等,A Structurally Distinct Human Mycoplasma Proteinthat Generically Blocks Antigen-Antibody Union.Science,2014.343(6171):p.656-661.
17.Wikstrom,M.,等,Proton nuclear magnetic resonance sequentialassignments and secondary structure of an immunoglobulin light chain-bindingdomain of protein L.Biochemistry,1993.32(13):p.3381-6.
18.Atkins,K.L.,等,S.aureus IgG-binding proteins SpA and Sbi:Hostspecificity and mechanisms of immune complex formation.Molecular Immunology,2008.45(6):p.1600-1611.
19.P.,等,Protein H—A novel igg binding bacterialprotein.Molecular Immunology,1990.27(6):p.523-531.
20.Sulaiman,S.,等,A review:potential usage of cellulose nanofibers(CNF)for enzyme immobilization via covalent interactions.Appl BiochemBiotechnol,2015.175(4):p.1817-42.
21.Wong,L.S.,F.Khan,and J.Micklefield,Selective covalent proteinimmobilization:strategies and applications.Chem Rev,2009.109(9):p.4025-53.
22.Gasteiger,E.,等,Protein Identification and Analysis Tools on theExPASy Server,in The Proteomics Protocols Handbook,J.M.Walker,Editor.2005,Humana Press:Totowa,NJ.p.571-607.
23.Zhang,L.,等,Morphology and structure of lipoproteins revealed byan optimized negative-staining protocol of electron microscopy.Journal oflipid research,2011.52(1):p.175-84.
24.Nilsson,J.,等,Competitive elution of protein A fusion proteinsallows specific recovery under mild conditions.European journal ofbiochemistry/FEBS,1994.224(1):p.103-8.
25.Jendeberg,L.,等,Kinetic analysis of the interaction betweenprotein A domain variants and human Fc using plasmon resonancedetection.Journal of molecular recognition:JMR,1995.8(4):p.270-8.
26.Lee,D.S.,等,A protein nanofiber hydrogel for sensitiveimmunoassays.Analyst,2013.138:p.4786-94.
序列表
&lt;110&gt; 托莱夫·哈德
麦茨·桑德兰
本杰明·施马克
&lt;120&gt; 抗体结合纳米原纤维
&lt;130&gt; P1335PC00
&lt;150&gt; SE 1650661-0
&lt;151&gt; 2016-05-17
&lt;160&gt; 12
&lt;170&gt; PatentIn version 3.5
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; α螺旋基序
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; HELIX
&lt;222&gt; (2)..(6)
&lt;223&gt; 重复2至5次
&lt;400&gt; 1
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 5
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 柔性接头
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; REPEAT
&lt;222&gt; (1)..(5)
&lt;223&gt; 重复5至7次
&lt;400&gt; 2
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 5
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 柔性接头
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; REPEAT
&lt;222&gt; (1)..(5)
&lt;223&gt; 重复5至7次
&lt;400&gt; 3
Gly Gly Gly Gly Thr
1 5
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 29
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 柔性接头
&lt;400&gt; 4
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
20 25
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 29
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 柔性接头
&lt;400&gt; 5
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
20 25
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 27
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 带有螺旋基序的柔性接头
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; HELIX
&lt;222&gt; (12)..(16)
&lt;223&gt; 重复2至3次
&lt;400&gt; 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 27
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 带有螺旋基序的柔性接头
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; HELIX
&lt;222&gt; (12)..(16)
&lt;223&gt; 重复2至3次
&lt;400&gt; 7
Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr
20 25
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 31
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 带有螺旋基序的柔性接头
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; HELIX
&lt;222&gt; (14)..(18)
&lt;223&gt; 重复2至3次
&lt;400&gt; 8
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe Ala Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
20 25 30
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 327
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; His6-凝血酶位点-Sup35(1-61)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; METAL
&lt;222&gt; (5)..(10)
&lt;223&gt; His6-tag
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DOMAIN
&lt;222&gt; (14)..(19)
&lt;223&gt; 凝血酶切割位点
&lt;400&gt; 9
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn
20 25 30
Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg
35 40 45
Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Ala Gly Gly
50 55 60
Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Gln Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr
85 90 95
Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala
100 105 110
Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys
115 120 125
Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr Gly
130 135 140
Thr Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly
145 150 155 160
Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Cys Ala Gly Cys
180 185 190
Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys
195 200 205
Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly
210 215 220
Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala
225 230 235 240
Gly Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly
245 250 255
Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly
260 265 270
Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr
290 295 300
Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Cys Ala Ala Thr Ala Ala
325
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 403
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; His6-凝血酶位点-Ure2(1-80)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; METAL
&lt;222&gt; (5)..(10)
&lt;223&gt; His6-tag
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DOMAIN
&lt;222&gt; (14)..(19)
&lt;223&gt; 凝血酶切割位点
&lt;400&gt; 10
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Met Asn Asn Asn Gly Asn Gln Val Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Ala Leu Arg Gln Val Asn Ile Gly Asn Arg Asn Ser Asn Thr
35 40 45
Thr Thr Asp Gln Ser Asn Ile Asn Phe Glu Phe Ser Thr Gly Val Asn
50 55 60
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Val Gln Asn
65 70 75 80
Asn Asn Ser Gly Arg Asn Gly Ser Gln Asn Asn Asp Asn Glu Asn Asn
85 90 95
Ile Lys Asn Thr Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys
100 105 110
Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys
115 120 125
Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr
130 135 140
Gly Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr
145 150 155 160
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Gly
165 170 175
Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala
180 185 190
Cys Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Thr Thr Ala
195 200 205
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly
210 215 220
Gly Cys Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala
225 230 235 240
Thr Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly
245 250 255
Ala Gly Thr Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly
260 265 270
Ala Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr
275 280 285
Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys
290 295 300
Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala
305 310 315 320
Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr
340 345 350
Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala
355 360 365
Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala
385 390 395 400
Thr Ala Ala
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 815
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; His6-凝血酶位点-Sup35(1-61)-GGGSG接头-Z同源二聚体
