JP2009537526A - 治療もしくは診断剤の全身投与のための抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームの製造およびその使用 - Google Patents
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Abstract
(a) 抗体または抗体断片を製造し;
(b) 該抗体または抗体断片をカチオン性リポソームと混合してカチオン性免疫リポソームを形成するか、またはカチオン性ポリマーと混合してポリプレックス(polyplex)を形成し;そして、
(c) 該カチオン性免疫リポソームまたは該ポリプレックスを治療もしくは診断剤と混合して該抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソームもしくはポリマー複合体を形成する
工程を含む、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、疾患を処置するための分子の全身送達のために有用な抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームおよび抗体もしくは抗体断片標的化ポリマーを製造する方法を提供する。リポソームおよびポリマー複合体は、小分子の送達、および標的化遺伝子送達ならびに全身投与後の有効な遺伝子発現を行うために有用である。送達システムの特異性は、標的化抗体もしくは抗体断片に由来する。
癌のための理想的な治療は、腫瘍表現型に関与する細胞経路を選択的に標的化するものであり、正常細胞に非毒性であるものである。今日まで、理想的な治療はまだ実現していない。遺伝子治療を含む癌処置は、かなりの見込みを有しているが、この見込みが実現し得る前に取り組むべき多くの問題が存在する。おそらく、巨大分子処置と関連する最大の問題は、治療分子のそれらが必要とされる身体部位への有効な送達である。理想的な送達ビヒクルは、全身的に投与された後、腫瘍細胞が体内の何処に発生しているかにかかわりなく常に当該腫瘍細胞を標的とするものであろう。ウイルスおよびリポソームを含むさまざまな送達系(“ベクター”)が試みられている。ウイルスを送達ベクターとして魅力的なものにする感染性は、また、最大の欠点を引き起こす。残りのウイルスエレメントは、免疫原性があるか、細胞変性的であるか、または組換え的であり得る。感染のための新規標的を有する新規ウイルスの産生は、また、いったん患者に投与すると、これらのウイルスが、遺伝子変化により、新規ヒト病原体に形質転換し得るという理論上の可能性を生じる。結果として、多くの注目は、分子治療の送達のための非ウイルスベクターに向けられている。リポソーム法は、遺伝子送達に関して、ウイルス方法論を超えた多くの利点を提供する。最も重要なのは、それらが免疫原性を欠いているということである。さらに、リポソームは、自己複製が可能な感染性薬剤ではないので、それらは、新種の感染性ヒト病原体を進化させる危険を生じない。
上記したとおり、ウイルスベクターを用いることに関連するいくつかの問題は、非ウイルス送達ベクターにより回避し得る。インビボでのヒト治療のための遺伝子の医薬製剤、とりわけ、カチオン性リポソーム仲介遺伝子送達系(31、32)の開発が進行している。カチオン性リポソームは、正電荷脂質二重層からなり、脂質およびDNAの単純混合により負電荷の裸DNAと複合体を形成し得て、その結果、生じた複合体は正味の正電荷を有する。複合体は、培養細胞に結合し、適度なトランスフェクション効率で取り込まれ得る(33)。カチオン性リポソームを多用途にし、DNA送達のために魅力的なものにするそれらの特徴は、下記を含む:製造の容易さ;大量のDNAと複合体を形成する能力;DNAまたはRNAの型および大きさでの使用における多用途性;非分裂細胞を含む多くの異なる細胞型にトランスフェクトする能力;および、免疫原性またはバイオハザード活性の欠如(34、35を参照のこと)。ヒト癌治療の展望からより重要なのは、カチオン性リポソームが、インビボでの遺伝子送達に関して、安全で有効であることが証明されていることである(33、34、36)。少なくとも99の臨床試験の症例が、遺伝子送達のためにカチオン性リポソームを用いて承認されていて(37)、小分子治療薬(例えば、抗真菌剤)の送達のためのリポソームは、既に上市している。
腫瘍抑制遺伝子p53は、DNA損傷、例えば、DNA修復、細胞周期の制御およびプログラムされた細胞死(アポトーシス)に応答して活性化される経路を含む、種々の細胞経路で重要な役割を果たす(1)。これらの重要な細胞経路の以上は、腫瘍形成の過程と関連している。ヒト癌の60%以上に関連している機能的なp53の欠損は、p53遺伝子自身の突然変異を介して(最も一般的な事象)、またはMDM-2遺伝子の増幅(ある特定の肉腫、および他の癌で見出される)、もしくはp53のヒトパピローマウイルスのE6タンパク質との結合(子宮頸癌で役割を果たし得る)のような他のメカニズムを介して生じ得る(2)。
本発明にしたがって、ヒト疾患を処置することにおける使用のためにさまざまな型の治療分子の腫瘍標的化全身送達を可能にするさまざまな免疫リポソームおよびポリマーを構築している。抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームもしくはポリマー複合体を、単純で有効な非化学的結合法により製造する。これらの複合体は、抗体もしくは抗体断片のリポソームもしくはポリマー複合体との化学的結合により製造された複合体と均しく有効であるか、またはより有効である。抗体断片を使用すると、得られた複合体は、完全な抗体分子を有する同じリポソーム治療剤またはポリマー治療剤複合体よりも、ずっと高いレベルのトランスフェクション効率を引き起こすことができる。
本発明にしたがって、抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性リポソームもしくはカチオン性ポリマー複合体は、望む混合物の構成要素を、一定の比率で、および一定の順序で、一緒に混合する、単純で有効な非化学的結合法により製造する。予想外に、得られた複合体は、抗体または抗体断片がリポソームまたはポリマーと化学的に結合する類似の複合体と均しく有効であるか、またはより有効である。
3'システインを有するTfRscFvの構築および精製
プラスミド発現ベクターpDFH2T-vecOKは、Dr. David Fitzgerald, NCIから入手した。このベクターは、5E9抗体のための一本鎖断片をコードし、それは、ヒトトランスフェリン受容体(CD71)を認識する。VH-リンカー-Vκ TfRscFvは、望む断片のPCR増幅により得た。システイン部分を、TfRscFvタンパク質の3'末端に加えた。このベクターの2つの形態を構築した。最初の形態は、ペリプラスム空間への輸送のためのpelBリーダーシグナル配列、およびHis Tagを含む。His Tagの存在は、タンパク質の検出を助け、したがって、精製プロトコールの開発を単純化する。この形態は、最初の試験のために使用されるが、FDAガイドラインは、外部配列が臨床試験での使用のために存在しないことを薦めている。したがって、これらの配列の両方が存在しない第2形態を製造した。
単純混合によるcys-TfRscFv-リポソームの製造
引用により本明細書の一部とする公開されたPCT出願WO 99/25320は、いくつかのカチオン性リポソームの製造を開示する。製造されたカチオン性リポソームは、透明溶液であり、それらの組成および比率は、下記のとおりである:
単純混合により製造したPanc I細胞でのcys-TfRscFv-リポソームAのトランスフェクション効率を、EGFPレポーター遺伝子Iを用いて評価した。
cys-TfRscFv-免疫リポソーム送達wtp53によるヒト癌細胞株のインビトロ化学増感
単純混合により製造したcys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体が、現在、前立腺癌の処置のために使用されている薬剤GEMZAR(登録商標)(Eli Lilly and Co.により製造されたゲムシタビンHCl)およびNOVANTRONE(登録商標)(ミトキサントロン、Immunex Corp.)に対して、前立腺癌細胞を増感させるのにいかに有効であるかを決定する実験を行った。突然変異p53を有する前立腺癌細胞株DU145を、これらの研究で使用した。XTT細胞毒性アッセイ(66)を、本発明のcys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体により誘導される化学増感のレベルを確立するのに使用した。5 x 103 DU145細胞を、96ウェルプレートのウェルにプレートした。24時間後、細胞を、混合したcys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体でトランスフェクトした。cys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体は、1:30(w:w)(cys-TfRscFv:リポソームA)および1:14(μg p53 DNA: nmoles 全脂質)の比率での混合により製造した。トランスフェクションの1日後、抗癌剤を、増加した濃度で加えた(3回)。XTTアッセイをおよそ3日後に行い、0%増殖阻害を産生する薬剤濃度であるIC50値を計算した。図5Aで示したとおり、cys-TfRscFv-リポソーム-p53複合体を用いた処理は、GEMZAR(登録商標)への細胞の増感を、8倍まで増加させた。図5Aに関して、IC50値(nM)は、下記のとおりである:cys-TfRscFv-LipA-p53: 0.5; cys-TfRscFv-LipA: 4.0; cys-TfRscFv-LipA-Vec: 4.0; 非トランスフェクト: 5.0。Vecとp53の倍率増感(fold sensitization)は、8であり、UTとp53の倍率増感は、10である。
単純混合により製造したcys-TfRscFv-LipA-EGFPによるインビボ腫瘍標的化
DU145腫瘍を、メス無胸腺ヌードマウス(NCR nu/nu)で、皮下で誘導した。マウスを、32 μg DNA/注射で、1/30のscFv:リポソーム比率(DNA:全脂質のさまざまな比率(1/10、1/11、1/12、1/13、1/14)で、単純混合により製造したcys-TfRscFv-LipA-EGFP(高められた緑色蛍光タンパク質)(TfRscFvII)で、24時間に3回、尾静脈に注射した。比較のために、結合法により製造した1/30、1/14の複合体(図7BのTfRscFv III)および1/30、1/14の単一鎖の異なるバッチ(図7BのTfRscFv I)を、また、マウスに注射した。注射の60時間後、マウスを殺し、腫瘍および肺を収集し、タンパク質を、抗EGFP抗体を用いたウエスタンブロット解析のために単離した。非リガンドLipA-EGFP複合体(UL)、Tf-LipA-EGFP複合体(Tf)およびBSA-LipA-EGFP複合体(BSA)を、コントロールとして注射した。図7A - DU145腫瘍で示したとおり、EGFPバンドは、ポジティブコントロールTf、TfRscFvIII、およびTfRscFvIで観察される。より重要なのは、強いEGFPシグナルが、DNAと脂質の比率が1/14で見出された。対照に、非常に弱いレベルのEGFP発現のみが、正常な肺組織で明らかであった。したがって、単純混合により製造したcys-TfRscFv-Lipoplexは、全身投与後、有効に、腫瘍を標的化し得る。
単純混合により製造した、全身に投与したcys-TfRscFv-リポソーム-p53によるヒト異種移植片腫瘍の放射線/化学増感
本発明のcys-TfRscFv-免疫リポソーム複合体が、インビボで腫瘍細胞に結合し、wtp53を効果的に送達する能力をさらに確認するために、有効性研究を行った。およそ60-90 mm3の皮下DU145腫瘍を有するマウスに、cys-TfRscFv-リポソーム-p53を、週3回(全10回の注射)、尾静脈に注射した。この複合体は、1/30(cys-TfRscFv:リポソームA、w:w)および1/14(μg DNA/nmoles 全脂質)の比率で、単純混合により製造した。腫瘍領域を、選択的に、γ放射線の1日の分割線量2.0 Gy(全体で32 Gyまで)に曝した(図8)。cys-TFRscFv-リポソームA複合体+放射線の組合せで処理した動物は、かなりの腫瘍成長阻害を有した。同様の結果が、また、抗癌剤Gemzar(登録商標)およびヒト膀胱癌異種移植片腫瘍(HTB-9)に腫瘍抑制遺伝子Rb94を送達する本発明のcys-TFRscFv-免疫リポソームの組合せを用いて、およびGEMZAR(登録商標)およびアポトーシスを誘導する他の遺伝子(アポプチン)またはp53を有するcys-TFRscFv-リポソームで処理したPanc I異種移植片で、観察された。
単純混合により製造したcys-TFRscFv-リポソームAにより送達されるアンチセンスHER-2オリゴヌクレオチドによるインビトロでの膵臓癌細胞の化学増感
