CN103655475A - 靶向的脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明是在药物输送的领域，并且确切地讲，是基于阳离子脂质体的药物输送。在实施方案中，本发明提供了制备适用于将脂质体输送至肿瘤(包括脑肿瘤)的配体靶向的(例如，抗体或抗体片段靶向的)脂质体的方法。在实施方案中，所述脂质体输送替莫唑胺越过血脑屏障以用于治疗原发性或转移性脑肿瘤。可以用所述脂质体来治疗的其它癌症包括：神经内分泌肿瘤、黑素瘤、前列腺癌、头颈部癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、乳癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、宫颈癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤以及其它类型的癌症。在另一个实施方案中，所述脂质体输送美法仑以用于治疗多发性骨髓瘤、血液的其它肿瘤、或其它实体肿瘤。在其它的实施方案中，所述脂质体可以输送其它药物(包括阿托品)以用于治疗有机磷中毒。
Description
发明背景
发明领域
本发明是在药物输送的领域，并且确切地讲，是基于阳离子脂质体的药物输送。在实施方案中，本发明提供了制备适用于将脂质体输送至肿瘤(包括脑肿瘤)的配体靶向的(例如，抗体或抗体片段靶向的)脂质体的方法。在实施方案中，脂质体输送替莫唑胺(temozolomide)越过血脑屏障以用于治疗原发性或转移性脑肿瘤。可以用脂质体来治疗的其它癌症包括：神经内分泌肿瘤、黑素瘤、前列腺癌、头颈部癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、乳癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、宫颈癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、多发性骨髓瘤以及其它类型的癌症。在另一个实施方案中，脂质体输送美法仑(melphalan)用于治疗多发性骨髓瘤、血液的其它肿瘤、或其它实体肿瘤。在其它的实施方案中，脂质体可以输送其它药物如阿托品(atropine)、培美曲塞(pemetrexed)或伊立替康(irinotecan)越过血脑屏障。
发明背景
原发性脑肿瘤，并且特别是神经胶质瘤，是最难治疗的癌症之一。除了原发性肿瘤之外，一年会在超过150,000患者中诊断出来自多种原发性源[肺占多数(60%)、乳房(20%)和黑素瘤(10%)]的转移性脑癌(Newton H和Malkin M(2010)Neurologic Complications of SystemicCancer and Antineoplastic Therapy.Informa Healthcare)。因此，迫切需要用于脑癌的改进治疗，NCI已经将脑癌视为其前5项基金优先性中的一项就印证了这一点。尽管最近在药物发现和靶向治疗方面有所进步，但在过去几年里患有脑癌的患者的预后仍缺乏改善，主要是因为治疗剂不能越过血脑屏障(BBB)(Blakeley,J.(2008)：Drug delivery tobrain tumors.Current Neurology&Neuroscience Reports，8：235-241)。
用于多形性成胶质细胞瘤(GBM)的目前的标准治疗是手术切除，接着用替莫唑胺(TMZ)来放射治疗和化疗。TMZ是一种第二代烷基化(甲基化)剂，其可引起细胞毒性DNA损伤，并且也被批准用于治疗间变性星形细胞瘤(AA)，并且在临床试验中用于治疗从其它非-CNS实体肿瘤发生的脑转移。作用机制和药理性质在最近已有综述(Tentori L和Graziani G(2009)Recent Approaches to Improve theAntitum or Efficacy of Temozolomide.Current Medicinal Chemistry16：第245-257页；和Mrugala MM、Adair J以及Kiem HP(2010)Temozolomide：Expanding Its Role in Brain Cancer.Drugs of Today46：第833-846页)。TMZ是耐受相对良好的(Jiang G、Wei ZP、Pei DS、Xin Y、Liu YQ以及Zheng J N(2011)A Novel Approach to OvercomeTemozolomide Resistance in Glioma and Melanoma：Inactivation ofMGMT by Gene Therapy.Biochemical and B iophysical ResearchCommunications406：第311-314页)，但是骨髓抑制、嗜中性白细胞减少症和血小板减少属于它的副作用，并且治疗剂量受到这些副作用的限制。还发现了长期的TMZ给药方案可引起淋巴细胞减少和机会性感染(Tentori L和Graziani G(2009)Recent Approaches to Improvethe Antitumor Efficacy of Temozolomide.Current Medicinal Chemistry16：第245-257页)。由口服施用的TMZ的非肿瘤特异性摄入所引起的广泛的组织分布是这些副作用的主要原因。因此，TMZ的靶向肿瘤的输送可以帮助减少这些不良事件。
TMZ已被证实一部分GBM患者有存活益处，但是与单独的放射比较，这种中位值增加仅是2.5个月(Chamberlain MC(2010)Temozolomide：Therapeutic Limitations in the Treatment of AdultHigh-Grade Gliomas.Expert Review of Neurotherapeutics10：第1537-1544页)。最近的研究也已经指出60%至75%的GBM患者和50%的AA患者不能受益于TMZ(Chamberlain MC(2010)Temozolomide：Therapeutic Limitations in the Treatment of AdultHigh-Grade Gliomas.Expert Review of Neurotherapeutics10：第1537-1544页)。可以将化疗的失败归因于许多因素，包括：循环中的短半衰期、药物通过p-糖蛋白而从肿瘤中流出、肿瘤对药物的抗性、以及无法越过血脑屏障。抵抗TMZ的主要机制是过度表达O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)，这种酶通过去除O6-鸟嘌呤加合物来修复TMZ诱导的DNA损伤(Mrugala MM、Adair J和Kiem HP(2010)Temozolomide：Expanding Its Role in Brain Cancer.Drugs ofToday46：第833-846页)。因此，用以例如经由肿瘤特异性输送p53肿瘤抑制基因来下调MGMT活性的方法将增强TMZ的治疗效果。
因此，急切需要开发用于治疗脑癌和其它癌症的新型治疗。本发明通过提供用于输送替莫唑胺的基于阳离子脂质体的药物输送系统来满足这些需要。
