CN101484139A - 用于治疗剂或诊断剂的全身施用的抗体或抗体片段靶向的免疫脂质体的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

制备抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体或聚合物复合物的方法，其包含下述步骤：(a)制备抗体或抗体片段；(b)将所述抗体或抗体片段与阳离子脂质体相混合，从而形成阳离子免疫脂质体，或与阳离子聚合物相混合，从而形成聚复合物；和(c)将所述阳离子免疫脂质体或所述聚复合物与治疗剂或诊断剂相混合，从而形成所述由抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体或聚合物复合物。

Description

用于治疗剂或诊断剂的全身施用的抗体或抗体片段靶向的免疫脂质体的制备及其应用
发明背景
发明领域
本发明提供了制备可用于分子的全身递送来治疗疾病的抗体或抗体片段靶向的免疫脂质体和抗体或抗体片段靶向的聚合物的方法。所述脂质体和聚合物复合物用于实现小分子的递送、以及靶向基因的递送和全身施用后的有效基因表达。所述递送系统的特异性源自靶向抗体或抗体片段。
相关技术
癌症的理想治疗剂应当是选择性地靶向负责肿瘤表型的细胞通路且对正常细胞无毒的治疗剂。迄今为止，理想治疗剂仍然只是一种理想。尽管包含基因治疗的癌症治疗具有巨大前途，在实现该前途之前必须解决许多问题。与大分子治疗有关的问题中可能最首要的是治疗分子向需要它们的身体部位的有效递送。理想的递送载体应当是可以全身施用并然后定位到在体内发生的肿瘤细胞的载体。已经尝试了多种递送系统(“载体”)，包括病毒和脂质体。使病毒成为有吸引力的递送载体的感染性也造成了它们最大的缺陷。残留的病毒元件可以是免疫原性的、致细胞病变的或致重组的。具有新感染靶标的新型病毒的产生也增加了理论可能性，即一旦进入患者中，这些病毒可以通过遗传改变转化成新的人病原体。结果，大量注意力已经指向用于递送分子治疗剂的非病毒载体。对于基因递送，脂质体方法提供了许多胜过病毒方法学的优点。最重要地，它们缺少免疫原性。此外，由于脂质体不是能自我复制的传染物，它们不具有进化成新类型传染性人病原体的危险。
通过修饰脂质体，使得它们选择性地递送它们的有效负荷至肿瘤细胞，而实现经脂质体靶向癌细胞。表面分子可以用于将脂质体靶向肿瘤细胞，因为装饰肿瘤细胞外部的分子不同于正常细胞上的那些。例如，如果脂质体具有蛋白转铁蛋白(Tf)或在它表面上的识别转铁蛋白受体(TfR)的抗体，它会定位到具有更高水平的TfR的癌细胞。被设计成定位到肿瘤的这种脂质体已经被比作能搜索它们的靶标的“智能”炸弹。
对治疗作出响应的失败体现了包括前列腺癌在内的多种癌症的治疗中的未满足的医学需要。经常在癌症复发时，肿瘤获得了对辐射或化疗剂的增加的抗性。导致辐射/化学敏化的新组分向目前使用的癌症疗法中的引入，具有巨大的临床关联性。实现这种敏化的一种途径是通过基因治疗(即，递送其表达会导致增加的敏化的基因)。在通过参考引用并入本文的PCT专利申请WO 00/50008(2000年8月31日公开)中，我们提供了抗-转铁蛋白受体单链抗体(TfRscFv)可以化学缀合至阳离子脂质体上的原理证据。此外，该TfRs cFv指导的脂质体递送系统可以将基因和其它分子全身地和特异性地递送至肿瘤。
作为基因转移载体的免疫脂质体和阳离子聚合物
如上所述，非病毒基因转移载体可以避开一些与使用病毒载体有关的问题。已经向开发用于体内人治疗的基因的非病毒药物制剂、尤其阳离子脂质体介导的基因转移系统做出了进展(31，32)。阳离子脂质体由带正电荷的脂质双层组成，且可以通过脂质和DNA的简单混合络合至带负电荷的裸DNA，使得得到的复合物具有净正电荷。复合物可以以适度良好的转染率被培养的细胞结合和摄取(33)。使它们对于DNA递送而言通用且有吸引力的阳离子脂质体的特征包括：容易制备；能络合大量DNA；与任意类型和大小的DNA或RNA一起使用的通用性；能转染许多不同类型的细胞，包括不分裂细胞；和缺少免疫原性或生物有害活性(综述见34，35)。从人癌症治疗的观点看更重要地，已经证实阳离子脂质体对于体内基因递送而言是安全的和有效的(33，34，36)。至少99个临床试验已经被批准使用阳离子脂质体进行基因递送(37)，用于递送小分子治疗剂(例如，抗真菌剂)的脂质体已经面市。
研究人员还已经考虑阳离子聚合物作为体内递送治疗剂的转移载体的适用性。例如，聚乙烯亚胺(PEI)是具有最高阳离子-电荷-密度电势的有机大分子，且是体外和体内基因和寡核苷酸转移的通用载体，如由Boussif等人首次报道的(66)。此后，大量研究瞄向该聚阳离子和它在基因治疗中的作用(73)。可以将细胞结合配体引入聚阳离子，以：1)靶向特定细胞类型，和2)在结合靶细胞后增强细胞内摄取(13)。Erbacher等人(67)通过二硫键缀合了整联蛋白结合肽9-mer RGD，并证实了用于全身基因递送的目标物理性质。
当阳离子脂质体和阳离子聚合物例如PEI携带细胞表面受体可以识别的配体时，可以显著增加它们的转染率。受体介导的胞吞作用代表真核细胞中存在的高效率内在化通路(38，39)。配体存在于脂质体上促进DNA进入细胞，这是通过配体与细胞表面上的其受体的最初结合，随后结合的复合物的内在化。转铁蛋白受体(TfR)水平在多种类型的癌细胞中升高，包括但不限于，乳腺癌、胰腺癌、头颈癌和前列腺癌(40)，甚至包括源自人淋巴结和骨转移灶的那些前列腺细胞系(40-43)。升高的TfR水平也与肿瘤细胞的攻击或增殖能力相关联(44)。因此，TfR是恶性细胞生长的治疗中药物递送的潜在靶标(45，46)。在我们实验室，我们已经制备了转铁蛋白络合的阳离子脂质体，其在SCCHN中的肿瘤细胞转染率是60％-70％，形成对比的是，没有配体的阳离子脂质体仅为5-20％(47)。也参见公开的PCT专利申请WO 00/50008。
除了使用被肿瘤细胞上的受体识别的配体以外，也可以将特定抗体结合到脂质体表面(48)，使它们指向特定肿瘤表面抗原(包括但不限于受体)(49)。这些“免疫脂质体”，尤其是空间稳定化的免疫脂质体，可以将治疗药物递送给特定靶细胞群体(50)。Parks等人(51)发现，与脂质体缀合的抗-HER-2单克隆抗体(MAb)Fab片段可以特异性地结合过表达HER-2的乳腺癌细胞系SK-BR-3。发现免疫脂质体通过包被的凹陷通路并且也可能通过膜融合，被受体介导的胞吞作用有效地内在化。此外，抗-HER-2Fab片段的锚定增强了它们的抑制作用。最近，Park等人(23)使用由化学缀合至抗-HER-2单克隆抗体scFv片段上的长循环脂质体组成的抗-HER-2免疫脂质体来递送多柔比星至乳腺癌肿瘤，尽管HER-2没有过表达。已经公开了许多其它研究，它们采用抗偶联至脂质体、主要是空间稳定化的脂质体的肿瘤特异性抗原的抗体来靶向肿瘤细胞，用于体外或体内递送前药和药物(52-56)。这些研究证实了免疫脂质体用于靶向肿瘤的药物递送的效用。阳离子脂质体基因转移和免疫脂质体技术的组合似乎是有前途的靶向基因治疗系统，且是本申请的主题。
生物技术的进展已经允许从MAb衍生出特定识别结构域(57)。重链和轻链可变区的重组和它们向单一多肽的整合，提供了为靶向目的使用单链抗体衍生物(指定为scFv)的可能性。因而，基于抗-TfR MAb 5E9的scFv(52)含有该MAb识别的TfR的表位的完整抗体结合位点，作为近似分子量26,000的单一多肽链。通过用适当设计的肽连接分别来自重链和轻链的组分VH和VL可变结构域而形成该TfRscFv。该肽连接第一个可变区的C-末端和第二个可变区的N-末端，次序是VH-肽-VL或VL-肽-VH。scFv的结合位点可以复制它的亲本抗体结合位点的亲和力和特异性。
出于许多原因，对人使用中将脂质体或阳离子聚合物靶向具有升高水平的TfR的癌细胞时，TfRscFv胜过Tf分子本身或甚至完整MAb。首先，scFv的大小(～28kDa)远远小于Tf分子(～80kDa)或亲本MAb(～150kDa)。scFv-脂质体-治疗剂复合物或scFv-聚合物-治疗剂复合物因而可以表现出更好的向实体瘤特有的小毛细管中的穿透。其次，更小的scFv也具有与它作为重组蛋白的生产有关的实用优点。本发明预想的用于最终的人试验的治疗需要大规模生产TfRscFv。第三，scFv是一种重组分子(不是血液产物，如Tf)，因此不会产生与血液传播病原体的潜在污染有关的问题。使用TfRscFv的其它优点涉及下述事实，即Tf仅在配体装载铁以后以高亲和力与TfR相互作用。含有装载铁的Tf的脂质体的大规模生产可能面临实践挑战。因而，TfRscFv的应用使肿瘤细胞TfR被不含有铁的脂质体治疗复合物所靶向(自身牵涉进癌症中(58))。第四，由于没有MAb的Fc区，消除了经Fc受体的非抗原特异性结合的问题(57)。
p53肿瘤抑制基因和前列腺癌的发病机理
肿瘤抑制基因p53在多种细胞通路中起重要作用，包括响应于DNA损害而激活的那些，例如DNA修复、细胞周期的调节和程序性细胞死亡(细胞凋亡)(1)。这些关键细胞通路的故障与肿瘤发生过程相关。功能性p53的丧失已经涉及超过60％的人癌症中，其发生可以通过p53基因自身的突变(最常见的发生)，或通过其它机理例如MDM-2基因的扩增(见于某些肉瘤和其它癌症中)，或p53与人乳头瘤病毒的E6蛋白的结合(其可能在子宫颈癌中起作用)(2)。
p53功能的丧失与广泛的癌症类型相关，无功能的p53与例如15-50％乳腺癌、25-70％转移性前列腺癌、25-75％肺癌和33-100％头颈癌有关(3)。突变体p53的存在也已经与许多人癌症的不良预后相关联，包括肺、结肠和乳腺(3)，且突变体p53在有些最可治愈形式的癌症中罕见，例如，维尔姆斯瘤、成视网膜细胞瘤、睾丸癌、神经母细胞瘤和急性淋巴细胞性白血病(4)。另外，p53蛋白转录地调节参与血管发生的基因，血管发生是实体瘤生长所需的过程(5)。Volpert等人已经提出，这些肿瘤的血管发生表型的发展需要2个p53等位基因都丧失(6)。
由于大多数抗癌剂似乎通过诱导细胞凋亡来起作用(20)，因此该通路的抑制或变化可能导致治疗方案的失败。已经暗示，p53的突变和对细胞毒性癌症治疗(化疗和放疗(21))的抗性之间的直接关联。也已经暗示，p53功能的丧失可能促成在有些肿瘤细胞中观察到的对抗癌剂的交叉抗性(22)。
因此p53功能的恢复导致原发性前列腺肿瘤以及甚至是转移灶对放疗/化疗的敏化。已经报道，wtp53的引入在体外和小鼠异种移植物模型中抑制不同类型恶性肿瘤的生长，例如，前列腺(23，24)、头颈(25，26)、结肠(27)、子宫颈(28)和肺(15，29)肿瘤细胞。但是，单独的p53尽管能部分地抑制肿瘤生长，尚未证实能消除已建立的肿瘤。然而重要的是，我们已经证明，全身递送的脂质体-p53和辐射的组合导致已建立的头颈异种移植肿瘤的完全长期肿瘤退化(25，30)。
总之，p53基因在大量人癌症中的涉入使它成为癌症基因治疗的主要候选物之一。基于日益增多的与p53功能有关的证据，可以预见到肿瘤细胞中这些功能的有效恢复会重建正常细胞生长控制，恢复对DNA-损伤剂(例如，化疗和放疗)的适当响应，和阻碍血管发生。
肿瘤对化疗和辐射的敏化可以降低两种抗癌疗法的有效剂量，相应地减轻经常与这些治疗伴随的严重副作用。迄今为止，大多数p53基因治疗方案已经采用单独的wtp53基因替换。基于现有文献和我们的数据(30，59)，单独的wtp53替换尽管能在一定程度上抑制肿瘤生长，似乎不足以长期消除肿瘤。因此，包括标准治疗和靶向基因治疗的组合方法似乎具有作为癌症治疗的新颖的且更有效的临床疗法的巨大希望。此外，我们的全身递送的配体-脂质体wtp53复合物的证实的肿瘤细胞选择性，说明该方法用于敏化甚至远距离微小转移灶的潜力，所述微小转移灶是许多前列腺癌死亡的根本原因。
包括但不限于受体酪氨酸激酶(RTK)和非受体酪氨酸激酶(非-RTK)的细胞内信号转导通路的组分是许多关键通路的重要介质，这些通路包括细胞增殖、分化、迁移、血管发生、细胞周期调节等(Baselga，Science312，1175-1178(2006)，Arora和Scholar，J Pharmacol Exp Ther 315，971-979(2005)，Krause和Van Etten N Eng J Med 353，172-187(2005))。许多这样的重要通路在癌细胞中失调。因而，RTK和非-RTK是癌症治疗剂的良好靶标。一类这样的治疗剂是小分子，包括但不限于靶向生长因子受体并从而影响这些信号转导通路的那些(Imai和Takoka，Nature Reviews：Cancer6，714-727(2006))。这些抑制剂与ATP竞争(ATP模仿物)，并抑制激酶活性。首先成功的小分子抑制剂之一是甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D0013111223QIETU
)。该小分子灭活CML中BCR-ABL融合蛋白的激酶活性(Druker Trends inMolecular Medicine 8，S14-S18(2002))，且已经在具有费城染色体阳性的CML的患者的治疗中表现出显著功效。它也是其它TK(包括KIT和PDGFRα和PDGFRβ)的抑制剂。KIT涉及转移性GISTs，并且这2种血小板衍生的生长因子受体涉及例如成胶质细胞瘤和隆凸性皮肤纤维肉瘤的肿瘤。因为它是EGF超家族的成员，EGFR也是小分子抑制剂的逻辑靶标。吉非替尼(Gefitinib，
Figure A200780024924D00141
)(Herbst等人Nature reviews Cancer 4，9560965(2004))和厄洛替尼(erlotinib，
Figure A200780024924D00142
)(Minna和DowellNature Reviews药物Discovery Suppl.S14-S15(2005))选择性地抑制EGFR，并已经表现出抗表达EGFR的癌症(例如NSCLC和头颈的鳞状细胞癌)的功效。在与化疗剂相组合的II期试验中，它们也已经表现出功效。厄洛替尼和化疗剂吉西他滨(一种抗代谢物)的组合已经被批准用于治疗晚期胰腺癌。吉非替尼的几个III期试验正在进行中(Chai和GrandisCurrent Treat Opin Oncol 7，3-11(2006))。
小分子试剂可以穿过质膜转移，并与细胞表面受体的胞浆结构域和细胞内信号转导分子相互作用。因而，也在开发通过抑制RAS异戊烯化、RAF-MEK激酶、PI3激酶、mTOR通路(雷帕霉素和甚至热休克蛋白9的哺乳动物靶标)来影响癌细胞增殖和存活的小分子。它们也通过抑制SRC激酶或基质金属蛋白酶影响细胞粘附和侵入。小分子对血管内皮生长因子(VEGF)的抑制，也可以抑制肿瘤的新血管形成。
一种新型的小分子试剂索拉非尼(Sorafenib，Nexavar)对RAF丝氨酸激酶的不同同种型以及多种RTK(VEGF、EGFR和PDGF)发挥它的抑制作用(Arora和Scholar，J Pharmacol Exp Ther 315，971-979(2005))。该“双效”激酶抑制剂通过抑制肿瘤增殖和血管发生，显示出广谱抗肿瘤活性(Marx Science 308，1248-1249(2005))。苹果酸舒尼替尼
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也是VEGF、PDGFR、KIT和FLIT3的多靶向TK抑制剂(Marx Science 308，1248-1249(2005))。还已经在细胞周期停滞和细胞凋亡(程序性细胞死亡)的关键的泛素-蛋白体通路中鉴别出小分子试剂的潜在靶标。已经报道，26S蛋白体中的胰凝乳蛋白酶性蛋白酶(chymotryptic protease)的一种选择性的、可逆的抑制剂硼替佐米(Bortezomb，Velcade)可以有效地抗多种癌症，尤其血液恶性肿瘤。
抗-EGFR TK抑制剂是经口施用的～500Da的合成化学试剂，
Figure A200780024924D00151
的半衰期是～46小时，
Figure A200780024924D00152
的半衰期是～36小时。因为它们经口而不是静脉内施用，相同剂量的小分子治疗剂的血浆浓度可以因患者而异(Dancy和Sausville Nature Rev Drug Discov 2，116-124(2003))。这是目前使用的这些试剂的缺点。因而，将小分子试剂包囊在可以以相同剂量持续静脉内施用的靶向肿瘤递送复合物中，例如本发明的那些，会提高它们作为治疗剂的应用。此外，包囊在这样的配体-脂质体复合物中会保护小分子试剂免于降解，进一步增强它们的功效。非靶向的经口施用的小分子试剂不是肿瘤细胞特异性的，该事实会增加了正常细胞毒性和不良副作用的风险。尽管这些副作用通常是温和的(例如疹、痤疮、干性皮肤和瘙痒)，胃肠道毒性(恶心、呕吐、食欲缺乏和尤其是腹泻)可以是剂量限制性的。最常见的副作用皮疹可能是由于对表皮中的靶激酶的非特异性作用(Herbst等人Clin Lung Caner 4，366-369(2003))。因而，通过肿瘤细胞特异性的试剂的递送可以减弱该问题。迄今为止报道的最严重的毒性是
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(吉非替尼)：间质性肺炎，特征在于下呼吸道中的非感染性炎症和纤维化的肺炎形式。在用
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治疗后，超过170位患者已经死于该病(Arora和Scholar，J Pharmacol Exp Ther 315，971-979(2005))。最近，胸部CT和放射摄影成像已经证实，吉非替尼相关的间质性肺病类似于常规抗肿瘤剂造成的肺损伤，可能存在直接的细胞毒性作用。因此，使用肿瘤细胞特异性的试剂来将或任意小分子试剂直接递送给肿瘤细胞，可能提供对间质性肺炎和其它副作用问题的解决方案。此外，通过本发明的方法直接递送到需要的部位(原发性和转移性疾病)，包括在脑中，也会导致有效治疗所需剂量的降低，这是目前不可能的另一个益处。
发明简述
根据本发明，已经构建了多种免疫脂质体和聚合物复合物，它们能靶向肿瘤地全身递送多种类型的治疗分子，用于治疗人疾病。抗体或抗体片段靶向的免疫脂质体或聚合物复合物通过简单且有效的非化学缀合方法来制备。这些复合物与通过将抗体或抗体片段化学缀合至脂质体或聚合物复合物上制备的类似复合物一样有效，或比后者更有效。如果使用抗体片段，得到的复合物能产生比携带完整抗体分子的相同脂质体-治疗剂或聚合物-治疗剂复合物高得多水平的转染率。
根据本发明，没有将单链蛋白化学缀合至脂质体或聚合物上。相反，通过以确定的比例和次序简单混合组分来制备抗体-或scFv-脂质体-治疗剂或诊断剂复合物或抗体-或scFv-聚合物-治疗剂或诊断剂复合物。抗体或抗体片段以脂质体直接络合(例如，结合，例如通过电荷-电荷相互作用)。在一个实施方案中，首先以约1:20至约1:40(重量:重量)的蛋白:脂质比或约0.1:1至10:1(摩尔比)的蛋白:聚合物比，将抗体或单链蛋白与阳离子脂质体或聚合物相混合。然后以约1:10至1:20(μg治疗剂或诊断剂:nmol总脂质)或约1:1至1:40(ug治疗剂或诊断剂:nmol聚合物)的比，将抗体或抗体片段-脂质体或抗体或抗体片段-聚合物与所需的治疗剂或诊断剂例如核酸相混合，并在室温温育10-15分钟。在治疗剂或诊断剂是小分子的实施方案中，以约0.2:7至约14:7(小分子:脂质体/聚合物复合物)的摩尔比，合适地以约2.8:7或约7:7(小分子:脂质体/聚合物复合物)的摩尔比，将抗体或抗体片段-脂质体或抗体或抗体片段-聚合物与小分子相混合。
得到的治疗剂或诊断剂-抗体-脂质体或治疗剂-抗体-聚合物复合物可以施用给哺乳动物、优选人，以将试剂递送给哺乳动物体内的靶细胞。希望使复合物靶向目标部位，后者可以是细胞，包括癌细胞或非癌细胞。靶向剂是抗体或抗体片段，其在一个示例性实施方案中结合转铁蛋白受体，且所述靶细胞是表达或含有目标靶部位的细胞。如果抗体或抗体片段结合转铁蛋白受体，则所述靶细胞是表达转铁蛋白受体的细胞。所述治疗剂可以是小分子、核酸，包括DNA分子和合适的编码野生型p53分子、Rb分子或调亡蛋白分子或反义HER-2的DNA分子。所述复合物(例如在治疗组合物中)可以全身地、优选静脉内地施用。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物的方法，该方法包括，制备抗体或抗体片段；将所述抗体或抗体片段与阳离子脂质体相混合，从而形成阳离子免疫脂质体，其中所述抗体或抗体片段非化学缀合至阳离子脂质体(但是直接络合/结合脂质体)；和将所述阳离子免疫脂质体与小分子相混合，从而形成所述抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物。在合适的实施方案中，所述抗体片段是单链Fv片段，例如抗-转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
适用于制备本发明的包含小分子的阳离子免疫脂质体复合物的脂质包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。合适地以约1:20至约1:40(重量:重量)的比，将抗体或抗体片段与所述阳离子脂质体混合。在实施方案中，所述阳离子脂质体包含磷酸二油酰基三甲基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或溴化二甲基双十八烷基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物。在其它实施方案中，以约0.2:7至约14:7(小分子:免疫脂质体)的摩尔比，合适地以约1:7至约12:7、约1:7至约10:7、约2:7至约9:7、约4:7至约8:7、约5:7至约8:7或约7:7(小分子:免疫脂质体)的摩尔比，混合阳离子免疫脂质体和小分子。
用于实施本发明的小分子合适地具有小于约5000道尔顿、更合适地小于约1000道尔顿、例如约300至约700道尔顿的分子量。在其它实施方案中，所述小分子具有至少一个在约2至约9范围内的pKa。适用于实现本发明的小分子包括抗癌小分子，包括但不限于，GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼和其类似物和衍生物。在另一个实施方案中，本发明提供了通过本文所述方法制备的包含小分子的阳离子免疫脂质体复合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物，其包含阳离子脂质体、抗体或抗体片段和小分子，其中所述抗体或抗体片段非化学缀合至所述阳离子脂质体(但是直接结合/络合脂质体)。所述小分子可以包囊在阳离子脂质体中，包含在阳离子脂质体的烃链区中，与阳离子脂质体的内部或外部单层(包括头基团区域)相结合，或其任意组合。
本发明也提供了治疗遭受或易感疾病状态(例如，但不限于，癌症)的患者的方法，其包括给所述患者施用包含小分子的阳离子免疫脂质体复合物。合适地，所述复合物通过静脉内施用来施用。或者，所述复合物可以通过其它施用途径来递送，例如瘤内的、病灶内的、气雾的、经皮的、内窥镜的、局部的、经口的或皮下的施用。在患者遭受或易感癌症的实施方案中，本发明的方法可以另外包括，在施用所述阳离子免疫脂质体复合物之前、过程中或之后(例如，之前至少12小时，之后至少12小时，或同时)，给所述患者施用辐射或化疗剂。合适的化疗剂包括但不限于，多柔比星、顺铂、米托蒽醌、泰索帝和CDDP。本发明也提供了增强化疗剂的功效的方法，其包含，在施用阳离子免疫脂质体复合物之前、过程中或之后(例如，之前至少12小时，之后至少12小时，或同时)，给患者施用与所述化疗剂相结合的本发明的包含小分子的阳离子免疫脂质体。
附图简述
图1显示了ELISA测定的结果，它显示了通过以多种蛋白/脂质和DNA/脂质比简单混合制备的TfRscFv-脂质体-DNA复合物与DU145细胞的结合。
图2显示了DU145细胞的体外转染测定的结果，其中使用不同的TfRscFv:脂质混合比(萤光素酶测定)。
图3显示了大鼠C6细胞的体外转染测定的结果，其中使用不同的TfRscFv:脂质混合比(萤光素酶测定)。
图4显示了非变性聚丙烯酰胺凝胶，它表明在简单混合后>95％的TfRscFv结合脂质体或脂质体-p53。
图5A显示了XTT细胞毒性测定的结果，它显示了用通过简单混合制备的TfRscFv-脂质体-p53处理的DU145细胞中诱导的对
Figure A200780024924D00181
的化学敏感性。
图5B显示了XTT细胞毒性测定的结果，它显示了用通过简单混合制备的TfRscFv-脂质体-p53处理的DU145细胞中诱导的对米托蒽醌的化学敏感性。
图6A和6B显示了XTT细胞毒性测定的结果，它显示了用通过简单混合制备的TfRscFv-脂质体-p53处理的胰腺癌细胞系(Colo 357和Panc I)中诱导的对
Figure A200780024924D00191
的化学敏感性。
图7A显示了全身施用的通过以多种DNA:脂质比例简单混合制备的TfRscFv-脂质体-EGFP复合物的体外肿瘤靶向能力。
图7B显示了4种不同肿瘤中全身施用的通过简单混合制备的TfRscFv-脂质体-EGFP复合物的体内肿瘤靶向能力，并使用多批TfRscFv蛋白。
图8显示了全身施用的通过简单混合制备的TfRscFv-脂质体A-p53和辐射的组合对DU145人前列腺异种移植肿瘤的作用。
图9显示了XTT细胞毒性测定的结果，它显示了用TfRscFv-脂质体-ASHER-2 ODN处理的Panc I细胞中诱导的对
Figure A200780024924D00192
的化学敏感性。
图10A显示了全身施用的TfRs cFv-脂质体A-AS HER-2 ODN和
Figure A200780024924D00193
的组合对Panc I人胰腺异种移植物肿瘤的作用。
图10B显示了全身施用的TfRscFv-脂质体B-AS HER-2 ODN和泰索帝的组合对MDA-MB-435人乳腺异种移植物肿瘤的作用。
图11显示了全身施用TfRscFv-脂质体复合物产生的增强的肿瘤成像。
图12显示了MDA-MB-435细胞中空间稳定化的TfRscFv-PEG-脂质体A-pLuc的体外转染测定的结果(萤光素酶测定)。
图13显示了GMC-5-193与LipA-HoKC的摩尔比的优化，和不同GMC-5-193/LipA-HoKC比的TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物对DU145人前列腺癌细胞的作用。
图14显示了TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物对不同细胞系的作用。
图15A显示了与游离GMC-5-193相比，使用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对多柔比星敏化的作用。
图15B显示了与游离GMC-5-193相比，使用TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对多柔比星敏化的作用。
图15C显示了在1.25μM GMC-5-193的浓度，与游离GMC-5-193相比，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物)使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对顺铂敏化的作用。
图15D显示了在2μMGMC-5-193的浓度，与游离GMC-5-193相比，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物)使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对顺铂敏化的作用。
图15E显示了在2.5μMGMC-5-193的浓度，与游离GMC-5-193相比，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物)使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对顺铂敏化的作用。
图16A显示了使用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送使正常人肺成纤维细胞IMR-90对多柔比星敏化的作用。
图16B显示了使用TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送使正常人肺成纤维细胞IMR-90对多柔比星敏化的作用。