この例は、治療処置のために、遺伝子以外の分子を腫瘍細胞に効果的に送達する本発明の有用性を証明する。複合体は、実施例2のとおり製造したが、ここで封入したDNAは、HER-2遺伝子の開始コドンに向けられた18 merのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(ODN)(AS HER-2)であった(51)。使用した比率は、プラスミドDNAのために上記したとおり、1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:14(nmoles ODN: n mole 全脂質)であった。Panc I細胞を、4x103細胞/ウェルで、96ウェルプレートに播種した。細胞を、24時間後、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-LipA-AS HER-2でトランスフェクトした。Tf-LipA-AS HER-2およびcys-TfRscFv-LipA-SC ODNをコントロールとして使用した。SC ODNは、AS HER-2 ODNと同じヌクレオチド組成を有するが、ランダムな順序であるスクランブルODNである。図9で示したとおり、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-Lip A-AS HER-2複合体は、化学療法剤 GEMZAR(登録商標)の効果に対して膵臓癌細胞株Panc Iを増感させることができた(11倍以上)。この感受性の増加は、ポジティブコントロールTf-LipA-AS HER2複合体でのトランスフェクションから生じたものと同一である。図9に関して、IC50値は、下記のとおりであった: TfRscFv-LipA3-AS-HER-2: 16nM; Tf-LipAe-AS-HER-2: 14nMおよびTfR-scFv-LipAe-SC: 200nM。TfR-scFv-LipAe-AS-HER-2のTfR-scFv-LipAe-SC/IC50のIC50 - 12.5。
単純混合により製造した全身送達cys-TFRscFv-LipA-AS HER-2 ODNによるヒト異種移植片腫瘍のインビボ化学増感
この例では、本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-リポソーム-DNA複合体が、全身送達後、インビボでアンチセンス分子を腫瘍細胞に送達する能力を証明する。この送達系の普遍性を示すために、2個の異なるヒト異種移植片マウス腫瘍モデル(膵臓癌および乳癌)を使用した。最初(図10A)のPanc I皮下異種移植片では、腫瘍を、メス無胸腺ヌード(NCR nu/nu)マウスで誘導した。腫瘍の大きさが100-200mm3であるとき、動物に、化学療法剤 GEMZAR(登録商標)(腹腔内)および本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-LipA AS HER-2(静脈注射)を注射した。複合体は、1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:15 (n mole ODN: n mole 全脂質)の比率を用いて製造した。静脈注射に加えて、上記の複合体をまた、腫瘍内に注射した。動物の第1集団は、GEMZAR(登録商標)のみを受け、第2コントロール集団は、GEMZAR(登録商標)+空ベクターを有する複合体を受けた。GEMZAR(登録商標)のみを用いた処理は、ほとんど膵臓癌の増殖を阻害できなかった。対照に(図10A)、GEMZAR(登録商標)および本発明の方法により製造したcys-TfRscFv-Lip A複合体により送達したAS-HER-2 ODNの組合せは、腫瘍増殖をかなり阻害し、腫瘍退行を生じた。
単純混合により製造したcys-TFRscFv-Liposomeによる、造影剤MAGNEVIST(登録商標)の送達によるMRIイメージの増強
この例は、本発明の方法により、MRI造影剤を封入し、cys-TfRscFv-リポソーム造影剤を形成する能力を証明する。本発明の方法により製造した複合体を、静脈内に投与して、原発性腫瘍および転移腫瘍のための腫瘍イメージの増強を生じ得る。これらの造影剤は、非限定的に、MAGNEVIST(登録商標)(Gd-DTPA)(Schering AG)を含み得る。単純混合により複合体を形成するために使用する比率は、1:30(cys-TfRscFv:リポソーム、w:w)および1:14 (ug 造影剤:nmoles 脂質)の好ましい比率である。これらの研究では、16 μlのMAGNEVIST(登録商標)を複合体中に使用した。
単純混合による立体的に安定した免疫リポソームの製造
リポソーム複合体は、細網内皮系により、血流から素早く除去される。この循環時間を延長するために、リポソーム複合体に組み込まれた親水性ポリマー、例えば、PEGを有する立体的に安定したリポソームを製剤した。PEG-リポソーム複合体中に、標的化リガンド、例えば、抗体または抗体断片を含む、さまざまな方法が考え出された。これらの方法論のすべてではないが、その多くは、抗体または抗体断片をPEGに結合させるために、化学的結合工程を含む。複合体を形成するために使用するそのような激しい化学反応および方法は、抗体活性の欠失または遮蔽を生じ得る。この例では、我々は、cys-TfRscFvタンパク質が、単純結合によりPEG-リポソーム分子に結合し得て、得られた複合体は、ヒト腫瘍細胞にトランスフェクトするのにより有効であり得ることを証明する。
単純混合による小分子(GMC-5-193)含有免疫リポソームの製造および特徴付け
小分子GMC-5-193のインビトロおよびインビボでの抗癌効果を改善するために、小分子を含む腫瘍標的化リポソーム複合体を製造した。TfRscFv/LipA複合体に加えて、エンドソーム破壊ペプチド(LipA-HoKC)と結合したカチオン性リポソームもまた、製造した。エンドソーム破壊ペプチドHoKCは、細胞の細胞質でのGMC-5-193の放出を助け、細胞質でのチューブリン重合に影響を与え得る。リガンド-リポソーム複合体は、選択的に、それらの表面上の相当する受容体の高められたレベルにより、腫瘍細胞を標的化する。リガンド-リポソーム送達遺伝子の高レベルの発現は、原発性腫瘍および転移腫瘍で明らかであるが、正常組織、例えば、肝臓、肺、骨髄、および腸陰窩では明らかではない。この例では、トランスフェリン受容体一本鎖(TfRscFv)を含む本発明のリポソーム複合体を、インビトロおよびインビボで癌細胞にGMC-5-193を送達するために使用し、GMC-5-193を含むリポプレックスのインビトロおよびインビボでの生物有効性を評価した。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)から購入した。K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC)(配列番号2)ペプチドは、Sigma-Genosys(The Woodlands, TX)により製造された。
化合物GMC-5-193を、バージニア大学の化学学科で合成した。それは、359.4 Daの分子量を有し、その構造は、質量分析およびNMRにより確認した。アミドプロトンおよびアミンプロトンのpKa値は、それぞれ、15および9であった。化合物の2.5 mg/mLストック溶液を、DMSOで製造した。
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)およびマウス黒色腫細胞株B16/F10(CRL-6475)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から取得した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。B16/F10(ATCC, CRL-6475)は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231、およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。転移性細胞株MDA435/LCC6は、MDA-MB-435腹水から開発した。MDA435/LCC6は、5% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したIMEMで培養した。Dr. I. Panyutin (Nuclear Medicine Department, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から贈られた正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸+10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2のモル比でのDOTAP: DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載した、および米国特許出願第09/914,046号に記載したエタノール注入法を用いて製造し、その開示は、引用によりその全体を本明細書の一部とする。TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体を、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのGMC-5-193を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。GMC-5-193とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7または2.8:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標) 3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
HoKCペプチドおよびLipA-MPB(1:1:0.1から1:2:0.1のモル比での、DOTAP: DOPE: MPB-DOPE またはDDAB:DOPE:MPB-DOPE)を用いた使用のためのカチオン性リポソーム製剤を、エタノール注入法を用いて製造した。LipA-HoKCリポソームを、次いで、以前記載したとおり、マレイミド基を有するカチオン性リポソームと末端システイン基を有するペプチド間のカップリング反応を用いて製造した。Yu, W., et al., “Enhanced transfection efficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolysine peptide.” Nucleic Acids Research 32:e48 (2004)。システイン上に遊離チオール基を有する0.1 mmolのペプチドのアリコートを、10 mM HEPES(pH 7.4)溶液中、2 mmolのLipA-MPBに加え、室温で2時間、回転させた。生じたLipA-HoKCは、1.4 mMの脂質濃度を有した。TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体は、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipA-HoKCとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipA-HoKCの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのGMC-5-193を、室温で、倒置による混合または撹拌により加え、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。GMC-5-193とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7または2.8:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標) 3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの適当な増殖培地中、各細胞株の5から5.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、無血清培地中、増加した濃度で、100 μLのTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)または遊離GMC-5-193を入れ、4-6時間、適当には、5時間、インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、さらに、24-72時間、適当には、48時間、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃でインキュベートした。その後、ウェルを、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