发明简要概述
在实施方案中，提供了制备靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物的方法。此类方法适合地包括：在乙醇中制备包含一种或多种阳离子脂质的脂质溶液，制备替莫唑胺的溶液，将脂质溶液与替莫唑胺的溶液混合，将脂质与替莫唑胺的混合物注入水溶液中，从而形成替莫唑胺阳离子脂质体，并且将替莫唑胺阳离子脂质体与配体混合以形成靶向的替莫唑胺阳离子脂质体，其中配体直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
适合地，配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
适合地，在二甲亚砜(DMSO)中制备替莫唑胺的溶液。适合地，在约1mM至约200mM、或约50mM至约200mM的浓度下制备替莫唑胺的溶液。
在实施方案中，脂质溶液包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。
适合地，脂质:替莫唑胺的摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或约1:1。适合地，脂质体的浓度是约1mM至约2mM、或约2mM至约10mM。
在实施方案中，配体:脂质的重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。在实施方案中，TfRscFv:脂质的重量比是约0.33:1。
适合地，提供了一种制备靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物的方法。在实施方案中，所述方法包括：在乙醇中制备包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)的脂质溶液，制备替莫唑胺的溶液，将脂质溶液与替莫唑胺的溶液混合，将脂质与替莫唑胺的混合物注入水溶液中，从而形成替莫唑胺阳离子脂质体，将替莫唑胺阳离子脂质体与抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)混合以形成靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物，其中TfRscFv直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在另一个实施方案中，提供了一种制备靶向的美法仑阳离子脂质体复合物的方法。在实施方案中，所述方法包括：在乙醇中制备包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)的脂质溶液，制备美法仑的溶液，将脂质溶液与美法仑的溶液混合，将脂质与美法仑的混合物注入水溶液中，从而形成美法仑阳离子脂质体，将美法仑阳离子脂质体与一种配体混合以形成靶向的美法仑阳离子脂质体复合物，所述配体包括例如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其中配体(例如，TfRscFv)直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在另外的实施方案中，提供了治疗患者的癌症的方法，所述方法包括对患者施用靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物。适合地，靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；替莫唑胺；和配体，其与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在另外的实施方案中，提供了治疗患者的癌症的方法，所述方法包括对患者施用靶向的美法仑阳离子脂质体复合物。适合地，靶向的美法仑阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；美法仑；和配体，其与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在实施方案中，施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、舌下的(SL)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
适合地，被治疗的癌症是脑癌，例如神经胶质瘤或星形细胞瘤。
在其它的实施方案中，被治疗的癌症是转移性脑肿瘤、神经内分泌肿瘤、黑素瘤、前列腺癌、头颈部癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、乳癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、宫颈癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、多发性骨髓瘤以及其它类型的癌症。
在另一个实施方案中，脂质体输送美法仑以用于治疗多发性骨髓瘤。
在其它的实施方案中，脂质体可以输送其它药物，如阿托品、培美曲塞或伊立替康和/或其衍生物。
在实施方案中，所述方法进一步包括对患者施用与靶向的替莫唑胺、美法仑、阿托品、培美曲塞或伊立替康阳离子脂质体复合物组合的另一治疗。适合地，所述另一治疗包括施用化疗剂、小分子、放射治疗或基于核酸的治疗。在实施方案中，基于核酸的治疗包括施用包含表达野生型p53的质粒DNA的阳离子脂质体复合物。在实施方案中，所述另一治疗包括在癌细胞中施用下调、改变或另外使MGMT的作用无效的任何分子。在其它的实施方案中，所述另一治疗包括施用干扰乙酰胆碱产生或干扰乙酰胆碱结合至其受体的任何分子。
在实施方案中，提供了治疗患者的脑癌的方法，所述方法包括对患者施用靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物。适合地，靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；替莫唑胺；和抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
还提供了治疗患者的癌症的方法，其适合地包括对患者施用通过本文描述的方法制备的靶向替莫唑胺阳离子脂质体复合物。
在其它的实施方案中，提供了治疗患者的多发性骨髓瘤的方法，所述方法包括对患者施用靶向的阳离子脂质体复合物。适合地，靶向的美法仑阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；美法仑；和抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其与所述阳离子脂质体直接复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在其它的实施方案中，提供了治疗患者的任何癌症的方法，所述方法包括对患者施用靶向的阳离子脂质体复合物。适合地，靶向的美法仑阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；美法仑；和抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其与所述阳离子脂质体直接复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