图16C显示了使用TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物，GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送使正常人肺成纤维细胞IMR-90对米托蒽醌敏化的作用。
图17A显示了GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物)使DU145人前列腺癌细胞对泰索帝敏化的作用。
图17B显示了GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物)使DU145人前列腺癌细胞对米托蒽醌敏化的作用。
图17C显示了GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物)使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对泰索帝敏化的作用。
图18显示了GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对CDDP敏化的作用。
图19A显示了MDA-MB-435细胞中游离GMC-5-193或TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物摄取的体外对比。
图19B显示了MDA-MB-435细胞中游离GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物摄取的体外对比。
图20A显示了通过把荧光小分子掺入TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)复合物，全身施用后增强的肿瘤特异性摄取。
图20B显示了通过把荧光小分子掺入TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物，全身施用后增强的肿瘤特异性摄取。
图20C显示证明使用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物，通过掺入荧光GMC-5-193全身施用后增强的肿瘤特异性摄取的其它数据。
图21A显示了用游离GMC-5-193、TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)和TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scLHK-GMC)复合物处理后，具有B16/F10肺肿瘤的同系小鼠中的肿瘤生长的抑制。
图21B显示了包含和不包含顺铂，用TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)和TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scLHK-GMC)复合物的组合处理后，具有B16/F10肺肿瘤的同系小鼠中的肿瘤生长的抑制。
图21C显示了包含和不包含CDDP，用TfRscFv/LipA/GMC-5-193和TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物的组合处理后，具有B16/F10肺肿瘤的同系小鼠中的肿瘤生长的抑制。
图22显示了包含和不包含CDDP，用TfRscFv/LipA/GMC-5-193和TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物的组合处理后，具有B16/F10肺肿瘤的同系小鼠血清中的切割的胱天蛋白酶-3。
图23A显示了不同YK-3-250:LipA比的TfRscFv/LipA/Yk-3-250复合物对MDA-MB-435细胞的效果的对比。
图23B显示了游离的和络合的YK-3-250对MDA-MB-435细胞的效果的对比。
图24A显示了通过脂质体复合物递送的甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00221
)和游离甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00222
)对人前列腺癌细胞的效果的对比。
图24B显示了通过脂质体复合物递送的甲磺酸伊马替尼()和游离甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00224
)对人黑素瘤细胞的效果的对比。
图24C显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00225
)对B16-F10细胞的效果的对比。
图25A显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00226
)(20μM)的脂质体复合物递送使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对泰索帝敏化的作用。
图25B显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00227
)(30μM)的脂质体复合物递送使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对泰索帝敏化的作用。
图26A显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00228
)(20μM)的脂质体复合物递送使DU145人前列腺癌细胞对米托蒽醌敏化的作用。
图26B显示了甲磺酸伊马替尼()(30μM)的脂质体复合物递送使DU145人前列腺癌细胞对米托蒽醌敏化的作用。
图27A显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D002210
)(20μM)的脂质体复合物递送使PANC-1人胰腺癌细胞对吉西他滨敏化的作用。
图27B显示了甲磺酸伊马替尼()(30μM)的脂质体复合物递送使PANC-1人胰腺癌细胞对吉西他滨敏化的作用。
图28A显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D002212
)(20μM)的脂质体复合物递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对顺铂(CDDP)敏化的作用。
图28B显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D002213
)(30μM)的脂质体复合物递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对顺铂(CDDP)敏化的作用。
图29A显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D002214
)(15μM)的脂质体复合物递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对达卡巴嗪(DTIC)24小时温育敏化的作用。
图29B显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D002215
)(20μM)的脂质体复合物递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对达卡巴嗪(DTIC)24小时温育敏化的作用。
图29C显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00231
)(15μM)的脂质体复合物递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对达卡巴嗪(DTIC)48小时温育敏化的作用。
图29D显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00232
)(20μM)的脂质体复合物递送使B16/F10小鼠黑素瘤细胞对达卡巴嗪(DTIC)48小时温育敏化的作用。
图30A显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00233
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00234
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对米托蒽醌敏化的作用。
图30B显示了甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00235
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00236
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对泰索帝敏化的作用。
图31显示了TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00237
)与CDDP的组合对B16/F10肺肿瘤生长的抑制。
图32A显示了通过配体-脂质体复合物递送的厄洛替尼()(TfRscFv/LipA/厄洛替尼(
Figure A200780024924D00239
))和游离厄洛替尼对人前列腺癌细胞(DU145)的效果的对比。
图32B显示了通过配体-脂质体复合物递送的厄洛替尼(
Figure A200780024924D002310
)(TfRscFv/LipA/厄洛替尼(
Figure A200780024924D002311
))和游离厄洛替尼对人胰腺癌细胞(PANC-1)的效果的对比。
图32C显示了通过配体-脂质体复合物递送的厄洛替尼(
Figure A200780024924D002312
)(TfRscFv/LipA/厄洛替尼(
Figure A200780024924D002313
))和游离厄洛替尼对人黑素瘤细胞(MDA-MB-435)的效果的对比。
图33A显示了与游离厄洛替尼(
Figure A200780024924D002314
)相比，在3.75uM浓度的厄洛替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人前列腺癌细胞系DU145对米托蒽醌敏化的作用。
图33B显示了与游离厄洛替尼(
Figure A200780024924D002315
)相比，在7.5uM浓度的厄洛替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人前列腺癌细胞系DU145对米托蒽醌敏化的作用。
图34A显示了与游离厄洛替尼(
Figure A200780024924D002316
)相比，在3.75uM浓度的厄洛替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人黑素瘤细胞对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图34B显示了与游离厄洛替尼(
Figure A200780024924D00241
)相比，在7.5uM浓度的厄洛替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人黑素瘤细胞对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图35显示了与游离厄洛替尼(
Figure A200780024924D00242
)相比，在7.5uM浓度的厄洛替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人胰腺癌细胞PANC-1对吉西他滨(
Figure A200780024924D00243
)敏化的作用。
图36A显示了厄洛替尼(
Figure A200780024924D00244
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/厄洛替尼(
Figure A200780024924D00245
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对米托蒽醌敏化的作用。
图36B显示了厄洛替尼(
Figure A200780024924D00246
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/厄洛替尼(
Figure A200780024924D00247
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对泰索帝敏化的作用。
图36C显示了厄洛替尼()的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/厄洛替尼(
Figure A200780024924D00249
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对吉西他滨(
Figure A200780024924D002410
)敏化的作用。
图37显示了与游离舒尼替尼相比，TfRscFv/LipA/舒尼替尼复合物中不同比例的舒尼替尼(
Figure A200780024924D002411
)/LipA对DU145人前列腺癌细胞的作用。图38A显示了通过配体-脂质体复合物递送的舒尼替尼()(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D002413
))和游离舒尼替尼对人前列腺癌细胞(DU145)的作用的对比。
图38B显示了通过配体-脂质体复合物递送的舒尼替尼(
Figure A200780024924D002414
)(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D002415
))和游离舒尼替尼对人胰腺癌细胞(PANC-1)的作用的对比。
图39A显示了与游离舒尼替尼()相比，在2.5uM浓度的舒尼替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人黑素瘤细胞系MDA-MB-435对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图39B显示了与游离舒尼替尼()相比，在5uM浓度的舒尼替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人黑素瘤细胞系MDA-MB-435对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图40显示了与游离舒尼替尼(
Figure A200780024924D00252
)相比，在5uM浓度的舒尼替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人前列腺癌细胞系DU145对米托蒽醌敏化的作用。
图41显示了与游离舒尼替尼(
Figure A200780024924D00253
)相比，在2.5uM浓度的舒尼替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人胰腺癌细胞系PANC-1对吉西他滨()敏化的作用。
图42A显示了舒尼替尼(
Figure A200780024924D00255
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D00256
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对米托蒽醌敏化的作用。
图42B显示了舒尼替尼()的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D00258
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图42C显示了舒尼替尼()的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D002510
))使正常人成纤维细胞细胞系H500对吉西他滨(
Figure A200780024924D002511
)敏化的作用。
图43A显示了舒尼替尼(
Figure A200780024924D002512
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D002513
))使正常人肺成纤维细胞细胞系IMR90对米托蒽醌敏化的作用。
图43B显示了舒尼替尼(
Figure A200780024924D002514
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D002515
))使正常人肺成纤维细胞细胞系IMR90对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图43C显示了舒尼替尼(
Figure A200780024924D002516
)的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/舒尼替尼(
Figure A200780024924D002517
))使正常人肺成纤维细胞细胞系IMR90对吉西他滨()敏化的作用。
图44显示了与游离吉非替尼(
Figure A200780024924D002519
)相比，TfRscFv/LipA/吉非替尼复合物中不同比例的吉非替尼(
Figure A200780024924D00261
)：LipA对MDA-MB-231人乳腺癌细胞的作用。
图45A显示了通过配体-脂质体复合物递送的吉非替尼()(TfRscFv/LipA/吉非替尼(scL-吉非替尼))和游离吉非替尼对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的作用的对比。
图45B显示了通过配体-脂质体复合物递送的吉非替尼(
Figure A200780024924D00263
)(TfRscFv/LipA/吉非替尼(scL-吉非替尼))和游离吉非替尼对人黑素瘤细胞(MDA-MB-435)的作用的对比。
图45C显示了通过配体-脂质体复合物递送的吉非替尼(
Figure A200780024924D00264
)(TfRscFv/LipA/吉非替尼(scL-吉非替尼))和游离吉非替尼对人前列腺癌细胞(DU145)的作用的对比。
图46A显示了与游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00265
)相比，在12uM浓度的吉非替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人乳腺癌细胞系MDA-MB-231对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图46B显示了与游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00266
)相比，在15uM浓度的吉非替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人黑素瘤细胞对多西他赛(泰索帝)敏化的作用。
图46C显示了与游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00267
)相比，在8uM浓度的吉非替尼的TfRscFv/LipA(scL)复合物递送使人前列腺癌细胞系(DU145)对米托蒽醌敏化的作用。
发明详述
根据本发明的抗体或抗体片段靶向的阳离子脂质体或阳离子聚合物复合物通过简单且有效的非化学缀合方法来制备，其中以确定的比例和确定的次序将所需复合物的组分混合到一起。预料之外地，得到的复合物与其中抗体或抗体片段化学缀合脂质体或聚合物的类似复合物同样有效，或比后者更有效。
完整抗体或抗体片段可以用于制备本发明的复合物。在一个示例性实施方案中，使用抗体片段。合适地，所述抗体片段是抗体的单链Fv片段。一种示例性抗体是抗-TfR单克隆抗体，且合适地抗体片段是基于抗-TfR单克隆抗体的scFv。一种合适的抗-TfR单克隆抗体是5E9。一种基于该抗体的scFv含有该MAb识别的TfR的表位的完整抗体结合位点，作为近似分子量为26,000的单个多肽链。scFv通过将适当设计的肽分别连接来自重链和轻链的组分VH和VL可变结构域而形成，所述肽连接第一个可变区的C-末端和第二个可变区的N-末端，次序是VH-肽-VL或VL-肽-VH。另一种示例性的抗体是抗-HER-2单克隆抗体，另一种优选的抗体片段是基于抗-HER-2单克隆抗体的scFv。
在一个优选的实施方案中，将半胱氨酸部分添加到scFv的C-末端。尽管不希望受理论的约束，认为提供游离巯基的半胱氨酸可以增强抗体和脂质体之间的复合物形成。有或没有半胱氨酸，蛋白可以表达成大肠杆菌包涵体，然后重新折叠，从而生产活性形式的抗体片段，如下面实施例中所详述的。
除非希望在复合物制备中使用空间稳定化的免疫脂质体，产生复合物的第一步包括，混合阳离子脂质体或者脂质体或小聚合物的组合与选择的抗体或抗体片段。广泛多种阳离子脂质体可以用于制备本发明的复合物。公开的PCT申请WO99/25320描述了几种阳离子脂质体的制备。希望的脂质体的实例包括，包含磷酸二油酰基三甲基铵(DOTAP)和二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)和DOPE和/或chol的混合物的那些。可以改变脂质的比例，以优化特定靶细胞类型对治疗分子的摄取效率。脂质体可以包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。阳离子脂质与中性或辅助脂质的希望的比例是约1:(0.5-3)，优选1:(1-2)(摩尔比)。另外，脂质体也可以包含内体破裂肽，例如由Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)生产的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：2)肽。内体破裂肽HoKC可以辅助试剂在细胞胞质中的释放。
合适的聚合物是结合DNA的阳离子聚合物，其能介导DNA压紧，且也可以介导内体释放。一种优选的聚合物是聚乙烯亚胺。其它有用的聚合物包括聚赖氨酸、鱼精蛋白和聚乙二胺树状聚体。
抗体或抗体片段是结合靶细胞表面、优选在靶细胞上差别表达的受体的。以约1:20至约1:40(重量:重量)的蛋白:脂质比或约0.1:1至10:1(摩尔比)的蛋白聚合物比，在室温将抗体或抗体片段与阳离子脂质体或聚合物混合。
使抗体或抗体片段和脂质体或聚合物在室温温育短的时间段，通常约10-15分钟，然后将该混合物与选择的治疗剂或诊断剂相混合。可以络合抗体和脂质体的治疗分子或试剂的实例包括基因、高分子量DNA(基因组DNA)、质粒DNA、反义寡核苷酸、siRNA、肽、核酶、核酸、小分子、病毒颗粒、免疫调节剂、蛋白、成像剂和化学试剂。优选的治疗分子包括编码p53、Rb94或调亡蛋白的基因。RB94是成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因的一种变体。调亡蛋白是仅在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡的基因。在另一个优选的实施方案中，所述试剂是反义寡核苷酸，例如HER-2。一种优选的HER-2反义寡核苷酸具有序列5’-TCC ATG GTG CTC ACT-3’(Seq.IDNo：1)。第三类优选的试剂是诊断成像剂，例如MRI成像剂，例如Gd-DTPA试剂。如果该试剂是DNA，例如p53的编码区，它可以位于强组成型启动子例如RSV或CMV启动子的控制下。
以约1:10至1:20(μg试剂:nmol总脂质)或约1:10至1:40(ug试剂:nmol总聚合物)的比例，将抗体或抗体片段和脂质体组合与治疗剂或诊断剂相混合，并在室温温育短的时间段，通常约10至15分钟。脂质体复合物的大小通常在约50-500nm的范围内，这可以使用Malvern
Figure A200780024924D00281
 3000通过动态光散射来测量。
在本发明的一个实施方案中，用于形成复合物的脂质体是空间稳定化的脂质体。空间稳定化的脂质体是其中已经掺入亲水聚合物例如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)或聚(n-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的脂质体。当与治疗剂或诊断剂络合时，这样的改良的脂质体是特别有用的，因为它们通常不会象没有这样改良的类似脂质体一样迅速地被网状内皮系统从血流中清除。为了制备本发明的空间稳定化的脂质体复合物，混合抗体或抗体片段、脂质体和治疗剂或诊断剂的次序与上述次序相反。在第一步中，首先以约1:10至1:20(μg试剂:nmol脂质)的比例，将上述的阳离子脂质体与上述的治疗剂或诊断剂相混合。向该脂质复合物(lipoplex)中，加入PEG聚合物在生理上可接受的缓冲液中的溶液，将得到的溶液在室温温育足以使该聚合物掺入脂质体复合物中的时间。然后以约1:5至约1:30(重量:重量)的蛋白：脂质比，在室温下将抗体或抗体片段与稳定化的脂质体复合物混合。
根据本发明制备的脂质体或聚合物复合物可以制备成用于体内施用的药理上可接受的制剂。所述复合物可以与药理上相容的介质或载体相组合。所述组合物可以制备成，例如，用于静脉内施用给会从复合物的治疗或诊断分子的施用中受益的人患者。适当调整复合物的大小，使得它们在静脉内施用后在体内分布。备选地，所述复合物可以通过其它施用途径来递送，例如瘤内的、经口的、病灶内的、气雾的、经皮的、内窥镜的、局部的、腹膜内或皮下的施用。
在一个实施方案中，施用包含抗体或抗体片段靶向的脂质体(或聚合物)和治疗剂复合物的组合物，以实现人基因治疗。所述复合物的治疗剂组分包含在适当调节序列控制下的治疗基因。通过全身递送含有编码wtp53的核酸的抗体或抗体片段靶向的脂质体或聚合物复合物，可以实现不同形式的人癌症的基因治疗。所述复合物可以特异性地靶向肿瘤细胞(原发性和转移性肿瘤)，并使它们对体外和体内辐射和/或化疗敏化。
通过脂质的选择和比例、抗体或抗体片段与脂质体的比例、抗体或抗体片段和脂质体与治疗剂或诊断剂的比例、和抗体或抗体片段和治疗剂或诊断剂的选择，可以针对靶细胞类型优化所述复合物。
在一个实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。尽管具有恶性细胞生长的任意组织可以是靶标，但优选的靶标是头颈、乳腺、前列腺、胰腺、成胶质细胞瘤、肾、肝、子宫颈、肺、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、卵巢、胃和结直肠癌。
通过本发明的方法制备的复合物也可以用于靶向非-肿瘤细胞，用于递送治疗分子。尽管任意正常细胞可以是靶标，但优选的细胞是树突细胞、血管内皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、鼻道细胞和肝细胞。可以靶向不希望的但是良性的细胞，例如良性前列腺增生细胞、活动过度的甲状腺细胞、脂肪瘤细胞和与自身免疫性疾病有关的细胞，例如生产参与关节炎、狼疮、重症肌无力、鳞状化生、发育异常等的抗体的B细胞。
所述复合物可以与另一种治疗剂(例如辐射或化疗剂)组合施用。治疗剂或治疗剂的组合可以在复合物施用之前或之后(例如在约12小时至约7天内)施用。化疗剂包括但不限于，例如，多柔比星、5-氟尿嘧啶(5FU)、顺铂(CDDP)、多西他赛、吉西他滨、紫杉醇、长春碱、依托泊苷(VP-16)，喜树碱、放线菌素-D、米托蒽醌和丝裂霉素C。辐射治疗包括γ辐射、X-射线、紫外线照射、微波、电子发射等。
诊断剂也可以通过脂质体或聚合物复合物递送给靶向的细胞。可以使用施用后可体内检测的试剂。示例性的诊断剂包括电子致密材料、磁共振成像剂和放射性药物。可用于成像的放射性核素包括铜、镓、铟、铼和锝的放射性同位素，包括同位素64Cu、67Cu、111In、99mTc、67Ga或68Ga。通过参考引用并入本文的，Low等人在美国专利5,688,488中公开的成像剂可用于本发明。
根据本发明的方法制备的复合物可以以试剂盒的形式提供，用于通过复合物全身递送治疗分子。合适的试剂盒可以在分开的、合适的容器中包含脂质体、抗体或抗体片段和治疗剂或诊断剂。可以以适当次序在无菌条件下混合所述组分，在制备后的合理时间段内(通常约30分钟至约24小时)施用给患者。所述试剂盒组分优选地作为溶液或作为干燥粉末提供。以溶液形式提供的组分优选地与适当缓冲剂、渗透压控制剂等一起，在无菌注射用水中配制。