化学増感研究のために、100 μL中、4〜5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)または遊離GMC-5-193を、GMC-5-193として1.25〜2.5 μMで入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドキソルビシン(Bedford Labs, Bedford, OH)、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)およびシスプラチン(CDDP; Bedford Labs, Bedford, OH)であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
共焦点像のために、5.0 × 104細胞/ウェルのMDA-MB-435を、24ウェルプレートのガラス上に播種し、24時間後、無血清培地で洗浄し、TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)または遊離GMC-5-193で処理し、6時間インキュベートした。処理の6時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、PBS中、4%パラホルムアルデヒドで固定し、再び、PBSで洗浄した。次いで、細胞を、PROLONG(登録商標) Antifade Kit (Molecular Probes, Eugene, OR)を用いて、スライドガラス上に載せた。核染色のために、固定した細胞のためのSelect FX Nuclear Labeling Kitでの青色蛍光対比染色であるDAPI(Molecular Probes)を、製造者のプロトコールにしたがって使用した。イメージングのために、GUMC Microscopyに置かれたOlympus FLUOVIEW(登録商標)-300レーザー走査共焦点システムおよびImaging Shared Resource (MISR)を使用した。
PBSに懸濁したヒト転移性細胞MDA435/LCC6(8×106)を、無胸腺ヌードマウスの尾静脈に注射した。MDA-MB-435/LCC6異種移植片腫瘍を有するマウスを、マウスあたり9 mg/kg GMC-5-193で、遊離GMC-5-193、TfRscFv/LipA/GMC-5-193、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193またはLipA/GMC-5-193(非リガンド複合体)を用いて、静脈注射した。これは、2.8:7のモル比である(小分子:リポソーム)。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。注射の3時間後、肝臓、肺および任意の他の可視腫瘍を切り取り、蛍光顕微鏡(Nikon SMZ-1500 EPI-Fluorescence立体鏡システム)下で調べた。
PBSで懸濁したマウス黒色腫細胞B16/F10(1×105)を、C57BL/6マウスの尾静脈に注射した。B16/F10腫瘍を有するマウスを、遊離GMC-5-193のみ、またはTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(所望により、TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)のみまたはCDDPとの組合せを用いて、3 mg/kg GMC-5-193/注射の用量で、週に2、3回、全体で7回、静脈注射した。各複合体中のGMC-5-193とLipAまたはLipA-HoKCのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。ある集団はまた、CDDPのみを、週2回の注射、全体で6回の注射を受けた。最初の2回のCDDP注射は、2.5 mg/kgであった。あらゆる次の注射は、2 mg/kgであった。処理の3週間後、マウスを殺し、肺を切り取り、各マウスから血液を回収した。器官を、10% ホルムアルデヒドで固定し、撮影前に、70% エタノールで保存した。
マウスの逆眼窩血脈洞(retroorbital sinus)から収集した血液を、室温で1時間凝固させた後、室温で10分間、1,000 rpmで遠心分離した。血清を、新しいチューブに移し、再び、10,000gで20分間、遠心分離した。上清を、P-30 Micro-Bio-Spin Chromatography Column (BIORAD, Hercules, CA)を用いて精製した。画分の15マイクロリットルを、4%から12%の勾配NuPAGEゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)に載せ、10kDaのタンパク質がゲルを流れきるまで流した(およそ、1.5から2時間)。電気泳動後、タンパク質を、Protran BA 85ニトロセルローストランスファーメンブレン(Schleicher and Schuell, BioScience, Keene, NH)に移した。最後に、切断されたカスパーゼ-3のウエスタンブロット解析を、切断カスパーゼ-3(17 kD)抗体を用いて行った。非特異的結合を妨害するために、メンブレンを、150 mM NaClおよび0.05 % Tween 20 (TBST)を含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 8.0中、5 % 脱脂乾燥ミルクを用いて、室温で1時間、インキュベートした。ブロットを、5%ミルクTBSTで1:1000希釈の切断カスパーゼ-3ウサギ一次抗体(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)を用いて、4℃で一晩、プローブし、次いで、TBSTで、3回洗浄した(各15分)。タンパク質を、ヤギ抗ウサギ二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、ECLウエスタンブロッティング検出剤、およびHyperfilm ECL (Amersham, Piscataway, NJ)を用いて検出した。
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体を、上記で詳述したとおり製造し、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体中の小分子とリポソームのモル比を最適化した。DU145ヒト前立腺癌細胞におけるGMC-5-193とLipA-HoKCの異なる比率での複合体GMC-5-193の細胞毒性効果を調べた。5.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体または遊離GMC-5-193で処理した。XTTアッセイは、細胞毒性を評価するために処理の48時間後に行い、IC50(50% 成長阻害を産生する薬剤濃度)値を、濃度-細胞生存曲線から計算した。図13は、各複合体で処理したDU145細胞のIC50値を示す。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。2:7〜7:7のGMC-5-193とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、IC50値を、7.7±0.9 μMから2.2±5 μMまで減少させた。8:7のGMC-5-193とリポソームのモル比で。複合体もしくは遊離GMC-5-193でトランスフェクトした細胞のIC50値は、類維持していた。2:7〜7:7のGMC-5-193とリポソームのモル比の範囲で、複合体GMC-5-193で処理したDU145細胞のIC50値の有意な差異が存在しなかったので、7:7のGMC-5-193とリポソームのモル比でのGMC-5-193複合体を、さらなる実験のために選択した。7:7(すなわち、1:1)のGMC-5-193とリポソームのモル比での複合体GMC-5-193の粒子サイズは、5 % デキストロース中、約300 nmであった。
図14は、異なる細胞株(DU145、MDA-MB-435、MDA435/LCC6、B16/F10)での複合体GMC-5-193および遊離GMC-5-193の細胞殺傷のレベルの比較を示す。ここで、4〜5.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体、遊離GMC-5-193で処理した。GMC-5-193の濃度は、50 nM〜31.25 μMであった。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。XTTアッセイを、細胞毒性を評価するために処理の48時間後に行い、IC50値を計算した。TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193で処理したDU145、MDA435/LCC6およびB16/F10細胞のIC50値は、遊離GMC-5-193で処理したものよりも低く、この分子に対する増加した増感を示した。MDA-MB-435は、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体または遊離GMC-5-193に対して類似の増感を示した。遊離および複合体GMC-5-193間の増感における最大の差異は、DU145細胞(遊離で7.9μMから複合体で3.2μMまで、IC50値を減らした)およびB16/F10細胞(6.6 ± 0.8 μMから4.2 ± 0.0 μMまでの範囲でIC50値を減少させた)で見られた。
表III. XTT生存アッセイで取得したIC50値(μM)*
したがって、GMC-5-193を本発明のTfRScFv/LipA-HoKCと複合体化させることは、現在、当業者に使用されている遊離小分子に対する応答と比較して、小分子に対する複数のヒトおよびマウス細胞株の応答を増加させる。
GMC-5-193は、微小管破壊および抗血管新生効果を有する。遊離およびリガンド/リポソーム複合体GMC-5-193の慣用的な化学治療剤との組合せの効果を、慣用的な化学治療剤の抗癌効果を高めるか否かを決定し、遊離小分子と比較した複合体小分子の増強のレベルを比較するために研究した。ドキソルビシンに対してMDA-MB-435ヒト黒色腫細胞を増感させるリガンド/リポソーム/GMC-5-193(TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)複合体の能力を調べ、結果を、図15Aに示す。ここで、4.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体、遊離GMC-5-193またはLipA-HoKCのみで処理した。GMC-5-193の濃度は、ウェルあたり1.25μMであった。複合体内のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体内の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。24時間後、ドキソルビシンを、2.07〜2070 ng/mLの増加した濃度で加えた。48時間後、XTTアッセイを、処理に応答する細胞生存を評価するために行った。図15Aの各点は、3回のサンプルの平均±標準偏差を表す。IC50値は、50%増殖阻害を生じる薬剤濃度を示す。UT = 非トランスフェクション。アントラサイクリン系抗生物質であるドキソルビシンは、それが、最も一般的な化学治療剤の1つであり、乳癌のために、微小管標的化チュームリン重合剤との組合せ療法で使用されていたので選択した。IC50値を計算した。GMC-5-193なしのLipA-HoKCでトランスフェクションした細胞は、非トランスフェクション細胞と類似したIC50を示し、それは、リポソーム自身が非毒性であることを示す。遊離GMC-5-193で処理した細胞は、IC50のわずかな減少を示したが、有意な差異はなく、これは、遊離GMC-5-193が、細胞増殖を効率的に阻害しないことを示す。しかしながら、増感のかなりの増加(〜50倍)が、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、複合体GMC-5-193で処理した細胞で観察され、IC50値を、300から8 ng/mLまで減少させた。