还提供了治疗患者的癌症的方法，其适合地包括对患者施用通过本文描述的方法制备的靶向的美法仑阳离子脂质体复合物。
还提供了治疗患者的脑癌的方法，所述方法包括对患者施用阳离子脂质体复合物和替莫唑胺，所述阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；质粒DNA，其表达野生型p53；以及抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其与所述阳离子脂质体直接复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
以下参阅附图详细描述了另外的实施方案、特征、和实施方案的优点、以及各种实施方案的结构和操作。
附图简述
图1示出游离的TMZ和如本文所述的包含TMZ的三种阳离子脂质体的U251细胞存活率相对TMZ浓度的关系。
图2示出游离的TMZ和如本文所述的包含TMZ的阳离子脂质体的U87细胞存活率相对TMZ浓度的关系。
图3A示出游离的TMZ和如本文所述的包含TMZ的靶向阳离子脂质体的T98G细胞存活率相对TMZ浓度的关系。
图3B示出游离的TMZ和如本文所述的包含TMZ的靶向阳离子脂质体的KMS-11细胞存活率相对TMZ浓度的关系。
图4A示出使用MaestroTM体内荧光成像系统的脑肿瘤的荧光强度。
图4B示出U87MG-luc2成胶质细胞瘤肿瘤异种移植对用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的反应的磁共振成像(MRI)图像。
图5示出用游离的TMZ或scL-TMZ治疗之后，通过MRI测量的脑肿瘤的大小。
图6示出用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的小鼠的生物发光成像。
图7示出用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的小鼠的其它生物发光成像。
图8示出用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的小鼠的生物发光信号强度的量化。
图9示出用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的小鼠的生物发光信号强度的量化。
图10示出用游离的TMZ和scL-TMZ治疗期间和之后小鼠的体重测量值。
图11示出Kaplan-Meier曲线图，其证明用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的动物的长期存活。
图12示出Kaplan-Meier曲线图，其证明用游离的TMZ和不同剂量的scL-TMZ治疗的动物的长期存活。
图13示出脑肿瘤的重量，其证明游离的TMZ和scL-TMZ的作用。
图14示出对细胞凋亡的水平的流式细胞检测分析的结果，所述结果是通过从脑肿瘤中分离出的单细胞的分裂半胱天冬酶-3抗体染色来测定。
图15示出游离的TMZ和scL-TMZ治疗的小鼠的肿瘤大小。
图16示出用游离的TMZ和scL-TMZ治疗的小鼠的体重。
图17示出从皮下T98G异种移植肿瘤中分离出的CD133+CSC和CD133-非CSC的TUNEL染色。
图18示出通过来自皮下T98G脑肿瘤的SSEA-1+CSC的分裂半胱天冬酶-3抗体染色所评估的细胞凋亡的水平。
图19示出游离的TMZ、如本文所述的scL-TMZ以及scL-TMZ连同表达p53基因的靶向阳离子脂质体的组合的T98G细胞存活率相对TMZ浓度的关系。
图20示出全身性施用的scL-6FAM-ODN到U251异种移植脑肿瘤的肿瘤靶向输送。
图21示出全身性施用之后，从U251异种移植肿瘤中分离出的CD133+和CD133-非CSC细胞中摄入的scL输送的6FAM-ODN的流式细胞检测分析。
图22示出全身性施用之后，通过scL输送的ODN而在IC GBM中肿瘤特异性靶向CSC。
图23示出TMZ添加至细胞之后的XTT分析和IC50值。
图24示出使用Xenogen的U87IC肿瘤的生物发光成像，其展示出SGT-53+TMZ的组合的协同效应。
图25示出SGT-53加TMZ对IC U87GBM的协同效应。
图26示出全身性施用的scL-p53加TMZ的组合的协同效应。
图27示出Kaplan-Meier曲线图，其证明在GBM的IC U87模型中，对TMZ治疗的SGT-53敏化作用明显提高存活率。
图28示出Kaplan-Meier曲线图，其证明在GBM(T98G细胞)的IC抗TMZ的模型中，对TMZ治疗的SGT-53敏化作用明显提高存活率。
图29示出如所指出的治疗后细胞凋亡中的肿瘤细胞的百分比。
图30示出T98G抗TMZ的脑肿瘤细胞和SQ异种移植肿瘤中的MGMT表达通过全身性复合物p53基因治疗而下调。
图31示出T98G抗TMZ的颅内脑肿瘤中的MGMT表达通过全身性复合物p53基因治疗而下调。
图32示出对于scL-p53的建议给药时间计划。
图33示出游离的美法仑(MEL)和如本文所述的包含美法仑的靶向阳离子脂质体的KMS-11细胞存活率相对美法仑浓度关系。
图34示出未包囊的美法仑与没有靶向部分的脂质/美法仑和与完全的scL/美法仑复合物、以及与仅是脂质体的比较。
图35示出未包囊的美法仑与新鲜的和冻干的scL/美法仑复合物的比较。
图36示出靶向p53治疗对KMS-11细胞的作用。
图37示出单独的游离的(未包囊的)美法仑、单独的scL/美法仑、或游离的(未包囊的)或scL包囊的美法仑加scL-p53的组合对KMS-11细胞的作用。
发明详述
应了解的是，本文示出和描述的具体实施方式是实施例，并且不意图以任何方式来另外限制本申请的范围。
本文引用的公布的专利、专利申请、网站、公司名以及科学文献的全部内容在此以引用的方式并入，以达到如同它们各自是被确切地和单独地指出以引用的方式并入一样。本文引用的任何参考文件与本申请文件的特定教义之间的任何冲突应当以有利于本申请文件的方式来解决。同样，本领域理解的词语或短语的定义与如在本申请文件中所确切教授的词语或短语的定义之间的任何冲突应当以有利于本申请文件的方式来解决。
如在本申请文件中所使用，除非内容另外清楚地指出，否则单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”也确切地涵盖它们提及的术语的复数形式。本文使用术语“大约”意指大致地、在…范围内、粗略地或在…左右。当结合数值范围来使用术语“大约”时，它通过扩展到在所列举数值以上和以下的界限来改变所述范围。通常，本文使用术语“大约”来使一个数值改变到所指出的值以上和以下的20%偏差值。
除非另外定义，否则本文使用的技术的和科学的术语具有本申请所属领域的技术人员通常所理解的含义。本文引用了对于本领域一般技术人员来说已知的各种方法和材料。