在另一个实施方案中，本发明提供了脂质体复合物，其中所述诊断剂和/或治疗剂是包囊在脂质体内部中、包含在双层的烃链区中、与内部或外部单层(例如，通过静电相互作用或化学/共价相互作用)相络合/结合的一种或多种小分子，或这些可能性中任意或全部的组合。本文使用的术语＂小分子＂是指低分子量药物、治疗剂和/或诊断剂(后者的实例是标记、染料等)，其分子量通常小于约10kD，合适地小于约5000道尔顿，更合适地小于约1000道尔顿，例如约100至约900道尔顿，约200至约800道尔顿，约300至约700道尔顿，约400至约600道尔顿，或约500道尔顿，以及这样的化合物的盐、酯和其它药学可接受形式。
小分子的实例包括用于治疗遭受或易感任意疾病状态的患者的化合物，包括、但不限于，癌症(例如，乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、胃肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、神经癌、头颈癌、皮肤癌、肉瘤、腺瘤、癌瘤和骨髓瘤)；感染性疾病(例如，细菌病、真菌病、寄生虫病和病毒病(例如病毒性肝炎、亲心性病毒造成的疾病；HIV/AIDS、流感、SARS等))；和遗传病(例如贫血、中性粒细胞减少症、血小板减少症、血友病、侏儒症和严重联合免疫缺陷病(“SCID”)；自身免疫性疾病(例如，银屑病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎)和神经变性病(例如，多发性硬化的不同形式和阶段、克雅病、阿尔茨海默氏病等)。
可用于治疗癌症的示例性小分子(即抗癌小分子)包括但不限于，抑制微管蛋白聚合的小分子、抗血管发生小分子、激酶抑制剂等。用于本发明的小分子合适地具有约2至约9的pKa，且在许多情况下，具有在该范围内的几种pKa(即，2、3、4等)。用于实施本发明的小分子可以是水溶性的、水微溶的或水难溶的(包括不溶于水的化合物)。
在合适的实施方案中，用于实施本发明的小分子包括但不限于微管蛋白聚合抑制剂，例如GMC-5-193(及其类似物)和YK-3-250(及其类似物)。
GMC-5-193(及其类似物)是一种沙利度胺类似物，其在几种癌细胞系中具有抗微管和抗血管发生作用。GMC-5-193的抗增殖活性会抑制人癌细胞增殖。该分子的效能类似于长春新碱，后者是一种众所周知的抗有丝分裂剂。几项研究提示，该抗增殖作用可能是由于几种类型的癌细胞中微管蛋白聚合的抑制。这些类似物启动癌细胞中的有丝分裂积累和异常有丝分裂纺锤体的形成。
从X射线结构看，已经证实GMC-5-193刚好进入βIII人微管蛋白中泰素和秋水仙素结合位点附近的最大氨基酸差异区域。但是，在检查体内功效时，该小分子的水难溶性阻碍了它的施用。溶解度是全身药物生物利用度中的一个重要考虑因素，因为不溶性会进一步限制药物功效，随后对增加的剂量的需求损害患者耐受性。为了避免该问题，使用该分子的肿瘤靶向脂质体递送系统，其中使用肿瘤靶向的配体(TfRscFv)和有(或没有)HoKC缀合的阳离子脂质体，所述HoKC是一种合成的pH-敏感的组氨酰化的寡赖氨酸。HoKC包含在复合物中以提高靶向复合物的抗癌作用，用于辅助内体逃逸。预期药物会扩散进细胞质中，并从此处转移进核中，发挥它的细胞毒性作用，或释放进胞外隔室，在这里它可以对其它肿瘤细胞产生细胞毒性作用(旁观者效应)。
用于实施本发明的其它小分子包括酪氨酸激酶抑制剂，例如，但不限于：
甲磺酸伊马替尼
Figure A200780024924D00321
Figure A200780024924D00322
C29H31N7O(MW＝589.7)，pKa＝7.5、3.0、2.7；
盐酸厄洛替尼
Figure A200780024924D00331
C22H23N3O4·HCl(MW＝429.90，pKa＝5.42)；
苹果酸舒尼替尼(SU11248，
Figure A200780024924D00333
)：
Figure A200780024924D00334
C22H27FN4O2·C4H6O5(MW＝532.6，pKa＝8.95)；和吉非替尼
Figure A200780024924D00336
C22H24CIFN4O3(MW＝446.9，pKa＝5.4和7.2)。
用于实施本发明的其它小分子包括药物化合物，以及标记染料和用于诊断的其它分子。这样的小分子的实例是众所周知的，且可以由本领域技术人员容易地鉴别，许多可以在例如Pharmabase(National Center forResearch Sources，National Institutes of Health)的数据库中找到。可以用于实施本发明的药物小分子的一般类别包括但不限于，参与调节膜转运的化合物(例如，通道、泵、受体、转运蛋白)；参与代谢的化合物(例如ATP抑制剂、电子传递控制剂、氨基酸或脂肪酸合成的抑制剂、神经酰胺类似物等)；细胞内信使(例如，激酶抑制剂等)；参与调节细胞信号转导的化合物；参与调节细胞面积的化合物；以及其它众所周知的小分子类别。小分子类别和化合物的其它实例可以参见美国专利号7,041,651、7,033,775、7,005,255和6,900,198，它们各自的公开内容通过参考整体引入本文中。
如本文所述，通过在加工过程中简单混合一种或多种小分子和脂质体，使小分子合适地包囊、包含在本发明的脂质体复合物中或与其络合/结合。小分子:脂质体复合物的合适比例可以由普通技术人员容易地确定。例如，小分子与脂质体复合物的摩尔比合适地在约0.2:7至约14:7(小分子:脂质体)的范围内，合适地在约1:7至约12:7、约1:7至约10:7、约2:7至约9:7、约4:7至约8:7、约5:7至约8:7、约2.8:7或约7:7(小分子:脂质体)的摩尔比。如全文所述，用于递送小分子的希望的阳离子脂质体的实例包括，包含磷酸二油酰基三甲基铵(DOTAP)和二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)和DOPE和/或chol的混合物的那些。可以改变脂质的比例，以优化特定靶细胞类型对治疗分子的摄取效率。脂质体可以包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。阳离子脂质与中性或辅助脂质的希望的比例是约1:(0.5-3)，优选1:(1-2)(摩尔比)。不同脂质的比例的实例包括但不限于：
LipA      DOTAP/DOPE       1:1摩尔比
LipB      DDAB/DOPE        1:1摩尔比
LipC      DDAB/DOPE        1:2摩尔比
LipD      DOTAP/Chol       1:1摩尔比
LipE       DDAB/Chol       1:1摩尔比
LipG       DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1摩尔比
LipH       DDAB/DOPE/Chol  2:1:1摩尔比
(DOTAP＝磷酸二油酰基三甲基铵，DDAB＝溴化二甲基双十八烷基铵；DOPE＝二油酰基磷脂酰基乙醇胺；chol＝胆固醇)。
在一个实施方案中，本发明提供了制备包含小分子的抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物的方法，该方法包含，制备抗体或抗体片段；将所述抗体或抗体片段与阳离子脂质体相混合，从而形成阳离子免疫脂质体，其中所述抗体或抗体片段非化学缀合至所述阳离子脂质体；和将所述阳离子免疫脂质体与小分子相混合，从而形成所述抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物。尽管不是化学缀合至阳离子脂质体，所述抗体或抗体片段直接结合/络合脂质体，例如，通过电荷-电荷或其它非化学缀合相互作用，以形成免疫脂质体。
在合适的实施方案中，所述抗体片段是单链Fv片段，例如，抗-转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。本文描述了适用于制备包含小分子的阳离子免疫脂质体的脂质，包括磷酸二油酰基三甲基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物；和溴化二甲基双十八烷基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物。合适地以约0.2:7至约14:7(小分子:免疫脂质体)的摩尔比，合适地以约1:7至约12:7、约1:7至约10:7、约2:7至约9:7、约4:7至约8:7、约5:7至约8:7或约7:7(小分子:免疫脂质体)的摩尔比，将阳离子免疫脂质体与小分子相混合。用于实施本发明的示例性的小分子包括本文所述的那些，以及本领域已知的和普通技术人员可容易地鉴别出的其它小分子。合适地，所述小分子是抗癌小分子，例如，但不限于，GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼以及其类似物和衍生物，以及本文所述的和/或普通技术人员熟知的其它小分子。在另一个实施方案中，本发明提供了通过本文所述方法制备的包含小分子的阳离子免疫脂质体复合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物，其包含阳离子脂质体、抗体或抗体片段和小分子，其中所述抗体或抗体片段非化学缀合至所述阳离子脂质体。小分子可以包囊在阳离子脂质体中，包含在阳离子脂质体的烃链区中，与阳离子脂质体的内部或外部单层(包括头基团区域)相结合，或其任意组合。合适地，本发明的阳离子免疫脂质体是单层脂质体(即单双层)，尽管也可以使用包含几个同心双层的多层脂质体。本发明的单双层阳离子免疫脂质体包含内部水性容积，其中可以包囊试剂(例如，小分子)(合适地水溶性试剂)。它们也包含具有烃链区(即，脂质的脂链区)的单双层，所述烃链区中可以含有试剂(例如，小分子)(合适地脂溶性试剂)。另外，试剂(例如，小分子)可以与脂质体膜(即，脂质的头部区域)的内部单层和/或外部单层之一或二者络合或结合。在其它实施方案中，试剂(例如，小分子)可以包囊/结合/络合在本发明的阳离子免疫脂质体复合物的这些区域中的任一个或全部中。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗遭受或易感疾病状态的患者的方法，其包括给所述患者施用本发明的包含小分子的阳离子免疫脂质体复合物。所述免疫脂质体复合物可以通过任意希望的途径施用，包括但不限于，静脉内的、经口的、局部的、通过吸入、肌肉内注射、瘤内注射、病灶内注射、气雾剂的、经皮的、内窥镜的、局部的、腹膜内的或皮下的施用或其它注射途径。本文使用的术语患者包括动物患者(例如，哺乳动物例如狗、猫、猪、绵羊等)以及人。
合适地，本发明的方法用于治疗遭受或易感癌症的患者。在其它实施方案中，治疗遭受或易感癌症的患者的方法，除了施用包含小分子的免疫脂质体复合物以外，还包括给患者施用化疗剂。在合适的实施方案中，本发明的方法包括施用包含小分子的免疫脂质体复合物和化疗剂，所述小分子选自GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物，所述化疗剂选自多柔比星、顺铂、米托蒽醌、泰索帝和CDDP。包含小分子的免疫脂质体复合物和化疗剂可以同时施用，或可以在不同时间施用(例如，彼此一前一后)。合适地，化疗剂在包含小分子的免疫脂质体复合物之前或之后(例如，在施用阳离子免疫脂质体复合物之前或之后至少6小时、之前或之后至少12小时、之前或之后至少24小时、之前或之后至少48小时等)施用。在其它实施方案中，将化疗剂和包含小分子的免疫脂质体复合物同时施用给患者。包含小分子的免疫脂质体复合物和化疗剂的适当剂量和时间安排或施用，由本领域技术人员基于本文包含的和本领域容易得到的信息容易地确定。
在另一个实施方案中，本发明提供了增强化疗剂的功效的方法，其包括给患者施用本发明的阳离子免疫脂质体复合物(例如，包含小分子的阳离子免疫脂质体复合物)以及化疗剂。合适的小分子和化疗剂包括本文所述的那些以及本领域已知的那些。包含小分子的免疫脂质体复合物和化疗剂可以同时施用，或可以在不同时间施用。合适地，化疗剂在包含小分子的免疫脂质体复合物之前或之后(例如，在施用阳离子免疫脂质体复合物之前或之后至少6小时、之前或之后至少12小时、之前或之后至少24小时、之前或之后至少48小时等)施用。在其它实施方案中，化疗剂和包含小分子的免疫脂质体复合物同时施用给患者。
相关领域的普通技术人员容易地明白，可以对本文所述方法和应用作出其它合适的修改和适应，而不脱离本发明或其任意实施方案的范围。现在已经详细描述了本发明，参考下面的实施例将会更清楚地理解本发明，所述实施例包含在这里仅用于示例说明，无意限制本发明。
实施例1
含有3’-半胱氨酸的TfRscFv的构建和纯化
从NCI的David Fitzgerald博士得到质粒表达载体pDFH2T-vecOK。该载体编码识别人转铁蛋白受体(CD71)的5E9抗体的单链片段。通过PCR扩增目标片段，得到VH-连接体-Vκ TfRscFv。将半胱氨酸部分添加到TfRscFv蛋白的3’末端。构建该载体的2种形式。第一种含有pelB先导信号序列(用于运输到周质空间)和His标签。His标签的存在辅助蛋白的检测，从而简化纯化方法的开发。尽管该形式用于最初测试，FDA指南推荐说，外来序列不能用于临床试验。因此，也制备了不含有这2个序列的第二种形式。
使用PCR扩增，将半胱氨酸残基和NotI限制位点的核苷酸序列导入3’末端。类似地，也掺入5’NcoI位点。将PCR产物克隆进商业化载体pET26b(+)(Novagen)的NcoI和NotI位点，从而生成含有pelB先导信号序列和His标签的蛋白产物。在含有IPTG的细菌培养物中生长，产生单链蛋白表达的约100倍增加，这在IPTG诱导的约10小时达到最大。主要在不溶级分(包涵体)中发现该蛋白。
也修改上述构建体，以在最终的蛋白产物中消除His标签和pelB序列。为此，在pelB序列的Nde I酶位点5’切割pET26b(+)载体。PCR扩增在TfR序列的VH-连接体-Vκ scFv的5’末端插入Nde I位点。除了在3’末端的半胱氨酸残基和NotI限制位点的核苷酸序列以外，将DNA终止密码子导入在半胱氨酸序列附近以及NotI位点之前。将PCR产物克隆进商业化表达载体pET26b(+)(Novogen)的NdeI和NotI位点。因而，该构建体的蛋白产物不含有pelB序列或His-标签。
发现大多数cys-TfRscFv蛋白(约90％)不溶，而是包含在包涵体内。因此，如下从包涵体分离来自上述构建体的蛋白：超声处理，用6M盐酸胍、200mM NaCl(6M GuHCl缓冲液)处理，并通过Sephacryl S-200凝胶过滤柱色谱进行纯化。通过对递减浓度的盐酸胍在4℃透析，实现cys-TfRscFv蛋白的重新折叠。备选地，如下制备cys-TfRscFv蛋白：通过用Triton X-100超声处理，随后溶于6M盐酸胍、0.1M tris-HCl pH＝8.0、2mM EDTA pH＝8.0和二硫赤藓糖醇来分离包涵体。如下进行重新折叠：与由0.1M Tris-HCl pH＝8.0、0.5M L-精氨酸-HCl、2mM EDTA和0.9mM谷胱甘肽组成的缓冲液混合，在4℃保持36-48小时，随后对20mMTris-HCl(pH＝9.0)、100mM脲和2mM EDTA(pH＝8.0)在4℃透析20-24小时。透析后，通过用Q-sepharose的离子交换色谱纯化cys-TfRscFv，随后浓缩(使用Amicon超滤装置)，并对PBS(pH＝7.4)+0.06M氯化钠在4℃透析30小时。纯化后，SDS-PAGE显示溶解的、重新折叠的cys-TfRscFv蛋白的单个条带，正确的分子量为约28-30kDa(如WO 00/50008所述)。在-80℃保藏cys-TfRscFv蛋白。
实施例2
通过简单混合制备cys-TfRscFv-脂质体
通过参考引用并入本文的公开的PCT申请WO 99/25320描述了几种阳离子脂质体的制备。制备的阳离子脂质体是澄清溶液，它们的组分和比例如下：
LipA        DOTAP/DOPE             1:1摩尔比
LipB        DDAB/DOPE              1:1摩尔比
LipC        DDAB/DOPE              1:2摩尔比
LipD        DOTAP/Chol             1:1摩尔比
LipE        DDAB/Chol              1:1摩尔比
LipG        DOTAP/DOPE/Chol         2:1:1摩尔比
LipH        DDAB/DOPE/Chol          2:1:1摩尔比
(DOTAP＝磷酸二油酰基三甲基铵，DDAB＝溴化二甲基双十八烷基铵；DOPE＝二油酰基磷脂酰基乙醇胺；chol＝胆固醇)
本领域技术人员熟知，缀合的TfRscFv-免疫脂质体保留了它的免疫活性。我们已经确定，cys-TfRscFv可以化学缀合到脂质复合物(
Figure A200780024924D0039124730QIETU
)上(PCT申请WO 00/50008)，且可以有效地体外和体内转染人前列腺肿瘤细胞。使用不同的化学缀合方法将单链抗体片段结合到脂质体上，是普通实施手段。我们进行了研究来确定，替代化学缀合的cys-TfRscFv和阳离子脂质体(其不含有具有可还原基团的任何脂质，例如马来酰亚胺DOPE或任何可还原基团)的简单混合是否会导致仍然有效结合并转染肿瘤细胞的免疫活性复合物的形成。通过以确定的1/25至1/36(重量/重量)的单链蛋白/脂质体的比例混合cys-TfRscFv和脂质体A，制备了一系列cys-TfRscFv-免疫脂质体复合物。基于缀合的cys-TfRscFv复合物的ELISA数据，混合的复合物中的DNA/nmol总脂质的比例也在1/8至1/18之间。所述复合物的制备根据下述一般程序：将适当量的2mM脂质体(上述的A-H)与产生目标体积所需的任意水相混合，并反转混合。向脂质体-水中，加入适当量的cys-TfRscFv，以产生目标比例，并通过轻轻反转5-10秒进行混合。将该混合物在室温放置10分钟(约5分钟后再次轻轻反转5-10秒)。同时，将适当量的DNA与产生目标体积所需的任意水反转混合5-10秒。通常，对于体外测定用途，希望DNA的浓度范围是每孔约0.01μg至约2μg；对于体内用途，希望每次注射提供约5μg至约100μgDNA。将DNA溶液迅速加入cys-TfRscFv-脂质体溶液中，将混合物反转5-10秒。将最终的混合物在室温放置10分钟，约5分钟后再次轻轻反转5-10秒。对于体内用途，加入50％葡萄糖或50％蔗糖至终浓度5-10％(V:V)，并通过轻轻反转混合5-10秒。在1:30(cys-TfRscFv:脂质体，重量:重量)和1:14(μgDNA:nmol总脂质)的优选比例的特定实例如下：对于在800μl终体积中的40μgDNA，混合183μl水和280μl2mM脂质体溶液。加入34μl cys-TfRscFv(浓度为0.4μg/ml)。混合183μl水和40μl 1μg/1μl DNA。最后一步是加入80μl 50％葡萄糖。
通过本发明的方法制备的最终复合物的大小是100至400(数字值)，使用Malvern Zetasizer 3000通过动态光散射测得ζ电位是25至35。该大小足够小，足以有效穿过肿瘤毛细血管床并到达肿瘤细胞。
进行ELISA测定，以评价所述混合的复合物对人前列腺癌DU145细胞的结合能力。为了对比，在测定中也包含用所述缀合的免疫脂质体制备的复合物。图1所示的结果清楚地表明，通过简单混合cys-TfRscFv蛋白和阳离子脂质体制备的免疫脂质体复合物至少与通过缀合制备的那些一样结合DU145细胞。类似于缀合的复合物，发现比例为1/30的蛋白/脂质和1/14的DNA/脂质具有最高结合能力。如以前用缀合的复合物也观察到的，结合以DNA剂量依赖性的方式降低。这些发现表明，组分的简单混合可以形成保留其免疫活性的复合物。在使用萤光素酶测定的人前列腺DU145细胞和RAT C6细胞中(图2和3)和在使用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)来评价转染率的人胰腺癌细胞系Panc I中(表I，II)，发现了相同的最佳比例。
表I
使用EGFP报告基因I评价的，通过简单混合制备的cys-TfRscFv-脂质体A在Panc I细胞中的转染率
DNA:总脂质比              ％荧光细胞
(μg:nmol)
1:8                         20
1:10                        22
1:12                        35
1:14                        50
1:16                        24
1:18                        20
Cys-TfRscFv:脂质体的比例是1:3(重量:重量)
表II
使用EGFP报告基因II评价的通过简单混合制备的cys-TfRscFv-脂质体A在Panc I细胞中的转染率
Cys-TfRs cFv:脂质比           ％荧光细胞
(重量:重量)
1:26                          14
1:28                          14
1:30                          30
1:32                          28
1:34                          15
1:36                          18
为了确定通过简单混合的cys-TfRscFv与脂质体复合物的结合效率，使用了非变性聚丙烯酰胺凝胶。与用于制备所述复合物的cys-TfRscFv的用量的1/5或1/10量的游离cys-TfRscFv一起，将混合的cys-TfRscFv-脂质体A-p53复合物和不含p53 DNA的cys-TfRscFv-脂质体A装载上凝胶。使用cys-TfRscFv:脂质体为1:30(重量:重量)和DNA:总脂质为1:14(μg:nmol总脂质)的比例,制备所述复合物。游离cys-TfRscFv复合物用作定量标准品，因为在非变性条件下，所述复合物不能进入凝胶，仅游离的、未结合的cys-TfRscFv可以迁移进入。转移至膜后，使用ECL蛋白印迹检测试剂盒(Amersham)，用抗-cys-TfRscFv抗体探测所述凝胶。图4所示的2种复合物(含有和不含p53 DNA)的低信号水平与游离cys-TfRscFv标准品的信号的对比，表明通过简单混合组分，超过95％的cys-TfRscFv掺入所述复合物中。
实施例3
cys-TfRscFv-免疫脂质体递送的wtp53对人癌细胞系的体外化学敏化
进行实验来测定，通过简单混合制备的cys-TfRscFv-脂质体-p53复合物何等有效地使前列腺肿瘤细胞对药物
Figure A200780024924D00421
(盐酸吉西他滨；由Eli Lilly and Co.生产)和
Figure A200780024924D00422
(米托蒽醌，Immunex Corp.)敏化，这2种药物目前都用于治疗前列腺癌。在这些研究中使用携带突变型p53的前列腺肿瘤细胞系DU145。使用XTT细胞毒性测定(66)来确定由本发明的cys-TfRscFv-脂质体-p53复合物诱导的化学敏感性的水平。将5x103个DU145细胞/孔涂布在96孔平板上。24小时后，用混合的cys-TfRscFv-脂质体-p53复合物转染所述细胞。通过以1:30(重量:重量)(cys-TfRscFv:脂质体A)和1:14(μg p53 DNA:nmol总脂质)的比例混合，以制备cys-TfRscFv-脂质体-p53复合物。转染后1天，以递增浓度加入抗肿瘤剂(一式三份)。约3天后进行XTT测定，并计算IC50值，即产生50％生长抑制的药物浓度。如图5A所示，cys-TfRscFv-脂质体-p53复合物处理使细胞对
Figure A200780024924D00423
的敏感性增加了8倍。对于图5A，IC50值(nM)如下：cys-TfRscFv-LipA-p53：0.5；cys-TfRscFv-LipA：4.0；cys-TfRscFv-LipA-Vec：4.0；未转染：5.0。Vec相对于p53的敏化倍数＝8，UT相对于p53的敏化倍数＝10。
类似地，使DU145细胞对药物米托蒽醌的敏化了17.5倍(图5B)。对于图5B，IC50值(ng/ml)如下：cys-TfRscFv-LipA-p53：0.08；cys-TfRscV-LipA：1.20；cys-TfRscFv-LipA-Vec：1.40和未转染：1.80。Vec相对于p53的敏化倍数＝17.5，UT相对于p53的敏化倍数＝22.5。使用人胰腺癌细胞系Panc I进行了类似的研究。涂布4 x 103个Panc I细胞/孔，如上进行XTT测定。这里也使用优选的比例1:30(cys-TfRscFv：脂质体A重量:重量)和1:14(μg p53 DNA:nmol总脂质)。对于DU145，肿瘤细胞对化疗剂显著敏化(图6A和B)。在0.06μg/孔的p53 DNA浓度，使用混合的cys-TfRscFv-脂质体DNA复合物，对
Figure A200780024924D00431
的敏化增加23.8倍(图6A)。对于图6A，IC50值如下：cys-TfRscFvLipA-p53：0.21nM；cys-TfRscFvLipA-Vec：5.00nM和TfLipA-p53：0.30nM。cys-TfRscFvLipA-Vec的IC50/cys-TfRscFrLipA-p53的IC50＝23.8。当使用空载体替代p53时，没有观察到敏化。在0.08μg DNA/孔的p53 DNA浓度，Panc I细胞的响应急剧增加(图6B)。这里观察到接近200倍的敏化增加。对于图6B，IC50值如下：cys-TfRscFvLipA-p53：1.8nM；cys-TfRscFvLipA-Vec：350nM；和cys-TfRscFvLipA：600nM。cys-TfRscFvLipA-Vec的IC50/cys-TfRscFvLipA-p53的IC50＝194.44。因此，这些体外研究表明，通过简单混合制备的cys-TfRscFv-脂质体可以有效地将wtp53转染进前列腺肿瘤细胞，并使它们对常规化疗剂敏化。
实施例4
由通过简单混合制备的cys-TfRscFv-LipA-EGFP的体内肿瘤靶向
在雌性无胸腺裸(NCR nu/nu)小鼠中皮下诱导DU145肿瘤。以32ugDNA/注射，在24小时阶段内给小鼠尾静脉内注射3次通过简单混合在1/30的scFv:脂质体比，但是在不同的DNA:总脂质比(1/10，1/11，1/12，1/13，1/14)制备的cys-TfRscFv-LipA-EGFP(增强的绿色荧光蛋白)(TfRscFvII)。为了对比，也将通过缀合方法制备的1/30、1/14的复合物(图7B中的TfRscFv III)和1/30、1/14的不同批次的单链(图7B中的TfRscFv I)注射进小鼠。注射后60小时，处死小鼠，采集肿瘤和肺，并分离蛋白用于使用抗-EGFP抗体的蛋白印迹分析。将未络合的LipA-EGFP复合物(UL)、Tf-LipA-EGFP复合物(Tf)和BSA-LipA-EGFP复合物(BSA)注射进小鼠作为对照。图7A-如在DU145肿瘤中所证实的，在阳性对照Tf、TfRscFvIII和TfRscFvI中观察到EGFP条带。更重要地，在1/14的DNA/脂质比，在TfRscFvII中发现了强EGFP信号。相反，在正常肺组织中仅看到非常低水平的EGFP表达。因此，通过简单混合制备的cys-TfRscFv-脂质复合物在全身施用后可以有效地靶向肿瘤。
为了评价混合的再现性，以1:30(scFv:脂质体重量:重量)和1:14(μgDNA:nmol总脂质)的优选比例，通过简单混合，将不同批次的cys-TfRscFv(I至V)与脂质体A-EGFP络合。如上文，皮下诱导人前列腺DU145、膀胱HTB-9、乳腺MDA-MB-435和头颈JSQ-3异种移植肿瘤。在24小时阶段内，也将复合物尾静脉内注射3次。Tf-LipA-EGFP(Tf)和未络合的LipA-EGFP复合物(UL)用作对照。注射后60小时，处死小鼠，采集并如上分析肿瘤和肝。发现所有混合的复合物在4种肿瘤类型中靶向(图7B)。但是，在正常组织(肝)中几乎没有信号。探测相同膜的肌动蛋白水平，以显示相等的装载。