共焦点像は、遊離GMC-5-193として送達したときと、標的化リポソーム(HoKCペプチドの有無)と複合体を形成したときのGMC-5-193の内在化を比較するために使用し、GMC-5-193の固有の蛍光を利用した。MDA-MB-435細胞を、遊離GMC-5-193または複合体GMC-5-193に6時間曝し、次いで、PBSで洗浄し、PBS中、4%パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点顕微鏡で視覚化した。図19Aは、遊離GMC-5-193の吸収とTfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体により細胞に送達された吸収間の比較を示し; 図19Bは、遊離GMC-5-193の吸収とTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (scLHK-GMC)複合体により送達された吸収間の比較を示す。5 x 104細胞/ウェルを、24ウェルプレート中のスライドガラスに播種し、24時間後、TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体または遊離GMC-5-193で処理した。複合体中のGMC-5-193とLipAまたはLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。処理の6時間後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、PBS中、4% パラホルムアルデヒドで固定し、スライドガラスに載せた。Olympus FLUOVIEW(登録商標)-300レーザー走査共焦点システムを、蛍光を視覚化するために用いた。細胞によるかなりの増加した蛍光吸収は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、小分子GMC-5-193を、本発明のTfRScFv/LipAもしくはTfRScFv/LipA-HoKC複合体と複合体化させるとき、観察された。
腫瘍保有動物を作製するために、PBSに懸濁したMDA435/LCC6ヒト黒色腫細胞(8×106)を、無胸腺ヌードマウスの尾静脈に注射した。
主に肺にMDA435/LCC6異種移植片腫瘍を有するマウスに、遊離GMC-5-193、非標的化LipA/GMC-5-193(L-GMC)またはTfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)を、マウスあたり9 mg GMC-5-193/kgで、静脈注射した。複合体中のGMC-5-193とLipAのモル比は、1:2.5(2.8:7と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。注射の3時間後、肝臓および肺を切り取り、蛍光顕微鏡下で調べた。転移は、微小なものから小さな可視転移まで大きさが変わった。図20Aは、明視野および蛍光での同じ視野撮影を示す。TfRscFv/LipA-GMC-5-193複合体が、GMC-5-193を肺の腫瘍細胞へ特異的に送達できることがはっきりと見られる。遊離GMC-5-193で処理したマウスの明視野像で、巨大な腫瘍が肺の周辺で観察できる(肝臓への転移を伴う)。しかしながら、蛍光像は、すべての組織で非常に弱い蛍光を示す。非標的化複合体(LipA/GMC-5-193 (L-GMC))は、肺および肝臓で非常に弱いシグナルを示し、腫瘍特異性を示さなかった。対照に、TfRscFv/LipA/GMC-5-193複合体(scL-GMC)を注射したマウスでは、GMC-5-193の蛍光シグナルが、肺転移でずっと強かった(正常な肺組織のより明るい泡状外観と比較して、より密集した外観による明視野像で区別可能である)。さらに、非常に弱いバックグランドシグナルが、複合体GMC-5-193で処理したマウスの正常な肝臓で観察され、再び、腫瘍特異性を証明する。これらの結果は、全身投与後のGMC-5-193の腫瘍特異的吸収が、GMC-5-193がTfRscFv/LipA複合体に組み込まれるとき高められることを示す。
主に肺にMDA-MB-435/LCC6 異種移植片腫瘍を有するマウスに、遊離GMC-5-193(図20B(パネルB))またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(図20B(パネルA))を、マウスあたり9 mg GMC-5-193/kgで、静脈注射した。複合体中のGMC-5-193とLipA-HoKCのモル比は、1:2.5(2.8:7と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片の比率は、1:30(w:w)であった。注射の3時間後、肝臓および肺を切り出し、蛍光顕微鏡下で調べた。転移は、微小なものから小さな可視転移まで大きさが変わった。同じ視野を、明視野および蛍光で撮影する。リガンド-リポソーム複合体が、GMC-5-193を肺の腫瘍細胞へ特異的に送達できることがはっきりと見られる(図20B(左手パネル))。遊離GMC-5-193で処理したマウスの明視野像で(図20B(右手パネル))、巨大な腫瘍が肺の周辺で観察できる(肝臓への転移を伴う)。しかしながら、蛍光像は、すべての組織で非常に弱い蛍光を示し、肝臓の転移で蛍光を示さなかった。これらの結果は、全身投与後のGMC-5-193の腫瘍特異的吸収が、GMC-5-193がTfRscFv/LipA-HoKC複合体に組み込まれるとき高められることを示す。
B16/F10腫瘍を有するC57BL/6マウスを、CDDPまたはTfRscFv/リポソーム/GMC-5-193複合体(TfRscFv/LipA/GMC-5-193もしくはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)のみまたはCDDPとの組合せで注射した。複合体中のGMC-5-193とLipAまたはLipA-HoKCのモル比は、1:1であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図21A-21Cは、処理の3週間後の各マウスの肺の写真を示す。B16/F10の多発性転移を、処理を受けなかった(UT)マウスの肺で観察した。図21Aでは、マウスは、GMC-5-193の静脈注射を、3 mg GMC-5-193/kg/注射で、週に2、3回、計7回受けた。これらの結果は、複合体GMC-5-193(HoKCペプチドの有無)が、単一薬剤処理としての遊離GMC-5-193よりもよいことを示す。図21Bおよび21Cでは、マウスはまた、GMC-5-193の静脈注射を、3 mg GMC-5-193/kg/注射で、週に2、3回、計7回受けた。CDDPを受けた集団では、CDDPを週に2回、全体で6回の注射で投与した。CDDPの最初の投与は、2.5mg/kgであったが、すべての次の投与は、2.0mg/kgであった。TfRscFv/リポソーム/GMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193)複合体+CDDPの組合せを用いて処理したマウスは、肺転移の数のかなりの減少を示した(図21B)。図21Cでは、TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scL-HK-GMC)複合体+シスプラチンの組合せで処理したマウスは、単一薬剤処理(複合体またはCDDP)と比較して、肺転移の数のかなりの減少を示した。
DU145細胞、B16/F10細胞、およびより少ない程度に、MDA435/LCC6細胞は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較して、TfRscFv/LipA/GMC-5-193またはTfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193複合体で処理した細胞の高められた感受性を示した(図14)。GMC-5-193の複合体化はまた、さまざま化学療法剤に対する複数の腫瘍細胞株(ヒトおよびマウス)の増感を生じた。共焦点像は、GMC-5-193が、遊離GMC-5-193よりも複合体GMC-5-193でより効率的にMDA-MB-435細胞に吸収されることを明らかにした(図19Aおよび19B)。より強い緑色蛍光は、遊離GMC-5-193で処理した細胞と比較してGMC-5-193複合体で処理した細胞で観察された。興味深いことに、GMC-5-193緑色蛍光は、GMC-5-193複合体で処理した細胞で、細胞全体にわたって等しく観察されたが、遊離GMC-5-193で処理した細胞では、緑色蛍光は、細胞質よりも核でより観察された。リガンド化したリポソーム複合体へのGMC-5-193の組み込みは、細胞吸収を高め、細胞内のGMC-193の局在様式を変えた。
単純混合による小分子(YK-3-250)含有免疫リポソームの製造および特徴付け
小分子YK-3-250(微小間破壊化合物)のインビトロおよびインビボでの抗癌効果を改善するために、小分子を含む腫瘍標的化リポソーム複合体を製造した。TfRscFv/LipA複合体に加えて、エンドソーム破壊ペプチドを結合したカチオン性リポソームをまた、本明細書に記載したとおり、製造および研究した。エンドソーム破壊ペプチドHoKCは、細胞の細胞質でのYK-3-250の放出を助け、細胞質でのチューブリンの重合に影響を与え得る。リガンド-リポソーム複合体は、それらの表面上の相当する受容体の高められたレベルにより、腫瘍分子を選択的に標的化する。リガンド-リポソーム送達遺伝子の高レベルの発現は、肝臓、肺、骨髄、および腸陰窩のような正常な組織ではなく、原発腫瘍および転移で明らかであった。本実施例では、トランスフェリン受容体一本鎖(TfRscFv)を含む本発明のリポソーム複合体を、YK-3-250を癌細胞に送達するのに使用し、YK-3-250を含むリポソーム複合体のインビトロ生物学的効果を評価した。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC)(配列番号2)ペプチドは、Sigma-Genosys (The Woodlands, TX)により製造された。
ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435は、10% 熱不活性化FBS、2 mM L-グルタミン、ならびに各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良型MEM(IMEM)で培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2モル比のDOTAP: DOPEまたはDDAB:DOPE)を、本明細書に記載したエタノール注入法を用いて製造した。濃度は、2mMである。TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体は、下記のとおり製造した:室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)のTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのYK-3-250を加え、倒置または撹拌により混合し、好ましくは、室温で10分間、インキュベートした。YK-3-250とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いた25℃での動的光散乱により決定した。
カチオン性リポソーム製剤およびLipA-MPB(1:1:0.1から1:2:0.1のモル比でのDOTAP: DOPE: MPB-DOPEまたはDDAB:DOPE:MPB-DOPE)を、エタノール注入法を用いて製造し得る。LipA-HoKCを、次いで、本明細書に上記したとおり、マレイミド基を有するカチオン性リポソームとペプチド含有末端システイン基間のカップリング反応を用いて製造する。システイン上に遊離チオール基を有する0.1 mmolのペプチドのアリコートを、10 mM HEPES (pH 7.4)溶液中、2 mmolのLipA-MPBに加え、室温で2時間、回転させた。生じたLipA-HoKCは、1.4 mMの脂質濃度を有する。好ましくは、室温で、回転または撹拌を用いて、LipA-HoKCとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)のTfRscFvとLipA-HoKCの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのGMC-5-193を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。YK-3-2503とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定する。