在实施方案中，提供了制备靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物的方法。适合地，所述方法包括在乙醇中制备包含一种或多种阳离子脂质的脂质溶液。制备替莫唑胺的溶液。将脂质溶液与替莫唑胺的溶液混合。将阳离子脂质与替莫唑胺的混合物注入水溶液中，从而形成替莫唑胺阳离子脂质体。然后将替莫唑胺阳离子脂质体与配体混合以形成靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物。适合地，配体直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在实施方案中，提供了制备靶向的美法仑阳离子脂质体复合物的方法。适合地，所述方法包括在乙醇中制备包含一种或多种阳离子脂质的脂质溶液。适合地，在含有足量盐酸以促进溶解美法仑的无水乙醇中制备美法仑的溶液。将脂质溶液与美法仑的溶液混合。将阳离子脂质与美法仑的混合物注入水溶液中，从而形成美法仑阳离子脂质体。然后将美法仑阳离子脂质体与配体混合以形成靶向的美法仑阳离子脂质体复合物。适合地，配体直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
在实施方案中，提供了制备靶向的阿托品、伊立替康或培美曲塞阳离子脂质体复合物的方法。适合地，所述方法包括在乙醇中制备包含一种或多种阳离子脂质的脂质溶液。在适当的溶剂如无水乙醇、DMSO、水或缓冲溶液(如磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液或TRIS缓冲液)中制备阿托品、伊立替康或培美曲塞的溶液。将脂质溶液与阿托品、伊立替康或培美曲塞的溶液混合。将阳离子脂质与阿托品、伊立替康或培美曲塞的混合物注入水溶液中，从而形成阳离子的阿托品、伊立替康或培美曲塞脂质体。然后将阿托品、伊立替康或培美曲塞阳离子脂质体与配体混合以形成靶向的阿托品、伊立替康或培美曲塞阳离子脂质体复合物。适合地，配体直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
全文可互换地使用术语“复合物”、“纳米复合物”、“脂质体复合物”以及“阳离子脂质体复合物”来指本发明的阳离子脂质体。
如本文所述，替莫唑胺是引起细胞毒性DNA损伤的第二代烷基化(甲基化)剂，并且还被批准用于治疗间变性星形细胞瘤(AA)。以下示出的替莫唑胺的结构具有实验式：C6H6N6O2。
替莫唑胺，MW=194.15
在实施方案中，替莫唑胺的盐(例如HCl盐)也可以在本文描述的方法中使用。
适合地，在二甲亚砜(DMSO)或其它适当的溶剂中制备替莫唑胺(TMZ)的溶液。可以制备在任何所需浓度下的TMZ的溶液。在实施方案中，溶液中的TMZ的浓度是约0.1mM至约500mM、更适合地约1mM至约200mM、约50mM至约200mM、约50mM至约100mM、或约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、或约200mM。
美法仑是属于氮芥烷基化剂类的抗肿瘤剂。烷基化剂将烷基(CnH2n+1)添加至DNA。在咪唑环的第7号氮原子上，它将烷基连接至DNA的鸟嘌呤碱基。以下示出的美法仑的结构具有实验式：C13H18Cl2N2O2。
美法仑，MW=305.20
适合地，在含有足量盐酸以促进溶解美法仑的无水乙醇或其它适当的溶剂中，制备美法仑的溶液。可以制备在任何所需浓度下的美法仑的溶液。在实施方案中，溶液中的美法仑的浓度是约0.1mM至约500mM、更适合地约1mM至约200mM、约50mM至约200mM、约50mM至约100mM、或约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、或约200mM。
适合地，在适当的溶剂如无水乙醇、DMSO、水或缓冲溶液(如磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液或TRIS缓冲液)中制备阿托品、伊立替康或培美曲塞的溶液。可以制备在任何所需的浓度下的阿托品、伊立替康或培美曲塞的溶液。在实施方案中，溶液中的阿托品、伊立替康或培美曲塞的浓度是约0.1mM至约500mM、更适合地约1mM至约200mM、约50mM至约200mM、约50mM至约100mM、或约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、或约200mM。
多种脂质适用于本文描述的方法。公布的PCT申请WO99/25320描述了几种阳离子脂质体的制备。适合的脂质的实例包括：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、以及二油酰三甲基铵丙烷(DOTAP)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物；二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)与DOPE和/或chol的混合物。可以改变脂质的比例，以便优化在特异性靶细胞类型中负载TMZ、美法仑、阿托品、培美曲塞或伊立替康和摄入的效率。脂质体可以包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助性脂质的混合物。阳离子脂质对中性或辅助性脂质的可取比例是约1:(0.5至3)、优选地1:(1至2)(摩尔比)。用于在制备本文描述的阳离子脂质体中使用的示例性的脂质是在本领域中众所周知的，并且包括，例如1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。
适用于实践本文描述的方法的各种脂质的比例的实例包括但不限于：
(DOTAP=1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷、DDAB=二甲基二(十八烷基)溴化铵；DOPE=二油酰磷脂酰乙醇胺；chol=胆固醇)。
如本文所述，适合地，在制备本文描述的复合物之前，在乙醇(例如，无水乙醇)中制备脂质。
在乙醇中使复合物的脂质组分溶解之后，将溶解在DMSO或其它适合溶剂中的适当量的TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞添加至脂质混合物。适合地，在添加TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞之前和期间，将脂质混合物维持在约50℃至60℃的温度下。
为了制备脂质体，将脂质与TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞的溶液注入水溶液中以形成脂质体。如本文所使用“注入”意指迫使或驱动脂质和TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞的溶液进入水溶液中。适合地，水溶液是水，但是其它的缓冲液和盐可以存在于水溶液中。在实施方案中，水溶液是不含内毒素的LAL试剂水(适合地具有<0.005EU/ml的内毒素含量)(BioWhittaker)。适合地，使用注射器或类似的装置进行注入以产生脂质体。在实施方案中，在添加脂质/TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞溶液期间，快速搅拌水溶液以便促进脂质体形成。
出乎意料地发现，根据本文描述的方法，不需要挤压或超声处理来形成具有所需的大小和ζ电势特征的脂质体。在实施方案中，超声处理和/或挤压脂质体被确切地从公开的方法中排除。在另外的实施方案中，制备全文描述的靶向阳离子脂质体的方法适合地包括或实质上包括列举的要素。在此类实施方案中，认为增加如挤压的步骤是对此类方法的实质改变，并且因此被确切地从实质上包括列举的要素的此类方法中排除。