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; METAL
&lt;222&gt; (5)..(10)
&lt;223&gt; His6-tag
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DOMAIN
&lt;222&gt; (14)..(19)
&lt;223&gt; 凝血酶切割位点
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DOMAIN
&lt;222&gt; (82)..(87)
&lt;223&gt; GGGGSG接头
&lt;400&gt; 11
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Asp Ser Asn Gln Gly Asn Asn Gln Gln Asn
20 25 30
Tyr Gln Gln Tyr Ser Gln Asn Gly Asn Gln Gln Gln Gly Asn Asn Arg
35 40 45
Tyr Gln Gly Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Gln Ala Gln Pro Ala Gly Gly
50 55 60
Tyr Tyr Gln Asn Tyr Gln Gly Tyr Ser Gly Tyr Gln Gln Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln
85 90 95
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu
100 105 110
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser
115 120 125
Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
130 135 140
Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu
145 150 155 160
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile
165 170 175
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
180 185 190
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Thr Gly Gly Gly
195 200 205
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr
210 215 220
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly
225 230 235 240
Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly
245 250 255
Thr Ala Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys Gly Ala Thr
260 265 270
Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Thr Ala
275 280 285
Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Thr Cys Ala
290 295 300
Gly Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Thr
305 310 315 320
Gly Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly
325 330 335
Gly Cys Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Gly Cys Thr Ala Thr Cys Ala
340 345 350
Gly Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr
355 360 365
Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys
370 375 380
Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Thr Ala
385 390 395 400
Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys
405 410 415
Thr Ala Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys
420 425 430
Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly
435 440 445
Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr
450 455 460
Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala
485 490 495
Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Ala Ala Thr Thr
500 505 510
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515 520 525
Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly
530 535 540
Thr Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly
545 550 555 560
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys
565 570 575
Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala
580 585 590
Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Cys Ala
595 600 605
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly
610 615 620
Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Thr
625 630 635 640
Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Thr
645 650 655
Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly
660 665 670
Cys Gly Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr
675 680 685
Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly
690 695 700
Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Ala
705 710 715 720
Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Gly Thr Cys
725 730 735
Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly
740 745 750
Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys
755 760 765
Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala
770 775 780
Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Ala
785 790 795 800
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala
805 810 815
&lt;210&gt; 12
&lt;211&gt; 842
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Z同源二聚体-GGGSG接头-Ure2(1-80)-His6
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DOMAIN
&lt;222&gt; (118)..(123)
&lt;223&gt; GGGGSG接头
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; METAL
&lt;222&gt; (205)..(210)
&lt;223&gt; His6-标签
&lt;400&gt; 12
Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile
20 25 30
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
35 40 45
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe
50 55 60
Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp
100 105 110
Ala Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Met Asn Asn Asn Gly
115 120 125
Asn Gln Val Ser Asn Leu Ser Asn Ala Leu Arg Gln Val Asn Ile Gly
130 135 140
Asn Arg Asn Ser Asn Thr Thr Thr Asp Gln Ser Asn Ile Asn Phe Glu
145 150 155 160
Phe Ser Thr Gly Val Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Ser Asn
165 170 175
Asn Asn Asn Val Gln Asn Asn Asn Ser Gly Arg Asn Gly Ser Gln Asn
180 185 190
Asn Asp Asn Glu Asn Asn Ile Lys Asn Thr Leu Glu His His His His
195 200 205
His His Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala
210 215 220
Ala Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly
225 230 235 240
Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Gly
245 250 255
Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys
260 265 270
Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala
275 280 285
Cys Ala Gly Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Ala
290 295 300
Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala
305 310 315 320
Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys
325 330 335
Gly Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly
340 345 350
Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala
355 360 365
Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly
370 375 380
Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr
385 390 395 400
Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala
405 410 415
Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly
420 425 430
Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala
435 440 445
Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala
450 455 460
Ala Cys Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr
465 470 475 480
Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Gly
485 490 495
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500 505 510
Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly
515 520 525
Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly
530 535 540
Ala Cys Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala
595 600 605
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610 615 620
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly
625 630 635 640
Gly Cys Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala
645 650 655
Thr Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly
660 665 670
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675 680 685
Ala Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr
690 695 700
Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys
705 710 715 720
Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala
725 730 735
Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala
740 745 750
Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Thr
755 760 765
Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala
770 775 780
Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Ala
785 790 795 800
Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala
805 810 815
Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys
820 825 830
Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly
835 840