实施例5
通过全身施用经简单混合制备的cys-TfRscFv-脂质体-p53，使人异种移植肿瘤辐射/化学敏化
进行功效研究来进一步证实本发明的cys-TfRscFv-免疫脂质体复合物的体内有效结合并递送wtp53给肿瘤细胞的能力。经尾静脉，给具有约60-90mm3的皮下DU145肿瘤的小鼠每周注射3次(共10次注射)cys-TfRscFv-脂质体-p53。通过以1/30(cys-TfRscFv:脂质体A，重量:重量)和1/14(μg DNA/nmol总脂质)的比例简单混合，制备该复合物。将肿瘤区域选择性地暴露于2.0Gy每日分次剂量的γ-辐射至总32Gy(图8)。用混合的cys-TFRscFv-脂质体A复合物+辐射处理的动物具有显著的肿瘤生长抑制。使用抗癌药物和将肿瘤抑制基因Rb94递送给人膀胱癌异种移植肿瘤(HTB-9)的本发明的cys-TFRscFv-免疫脂质体的组合，和在用
Figure A200780024924D00442
和携带另一种诱导细胞凋亡的基因(调亡蛋白)或p53的cys-TFRscFv-脂质体处理的Panc I异种移植物中，也观察到类似结果。
这些结果表明，通过本发明的方法制备的复合物可以包含多种基因(掺入质粒载体中)，用于体内有效递送给癌细胞作为治疗性处理。
实施例6
通过简单混合制备的cys-TFRscFv-脂质体A递送的反义HER-2寡核苷酸使胰腺癌细胞体外化学敏化
该实施例证明了本发明在将除基因以外的分子有效递送给肿瘤细胞用于治疗性处理的有用性。复合物的制备如实施例2所述，但是，这里包囊的DNA是18mer硫代磷酸化的寡核苷酸(ODN)，其针对HER-2基因的起始密码子(AS HER-2)(51)。对于质粒DNA，使用如上的比例1:30(cys-TfRscFv:脂质体，重量:重量)和1:14(nmol ODN:nmol总脂质)。以4x103个细胞/孔，将Panc I细胞接种进96孔平板。24小时后，用通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-LipA-AS HER-2转染所述细胞。Tf-LipA-AS HER-2和cys-TfRscFv-LipA-SC ODN用作对照。SC ODN是乱序ODN，其具有与AS HER-2 ODN相同、但是以随机次序的核苷酸组成。如图9所示，通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-Lip A-AS HER-2复合物能使胰腺癌细胞系Panc I对化疗剂
Figure A200780024924D00451
的作用敏化超过11倍。敏化的这种增加等于用阳性对照Tf-LipA-AS HER2复合物转染产生的增加。对于图9，IC50值如下：TfRscFv-LipA3-AS-HER-2：16nM；Tf-LipAe-AS-HER-2：14nM和TfR-scFv-LipAe-SC：200nM。TfR-scFv-LipAe-SC的IC50/TfR-scFv-LipAe-AS-HER-2的IC50＝12.5。
实施例7
全身递送通过简单混合制备的cys-TFRscFv-LipA-AS HER-2 ODN对人异种移植肿瘤的体内化学敏化
在该实施例中，证明了通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv脂质体-DNA复合物在全身递送后向肿瘤细胞体内递送反义分子的能力。为了证实该递送系统的通用性，采用了两种不同的人异种移植小鼠肿瘤模型(胰腺癌和乳腺癌)。首先(图10A)，在雌性无胸腺裸(NCR nu/nu)小鼠中诱导PancI皮下异种移植肿瘤。当肿瘤大小是100-200mm3时，给动物注射化疗剂
Figure A200780024924D00461
(腹膜内地)和通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-LipA ASHER-2(静脉内)。使用1:30(cys-TfRscFv:脂质体，重量:重量)和1:15(nmol ODN:nmol总脂质)的比例，制备所述复合物。除了静脉内注射以外，也瘤内注射上述复合物。一组动物仅接受
Figure A200780024924D00462
第二个对照组接受+携带空载体的复合物。仅
Figure A200780024924D00464
治疗不能显著抑制胰腺肿瘤生长。相反(图10A)，
Figure A200780024924D00465
和通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-Lip A复合物递送的AS-HER-2 ODN的组合不仅显著抑制肿瘤生长，而且导致肿瘤退化。
药物泰索帝
Figure A200780024924D00466
(多西他赛；生产商是Aventis Pharmaceuticals，Collegeville，PA)和静脉内施用的通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-LipB AS HER-2的组合中，也观察到人乳腺癌异种移植肿瘤的显著的肿瘤生长抑制(图10B)。当脂质体制剂B用于乳腺肿瘤时，采用与上面为Panc I所述相同的比例。
实施例8
用通过简单混合制备的cys-TFRs cFv-脂质体A递送成像剂
Figure A200780024924D00467
对MRI图像的增强
该实施例证明了通过本发明的方法包囊MRI成像剂和形成cys-TfRscFv-脂质体-成像剂复合物的能力。通过本发明的方法制备的复合物可以静脉内地施用，导致增加的原发肿瘤和转移灶肿瘤图像的增强。这些成像剂包括但不限于，
Figure A200780024924D00468
(Gd-DTPA)(Schering AG)。用于通过简单混合形成复合物的比例是1:30(cys-TfRscFv:脂质体，重量:重量)和1:14(ug成像剂:nmol脂质)的优选比例。在这些研究中，在所述复合物中使用16ul 
Figure A200780024924D00469
图11显示了向具有人头颈(上图)、乳腺(中图)或前列腺(下图)来源的皮下异种移植肿瘤的小鼠中一次静脉内注射通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-LipA-MAGNEVIST
Figure A200780024924D0047113325QIETU
的结果。与接受游离
Figure A200780024924D00471
的肿瘤相比，在接受cys-TfRscFv-LipA-
Figure A200780024924D00472
的肿瘤中观察到更高水平的成像剂增强，这证明了施用通过本发明的方法制备的复合物施用成像剂的益处。在其它实验中，也观察到与周围的正常组织相比增加的肿瘤摄取。
使用同系小鼠肺转移模型，也观察到类似的增强。将B16/F10小鼠黑素瘤细胞静脉内地注射进C57BL/6小鼠。这些细胞在小鼠肺中形成肿瘤结。也使用1:30和1:14的优选比例，通过本发明的方法制备cys-TfRscFv-脂质体-
Figure A200780024924D00473
复合物。静脉内施用复合物，通过MRI对肿瘤结成像。与游离
Figure A200780024924D00474
相比，包囊的成像剂也在肿瘤中具有延长的摄取，因为复合物的峰增强晚于游离
实施例9
通过简单混合制备空间稳定化的免疫脂质体
脂质体复合物被网状内皮系统从血流中迅速清除。在延长该循环时间的努力中，已经配制了空间稳定化的脂质体，其具有掺入脂质体复合物中的亲水聚合物例如PEG。已经设计了多种方法来在PEG-脂质体复合物中包含靶向配体，例如抗体或抗体片段。大多数(或全部)这样的方法包括化学缀合步骤，以将抗体或抗体片段连接到PEG上。用于形成所述复合物的如此剧烈的化学反应和方法会导致抗体活性的丧失或掩蔽。在该实施例中，我们证明了通过简单混合可以将cys-TfRscFv蛋白连接到PEG-脂质体分子上，且产生的复合物可以更有效地转染人肿瘤细胞。
为了形成该复合物，如实施例2所述，以1:14(ug DNA:nmol脂质)的比例，将在实施例2中产生的阳离子脂质之一组成的脂质复合物核酸相混合。向该脂质复合物中，加入在25mM HEPE缓冲液(pH7.2)中的商购得到的NHS-PEG-MAL聚合物(2％)。将溶液轻轻反转3-5秒，并在室温温育1.5小时。为了形成cys-TfRscFv-PEG-脂质体-DNA复合物，以1:8(cys-TfRscFv:脂质体，重量:重量)的比例，将cys-TfRscFv蛋白加入PEG-脂质复合物，轻轻反转，并在室温放置10分钟至1小时，然后用于体外转染细胞。也采用在1:5至1:30(cys-TfRscFv:脂质体，重量:重量)范围内的其它比例来形成复合物。对于体内用途，在温育后加入50％葡萄糖至5％的终浓度，通过反转轻轻混合，并注射进动物。备选地，可以将最终的复合物在4℃保藏过夜(12-18小时)。
在这里所示的实验中，核酸是pLuc，即编码萤火虫萤光素酶基因的质粒DNA。以5 x 104个细胞/孔，涂布人黑素瘤细胞MDA-MB-435。24小时后，如实施例3所述用cys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc转染它们，并通过萤光素酶活性水平评价转染率。如图12所示，通过本发明的方法制备的cys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc复合物能以比不含有靶向cys-TfRscF蛋白的PEG-LipA-pLuc更好的效率转染靶细胞。
因而，本文所述的简单混合的方法也可以用作简单的、非破坏性的制备空间稳定化的靶向免疫脂质体的手段。
实施例10
通过简单混合制备包含小分子(GMC-5-193)的免疫脂质体及其表征
为了提高小分子GMC-5-193的体外和体内抗癌作用，制备了包含小分子的肿瘤靶向脂质体复合物。除了TfRscFv/LipA复合物以外，也制备了与内体破裂肽缀合的阳离子脂质体(LipA-HoKC)。内体破裂肽HoKC可以辅助GMC-5-193在细胞胞质中的释放，从而影响胞质中的微管蛋白聚合。所述配体-脂质体复合物优先靶向肿瘤细胞，这是由于它们表面上的增高水平的对应受体。在原发肿瘤和转移灶中观察到所述配体-脂质体递送的基因的高水平表达，但是在正常组织例如肝、肺、骨髓和肠隐窝中则没有。在该实施例中，将包含转铁蛋白受体单链(TfRscFv)的本发明的脂质体复合物用于向癌细胞体外和体内递送GMC-5-193，以评价包含GMC-5-193的脂质复合物的体外和体内生物功效。
材料和方法
1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和N-马来酰亚胺基-苯基丁酸酯DOPE(MPB-DOPE)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ IDNO：2)肽的生产商是Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)。
GMC-5-193的合成
在Virginia大学化学系合成化合物GMC-5-193。它的分子量是359.4Da，通过质谱和NMR证实它的结构。酰胺质子和胺质子的pKa值分别是15和9。在DMSO中制备该化合物的2.5mg/mL原液。
细胞系和培养
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；Manassas，VA)得到人前列腺癌细胞系DU145(HTB-81)和小鼠黑素瘤细胞系B16/F10(CRL-6475)。在含有Earls盐的Eagle最低基础培养基(EMEM)中培养DU145，所述EMEM中添加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养B16/F10(ATCC，CRL-6475)，所述DMEM中添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的改良MEM(IMEM)中培养人黑素瘤细胞系MDA-MB-435、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人胰腺癌细胞系PANC-1。转移性细胞系MDA435/LCC6从MDA-MB-435腹水中形成。在添加了5％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的IMEM中培养MDA435/LCC6。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的EMEM中培养正常人肺成纤维细胞IMR-90细胞，它由I.Panyutin博士(Nuclear Medicine Department，National Institutes of Health，Bethesda，MD)捐赠。在含有1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸+10％热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的EMEM中培养正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞系H500。EMEM购自MediaTech(Herndon，VA)，其它细胞培养基和成分从Biofluids(Rockville，MD)得到。
TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物的制备
使用本文和在美国专利申请号09/914,046(其公开内容通过参考整体并入本文中)中所述的乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂LipA(以1:1至1:2摩尔比的DOTAP:DOPE或DDAB:DOPE)。如下制备TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物。在旋转或搅拌下，在室温温育LipA和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA的比例，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的GMC-5-193，通过室温下反转或搅拌进行混合，并温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。GMC-5-193:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7，更合适地2:7至8:7，最合适地7:7或2.8:7。用
Figure A200780024924D00501
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物的制备
使用乙醇注射方法，制备与HoKC肽和LipA-MPB一起使用的阳离子脂质体制剂(以1:1:0.1至1:2:0.1摩尔比的DOTAP:DOPE:MPB-DOPE或DDAB:DOPE:MPB-DOPE)。然后使用如前所述的携带马来酰亚胺基团的阳离子脂质体和携带末端半胱氨酸基团的肽之间的偶联反应，制备LipA-HoKC脂质体。Yu，W.，et al.，＂Enhanced transfectionefficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolysinepeptide.＂Nucleic Acids Research 32：e48(2004)。将0.1mmol含有在半胱氨酸上游离巯基的肽的等分试样加入在10mM HEPES(pH7.4)溶液中的2mmol LipA-MPB中，在室温旋转2小时。得到的LipA-HoKC具有1.4mM的脂质浓度。如下制备TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物。在旋转或搅拌下，在室温温育LipA-HoKC和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA-HoKC的比例，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的GMC-5-193，通过室温下反转或搅拌进行混合，并温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。GMC-5-193:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7、更合适地2:7至8:7、最合适地7:7或2.8:7。用
Figure A200780024924D0051090239QIETU
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
体外细胞生存力和TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/脂质体-HoKC/GMC-5-193复合物的优化
对于体外细胞毒性研究，将在100μL每种细胞系的适当生长培养基中的5-5.5×103个细胞/孔涂布进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖100μL在不含血清的培养基中的递增浓度的TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193，根据需要)或游离GMC-5-193，温育4-6小时，合适地5小时，然后添加FBS。然后在37℃、在含有5％CO2的湿润空气下，将所述细胞温育另外24-72小时，合适地48小时。此后，用不含酚红的IMEM洗涤细胞，并根据生产商的手册(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)进行细胞生存力的基于XTT的测定。在有电子偶合剂XTT存在下，3’-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠被活细胞线粒体中的脱氢酶转化成橙色甲臢(orangeformazan)。使用微平板读取仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)，在450nm处测量与活细胞数目相关联的甲臢吸光度。从药物浓度与活细胞分数的对数关系图，内插得到产生50％生长抑制的IC50。
体外化学敏化
对于化学敏化研究，将100μL的4～5×103个细胞/孔接种进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖100μL TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193，根据需要)或1.25～2.5μM的游离GMC-5-193(作为GMC-5-193)，温育4-6小时，合适地5小时，然后向每个孔中加入FBS。将所述细胞温育另外24-72小时，合适地19小时，随后加入含有或不含递增浓度的化疗剂的适当补充的培养基中，并继续温育约24-72小时，合适地48小时。使用的化疗药物是多柔比星(Bedford Labs，Bedford，OH)、多西他赛(泰索帝；Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)、米托蒽醌(
Figure A200780024924D00521
Immunex Corp.，Seattle WA)和顺铂(CDDP；Bedford Labs，Bedford，OH)。进行XTT测定来评价对化疗剂的敏化程度，并计算每种细胞的IC50值。敏化倍数等于：未转染的IC50/每种复合物的IC50。
体外共聚焦成像
对于共聚焦成像，将5.0×104个细胞/孔的MDA-MB-435接种到24孔平板中的玻璃上，24小时后，用不含血清的培养基洗涤，用TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193，根据需要)或游离GMC-5-193处理，并温育6小时。处理后6小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞2次，用在PBS中的4％多聚甲醛固定，并用PBS再次洗涤。然后，使用PROLONG
Figure A200780024924D0047113325QIETU
 Antifade试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)，将所述细胞固定在载玻片上。对于核染色，根据生产商的手册，对固定细胞使用在Select FX Nuclear Labeling试剂盒中的蓝荧光复染试剂-DAPI(Molecular Probes)。为了成像，使用配置在GUMC显微镜上的OlympusFLUOVIEW
Figure A200780024924D0047113325QIETU
-300激光扫描共聚焦系统和Imaging Shared Resource(MISR)的。
体内肿瘤靶向
将悬浮于PBS中的人转移性细胞MDA435/LCC6(8×106)静脉内地注射进无胸腺裸小鼠的尾静脉。以每只小鼠9mg/kg GMC-5-193，给携带MDA-MB-435/LCC6异种移植肿瘤的小鼠静脉内地注射游离GMC-5-193、TfRscFv/LipA/GMC-5-193、TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193或LipA/GMC-5-193(未络合的复合物)。这是2.8:7(小分子:脂质体)的摩尔比。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比是1:30(重量:重量)。注射后3小时，切离肝、肺和任何其它可见的肿瘤，并在荧光显微镜(Nikon SMZ-1500EPI-荧光立体镜系统)下检查。
体内功效研究
将悬浮于PBS中的小鼠黑素瘤细胞B16/F10(1×105)静脉内地注射进C57BL/6小鼠的尾静脉。以每次注射3mg/kg GMC-5-193的剂量，每周2-3次至共7次注射，给携带B16/F10肿瘤的小鼠静脉内地注射仅游离GMC-5-193、或者单独的或与CDDP相组合的TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193，根据需要)。每种复合物中GMC-5-193:LipA或LipA-HoKC的比是7:7。每种复合物中单链抗体片段：脂质体的比是1:30(重量:重量)。某些组也仅接受CDDP，给予每周2次，共6次注射。前2次CDDP注射是在2.5mg/kg。所有后续注射是在2mg/kg。处理3周后，处死小鼠，切离肺，从每只小鼠抽血。器官固定在10％甲醛中，并在照像之前保藏在70％乙醇中。
来自小鼠血清的切割的胱天蛋白酶-3的蛋白印迹分析
在室温凝固1小时后，在室温以1,000rpm离心从小鼠眶后窦收集的血液10分钟。将血清转入新试管，以10,000g再次离心20分钟。使用P-30Micro-Bio-Spin色谱柱(BIORAD，Hercules，CA)纯化上清液血清。将15微升级分装载上4％-12％梯度NuPAGE凝胶(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)，运行至10kDa蛋白标志物已经跑出凝胶(约1.5至2小时)。电泳后，将蛋白转移上Protran BA 85硝酸纤维素转移膜(Schleicher and Schuell，BioScience，Keene，NH)。最后，用切割的胱天蛋白酶-3(17kD)抗体，进行切割的胱天蛋白酶-3的蛋白印迹分析。为了阻断非特异性结合，用在含有150mM NaCl和0.05％吐温20(TBST)的10mM Tris-HCl缓冲液pH8.0中的5％脱脂奶粉在室温温育所述膜1小时。用在5％奶TBST中的1:1000稀释的切割的胱天蛋白酶-3兔第一抗体(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)在4℃探测印迹过夜，然后用TBST洗涤3次(各15分钟)。使用山羊抗兔第二抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)、ECL蛋白印迹检测剂和Hyperfilm ECL(Amersham，Piscataway，NJ)，检测蛋白。
结果
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物的摩尔比的体外优化
如上所述制备TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物，并优化TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物的小分子与脂质体的摩尔比。检查了在不同比例的GMC-5-193:LipA-HoKC的络合的GMC-5-193对DU145人前列腺癌细胞的细胞毒性效应。将5.5 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物或游离GMC-5-193处理。处理后48小时，进行XTT测定，以评价细胞毒性，并从浓度-细胞生存力曲线计算IC50值(产生50％生长抑制的药物浓度)。图13显示了用每种复合物处理的DU145细胞的IC50值。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比是1:30(重量:重量)。在2:7～7:7的GMC-5-193:脂质体摩尔比范围内，与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到IC50值的降低，使IC50值从7.7±0.9μM降低至2.2±5μM。在8:7的GMC-5-193:脂质体摩尔比，用络合的或游离的GMC-5-193转染的细胞的IC50值是类似的。选择在7:7的GMC-5-193:脂质体摩尔比的GMC-5-193复合物用于进一步实验，因为在2:7～7:7的GMC-5-193:脂质体摩尔比范围内，用络合的GMC-5-193处理的DU145细胞的IC50值没有显著差异。在7:7(即1:1)的GMC-5-193:脂质体摩尔比，络合的GMC-5-193在5％葡萄糖中的粒度是约300nm。
游离的或络合的GMC-5-193对不同细胞系的细胞杀死(敏感度)的作用
图14显示了不同细胞系(DU145、MDA-MB-435、MDA435/LCC6、B16/F10)中络合的GMC-5-193和游离的GMC-5-193的细胞杀死水平的比较。这里将4～5.5 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后，用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物、游离GMC-5-193处理。GMC-5-193的浓度是50nM～31.25μM。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比是1:30(重量:重量)。处理后48小时，进行XTT测定，以评价细胞毒性，并计算IC50值。用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193处理的DU145、MDA435/LCC6和B16/F10细胞的IC50值低于用游离GMC-5-193处理的细胞，显示了对该分子增加的敏感度。MDA-MB-435表现出与TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物或游离GMC-5-193类似的敏感度。用DU145细胞(IC50值从游离的7.9uM降低至复合物的3.2uM)和B16/F10细胞(IC50值范围从6.6±0.8μM降低至4.2±0.0μM)观察到游离的和络合的GMC-5-193之间的敏感度的巨大差异。
下面的表III显示了对比游离GMC-5-193和TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物而进行的类似实验的结果。
表III.用XTT生存力测定得到的IC50值(μM)*
 
细胞系 游离GMC-5-193 TfRscFv/LipA/GMC-5-193
DU145 11.3±0.6 3.9±0.5
MDA-MB-435 4.0±0.5 2.5±0.1
B16-F10 >31 5.7±0.4
＊3组测量的平均值±S.D.