通过将脂质(在氯仿中)混合在一起，蒸发至干燥，并且用溶液中含有药物的水重构而进行的脂质体制备(用于药物的脂质体包囊的常见步骤)，不能产生均质总体。通过光散射的测量得到较差结果，同时质量报告指出累积的拟合误差高，因此数据质量太差而不能用于累积量分析，并且样品对于累计量分析来说过于多分散。这种制备的Z-平均数(d-nm)是743.9nm(数均值)。
然后将根据本文描述的注入方法而形成的替莫唑胺、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞阳离子脂质体与配体混合，以便形成靶向的替莫唑胺、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞阳离子脂质体。如全文所述，配体直接与阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。在其它的实施方案中，配体可以被化学偶联至阳离子脂质体。
如本文所使用，术语“配体”是指任何适合的靶向部分，其可以化学偶联至阳离子脂质体，或直接与所述阳离子脂质体缔合/复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。在配体直接与阳离子脂质体缔合/复合的实施方案中，不使用连接物、间隔物或其它桥联分子将配体复合至脂质体。用于在本发明的实践中的示例性的配体包括但不限于：蛋白质(例如，转铁蛋白或叶酸酯)、肽(例如，L-37pA)、抗体、抗体片段(包括Fab'片段和单链Fv片段(scFv))和糖(例如，半乳糖)、以及其它靶向分子。
在示例性的实施方案中，可以使用整个抗体或抗体片段作为配体来制备本发明的复合物。在适合的实施方案中，可以使用抗体片段，包括抗体的Fab片段和单链Fv片段(scFv)。一种适合的抗体是抗转铁蛋白受体(抗TfR)单克隆抗体，并且适合的抗体片段是基于抗TfR单克隆抗体的scFv(TfRscFv)。scFv含有用于TfR的抗原表位的完整抗体结合位点，所述抗原表位由这个Mab识别为近似分子量26,000的单多肽链。通过将分别来自重链和轻链的组分VH和VL可变区与适当指定的肽相连接形成scFv，所述肽桥联第一可变区的C端和第二可变区的N端，顺序为VH-肽-VL或VL-肽-VH。还可以在本发明的实践中使用其它的配体，如全文描述的那些配体。
在一个实施方案中，将半胱氨酸部分添加至scFv的C端。虽然不希望受理论约束，但应当相信的是在化学偶联和非化学偶联的实施方案中，提供游离巯基的半胱氨酸可增强抗体与脂质体之间的复合物形成。有或没有半胱氨酸的蛋白质可以在大肠杆菌(E.coli)包含体中表达，然后被重新折叠以产生活性形式的抗体片段。
适合的配体，例如蛋白质/肽、抗体或抗体片段，是将结合至靶细胞的表面并且优选地结合至在靶细胞上差异表达的受体的那些配体。在室温下，在配体(例如，蛋白质、抗体或抗体片段):脂质比例(重量:重量)在约1:10(0.01:1)至约1:50、适合地约1:20至约1:40(w:w)的范围内时，将配体与阳离子脂质体混合。适合地，配体:脂质的重量比是约0.01:1至约0.5:1、约0.3:1至约0.4:1、或约0.33:1，包括这些范围内的任何比例。允许配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和脂质体在室温下孵育短期的时间，通常约10至15分钟。
如通过使用Malvern
3000或Malvern
NANO-ZS的动态光散射所测量，脂质体复合物的大小通常在约5nm至约1000nm的范围内。参见美国公布专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。通过代表均质大小总体的单峰来证明脂质体的大小。更适合地，添加配体之前脂质体复合物的大小是在约5nm至约500nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm、约5nm至约100nm、约10nm至约70nm、或约20nm至约60nm的范围内。添加配体之后脂质体复合物的大小适合地是在约5nm至约800nm、约10nm至约500nm、约20nm至约400nm、约20nm至约200nm、或约30nm至约200nm的范围内。
适合地，本文描述的脂质体具有正的ζ电势。适合地，添加配体之前脂质体的ζ电势是约1mV至约200mV、约1mV至约100mV、约10mV至约100mV、约20mV至约60mV、或约30mV至约50mV。添加配体之后脂质体的适合ζ电势是约1mV至约200mV、约1mV至约100mV、约10mV至约80mV、约10mV至约60mV、或约25mV至约50mV。
在实施方案中，用于形成如本文所述的复合物的脂质体是空间上稳定的脂质体。空间上稳定的脂质体是亲水聚合物(如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)、或聚(n-异丙基乙酰胺(PNIPAM)))已经被整合进入其中的脂质体。此类改性的脂质体可以是特别有用的，因为它们通常不会像没有如此改性的比较脂质体那样，通过网状内皮系统很快地从血流中清除。为了制备本发明的空间上稳定的脂质体复合物，如上制备包含替莫唑胺、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞的阳离子脂质体。在约0.1:100(PEG的nmol数:脂质体的nmol数)、适合地约0.5:50、例如约1:40(PEG的nmol数:脂质体的nmol数)的比例下，将生理学上可接受的缓冲液中的PEG聚合物的溶液添加至这种脂质体。所得到的溶液在室温下孵育一段时间，这段时间足以允许聚合物整合进入脂质体复合物中。然后在室温下，并且在配体(例如，蛋白质):脂质比例在约1:5至约1:40(w:w)的范围内，将配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)与稳定的脂质体复合物混合。
如本文所述，配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)经由配体与脂质体之间的相互作用(例如，静电的、范德华(van der Walls)或其它非化学偶联的相互作用)适合地直接与脂质体缔合(复合)。通常，当非化学偶联时，不使用连接体或间隔物分子(例如，聚合物或其它分子)来连接配体和脂质体。
如本文所述，在其它的实施方案中，例如经由含有马来酰亚胺基或其它巯基反应基团的阳离子脂质体与配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)上的硫原子之间的化学相互作用使配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)化学偶联至阳离子脂质体。直接化学偶联的此类方法被公开于2001年10月1日提交的美国专利申请号09/914,046中，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。
