CN108350450A - 人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离方法 - Google Patents

人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂。该课题可通过人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂而解决，所述分离剂包含载体、和通过化学键而键合于载体的表面的单链抗体，该单链抗体对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10‑8M以下的解离常数。

Description

人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血 清来源的IgG 多克隆抗体的分离方法
技术领域
本发明涉及单链抗体的筛选方法及单链抗体。
背景技术
作为分子靶向药物的形态，已研究/开发了各种形态：以抗体医药品、低分子医药品为首的肽医药品、细胞因子等活体内蛋白制剂，以及除此以外的siRNA、适体等(例如，专利文献1)。就抗体的作为治疗药的用途而言，从其特异性方面考虑，对于疾病细胞表达特异性抗原的病情的治疗是有用的。抗体将在细胞表面表达的蛋白质作为抗原而结合，从而有效地作用于所结合的细胞。抗体具有血中半衰期长、对抗原的特异性高这样的特征，作为抗肿瘤剂也是非常有用的。
作为获得这样的抗体的方法，已知有通过进行使用抗体文库的淘选(模拟了“从砂中淘出砂金”的过程而称为“淘选”)而获得抗体的技术。例如，已知有将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法使其在噬菌体的表面表达，从而选择与抗原结合的噬菌体的方法。如果对所选择的噬菌体的基因加以解析，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以将该序列组装于适当的表达载体，从而容易地制造人抗体(例如，专利文献2、3)。
像这样，已知有基于使用抗体文库的淘选来获得作为抗体药物的候选的抗体的方法等。但是，在该技术领域，在使抗原和噬菌体结合时，通常要将抗原固定于聚苯乙烯制的管、板，有时需要阻断(blocking)的操作、或导致吸附于管等的蛋白质发生变性。其结果，存在以下问题：在噬菌体文库中，产生与用于阻断的蛋白质、发生了变性的蛋白质结合的那些，导致获得了与目标抗原以外的抗原结合的噬菌体。
另一方面，与上述抗体的获得方法相反地，开发了使用多层脂质体从肽文库获得与特定的抗体结合的肽的方法(非专利文献1)。在该文献中，作为模型，在对于固定于多层脂质体的抗八肽(FVNQHLCK，序列号35)抗体适用通过噬菌体展示法而在噬菌体的表面表达的肽的文库时，确认到可选择性地获得八肽(FVNQHLCK，序列号35)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-145366号公报
专利文献2：日本特开2015-097496号公报
专利文献3：日本特表平9-506508号公报
非专利文献
非专利文献1：Journal of Chromatography A,1080(2005)22-28
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供分离效率优异、与抗原的结合能力极大的单链抗体的筛选方法，以及通过该筛选法获得的单链抗体。
解决问题的方法
本发明人发现：在使用通过噬菌体展示法制备的抗体文库经淘选而获得目标的抗体时，可以利用将抗原与多层脂质体结合这样的方法来解决以往那样的在使用将抗原固定于管等的方法的情况下所产生的容易获得与目标抗原以外的抗原结合的噬菌体的问题。本发明如下所述。
[1]与抗原结合的单链抗体的筛选方法，其包括：
准备结合于多层脂质体的抗原的工序、
准备展示单链抗体的噬菌体文库的工序、及
从上述噬菌体文库选择展示与上述结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中，上述单链抗体是兔来源单链抗体。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述抗原为蛋白质。
[4]根据[3]所述的方法，其中，上述蛋白质为抗体。
[5]根据[4]所述的方法，其中，上述抗体为人血清来源的IgG多克隆抗体或人血清来源的IgA多克隆抗体。
[6]根据[4]或[5]所述的方法，其中，上述单链抗体为与人来源抗体的L 链结合的单链抗体。
[7]抗体的制造方法，其包括：
通过[1]～[6]中任一项所述的筛选方法进行筛选的工序，
确定所筛选的单链抗体的氨基酸序列的工序，
基于所确定的氨基酸序列的可变区的序列而制作编码抗体的DNA序列的工序、及
使制成的DNA序列在宿主细胞中表达的工序。
[8]根据[7]所述的制造方法，其中，编码抗体的DNA序列编码人源化抗体。
[9]对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数的单链抗体。
[10]根据[9]所述的单链抗体，其进一步与人血清来源的IgA多克隆抗体结合。
[11]对于人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。
[12]对于人来源抗体的L链具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。
发明的效果
根据本发明，可提供分离效率优异、与抗原的结合能力极大的单链抗体的筛选方法，以及通过该筛选法获得的单链抗体。
由于多层脂质体的分散性良好，因此与传统方法相比，能够使结合于多层脂质体的抗原与抗体的接触有效地进行，还能够通过离心分离而简便地回收。另外，如果使用多层脂质体，则非特异性地吸附于载体的噬菌体会变得极少。进一步，由于抗原可以在多层脂质体的膜上横向扩散，因此与噬菌体文库的结合性大、分离效率优异，可以获得与抗原的结合能力极大的单链抗体。
附图说明
[图1]示出了实施例1-1、实施例1-2、比较例1-1、比较例1-2中获得的阳性克隆数相对于克隆数的比例的图。
[图2]示出了实施例2及比较例2中的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的噬菌体数的图。
[图3]示出了用实施例2及比较例2中的第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的各噬菌体数分别除以淘选前的噬菌体数而得到的回收率(％) 的图。
[图4]示出了在实施例2的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第 3轮结束时以得到的含噬菌粒的大肠杆菌颗粒单元进行抗原结合活性评价时在波长450nm(副波长650nm)下的吸光度的图。
[图5]示出了针对由实施例3-2中第1轮结束时所得到的48个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图6]示出了针对由实施例3-2中第2轮结束时所得到的48个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-1]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-2]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-3]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-4]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-5]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-6]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-7]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图7-8]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图8-1]示出了在实施例5中确定的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列。
[图8-2]示出了在实施例5中确定的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列。
[图9-1]示出了实施例6及比较例6-1的抗原结合活性评价的结果的图。
[图9-2]示出了实施例6及比较例6-2的抗原结合活性评价的结果的图。
[图10]实施例8中的穿透曲线。
[图11]示出了实施例9-1及比较例9-1中的淘选前、第1轮结束时、第 2轮结束时、第3轮结束时的噬菌体数的图。
[图12]示出了用实施例9-1及比较例9-1中的第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的各噬菌体数分别除以淘选前的噬菌体数而得到的回收率(％)的图。
[图13]示出了在实施例9-2的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时以得到的含噬菌粒的大肠杆菌颗粒单元进行抗原结合活性评价时在波长450nm(副波长650nm)下的吸光度的图。
[图14]示出了针对由实施例9-3中第1轮结束时所得到的32个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图15]示出了针对由实施例9-3中第2轮结束时所得到的32个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图16]示出了针对由实施例9-3中第3轮结束时所得到的32个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。
[图17-1]针对实施例10中的第1轮结束时所得到的32个菌落，示出了由VH结构域的基因序列所确定的氨基酸序列。
[图17-2]针对实施例10中的第1轮结束时所得到的32个菌落，示出了由VH结构域的基因序列所确定的氨基酸序列的分析结果。
[图17-3]针对实施例10中的第2轮结束时所得到的32个菌落，示出了由VH结构域的基因序列所确定的氨基酸序列。
[图17-4]针对实施例10中的第2轮结束时所得到的32个菌落，示出了由VH结构域的基因序列所确定的氨基酸序列的分析结果。
[图17-5]针对实施例10中的第3轮结束时所得到的32个菌落，示出了由VH结构域的基因序列所确定的氨基酸序列。
[图17-6]针对实施例10中的第3轮结束时所得到的32个菌落，示出了由VH结构域的基因序列所确定的氨基酸序列的分析结果。
[图17-7]在实施例10中作为参考而示出的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列。
[图17-8]示出了在实施例10中第1轮结束时所得到的共通克隆的数量的表。
[图17-9]示出了在实施例10中第2轮结束时所得到的共通克隆的数量的表。
[图17-10]示出了在实施例10中第3轮结束时所得到的共通克隆的数量的表。
[图18]示出了实施例11及比较例11的抗原结合活性评价的结果的图。
具体实施方式
本发明包括：涉及单链抗体的筛选方法的第一发明、及涉及单链抗体的第二发明。在本说明书中，也将多层脂质体称为MLVs。另外，也将单链抗体称为scFv(单链Fv)。本发明中的单链抗体(scFv)在本技术领域，也作为低分子抗体之一而被称为单链Fv(单链Fv)等。
在下文中，虽然也有作为本发明中的单链抗体而使用兔来源单链抗体的情况的记载，但这仅仅是单链抗体为兔来源的情况的一例，本发明的单链抗体并不限定于兔来源的单链抗体。
<1.第一发明>
本发明的第一发明包括以下的第一实施方式及第二实施方式。
第一实施方式：与抗原结合的单链抗体的筛选方法，其包括：准备结合于多层脂质体的抗原的工序；准备展示单链抗体的噬菌体文库的工序；以及从上述噬菌体文库选择展示与上述结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体的工序。
第二实施方式：抗体的制造方法，其包括：通过第一实施方式中记载的筛选方法进行筛选的工序；确定所筛选的单链抗体的氨基酸序列的工序；基于所确定的氨基酸序列的可变区的序列而制作编码抗体的DNA序列的工序；以及使制成的DNA序列在宿主细胞中表达的工序。
<1-1.第一发明中的第一实施方式>
本发明的第一发明中的第一实施方式为与抗原结合的单链抗体的筛选方法，其包括：准备结合于多层脂质体的抗原的工序；准备展示单链抗体的噬菌体文库的工序；以及从上述噬菌体文库选择展示与上述结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体的工序。
本筛选方法也可以是筛选上述与抗原结合的单链抗体的候选的方法。
<(1)准备结合于多层脂质体的抗原的工序>
[多层脂质体(MLVs)]
作为多层脂质体，只要可与抗原结合则没有特别的限制。例如，可以依照Journalof Biotechnology 131(2007)144-149中记载的那样的公知的方法来制作。具体而言，可以将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷酸二鲸蜡酯(DCP)、及N-(4-(对马来酰亚胺苯基)丁酰基)二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MPB-DPPE)进行适量水合等来制作。
此时，由于仅进行水合时多为多层脂质体和单层脂质体混合的状态，因此优选在通过离心分离而分离出多层脂质体后使用。作为离心分离的条件，只要可分离出多层脂质体则没有特别的限制。可列举例如：于25℃、以 20,000g进行2分钟离心分离。
[抗原]
作为抗原，只要是与通过本实施方式涉及的筛选方法所筛选的单链抗体结合的物质即可，没有特别限制。可列举例如：细胞、蛋白质、脂质、糖链等，这些中，优选蛋白质，在蛋白质中，优选抗体。抗原可根据得到的单链抗体的用途而适宜选择。
对作为抗原使用的抗体的生物种类没有特别的限制，可以根据得到的单链抗体的用途而适宜选择。可列举例如：人、大鼠、小鼠、兔、鸡、山羊、绵羊、牛、马、犬、猫、猴等，优选为：人、大鼠、小鼠、兔、鸡、山羊。另外，作为抗原使用的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，可以根据得到的单链抗体的用途而适宜选择。
进一步，作为抗原使用的抗体也可以为包含IgG抗体、IgM抗体、IgA 抗体、IgD抗体及IgE抗体的任意抗体，可以仅为任一种，也可以为两种以上。进一步，分别可以为各自的亚类，既可以仅为各自的亚类的任一种，也可以为两种以上。
例如，如果作为抗原使用的抗体为人IgG抗体，则其亚类可列举：人IgG1 抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4抗体。可以为它们中的任一种、也可以为两种以上、也可以为3种以上、还可以为4种全部。
另外，例如，如果作为抗原使用的抗体为人血清来源的IgG多克隆抗体，则其亚类可列举：人血清来源的IgG1多克隆抗体、人血清来源的IgG2多克隆抗体、人血清来源的IgG3多克隆抗体、及人血清来源的IgG4多克隆抗体。可以为它们中的任一种、也可以为两种以上、也可以为3种以上、可以为4 种全部。
另外，通过本筛选方法所选择的单链抗体，如果与上述固定于多层脂质体的抗原结合、与其它抗原不结合，则可以作为特异性高的单链抗体加以利用。另一方面，通过本筛选方法所选择的单链抗体，包含与上述固定于多层脂质体的抗原结合且也与其它抗原结合的可能性。这样的单链抗体可以作为与两种以上不同抗原的共通部位结合的单链抗体、或作为单链抗体的氨基酸序列相同但与两种以上不同部位结合的单链抗体而加以利用。均可根据用途进行选择并利用，均为优选实施方式。
这里，关于与两种以上不同抗原的共通部位结合的单链抗体，例如如果将利用分别对于两种以上不同抗原进行的筛选所选择的单链抗体的氨基酸序列进行比较，则可以确定。这些对于本领域技术人员而言可以容易地理解。
另外，关于作为单链抗体的氨基酸序列相同但与两种以上不同部位结合的单链抗体，例如确认通过使用了某抗原的筛选所选择的单链抗体相对于其它抗原的结合性即可。这些对于本领域技术人员而言可以容易地理解。
其中，作为与两种以上不同抗体的共通部位结合的单链抗体，可列举例如：与两种以上不同抗体的轻链(L链)、具体是与λ链或κ链中包含的共通的部位结合的单链抗体。特别是，由于λ链或κ链的氨基酸序列与同种型无关系，因此，如果选择与λ链或κ链中包含的氨基酸序列结合的单链抗体，则即使其单链抗体为不同的同种型，也会识别其氨基酸序列并结合，这些对于本领域技术人员而言可以容易地理解。