因而，与对本领域目前使用的游离小分子的响应相比，用本发明的TfRScFv/LipA-HoKC络合GMC-5-193增加了多种人和小鼠细胞系对该小分子的响应。
TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物的体外化学敏化
GMC-5-193具有微管破裂和抗血管发生作用。为了确定是否可以增强常规化疗的抗癌作用，并与游离小分子相比来比较络合小分子的增强水平，研究了游离的和配体/脂质体络合的GMC-5-193与常规化疗剂的联合治疗的作用。检查了配体/脂质体/GMC-5-193(TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)复合物的使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对多柔比星敏化的能力，结果如图15A所示。在这里，将4.5 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后，用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物、游离GMC-5-193或仅LipA-HoKC处理。GMC-5-193的浓度是1.25μM/孔。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比是1:30(重量:重量)。24小时后，加入浓度从2.07递增至～2070ng/mL的多柔比星。48小时后，进行XTT测定，以评价响应于治疗的细胞生存力。图15A中的每个点代表一式三份样品的平均值±标准差。IC50值代表产生50％生长抑制的药物浓度。UT＝未转染。选择蒽环类抗生素多柔比星，因为它是最常见的化疗剂之一，且已经与微管靶向的、微管蛋白聚合剂一起用于乳腺癌的联合治疗。计算IC50值。用没有GMC-5-193的LipA-HoKC转染的细胞表现出与未转染的细胞类似的IC50，表明脂质体本身是无毒的。用游离GMC-5-193处理的细胞表现出轻微降低的、但是不显著不同的IC50，表明游离GMC-5-193不会有效抑制细胞生长。但是，与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到敏化的显著(～50倍)增加，IC50值从300下降至8ng/mL。
在图15B中显示了检查仅多柔比星、多柔比星+游离GMC-5-193(GMC)和多柔比星+TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)复合物(即，不含HoKC肽的阳离子免疫脂质体)的作用的类似研究的结果。复合物中GMC-5-193:LipA的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。与用仅多柔比星和多柔比星+游离GMC-5-193处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到敏化的约10倍增加。
研究了递增剂量的，游离的或作为TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物施用的GMC-5-193使B16/F10细胞对顺铂(CDDP)敏化的作用，如图15C-E所示。GMC-5-193的浓度分别是1.25、2和2.5uM。复合物中GMC-5-193:LipA的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。在图15C中，GMC-5-193的浓度是1.25μM/孔，将XTT测定温育9小时。在图15D中，GMC-5-193的浓度是2μM/孔，将XTT测定温育7小时。在图15E中，GMC-5-193的浓度是2.5μM/孔，将XTT测定温育9小时。在GMC-5-193的最低剂量，游离的和络合的GMC-5-193都没有增强对CDDP的响应(图15C)。但是，敏化程度随着GMC-5-193的剂量增加至2uM和2.5UuM而增加。在2种情况下，与仅CDDP和游离GMC-5-193相比，络合的小分子对细胞具有提高的作用。该差异在2uM剂量时最显著。因而，在该处理方法下，与用相同浓度的游离GMC-5-193处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到敏化的增加，这解释了使用所述复合物递送的有益效应。因而，用复合物递送的GMC-5-193时，敏化存在剂量依赖性的增加。
上组实验也证明，当使用TfRscFv/LipA-HoKC或TfRscFv/LipA来递送小分子时，得到增加的响应。
在图16A-C中，用正常肺成纤维细胞细胞系IMR-90显示了小分子在被包含为本发明的复合物的一部分时的作用的特异性。上述使用B16/F10和MDA-MB-435的敏化结果显著不同于在相同条件下使用正常人肺成纤维细胞IMR-90的结果。将4.5x103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后，用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物、游离GMC-5-193或仅LipA-HoKC处理(图16A)。GMC-5-193的浓度是1.25μM/孔。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。24小时后，加入浓度从2.07ng/mL递增至约2070ng/mL的多柔比星。48小时后，进行XTT测定以评价响应处理的细胞生存力。每个点代表一式三份样品的平均值±标准差。IC50值代表产生50％生长抑制的药物浓度。UT＝未转染。在IMR-90细胞中，仅LipA-HoKC、游离GMC-5-193和络合的GMC-5-193的敏化倍数不具有统计上差异，表明单独地或与TfRscFv/Lip-HoKC络合地施用的GMC-5-193对正常细胞没有作用或具有微弱的作用。这得到了进一步证实，因为与在MDA-MB-435细胞中的8ng/mL相比，络合的GMC-5-193在IMR-90中的IC50是200ng/mL，这代表正常和肿瘤细胞系之间的25倍差异。形成对比的是，在用游离GMC-5-193处理后，2种细胞系之间IC50值的差异仅是1.1倍。因而，与作为游离GMC-5-193施用时相比，当作为TfRscFv/LipA-HoKC复合物的组分递送时，GMC-5-193对肿瘤细胞是特别更有效的。
在图16B中显示了检查GMC-5-193的TfRscFV/LipA(不含HoKC)递送使正常人肺成纤维细胞IMR-90对多柔比星敏化的作用的类似实验的结果。另外，用所述复合物施用小分子不会使正常细胞对化疗剂敏化。
类似地，在使用IMR-90和不同化疗剂的研究中，检查了GMC-5-193的肿瘤靶向脂质体递送(TfRscFv/LipA/GMC-5-193)使得对米托蒽醌敏化的作用(图16C)。这里，络合小分子也没有影响正常细胞对米托蒽醌的响应。
也检查了所述复合物使另一种人肿瘤细胞系，DU145人前列腺癌细胞对泰索帝的敏化的作用(图17A)。将4.5 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，并在24小时后，用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物处理。GMC-5-193的浓度是1.25μM/孔。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。24小时后，加入浓度从0.08nM递增至约82.7nM的泰索帝。48小时后，进行XTT测定，以评价响应于治疗的细胞生存力。每个点代表一式三份样品的平均值±标准差。IC50值代表产生50％生长抑制的药物浓度。UT＝未转染。泰索帝是一种微管靶向的、微管蛋白聚合剂，已经证实其发挥高水平的临床活性。选择该药物，因为它是用于前列腺癌的联合治疗的一线化疗剂之一。用仅LipA-HoKC、游离GMC-5-193和TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193处理后，DU145细胞对泰索帝的敏化倍数分别是1.1、1.2和47.1，表明在用络合的GMC-5-193处理的细胞中，极大增强了对泰索帝的响应水平。
在图17B中显示了使用不同化疗剂的类似研究的结果，其中对比了游离GMC-5-193、仅LipA和TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物使DU145人前列腺癌细胞对米托蒽醌的敏化程度。复合物中GMC-5-193:LipA的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。与用仅米托蒽醌处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到敏化的约3倍增加，而用游离GMC-5-193观察到仅1.7倍增加。当使用所述复合物时，敏化倍数翻倍。
在图17C中显示了另一个研究的结果，其中对比了游离GMC-5-193(GMC)、仅LipA和TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物使MDA-MB-435人黑素瘤细胞对泰索帝的敏化程度。复合物中GMC-5-193:LipA的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。与用仅泰索帝处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到敏化的约10倍增加，这是用游离GMC-5-193时的2倍。
接着，对比了络合的GMC-5-193和CDDP处理在小鼠同系肺转移模型中的作用。图18显示了与游离GMC-5-193相比，所述复合物使B16/F10细胞对CDDP敏化的作用。将3.5 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，并在24小时后，用仅LipA-HoKC、游离GMC-5-193和TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物转染。GMC-5-193的浓度是2μM/孔。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。24小时后，加入浓度从0.4μM递增至约200μM的CDDP。CDDP处理后48小时，进行XTT测定，以评价对CDDP的敏化程度。每个点代表一式三份样品的平均值±标准差。IC50值是产生50％生长抑制的药物浓度。UT＝未转染。观察到络合的GMC-5-193超过游离GMC-5-193的敏感增加，IC50值从42降低至20μM。所述复合物的敏化倍数是2.6，这又是游离GMC-5-193的2倍。因而，来自所有上述体外实验的结果支持了下述观察，即与本领域目前作为游离GMC-5-193递送时相比，与靶向脂质体TfRscFv/LipA和TfRScFv/LipA-HoKC络合的GMC-5-193更有效地使癌细胞对常规化疗剂敏化。
体外共聚焦成像
使用共聚焦成像来对比当作为游离GMC-5-193递送时和当与所述靶向脂质体(含有和不含HoKC肽)络合时的GMC-5-193的内化，其中利用GMC-5-193的固有荧光。将MDA-MB-435细胞暴露于游离GMC-5-193或络合的GMC-5-193以6小时，然后用PBS洗涤，用在PBS中的4％多聚甲醛固定，并通过共聚焦显微镜观察。图19A显示了游离GMC-5-193的摄取和用TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物递送给细胞的GMC-5-193的摄取之间的对比；图19B显示了游离GMC-5-193的摄取和用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scLHK-GMC)复合物递送的GMC-5-193的摄取之间的对比。将5 x 104个细胞/孔接种到在24孔平板中的载玻片上，并在24小时后，用TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物或游离GMC-5-193处理。复合物中GMC-5-193:LipA或LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。处理后6小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，用在PBS中的4％多聚甲醛固定，并封装在载玻片上。使用Olympus FLUOVIEW
Figure A200780024924D0047113325QIETU
-300激光扫描共聚焦系统来观察荧光。与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，当小分子GMC-5-193与本发明的TfRScFv/LipA或TfRScFv/LipA-HoKC复合物络合时，观察到显著增加的细胞对荧光的摄取。
在用络合的GMC-5-193处理的细胞中，观察在整个细胞(包括细胞质和细胞核)中的GMC-5-193荧光分布模式。DIC图像揭示，用GMC-5-193复合物处理的细胞的形态学不同于用游离GMC-5-193处理的细胞。前者表现出相对圆形的细胞，后者表现出伸长的且更伸展的细胞，类似于未处理的细胞观察到的结果。这些结果表明，与TfRscFv/LopA或TfRScFv/LipA-HoKC络合后，GMC-5-193可以更有效地被癌细胞摄取，更加证明了它的预期细胞杀死。为了进一步研究，用细胞核特异性染料DAPI(蓝色荧光)对细胞核染色，并分析图像。从拍照细胞的三维动画可以看出，在用任一种GMC-5-193复合物处理的细胞中，GMC-5-193绿色荧光在细胞中均匀分布，而在用游离GMC-5-193处理的细胞中，在细胞核中观察到比在细胞质中更多的绿色荧光。
携带GMC-5-193的配体/脂质体复合物的体内肿瘤靶向
为了制备具有肿瘤的动物，将悬浮于PBS中的MDA435/LCC6人黑素瘤细胞(8×106)静脉内地注射进无胸腺裸小鼠的尾静脉。
使用TfRscFv/LipA/GMC-5-193：
以每只小鼠9mg GMC-5-193/kg，给携带MDA435/LCC6异种移植肿瘤(主要在肺中)的小鼠静脉内地注射游离GMC-5-193、非靶向的LipA/GMC-5-193(L-GMC)或TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)。复合物中GMC-5-193:LipA的摩尔比是1:2.5(相当于2.8:7)。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。注射后3小时，切离肝和肺，并在荧光显微镜下检查。转移灶的大小是从极微小的至小的可见转移灶。图20A显示了在明视野中和用荧光拍摄的相同视野。可以清楚地看出，TfRscFv/LipA-GMC-5-193复合物能将GMC-5-193特异性地递送给肺中的肿瘤细胞。在用游离GMC-5-193处理的小鼠的明视野图像中，在肺周围观察到大肿瘤，并转移向肝。但是，荧光图像显示了在所有组织中的非常弱的荧光。未靶向的复合物(LipA/GMC-5-193(L-GMC))表现出在肺和肝中的非常弱的信号，且没有肿瘤特异性。相反，在注射TfRscFv/LipA/GMC-5-193复合物(scL-GMC)的小鼠中，肺转移灶中的GMC-5-193的荧光信号要强得多(与正常肺组织的更亮的多泡外观相比，在明视野图像中更密集的外观可以区分)。另外，在用络合的GMC-5-193处理的小鼠的正常肝中，观察到非常低的背景信号，再次证明了肿瘤特异性。这些结果表明，当将GMC-5-193掺入TfRscFv/LipA复合物中时，会增强全身施用后肿瘤特异性的GMC-5-193摄取。
使用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193
以每只小鼠9mg GMC-5-193/kg，给携带MDA-MB-435/LCC6异种移植肿瘤(主要在肺中)的小鼠静脉内地注射游离GMC-5-193(图20B(图B))或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(图20B(图A))。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:2.5(相当于2.8:7)。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。注射后3小时，切离肝和肺，并在荧光显微镜下检查。转移灶的大小是从极微小的至小的可见转移灶。在明视野中和用荧光拍摄相同视野。可以清楚地看出，配体-脂质体复合物能将GMC-5-193特异性地递送给肺中的肿瘤细胞(图20B(左图))。在用游离GMC-5-193处理的小鼠的明视野图像(图20B(右图))中，在肺周围观察到大肿瘤，并转移向肝。但是，在所有组织中具有非常弱的荧光，肝的转移灶中没有荧光。这些结果表明，当将GMC-5-193掺入TfRscFv/LipA-HoKC复合物中时，会增强全身施用后肿瘤特异性的GMC-5-193摄取。
在图20C中显示了证明用TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物递送的荧光GMC-5-193的肿瘤特异性掺入的其它结果。复合物中GMC-5-193:LipA-HoKC的摩尔比是1:2.5(相当于2.8:7)。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。在这里，接受TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193的静脉内施用的小鼠与接受静脉内游离GMC-5-193的小鼠之间的信号差异也是显著的。在接受游离GMC-5-193的小鼠中存在在肝中和在脊柱附近的大肿瘤。但是，在这些肿瘤中观察到非常微弱的荧光。相反，在来自接受络合的GMC-5-193的小鼠的肺转移灶和分离的肿瘤中的荧光信号要强得多。这些上述实验清楚地证明了当与本发明的配体/脂质体(含有和不含HoKC肽)复合物络合时，全身施用的GMC-5-193的有效肿瘤靶向和递送。
体内功效研究
给携带B16/F10肿瘤的C57BL/6小鼠注射CDDP、或者单独的或与CDDP组合的TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(TfRs cFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)。复合物中GMC-5-193:LipA或LipA-HoKC的摩尔比是1:1。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。图21A-21C显示了处理3周后每只小鼠的肺的照片。在没有接受处理(UT)的小鼠的肺中观察到B16/F10的多个转移灶。在图21A中，以3mg GMC-5-193/kg/注射，每周2或3次，给小鼠静脉内注射GMC-5-193以7次。这些结果表明，络合的GMC-5-193(含有和不含HoKC肽)优于游离GMC-5-193单试剂处理。在图21B和21C中，也以3mg GMC-5-193/kg/注射，每周2或3次，给小鼠静脉内注射GMC-5-193以7次。在接受CDDP的组中，每周2次施用CDDP，共6次注射。CDDP的起始剂量是2.5mg/kg，而所有随后剂量是2.0mg/kg。用TfRscFv/脂质体/GMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193)复合物+CDDP的组合处理的小鼠表现出肺转移灶数目的显著降低(图21B)。在图21C中，用TfRscFv/LipA/GMC-5-193(scL-GMC)或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193(scL-HK-GMC)复合物+顺铂的组合处理的小鼠也表现出与单试剂处理(复合物或CDDP)相比，肺转移灶数目的显著降低。
图21B的结果与切割的胱天蛋白酶-3作为细胞凋亡标志物的蛋白印迹分析结果相关联(图22)。在未处理的小鼠或用单独的TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(含有或不含HoKC)处理的小鼠的血清中，没有检测到切割的胱天蛋白酶-3，表明没有细胞凋亡，因而小分子治疗剂没有显著作用。在接受单独CDDP的小鼠的血清中，仅检测到切割的胱天蛋白酶-3的弱条带。最重要的是，用络合的GMC-5-193(TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)+CDDP的组合处理的小鼠表现出高水平的切割的胱天蛋白酶-3，表明所述联合治疗对程序性细胞死亡的增强。
讨论
与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，DU145细胞、B16/F10细胞和MDA435/LCC6细胞(更低程度地)表现出对TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193复合物的增强的敏感度(图14)。络合GMC-5-193也导致多个肿瘤细胞系(人和小鼠)对多种化疗剂的增加的敏化。共聚焦图像揭示，与作为游离GMC-5-193相比，当作为络合的GMC-5-193时，GMC-5-193能更有效地被MDA-MB-435细胞摄取(图19A和19B)。与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，在用GMC-5-193复合物处理的细胞中观察到强得多的绿色荧光。令人感兴趣地，在用GMC-5-193复合物处理的细胞中观察到均匀遍及GMC-5-193绿色荧光，而在用游离GMC-5-193处理的细胞中，在细胞核中比在细胞质中观察到更多的绿色荧光。GMC-5-193掺入络合的脂质体复合物中增强了细胞摄取并改变了细胞中GMC-193的定位模式。
GMC-5-193通过结合细胞质中的微管蛋白，显示出抗癌作用；因而所述小分子在细胞质中的存在对促进抗癌作用更好。另外，药物向细胞质中释放后发生向胞外隔室的释放，这可以造成旁观者效应。鉴于该原因，检查了用络合的GMC-5-193处理的细胞中增强的抗癌活性。
人黑素瘤细胞MDA-MB435对多柔比星体外化学敏化的结果，与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，在用络合的GMC-5-193处理的细胞中观察到敏化的显著增加(图15A-15B)。这些敏化结果与在相同条件下的正常人肺成纤维细胞IMR-90的结果显著不同，在后者中，游离的或络合的GMC-5-13实际上没有作用(图16A-16B)。与用游离GMC-5-193处理的细胞相比，当用络合的GMC-5-193处理细胞时，观察到癌细胞的IC50值之间增加的差异倍数。这些发现表明，TfRscFv靶向癌细胞并将复合物有效地递送给癌细胞，以增加细胞毒性，但是对于正常细胞则不然，这证明了与络合的GMC-5-193的联合治疗可以增加治疗指数。观察到类似的DU145人前列腺癌细胞对泰索帝的化学敏化(图17A-17B)。当用所述复合物处理细胞时，B16/F10转移性小鼠黑素瘤细胞对CDDP的敏化倍数也升高2.6倍(图18)。
所有体外实验的结果都支持了下述结论，即与靶向脂质体络合的GMC-5-193会比作为游离GMC-5-193递送时，更有效地使癌细胞对常规化疗剂敏化。
该研究的一个目的是，在全身施用后肿瘤靶向递送GMC-5-193。当将TfRscFv/LipA/GMC-5-193或TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193静脉内地施用给携带MDA-MB-435/LCC6异种移植肿瘤(主要在肺中)的无胸腺裸小鼠时，可以清楚地看出，配体-脂质体复合物将GMC-5-193特异性地递送给在肺中的肿瘤细胞(图20A-20C)。这些小鼠的肺转移灶中GMC-5-193的绿色荧光信号比用游离GMC-5-193处理的小鼠强得多的。当将小分子掺入通过简单混合组分制备的本发明的配位脂质体复合物中时，会增强全身施用后GMC-5-193的肿瘤特异性摄取。从这些结果可以看出，将小分子包含在本发明的TfRScFv/LipA或TfRScFV/LipA-HoKC复合物中增强了小分子向肿瘤细胞中的特异性摄取，无论它们是原发肿瘤还是转移灶。
该肿瘤靶向能力反映在体内功效研究中。如上所述，当用络合的GMC-5-193处理时，B16/F10细胞表现出增强的敏感度。因此，选择携带B16/F10肿瘤的C57BL/6小鼠作为功效研究的动物模型。如上所述，与用单独的CDDP或TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物处理的小鼠相比，用TfRscFv/脂质体/GMC-5-193复合物(含有或不含HoKC肽)+CDDP的组合处理的小鼠表现出它们肺中转移灶的显著降低，和升高水平的切割的胱天蛋白酶-3。
参与细胞凋亡的胱天蛋白酶可以分成2组：起始子胱天蛋白酶，它们包括胱天蛋白酶-2、-8、-9和-10，以及效应子胱天蛋白酶，它们包括胱天蛋白酶-3、-6和-7。起始子胱天蛋白酶对效应子胱天蛋白酶的激活负责细胞底物的蛋白水解性切割，所述细胞底物包括肌动蛋白、核纤层蛋白、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和脱氧核糖核酸酶的抑制剂(例如DFF45或lCAD)。在细胞凋亡过程中，这些底物的切割会将染色体降解成核小体片段。已经认为胱天蛋白酶-3与细胞凋亡最直接相关，因为它位于蛋白酶级联通路中。胱天蛋白酶-3合成为32-kD前体，并被切割，产生由17-kD亚基(经过中间的20-kD)和12-kD亚基组成的成熟形式(34-36)。认为升高水平的17-kD切割的胱天蛋白酶-3是程序性细胞死亡的标志物。
因而，实现了抗癌小分子GMC-5-193的特异性的且有效的靶向药物递送。这些结果表明，TfRscFv将阳离子脂质体-GMC-5-193复合物(含有或不含HoKC)体外和体内地靶向肿瘤细胞，并体外和体内地增强常规化疗剂的抗肿瘤作用。更具体地，证明了常规化疗剂的有效剂量的降低，伴随它们毒性作用的降低。
实施例11
通过简单混合制备包含小分子(YK-3-250)的免疫脂质体及其表征
为了提高小分子YK-3-250(一种微管破裂化合物)的体外和体内抗癌作用，制备了包含该小分子的肿瘤靶向脂质体复合物。除了TfRscFv/LipA复合物以外，也如本文所述制备和研究了与内体破裂肽(LipA-HoKC)缀合的阳离子脂质体。内体破裂肽HoKC可以辅助YK-3-250在细胞胞质中的释放，以影响胞质中的微管蛋白聚合。配体-脂质体复合物优先靶向肿瘤细胞，这是由于它们表面上的高水平的对应受体。在原发肿瘤和转移灶中观察到配体-脂质体递送的基因的高水平表达，但是在正常组织例如肝、肺、骨髓和肠隐窝中则没有。在该实施例中，将包含转铁蛋白受体单链(TfRscFv)的本发明的脂质体复合物用于体外向癌细胞递送YK-3-250，以评价包含YK-3-250的脂质复合物的体外生物功效。
材料和方法
1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和N-马来酰亚胺基-苯基丁酸酯DOPE(MPB-DOPE)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQID NO：2)肽的生产商是Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)。
细胞系和培养
在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的改良MEM(IMEM)中培养人黑素瘤细胞系MDA-MB-435。EMEM购自MediaTech(Herndon，VA)，其它细胞培养基和成分从Biofluids(Rockville，MD)得到。
TfRscFv/LipA/YK-3-250复合物的制备
使用如本文所述的乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂LipA(DOTAP:DOPE或DDAB:DOPE为1:1至1:2摩尔比)。浓度是2mM。如下制备TfRscFv/LipA/YK-3-250复合物：在旋转或搅拌下，温育(合适地在室温)LipA和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA的比，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入在适当浓度的YK-3-250，通过反转或搅拌进行混合，并温育10分钟，优选在室温。YK-3-250:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7、更合适地2:7至8:7、最合适地7:7。用
Figure A200780024924D00661
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
TfRscFv/LipA-HoKC/YK-3-250复合物的制备