全文描述了用于在方法和脂质体中使用的脂质:替莫唑胺的适合比例。在示例性的实施方案中，脂质:替莫唑胺的摩尔比是约0.1:1至约1:100、约0.05:1至约1:50、约1:1至约1:20、约2:1至约10:0.1、约0.5:1至约2:1或约1:1。
全文描述了用于在方法和脂质体中使用的脂质:美法仑的适合比例。在示例性的实施方案中，脂质:美法仑的摩尔比是约0.1:1至约1:100、约0.05:1至约1:50、约1:1至约1:20、约2:1至约10:0.1、约0.5:1至约2:1或约1:1。
全文描述了用于在方法和脂质体中使用的脂质:阿托品、伊立替康或培美曲塞的适合比例。在示例性的实施方案中，脂质:阿托品、伊立替康或培美曲塞的摩尔比是约0.1∶1至约1∶100、约0.05:1至约1:50、约1:1至约1:20、约2:1至约10:0.1、约0.5:1至约2:1或约1:1。
对于TMZ脂质体的包囊效率适合地是在约20%至约100%、约20%至约80%、约20%至约60%、或约20%至约55%包囊的TMZ的范围内。这是用于使TMZ包囊在脂质体中的乙醇注入方法的令人惊讶、出人意料的结果。
对于美法仑脂质体的包囊效率适合地是在约20%至约100%、约20%至约80%、约20%至约60%、或约20%至约40%包囊的美法仑的范围内。这是用于使美法仑包囊在脂质体中的乙醇注入方法的令人惊讶、出人意料的结果。
对于阿托品、伊立替康或培美曲塞脂质体的包囊效率适合地是在约20%至约100%、约20%至约80%、约20%至约60%、或约20%至约40%包囊的阿托品、伊立替康或培美曲塞的范围内。这是用于使阿托品、伊立替康或培美曲塞包囊在脂质体中的乙醇注入方法的令人惊讶、出人意料的结果。
在其它的实施方案中，脂质体还可以包含胞内干扰肽(endosomaldisrupting peptides)，如Sigma-Genosys(The Woodlands,TX)制造的、与脂质体缔合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(HK)(SEQ ID NO:1)肽。胞内干扰肽HoKC可帮助细胞的细胞质中TMZ、美法仑、阿托品、培美曲塞或伊立替康的释放。在此类实施方案中，脂质体还适合地包含5摩尔百分比的总脂质下的MPB-DOPE。因为HoKC肽(K[K(H)KKK]5-K(H)KKC)带有末端的半胱氨酸，所以包括MPB-DOPE为了允许肽偶联至脂质体。使用带有马来酰亚胺基团的阳离子脂质体(脂质-MPB)与肽之间的偶联反应来制备脂质-HoKC脂质体。将0.1mmol的在半胱氨酸上具有游离巯基的肽等分试样添加至2mmol的、在10mM HEPES中的脂质-MPB溶液(pH7.4)，并且在室温下旋转(20至30r.p.m.)2h。
根据本发明制备的脂质体复合物可以被配制成药理学上可接受的制剂用于体内施用。可以将复合物与药理学上可相容的媒介物或载体组合。例如，可以将组合物配制用于对哺乳动物静脉施用，所述哺乳动物例如通过施用复合物中的TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞而受益的人类患者。按适当地大小制备复合物，以使得在静脉注射施用之后，它们被分布于整个身体。或者，可以经由施用的其它路线：瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、舌下的(SL)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用来输送复合物。经由此类方法来制备制剂以用于输送和使用此类方法的输送是本领域众所周知的。
可以由以下各项针对靶细胞类型来最佳化复合物：脂质的选择和比例、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)与脂质体的比例、配体和脂质体与TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞的比例，以及配体的选择。
根据本发明的方法制备的复合物可以呈试剂盒的形式被提供来用于输送TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞。适合的试剂盒可以单独地包括：适合的容器、靶向的TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞阳离子脂质体复合物(适合地干燥、冻干的粉末)以及适合的缓冲液。可以在无菌条件下，按适当的顺序混合组分，并且在制备之后，在合理的时间段内对患者施用，通常从约30分钟至约24小时。适合地，在无菌的注射用水连同适当的缓冲液、渗透性控制剂等中制备脂质体。适合地，将全部的复合物配制成干燥的粉末(冻干的)(例如，参见美国公布专利申请号2005/0002998，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文)。
本发明的阳离子脂质体复合物适合地在它们的表面上包含抗转铁蛋白受体单链抗体分子(TfRscFv)。已经测定到这种靶向分子增强了越过血脑屏障的输送和向脑癌细胞的靶向输送。靶向的脂质体还被用于在体内治疗其它癌症和用于输送其它药物。
还提供的是根据全文描述的方法而制备的阳离子脂质体复合物。举例来说，提供了配体靶向的(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体复合物，所述复合物包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)以及TMZ、美法仑、阿托品、培美曲塞或伊立替康，其中配体直接与阳离子脂质体复合/缔合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞可以被包囊在阳离子脂质体内(即，在脂质体的亲水、含水的内部)、被包含在阳离子脂质体的烃链区内、与阳离子脂质体的内或外单层(例如，头基区)缔合、或其任何的组合。适合地，虽然还可以使用包含几个同心双分子层的多层脂质体，但本发明的阳离子脂质体是单层的脂质体(即，单个双分子层)。本发明的单个双分子层阳离子脂质体包括内部含水体积，其中可以包囊TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞。它们还包括具有烃链区(即，脂质的脂质链区)的单个双分子层，在所述烃链区可以含有TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞。另外，TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞可以与脂质体膜的内部单层和/或外部单层(即，脂质的头基区)两者之一或两者复合或缔合。在另外的实施方案中，TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞可以被包囊/缔合/复合在本发明的阳离子脂质体复合物的这些区的任何区或所有区中。