这里，对于本领域技术人员而言，可以通过例如蛋白质印迹(Western Blot) 法等公知的方法对所选择的单链抗体与抗体的轻链(L链)中包含的氨基酸序列的结合、具体是与λ链或κ链中包含的氨基酸序列的结合进行确认。
对于用于选择与同种型无关系地与轻链(L链)中包含的氨基酸序列结合的单链抗体的作为抗原的抗体，没有特别限制，优选为IgA抗体，可列举例如人血清来源的IgA多克隆抗体等。
这里由于，考虑到例如IgG抗体、IgM抗体具有补体活性，而另一方面 IgA抗体不具有补体活性，则可以认为，在以IgG抗体为基准考虑的情况下，相比于IgM抗体而言，功能及结构与IgG抗体相差更远的会是IgA抗体，因此，例如与使用IgM抗体的情况相比，使用IgA抗体时更容易选择与轻链(L链)中包含的氨基酸序列结合的单链抗体。
另外由于，例如与形成五聚体的IgM抗体相比，形成单体或二聚体的IgA抗体的分子量较小，在多层脂质体上的分散性也高，因此与使用IgM抗体的情况相比，使用IgA抗体时筛选的效率更好。
进一步，IgA抗体也可以作为在粘膜中治疗效果高的抗体药物加以利用。
[将抗原与多层脂质体结合的工序]
作为将抗原与多层脂质体结合的方法，只要抗原不从多层脂质体游离则没有特别限制。例如，可以依照非专利文献1中记载那样的公知的方法进行结合。具体而言，可列举：向抗原和多层脂质体的混合液添加以摩尔比计过量的2-亚氨基硫烷盐酸盐，在搅拌的同时使其反应等。可列举例如：向抗原和多层脂质体的混合液添加以摩尔比计为抗原的10倍量的2-亚氨基硫烷盐酸盐，于25℃搅拌3小时以上的同时使其反应等。
<(2)准备展示单链抗体的噬菌体文库的工序>
[展示单链抗体的噬菌体文库]
作为噬菌体文库，只要是展示单链抗体的噬菌体文库则没有特别的限制，可以使用公知的文库、市售的文库。对单链抗体的来源动物没有特别的限制，优选对抗原的结合能力较大的动物，可列举人、大鼠、小鼠、兔、鸡、山羊、绵羊、牛、马、犬、猫、猴等，更优选为人、大鼠、小鼠、兔、鸡、山羊，进一步优选为小鼠、兔，特别优选为兔。
作为构建噬菌体文库的方法，可列举例如：日本特愿2013-233096号公报中记载那样的公知的方法。
使用免疫动物的情况下，例如可以如下所述地进行。对免疫动物施用特定的抗原，从该免疫动物的脾脏获得全部RNA，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来构建cDNA文库。下面，使用给定的引物，利用PCR扩增重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因、及轻链(L链)的可变区(VL结构域)的基因。
作为使用兔作为免疫动物情况下的引物，只要可以利用PCR特异性地扩增目标基因即可，没有特别的限制，作为扩增重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因的正义引物，可列举例如：
5’-AAAAAGGCCATGGCCCAGTCGGTGGAGGAGTCCRGG-3’(序列号 1，在本说明书中也称为Nco-VH1S)，
5’-AAAAAGGCCATGGCCCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAG-3’(序列号 2，在本说明书中也称为Nco-VH2S)，
5’-AAAAAGGCCATGGCCCAGTCGYTGGAGGAGTCCGGG-3’(序列号 3，在本说明书中也称为Nco-VH3S)，
5’-AAAAAGGCCATGGCCCAGSAGCAGCTGRWGGAGTCCGG-3’(序列号4，在本说明书中也称为Nco-VH4S)等，
作为反义引物，可列举例如：
5’-TCCACCACTAGTGACGGTGACSAGGGT-3’(序列号5，在本说明书中也称为VH-SpeAS)等。
作为扩增轻链(L链)的可变区(VL结构域)的基因的正义引物，可列举例如：
5’-AATTAAGGATCCGAGCTCGTGMTGACCCAGACTSCA-3’(序列号 6，在本说明书中也称为Bam-Vκ1S)，
5’-AATTAAGGATCCGAGCTCGATMTGACCCAGACTSCA-3’(序列号 7，在本说明书中也称为Bam-Vκ2S)，
5’-AATTAAGGATCCGAGCTCGTGATGACCCAGACTGCA-3’(序列号 8，在本说明书中也称为Bam-Vκ3S)，
5’-AATTAAGGATCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCGYCCTC-3’(序列号9，在本说明书中也称为Bam-Vλ4S)等，
作为反义引物，可列举例如：
5’-TATATATGCGGCCGCCGAACSTKTGAYSWCCAC-3’(序列号10，在本说明书中也称为Vκ-Not AS)，
5’-TTTAAATTTGCGGCCGCCGAACCTGTGACGGTCAG-3’(序列号 11，在本说明书中也称为Vλ-Not AS)等。
需要说明的是，基于碱基的IUPAC命名法，W表示A或T，R表示A 或G，M表示A或C，K表示T或G，Y表示T或C，S表示G或C，H表示A、C或T，B表示G、C或T，V表示A、G或C，D表示A、G或T， N表示A、G、C或T。
下面，进行用于将这些PCR产物插入噬菌粒载体的基于给定的限制酶的处理等。另外，对于噬菌粒载体也进行基于给定的限制酶的处理等。并且，将经过了限制酶处理后的各基因插入经过了限制酶处理后的噬菌粒载体。
这样地，通过将插入了重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因、及轻链 (L链)的可变区(VL结构域)的基因的重组噬菌粒载体导入宿主细胞(例如大肠杆菌)，进一步使其感染辅助噬菌体而进行培养，可以使培养上清液中产生展示兔来源单链抗体的噬菌体的文库。在此使用的辅助噬菌体的种类没有特别限制，可列举例如：VCSM13等。
<(3)从噬菌体文库选择展示与结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体的工序(选择工序)>
本工序(选择工序)包括：将抗原与在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体结合的工序(结合工序)、通过洗涤将展示未与结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体除去的工序(洗涤工序)、以及使展示与结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体从该抗原解离(洗脱)的工序(洗脱工序)。
<(3-1)结合工序>
本工序将抗原与在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体结合的工序。作为该方法，只要可以使两者充分结合则没有特别的限制。例如，可以在如下的条件下进行。
(抗原和噬菌体文库的量比)
就抗原和噬菌体文库之比而言，只要可以使两者充分结合则没有特别的限制。作为文库中的总噬菌体数:抗原分子数，通常为1:5以上、优选为1: 100以上、更优选为1:1000以上。通过在该范围内，抗原分子数相对于在噬菌体表面表达的单链抗体是足够的，可以期待两者间进行充分结合。
(溶剂)
对于将抗原与在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体结合的情况下的溶剂的种类，只要可以使两者充分结合则没有特别的限制。例如，可以使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)等在该技术领域中被使用的常规溶剂。
(温度)
作为将抗原与在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体结合的情况下的温度，只要可以使两者充分结合则没有特别的限制，为了避免分解、变性等，例如，优选为室温(例如25℃)、更优选为低温(例如4℃)。
(时间)
作为将抗原与在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体结合的情况下的结合时间，只要可以使两者充分结合则没有特别的限制，例如为30 分钟以上、优选为1小时以上、更优选为过夜。
(其它)
对于抗原和在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体，优选例如一边进行旋转一边使它们结合、从而使得它们在反应中得到充分的搅拌。另外，对于将两者结合时使用的管等反应容器，优选预先进行封闭。作为封闭剂，可列举公知的那些，可列举例如添加了牛血清白蛋白(BSA)的那些等。另外，也可将这样的封闭剂预先添加至在结合中使用的溶剂中等。
<(3-2)洗涤工序>
本工序为通过洗涤而将展示未与结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体除去的工序。该方法只要可以通过洗涤而将展示未与抗原结合的展示单链抗体的噬菌体除去则没有特别的限制。例如，可以在如下的条件下进行。
(离心分离及溶剂交换)
在抗原和在噬菌体文库中的噬菌体表面表达的单链抗体的结合反应之后，通过离心分离，与结合于多层脂质体的抗原结合的噬菌体发生沉淀，未结合的噬菌体包含在上清液中。因此，可以通过在除去上清液后向颗粒添加溶剂而进行悬浮，从而选择性获得与结合于多层脂质体的抗原结合的噬菌体。
对此时使用的溶剂没有限制，但优选与在上述“(3-1)结合工序”中使用的溶剂相同，可以使用PBS等。另外，可预先添加BSA等封闭剂等。进一步，在将向颗粒添加这样的溶剂所得到的悬浮液转移至新的管等容器的情况下，优选对该容器也同样地预先进行封闭。另外，也可将这样的封闭剂预先添加至在结合中使用的溶剂中等。
作为离心分离的条件，只要是能够将与结合于多层脂质体的抗原结合的噬菌体和未结合的噬菌体分离的条件则没有特别的限制。可列举例如，于 4℃、以20.000g进行2分钟离心分离。该离心分离及溶剂交换，可以单次也可以重复多次，通常为2次以上，优选重复3次以上。
<(3-3)洗脱工序>
本工序为使展示与结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体从该抗原解离(洗脱)的工序。对该方法没有特别限制，可以按照例如非专利文献1中记载那样的公知的方法进行。
作为用于洗脱噬菌体的溶液，可以使用例如甘氨酸-盐酸缓冲液等。进一步，也可以在洗脱噬菌体后将该溶液中和，在该中和中，例如可以使用 Tris-HCl缓冲液等。
<(3-4)任意工序>
该选择工序也可以在除了上述3个工序(结合工序、洗涤工序、洗脱工序)以外包括适当的任意工序。可列举例如：扩增所选择的噬菌体的工序(扩增工序)、重复进行上述选择工序的工序(重复工序)、确定所选择的噬菌体的基因序列的工序(基因测序工序)、基于通过基因测序工序而确定的序列来选择克隆的工序(克隆选择工序)、对所选择的噬菌体所展示的单链抗体相对于抗原的结合活性进行评价的工序(抗原结合活性的评价工序)等。
[扩增工序]
本工序为扩增在选择工序中选择的噬菌体的工序。对该方法没有特别限制，例如可以在如下的条件下进行。
(噬菌体感染宿主细胞、及感染了噬菌体的宿主细胞的培养)
可以使在选择工序中选择的噬菌体感染宿主细胞从而使其扩增。对该方法没有特别的限制，可以按照非专利文献1中记载那样的公知的方法进行。作为宿主细胞，只要可以增殖噬菌体则没有特别的限制，例如可以使用大肠杆菌，作为菌株，可列举例如TG1株、XL-1Blue株等。另外，优选预先培养宿主细胞，使用指数增殖中期的宿主细胞。对于使噬菌体感染宿主细胞之后的该宿主细胞的培养条件也没有特别的限制，可列举例如于37℃、200rpm的振荡培养。
(辅助噬菌体感染宿主细胞、及噬菌体在培养上清液中的产生)
对于感染了噬菌体的宿主细胞，通过使其感染辅助噬菌体并进行培养，可以使培养上清液中分泌出展示单链抗体的噬菌体及单链抗体。对该方法没有特别的限制，可以按照非专利文献1中记载那样的公知的方法进行。此时，对辅助噬菌体没有特别限定，可列举例如VCSM13等。另外，对培养条件也没有特别的限制，可列举例如于37℃、200rpm的振荡培养。
[重复工序]
也可以使用在上述选择工序中所选择的噬菌体的文库，或进一步在上述扩增工序中扩增的噬菌体的文库，来重复上述选择工序。
通过重复将上述选择工序作为1个单位的轮，可以进一步选择与抗原的结合能力极大的噬菌体。该轮数没有特别限制。如果轮数多，则可获得与抗原的结合能力极大的噬菌体，而如果轮数少，则作为迅速而有效的筛选法而有用。本方法在可利用与现有技术相比较少的轮数来获得与抗原的结合能力极大的噬菌体的方面是有用的。
进行重复工序的次数通常为3次以下、优选为2次以下，更优选为1次以下、进一步优选为0次。进行重复工序的次数为0次，意味着仅进行1次选择工序。
[基因测序工序]
本工序为使用在上述选择工序中选择的噬菌体的文库来确定各噬菌体的重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因序列、及轻链(L链)的可变区(VL结构域)的基因序列的工序。本工序也可以在最终一轮和/或轮与轮之间进行。
对该方法没有特别的限制，可以按照非专利文献1中记载那样的公知的方法进行。例如可利用如下方法确定。
可以将利用上述扩增工序中的“噬菌体感染宿主细胞、及感染了噬菌体的宿主细胞的培养”一栏的方法而感染了噬菌体的大肠杆菌进行单一菌落化而分别亚克隆之后，对每个菌落分析重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因、及轻链(L链)的可变区(VL结构域)的基因的序列来确定。基因序列的分析可以使用公知的技术。另外，如果可以确定基因序列，则也可确定该基因序列所编码的氨基酸序列。像这样，如果可以确定基因序列，则也可以监测筛选的效率。
[克隆选择工序]
本工序为基于通过基因测序工序而确定的序列选择克隆的工序。是选择感染了包含期望的重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因序列、及轻链(L链) 的可变区(VL结构域)的基因序列的噬菌体的宿主细胞的克隆的工序。对于排除重复的克隆而言也是有效的。
本工序也可以在最终一轮和/或轮与轮之间进行。如果可以选择这样的克隆，则可以选择感染了相对于抗原的结合能力大的噬菌体的宿主细胞，可以更有效地进行筛选。
[抗原结合活性的评价工序]
本工序为对所选择的噬菌体所展示的抗体与抗原的结合活性进行评价的工序。只要可以评价所选择的噬菌体所展示的抗体与抗原的结合活性即可，该方法没有限制。
可列举例如：实施例3-2中记载的那样的方法。即，可列举下述方法：将含有噬菌粒的宿主细胞进行单一菌落化，将溶菌后的上清液适用于固定有抗原的板上，使用酶标仪测定吸光度。
本工序也可以在最终一轮和/或轮与轮之间进行。如果可以选择包含对抗原的结合能力大的抗体的基因的克隆，则可以使用该克隆而更有效地进行筛选。
此外，也可以如实施例4、实施例6中记载的那样，使用Biacore等测定解离速率常数koff、解离常数KD，将其作为指标。
测定解离速率常数koff、解离常数KD时的样品的制备方法没有特别限制，例如可以如实施例所示那样地，培养含有噬菌粒的宿主细胞的菌落后进行溶菌，使用离心分离后的上清液。
另外，关于噬菌体及单链抗体是否由宿主细胞分泌、或是否存在于周质(periplasm)内，可以如下地进行确认。例如，如果如实施例所示那样，使用噬菌粒载体扩增包含单链抗体基因的DNA片段，使其插入pET22载体(默克公司)等适当的载体，则会以在N末端侧融合有周质定位信号序列(pelB leader signal)、在C末端侧融合有组氨酸标签(6×His-tag)的形式表达单链抗体。培养包含该重组载体的宿主细胞，并通过适当的方法，可以从培养上清液及菌体回收菌体内可溶性级分。可以使用将该培养上清液及菌体内可溶性级分分别适用于可捕获组氨酸标签的柱等而得到的洗脱液，来测定解离常数KD。
以下，针对解离速率常数koff和解离常数KD进行说明。
[解离速率常数koff]
(定义)
在本说明书中，如后所述地定义了抗原和单链抗体的结合中的解离速率常数koff。解离速率常数koff通常为3.0×10-3s-1以下、优选为1.0×10-3s-1以下、更优选为4.0×10-4s-1以下、进一步优选为2.0×10-4s-1以下、更进一步优选为 5.0×10-5s-1以下、特别优选为4.0×10-5s-1以下、更特别优选为3.0×10-5s-1以下。解离速率常数koff越小，与抗原的结合能力越大，作为抗体越有用。
将抗原记为Ag、抗原浓度记为[Ag]、抗体记为Ab、抗体浓度记为[Ab]、抗原-抗体复合体记为Ag·Ab、抗原-抗体复合体浓度记为[Ag·Ab]、结合速率常数记为kon、解离速率常数记为koff时，抗原和单链抗体的结合反应可表示为下述式(1)、(2)那样。
[数学式1]
[数学式2].