使用乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂和LipA-MPB(DOTAP:DOPE:MPB-DOPE或DDAB:DOPE:MPB-DOPE为1:1:0.1至1:2:0.1摩尔比)。然后如本文前面所述，使用携带马来酰亚胺基团的阳离子脂质体和携带末端半胱氨酸基团的肽之间的偶联反应，制备LipA-HoKC脂质体。将0.1mmol含有在半胱氨酸上游离巯基的肽的等分试样加入在10mMHEPES(pH7.4)溶液中的2mmol LipA-MPB，在室温旋转2小时。得到的LipA-HoKC具有1.4mM的脂质浓度。如下制备TfRscFv/LipA-HoKC/YK-3-250复合物：在旋转或搅拌下，温育(合适地在室温)LipA-HoKC和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA-HoKC的比，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的YK-3-250，通过反转或搅拌进行混合，并在室温温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。YK-3-250:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7、更合适地2:7至8:7、最合适地7:7。用ZETASIZER
Figure A200780024924D0047113325QIETU
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
体外细胞生存力和TfRscFv/脂质体/YK-3-250复合物的优化
对于体外细胞毒性研究，将在100μL每种细胞系的适当生长培养基中的5-5.5×103个细胞/孔涂布进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL在不含血清的培养基中的递增浓度的TfRscFv/LipA/YK-3-250、仅Lip A或游离YK-3-250，温育4-6小时，优选5小时，然后添加FBS。然后在37℃、在含有5％CO2的湿润空气下，将所述细胞温育另外24-72小时，优选48小时。此后，用不含酚红的IMEM洗涤孔，并根据生产商的手册(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，进行细胞生存力的基于XTT的测定。在有电子偶合剂XTT存在下，3’-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠被活细胞线粒体中的脱氢酶转化成橙色甲臢。使用微平板读取仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)，在450nm处测量与活细胞数目相关联的甲臢吸光度。从药物浓度与活细胞分数的对数关系图，内插得到产生50％生长抑制的IC50。
结果
TfRscFv/LipA/YK-3-250复合物的摩尔比的体外优化
制备TfRscFv/LipA/YK-3-250复合物，并优化TfRscFv/LipA/YK-3-250复合物的小分子:脂质体的摩尔比。对比了在不同YK-3-250:LipA比的络合和游离YK-3-250对MDA-MB-435癌细胞的细胞杀死作用。TfRscFv:LipA比是1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量)。将5.5 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后用TfRscFv/LipA/YK-3-250复合物、仅LipA或游离YK-3-250处理。处理后48小时，进行XTT测定，以评价细胞毒性，并从浓度-细胞生存力曲线计算IC50值(产生50％生长抑制的药物浓度)。图23A显示了每种处理的MDA-MB-435的IC50值。在6:7～8:7的YK-3-250:脂质体摩尔比范围，与用游离YK-3-250或游离LipA处理的细胞相比，在用络合的YK-3-250处理的细胞中观察到IC50值的降低，IC50值从>300nM降低至16nM，在7:7的YK-3-250:脂质体摩尔比低至8nM。
图23B显示了使用7:7(也相当于1:1)的YK-3-205:脂质体复合物(LipA)摩尔比，游离YK-3-250和TfRscFv/LipA/YK-3-250(scL-YK-3-250)复合物对MDA-MB-435细胞的作用的对比。与游离小分子相比，络合的YK-3-250的细胞杀死水平的对比指示了本发明的复合物的效力的约2倍增加。
实施例12
通过简单混合制备包含小分子(甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00681
))的免疫脂质体及其表征
Figure A200780024924D00682
(甲磺酸伊马替尼；Novartis Pharmaecuticals Corp.，East Hanover，NJ)，以前称作STI-571，是一种抗增殖剂(信号转导抑制剂)，它干扰发出肿瘤细胞生长和增殖信号的通路。甲磺酸伊马替尼选择性地抑制一组受体酪氨酸激酶，包括Bcr-Abl、c-KIT和PDGF受体α和β，导致细胞生长的中断和最终的细胞死亡。
已经证明，甲磺酸伊马替尼有效地抑制Bcr-Abl的活性，所述Bcr-Abl是在该疾病中功能异常的酪氨酸激酶蛋白，并发出使细胞连续生长和分裂的信号，甲磺酸伊马替尼已经被批准用于治疗具有KIT(CD117)阳性的不能切除的和/或转移的恶性胃肠间质肿瘤(GIST)的患者，所述GIST是归因于c-KIT酪氨酸激酶活性的相对罕见的癌症形式。
因为蛋白激酶在细胞信号转导级联中起关键作用，并从而直接参与许多疾病(包括癌症)，所以激酶抑制剂已经成为开发新类型抗癌治疗剂的焦点。目前，超过30种其它激酶抑制剂处于临床试验中。甲磺酸伊马替尼也可以用于治疗许多其它癌症，尤其是表现出被证明被甲磺酸伊马替尼靶向的酪氨酸激酶(包括PDGF受体α和β)的异常活性的那些。初步的结果是鼓舞人心的，但是，这些药物在没有毒副作用时是无效的。对于甲磺酸伊马替尼而言，它们包括造血抑制、肝毒性和肾毒性以及液体潴留(眼或腿周围肿胀)、腹泻、恶心、呕吐、疲劳、肌肉痛性痉挛、肌肉或骨疼痛、腹痛和疹。减少这些副作用会导致患者生活质量的显著提高。尽管这些毒性的减轻是重要的，但是在治疗有益方面增加肿瘤细胞中治疗剂的浓度甚至是更重要的。上述实验证明了甲磺酸伊马替尼在本发明的免疫脂质体中的包囊和在人乳腺、前列腺和胰腺癌模型中的作用。
材料和方法
1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和N-马来酰亚胺基-苯基丁酸酯DOPE(MPB-DOPE)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。
细胞系和培养
从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)得到人前列腺癌细胞系DU145(HTB-81)和小鼠黑素瘤细胞系B16/F10(CRL-6475)。在含有Earls盐的Eagle最低基础培养基(EMEM)中培养DU145，所述EMEM中添加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养B16/F10(ATCC，CRL-6475)，所述DMEM中添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的改良MEM(IMEM)中培养人黑素瘤细胞系MD A-MR-435和人胰腺癌细胞系PANC-1。在添加了1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸+10％热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的EMEM中培养正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞系H500。EMEM购自MediaTech(Herndon，VA)，其它细胞培养基和成分从Biofluids(Rockville，MD)得到。
TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC
Figure A200780024924D0047113325QIETU
复合物的制备
使用本文所述的乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂LipA(DOTAP:DOPE或DDAB:DOPE为1:1至1:2摩尔比)。如下制备TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物。在旋转或搅拌下，在室温温育LipA和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA的比，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的甲磺酸伊马替尼，通过在室温反转或搅拌进行混合，并温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。甲磺酸伊马替尼:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7、更合适地2:7至8:7、最合适地7:7。用ZETASIZER
Figure A200780024924D0047113325QIETU
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
用TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物的体外细胞生存力
对于体外细胞毒性研究，将在100μL每种细胞系的适当生长培养基中的2.5-5.5×103个个细胞/孔涂布进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL在不含血清的培养基中的递增浓度的TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物或游离甲磺酸伊马替尼，温育4-6小时，合适地5小时，然后添加FBS。然后在37℃、在含有5％CO2的湿润空气下，将所述细胞温育另外24-72小时，合适地48小时。此后，用不含酚红的IMEM洗涤孔，并根据生产商的手册(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，进行细胞生存力的基于XTT的测定。在有电子偶合剂XTT存在下，3’-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠被活细胞线粒体中的脱氢酶转化成橙色甲臢。使用微平板读取仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)，在450nm处测量与活细胞数目相关联的甲臢吸光度。从药物浓度与活细胞分数的对数关系图，内插得到产生50％生长抑制的IC50。
体外化学敏化
对于化学敏化研究，将100μL的2.5～5.5×103个细胞/孔接种进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL以15-30μM甲磺酸伊马替尼的TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物或游离甲磺酸伊马替尼，温育4-6小时，合适地5小时，然后向每个孔中加入FBS。将所述细胞温育另外24-72小时，合适地19小时，随后加入含有或不含递增浓度的化疗剂的适当补充培养基中，并继续温育约24-72小时，合适地48小时。使用的化疗药物是多柔比星(Bedford Labs，Bedford，OH)、多西他赛(泰索帝；Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)、米托蒽醌(
Figure A200780024924D00711
Immunex Corp.，Seattle WA)、顺铂(CDDP；Bedford Labs，Bedford，OH)、吉西他滨(
Figure A200780024924D00712
Eli Lillyand Co.，Indianapolis IN)和达卡巴嗪(DTIC)(Mayne Pharmaceuticals，Paramus NJ)。进行XTT测定来评价对化疗剂的敏化程度，并计算每种细胞的IC50值。敏化倍数等于：未转染的IC50/每种复合物的IC50。
体内功效研究
将悬浮于PBS中的小鼠黑素瘤细胞B16/F10(1×105)静脉内地注射进C57BL/6小鼠的尾静脉。4天后，给携带B16/F10肿瘤的小鼠静脉内地注射剂量为0.5mg/kg甲磺酸伊马替尼的游离甲磺酸伊马替尼、单独的CDDP或与CDDP组合中的TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼。每周注射3次，共9次注射。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比是1:30(重量:重量)。某些组也仅接受仅CDDP。每周注射2mg/kg的CDDP2次，共6次注射。处理3周后，处死小鼠，切离肺。在10％甲醛中固定所述器官，在照像之前将其保藏在70％乙醇中。
结果
包囊的和游离的甲磺酸伊马替尼的对比
在人前列腺癌细胞系(DU145)(图24A)和人黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)(图24B)和小鼠黑素瘤细胞系(B16/F10)(图24C)中，通过XTT测定(如本文所述)评估与游离甲磺酸伊马替尼()对比，TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼(
Figure A200780024924D00722
)对细胞存活率的功效。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。将甲磺酸伊马替尼溶于DMSO或水。如图24A所示，用脂质体复合物递送的甲磺酸伊马替尼处理DU145细胞，导致与溶于DMSO或水中的游离甲磺酸伊马替尼相比，大于5倍的细胞杀死增加。
类似地，在人黑素瘤细胞中(图24B)，经所述脂质体复合物递送的甲磺酸伊马替尼具有比以“游离”形式递送时明显更大的细胞杀死作用。TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼比游离小分子有3倍提高。无论Gleevec溶于水还是DMSO中，结果是相同的。因而，后续实验使用溶于水中的Gleevec。
当在B16/F10小鼠黑素瘤细胞中对比游离的或TfRScFv/LipA络合的甲磺酸伊马替尼(scL-Gleevec)的作用时，观察到类似的scL-Gleevec超过游离Gleevec的细胞杀死的3倍增加(图24C)。
TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼(scL-Gleevec)的化学敏化
也通过XTT测定评估了“游离的”或经脂质体复合物(scL-)递送的甲磺酸伊马替尼的使肿瘤细胞(人和小鼠)对一线化疗剂敏化的能力。用20μM或30μM游离的或络合的甲磺酸伊马替尼处理人黑素瘤细胞系MDA-MB-435，随后加入递增剂量的泰索帝。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如图25A所示，在20uM甲磺酸伊马替尼浓度，与作为游离甲磺酸伊马替尼施用时相比，当通过脂质体复合物(scL-
Figure A200780024924D00731
)递送甲磺酸伊马替尼时，对所述化疗剂的响应有几乎50倍的增加。在该剂量，游离甲磺酸伊马替尼不会使细胞对泰索帝敏化。此外，观察到化学敏化的剂量依赖性的增加。在30uM甲磺酸伊马替尼，尽管游离甲磺酸伊马替尼表现出约4倍敏化，使用脂质体复合物甲磺酸伊马替尼的响应过于剧烈，以致于不能测定IC50值(图25B)。
类似地，在人前列腺细胞(DU145)中，与游离甲磺酸伊马替尼相比，20μM的经脂质体复合物(scL-
Figure A200780024924D00732
)递送的甲磺酸伊马替尼使所述细胞对米托蒽醌的响应增加了约4倍(图26A)。这里也存在剂量响应，在30μM，使用TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物(scL-)时不能测定IC50值(图26B)。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。
也在人胰腺癌细胞系PANC-1中，评价了甲磺酸伊马替尼的脂质体复合物递送的作用。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如在其它肿瘤细胞中所观察到的，当经本发明的脂质体复合物(scL-
Figure A200780024924D00734
)递送甲磺酸伊马替尼时，对化疗剂
Figure A200780024924D00735
(盐酸吉西他滨)的敏感度水平存在剂量响应和急剧增加(图27A和B)。在20μM，使用脂质体复合物甲磺酸伊马替尼时比使用游离甲磺酸伊马替尼时，观察到PANC-1对吉西他滨的响应的100倍增加(图27A)。如上，在30μM，不能测定IC50值(图27B)。相反，使用游离甲磺酸伊马替尼的IC50值没有随着剂量的增加而显著改变。
小鼠黑素瘤细胞系B16/F10的结果反映了人肿瘤细胞的结果。证明了游离和TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物(scL-)对化学敏化的作用对2种单独的化疗剂顺铂(CDDP)和达卡巴嗪(DTIC)是剂量和时间依赖性的。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。对于CDDP，与游离甲磺酸伊马替尼相比，20uM浓度的TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物(scL-
Figure A200780024924D00737
)的转染导致敏化的2倍增加(图28A)。这里，也在30uM浓度的甲磺酸伊马替尼，对CDDP的敏化水平过强，使得仅～10％的细胞在最低甲磺酸伊马替尼剂量存活(图28B)。
进行类似实验来对比游离的或络合的甲磺酸伊马替尼使B16/F10细胞对另一种化疗剂达卡巴嗪(DTIC)的敏化。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。这里除了使用TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼时敏化的剂量依赖性增强(用游离小分子没有观察到)以外，敏化倍数也随着加入化疗剂之前，转染后的温育时间的增加而增加(图29A至D)。用15uM浓度的甲磺酸伊马替尼温育24小时后，与游离甲磺酸伊马替尼相比，络合的甲磺酸伊马替尼导致响应DTIC的2.1倍增加(图29A)。当所述小分子浓度增加至20uM时，与游离甲磺酸伊马替尼相比，本发明的复合物使敏化加倍至4.2倍增加(图29B)。在更长的温育时间(48小时)，与游离甲磺酸伊马替尼(浓度＝15uM)相比，使用TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼的敏化增加是5.7倍(图29C)，而在48小时、20uM浓度时，响应大到没有得到IC50(图29D)。因而，这里我们在多种肿瘤细胞类型中和用多种化疗剂再次证明，当将小分子甲磺酸伊马替尼包囊在本发明的复合物中时，会增强小分子甲磺酸伊马替尼的递送和功效。
在图30A和B中显示了配体/脂质体/甲磺酸伊马替尼诱导的化学敏化的肿瘤细胞特异性性质。在加入化疗剂米托蒽醌(图30A)或泰索帝(图30B)之前，如上所述用仅LipA、游离甲磺酸伊马替尼和TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼
Figure A200780024924D00741
(在20uM浓度)转染正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞(H500)。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。在2个实验中，都没有观察到对所述化疗剂敏化的显著增加。所有IC50值都在与对照相同的范围内，就米托蒽醌而言>100ng/ml，且就泰索帝而言>100nM。
TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼复合物的体内功效：增强的肿瘤生长抑制
将悬浮于PBS中的1×105个B16/F10小鼠黑素瘤细胞静脉内地注射进C57BL/6小鼠的尾静脉。4天后，给携带B16/F10肺转移灶的小鼠注射仅顺铂(CDDP)、游离甲磺酸伊马替尼或与顺铂相组合的TfRscFv/LipA/甲磺酸伊马替尼
Figure A200780024924D00751
复合物。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。以0.5mg甲磺酸伊马替尼/小鼠/注射，给小鼠每周注射3次游离甲磺酸伊马替尼或scL-GLEEVEC
Figure A200780024924D0047113325QIETU
复合物，共9次注射。以2mg/kg的剂量，每周腹膜内施用CDDP 2次，共6次注射。处理3周后，人道地处死小鼠，切离肺并拍照。
如图31所示，与接受单一试剂治疗的动物相比，接受TfRScFv/Lipa/甲磺酸伊马替尼+CDDP的组合的小鼠的肺中存在肿瘤细胞生长的显著抑制。因而，这支持了本发明的配体/脂质体/小分子复合物作为抗癌剂的应用，尤其当与化疗剂组合使用时。
结论
甲磺酸伊马替尼已经被批准用于治疗具有费城染色体阳性的(Ph+)慢性髓性白血病(CML)的患者和具有KIT(CD117)阳性的不能切除的和/或转移性的恶性胃肠间质肿瘤(GIST)的患者。已经体外证明它会抑制许多酪氨酸激酶，包括Bcr-Abl，c-KIT和PDGF受体α和β。因而，该药物具有用于治疗表达这些激酶的其它癌症的潜力。在这些研究中，我们已经证明，当通过本发明的靶向脂质体递送复合物来递送给细胞时，甲磺酸伊马替尼的诱导肿瘤细胞死亡(在乳腺、前列腺和胰腺癌中)和增加它们对一线化疗剂的应答的功效急剧提高。这些结果也证明了该纳米复合物的极大增加甲磺酸伊马替尼的功效的能力。
实施例13
通过简单混合制备包含小分子(厄洛替尼
Figure A200780024924D00752
)的免疫脂质体及其表征
Figure A200780024924D00753
(厄洛替尼，Genentech Inc，So.San Francisco CA)是一种人表皮生长因子受体1型/表皮生长因子受体(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制剂。该酪氨酸激酶是非小细胞肺癌和胰腺癌中对于细胞生长而言关键的因子之一。
表皮生长因子受体(EGFR)是HER(人表皮生长因子受体)信号转导通路的组分。该通路由至少4种细胞受体组成：EGFR/HER1、HER2、HER3和HER4。已知约11种不同的因子以某些方式结合和激活这些受体。HER信号转导通路在细胞生长、增殖、迁移和介导过程(例如伤口愈合、组织修复和皮肤的维持)的正常调节中起作用。除了它的控制正常细胞生长的作用以外，已经证明HER信号转导通路对癌细胞的生长、增殖、迁移和存活具有显著影响。
EGFR和HER信号转导通路的其它组分以复杂且严格调节的方式相互作用，以调节细胞生长。HER家族成员的量或活性的改变，可以造成或支持不适当的细胞生长，而导致癌细胞的增殖、迁移和存活。因为所述信号转导通路作为在每个步骤中放大生长信号的级联起作用，EGFR的量或活性的微小变化可以通过促进细胞生长和转移(细胞迁移)以及抑制细胞凋亡(程序性细胞死亡)，显著驱动癌症的发展或进展。另外，几项研究已经证明，HER信号转导(正常细胞和组织修复的一种重要调节剂)响应于破坏细胞和组织的多种癌症疗法(包括有些化疗剂和辐射)而被激活。这些研究暗示，包含EGFR的HER通路的激活有助于治疗抗性的癌症的发展。
Figure A200780024924D00761
经设计用于抑制细胞内HER1信号转导通路的酪氨酸激酶活性。
Figure A200780024924D00762
是一种口服片剂。厄洛替尼是化学名称为N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧乙氧基)-4-喹唑啉的一种喹唑啉。
Figure A200780024924D00763
含有厄洛替尼盐酸盐。厄洛替尼抑制与表皮生长因子受体(EGFR)有关的酪氨酸激酶的细胞内磷酸化。尚未充分表征关于其它酪氨酸激酶受体的抑制的特异性。EGFR在正常细胞和癌细胞的细胞表面上表达。在2004年11月，美国食品和药品管理局(FDA)批准(150mg)在至少一个先前化疗方案失败后用于治疗具有局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。在具有局部晚期或转移性NSCLC的一线患者中进行的2个多中心、安慰剂对照的、随机的III期试验的结果表明，与基于铂的化疗同时施用没有临床益处，不推荐将它用于该情况。在这方面，不会预见到通过本发明的方法，即通过简单混合使小分子与肿瘤靶向的络合的脂质体复合物络合，用厄洛替尼
Figure A200780024924D00772
增加多个肿瘤细胞系对不同化疗剂的敏化。接受150mg 
Figure A200780024924D00773
单一疗法的NSCLC患者的最常见的副作用是轻度至中等的疹和腹泻。在9％和6％的
Figure A200780024924D00774
-治疗的患者中分别发生3/4级疹和腹泻，各自导致1％的患者中断单试剂III期试验。在接受
Figure A200780024924D00775
治疗NSCLC、胰腺癌或其它晚期实质瘤的患者中，经常报道严重的间质性肺病(ILD)-样事件，包括死亡。在NSCLC单试剂试验中，ILD-样事件的发生是罕见的(0.8％)，且在治疗组之间均匀分布。
在2005年11月，FDA批准
Figure A200780024924D00776
(100mg)与吉西他滨化疗的组合用于治疗之前没有接受化疗的患者的局部晚期的、不能手术的或转移性的胰腺癌。在胰腺癌的III期研究中，报道的最常见的不利事件是疲劳、疹、恶心、食欲缺乏和腹泻。在69％的接受
Figure A200780024924D00777
吉西他滨的患者中和在30％的接受吉西他滨+安慰剂的患者中报道了疹。在48％的接受
Figure A200780024924D00778
+吉西他滨的患者中和在36％的接受吉西他滨+安慰剂的患者中报道了腹泻。疹和腹泻各自导致在2％患者中的剂量减少，并导致最高达1％的接受+吉西他滨的患者中研究的中断。另外，严重的和潜在的致命不利事件包括接受
Figure A200780024924D007710
吉西他滨的患者的间质性肺病-样并发症、心肌梗死或缺血、脑血管意外和具有血小板减少症的微血管病性溶血性贫血。
材料和方法
1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和N-马来酰亚胺基-苯基丁酸酯DOPE(MPB-DOPE)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。
细胞系和培养
从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)得到人前列腺癌细胞系DU145(HTB-81)。在含有Earls盐的Eagle最低基础培养基(EMEM)中培养DU145，所述EMEM中添加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的改良MEM(IMEM)中培养人黑素瘤细胞系MDA-MB-435和人胰腺癌细胞系PANC-1。在添加了1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸+10％热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的EMEM中培养正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞系H500。EMEM购自MediaTech(Herndon，VA)，其它细胞培养基和成分从Biofluids(Rockville，MD)得到。
TfRscFv/LipA/厄洛替尼
Figure A200780024924D00781
复合物的制备
使用本文所述的乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂LipA(DOTAP:DOPE或DDAB:DOPE为1:1至1:2摩尔比)。如下制备TfRscFv/LipA/厄洛替尼复合物：在旋转或搅拌下，在室温温育LipA和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA的比，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的厄洛替尼，通过在室温反转或搅拌进行混合，并温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。厄洛替尼:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7，更合适地2:7至8:7，最合适地7:7。用ZETASIZER