在另外的实施方案中，提供了包含全文描述的配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物。在适合的实施方案中，药物组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种赋形剂：一种或多种抗菌剂(例如，两性霉素B、金霉素、庆大霉素、新霉素)、一种或多种防腐剂(苄索氯铵、EDTA、甲醛、2-苯氧乙醇)、一种或多种缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、硼酸钠、氯化钠)、一种或多种表面活性剂(聚山梨醇20、80)、一种或多种蛋白质稳定剂(例如，白蛋白、乳糖、谷氨酸钾)、糖(蔗糖或右旋糖)、以及佐剂(例如，氢氧化铝、磷酸铝)。其它的赋形剂是本领域中众所周知的，并且可以易于在本发明的实践中使用。
还提供的是包含第一配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物，所述复合物包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)以及TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞，其中配体直接与阳离子脂质体复合/缔合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。在另外的实施方案中，配体可以化学偶联至阳离子脂质体。药物组合物还适当地包含第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)以及一种或多种核酸分子(包括质粒DNA、siRNA或反义核酸)，其中配体直接与阳离子脂质体复合/缔合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。(参见美国专利号7,780,822和美国公布专利申请号2007/0065449，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文)。在另外的实施方案中，组合物还可以包含配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和一种或多种小分子(参见美国公开专利申请号2007/0231378，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文)、或一种或多种显像剂(参见美国公布专利申请号2007/0134154，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文)，其中配体直接与阳离子脂质体复合/缔合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。在另外的实施方案中，在此类组合物中配体可以化学偶联至阳离子脂质体。
还提供的是包含第一配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物，所述复合物包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)以及TMZ、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞，其中配体直接与阳离子脂质体复合/缔合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。在另外的实施方案中，配体可以化学偶联至阳离子脂质体。药物组合物还适合地包含第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、以及一种或多种核酸分子(包括质粒DNA、siRNA或反义核酸)、一种或多种小分子、或一种或多种显像剂(包括超顺磁性氧化铁、或钆)，其中核酸分子、小分子或显像剂在癌细胞中下调、改变或另外使MGMT的作用失效。
在另外的实施方案中，提供了治疗患者的癌症的方法。适合地，此类方法包括对患者施用如本文所述的靶向阳离子脂质体复合物。适合地，根据全文描述的方法来制备复合物。
在实施方案中，治疗的方法包括对患者施用靶向的替莫唑胺或美法仑阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；替莫唑胺或美法仑；和配体，其与阳离子脂质体复合、但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
如全文所述，配体适合地是抗体、抗体部分或蛋白质，包括单链Fv抗体片段。在示例性的实施方案中，单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
还提供了治疗患者的有机磷中毒(即，神经毒气中毒)的方法，所述方法包括对患者施用靶向的阿托品阳离子脂质体复合物，其中靶向的阿托品阳离子脂质体复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；阿托品；和配体，其与阳离子脂质体直接复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。本文描述了示例性的配体。
适合地，使用本文描述的方法，以约1mg/m2至约1000mg/m2剂量，更适合地以约10mg/m2至约500mg/m2、或约50mg/m2至约400mg/m2、约80mg/m2至约300mg/m2、约50mg/m2至约250mg/m2、约50mg/m2至约250mg/m2、或约50mg/m2、约60mg/m2、约70mg/m2、约80mg/m2、约90mg/m2、约100mg/m2、约110mg/m2、约120mg/m2、约130mg/m2、约140mg/m2、约150mg/m2、约160mg/m2、约170mg/m2、约180mg/m2、约190mg/m2、约200mg/m2、约210mg/m2、约220mg/m2、约230mg/m2、约240mg/m2、约250mg/m2、约260mg/m2、约270mg/m2、约280mg/m2、约290mg/m2、或约300mg/m2的剂量对患者施用替莫唑胺。
适合地，使用本文描述的方法，以约1mg/m2至约500mg/m2的剂量，更适合地以约1mg/m2至约100mg/m2、或约1mg/m2至约50mg/m2、约1mg/m2至约30mg/m2、约5mg/m2至约20mg/m2、约6mg/m2至约16mg/m2、或约1mg/m2、约2mg/m2、约3mg/m2、约4mg/m2、约5mg/m2、约6mg/m2、约7mg/m2、约8mg/m2、约9mg/m2、约10mg/m2、约11mg/m2、约12mg/m2、约13mg/m2、约14mg/m2、约15mg/m2、约16mg/m2、约17mg/m2、约18mg/m2、约19mg/m2、约20mg/m2、约21mg/m2、约22mg/m2、约23mg/m2、约24mg/m2、或约25mg/m2的剂量对患者施用美法仑。
适合地，使用本文描述的方法，以约1mg/m2至约1000mg/m2的剂量，更适合地以约10mg/m2至约500mg/m2、或约50mg/m2至约400mg/m2、约80mg/m2至约300mg/m2、约100mg/m2至约250mg/m2、或约50mg/m2、约60mg/m2、约70mg/m2、约80mg/m2、约90mg/m2、约100mg/m2、约110mg/m2、约120mg/m2、约130mg/m2、约140mg/m2、约150mg/m2、约160mg/m2、约170mg/m2、约180mg/m2、约190mg/m2、约200mg/m2、约210mg/m2、约220mg/m2、约230mg/m2、约240mg/m2、约250mg/m2、约260mg/m2、约270mg/m2、约280mg/m2、约290mg/m2、或约300mg/m2的剂量对患者施用阿托品、伊立替康或培美曲塞。