如果将其变形，则可表示为下述式(3)那样。
[数学式3]
在Biacore等送液体系中，洗涤传感器芯片时，[Ab]＝0，因此上述式(3) 可表示为下述式(4)那样。
[数学式4]
进一步，如果将时间t＝0时的[Ag·Ab]设为[Ag·Ab]0，则可表示为下述式 (5)那样。
[数学式5]
使用Biacore等送液体系来计算抗原和单链抗体的结合中的解离速率常数的情况下，如果绘制横轴为t、纵轴为
[数学式6]
的测定图，则可以由其斜率计算出解离速率常数。
(解离速率常数koff的测定方法)
解离速率常数的测定方法没有特别的限制，例如：如果使用Biacore X-100(GEHealthcare公司)等公知的装置作为测定装置如上所述地绘制测定图，则可以由其斜率计算出解离速率常数。
[解离常数KD]
解离常数KD通常为3.0×10-8M以下、优选为1.0×10-8M以下、更优选为 6.0×10-9M以下、进一步优选为1.0×10-9M以下、更进一步优选为6.0×10-10M 以下、特别优选为1.0×10-10M以下。解离常数越小，与抗原的结合能力越大，作为抗体越有用。另外，一般抗体的KD为10nM左右，与此相对，本实施方式中的单链抗体的KD的范围如上所述，可知其结合能力远大于一般抗体。
(解离常数KD的测定方法)
解离常数KD的测定方法没有特别的限制，可以使用公知的方法。例如，作为测定装置，可以使用Biacore X-100(GE Healthcare公司)。
[单链抗体的VH链的互补决定区(CDR)]
单链抗体的VH链的互补决定区(CDR)包含CDR1、CDR2及CDR3。众所周知，这些中，对抗原的结合性最有贡献的是CDR3的氨基酸序列。
对于本实施方式中的单链抗体的VH链的CDR的氨基酸序列而言，只要构成抗体时该抗体与抗原结合则没有特别限定。其中，关于CDR3的氨基酸序列，在使用人血清来源的IgG多克隆抗体、人血清来源的IgA多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，优选本说明书的实施例中记载的VH链的CDR3的氨基酸序列。这是由于，它们在构成抗体时该抗体对抗原的结合性大。另外，这些中，更优选构成抗体时该抗体对抗原的结合性更大的那些。
另外，CDR1的氨基酸序列、CDR2的氨基酸序列也是同样的，在使用人血清来源的IgG多克隆抗体、人血清来源的IgA多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，优选本说明书的实施例中记载的VH链的CDR1、CDR2的氨基酸序列。这是由于，它们在构成抗体时该抗体对抗原的结合性大。另外，这些中，更优选构成抗体时该抗体对抗原的结合性更大的那些。
[与VH链的CDR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列]
本实施方式中的VH链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列均是只要在构成抗体时该抗体与抗原结合则没有特别限定。在使用人血清来源的IgG 多克隆抗体、人血清来源的IgA多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，可以是与本说明书的实施例中记载的 VH链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。
另外，在在使用人血清来源的IgG多克隆抗体、人血清来源的IgA多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，可以是在本说明书的实施例中记载的VH链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列中有1个～数个氨基酸发生了置换、缺失、插入或者添加的氨基酸序列。这里，1个～数个优选为1～5个，更优选为1个～3个。
另外，上述置换优选为保守性置换，保守性突变是指下述的突变：在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr之间互相置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val之间互相置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn之间互相置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His之间互相置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu之间互相置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr之间互相置换的突变。
作为保守性置换，可列举从Ala向Ser或Thr的置换，从Arg向Gln、 His或Lys的置换，从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换，从Asp 向Asn、Glu或Gln的置换，从Cys向Ser或Ala的置换，从Gln向Asn、 Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换，从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换，从Gly向Pro的置换，从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换，从Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换，从Leu向Ile、Met、Val或Phe 的置换，从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换，从Met向Ile、Leu、 Val或Phe的置换，从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换，从Ser向 Thr或Ala的置换，从Thr向Ser或Ala的置换，从Trp向Phe或Tyr的置换，从Tyr向His、Phe或Trp的置换，以及从Val向Met、Ile或Leu的置换。
另外，只要是构成抗体时该抗体与抗原结合，该氨基酸序列也可以是经过修饰的。作为该修饰，可列举酰胺化、脂质链的加成(脂肪族酰化(棕榈酰化、肉豆蔻酰化等)、异戊烯基化(法尼基化、香叶基香叶基化等)等)、磷酸化(丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基等中的磷酸化)、乙酰化、糖链的加成(N-糖基化、O-糖基化)等。
[单链抗体的VL链的互补决定区(CDR)]
单链抗体的VL链的互补决定区(CDR)包含CDR1、CDR2及CDR3。众所周知，这些VL链的CDR的氨基酸序列也有助于对抗原的结合性。
对于本实施方式中的单链抗体的VL链的CDR的氨基酸序列而言，只要构成抗体时该抗体与抗原结合则没有特别限定。关于CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列，在分别使用人血清来源的IgG多克隆抗体、人血清来源的 CDR1、CDR2、IgA多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，优选为本说明书的实施例中记载的VL链的CDR3 的氨基酸序列。这是由于，它们在构成抗体时该抗体对抗原的结合性大。另外，这些中，更优选构成抗体时该抗体对抗原的结合性更大的那些。
[与VL链的CDR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列]
与上述“与VH链的CDR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列”中记载的内容相同。
[单链抗体的VH链的框架区(FR)]
单链抗体的VH链的框架区(FR)包含FR1、FR2、FR3及FR4。众所周知，这些VH链的FR的氨基酸序列也有助于对抗原的结合性。
对于本实施方式中的单链抗体的VH链的FR的氨基酸序列而言，只要构成抗体时该抗体与抗原结合则没有特别限定。关于FR1、FR2、FR3、FR4 的氨基酸序列，在分别使用人血清来源的IgG多克隆抗体、人血清来源的IgA 多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，优选本说明书的实施例中记载的VH链的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列。这是由于，它们在构成抗体时该抗体对抗原的结合性大。另外，这些中，更优选构成抗体时该抗体对抗原的结合性更大的那些。
[与VH链的FR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列]
与上述“与VH链的CDR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列”中记载的内容相同。
[单链抗体的VL链的框架区(FR)]
单链抗体的VL链的框架区(FR)包含FR1、FR2、FR3及FR4。众所周知，这些VL链的FR的氨基酸序列也有助于对抗原的结合性。
对于本实施方式中的单链抗体的VL链的FR的氨基酸序列而言，只要构成抗体时该抗体与抗原结合则没有特别限定。关于FR1、FR2、FR3、FR4 的氨基酸序列，在分别使用人血清来源的IgG多克隆抗体、人血清来源的IgA 多克隆抗体作为抗原、使用兔来源单链抗体作为单链抗体而实施本方法的情况下，优选本说明书的实施例中记载的VL链的FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，这是由于，它们在构成抗体时该抗体对抗原的结合性大。另外，这些中，更优选构成抗体时该抗体对抗原的结合性更大的那些。
[与VL链的FR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列]
与上述“与VH链的CDR的氨基酸序列具有实质的同源性的氨基酸序列”中记载的内容相同。
<1-2.第一发明中的第二实施方式>
本发明的第一发明中的第二实施方式为抗体的制造方法，其包括：利用第一实施方式中记载的筛选方法进行筛选的工序；确定所筛选的单链抗体的氨基酸序列的工序；基于所确定的氨基酸序列的可变区的序列而制成编码抗体的DNA序列的工序；以及使制成的DNA序列在宿主细胞中表达的工序。
<(1)利用第一实施方式中记载的筛选方法进行筛选的工序>
本工序是利用第一实施方式中记载的筛选方法进行筛选的工序，在其说明中，可适用前述的第一实施方式的说明。
<(2)确定缩筛选的单链抗体的氨基酸序列的工序>
本工序为确定所筛选的单链抗体的氨基酸序列的工序。只要可以确定所筛选的单链抗体的氨基酸序列，则该方法没有限制。
例如，可以基于通过前述的“基因测序工序”所确定的基因序列来确定氨基酸序列。
<(3)基于所确定的氨基酸序列的可变区的序列而制成编码抗体的DNA 序列的工序>
本工序中，只要可以基于所确定的氨基酸序列的可变区的序列制成编码抗体的DNA序列，则该方法没有限制。另外，由于编码各氨基酸的密码子是公知的，因此可以容易地确定编码特定的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
制作编码抗体的DNA序列的公知的方法有很多，例如可以将编码已利用确定氨基酸序列的工序而确定的氨基酸序列的可变区(V结构域)的DNA 序列与编码期望的恒定区(C结构域)的DNA连接并将其装配至表达载体，或将编码抗体的可变区(V结构域)的DNA装配至包含恒定区的DNA的表达载体。此时，例如可以组装至以表达控制区域(例如：增强子/启动子)的控制为基础进行表达的方式的表达载体，利用该表达载体转化宿主细胞，使抗体产生。
此时，恒定区(C结构域)的氨基酸序列的来源动物没有限制。可以是与可变区(V结构域)的氨基酸的来源动物不同的动物，在这样的情况下组合而制作的抗体为嵌合抗体。可列举例如：人、大鼠、小鼠、山羊、绵羊、牛、马、犬、猫、猴等，优选为人。在可变区(V结构域)的氨基酸的来源动物不是人、恒定区(C结构域)的氨基酸序列的来源动物是人的情况下，组合而制作的抗体为人源化抗体。
另外，DNA序列编码的抗体不需要是免疫球蛋白，可以为例如：scFv、 Fv、Fab、Fab’、或F(ab’)2等。
(编码人源化抗体的DNA序列)
以下，以编码人源化抗体的DNA序列为例进行说明，但如上所述，恒定区(C结构域)的氨基酸序列的来源动物不受限制。
人源化抗体指的是也被称为重构(reshaped)人抗体的修饰抗体。在本实施方式中，人源化抗体可以通过将利用第一实施方式中记载的筛选方法筛选的单链抗体的CDR移植至人抗体的互补决定区而构建。其常见基因重组手段也是已知的。记载于例如：国际公开2013/125654号小册子、欧洲专利申请公开第EP239400号公报、国际公开96/02576号小册子等。
在本实施方式中，例如，由以在末端部具有重叠部分的方式制作的数个寡核苷酸、通过PCR法合成下述DNA序列，即设计成了使得利用第一实施方式中记载的筛选方法筛选的单链抗体的CDR和人抗体的FR连接的DNA 序列。可以通过将得到的DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，然后装配至表达载体，将其导入宿主并使其产生而得到。
就经由CDR连接的人抗体的FR而言，可选择互补决定区形成良好的抗原结合部位的那些。也可以根据需要置换在抗体的可变区中的框架区的氨基酸而使得人源化抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位。该方法例如记载于：Sato K.et al.,Cancer Research1993,53:851-856等。另外，FR可以与不同类或亚类的人抗体来源的框架区进行置换。该方法例如记载于：国际公开99/51743号小册子。
另外，制作人源化抗体时，也可以用其它氨基酸置换可变区(例如：FR)、恒定区中的氨基酸等。可以使用日本血栓止血学会志4(3):193-200,1993中记载的方法。也可以如该文献中记载的那样，在对所确定的可变区的氨基酸序列和位于数据银行的人抗体的可变区的氨基酸加以比较，选择两者的骨架 (FR)最类似的人抗体基因之后，通过计算机图表分析其高次结构，确定最适的可变区的氨基酸序列。进一步，也可以在装配至表达载体、导入至宿主细胞而产生抗体时，进行为了有效地产生而必要的氨基酸的置换等。
氨基酸的置换例如为低于15个、低于10个、8个以下、7个以下、6 个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选为1～5 个氨基酸、更优选为1个或2个氨基酸的置换，置换抗体应与未置换抗体在功能上等同。置换优选为保守性的氨基酸置换，保守性的氨基酸置换是指在电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸间的置换。性质类似的氨基酸可分类为例如：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
<(4)使制成的DNA序列在宿主细胞中表达的工序>
在本工序中，只要使制成编码抗体的DNA序列的工序中制成的DNA 序列在宿主细胞中表达即可，该方法没有限制。
例如，用于生产的抗体的宿主大多为哺乳动物起源的宿主，对于本领域技术人员而言，可以适当选择最适于表达想要表达的基因产物的特定的宿主细胞。作为通常的宿主细胞系，可列举CHO来源的细胞株(中国仓鼠卵巢细胞类)、CV1(猴肾脏类)、COS(制作SV40T抗原的CV1的衍生物)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag 3.653(小鼠骨髓瘤)、293(人肾脏)、及293T(制作SV40T 抗原的293的衍生物)等，但不限于这些。宿主细胞系可以从各种制造商、 ATCC等机构或文献中记载的论文发表机构获取。
<(5)任意工序>
在宿主细胞中表达的工序后，也可以设定分离、纯化该抗体的工序。对该方法没有特别限制，可以适当组合公知的分离、纯化法来分离、纯化抗体。
可列举例如：离子交换色谱等利用带电差异的方法、透析法、超滤法、凝胶过滤法、及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等主要利用分子量差异的方法、亲和层析法等利用特异性的亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳法等利用等电点差异的方法等。
<2.第二发明>
本发明的第二发明包括以下第一实施方式～第六实施方式。
第一实施方式：对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数的单链抗体。
第二实施方式：人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂，其包含载体和通过化学键而键合于载体的表面的第一实施方式所述的单链抗体。
第三实施方式：对于人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。
第四实施方式：人血清来源的IgA多克隆抗体的分离剂，其包含载体和通过化学键而键合于载体的表面的第三实施方式所述的单链抗体。
第五实施方式：对于人来源抗体的L链具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。
第六实施方式：人来源抗体的分离剂，其包含载体和通过化学键而键合于载体的表面的第五实施方式所述的单链抗体。
<2-1.第二发明中的第一实施方式>
本发明的第二发明中的第一实施方式为：对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数的单链抗体。
该单链抗体优选进一步为针对人血清来源的IgA多克隆抗体的抗体，更优选为对于人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数。另外，该单链抗体优选与这些抗体的L链结合，更优选与κ链结合。
在本实施方式中的关于其他的说明中，可适用前述的第一发明的说明。
<2-2.第二发明中的第二实施方式>
本发明的第二发明中的第二实施方式为：人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂，其包含载体和通过化学键而键合于载体的表面的第二发明中的第一实施方式所述的单链抗体。
[人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂]
第一实施方式的单链抗体可以利用其抗体结合性，作为人血清来源的 IgG多克隆抗体的分离剂而加以利用。该分离剂可以用于抗体的纯化或除去、利用抗体的诊断、治疗、检查等。
本实施方式的分离剂具有第一实施方式的单链抗体被固定于水不溶性的固相支撑体的形态。
[水不溶性载体]
作为所使用的水不溶性载体，可列举：玻璃珠、硅胶等无机载体，包括交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类的有机载体，以及通过将它们组合而得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等，其中，亲水性载体由于非特异性吸附较少、对第一实施方式的单链抗体的选择性良好，故优选。这里所说的亲水性载体，是指将构成载体的化合物制成平板状时与水的接触角为60度以下的载体。作为这样的载体的代表例，可列举由纤维素、壳聚糖、葡聚糖等多糖类，聚乙烯醇、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝聚乙烯，聚丙烯酰胺接枝聚乙烯、玻璃等制成的载体。
作为市售品，可以示例出作为多孔性纤维素凝胶的GCL2000、GC700、烯丙基葡聚糖和亚甲基二丙烯酰胺以共价键交联而成的Sephacryl S-1000、作为丙烯酸酯类的载体的Toyopearl、作为琼脂糖类的交联载体的 SepharoseCL4B，作为经环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的Eupargit(オイパーギット)C250L等。其中，在本实施方式中并不仅仅限定于这些载体、活化载体。上述的载体可以分别单独使用，也可以混合任意2种以上。另外，作为本实施方式中使用的水不溶性载体，从本分离剂的使用目的及方法考虑，优选表面积较大，优选具有许多适当大小的细孔、即优选为多孔性。
作为载体的形态，可以为珠状、纤维状、膜状(也包括中空纤维)等中的任意形态，可以选择任意形态。从制作具有特定的排阻极限分子量的载体的容易度的方面出发，特别优选使用珠状。珠状的平均粒径为10～2500μm的那些容易使用，尤其是从单链抗体固定化反应的容易度的方面考虑，优选在 25μm～800μm的范围。
进一步，如果在载体表面存在可用于单链抗体的固定化反应的官能团，则有利于单链抗体的固定化。作为这些官能团的代表例，可列举羟基、氨基、醛基、羧基、硫羟基、硅烷醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚胺基、酸酐基、碘乙酰基等。
在将单链抗体固定化至上述载体时，为了通过减小单链抗体的空间位阻而使分离效率提高、进一步抑制非特异性结合，更优选经由亲水性间隔物进行固定化。作为亲水性间隔物，优选使用例如：两末端利用羧基、氨基、醛基、环氧基等取代而成的聚环氧烷的衍生物。