Figure A200780024924D0078114516QIETU
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
使用TfRscFv/LipA/厄洛替尼复合物测定体外细胞生存力
对于体外细胞毒性研究，将在100μL每种细胞系的适当生长培养基中的2.5-3.5×103个细胞/孔涂布进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL在不含血清的培养基中的递增浓度的TfRscFv/LipA/厄洛替尼复合物或游离厄洛替尼，温育4-6小时，合适地5小时，然后添加FBS。然后在37℃、在含有5％CO2的湿润空气下，将所述细胞温育另外24-72小时，合适地48小时。此后，用不含酚红的IMEM洗涤孔，并根据生产商的手册(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，进行细胞生存力的基于XTT的测定。在有电子偶合剂XTT存在下，3’-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠被活细胞线粒体中的脱氢酶转化成橙色甲臢。使用微平板读取仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)，在450nm处测量与活细胞数目相关联的甲臢吸光度。从药物浓度与活细胞分数的对数关系图，内插得到产生50％生长抑制的IC50。
体外化学敏化
对于化学敏化研究，将100μL的2.5～5.5×103个细胞/孔接种进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL 3-8μM厄洛替尼的TfRscFv/LipA/厄洛替尼复合物或游离厄洛替尼，温育4-6小时，合适地5小时，然后向每个孔中加入FBS。将所述细胞温育另外24-72小时，合适地19小时，随后加入含有或不含递增浓度的化疗剂的适当补充的培养基中，并继续温育约24-72小时，合适地48小时。使用的化疗药物是多西他赛(泰索帝；Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)、米托蒽醌(
Figure A200780024924D00791
Immunex Corp.，Seattle WA)和吉西他滨(
Figure A200780024924D00792
Eli Lilly and Co.，Indianapolis IN)。进行XTT测定来评价对所述化疗剂的敏化程度，并计算每种细胞的IC50值。敏化倍数等于：未转染的IC50/每种复合物的IC50。
结果
包囊的和游离的厄洛替尼
Figure A200780024924D00793
的对比
通过XTT测定(如本文所述)，在人前列腺癌细胞系(DU145)(图32A)、人胰腺癌细胞系(PANC-1)(图32B)和人黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)(图32C)中评估与游离厄洛替尼
Figure A200780024924D00794
相比，TfRscFv/LipA/厄洛替尼
Figure A200780024924D00795
对细胞存活率的功效。每种复合物中厄洛替尼
Figure A200780024924D00796
:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。将厄洛替尼
Figure A200780024924D00797
溶于水中。如在图32A中所证明的，用脂质体复合物递送的厄洛替尼
Figure A200780024924D00798
处理DU145细胞，导致与游离厄洛替尼
Figure A200780024924D00799
相比细胞杀死超过5倍的增加。
类似地，在人胰腺癌细胞中(图32B)，，通过脂质体复合物递送的厄洛替尼
Figure A200780024924D00801
具有比“游离”形式递送时明显更大的细胞杀死作用。TfRscFv/LipA/厄洛替尼比游离小分子有接近10倍提高。
当在人黑素瘤细胞(MDA-MB-435)中对比游离的或TfRScFv/LipA络合的厄洛替尼
Figure A200780024924D00803
(scL-Tarceva)的作用时，观察到scL-
Figure A200780024924D00804
超过游离Tarceva的细胞杀死的>2倍增加(图32C)。
TfRscFv/LipA/厄洛替尼
Figure A200780024924D00805
的化学敏化
也通过XTT测定，评估了“游离的”或通过脂质体复合物
Figure A200780024924D00806
递送的厄洛替尼
Figure A200780024924D00807
的使肿瘤细胞对一线化疗剂敏化的作用。用3.75μM或7.5μM游离的或络合的厄洛替尼(
Figure A200780024924D00808
)处理人前列腺细胞系DU145，随后加入递增剂量的米托蒽醌。每种复合物中厄洛替尼(
Figure A200780024924D00809
):LipA的摩尔比是7:7(相当于1:1)。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如图33A所示，在3.75uM厄洛替尼
Figure A200780024924D008010
浓度，与作为游离厄洛替尼施用时相比，当通过脂质体复合物
Figure A200780024924D008011
递送厄洛替尼时，对化疗剂的响应有几乎13倍的增加。在该剂量，游离厄洛替尼不会使细胞对米托蒽醌敏化。此外，观察到化学敏化的剂量依赖性增加，但是仅在通过本发明的方法递送厄洛替尼
Figure A200780024924D008013
时观察到，作为游离厄洛替尼
Figure A200780024924D008014
时没有观察到。在7.5uM厄洛替尼用
Figure A200780024924D008016
处理后DU145细胞对米托蒽醌的敏化水平比游离厄洛替尼
Figure A200780024924D008017
高超过34倍(图33B)。相反，甚至在该更高的剂量，游离厄洛替尼
Figure A200780024924D008018
对所述化疗剂响应没有作用。
类似地，在人黑素瘤细胞(MDA-MB-435)中，与游离厄洛替尼相比，通过脂质体复合物
Figure A200780024924D008020
递送的在3.75μM的厄洛替尼
Figure A200780024924D008021
使细胞对泰索帝的响应增加了>4倍(图34A)。这里也存在剂量响应，但是仍然仅在使用scL递送的小分子时观察到。在7.5μM，使用TfRscFv/LipA/厄洛替尼复合物
Figure A200780024924D00812
的敏化水平太强，以致于不能测定IC50值(图34B)，但是与游离厄洛替尼相比敏化倍数估计>140倍。相反，游离厄洛替尼仅有微小作用。每种复合物中厄洛替尼
Figure A200780024924D00813
:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。
也在人胰腺癌细胞系PANC-1中评估了厄洛替尼
Figure A200780024924D00814
的脂质体复合物递送的作用。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如在其它肿瘤细胞中所观察到的，当通过本发明的脂质体复合物
Figure A200780024924D00815
递送厄洛替尼
Figure A200780024924D00816
时，对化疗剂
Figure A200780024924D00817
(盐酸吉西他滨)的敏感度水平急剧增加(图35)。在7.5μM，与使用游离厄洛替尼相比，使用脂质体络合的厄洛替尼
Figure A200780024924D00818
使PANC-1对吉西他滨的响应有令人惊讶的545倍增加。考虑到已经在临床试验(其中发现游离
Figure A200780024924D00819
不会增强标准化疗剂的作用)中发现的结果，这样的对标准化疗剂的响应的突出作用在意料之外。
因而，这里又和前面实施例中的其它小分子一样，我们已经在多种肿瘤细胞类型中并用多种化疗剂证明，当将小分子厄洛替尼包囊在本发明的复合物中时，会增强小分子厄洛替尼的递送和功效。
在图36A-C中显示了配体/脂质体/厄洛替尼
Figure A200780024924D008110
诱导的化学敏化的肿瘤细胞特异性性质。在加入化疗剂米托蒽醌(图36A)、泰索帝(图36B)或吉西他滨
Figure A200780024924D008111
(图36C)之前，如上所述用仅LipA、游离厄洛替尼(单独的
Figure A200780024924D008112
)和TfRscFv/LipA/厄洛替尼
Figure A200780024924D008113
(在7.5uM浓度)转染正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞(H500)。每种复合物中厄洛替尼
Figure A200780024924D008114
:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。在所有3个实验中，没有观察到对所述化疗剂敏化的显著增加。所有IC50值都在与对照相同的范围内。
因而，这里又和前面实施例中的其它小分子一样，我们已经在多种肿瘤细胞类型中并用多种化疗剂证明，当将小分子厄洛替尼包囊在本发明的复合物中时，会增强小分子厄洛替尼的递送和功效。
实施例14
通过简单混合制备包含小分子苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D0082114905QIETU
的免疫脂质体及其表征
大多数癌症，包括肾细胞癌(RCC)和胃肠间质肿瘤(GIST)，源自多个信号转导通路中的突变或其它异常，这相对于单个、非常确定的突变和异常。这些变化最终实现了对于癌症生长而言关键的过程，包括：生长信号的自给自足、对生长抑制信号的不敏感、程序性细胞死亡(细胞凋亡)的脱离、无限复制潜力、持续的血管发生以及组织侵入和转移。苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00821
是一种口服多激酶抑制剂，其同时抑制参与RCC和GIST发展的几种受体激酶。苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00822
同时抑制所有已知的PDGF和VEGF受体，它们在肿瘤细胞增殖和血管发生中起作用。
Figure A200780024924D00823
是用于同时抑制PDGF、VEGF和KIT受体的第一种多激酶GIST疗法。在RCC和GIST的临床前研究中，通过抑制周细胞上的PDGF受体和内皮细胞上的VEGF受体，
Figure A200780024924D00824
表现出抗血管发生活性。在临床前研究中，诱导肿瘤退化并抑制血管发生和转移进展。
Figure A200780024924D00826
因此抑制多个信号转导通路，导致双重抗增殖和抗血管发生效应。
Figure A200780024924D00827
被指明用于治疗疾病发展后或对甲磺酸伊马替尼产生抗性的胃肠间质肿瘤(GIST)，和用于治疗晚期肾细胞癌(RCC)。对晚期RCC的批准是基于部分反应速率和反应持续时间。的随机试验没有证明临床益处，例如增加的存活率或RCC中疾病相关症状的改善。
材料和方法
1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和N-马来酰亚胺基-苯基丁酸酯DOPE(MPB-DOPE)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。
细胞系和培养
从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)得到人前列腺癌细胞系DU145(HTB-81)。在含有Earls盐的Eagle最低基础培养基(EMEM)中培养DU145，所述EMEM中添加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的改良MEM(IMEM)中培养人黑素瘤细胞系MDA-MB-435和人胰腺癌细胞系PANC-1。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的EMEM中培养正常人肺成纤维细胞IMR-90细胞，它由I.Panyutin博士(Nuclear Medicine Department，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)赠送。在添加了1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸+10％热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的EMEM中培养正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞系H500。EMEM购自MediaTech(Herndon，VA)，其它细胞培养基和成分从Biofluids(Rockville，MD)得到。
TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00831
复合物的制备
使用本文所述的乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂LipA(DOTAP:DOPE或DDAB:DOPE为1:1至1:2摩尔比)。如下制备TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00832
复合物：在旋转或搅拌下，在室温温育LipA和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA的比，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00833
通过在室温反转或搅拌进行混合，并温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00834
:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7，更合适地3:7至11:7，最合适地7:7。用
Figure A200780024924D00835
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
使用TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼复合物测定体外细胞生存力
对于体外细胞毒性研究，将在100μL每种细胞系的适当生长培养基中的2.5-3.5×103个细胞/孔涂布进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL在不含血清的培养基中的递增浓度的TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00842
复合物或游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00843
温育4-6小时，合适地5小时，然后添加FBS。然后在37℃、在含有5％CO2的湿润空气下，将所述细胞温育另外24-72小时，合适地48小时。此后，用不含酚红的IMEM洗涤孔，并根据生产商的手册(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，进行细胞生存力的基于XTT的测定。在有电子偶合剂XTT存在下，3’-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠被活细胞线粒体中的脱氢酶转化成橙色甲臢。使用微平板读取仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)，在450nm处测量与活细胞数目相关联的甲臢吸光度。从药物浓度与活细胞分数的对数关系图，内插得到产生50％生长抑制的IC50。
体外化学敏化
对于化学敏化研究，将100μL的2.5～3.5×103个细胞/孔接种进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL 2-6μM苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00844
的TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00845
复合物或游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00846
温育4-6小时，合适地5小时，然后向每个孔中加入FBS。将所述细胞温育另外24-72小时，合适地19小时，随后加入含有或不含递增浓度的化疗剂的适当补充的培养基中，并继续温育约24-72小时，合适地48小时。使用的化疗药物是多西他赛(泰索帝；Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)、米托蒽醌(
Figure A200780024924D00847
Immunex Corp.，Seattle WA)和吉西他滨(Eli Lilly and Co.，Indianapolis IN)。进行XTT测定来评价对化疗剂的敏化程度，并计算每种细胞的IC50值。敏化倍数等于：未转染的IC50/每种复合物的IC50。
结果
TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00851
复合物的摩尔比的体外优化
制备TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00852
复合物，并优化TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼复合物的小分子与脂质体的摩尔比。对比了在不同比例的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00854
:LipA的络合和游离苹果酸舒尼替尼对DU1455人前列腺癌细胞的细胞杀死作用。TfRscFv:LipA比是1:30(重量/重量)。将3 x 103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后用TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00856
复合物或游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00857
处理。处理后72小时进行XTT测定，以评价细胞毒性，并从浓度-细胞生存力曲线计算IC50值(产生50％生长抑制的药物浓度)。图37显示了每个比例的IC50值。在3:7～7:7的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00858
:脂质体的摩尔比范围内，与用游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00859
处理的细胞相比，在用络合的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008510
处理的细胞中观察到IC50值的降低。
包囊的和游离的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008511
的对比
在人前列腺癌细胞系(DU145)(图38A)和人胰腺癌细胞系(PANC-1)(图38B)中，通过XTT测定(如本文所述)评估与游离苹果酸舒尼替尼相比，TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008513
对细胞存活率的功效。每种复合物中苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008514
:LipA的摩尔比是7:7(相当于1:1)。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如图38A所证明的，用脂质体复合物递送的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008515
处理DU145细胞，导致与游离苹果酸舒尼替尼相比细胞杀死的显著增加。
类似地，在人胰腺癌细胞中(图38B)，经脂质体复合物递送的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008517
具有比以“游离”形式递送时明显更大的细胞杀死作用。TfRs cFv/LipA/苹果酸舒尼替尼比游离小分子有4倍提高。
TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008519
的化学敏化
也通过XTT测定评估了“游离的”或经脂质体复合物
Figure A200780024924D00861
递送的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00862
的使肿瘤细胞对一线化疗剂敏化的能力。用2.5μM或5μM游离的或络合的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00863
处理人黑素瘤细胞系MDA-MB-435，随后加入递增剂量的泰索帝。每种复合物中甲磺酸伊马替尼:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如图39A所示，在2.5uM苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00864
浓度，与作为游离苹果酸舒尼替尼施用时相比，当通过苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00866
脂质体复合物
Figure A200780024924D00867
递送时，对化疗剂的响应有超过8倍增加。此外，当通过本发明的方法递送苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00868
时，观察到化学敏化的剂量依赖性增加。在5uM苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00869
敏化水平高到以致于不能得到IC50值，但是据估计，用处理后MDA-MB-435细胞对泰索帝的敏化水平比游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008611
高超过300倍(图39B)。
类似地，在人前列腺细胞(DU145)中，与使前列腺癌细胞对化疗剂的敏化仅有微小作用的游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D0086115251QIETU
相比，5μM的经脂质体复合物递送的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008614
使所述细胞对米托蒽醌的响应增加了>400倍(图40)。每种复合物中苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008615
:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。
也在人胰腺癌细胞系PANC-1中，评价了苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008616
的脂质体复合物递送的作用。每种复合物中苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008617
:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如在其它肿瘤细胞中所观察到的，当通过本发明的脂质体复合物
Figure A200780024924D008618
递送苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008619
时，对化疗剂
Figure A200780024924D008620
(盐酸吉西他滨)的敏感度水平急剧增加(图41)。在2.5μM，使用脂质体络合的苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008621
时比使用游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008622
时观察到PANC-1对吉西他滨的响应的几乎6倍增加。
在图42(A-C)和43(A-C)中显示了配体/脂质体/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00871
诱导的化学敏化的肿瘤细胞特异性性质。在加入化疗剂米托蒽醌(图42A)、泰索帝(图42B)或吉西他滨
Figure A200780024924D00872
(图42C)之前，如上所述用仅LipA、单独的游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00873
和TfRs cFv/LipA/苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00874
(在2.5或5uM浓度)转染正常(非癌性)皮肤成纤维细胞细胞(H500)。每种复合物中苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D00875
:LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段：脂质体的比例是1:30(重量:重量)。在所有3个实验中，没有观察到对所述化疗剂敏化的显著增加。所有IC50值都在与对照相同的范围内。
当如上所述加入化疗剂米托蒽醌(图43A)、泰索帝(图43B)或吉西他滨
Figure A200780024924D00876
(图43C)之前用仅LipA、单独的游离苹果酸舒尼替尼和TfRscFv/LipA/苹果酸舒尼替尼(
Figure A200780024924D00878
)(scL-
Figure A200780024924D00879
)(在2.5uM浓度)转染正常人肺成纤维细胞(IMR-90)细胞时，观察到类似的结果。每种复合物中苹果酸舒尼替尼():LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。在所有3个实验中，没有观察到对所述化疗剂敏化的显著增加。所有IC50值都在与对照相同的范围内。
因而，这里又和前面实施例中的其它小分子一样，我们已经在多种肿瘤细胞类型中并用多种化疗剂证明，当将小分子苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008711
包囊在本发明的复合物中时，会增强小分子苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008712
的递送和功效。由于在该实施例中证明的与游离苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008713
相比，当苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008714
如本发明所述络合时，对苹果酸舒尼替尼
Figure A200780024924D008715
明显更敏化的3种肿瘤类型不是其中已经发现该小分子的应用是有用的肿瘤类型，所以这些肿瘤细胞对本发明如此好的响应是意料之外的发现。
实施例15
通过简单混合制备包含小分子(吉非替尼
Figure A200780024924D008716
)的免疫脂质体及其表征
吉非替尼
Figure A200780024924D00881
是称作表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制剂的新抗癌药物类别中第一种获得上市批准的药物，目前在世界上36个国家被许可用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。许多细胞(包括癌细胞)在它们的表面上具有表皮生长因子(EGF)的受体，所述EGF是由身体正常生成并促进细胞的生长和增殖的蛋白。当EGF结合表皮生长因子受体(EGFRs)时，它会造成称作酪氨酸激酶的酶变得在细胞内有活性。酪氨酸激酶触发以下化学过程，其造成细胞(包括癌细胞)生长、增殖和扩散。吉非替尼结合EGFRs，并从而阻断EGF的结合和酪氨酸激酶的激活。该终止癌细胞的生长和增殖的机理非常不同于化疗和激素疗法的机理。吉非替尼在2003年5月得到FDA的批准。吉非替尼单独地(单一疗法)用于治疗具有某些类型的肺癌、即非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。