Claims (20)

1.一种抗体结合纳米原纤维，其能够通过以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白的共原纤化获得。
2.根据权利要求1所述的抗体结合纳米原纤维，其包含以1:0.20至1:0.90的所述区间内选择的所述摩尔比的所述载体蛋白和所述载体-Z融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的抗体结合纳米原纤维，其中在1:0.30至1:0.90的区间内、优选在1:0.30至1:0.70的区间内并且更优选在1:0.30至1:0.50的区间内选择所述摩尔比。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述载体蛋白是Sup35载体蛋白，并且所述载体-Z融合蛋白是Sup35-Z融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述Sup35载体蛋白是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核翻译释放因子Sup35的N末端片段，并且所述Sup35-Z融合蛋白是所述酿酒酵母(S.cerevisiae)真核翻译释放因子Sup35的N末端片段和至少一个Z结构域的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述N末端片段由酿酒酵母真核翻译释放因子Sup35的编号1至61的氨基酸组成。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中在1:0.30至1:0.40的区间内、优选在1:0.30至1:0.35的区间内选择所述摩尔比并且更优选等于约1:0.33。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述载体蛋白是Ure2载体蛋白，并且所述载体-Z融合蛋白是Ure2-Z融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述Ure2载体蛋白是酿酒酵母脲基琥珀酸转运蛋白的N末端片段，并且所述Ure2-Z融合蛋白是所述酿酒酵母脲基琥珀酸转运蛋白的N末端片段和至少一个Z结构域的融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述N末端片段由酿酒酵母脲基琥珀酸转运蛋白的编号1至80的氨基酸组成。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中在1:0.45至1:0.55的区间内、优选在1:0.47至1:0.51的区间内选择所述摩尔比并且更优选等于约1:0.49。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述载体-Z融合蛋白是所述载体蛋白和蛋白A的免疫球蛋白(IgG)结合结构域之间的融合蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述载体-Z融合蛋白是载体-Z二聚体融合蛋白。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述抗体结合纳米原纤维能够结合免疫球蛋白(IgG)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其中所述抗体结合纳米原纤维具有每mg纳米原纤维至少1.5mg免疫球蛋白G(IgG)、优选每mg纳米原纤维至少1.6mgIgG、更优选每mg纳米原纤维至少1.7mg IgG、例如每mg纳米原纤维至少1.8mg IgG的结合能力。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体结合纳米原纤维，其包含至少一种与载体-Z融合蛋白的至少一个Z结构域结合的抗体。
17.一种试剂盒，其用于检测样品中化学物质的存在，所述试剂盒包含：
根据权利要求1至15中任一项所述的抗体结合纳米原纤维；和
抗体，其特异性结合所述样品中的所述化学物质，其中所述抗体结合纳米原纤维的载体-Z融合蛋白能够结合所述抗体。
18.一种抗体捕获装置，其包含固定在固体表面上的根据权利要求1至15中任一项所述的抗体结合纳米原纤维。
19.一种产生抗体结合纳米原纤维的方法，所述方法包括以1:0.20至1:0.90的区间内选择的摩尔比的载体蛋白和载体-Z融合蛋白的共原纤化(S2)以形成所述抗体结合纳米原纤维。
20.根据权利要求19所述的方法，其进一步包括通过在水溶液中超声处理载体蛋白而产生(S1)种子，其中所述载体蛋白和所述载体-Z融合蛋白的共原纤化(S2)包括用所述载体蛋白和所述载体-Z融合蛋白以所述摩尔比孵育(S2)所述种子以形成所述抗体结合纳米原纤维。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112469736A (zh) * 2018-08-01 2021-03-09 国立大学法人鹿儿岛大学 肽融合蛋白质

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000075324A2 (en) * 1999-06-09 2000-12-14 Arch Development Corporation Recombinant prion-like genes and proteins and materials and methods comprising same
WO2008033451A2 (en) * 2006-09-13 2008-03-20 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein aggregation domains from prions and methods of use thereof
WO2016034728A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 Cambridge Enterprise Limited Protein capsules

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005118633A2 (en) * 2004-05-20 2005-12-15 The Whitehead Institute For Biomedical Research Electrical conductors and devices from prion-like proteins
CN101624568B (zh) * 2009-08-07 2012-09-19 中国科学院武汉病毒研究所 一种纳米分子生物传感器及制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000075324A2 (en) * 1999-06-09 2000-12-14 Arch Development Corporation Recombinant prion-like genes and proteins and materials and methods comprising same
WO2008033451A2 (en) * 2006-09-13 2008-03-20 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein aggregation domains from prions and methods of use thereof
WO2016034728A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 Cambridge Enterprise Limited Protein capsules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAE-SUNG LEE等: "A protein nanofiber hydrogel for sensitive immunoassays", 《ALALYST》 *

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