对于向上述载体导入的单链抗体及作为间隔物使用的有机化合物的固定化方法及条件没有特别限定，可示例出通常在将蛋白质、肽固定于载体时所采用的方法。可列举：使载体与溴化氰、环氧氯丙烷、二缩水甘油醚、甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯(tresylchloride)、肼等反应而使载体活化(转变为比载体原本具有的官能团更容易与单链抗体发生反应的官能团)，与单链抗体发生反应、从而固定化的方法；以及基于向存在载体和单链抗体的体系添加碳二亚胺这样的缩合试剂、或戊二醛这样的在分子中具有多个官能团的试剂而进行缩合、交联的固定化方法。但更优选采用在分离剂的灭菌时或利用时单链抗体不会容易地从载体脱离的固定化方法。
[具体例]
作为人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂及其制造方法的具体例，可列举例如：实施例8中记载的那样的HiTrap NHS-活化HP柱(GE Healthcare) 及使用其的第一实施方式涉及的单链抗体的固定化方法。简而言之，将 Sepharose(珠状的琼脂糖载体)的羧基利用NHS进行酯化，与经过了纯化的第一实施方式涉及的单链抗体的氨基形成酰胺键而使其固定化。对于未反应的NHS酯，可以添加乙醇胺进行封闭。
[关于其他]
在本实施方式中的关于其他的说明中，可适用前述的第一发明、及第二发明中的第一实施方式的说明。
<2-3.第二发明中的第三实施方式>
本发明的第二发明中的第三实施方式为对于人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。
该单链抗体优选进一步为针对人血清来源的IgG多克隆抗体抗的抗体，更优选对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数。另外，该单链抗体优选与这些抗体的L链结合，更优选与κ链结合。
在本实施方式中的关于其他的说明中，可适用前述的第一发明的说明。
<2-4.第二发明中的第四实施方式>
本发明的第二发明中的第四实施方式为人血清来源的IgA多克隆抗体的分离剂，其包含载体和通过化学键而键合于载体的表面的第二发明的第三实施方式所述的单链抗体。
在本实施方式中的关于其他的说明中，可适用前述的第一发明、第二发明中的第二实施方式、第二发明中的第三实施方式的说明。
<2-5.第二发明中的第五实施方式>
本发明的第二发明中的第五实施方式为对于人来源抗体的L链具有 1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。
该单链抗体优选为针对人血清来源的IgG多克隆抗体和/或人血清来源的IgA多克隆抗体的抗体，更优选对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有 3.0×10-8M以下的解离常数、和/或对于人血清来源的IgA多克隆抗体具有 1.0×10-3s-1以下的解离速率常数。另外，该单链抗体优选与κ链结合。
在本实施方式中的关于其他的说明中，可适用前述的第一发明的说明。
<2-6.第二发明中的第六实施方式>
本发明的第二发明中的第六实施方式为人来源抗体的分离剂，其包含载体和通过化学键而键合于载体的表面的第二发明的第五实施方式所述的单链抗体。
在本实施方式中的关于其他的说明中，可适用前述的第一发明、第二发明中的第二实施方式、第二发明中的第五实施方式的说明。
实施例
以下，结合实施例对本发明进行更为详细的说明，但本发明在不脱离该中心的范围内，不限定于下述的实施例。另外，为求方便，实施例编号、比较例编号有时是不连续的。
<1.模型实验>
以下记载了在本发明的第一发明涉及的筛选法的实施例之前，从噬菌体文库中筛选与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的小鼠来源单链抗体(以下，有时称为“抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体”)的方法。此时，作为比较实验，也针对使用未展示小鼠来源单链抗体的噬菌体文库的情况进行了记载。进一步，在任一情况下均记载了使用多层脂质体的情况和使用免疫管的实验。
<1-1.多层脂质体与人血清来源的IgG多克隆抗体的结合>
将10μmol的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1μmol的磷酸二鲸蜡酯 (DCP)、0.5μmol的N-(4-(对马来酰亚胺苯基)丁酰基)二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (MPB-DPPE)溶解于氯仿5ml中，在100ml梨型瓶中在减压下蒸馏除去氯仿。
接着，将在烧瓶内壁形成的磷脂薄膜于50℃下利用3ml的PBS进行水合，使其形成多层脂质体(MLVs)。于25℃、以20.000g进行2分钟的离心分离，除去上清液。将该操作再重复2次。
利用3ml的PBS进行悬浮，于4℃保存(有时将其称为“反应性MLVs”)。将1ml的反应性MLVs于25℃、以20.000g进行2分钟的离心分离。将人血清来源的IgG多克隆抗体(Sigma，#I4506)溶解于PBS使其达到1mg/ml，在该溶液中分散了上述离心分离后的反应性MLVs的颗粒。
加入以摩尔比计为人血清来源的IgG多克隆抗体的10倍量的2-亚氨基硫烷盐酸盐(Sigma)，于25℃搅拌3小时以上的同时进行培养。之后，于25℃、以20.000g进行2分钟的离心分离，除去上清液，利用1ml的PBS进行悬浮。将该离心分离和上清液的除去、及在1ml的PBS中的悬浮作为1个单元，进一步重复了3次。
将得到的悬浮液作为人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs于4℃保存。对于被固定于MLVs的人血清来源的IgG多克隆抗体量，通过DC蛋白测定进行了定量。
<1-2.人血清来源的IgG多克隆抗体向管的固定>
向免疫管(Immunotube；Nunc公司，Maxisorp(注册商标))加入利用PBS 配制为浓度10μg/ml的人血清来源的IgG多克隆抗体(Sigma，#I4506)溶液 1ml，于4℃培养过夜。之后，利用PBS洗涤5次，加入2％BSA-PBS 1ml 培养1小时。
之后，在与噬菌体文库混合时，利用PBS进一步洗涤5次后添加噬菌体文库溶液而使用。
需要说明的是，尽管是使用了兔血清来源的IgG多克隆抗体的情况，但在非专利文献1中显示：与将抗体固定至多层脂质体的情况下与多层脂质体非特异性结合的抗体的比例相比，在将抗体固定至管的情况下与管非特异性结合的抗体的比例非常大。因而对于本领域技术人员而言可以容易地理解：在使用人血清来源的IgG多克隆抗体的情况下也是同样的。
<1-3.展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的噬菌体的文库的制备>
委托合成了包含pelB leader的基因序列、Nco I位点、Spe I位点、柔性接头(G4S)3的基因序列、BamH I位点、Not I位点、FLAG-tag的基因序列、 c-myc-tag的基因序列、Amber终止密码子(TAG)及gIIIp外壳蛋白质的基因 (缺失了N末端侧的250个氨基酸残基)的DNA，插入至pT7Blue(默克公司) 的Xba I/BamH I位点。将该pT7Blue重组噬菌粒载体作为pPLFMAδ250gIIIp，用于一系列的噬菌体展示的实验。
利用PCR扩增由小鼠杂交瘤CRL-1786株(ATCC)确定的抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因，并将其导入重组噬菌粒载体pPLFMAδ250gIIIp的Nco I/Not I位点。
利用该重组噬菌粒载体转化大肠杆菌TG1，接菌于2×YT培养基(含有 1％葡萄糖，50mg/L氨苄青霉素)10ml中。在200ml锥形瓶中于37℃、以 200rpm培养过夜(前培养)。
将前培养液接菌至50ml的2×YT培养基(含有1％葡萄糖，50mg/L氨苄青霉素)中，并使OD600＝0.1，于30℃、以200rpm进行振荡培养。培养至 OD＝1.0附近后，将辅助噬菌体VCSM13加入至培养液、并使感染复数 (MOI)＝20，于37℃培养30分钟。于37℃以3000g离心分离10分钟，除去上清液，温和悬浮于2×YT培养基(含有50mg/L氨苄青霉素、35mg/L卡那霉素)50ml中。于30℃、以200rpm振荡12小时以上，在培养上清液中生产了展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的噬菌体。
通过离心分离回收上清液，通过PEG沉淀进行浓缩的同时再悬浮于1ml 的PBS中，获得了展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的噬菌体的文库。
<1-4.非展示噬菌体的文库的制备>
利用未插入抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因的重组噬菌粒载体pPLFMAδ250gIIIp来转化大肠杆菌TG1，除此以外，与上述1-3同样地进行，获得了非展示噬菌体。
<1-5.淘选>
(伪噬菌体文库的制备)
将在上述1-3及1-4中获得的展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的噬菌体的文库和非展示噬菌体的文库以表1所示的比例混合，制备了伪噬菌体文库。
[表1]
表1.伪噬菌体文库的组成
[实施例1-1]
(使用了人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs的淘选)
如下所述地，作为上述伪噬菌体文库而采用了条件1，使用在上述1-1 中制备的人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs如下所述地实施了淘选。
(轮)
首先，对在各轮中进行的操作进行说明。
加入人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs、使得IgG量为10μg，进行涡流混合。将其于25℃、以20.000g离心分离2分钟，除去上清液，加入0.9ml的2％BSA-PBS进行再悬浮。
另一方面，将伪噬菌体文库溶液于25℃、以20.000g离心分离2分钟，回收上清液。将100μl的上清液加入管进行涡流混合，于25℃使用旋转器翻转混合1小时，使人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs和伪噬菌体文库结合而进行反应。
将上述结合反应液和1ml的2％BSA-PBS混合，于25℃、以20.000g离心分离2分钟，除去上清液(洗涤)。将洗涤操作重复5次。
(通过淘选而选择的噬菌体的获得)
向上述管内的人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs添加10mM 甘氨酸-HCl(pH1.5)0.9ml进行悬浮，转移至经BSA封闭的管。并且，进一步于室温(或4℃)将管翻转混合10分钟而将噬菌体洗脱。
将从上述管回收的噬菌体洗脱液0.9ml和0.1ml的2M Tris-HCl溶液混合而中和了噬菌体洗脱液。
另一方面，将大肠杆菌TG1的培养液接菌于新LB培养基10ml、使得 OD＝0.1，于30℃进行了培养。
将中和后的洗脱液1ml和培养的大肠杆菌TG1的培养液1ml混合，于 37℃培养1小时。培养之后，添加至2×YT培养基(含有1％葡萄糖、50mg/L 氨苄青霉素)中，于30℃、以200rpm培养至OD600＝1.0为止。
向该培养液添加辅助噬菌体VCSM13、使得感染复数(MOI)＝20，于37℃培养30分钟。于30℃、以1500rpm离心分离15分钟后抛弃上清液，使菌体再分散于2×YT培养基(含有50mg/L氨苄青霉素、50mg/L卡那霉素)50ml 中。将其于30℃、以200rpm进行12小时培养，在培养上清液中生产噬菌体。
之后，于30℃、以1500rpm离心分离15分钟后回收上清液，通过PEG 沉淀而进行了浓缩、纯化。最后分散于1ml的PBS，通过离心分离而除去凝聚物。
将到此为止的操作作为一轮。通过上述操作而进行了第1轮。
之后，将上述一轮再实施3次。即，进行至第4轮为止。从各轮中得到的菌落回收噬菌粒DNA。
[实施例1-2]
作为伪噬菌体文库而采用了条件2，除此以外，与实施例1-1同样地进行，并将其作为实施例1-2。
[比较例1-1]
作为上述伪噬菌体文库而采用了条件1，不使用人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs，而是使用上述1-2中制备的人血清来源的IgG多克隆抗体固定化管，如下所述地进行了淘选。
(轮)
对在各轮中进行的操作进行说明。
如上述1-2所述，向免疫管(Immunotube；Nunc公司，Maxisorp(注册商标))加入利用PBS配制为浓度10μg/ml的人血清来源的IgG多克隆抗体 (Sigma，#I4506)溶液1ml，于4℃培养过夜。之后，利用PBS洗涤5次，加入2％BSA-PBS1ml培养1小时。
接着，利用PBST洗涤5次，加入2％BSA-PBST 900μl，进一步加入伪噬菌体文库溶液100μl，于25℃培养1小时。
(通过淘选而选择的噬菌体的获得)
将大肠杆菌TG1的培养液接菌于新LB培养基10ml、使得OD＝0.1，于30℃进行了培养。
将洗脱液1ml和培养的大肠杆菌TG1的培养液1ml混合，于37℃培养 1小时。培养之后，添加至2×YT培养基(含有1％葡萄糖、50mg/L氨苄青霉素)中，于30℃、以200rpm培养至OD600＝1.0为止。
向该培养液添加辅助噬菌体VCSM13、使得感染复数(MOI)＝20，于37℃培养30分钟。于30℃、以1500rpm离心分离15分钟后抛弃上清液，使菌体再分散于2×YT培养基(含有50mg/L氨苄青霉素、50mg/L卡那霉素)50ml 中。将其于30℃、以200rpm进行12小时培养，在培养上清液中生产噬菌体。
之后，于30℃、以1500rpm离心分离15分钟后回收上清液，通过PEG 沉淀进行了浓缩、纯化。最后分散于1ml的PBS，通过离心分离而除去凝聚物。
将到此为止的操作作为一轮。通过上述操作而进行了第1轮。
之后，将上述一轮再实施3次。即，进行至第4轮为止。从各轮中得到的菌落回收噬菌粒DNA。
[比较例1-2]
作为伪噬菌体文库而采用了条件2，除此以外，与比较例1-1同样地进行，并将其作为比较例1-2。
<1-6.抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因的有无的确认>
由在实施例1-1、实施例1-2、比较例1-1、比较例1-2中回收的噬菌粒 DNA，确认了抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因的有无。
通过使用了1％琼脂糖凝胶的电泳将得到的噬菌粒DNA分离，并通过溴乙锭染色使其可视化。与未插入抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因的噬菌粒载体(pPLFMAδ250gIIIp)比较了泳动距离，目测确认了抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因的有无。
<1-7.淘选的结果>
表2-1及表2-2中示出了第1～4轮中的淘选前后的噬菌体数、淘选后的噬菌体数相对于淘选前的回收率。
另外，表3中显示了第1～4轮中的所获得的阳性克隆数(即，包含抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-小鼠来源的单链抗体的基因的克隆数)、和阳性克隆数相对于所获得的总克隆数的比例。进一步将该比例示于图1。
[表2-1]
表2-1
[表2-2]
表2-2
[表3]
表3
由上述结果可知，与将作为抗原的人血清来源的IgG多克隆抗体固定于管的方法相比，采用使其与多层脂质体结合的方法时，能够实现有效的淘选。
<2.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法>
以下，记载了从噬菌体文库中筛选与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体(以下，有时称为“抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体”)的方法。
<2-1.多层脂质体和人血清来源的IgG多克隆抗体的结合>
与上述1-1同样地进行，制备了人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs。
<2-2.展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的噬菌体的文库的制备>
首先，通过公知的方法用人血清来源的IgG多克隆抗体(Sigma，#I4506) 免疫了穴兔。从该兔的脾脏提取总RNA。
使用Superscript(注册商标)IV Reverse Transcriptase(Thermo FisherScientific公司)作为逆转录酶从总RNA制作了cDNA。将cDNA作为模板，使用序列号1～11的引物扩增了重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因、及轻链(L链)的可变区(VL结构域)的基因。
将扩增的VL基因导入pPLFMAδgIIIp载体的BamH I/Not I位点，将其制成了VL文库载体。此时的宿主细胞为大肠杆菌TG1。
下面，将从大肠杆菌将VL文库载体纯化、扩增而成的VH基因导入Nco I/Spe I位点，获得了展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的噬菌体文库载体(2.0×107个菌落)。此时的宿主细胞也是大肠杆菌TG1。
接着，将包含噬菌体文库载体的大肠杆菌TG1接菌于2×YT培养基(含有1％葡萄糖、50mg/L氨苄青霉素)50ml中，于30℃、以200rpm振荡培养至OD＝1为止。向该培养液添加辅助噬菌体VCSM13、使得感染复数 MOI＝20，于37℃培养1小时。于30℃、以1500rpm离心分离15分钟后抛弃上清液，将菌体悬浮于2×YT培养基(含有50mg/L氨苄青霉素、50mg/L 卡那霉素)50ml中，于30℃、以200rpm进行12小时以上培养，在培养上清液中生产噬菌体。
于4℃、以10000g进行15分钟的离心分离2次，将上清液作为噬菌体文库进行回收。进而，通过PEG沉淀浓缩了噬菌体文库，分散于1ml的1×PBS 中。
<2-3.淘选>
[实施例2]
使用上述2-2中制备的噬菌体文库、和上述2-1中制备的人血清来源的 IgG多克隆抗体固定化MLVs，如下所述地实施了淘选。
(轮)
对在各轮中进行的操作进行说明。
向1.5ml Eppendorf管加入2％BSA-PBS 1ml，于室温封闭1小时以上。对使用的全部管进行了该封闭。加入人血清来源的IgG多克隆抗体固定化 MLVs、使得IgG量为10μg，进行涡流混合。将其于4℃、以20.000g进行离心分离2分钟，除去上清液。向其中加入利用2％BSA-PBS稀释了10倍的噬菌体文库1ml，于4℃进行旋转翻转的同时培养过夜。
之后，于4℃、以20000g离心分离2分钟，除去上清液。加入2％BSA-PBS 1ml进行悬浮，转移至另一个Eppendorf管。将该离心分离、上清液的除去、利用2％BSA-PBS的悬浮、及转移至另一个Eppendorf管的操作作为一个单元，共计重复了3次。
(通过淘选而选择的噬菌体的获得)
接下来，于4℃、以20000g离心分离2分钟，除去上清液。加入10mM 甘氨酸-HCl(pH1.5)0.9ml进行悬浮，将溶液转移至另一个Eppendorf管。于 4℃进行旋转翻转的同时培养10分钟，将噬菌体洗脱。
于4℃、以20000g离心分离2分钟，将上清液转移至另一个Eppendorf 管。进一步，加入2M Tris-HCl(pH 8.0)0.1ml，中和了噬菌体洗脱液。
另一方面，加入预先进行了培养的指数增殖中期的大肠杆菌TG1的培养液1ml，于37℃培养30分钟。
将该溶液悬浮于2×YT培养基(含有1％葡萄糖、50mg/L氨苄青霉素)，于30℃、以200rpm进行振荡培养。使其增殖至OD＝1.0附近之后，添加 VCSM13、使得感染复数(MOI)＝20，于37℃培养30分钟，于30℃、以3000g 离心分离10分钟。
于30℃、以1500rpm离心分离15分钟后除去上清液，将菌体悬浮于50ml 的2×YT培养基(含有50mg/L氨苄青霉素、50mg/L卡那霉素)之后，于30℃、以200rpm培养12小时，在培养上清液中生产噬菌体。
之后，于4℃、以20000g离心分离2分钟，回收上清液，进行PEG沉淀(2次)，使其分散于1ml的PBS。最后，于4℃、以20000g离心分离2分钟，将上清液作为噬菌体溶液回收。
将到此为止的操作作为一轮。通过上述操作而进行了第1轮。
之后，将上述一轮再实施2次。即，进行至第3轮为止。从各轮中得到的菌落回收噬菌粒DNA。
[比较例2]
使用了未结合人血清来源的IgG多克隆抗体的多层脂质体，除此以外，与实施例2同样地进行，并将其作为比较例2。
<2-4.从噬菌体的回收到基因序列的测序>