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの各細胞株の適当な増殖培地中、5から5.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で、無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/YK-3-250、Lip Aのみまたは遊離YK-3-250を入れ、4-6時間、好ましくは、5時間インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、さらに、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で24-72時間、好ましくは、48時間インキュベートした。その後、細胞をフェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体を製造し、TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体中の小分子とリポソームのモル比を最適化した。MDA-MB-435癌細胞において、YK-3-250とLipAの異なる比率での複合体および遊離YK-3-250の細胞殺傷効果を比較した。TfRscFvとLipAの比率は、1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)であった。5.5 x 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA/YK-3-250複合体、LipAのみまたは遊離YK-3-250で処理した。XTTアッセイを、細胞毒性を評価するために処理の48時間後に行い、IC50値(50%増殖阻害を産生する薬剤濃度)を、濃度-細胞生存曲線から計算した。図23Aは、各処理のためのMDA-MB-435のIC50値を示す。6:7〜8:7のYK-3-250とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少は、遊離YK-3-250、または遊離LipAを用いて処理した細胞と比較して、複合体YK-3-250で処理した細胞で観察され、IC50値を、>300nMから16 nMまで減少させた(7:7のYK-3-250とリポソームのモル比では、8 nMまで減少した)。
単純混合による小分子(メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標)))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
以前、STI-571として既知のGLEEVEC(登録商標)(メシル酸イマチニブ; Novartis Pharmaecuticals Corp., East Hanover, NJ)は、腫瘍細胞の成長および増殖のシグナルを伝達する経路を妨害する抗増殖剤(シグナル伝達阻害剤)である。メシル酸イマチニブは、Bcr-Abl、c-KITおよびPDGF受容体αおよびβを含む受容体チロシンキナーゼのグループを選択的に阻害し、細胞増殖の破壊および最終的には細胞死を生じる。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)およびマウス黒色腫細胞株B16/F10(CRL-6475)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から入手した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。B16/F10(ATCC、CRL-6475)は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸+10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2のモル比でのDOTAP:DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載したエタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体は、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30(wt/wt)のTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのメシル酸イマチニブを加え、倒置または撹拌により混合し、室温で10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。メシル酸イマチニブとリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
インビトロ毒性研究のために、100 μの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から5.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体または遊離メシル酸イマチニブを入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で、さらに、24-72時間、適当には、48時間インキュベートした。その後、細胞を、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜5.5×103細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ複合体または遊離メシル酸イマチニブを、15から30 μMメシル酸イマチニブで載せ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度で、化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションをおよそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドキソルビシン(Bedford Labs, Bedford, OH)、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)、シスプラチン(CDDP; Bedford Labs, Bedford, OH)、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標), Eli Lilly and Co., Indianapolis IN)およびダカルバジン(DTIC)(Mayne Pharmaceuticals, Paramus NJ)であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクション/IC50各複合体。
PBSに懸濁したマウス黒色腫細胞B16/F10(1×105)を、C57BL/6マウスの尾静脈に注射した。4日後、B16/F10腫瘍を有するマウスに、遊離メシル酸イマチニブ;CDDPのみまたはCDDPと組み合わせたTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブを、0.5 mg/kgメシル酸イマチニブの用量で、静脈注射した。注射は、週に3回、全体で9回行った。混合物中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各混合物中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。ある集団はまた、CDDPのみを受けた。CDDPを週2回、2mg/kgで、全体で6回注射した。処理の3週間後、マウスを殺し、肺を切り取った。器官を、10% ホルムアルデヒドで固定し、撮影前に70%エタノールで保存した。
封入および遊離メシル酸イマチニブの比較
細胞生存に関して、遊離メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))の有効性を、ヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図24A)およびヒト黒色腫細胞株(MDA-MB-435)(図24B)、およびマウス黒色腫細胞株(B16/F10)(図24C)で、XTTアッセイにより評価した(本明細書に記載したとおりである)。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。メシル酸イマチニブを、DMSOまたは水に溶解させた。図24Aで証明したとおり、リポソーム複合体送達メシル酸イマチニブを用いたDU145細胞の処理は、DMSOまたは水に溶解させた遊離メシル酸イマチニブと比較して、細胞殺傷の5倍以上の増加を示した。
第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞(ヒトおよびマウス)を増感させるために、‘遊離’またはリポソーム複合体により送達したメシル酸イマチニブの能力を、また、XTTアッセイで評価した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435を、20μMまたは30μMの遊離もしくは複合体メシル酸イマチニブで処理し、その後、漸増用量のタキソテールを加えた。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図25Aで示したとおり、20μMのメシル酸イマチニブ濃度で、遊離メシル酸イマチニブを投与したときと比較して、メシル酸イマチニブをリポソーム複合体(scL- GLEEVEC(登録商標))により送達するとき、化学療法剤に対するほぼ50倍の増加が存在する。この用量で、遊離メシル酸イマチニブは、タキソテールに対して細胞を増感させない。さらに、用量依存性化学感受性の増加が観察された。30μMのメシル酸イマチニブで、遊離メシル酸イマチニブは、およそ4倍の増感を示したが、リポソーム複合体メシル酸イマチニブを用いた応答は、非常に劇的であり、IC50値は、決定できなかった(図25B)。
PBSに懸濁した1×105 B16/F10マウス黒色腫細胞を、C57BL/6マウスの尾静脈に注射した。4日後、B16/F10肺転移を有するマウスに、シスプラチン(CDDP)のみ、シスプラチンと組み合わせた遊離メシル酸イマチニブもしくはTfRscFv/LipA/メシル酸イマチニブ(scL-GLEEVEC(登録商標))複合体を注射した。各複合体中のメシル酸イマチニブとLipAのモル比は、7:7であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。マウスは、0.5 mg メシル酸イマチニブ/マウス/注射で、週3回、全体で9回の遊離メシル酸イマチニブまたはscL-GLEEVEC(登録商標)複合体の注射を受けた。CDDPを、2 mg/kgの用量で、週2回、全体で6回、腹腔内注射した。処理の3週間後、マウスを、人道的に安楽死させ、肺を切り取り、撮影した。
メシル酸イマチニブは、フィラデルフィア染色体陽性(Ph+)慢性骨髄性白血病(CML)およびKIT(CD117)陽性切除不能および/または転移生悪性腫瘍 Gastrointestinal Stromal Tumors (GIST)を患う患者の処置のために承認されている。それは、Bcr-Abl、c-KITならびにPDGF受容体αおよびβを含む多くのチロシンキナーゼをインビトロで阻害することが示された。したがって、該薬剤は、これらのキナーゼを発現する他の癌の処置のための潜在性を有する。これらの研究で、我々は、腫瘍細胞死(乳癌、前立腺癌および膵臓癌で)を誘導し、第1選択化学療法剤に対するそれらの応答を増加させるメシル酸イマチニブの有効性が、本発明の標的化リポソーム送達複合体により細胞を送達するとき劇的に改善されることを証明した。これらの結果は、メシル酸イマチニブの効果を大いに増加させるナノ複合体の能力を証明する。
単純混合による小分子(エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
TARCEVA(登録商標)(エルロチニブ、Genentech Inc, So. San Francisco CA)は、1型ヒト上皮成長因子受容体/上皮成長因子受容体(HER1/EGFR)チロシンキナーゼ阻害剤である。このチロシンキナーゼは、非小細胞肺癌および膵臓癌での細胞増殖に重要な因子の1つである。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
ヒト前立腺癌細胞株DU145 (HTB-81)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から入手した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸+10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2のモル比でのDOTAP: DOPEまたはDDAB:DOPE)を、本明細書に記載したとおり、エタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体は、下記のとおり製造した: 室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのエルロチニブを加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。エルロチニブとリポソームのモル比は、0.2:7から14:7まで、より適当には、2:7から8:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃での動的光散乱により決定した。