批准是基于2个II期试验，IDEAL 1和2，它们证明IRESSA对于许多具有之前治疗过的晚期NSCLC的患者而言是一种有效的治疗。在IDEAL试验中，约50％患者实现肿瘤收缩或他们的肿瘤的稳定，且发现该药物能被普遍良好地耐受，报道的最常见的不良药物反应是轻度至中等的皮疹和腹泻。但是，在接受IRESSA的患者中已经观察到间质性肺病(ILD)，它在发作时可能是急性的，且有些病例已经是致命的。已经观察到具有并发的自发性肺纤维化/间质性肺炎/尘肺病/辐射肺炎/药物引发的肺炎的患者具有源于该病的增加的死亡率。
在2004年12月，AstraZeneca宣布了III期ISEL(在肺癌中的
Figure A200780024924D00882
存活率评价)研究的结果，该研究在已经失败了1个或2个之前化疗方案的晚期NSCLC患者中对比了和安慰剂。ISEL表明，在所有群体中或在腺癌患者中，与安慰剂相比，使用
Figure A200780024924D00884
时存活率有所提高，但是没有达到统计显著性。预先规划的亚群分析表明，在亚洲来源患者中和在从不抽烟的患者中，与安慰剂相比，使用
Figure A200780024924D00885
时存活率有统计学显著提高。另外，来自ISEL的生物标记物数据的探索性分析已经暗示，高EGFR基因拷贝数是在预治疗的晚期NSCLC中使用
Figure A200780024924D00891
的益处的一种强预测指标。
在宣布ISEL数据后，AstraZeneca自愿撤回了欧洲
Figure A200780024924D00892
提案，且美国和加拿大的管理当局将
Figure A200780024924D00893
的用途限定为已经从该药物获益的那些患者。在亚太地区，由于在肺癌中的分子差异，
Figure A200780024924D00894
已经成为预治疗的晚期NSCLC的确定疗法，且该药物在一线晚期场合中的应用现在在大III期全亚洲试验研究(称作IP ASS研究)中。
从ISEL结果和广泛的临床经验中，清楚
Figure A200780024924D00895
是有些晚期NSCLC患者的有效治疗。AstraZeneca现在集中在鉴别最可能从该药获益的那些NSCLC患者。
由于
Figure A200780024924D00896
靶向似乎在许多实体瘤的生长中起作用的信号转导通路，因此它可能在广范范围的癌症中具有治疗潜力。正在进行的该潜力的研究包括在头颈癌和乳腺癌中的临床试验。
材料和方法
1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和N-马来酰亚胺基-苯基丁酸酯DOPE(MPB-DOPE)购自AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。
细胞系和培养
从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)得到人前列腺癌细胞系DU145(HTB-81)。在含有Earls盐的Eagle最低基础培养基(EMEM)中培养DU145，所述EMEM中添加了10％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素。在添加了10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和各50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素的改良MEM(IMEM)中培养人黑素瘤细胞系MDA-MB-435和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞系。EMEM购自MediaTech(Herndon，VA)，其它细胞培养基和成分从Biofluids(Rockville，MD)得到。
TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00897
复合物的制备
使用本文所述的乙醇注射方法，制备阳离子脂质体制剂LipA(DOTAP:DOPE或DDAB:DOPE为1:1至1:2摩尔比)。如下制备TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00901
复合物。在旋转或搅拌下，在室温温育LipA和TfRscFv的混合物(TfRscFv:LipA的比，1:1至1:40(重量/重量)，更合适地1:10至1:30(重量/重量))10分钟后，加入适当浓度的吉非替尼
Figure A200780024924D00902
，通过在室温反转或搅拌进行混合，并温育10分钟。对于动物注射，将葡萄糖或蔗糖加入每种样品中，至1％-20％、更合适地5-10％的终浓度。吉非替尼:脂质体的摩尔比是0.2:7至14:7，更合适地3.5:7至7:7，最合适地7:7。用
Figure A200780024924D00904
 3000HS系统(Malvern，英国)，在25℃通过动态光散射测定复合物的大小。
使用TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00905
复合物测定体外细胞生存力
对于体外细胞毒性研究，将在100μL每种细胞系的适当生长培养基中的2.5-3.5×103个细胞/孔涂布进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL在不含血清的培养基中的递增浓度的TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00906
复合物或游离吉非替尼
Figure A200780024924D00907
，温育4-6小时，合适地5小时，然后添加FBS。然后在37℃、在含有5％CO2的湿润空气下，将所述细胞温育另外24-72小时，合适地72小时。此后，用不含酚红的IMEM洗涤孔，并根据生产商的手册(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，进行细胞生存力的基于XTT的测定。在有电子偶合剂XTT存在下，3’-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠被活细胞线粒体中的脱氢酶转化成橙色甲臢。使用微平板读取仪(Molecular Devices，Menlo Park，CA)，在450nm处测量与活细胞数目相关联的甲臢吸光度。从药物浓度与活细胞分数的对数关系图，内插得到产生50％生长抑制的IC50。
体外化学敏化
对于化学敏化研究，将100μL的2.5～3.5×103个细胞/孔接种进96孔平板。24小时后，用不含血清的培养基洗涤所述细胞，覆盖以100μL8-15μM吉非替尼
Figure A200780024924D00908
的TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00909
复合物或游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00911
)，温育4-6小时，合适地5小时，然后向每个孔中加入FBS。将所述细胞温育另外24-72小时，合适地19小时，随后加入含有或不含递增浓度的化疗剂的适当补充的培养基中，并继续温育约24-72小时，合适地48小时。使用的化疗药物是多西他赛(泰索帝；Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)和米托蒽醌(
Figure A200780024924D00912
Immunex Corp.，Seattle WA)。进行XTT测定来评价对化疗剂的敏化程度，并计算每种细胞的IC50值。敏化倍数等于：未转染的IC50/每种复合物的IC50。
结果
TfRscFv/L ipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00913
复合物的摩尔比的体外优化
制备TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00914
复合物，并优化TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00915
复合物的小分子与脂质体的摩尔比。对比了在不同比例的吉非替尼
Figure A200780024924D00916
:LipA的络合的和游离的吉非替尼
Figure A200780024924D00917
对MDA-MB-231人乳腺癌细胞的细胞杀死作用。TfRscFv:LipA比是1:30(重量/重量)。将3x103个细胞/孔接种进96孔平板，24小时后用TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00918
复合物或游离吉非替尼
Figure A200780024924D00919
处理。处理后72小时进行XTT测定，以评价细胞毒性，并从浓度-细胞生存力曲线计算IC50值(产生50％生长抑制的药物浓度)。图44显示了每个比例的IC50值。在3:7～7:7的吉非替尼:脂质体的摩尔比范围内，与用游离吉非替尼
Figure A200780024924D009111
处理的细胞相比，在用络合的吉非替尼
Figure A200780024924D009112
处理的细胞中观察到IC50值的降低。
包囊的和游离的吉非替尼
Figure A200780024924D009113
的对比
在人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)(图45A)、人黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)(图45B)和人前列腺癌细胞系(DU145)(图45C)中，通过XTT测定(如本文所述)评估与游离吉非替尼相比TfRscFv/LipA/吉非替尼对细胞存活率的功效。每种复合物中吉非替尼
Figure A200780024924D009116
:LipA的摩尔比是7:7(相当于1:1)。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如图45A所证明的，用脂质体复合物递送的吉非替尼(
Figure A200780024924D00921
)处理MDA-MB-231细胞，导致与游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00922
)相比细胞杀死的2倍增加。
此外，在MDA-MB-435细胞中，与游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00923
)相比，当吉非替尼(
Figure A200780024924D00924
)作为本发明的复合物(scL-
Figure A200780024924D00925
)的一部分递送时，观察到响应的1.5倍增加(图45B)。
类似地，在人前列腺癌细胞(图45C)中，通过脂质体复合物递送的吉非替尼()具有比以“游离”形式递送时明显更大的细胞杀死作用。TfRscFv/LipA/吉非替尼(
Figure A200780024924D0092132803QIETU
)比游离小分子有1.7倍的提高。
TfRscFv/LipA/吉非替尼
Figure A200780024924D00928
的化学敏化
也通过XTT测定评估了“游离的”或通过脂质体复合物(scL-IRESSA)递送的吉非替尼(
Figure A200780024924D009210
)的使肿瘤细胞对一线化疗剂敏化的能力(图46A-C)。用8-15μM游离的或络合的吉非替尼(
Figure A200780024924D009211
)处理3种不同的人癌细胞系，随后加入递增剂量的化疗剂。每种复合物中吉非替尼():LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段：脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如图46A所示，在12uM吉非替尼(
Figure A200780024924D009213
)浓度，与作为游离吉非替尼(
Figure A200780024924D009214
)施用时相比，当通过吉非替尼(
Figure A200780024924D009215
)脂质体复合物(scL-
Figure A200780024924D009216
)递送时，对化疗剂泰索帝的响应增加了超过2倍。
类似地，在人黑素瘤细胞(MDA-MB-435)中，与根本不会使细胞对化疗剂敏化的游离吉非替尼()相比，15μM的通过脂质体复合物(scL-)递送的吉非替尼(
Figure A200780024924D009219
)使细胞对泰索帝的响应增加了2.2倍(图46B)。每种复合物中吉非替尼(
Figure A200780024924D009220
):LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。
也在人前列腺癌细胞系DU145中，评价了吉非替尼()的脂质体复合物递送的作用。每种复合物中吉非替尼(
Figure A200780024924D009222
):LipA的摩尔比是7:7。每种复合物中单链抗体片段:脂质体的比例是1:30(重量:重量)。如在其它肿瘤细胞中所观察到的，当通过本发明的脂质体复合物(scL-
Figure A200780024924D009223
)递送吉非替尼(
Figure A200780024924D009224
)时，对化疗剂米托蒽醌的敏感度水平存在显著增加(图46C)。在8μM，使用脂质体络合的吉非替尼(
Figure A200780024924D00931
)时比使用游离吉非替尼(
Figure A200780024924D00932
)时观察到DU145对米托蒽醌的响应的几乎5倍增加。
因而，这里又和前面实施例中的其它小分子一样，我们已经在多种肿瘤细胞类型中并用多种化疗剂证明，当将小分子吉非替尼()包囊在本发明的复合物中时，会增强小分子吉非替尼(
Figure A200780024924D00934
)的递送和功效。由于在该实施例中证明的与游离吉非替尼()相比，当吉非替尼(
Figure A200780024924D00936
)如本发明所述络合时，对吉非替尼(
Figure A200780024924D00937
)更敏化的3种肿瘤类型不是其中已经发现该小分子的应用是有效的肿瘤类型，所以这些肿瘤细胞对本发明如此好的响应是意料之外的发现。
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Fujiwara，T.，Grimm，E.A.，Mukhopadhyay，T.，Zhang，W.W.，Owen-Schaub，L.B.and Roth，J.A.，Cancer Res，54，2287-2291(1994).
Fujiwara，T.，Grimm，E.A.，Mukhopadhyay，T.，Cai，D.W.，Owen-Schaub，L.B.and Roth，J.A.，Cancer Res，53，4129-4133(1993).
Xu，L.，Pirollo，K.F.，Rait，A.，Murray，A.L.and Chang，D.H.，TumorTargeting，4，92-104(1999).
Xu，L.，Pirollo，K.F.，Tang，W.，Rait，A.and Chang，E.H.，Human GeneTherapy，10，2941-2952(1999)，
Rait，A.，Pirollo，K.，Rait，V.，Krkygier，J.，Xiang，L.and Chang，E.H.，Cancer Gene Therapy 8，728-739(2001).
Yazdi，P.T.，Wenning，L.A.and Murphy，R.M.，Cancer Res.，55，3763-3771(1995).
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在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都指示着本发明所属领域的技术人员的技术水平，并在本文中引作参考，其程度如同各出版物、专利和专利申请特别地和各自地引作参考一样。
序列表
<110>乔治敦大学
     Synergene Therapeutics，Inc.
     E.H.常
     K.F.皮洛罗
<120>用于治疗剂或诊断剂的全身给药的抗体或抗体片段靶向的
     免疫脂质体的制备及其应用
<130>2474.002PC06
<140>PCT/US2007/011407
<141>2007-05-11
<150>US 60/800,163
<151>2006-05-15
<150>US 60/844,352
<151>2006-09-14
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的HER-2反义寡核苷酸
<400>1
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的HoKC肽化学合成
<400>2
Figure A200780024924D01051

Claims (65)

1.制备抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物的方法，其包括：
(a)制备抗体或抗体片段；
(b)将所述抗体或抗体片段与阳离子脂质体相混合，从而形成阳离子免疫脂质体，其中所述抗体或抗体片段非化学缀合至所述阳离子脂质体；和
(c)将所述阳离子免疫脂质体与小分子相混合，从而形成所述抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物。
2.权利要求1的方法，其中将抗体与所述阳离子脂质体相混合。
3.权利要求1的方法，其中将抗体片段与所述阳离子脂质体相混合。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体片段是单链Fv片段。
5.权利要求4的方法，其中所述抗体片段是抗-转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
6.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗体片段是抗-HER-2抗体或抗体片段。
7.权利要求1的方法，其中在与所述阳离子脂质体混合之前，所述抗体片段包含在羧基末端的半胱氨酸部分。
8.权利要求1的方法，其中所述阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
9.权利要求1的方法，其中以在约1∶20至约1∶40(重量：重量)范围内的比例，将所述抗体或抗体片段与所述阳离子脂质体相混合。
10.权利要求1的方法，其中所述阳离子脂质体包括磷酸二油酰基三甲基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或溴化二甲基双十八烷基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
11.权利要求1的方法，其中以在约0.2:7至约14:7(小分子:免疫脂质体)范围内的摩尔比，将所述阳离子免疫脂质体与所述小分子相混合。
12.权利要求1的方法，其中以约7:7(小分子:免疫脂质体)的摩尔比，将所述阳离子免疫脂质体与所述小分子相混合。
13.权利要求1的方法，其中所述小分子的分子量小于约5000道尔顿。
14.权利要求13的方法，其中所述小分子的分子量小于约1000道尔顿。
15.权利要求14的方法，其中所述小分子的分子量是约300至约700道尔顿。
16.权利要求1的方法，其中所述小分子具有在约2至约9范围内的至少一个pKa。
17.权利要求1的方法，其中所述小分子是抗癌小分子。
18.权利要求1的方法，其中所述小分子选自：GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物。
19.通过权利要求1的方法制备的阳离子免疫脂质体复合物。
20.抗体或抗体片段靶向的阳离子免疫脂质体复合物，其包含阳离子脂质体、抗体或抗体片段和小分子，其中所述抗体或抗体片段非化学缀合至所述阳离子脂质体。
21权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子包囊在所述阳离子脂质体中。
22.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子包含在所述阳离子脂质体的烃链区中。
23.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子与所述阳离子脂质体的内部或外部单层相结合。
24.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述抗体片段是单链Fv片段。
25.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述抗体片段是抗-转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
26.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述抗体或抗体片段是抗-HER-2抗体或抗体片段。
27.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
28.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述抗体或抗体片段和所述阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(重量:重量)范围内的比例存在。
29.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体包括磷酸二油酰基三甲基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或溴化二甲基双十八烷基铵与二油酰基磷脂酰基乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
30.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子和所述阳离子免疫脂质体以在约0.2:7至约14:7(小分子:免疫脂质体)范围内的摩尔比存在。
31.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中小分子和所述阳离子免疫脂质体以约7:7(小分子:免疫脂质体)的摩尔比存在。
32.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子的分子量小于约5000道尔顿。
33.权利要求32的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子的分子量小于约1000道尔顿。
34.权利要求33的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子的分子量是约300至约700道尔顿。
35.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子具有在约2至约9范围内的至少一个pKa。
36.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子是抗癌小分子。
37.权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物，其中所述小分子选自：GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物。
38.治疗遭受疾病状态的患者的方法，其包括给所述患者施用权利要求19或权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物。
39.权利要求38的方法，其中所述施用包括静脉内施用。
40.治疗遭受癌症的患者的方法，其包括给所述患者施用权利要求19或权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物。
41.权利要求40的方法，其中所述施用包括静脉内施用。
42.权利要求40的方法，其中所述施用包括通过选自下述的途径的施用：瘤内的、病灶内的、气雾剂的、经皮的、内窥镜的、局部的、经口的和皮下的施用。
43.权利要求40的方法，其还包括给所述患者施用化疗剂。
44.权利要求43的方法，其中所述小分子选自：GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物，
且其中所述化疗剂选自：多柔比星、顺铂、米托蒽醌、泰索帝和CDDP。
45.权利要求43的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之后递送。
46.权利要求45的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之后至少12小时递送。
47.权利要求43的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之前递送。
48.权利要求47的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之前至少12小时递送。
49.增强化疗剂的功效的方法，其包括给患者施用与所述化疗剂相结合的权利要求19或权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物。
50.权利要求49的方法，其中所述小分子选自：GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物，
且其中所述化疗剂选自：多柔比星、顺铂、米托蒽醌、泰索帝和CDDP。
51.权利要求49的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之后递送。
52.权利要求51的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之后至少12小时递送。
53.权利要求49的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之前递送。
54.权利要求53的方法，其中所述化疗剂在阳离子免疫脂质体复合物之前至少12小时递送。
55.权利要求40的方法，其还包括给患者施用辐射治疗。
56.权利要求55的方法，其中所述小分子选自：GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物，
且其中所述辐射治疗选自：γ辐射、X-射线、紫外线照射、微波和电子发射。
57.权利要求55的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之后递送。
58.权利要求57的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之后至少12小时递送。
59.权利要求55的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之前递送。
60.权利要求59的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之前至少12小时递送。
61.增强辐射治疗的功效的方法，其包括给患者施用与所述辐射治疗相结合的权利要求19或权利要求20的阳离子免疫脂质体复合物。
62.权利要求61的方法，其中所述小分子选自：GMC-5-193、YK-3-250、甲磺酸伊马替尼、盐酸厄洛替尼、苹果酸舒尼替尼、吉非替尼及其类似物和衍生物，
且其中所述辐射治疗选自：γ辐射、X-射线、紫外线照射、微波和电子发射。
63.权利要求61的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之后递送。
64.权利要求63的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之后至少12小时递送。
65.权利要求61的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之前递送。
66.权利要求65的方法，其中所述辐射治疗在阳离子免疫脂质体复合物之前至少12小时递送。
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