由在实施例2、比较例2中回收的噬菌粒DNA，确认了抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的基因的有无。
通过使用了1％琼脂糖凝胶的电泳将得到的噬菌粒DNA分离，并通过溴乙锭染色使其可视化。与未插入抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的基因的噬菌粒载体(pPLFMAδ250gIIIp)比较了泳动距离，目测确认了抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的基因的有无。将已确认到该基因的插入的噬菌粒载体通过DNA测序分析(委托)进行了测序。
利用IMGT(http://www.imgt.org/)的Vquest搜索引擎进行了该基因内的 CDR区域的确定。
<2-5.淘选的结果>
图2中示出了实施例2及比较例2中的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的噬菌体数。
另外，图3中示出了用实施例2及比较例2中的第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的各噬菌体数分别除以淘选前的噬菌体数而得到的回收率(％)。
由上述结果可知，在实施例2中，回收率早在第2轮即已大幅增加。其中，需要补充说明的是，在使用常规免疫管的方法中，如果不至少到第3轮或第4轮以上，则无法得到迄今为止的回收率(％)。即，由此可知，通过使用多层脂质体，能够实现与现有技术相比明显有效的淘选。
<3-1.抗原结合活性评价1>
[实施例3-1]
对从在各轮中回收的含噬菌粒的大肠杆菌的颗粒单元(即，未进行单一菌落化，颗粒中包含的大肠杆菌所包含的噬菌体整体)得到的兔来源单链抗体，如下所述地评价了抗原结合活性。
向Maxisorp(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)板添加100μl的 PBS，使得人IgG1(Sigma，#I5154)、人IgG2(Sigma，#I5404)、人IgG3(Sigma， #I5654)、人IgG4(Sigma，#I4639)、人IgA(Sigma，#I4036)分别达到5μg/ml 的最终浓度，于4℃培养过夜(抗原的固定化)。
下面，利用PBS洗涤上述经固定化的板，加入10％的Blocking One-PBS(NACALAITESQUE)300μl，于25℃培养(封闭)1小时之后，利用 PBST洗涤板。
另一方面，分别向实施例2中的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时得到的含噬菌粒的大肠杆菌颗粒25ml中添加2.5ml的 Bugbuster(注册商标)(默克公司)、及2.5μL的Benzonase Nuclease(注册商标)(默克公司)而进行溶菌之后，于4℃、以10,000g离心分离15分钟，回收上清液。
利用10％Blocking One-PBST将其稀释至10倍，以每份100μl加入至上述经封闭及利用PBST洗涤之后的板，于25℃培养1小时。
接下来，利用PBST洗涤板，以每份100μl加入利用10％Blocking One-PBST稀释了10000倍的HRP标记抗c-myc抗体，于25℃培养1小时。
之后，利用PBST洗涤板，以每份100μl加入TMB溶液并培养5分钟，以每份100μl加入0.3M硫酸而终止反应。
使用酶标仪测定了在450nm下的吸光度。需要说明的是，以650nm为副波长。
图4示出其结果。由图4可知，作为相对于人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、人IgG4抗体的结合活性，通过仅1轮的淘选操作即显示出较大的吸光度。即，可知：尽管是1轮的淘选操作，与抗原特异性结合的噬菌体已发生了浓缩。
进一步可知：在第2轮结束时，除了人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3 抗体、人IgG4抗体以外，相对于人IgA抗体也特异性结合的噬菌体发生了浓缩。
<3-2.抗原结合活性评价2>
[实施例3-2]
对于从在各轮中回收的含噬菌粒的大肠杆菌的菌落得到的兔来源单链抗体，如下所述地评价了抗原结合活性。
将在实施例2中的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时得到的含噬菌粒的大肠杆菌的菌落在96孔深孔板内接菌于1ml的 Overnight Express(注册商标，默克)培养基中，于30℃、以1600rpm培养24 小时之后，通过离心分离而除去上清液。向其中添加0.2ml的Bugbuster、及0.2μL的Benzonase Nuclease进行溶菌之后，进行离心分离并回收上清液。在此之后与上述3-1相同。
图5、表4-1、表4-2中示出了对从在第1轮结束时所得到的48个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。其中，“文库”是指对从含噬菌粒的大肠杆菌的颗粒单元(即，未进行单一菌落化，颗粒中包含的大肠杆菌所包含的噬菌体整体)得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。另外，将OD值为0.1以上的情况作为阳性克隆，将低于0.1 的情况作为阴性克隆。
需要说明的是，作为在与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法中获得的克隆的名称，例如有时将“第1轮结束时的克隆号1”的克隆简称为“R1-1”、“I-1”。同样，例如有时将“第2轮结束时的克隆号1”的克隆简称为“R2-1”、“II-1”、将“第3轮结束时的克隆号1”的克隆简称为“R3-1”、“III-1”。
[表4-1]
表4-1
[表4-2]
表4-2
同样，在图6、表5-1、表5-2中示出了对从第2轮结束时所得到的48 个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。在此示出了相对于IgG1抗体、人IgG3抗体、人IgA抗体的结合活性的结果。其中，“文库”与上述同样地是指对从含噬菌粒的大肠杆菌的颗粒单元(即，未进行单一菌落化，颗粒中包含的大肠杆菌所包含的噬菌体整体)得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。另外，将OD值为0.1以上的情况作为阳性克隆，将低于0.1的情况作为阴性克隆。
[表5-1]
表5-1
[表5-2]
表5-2
同样，在图7-1～图7-8、表6-1～表6-5中示出了对从第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。需要说明的是，将OD值为0.1以上的情况作为阳性克隆，将低于0.1的情况作为阴性克隆。
[表6-1]
表6-1
克隆号 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
R3-1 0.0310 0.0370 0.0360 0.0180 0.0370 0.0240
R3-2 3.0800 3.1090 3.0940 3.1140 3.1180 0.0590
R3-3 2.8830 2.9510 2.8880 2.9560 2.6520 0.0340
R3-4 2.5980 2.7860 2.7350 1.7970 2.4910 0.0260
R3-5 2.9690 3.0340 3.0400 3.0120 2.9450 0.0280
R3-6 3.0750 3.0610 3.0590 3.0430 3.1060 0.0380
R3-7 3.0980 2.9180 3.0420 3.0640 3.0510 0.0550
R3-8 3.0140 3.0280 3.0250 3.0600 3.0920 3.0630
R3-9 3.1070 3.0960 3.0760 2.8800 3.0170 0.0420
R3-10 3.0930 3.1050 3.1540 2.7160 3.1220 0.0310
R3-11 3.0930 3.0690 3.0950 3.0400 3.0350 0.0280
R3-12 2.2380 2.5210 2.4300 0.6300 1.9520 0.0200
R3-13 2.8830 2.9640 2.9040 1.1880 2.8740 0.0200
R3-14 3.0970 3.0880 3.1320 2.9640 3.1210 0.0280
R3-15 1.2220 1.5330 1.5390 0.0480 1.1510 0.0280
R3-16 3.0640 3.0810 3.0930 1.5460 3.1160 0.0610
R3-17 3.1290 3.1580 3.0970 3.0340 3.1070 0.0650
R3-18 3.0470 3.0680 3.0980 1.9300 3.1070 0.0400
R3-19 3.0610 3.0910 3.1060 3.0340 3.1140 0.0230
R3-20 0.0820 0.1120 0.1160 0.0310 0.0730 0.0180
R3-21 3.0520 3.0760 3.0870 2.6270 3.0640 0.0970
R3-22 2.9310 3.0260 3.0840 1.5340 3.0600 0.0240
R3-23 3.0370 3.0550 3.0560 3.0220 3.0560 0.0440
R3-24 3.0680 3.0780 3.0790 3.0220 3.0820 0.0680
[表6-2]
表6-2
克隆号 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
R3-25 3.1060 3.1460 3.0560 3.1750 3.2120 0.0320
R3-26 3.0960 3.1000 3.0370 3.1440 3.1580 0.0370
R3-27 3.0960 3.1090 3.0770 3.0890 3.1390 0.0220
R3-28 3.1190 3.1290 3.0440 3.0720 3.1380 0.0220
R3-29 2.1340 3.0510 2.9840 0.1170 2.5800 0.0260
R3-30 3.0330 3.0940 3.0100 3.1070 3.0930 0.0300
R3-31 3.0970 3.0660 3.0280 3.0780 3.1250 0.0370
R3-32 3.0950 2.9880 2.9860 3.1500 3.0800 0.0380
R3-33 3.1380 3.1370 3.1400 3.1270 3.1660 0.0260
R3-34 3.0970 3.1190 3.1370 2.9870 3.1430 0.0200
R3-35 3.0740 3.1400 3.1190 3.0850 3.1080 0.0280
R3-36 3.0880 3.1110 3.1020 2.9920 3.1130 0.0180
R3-37 3.0650 3.0820 3.1260 2.1810 3.1020 0.0940
R3-38 2.7950 2.8820 2.7880 1.2760 2.7010 0.0180
R3-39 3.0760 3.0750 3.1010 2.9760 3.0900 0.0190
R3-40 3.0700 3.1080 3.1080 1.7450 3.1040 0.0400
R3-41 3.0470 3.0970 3.1200 3.1280 3.1680 0.0270
R3-42 3.1050 3.1300 3.1430 3.1020 3.1400 0.0200
R3-43 3.0960 3.1390 3.1510 3.0700 3.1530 0.0190
R3-44 3.0560 3.0620 3.1000 3.1210 3.1030 0.0220
R3-45 3.0570 3.0920 3.1290 2.9400 3.1150 0.0160
R3-46 3.0660 3.1220 3.0540 3.0390 3.1270 0.0170
R3-47 0.1210 0.1750 0.1800 0.0630 0.1080 0.0250
R3-48 3.0760 3.1180 3.1320 2.1820 3.1440 0.0200
[表6-3]
表6-3
克隆号 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
R3-49 3.0920 3.0680 3.0740 3.1260 3.2050 0.0330
R3-50 3.0680 3.0770 3.0960 2.1670 3.1910 0.0200
R3-51 3.0400 3.0480 3.0990 3.0520 3.1630 0.0150
R3-52 3.0640 2.9840 3.0860 3.1580 3.1460 0.0220
R3-53 3.0380 3.0300 3.0860 3.1260 3.1210 0.0580
R3-54 3.0390 3.0520 3.0950 3.0980 3.1660 0.0280
R3-55 3.0520 3.0110 3.1080 3.0960 3.1000 0.0150
R3-56 3.0850 3.0440 3.0910 3.1430 3.1590 0.0540
R3-57 3.0850 3.1320 3.0830 3.0730 3.1420 0.1160
R3-58 3.0460 3.1360 3.0790 3.1140 3.1690 0.0300
R3-59 3.0720 3.1590 3.0710 2.9270 3.1420 0.0180
R3-60 3.0310 3.1390 3.0440 2.9530 3.1010 0.0350
R3-61 3.0360 3.0780 3.0130 3.0230 3.0780 0.0320
R3-62 3.0580 3.0910 3.0490 3.0700 3.1060 0.0320
R3-63 3.0300 3.0620 3.0450 2.9870 3.1170 0.0240
R3-64 3.0750 3.1320 3.0800 2.8780 3.1220 0.0220
R3-65 3.1030 3.0710 3.0540 3.1120 3.1280 0.0270
R3-66 3.0640 3.1340 3.0810 3.0090 3.1370 0.0230
R3-67 3.0520 3.0990 3.0780 2.6830 3.1160 0.0780
R3-68 3.0610 3.0780 3.0630 3.0960 3.0890 0.0760
R3-69 3.0400 3.0640 3.0600 3.0720 3.0470 0.0360
R3-70 3.0430 3.0990 3.0800 3.0040 3.0960 0.0300
R3-71 3.0520 3.0930 3.0790 3.0600 3.0980 0.0170
R3-72 3.0610 3.0880 3.0630 3.0740 3.1290 0.0340
[表6-4]
表6-4
克隆号 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
R3-73 3.0550 3.1000 3.0920 3.1200 3.1370 0.1650
R3-74 3.0070 3.0470 3.0610 3.0800 3.1430 0.0250
R3-75 3.0110 3.0500 3.0400 3.1240 3.1070 3.0610
R3-76 2.9820 3.0840 3.0820 1.2550 3.1270 0.0490
R3-77 3.0360 3.0540 3.0300 3.0740 3.1430 0.0280
R3-78 3.0060 3.0580 3.0560 2.8450 3.0970 0.0300
R3-79 3.0070 3.0510 3.0490 3.0620 3.1290 0.0280
R3-80 3.0410 3.0570 3.0630 2.9360 3.1410 0.0230
R3-81 3.0990 3.1640 3.1200 3.0440 3.1530 0.0410
R3-82 3.0570 3.1510 3.1250 2.6310 3.1620 0.0270
R3-83 3.1000 3.1090 3.1050 2.9730 3.1160 0.0570
R3-84 3.0610 3.1290 3.0800 2.9890 3.1080 0.0930
R3-85 3.0390 3.1480 3.0880 2.9480 3.0770 0.0270
R3-86 2.8250 3.0800 3.0730 0.1340 3.0630 0.0540
R3-87 3.0220 3.1040 3.0650 1.6500 3.0650 0.0210
R3-88 3.0200 3.1380 3.0920 1.8170 3.0970 0.0430
R3-89 2.9340 3.1590 3.1150 1.3950 3.1080 0.0170
R3-90 3.0200 3.1280 3.1080 2.9950 3.1010 0.0240
R3-91 3.0580 3.1570 3.0490 2.9740 3.1160 0.0280
R3-92 3.0360 3.0980 3.0980 2.9290 3.0950 0.0280
R3-93 3.0100 3.1110 3.0990 1.8240 3.0700 0.0470
R3-94 3.0280 3.0970 3.0310 3.0530 3.0950 0.0400
R3-95 3.0360 3.1210 3.1000 2.9770 3.0560 0.0230
R3-96 3.0810 3.1460 3.0000 3.0610 3.1210 0.0250
[表6-5]
表6-5
从以上的结果可知以下内容。
通过使用人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs，可以有效地回收与人血清来源的IgG多克隆抗体极其特异性结合的噬菌体。这里，通过一轮的淘选使总克隆数中的阳性克隆数的比例超过50％的结果，在现有技术中是困难而极其稀有的。另外，根据每重复一轮时阳性克隆数明显增加、结合量也明显增加，可认为使用了多层脂质体的本发明所涉及的筛选方法为非常高效的筛选技术。
另外，所分离的兔来源单链抗体大多与选自人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4抗体中的两种以上具有结合特异性。特别是与人 IgG1抗体和人IgG3抗体这两者的结合量相同的兔来源单链抗体，可认为其成为代替目前使用的蛋白A的亲和性配体的可能性较高。
进一步，虽然数量较少，但也存在除了人IgG1抗体、人IgG2抗体、人 IgG3抗体及人IgG4抗体以外，对人IgA抗体也显示除同等程度的吸光度的情况。可认为这表明与抗体的L链发生特异性结合。
<4.解离速率常数koff的测定>
[实施例4]
对于在第1轮结束时所得到的48个菌落、第2轮结束时所得到的48个菌落、及第3轮结束时所得到的96菌落中，在抗原结合活性评价2中吸光度超过2.5的各个菌落，使用Biacore X-100(GE Healthcare公司)进行了解离速率常数koff的测定。
(样品的制备)
将含噬菌粒的大肠杆菌的菌落在96孔深孔板内接菌于1ml的Overnight Express(注册商标，默克)培养基中，于30℃、以1600rpm培养24小时之后，通过离心分离而除去上清液。向其中添加0.2ml的Bugbuster、及0.2μL的 Benzonase Nuclease进行溶菌之后，进行离心分离并回收上清液。回收的上清液利用PBST稀释10倍。
(测定方法)
在以下测定条件下进行测定。
Sensor Chip(传感器芯片)：human IgG-coupled CM5(15000 RU)
Running buffer(运行缓冲区)：PBST
Binding time(绑定时间)：300秒
Dissociation time(解离时间)：180秒
Elution(洗脱)：10mM甘氨酸，pH 1.5
依照前述的解离速率常数koff的计算方法计算解离速率常数koff，将按从小到大的顺序从1位到140位的排名示于表7-1～表7-5。
[表7-1]
表7-1
序位 克隆号 koff(s^-1) IgG1 IgG3 IgA
1 R3-75 2.78E-04 3.0500 3.1240 3.0610
2 R3-23 4.08E-04 3.0550 3.0220 0.0440
3 R3-26 5.71E-04 3.1000 3.1440 0.0370
4 R3-43 6.41E-04 3.1390 3.0700 0.0190
5 R3-58 7.42E-04 3.1360 3.1140 0.0300
6 R2-18 8.00E-04 3.1140 3.0750 3.1080
7 R2-16 8.38E-04 3.1150 3.0470 0.0260
8 R1-27 8.59E-04 3.0730 3.0820 0.0290