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から3.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で、無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体または遊離エルロチニブを入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で、さらに、24-72時間、適当には、48時間インキュベートした。その後、ウェルを、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜3.5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/エルロチニブ複合体または遊離エルロチニブを、3から8μMのエルロチニブで入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)およびゲムシタビン(GEMZAR(登録商標), Eli Lilly and Co., Indianapolis IN )であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
封入および遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))の比較
細胞生存に関して、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))の有効性を、ヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図32A)、ヒト膵臓癌細胞株(PANC-1)(図32B)およびヒト黒色腫細胞株(MDA-MB-435)(図32C)で、XTTアッセイ(本明細書に記載したとおりである)により評価した。各複合体におけるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7であった。各複合体における一本鎖抗体断片とリポソームの比は、1:30(w:w)であった。エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))を、水に溶解させた。図32Aで証明したとおり、リポソーム複合体送達エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))を用いたDU145の処理は、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))と比較したとき、5倍以上の細胞殺傷を生じた。
第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞を増感させる、遊離’またはリポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))により送達されるエルロチニブ(TARCEVA(登録商標))の能力を、また、XTTアッセイにより評価した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435を、3.75μMまたは7.5μMの遊離もしくは複合体エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))で処理し、その後、漸増用量のミトキサントロンを加えた。各複合体中のエルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30 (w:w)であった。図33Aで示したとおり、3.75μM エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))の濃度で、遊離エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))を投与したときと比較して、エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))を、リポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))で送達したとき、化学療法剤に対する応答がほぼ13倍増加した。この用量では、遊離エルロチニブは、ミトキサントロンに対して細胞を増感させない。さらに、化学増感の用量依存増加は、エルロチニブ(scL-TARCEVA(登録商標))を本発明の方法により送達したときおよび遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))として送達されたとき観察された。7.5μM エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))で、scL-TARCEVA(登録商標)を用いた処理後のミトキサントロンに対するDU145細胞の増感のレベルは、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))のそれよりも34倍高かった(図33B)。対照に、この高い用量においてさえ、遊離エルロチニブ(TARCEVA(登録商標))は、化学療法剤に対する応答効果を示さなかった。
単純混合による小分子リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
腎細胞癌(RCC)および消化管間質腫瘍(GIST)を含む多くの癌は、単一のよく定義された突然変異または異常とは反対に、複数のシグナル伝達経路における突然変異または他の異常から生じる。これらの変化は、最終的には、癌増殖に重要な過程を可能にし、それは、下記を含む:増殖シグナルの自律性、増殖阻害シグナルへの非感受性、プログラムされた細胞死(アポトーシス)の回避、無制限の複製潜在性、持続した血管新生、ならびに組織浸潤および転移。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、RCCおよびGIST進行に関与するいくつかの受容体キナーゼを同時に阻害する、経口複数キナーゼ阻害剤である。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))は、腫瘍細胞増殖および血管新生の両方で役割を果たすあらゆる既知のPDGFおよびVEGF受容体を同時に阻害する。SUTENT(登録商標)は、PDGF、VEGF、およびKIT受容体を同時に阻害する最初の複数キナーゼGIST療法である。SUTENT(登録商標)は、RCCおよびGISTにおける前臨床試験で、周皮細胞においてPDGF受容体および内皮細胞においてVEGF受容体を阻害することによる血管新生活性を証明した。SUTENT(登録商標)は、前臨床試験で、腫瘍退行を誘導し、血管新生および転移進行を阻害した。SUTENT(登録商標)は、したがって、複数のシグナル伝達経路を阻害し、その結果、二重の抗増殖および抗血管新生効果を生じる。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレート DOPE (MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から取得した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト膵臓癌細胞株PANC-1は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。Dr. I. Panyutin (Nuclear Medicine Department, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から贈られた正常なヒト肺線維芽細胞IMR-90は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。正常な(非癌性)皮膚線維芽細胞株H500は、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM 非必須アミノ酸+10% 熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L-グルタミンおよび各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEMEMで培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2モル比でのDOTAP:DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載したとおり、エタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体は、下記のとおり製造した: 室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7、より適当には、3:7から11:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃で、動的光散乱により決定した。
インビトロ毒性研究のために、100 μの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から3.5 × 103細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体または遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境中、37℃で、さらに、24-72時間、適当には、48時間インキュベートした。その後、細胞を、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜3.5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体または遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を、2から6μMのリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、ミトキサントロン(NOVANTRONE(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)およびゲムシタビン(GEMZAR(登録商標), Eli Lilly and Co., Indianapolis IN )であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体を製造し、TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体の小分子とリポソームのモル比を最適化した。DU1455ヒト前立腺癌細胞で、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAの異なる比率で、複合体および遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の細胞殺傷効果を比較した。TfRscFvとLipAの比率は、1:30(wt/wt)であった。3 x 103 細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))複合体、または遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を用いて、処理した。XTTアッセイは、細胞毒性を評価するために、処理後72時間で行い、IC50(50%成長阻害を産生する薬剤濃度)は、濃度-細胞生存曲線から計算した。図37は、各比率のためのIC50値を示す。3:5〜7:7のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少が、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で処理した細胞と比較して、複合体リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で処理した細胞で観察された。
細胞生存に関して、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の有効性は、ヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図38A)、およびヒト膵臓癌細胞株(PANC-1)(図38B)で、XTTアッセイ(本明細書に記載したとおり)により評価した。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図38Aで証明したとり、リポソーム複合体送達リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を用いたDU145細胞の処置は、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較して、かなりの細胞殺傷の増加を生じた。