9 R3-42 8.62E-04 3.1300 3.1020 0.0200
10 R3-44 8.74E-04 3.0620 3.1210 0.0220
11 R3-8 8.80E-04 3.0280 3.0600 3.0630
12 R3-24 8.80E-04 3.0780 3.0220 0.0680
13 R3-2 8.97E-04 3.1090 3.1140 0.0590
14 R3-74 9.32E-04 3.0470 3.0800 0.0250
15 R3-25 9.40E-04 3.1460 3.1750 0.0320
16 R3-33 9.42E-04 3.1370 3.1270 0.0260
17 R3-3I 9.55E-04 3.0660 3.0780 0.0370
18 R3-28 9.60E-04 3.1290 3.0720 0.0220
19 R3-41 9.71E-04 3.0970 3.1280 0.0270
20 R3-52 9.73E-04 2.9840 3.1580 0.0220
21 R3-54 1.00E-03 3.0520 3.0980 0.0280
22 R3-62 1.05E-03 3.0910 3.0700 0.0320
23 R3-78 1.07E-03 3.0580 2.8450 0.0300
24 R3-59 1.08E-03 3.1590 2.9270 0.0180
25 R3-5 1.11E-03 3.0340 3.0120 0.0280
26 R3-92 1.11E-03 3.0980 2.9290 0.0280
27 R3-56 1.12E-03 3.0440 3.1430 0.0540
28 R3-61 1.13E-03 3.0780 3.0230 0.0320
29 R3-77 1.13E-03 3.0540 3.0740 0.0280
30 R3-6 1.21E-03 3.0610 3.0430 0.0380
[表7-2]
表7-2
序位 克隆号 koff(s^-1) IgG1 IgG3 IgA
31 R3-68 1.22E-.03 3.0780 3.0960 0.0760
32 R3-64 1.24E-03 3.1320 2.8780 0.0220
33 R2-3 1.25E-03 2.5150 2.5170 0.0100
34 R3-3 1.27E-03 2.9510 2.9560 0.0340
35 R3-7 1.32E-03 2.9180 3.0640 0.0550
36 R3-85 1.34E-03 3.1480 2.9480 0.0270
37 R3-32 1.34E-03 2.9880 3.1500 0.0380
38 R3-39 1.36E-03 3.0750 2.9760 0.0190
39 R3-34 1.39E-03 3.1190 2.9870 0.0200
40 R2-32 1.39E-03 3.0850 3.1180 0.0470
41 R3-95 1.40E-03 3.1210 2.9770 0.0230
42 R3-21 141E-03 30760 2.6270 0.0970
43 R2-1 1.42E-03 3.1060 2.9480 0.0250
44 R3-73 1.42E-03 3.1000 3.1200 0.1650
45 R3-46 1.48E-03 3.1220 3.0390 0.0170
46 R2-24 1.49E-03 3.1600 3.1080 0.0380
47 R3-90 1.51E-03 3.1280 2.9950 0.0240
48 R3-91 1.52E-03 3.1570 2.9740 0.0280
49 R3-60 1.52E-03 3.1390 2.9530 0.0350
50 R3-80 1.53E-03 3.0570 2.9360 0.0230
51 R3-82 1.54E-03 3.1510 2.6310 0.0270
52 R2-25 1.57E-.03 3.1110 2.5610 0.0270
53 R3-84 1.57E-03 3.1290 2.9890 0.0930
54 R1-43 1.60E-03 3.0910 2.9530 0.0200
55 R3-63 1.62E-03 3.0620 2.9870 0.0240
56 R3-51 1.63E-03 3.0480 3.0520 0.0150
57 R2-31 1.64E-03 3.1040 2.5360 0.0220
58 R3-27 1.64E-03 3.1090 3.0890 0.0220
59 R3-55 1.65E-03 3.0110 3.0960 0.0150
60 R1-5 1.66E-03 3.1910 3.0870 0.0230
[表7-3]
表7-3
序位 克隆号 koff(s^-1) IgG1 IgG3 IgA
61 R3-49 1.67E-03 3.0680 3.1260 0.0330
62 R3-83 1.68E-03 3.1090 2.9730 0.0570
63 R3-45 1.69E-03 3.0920 2.9400 0.0160
64 R3-14 1.71E-03 3.0880 2.9640 0.0280
65 R3-65 1.73E-03 3.0710 3.1120 0.0270
66 R3-36 1.73E-03 3.1110 2.9920 0.0180
67 R3-94 1.74E-03 3.0970 3.0530 0.0400
68 R1-7 1.75E-03 3.1240 0.0660 0.0360
69 R3-9 1.76E-03 3.0960 2.8800 0.0420
70 R2-22 1.86E-03 3.1160 0.0400 0.0250
71 R3-67 1.86E-03 3.0990 2.6830 0.0780
72 R3-96 1.86E-03 3.1460 3.0610 0.0250
73 R2-33 1.86E-03 3.1310 2.8100 0.0240
74 R1-36 1.87E-03 3.0660 0.5400 0.0170
75 R3-70 1.87E-03 3.0990 3.0040 0.0300
76 R3-53 1.88E-03 3.0300 3.1260 0.0580
77 R3-81 1.93E-03 3.1640 3.0440 0.0410
78 R3-17 1.94E-03 3.1580 3.0340 0.0650
79 R3-71 1.94E-03 3.0930 3.0600 0.0170
80 R3-57 1.95E-03 3.1320 3.0730 0.1160
81 R3-30 1.97E-03 3.0940 3.1070 0.0300
82 R2-14 2.04E-03 2.9970 0.5070 0.0220
83 R2-26 2.05E-03 3.0630 1.2730 0.0180
84 R3-79 2.06E-03 3.0510 3.0620 0.0280
85 R1-29 2.08E-03 3.0530 2.2800 0.0530
86 R2-15 2.09E-03 3.1040 2.9740 0.0200
87 R3-19 2.10E-03 3.0910 3.0340 0.0230
88 R2-10 2.11E-03 3.1010 2.8040 0.0210
89 R1-42 2.11E-03 3.1050 2.5150 0.0170
90 R3-11 2.18E-03 3.0690 3.0400 0.0280
[表7-4]
表7-4
序位 克隆号 koff(s^-1) IgG1 IgG3 IgA
91 R1-38 2.22E-03 3.0930 2.9980 0.0210
92 R2-8 2.22E-03 3.1140 2.0550 0.0190
93 R1-39 2.22E-03 2.9170 0.2600 0.0170
94 R2-27 2.28E-03 3.0220 2.4760 0.1570
95 R2-30 2.31E-03 3.0180 3.0400 0.0210
96 R2-5 2.33E-03 2.9640 0.1920 0.0130
97 R1-25 2.33E-03 3.1200 0.7990 0.0310
98 R2-23 2.36E-03 2.8150 0.5180 0.0220
99 R2-34 2.36E-03 3.1600 1.8090 0.0360
100 R3-10 2.38E-03 3.1050 2.7160 0.0310
101 R3-66 2.42E-03 3.1340 3.0090 0.0230
102 R1-47 2.44E-03 3.1160 2.8050 0.0190
103 R3-72 2.44E-03 3.0880 3.0740 0.0340
104 R2-9 2.44E-03 3.1330 3.0210 0.0200
105 R1-13 2.47E-03 3.1020 2.9500 0.0200
106 R1-23 2.48E-03 3.0390 0.8750 0.0170
107 R1-41 2.48E-03 3.1450 2.1250 0.3290
108 R2-35 2.48E-03 3.0810 2.9710 0.0200
109 R3-35 2.53E-03 3.1400 3.0850 0.0280
110 R1-6 2.53E-03 3.1740 2.8820 0.0780
111 R2-17 2.55E-03 3.1850 0.4590 0.0350
112 R3-69 2.59E-03 3.0640 3.0720 0.0360
113 R1-35 2.60E-03 3.1030 0.7110 0.0310
114 R2-37 2.60E-03 3.0820 2.3490 0.0170
115 R1-9 2.65E-03 3.1220 2.2560 0.0200
116 R2-19 2.67E-03 2.7350 1.8010 0.0210
117 R1-24 2.68E-03 3.0480 0.0530 0.0270
118 R2-2 2.82E-03 3.0650 2.9030 0.0370
119 R1-3 2.85E-03 3.1470 2.2850 0.0410
120 R1-20 2.86E-03 2.8940 1.0570 0.0190
[表7-5]
表7-5
序位 克隆号 koff(s^-1) IgG1 IgG3 IgA
121 R2-11 2.96E-03 2.7430 0.0210 0.0180
122 R2-45 3.09E-03 3.1430 2.8320 0.0180
123 R2-48 3.14E-03 3.1430 3.1320 0.0260
124 R1-34 3.27E-03 3.1380 0.6290 0.0250
125 R1-48 3.45E-03 3.1370 2.9600 0.0290
126 R1-45 3.47E-03 3.0720 2.5140 0.0130
127 R1-26 3.63E-03 3.0350 3.0000 0.0200
128 R1-14 3.66E-03 3.1160 3.0010 0.0220
129 R2-42 3.87E-03 3.1680 1.7200 0.0210
130 R1-10 4.00E-03 2.8020 1.2220 0.0360
131 R2-44 4.06E-03 3.1840 1.0250 0.0830
132 R2-47 4.11E-03 3.1440 3.0400 0.0420
133 R1-11 4.38E-03 3.1100 2.9800 0.0480
134 R2-40 4.88E-03 3.1540 2.6190 0.0200
135 R2-46 6.78E-03 3.1590 1.2460 0.0180
136 R2-41 6.94E-03 3.1320 2.7460 0.0300
137 R2-43 6.95E-03 3.1190 1.7940 0.0200
138 R2-38 9.89E-03 3.0670 2.6320 0.0180
139 R2-20 无法测定 2.8910 0.0680 0.0190
140 R2-36 无法测定 3.0860 3.0690 0.0310
<5.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列的确定>
[实施例5]
利用解离速率常数koff的测定的结果，对于1位(R3-75)、2位(R3-23)、3位(R3-26)、4位(R3-43)、5位(R3-58)、6位(R2-18)、7位(R2-16)、8位(R1-27)、 11位(R3-8)、68位(R1-7)，由兔来源单链抗体基因的基因序列确定了氨基酸序列。需要说明的是，4位(R3-43)不能测序。
图8-1、图8-2示出了确定的氨基酸序列。可知以下内容。需要说明的是，对于图8-1所示的重链(H链)的可变区(VH结构域)的基因，将1位(R3-75) 的序列设为序列号12、将2位(R3-23)的序列设为序列号13、将3位(R3-26) 的序列设为序列号14、将5位(R3-58)的序列设为序列号15、将6位(R2-18) 的序列设为序列号16、将7位(R2-16)的序列设为序列号17、将8位(R1-27) 的序列设为序列号18、将11位(R3-8)的序列设为序列号19、将68位(R1-7)的序列设为序列号20。
另外，对于图8-2所示的重链(L链)的可变区(VL结构域)的基因，将1 位(R3-75)的序列设为序列号21、将2位(R3-23)的序列设为序列号22、将3 位(R3-26)的序列设为序列号23、将5位(R3-58)的序列设为序列号24、将6 位(R2-18)的序列设为序列号25、将7位(R2-16)的序列设为序列号26、将8 位(R1-27)的序列设为序列号27、将11位(R3-8)的序列设为序列号28、将68 位(R1-7)的序列设为序列号29。
可知：由1位(R3-75)、6位(R2-18)、11位(R3-8)得到的兔来源单链抗体基因作为CDR3而具有“ATRYDSYGYAYNYWFGTLW(序列号30，19个残基)”。另外，从这些菌落获得的兔来源单链抗体与人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、人IgG4抗体、及人IgA抗体结合。
可知：由2位(R3-23)得到的兔来源单链抗体基因作为CDR3具有“GSYYDSHGYAYVSLW(序列号31，15个残基)”。另外，从该菌落获得的兔来源单链抗体与人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4 抗体结合。
可知：由3位(R3-26)得到的兔来源单链抗体基因作为CDR3为“ATDYGIYGYAYGHLW(序列号32，15个残基)”。另外，从该菌落获得的兔来源单链抗体与人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4 抗体结合。
可知：由5位(R3-58)、8位(R1-27)得到的兔来源单链抗体基因作为CDR3 具有“ARYSGDNGGTLNLW(序列号33，14个残基)”。另外，从该菌落获得的兔来源单链抗体与人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4 抗体结合。
可知：由7位(R2-16)得到的兔来源单链抗体基因作为CDR3具有“ARYSGDNGGALNLW(序列号34，14个残基)”。另外，从该菌落获得的兔来源单链抗体与人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4抗体结合。
<6.与人IgG1抗体的结合能力的测定>
[实施例6]
利用解离速率常数koff的测定的结果，对于从成为1位(R3-75)、2位 (R3-23)、6位(R2-18)、7位(R2-16)、8位(R1-27)、68位(R1-7)的各菌落所获得的兔来源单链抗体，使用Biacore X-100(GE Healthcare公司)测定了与人 IgG1抗体的结合性。
(样品的制备方法)
将得到的含噬菌粒的大肠杆菌的菌落在500ml带挡板烧瓶内接菌于 50ml的Overnight Express(注册商标，默克)培养基中，于30℃、以200rpm 进行24小时培养之后，通过离心分离而除去上清液。向其中添加5ml的 Bugbuster、及0.2μL的BenzonaseNuclease而进行溶菌之后，进行离心分离并回收上清液。利用PBST将其稀释10倍，用于测定。
(测定方法)
在以下测定条件下进行测定。
Sensor Chip(传感器芯片)：human IgG1-coupled CM5(5000RU)
Running buffer(运行缓冲区)：PBST
Binding time(绑定时间)：540秒
Dissociation time(解离时间)：120秒
Elution(洗脱)：10mM甘氨酸，pH 1.5
[比较例6-1]
代替样品而使用了利用PBST制备成最终浓度10μg/mL的蛋白 A(Nacalai tesque，29435-14)，除此以外，与实施例6同样地进行，并将其作为比较例6-1。
[比较例6-2]
代替样品而使用了小鼠scFv-FM(将可溶性级分利用PBST稀释10倍)，除此以外，与实施例6同样地进行，并将其作为比较例6-2。
将得到的含噬菌粒的大肠杆菌的菌落在500ml带挡板烧瓶内接菌于 50ml的Overnight Express(注册商标，默克)培养基中，于30℃、以200rpm 进行24小时培养之后，通过离心分离而除去上清液。向其中添加5ml的 Bugbuster、及0.2μL的BenzonaseNuclease溶菌之后，离心分离并回收上清液。利用PBST将其稀释10倍，用于测定。
图9-1、图9-2中示出了测定结果。可知，相对于人IgG1抗体的结合能力，任一兔来源单链抗体均明显大于比较例6-1的蛋白A、比较例6-2的小鼠scFv-FM。
<7.相对于人IgG1抗体的解离常数KD的测定>
[实施例7]
利用解离速率常数koff的测定的结果，对于从成为1位(R3-75)、2位 (R3-23)、3位(R3-26)、6位(R2-18)、7位(R2-16)、8位(R1-27)、68位(R1-7) 的菌落获得的兔来源单链抗体，使用Biacore X-100(GE Healthcare公司)进行了相对于人IgG1抗体的解离常数KD的测定。
(样品的制备方法)
由噬菌粒载体使用T7promoter primer及M13primer，通过PCR扩增了包含兔来源单链抗体基因的DNA片段。将DNA片段纯化之后，利用限制酶Xba I及Not I进行消化，插入至pET22载体(默克)的Xba I/Not I位点。构建的兔来源单链抗体表达载体，以在N末端侧融合有周质定位信号序列 (pelB leader signal)、C末端侧融合有组氨酸标签(6xHis-tag)的形式被表达。表达之后，兔来源单链抗体向周质转移，pelB leader序列被信号肽酶所切割。
利用构建的兔来源单链抗体-His表达载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，在LB琼脂平板(含有50mg/L氨苄青霉素、35mg/L卡那霉素)上进行了培养。将得到的单一菌落在LB培养基10ml(含有50mg/L氨苄青霉素、35mg/L卡那霉素)中培养过夜。将得到的培养液接菌至50ml Overnight Express TB培养基(默克)，于37℃、以200rpm培养24小时。
将得到的培养液离心分离(10000rpm，4℃，15分钟)，得到了培养上清液。另外，将菌体与含有Bugbuster、溶菌酶、Benzonase Nuclease的5ml的溶解缓冲液进行悬浮，于37℃培养1小时，由此进行了破碎。以10000rpm、 4℃离心分离15分钟，回收上清液作为菌体内可溶性级分。
将上述培养上清液及菌体内可溶性级分分别应用至His-Trap HP柱(GEHealthcare)，通过使用0.4M咪唑的梯度洗脱而回收兔来源单链抗体-His。另外，洗脱液的蛋白质浓度通过DC Protein assay(Biorad)进行了定量。进一步，通过SDS-PAGE确认了洗脱液中的兔来源单链抗体-His的纯度。在洗脱液中的兔来源单链抗体-His的纯度差时，将洗脱液利用人IgG结合柱进行进一步纯化、定量。将回收的洗脱液利用PBST稀释10倍以上，利用BiacoreX-100 测定了解离常数KD。
(测定方法)
在以下测定条件下进行测定。
Sensor Chip(传感器芯片)：human IgG1-coupled CM5(5000RU)
Running buffer(运行缓冲区)：PBST
Binding time(绑定时间)：180秒
Dissociation time(解离时间)：600秒
Elution(洗脱)：10mM甘氨酸，pH 1.5
Mode(模式)：Single cycle kinetics mode(单循环动力学模式)
表8汇总了包括解离常数KD的测定结果在内的所获得的兔来源单链抗体的特性。可知：1位(R3-75)的兔来源单链抗体的相对于人IgG1抗体的解离常数KD为5.5×10-10M。常见的蛋白A相对于人IgG1抗体的解离常数KD为5-10nM左右，考虑到此，可认为1位(R3-75)的兔来源单链抗体对于人IgG1 抗体为非常强固地结合。