第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞を増感させる、遊離’またはリポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))により送達されるリンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の能力を、また、XTTアッセイにより評価した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435を、2.5μMまたは5μMの遊離もしくは複合体リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で処理し、その後、漸増用量のタキソテールを加えた。各複合体中のリンゴ酸スニチニブ (SUTENT(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30 (w:w)であった。図39Aで示したとおり、2.5uM リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))の濃度で、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))と比較して、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))リポソーム複合体(scL-SUTENT(登録商標))で送達したとき、化学療法剤に対する応答が8倍以上増加した。さらに、化学増感の用量依存増加は、リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))を本発明の方法により送達したとき、観察された。5μM リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))で、増感のレベルは非常に高く、IC50値には影響しなかったが、scL-SUTENT(登録商標)での処理後、タキソテールに対するMDA-MB-435細胞の増感レベルは、遊離リンゴ酸スニチニブ(SUTENT(登録商標))のレベルの300倍以上であることが見積もられた(図39B)。
単純混合による小分子(ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)))含有免疫リポソームの製造および特徴付け
ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))は、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)阻害剤として既知である最初の新規クラス抗癌剤であり、市場の承認を得て、現在では、世界36カ国で、進行した非小細胞肺癌(NSCLC)の処置のために認可されている。癌細胞を含む多くの細胞は、それらの表面に、上皮増殖因子(EGF)のために、正常に身体で産生され、細胞の成長および増殖を促進するタンパク質である受容体を有する。EGFが上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合すると、チロシンキナーゼと呼ばれる酵素が細胞内で活性化される。チロシンキナーゼは、癌細胞を含む細胞が、成長し、増殖し、拡張する化学過程を誘導する。ゲフィチニブは、EGFRに結合し、それにより、EGFの結合およびチロシンキナーゼの活性を妨害する。癌細胞が成長および増殖するのを止めるメカニズムは、化学療法およびホルモン療法のメカニズムとは非常に異なる。ゲフィチニブは、2003年5月にFDAにより承認された。ゲフィチニブは、ある型の肺癌、すなわち、非小細胞肺癌(NSCLC)を患う患者の処置のためにのみ(単剤療法)使用される。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、トリメチルアンモニウムプロパン(DOPE)、およびN-マレイミド-フェニルブチレートDOPE(MPB-DOPE)は、Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)から購入した。
ヒト前立腺癌細胞株DU145(HTB-81)は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から取得した。DU145は、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充したEarls塩(EMEM)を含むイーグル最少必須培地で培養した。ヒト黒色腫細胞株MDA-MB-435およびヒト乳癌細胞株MDA-MB-231は、10% 熱不活性化FBS、2mM L-グルタミン、および各50 μg/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびネオマイシンを補充した改良したMEM(IMEM)で培養した。EMEMは、MediaTech (Herndon, VA)から購入し、他の細胞培養培地および成分は、Biofluids (Rockville, MD)から取得した。
カチオン性リポソーム製剤LipA(1:1から1:2モル比でのDOTAP:DOPEまたはDDAB:DOPE)は、本明細書に記載したとおり、エタノール注入法を用いて製造した。TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体は、下記のとおり製造した。室温で、回転または撹拌を用いて、LipAとTfRscFvの混合物(1:1から1:40(wt/wt)、より適当には、1:10から1:30 wt/wtのTfRscFvとLipAの比率)のインキュベーションの10分後、適当な濃度でのゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を加え、倒置または撹拌により混合し、室温で、10分間、インキュベートした。動物注射のために、デキストロースまたはスクロースを、1%から20%、より適当には、5-10%の最終濃度で、各サンプルに加えた。ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とリポソームのモル比は、0.2:7から14:7、より適当には、3.5:7から7:7、最も適当には、7:7であった。複合体の大きさは、ZETASIZER(登録商標)3000HSシステム(Malvern, United Kingdom)を用いて、25℃で、動的光散乱により決定した。
インビトロ細胞毒性研究のために、100 μLの各細胞株の適当な増殖培地中、2.5から3.5 × 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、漸増濃度で、無血清培地中、100 μLのTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体または遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを補充した。細胞を、次いで、5% CO2を含む湿気のある環境で、さらに、24-72時間、適当には、72時間、インキュベートした。その後、ウェルを、フェノールレッドを含まないIMEMで洗浄し、細胞生存XTTに基づくアッセイを、製造者のプロトコールにしたがって行った(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。電子カップリング剤XTTの存在で、生細胞のミトコンドリアでのデヒドロゲナーゼにより、ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3, 4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホネートを、オレンジホルマザンに変換する。生存細胞の数に相関するホルマザン吸光度を、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて、450 nmで測定した。50%増殖阻害を産生するIC50値を、薬剤濃度と生存細胞の割合のlogグラフから補間した。
化学増感研究のために、100 μL中、2.5〜3.5× 103 細胞/ウェルを、96ウェルプレートに播種した。24時間後、細胞を無血清培地で洗浄し、100 μLのTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体または遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を、8から15μMのゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で入れ、4-6時間、適当には、5時間インキュベートし、次いで、FBSを各ウェルに加えた。細胞を、さらに、24-72時間、適当には、19時間インキュベートし、その後、漸増濃度での化学治療剤の有無で適当な補充培地を添加し、インキュベーションを、およそ24-72時間、適当には、48時間続けた。使用する化学治療剤は、ドセタキセル(Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ)、およびミトキサントロン(Novantrone(登録商標), Immunex Corp., Seattle WA)であった。XTTアッセイを、化学治療剤に対する増感の程度を評価するために行い、各細胞のIC50値を計算した。倍率増感は、下記に等しい: IC50非トランスフェクト/IC50各複合体。
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体のモル比のインビトロ最適化
TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体を製造し、TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の小分子とリポソームのモル比を最適化した。MDA-MB-231ヒト乳癌細胞で、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAの異なる比率で、複合体および遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の細胞殺傷効果を比較した。TfRscFvとLipAの比率は、1:30(wt/wt)であった。3 x 103 細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、24時間後、TfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))複合体、または遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を用いて、処理した。XTTアッセイは、細胞毒性を評価するために、処理後72時間で行い、IC50(50%成長阻害を産生する薬剤濃度)は、濃度-細胞生存曲線から計算した。図44は、各比率のためのIC50値を示す。3:5〜7:7のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とリポソームのモル比の範囲で、IC50値の減少が、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で処理した細胞と比較して、複合体ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で処理した細胞で観察された。
細胞生存における、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較したTfRscFv/LipA/ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の有効性は、ヒト乳癌細胞株(MDA-MB-231)(図45A)、ヒト黒色腫細胞株(MDA-MB-435)(図45B)、およびヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図45C)で、XTTアッセイ(本明細書に記載したとおりである)により評価した。各複合体のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1に等しい)であった。各複合体の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図45Aで証明したとおり、リポソーム複合体送達ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を用いたMDA-MB-231細胞の処理は、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))と比較して、2倍の細胞殺傷の増加を生じた。