需要说明的是，在表8的“位置”中，将使用培养上清液的样品而确认了活性的情况记载为“上清液”，将使用可溶性级分的样品而确认了活性的情况记载为“周质”。在为“上清液”的情况下，表示由大肠杆菌分泌了噬菌体或兔来源单链抗体，在为“周质”的情况下，表示存在于大肠杆菌的周质内。
[表8]
表8
序位 克隆号 k。n(M-1s-1) koff(s-1) KD(M) Rmax(RU) 位置
1 R3-75 6.7×104 3.7×10-5 5.5×10-10 342.2 上清液
2 R3-23 1.1×104 1.3×10-4 1.1×10-8 364.1 周质
3 R3-26 2.1×104 4.3×10-5 2.1×10-9 329.4 上清液
6 R2-18 2.5×104 1.2×10-4 4.8×10-9 364.1 上清液
7 R2-16 1.3×105 3.2×10-4 2.5×10-9 241.8 周质
8 R1-27 9.9×103 4.0×10-4 4.0×10-8 530.6 周质
68 R1-07 7.1×104 1.7×10-3 2.4×10-8 79.9 周质
可知：1位(R3-75)、3位(R3-26)、及6位(R2-18)的兔来源单链抗体被分泌到培养上清液中。
<8.人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂>
[实施例8]
(单链抗体的制备)
通过使用了Jar Fermenter的补料分批培养而大量生产了“R3-26”单链抗体。进一步，通过利用HisTrap HP柱(GE Healthcare)的固定化金属离子亲和层析法(IMAC)对被分泌至培养上清液中的单链抗体进行了纯化。进一步，使用脱盐缓冲液交换用Hi TrapDesalting柱(GE Healthcare)置换为包含0.5M NaCl的0.1M碳酸缓冲液(pH 8.3)，进一步采用超滤进行浓缩。最终得到了浓度1mg/ml、体积10ml的单链抗体。
(单链抗体向载体的固定)
将作为HiTrap NHS柱5ml(GE Healthcare)的载体的Sepharose(珠状的琼脂糖载体)的羧基利用NHS进行酯化，并供给经过了纯化的上述单链抗体，使得与其氨基形成酰胺键而固定化。对于未反应的NHS酯，添加乙醇胺而进行封闭。
(人血清来源的IgG多克隆抗体的分离)
将固定有单链抗体的上述柱5ml设置于色谱系统AKTA Purifier UPC 10(GEHealthcare)，利用PBS进行平衡化。以1ml/min的流速向其中供给制备成1mg/ml的人血清来源的IgG多克隆抗体(Sigma，#I4506)10ml的量。之后，利用PBS洗涤柱，确认UV280的值达到基线后，供给0.5M精氨酸(pH 1.5)，从柱中洗脱人血清来源的IgG多克隆抗体。
其结果，得到了如图10所示的穿透曲线。进一步，在使用0.5M精氨酸 (pH 1.5)从柱中强制性解离人血清来源的IgG多克隆抗体时，可以以高纯度分离。由直接通过的级分与洗脱级分的峰面积比可知，在供给的IgG(10mg) 内，大约有53％(5.3mg)吸附于柱而被洗脱。
根据以上的结果，显示了通过本发明的筛选方法所选择的单链抗体的、作为人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂的利用可能性。
<9.与人抗体的L链特异性结合的兔来源单链抗体的筛选方法>
在先前研究的使用人血清来源的IgG多克隆抗体固定化MLVs的淘选中，进行了对第1～3轮中得到的共计192个克隆的抗原特异性以及氨基酸序列的评价，结果可知，3个克隆(R2-18、R3-8、R3-75)不仅与人IgG抗体、与人IgA抗体也发生了强力结合。
进一步，利用蛋白质印迹分析乐这些单链抗体的抗原特异性，结果发现，它们特异性地识别了人抗体的轻链(L链)、具体而言为κ链。在比较人IgG 抗体和人IgA抗体的恒定区的氨基酸序列时，重链(H链)的氨基酸序列完全不同，但轻链(L链)的氨基酸序列大致分为λ链或κ链，序列是分别共通的。对于该点，在人IgM抗体、人IgE抗体、人IgD抗体等中也是同样的。因此，表明这3个克隆是不仅对于人IgG抗体、人IgA抗体，对于人IgM抗体、人IgE抗体、人IgD抗体等全部人抗体均可特异性结合的附加价值非常高的抗体。
因此，为了从先前制备的展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的噬菌体的文库中高效地回收这样的与人抗体的L链特异性结合的兔来源单链抗体，新进行了以下淘选。
以下，记载了从噬菌体文库中筛选与人抗体的L链特异性结合的兔来源单链抗体(以下，有时称为“抗-人抗体L链-兔来源单链抗体”)的方法。
需要说明的是，作为与抗-人抗体L链-兔来源单链抗体的筛选方法中获得的克隆的名称，例如也有时将“第1轮结束时的克隆号1”的克隆简称为“IgA R1-1”、“IgA I-1”。同样，例如也有时将“第2轮结束时的克隆号1”的克隆简称为“IgA R2-1”、“IgA II-1”、也有时将“第3轮结束时的克隆号1”的克隆简称为“IgA R3-1”、“IgA III-1”。
<9-1.多层脂质体和人血清来源的IgA多克隆抗体的结合>
与上述1-1同样地进行，制备了人血清来源的IgA多克隆抗体固定化 MLVs。人血清来源的IgA多克隆抗体使用了Sigma的#I4036。
<9-2.展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体-兔来源单链抗体的噬菌体的文库的制备>
与上述2-2同样地进行，制备了展示抗-人血清来源的IgG多克隆抗体- 兔来源单链抗体的噬菌体的文库。
<9-3.淘选>
[实施例9-1]
使用在上述9-2中制备的噬菌体文库、和在上述9-1中制备的人血清来源的IgA多克隆抗体固定化MLVs，与上述2-3同样地实施了淘选。
[比较例9-1]
使用了未固定化人血清来源的IgA多克隆抗体的多层脂质体，除此以外，与实施例9-1同样地进行，并将其作为比较例9-1。
<9-4.从噬菌体的回收到基因序列的测序>
与上述2-2同样地进行，由在实施例9-1、比较例9-1中回收的噬菌粒 DNA，确认了抗-人血清来源的IgA多克隆抗体-兔来源单链抗体的基因的有无。
<9-5.淘选的结果>
图11中示出了实施例9-1及比较例9-1中的淘选前、第1轮结束时、第 2轮结束时、第3轮结束时的噬菌体数。
另外，在图12中示出了用实施例9-1及比较例9-1中的第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的各噬菌体数分别除以淘选前的噬菌体数而得到的回收率(％)。
由上述结果可知，在实施例9-1中，回收率在第3轮大幅增加，与比较例9-1相比，回收率为100倍以上。可知，在使用了人血清来源的IgA多克隆抗体固定化MLVs的淘选中，也可以实施有效的淘选。
<9-6.抗原结合活性评价1>
[实施例9-2]
与上述3-1同样地，对从在各轮中回收的含噬菌粒的大肠杆菌的颗粒单元(即，未进行单一菌落化，颗粒中包含的大肠杆菌所包含的噬菌体整体)得到的兔来源单链抗体，如下所述地评价了抗原结合活性。其中，作为固定化至板的抗原，仅使用了人IgA抗体(Sigma，#I4036)，抗原结合活性评价也仅对于人IgA抗体进行。即，没有进行对人IgG1抗体等固定化及人IgG1 抗体等的抗原结合活性评价。
图13示出其结果。根据图13，在第2轮中相对于人IgA抗体的抗原结合活性飞跃性地增加。进一步，在第3轮中对于人IgA抗体的抗原结合活性比第2轮进一步升高。由该结果可知，即使在将人血清来源的IgA多克隆抗体固定化MLVs作为载体进行淘选的情况下，相对于人IgA抗体特异性结合的噬菌体也发生了浓缩。
<9-7.抗原结合活性评价2>
[实施例9-3]
对于从在各轮中回收的含噬菌粒的大肠杆菌的菌落得到的兔来源单链抗体，与3-2同样地进行，评价了抗原结合活性。另外，在此，作为固定化至板的抗原不仅使用了人IgA抗体(Sigma，#I4036)，也与3-2同样地使用了人IgG1抗体等，也进行了相对于人IgG1抗体等的抗原结合活性评价。
图14、表9-1、表9-2中示出了对从在第1轮结束时所得到的32个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。另外，将OD值为 0.1以上的情况作为阳性克隆，将低于0.1的情况作为阴性克隆。
[表9-1]
表9-1
克隆号 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
IgA R1-1 0.0850 0.1040 0.2120 0.0440 0.0380
IgA R1-2 0.0600 0.0760 0.0690 0.0280 0.0240
IgA R1-3 0.0540 0.0560 0.0790 0.0270 0.0200
IgA R1-4 0.2200 0.5880 1.5880 0.5000 0.2600
IgA R1-5 0.0600 0.1100 0.6720 0.0970 0.0440
IgA R1-6 0.0500 0.0650 0.0850 0.0330 0.0270
IgA R1-7 0.0730 0.1150 0.9080 0.1290 0.0920
IgA R1-8 0.2330 0.2670 0.6240 0.3280 0.2690
IgA R1-9 0.1810 0.0760 0.1100 0.0300 0.0310
IgA R1-10 0.0270 0.0820 0.2070 0.0440 0.0320
IgA R1-11 0.0180 0.0570 0.0770 0.0250 0.0210
IgA R1-12 0.0220 0.0750 0.1360 0.0350 0.0270
IgA R1-13 0.0190 0.0590 0.1230 0.0340 0.0260
IgA R1-14 0.0450 0.1510 0.9870 0.1680 0.1210
IgA R1-15 0.0220 0.0800 0.0950 0.0350 0.0300
IgA R1-16 0.0520 0.1140 0.2510 0.0670 0.0430
IgA R1-17 0.0240 0.0710 0.3950 0.0580 0.0290
IgA R1-18 0.3240 0.7110 1.8720 0.6230 0.3630
IgA R1-19 0.4750 0.2010 1.3900 2.2470 0.6940
IgA R1-20 0.0390 0.2960 0.2900 0.1420 0.1120
IgA R1-21 0.0120 0.0560 0.0820 0.0210 0.0170
IgA R1-22 0.0830 0.1650 1.6250 0.2780 0.1050
IgA R1-23 0.0200 0.0570 0.1450 0.0310 0.0230
IgA R1-24 0.0460 0.0600 0.0600 0.0190 0.0210
IgA R1-25 0.0210 0.0850 0.3760 0.0490 0.0310
IgA R1-26 0.0330 0.1190 0.3780 0.0790 0.0500
IgA R1-27 0.0630 0.0810 0.6180 0.1260 0.0540
IgA R1-28 0.0490 0.1350 0.6880 0.1000 0.0640
IgA R1-29 0.0320 0.1310 0.8010 0.1050 0.0610
IgA R1-30 0.0130 0.0640 0.1430 0.0280 0.0220
IgA R1-31 0.1870 0.6220 1.8370 0.6150 0.2750
IgA R1-32 1.2300 2.1850 2.7570 2.0930 2.5720
[表9-2]
表9-2
同样地，在图15、表10-1、表10-2中示出了对从第2轮结束时所得到的32个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。另外，将OD值为0.1以上的情况作为阳性克隆，将低于0.1的情况作为阴性克隆。
[表10-1]
表10-1
克隆号 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
IgA R2-1 0.0140 0.0560 0.0710 0.0220 0.0200
IgA R2-2 3.0900 3.0160 2.9940 2.9860 2.9130
IgA R2-3 3.1110 2.9990 2.9910 2.9780 2.9280
IgA R2-4 2.9270 2.9660 2.9890 2.9540 2.9070
IgA R2-5 0.0100 0.0540 0.0760 0.0220 0.0180
IgA R2-6 3.0640 2.9620 2.9640 2.9300 2.8760
IgA R2-7 0.0090 0.0450 0.0270 0.0170 0.0180
IgA R2-8 3.1390 3.0310 3.0200 3.0030 2.9220
IgA R2-9 0.0330 0.0980 0.4670 0.0560 0.0450
IgA R2-10 3.0600 3.0060 3.0150 2.9410 2.8700
IgA R2-11 3.0650 2.9860 2.9960 2.9860 2.8940
IgA R2-12 0.2040 0.4280 2.2810 0.5590 0.2790
IgA R2-13 0.0430 0.1360 1.5570 0.1690 0.0660
IgA R2-14 0.1150 0.3220 1.3980 0.2480 0.1490
IgA R2-15 0.0380 0.1140 0.7580 0.1350 0.0550
IgA R2-16 0.0720 0.1760 1.6820 0.1760 0.0630
IgA R2-17 0.0690 0.1650 1.7400 0.2470 0.1160
IgA R2-18 0.0120 0.0520 0.0850 0.0220 0.0210
IgA R2-19 0.0250 0.0950 0.6030 0.0590 0.0380
IgA R2-20 3.0290 3.0270 2.9720 2.9640 2.8480
IgA R2-21 0.0080 0.0460 0.1020 0.0150 0.0170
IgA R2-22 2.8440 3.0150 2.9650 2.9660 2.8580
IgA R2-23 0.0320 0.1070 1.1400 0.0960 0.0410
IgA R2-24 0.1180 0.5180 1.9500 0.3020 0.4330
IgA R2-25 0.0810 0.2390 1.6760 0.4050 0.1340
IgA R2-26 3.0840 2.9940 2.9820 3.0180 2.9360
IgA R2-27 0.1000 0.4810 1.4420 0.3820 0.2800
IgA R2-28 3.0400 2.9900 2.9300 2.9910 2.9560
IgA R2-29 2.1590 2.8960 2.8920 1.0310 2.7930
IgA R2-30 0.2730 0.6990 1.7850 0.6590 0.4920
IgA R2-31 0.1900 2.4280 1.2270 1.4560 0.0990
IgA R2-32 0.0620 0.1050 0.4250 0.0760 0.0650
[表10-2]
表10-2
同样地，在图16、表11-1、表11-2中示出了对从第3轮结束时所得到的32个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果。另外，将OD值为0.1以上的情况作为阳性克隆，将低于0.1的情况作为阴性克隆。
[表11-1]
表11-1
克隆号 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA
IgA R3-1 3.0930 3.0670 3.0240 3.0710 2.9960
IgA R3-2 3.0790 3.0310 2.9910 3.0140 2.9740
IgA R3-3 0.2860 2.7640 2.9480 2.9950 2.8860
IgA R3-4 3.0610 3.0250 2.9770 3.0420 2.9520
IgA R3-5 3.1030 3.0350 2.9900 3.0390 2.9580
IgA R3-6 3.0930 3.0310 2.9770 3.0500 2.9540
IgA R3-7 3.0870 3.0090 2.9810 3.0490 2.9950
IgA R3-8 3.0920 3.0590 3.0440 3.0210 2.9840
IgA R3-9 3.0780 3.0910 3.0370 3.0210 2.9860
IgA R3-10 3.1220 3.0150 3.0140 3.0280 2.9690
IgA R3-11 2.9950 3.0290 2.9600 3.0350 3.0260
IgA R3-12 3.0610 3.0490 2.9380 3.0060 3.0120
IgA R3-13 2.8620 2.9970 2.9940 3.0250 3.0410
IgA R3-14 3.0680 3.0490 2.9530 3.0210 3.0010
IgA R3-15 3.0920 3.0420 2.9610 3.0480 2.9550
IgA R3-16 3.0900 3.0750 3.0210 3.0380 2.9770
IgA R3-17 3.1130 3.0810 2.9750 3.1040 3.0100
IgA R3-18 3.0910 3.0900 2.9910 3.0790 3.0340
IgA R3-19 2.9280 3.0170 2.9810 3.0840 2.9920
IgA R3-20 3.0290 3.0130 2.9810 3.0490 2.9650
IgA R3-21 3.0950 3.0490 2.9920 3.0600 2.9960
IgA R3-22 3.0400 3.0500 2.9610 3.1010 3.0010
IgA R3-23 3.0360 3.0310 2.9540 3.0780 2.9660
IgA R3-24 3.1110 3.0640 2.9940 3.0400 2.9730
IgA R3-25 3.0670 3.1040 2.9840 3.1550 3.0870
IgA R3-26 2.8440 3.0730 3.0000 3.0990 3.0030
IgAR3-27 3.0450 3.0810 3.0150 3.1110 3.0520
IgA R3-28 3.0470 3.0720 3.0050 3.0910 3.0640
IgA R3-29 2.7280 3.0550 2.9890 3.1130 3.0150
IgA R3-30 3.0490 2.9040 2.9910 3.0780 3.1070
IgA R3-31 3.0370 3.0520 2.9900 3.1030 2.9870
IgA R3-32 2.7580 3.0530 2.9610 3.0670 3.0590
[表11-2]
表11-2
由以上的结果可知以下内容。
在第3轮中回收的单链抗体全部与人IgA抗体结合，其结合活性也极高。另外，不仅与人IgA抗体，与人IgG1抗体、人IgG2抗体、人IgG3抗体、及人IgG4抗体也全部结合。根据该结果可知，极其高效地实施了淘选。
<9-8.与人血清来源的IgA多克隆抗体结合的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列的确定>
[实施例10]
对于第1轮结束时所得到的32个菌落、第2轮结束时所得到的32个菌落、及第3轮结束时所得到的32个菌落，由兔来源单链抗体基因的基因序列确定了氨基酸序列。
对于第1轮结束时所得到的32个菌落，将由VH结构域的基因序列确定的氨基酸序列示于图17-1，如图中所示，对各氨基酸序列标记了序列号。另外，序列为空栏的部分是不能测序的序列。
另外，对于与抗原抗体反应的特异性极大相关的VH结构域的CDR3区域的氨基酸序列，将氨基酸残基数、32个克隆中的出现数、32个克隆中的出现概率示于图17-2。所述“阴性克隆”涉及不能确定VH结构域的CDR3区域的氨基酸序列的克隆。对于这些，也如图中所示那样对各氨基酸序列标记了序列号。
同样地进行，对于第2轮结束时所得到的32个菌落，示于图17-3、图 17-4，对于第3轮结束时所得到的32个菌落，示于图17-5、图17-6。
进一步，为了参考，将<2.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法>中得到的“R2-18”、“R3-8”、“R3-75”的VH结构域的氨基酸序列示于图17-7。
另外，在备注栏中，例如记载为“共通1”的克隆有多个。表示记载为“共通1”的克隆组全部为同一克隆。同样，表示记载为“共通2”的克隆组也全部为同一克隆。其中，这些编号仅是为了方便而标记的。
进一步，在备注栏中，例如存在记载为“共通3(与R3-75相同)”的克隆。其表示与<2.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法>中得到的“R3-75”为同一克隆。