‘遊離’もしくはリポソーム複合体(scL-IRESSA(登録商標))を送達するゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))の第1選択化学療法剤に対して腫瘍細胞を増感させる能力を、また、XTTアッセイにより評価した(図46A-C)。3つの異なるヒト癌細胞株を、8-15μMの遊離もしくは複合体ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))で処理し、その後、漸増用量の化学療法剤を添加した。各複合体中のゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))とLipAのモル比は、7:7(1:1と同等である)であった。各複合体中の一本鎖抗体断片とリポソームの比率は、1:30(w:w)であった。図46Aで示したとおり、12μMのゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))濃度で、遊離ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))を投与したときと比較して、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標))リポソーム複合体(scL-IRESSA(登録商標))により送達されたとき、化学療法剤タキソテールに対する2倍以上の応答を示す。
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Claims (66)
- 抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を製造する方法であって、
(a) 抗体または抗体断片を製造し;
(b) 該抗体または抗体断片をカチオン性リポソームと混合してカチオン性免疫リポソームを形成し(ここで、該抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームと結合しない);そして、
(c) 該カチオン性免疫リポソームを小分子と混合して該抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を形成すること
を含む、方法。 - 抗体を該カチオン性リポソームと混合する、請求項1に記載の方法。
- 抗体断片を該カチオン性リポソームと混合する、請求項1に記載の方法。
- 該抗体断片が、一本鎖Fv断片である、請求項3に記載の方法。
- 該抗体断片が、抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)である、請求項4に記載の方法。
- 該抗体または抗体断片が、抗HER-2抗体もしくは抗体断片である、請求項1に記載の方法。
- 該抗体断片が、該カチオン性リポソームと混合される前に、カルボキシ末端にシステイン部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性リポソームが、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 該抗体または抗体断片を、約1:20から約1:40(w:w)の範囲の比率で該カチオン性リポソームと混合する、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートおよび/またはコレステロールの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性免疫リポソームを、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で該小分子と混合する、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性免疫リポソームを、約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比で該小分子と混合する、請求項1に記載の方法。
- 該小分子が、約5000ダルトン未満の分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 該小分子が、約1000ダルトン未満の分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 該小分子が、約300から約700ダルトンの分子量を有する、請求項14に記載の方法。
- 該小分子が、約2から約9の範囲の少なくとも1個のpKaを有する、請求項1に記載の方法。
- 該小分子が、抗癌小分子である、請求項1に記載の方法。
- 該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により製造されたカチオン性免疫リポソーム。
- カチオン性リポソーム、抗体または抗体断片、および小分子を含み、ここで、該抗体または抗体断片は、化学的に、該カチオン性リポソームに結合しない、抗体もしくは抗体断片標的化カチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、該カチオン性リポソームに封入された、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、該カチオン性リポソームの炭化水素鎖領域内に含まれる、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、該カチオン性リポソームの内部もしくは外部単層と結合する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該抗体断片が、一本鎖Fv断片である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該抗体断片が、抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該抗体または抗体断片が、抗HER-2抗体もしくは抗体断片である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該カチオン性リポソームが、1個またはそれ以上のカチオン性脂質および1個またはそれ以上の中性もしくはヘルパー脂質の複合体を含む、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該抗体または抗体断片および該カチオン性リポソームが、約1:20から約1:40(w:w)の範囲の比率で存在する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物を含む、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子および該カチオン性免疫リポソームが、約0.2:7から約14:7(小分子:免疫リポソーム)の範囲のモル比で存在する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 小分子および該カチオン性免疫リポソームが、約7:7(小分子:免疫リポソーム)のモル比で存在する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、約5000ダルトン未満の分子量を有する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、約1000ダルトン未満の分子量を有する、請求項32に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、約300から約700ダルトンの分子量を有する、請求項33に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、約2から約9の範囲の少なくとも1個のpKaを有する、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、抗癌小分子である、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体。
- 請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、疾患状態を患う患者を処置する方法。
- 該投与が、静脈内投与である、請求項38に記載の方法。
- 請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、癌を患う患者を処置する方法。
- 該投与が、静脈内投与である、請求項40に記載の方法。
- 該投与が、腫瘍内、病巣内、エアロゾル、経皮、内視鏡、局所、経口、および皮下投与からなる群から選択される経路による投与を含む、請求項40に記載の方法。
- さらに、化学療法剤を患者に投与することを含む、請求項40に記載の方法。
- 該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、ミトキサントロン、タキソテールおよびCDDPからなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達する、請求項43に記載の方法。
- 該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達する、請求項45に記載の方法。
- 該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達する、請求項43に記載の方法。
- 該化学療法剤を、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達する、請求項47に記載の方法。
- 化学療法剤と共に、請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、化学療法剤の効果を高める方法。
- 該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該化学療法剤が、ドキソルビシン、シスプラチン、ミトキサントロン、タキソテールおよびCDDPからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達される、請求項49に記載の方法。
- 該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達される、請求項51に記載の方法。
- 該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達される、請求項49に記載の方法。
- 該化学療法剤が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達される、請求項53に記載の方法。
- さらに、放射線治療を患者に施すことを含む、請求項40に記載の方法。
- 該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該放射線治療が、γ線、X線、紫外線、マイクロ波および電子放出からなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達される、請求項55に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達される、請求項57に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達される、請求項55に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達される、請求項59に記載の方法。
- 放射線治療と共に、請求項19または20に記載のカチオン性免疫リポソーム複合体を患者に投与することを含む、放射線治療の効果を高める方法。
- 該小分子が、GMC-5-193、YK-3-250、メシル酸イマチニブ、塩酸エルロチニブ、リンゴ酸スニチニブ、ゲフィチニブ、ならびにその類似体および誘導体からなる群から選択され、該放射線治療が、γ線、X線、紫外線、マイクロ波および電子放出からなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体後に送達される、請求項61に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間後に送達される、請求項63に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体前に送達される、請求項61に記載の方法。
- 該放射線治療が、カチオン性免疫リポソーム複合体の少なくとも12時間前に送達される、請求項65に記載の方法。
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