进一步，将第1～3轮结束时所得到的“共通1”～“共通7”的克隆的数归纳于图17-8、图17-9、图17-10。
从以上的结果可知以下内容。
由图17-6可知，在第3轮中，在<2.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法>中得到的、包含“R2-18”、“R3-8(其中，该克隆与R2-18为同一克隆。)”、“R3-75”所包含的CDR3的氨基酸序列“ATRYDSYGYAYNYWFGTLW(序列号30，19个残基)”的VH结构域，在全部32个克隆中的26个克隆获得，以81.3％的比例存在。
在它们中，有12个克隆和8个克隆分别为共通1的克隆、共通2的克隆。另外，其它2个克隆为与在<2.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法>中得到的“R2-18(6位；其中，该克隆为与“R3-8”相同的克隆)”相同的共通4的克隆。
进一步，其它2个克隆为与在<2.与人血清来源的IgG多克隆抗体结合的兔来源单链抗体的筛选方法>中得到的“R3-75(1位)”相同的共通3的克隆。
进一步，如“ARADYNTVAYFDLW(14个残基，序列号141)”、“ARADYNTAAYFDLW(14个残基，序列号142)”、“VRADYNTVSYFDLW(14 个残基，序列号143)”那样，也获得了多个在VH结构域的CDR3的氨基酸序列中彼此同源性较高的克隆。
另外，由蛋白质印迹的结果可知，第3轮中获得的克隆，不论VH结构域的CDR3的氨基酸序列的长度如何，均与人抗体的轻链(L链)、具体而言与κ链结合。
由以上的结果可知，通过将人血清来源的IgA多克隆抗体用于载体而进行淘选，能够即高效地回收与作为人IgG抗体和人IgA抗体的共通部分的人抗体的轻链(L链)、具体而言与κ链特异性结合的单链抗体。
<9-9.解离速率常数koff的测定>
[实施例11]
作为传感器芯片，使用了人IgA抗体固定化CM5，除此以外，与<4.解离速率常数koff的测定>同样地进行，针对在第3轮结束时所得到的32个菌落进行了解离速率常数koff的测定。将该结果示于图18、表12。另外，也一并记载了R2。
[比较例11]
使用了“IgA R1-2”，除此以外，与实施例11同样地进行而作为阴性对照，将其作为比较例11。
[表12]
表12
克隆号 koff(sec-1) R2 备注
IgA R3-6 8.69E-05 9.92E-01 共通1
IgA R3-2 1.48E-04 9.92E-01 共通2
IgA R3-1 9.88E-05 9.81E-01 共通3
IgA R3-18 1.81E-04 9.93E-01 共通4
IgA R3-7 9.56E-05 9.74E-01 共通5
IgA R3-19 9.81E-04 9.84E-01 共通6
IgA R3-13 1.31E-04 9.95E-01 共通7
IgA R3-3 6.75E-04 9.53E-01
IgA R3-26 1.00E-03 9.86E-01
IgA R3-29 6.61E-04 9.97E-01
IgA R3-32 5.64E-04 9.99E-01
IgA R1-2 - -
在第3轮中得到的全部克隆中，确认了相对于人IgA抗体的结合。进一步，如表12所示，基于在第3轮中获得的克隆的单链抗体的解离速率常数 koff基本在10-5～10-4秒-1级的范围，非常小。特别是，基于32个克隆中占了 12个克隆的“IgA R3-6(共通1)”的单链抗体的解离速率常数koff，小于基于与“R3-75”为同一克隆的“IgA R3-1(共通3)”的单链抗体的解离速率常数koff，这表明其具有更高的亲和性。
从以上的结果可知，本方法即使对文库中存在率低的克隆也能够以极高的效率进行回收，对于具有高亲和性/特异性的单链抗体的回收/分离是有效的。
工业实用性
本发明例如可适用于抗体药物的制造方法。
序列表
<110> 国立大学法人京都工艺纤维大学
株式会社大赛璐
<120> 人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血清来源的IgG多克隆抗体的分离方法
<130> 15P0464-6197
<150> JP 2015-219765
<151> 2015-11-09
<150> JP 2016-024016
<151> 2016-02-10
<160> 147
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
aaaaaggcca tggcccagtc ggtggaggag tccrgg 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
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<220>
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aaaaaggcca tggcccagtc ggtgaaggag tccgag 36
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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<210> 5
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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tccaccacta gtgacggtga csagggt 27
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<212> DNA
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<220>
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aattaaggat ccgagctcgt gmtgacccag actsca 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
aattaaggat ccgagctcga tmtgacccag actsca 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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aattaaggat ccgagctcgt gatgacccag actgca 36
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
aattaaggat ccgagctcgt gctgactcag tcgycctc 38
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 10
tatatatgcg gccgccgaac stktgayswc cac 33
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<212> DNA
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<220>
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tttaaatttg cggccgccga acctgtgacg gtcag 35
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 穴兔
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50 55 60
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Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Arg Tyr
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Asp Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Asn Tyr Trp Phe Gly Thr Leu Trp Gly
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Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Thr Ser
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<212> PRT
<213> 穴兔
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Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ala
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Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Thr Trp Ala Arg Gly
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Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
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Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Val Thr Tyr Phe Cys Gly Ser Tyr Tyr
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Asp Ser His Gly Tyr Ala Tyr Val Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Thr Ser
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<212> PRT
<213> 穴兔
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Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys
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Asp Tyr Gly Ile Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly His Leu Trp Gly Pro Gly
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Thr Leu Val Thr Val Thr Ser
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<212> PRT
<213> 穴兔
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Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Ile Ile Arg Asn Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys
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Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
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Tyr Ser Gly Asp Asn Gly Gly Ala Leu Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr
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Leu Val Thr Val Thr Ser
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<212> PRT
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Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Asn Ala
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Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
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Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
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Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
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Thr Val Thr Ser
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Gly Ile Ile Ala Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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<213> 穴兔
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Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
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Ile Ile Ala Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg
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Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
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Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
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Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Ala Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Glu
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<213> 穴兔
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<213> 穴兔
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Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Glu
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Val Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Val Thr Gly Ser
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<213> 穴兔
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Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
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<213> 穴兔
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<213> 穴兔
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Gly Ser Tyr Tyr Asp Ser His Gly Tyr Ala Tyr Val Ser Leu Trp
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 32
Ala Thr Asp Tyr Gly Ile Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly His Leu Trp
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<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 33
Ala Arg Tyr Ser Gly Asp Asn Gly Gly Thr Leu Asn Leu Trp
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<212> PRT
<213> 穴兔
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Ala Arg Tyr Ser Gly Asp Asn Gly Gly Ala Leu Asn Leu Trp
1 5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> octapeptide
<400> 35
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Lys
1 5
<210> 36
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<212> PRT
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<213> 穴兔
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<213> 穴兔
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Claims (10)

1.人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂，其包含载体、和通过化学键而键合于载体的表面的单链抗体，该单链抗体对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数。
2.根据权利要求1所述的分离剂，其中，所述单链抗体进一步为针对人血清来源的IgA多克隆抗体的抗体。
3.根据权利要求2所述的分离剂，其中，所述单链抗体对于所述人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分离剂，其中，所述单链抗体为与L链结合的抗体。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的分离剂，其中，所述单链抗体为与κ链结合的抗体。
6.使用分离剂从两种以上物质的混合液分离人血清来源的IgG多克隆抗体的方法，所述分离剂包含载体、和通过化学键而键合于载体的表面的单链抗体，所述单链抗体对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述单链抗体进一步为针对人血清来源的IgA多克隆抗体的抗体，该方法进一步分离人血清来源的IgA多克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述单链抗体对于所述人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其中，所述单链抗体为与L链结合的抗体。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的方法，其中，所述单链抗体为与κ链结合的抗体。
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