在实施方案中，使用本文描述的方法，以约0.01至约100mg的剂量，更适合地以约0.1mg至约50mg、或约1mg至约40mg、约1mg至约30mg、约1mg至约20mg、约1mg至约10mg、约2mg至约6mg、或约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg或约20mg的剂量对患者施用阿托品(适合地肌肉内施用)。
如本文所述，在实施方案中，用于在本文描述的方法中使用的阳离子脂质体中的脂质:替莫唑胺、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞的摩尔比是约0.1:1至约5:1。更适合地，在阳离子脂质体中的脂质:替莫唑胺、美法仑、阿托品、伊立替康或培美曲塞的摩尔比是：约0.1:1至约1:100、约0.05:1至约1:50、约1:1至约1:20、约2:1至约10:01、约05:1至约2:1、或约1:1。
用于本文描述的方法中的阳离子脂质体中配体:脂质的重量比适合地是约0.01:1至约0.5:1。适合地，阳离子脂质体中配体:脂质的重量比是约0.01:1至约0.5:1、约0.3:1至约0.4:1、或约0.33:1，包括这些范围内的任何比例。
适合的施用方法包括但不限于：静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、舌下的(SL)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。它们可以呈大丸剂或呈浸剂被施用。在其它的实施方案中，可以使用本文描述的或另外在本领域中已知的各种方法，将配体化学偶联至阳离子脂质体。
可以使用本发明描述的方法来治疗的示例性的癌症包括但不限于：头颈部癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌(包括成胶质细胞瘤和星形细胞瘤)、神经内分泌癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤以及血癌。
如本文所述，令人惊讶地发现通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体能够越过血脑屏障。通常，这种屏障是被指定来治疗癌症和脑的其它疾病或病状的治疗，或被指定来输送药物至脑的其它治疗的重大障碍。因此，在实施方案中，在本文描述的方法适用于成功治疗脑癌(包括神经胶质瘤)，并且通常用于输送药物越过血脑屏障。
在另一个实施方案中，本文描述的方法还可以被用作用于有机磷中毒的治疗。
如本文所述，令人惊奇地发现通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体能够有效输送足量的TMZ至抵抗标准的未包囊TMZ的靶肿瘤细胞，以便克服这些细胞的固有抗性，这可能是由于活化的MGMT，从而导致现在这些肿瘤细胞对TMZ反应。
如本文所述，令人惊奇地发现通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体能够诱导肿瘤细胞中的细胞死亡(细胞凋亡)，所述肿瘤细胞对没有施用靶向阳离子脂质体的TMZ的杀伤作用有抗性。
如本文所述，令人惊奇地发现，不考虑这些细胞对没有施用靶向阳离子脂质体的TMZ反应，通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体能够诱导肿瘤中癌干细胞(CSC)以及分化的癌细胞(非CSC)中的细胞凋亡。
如本文所述，令人惊奇地发现在肿瘤中，在癌干细胞(CSC)中通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体诱导的细胞凋亡的水平成比例地高于分化癌细胞(非CSC)中的水平。
如本文所述，令人惊奇地发现用通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体来治疗肿瘤，不仅诱导肿瘤生长抑制，还导致肿瘤消退，并且甚至在已经结束治疗之后，还可以维持所述的这种反应。
如本文所述，令人惊奇地发现用通过公开的方法来制备的靶向的阳离子脂质体来治疗肿瘤细胞，不仅诱导肿瘤生长抑制，还导致肿瘤消退，并且甚至在已经结束治疗之后，还可以维持所述的这种反应。
在适合的实施方案中，所述方法进一步包括对患者施用与靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物组合的另一治疗。可以使用的示例性的治疗包括施用化疗剂、小分子、放射治疗或基于核酸的治疗。示例性的化疗剂包括多西他赛(docetaxel)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿霉素以及吉西他滨(gemcitabine)。示例性的小分子包括但不限于：甲磺酸伊马替尼(GLEEVECTM)、盐酸厄洛替尼(TARCEVATM)、苹果酸舒尼替尼(SU11248,SUTENTTM)以及吉非替尼(IRESSATM)。示例性的基于核酸-酸的治疗(包括肿瘤抑制基因、反义寡核苷酸或siRNA)包括公开于美国公布专利申请号2007/0065499和美国专利号7,780,882中的那些核酸-酸，每个所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。在适合的实施方案中，如在美国专利号7,780,882中所述，基于核酸的治疗包括施用阳离子脂质体复合物，所述阳离子脂质体复合物包含编码wtp53基因并且经由TfRscFv(scL-p53)靶向的质粒DNA。
还提供的是治疗患者的脑癌的方法，所述方法包括对患者施用如在美国专利号7,780,882中所述的阳离子脂质体复合物。适合地，所述复合物包含：阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；质粒DNA，其表达野生型p53；和抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其与阳离子脂质体直接复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。所述方法进一步包括适合地在与阳离子脂质体复合物同一时间或在施用阳离子脂质体复合物之后，施用替莫唑胺。
对于相关领域一般技术人员来说容易显而易见的是，对本文描述的方法和应用的其它适合的修改和调整可以在不脱离本发明或其任何实施方案的范围的情况下做出。现已详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，本发明所包括的这些实施例仅为了说明本发明，而不意图限制本发明。
实施例1
制备包含替莫唑胺的阳离子脂质体
材料：
DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷，盐酸盐)
从Avanti Polar Lipids,Inc.获得，目录号(#)890890E，MW698.55
浓度：25mg/mL乙醇溶液
在使用之前，用无水乙醇稀释脂质至20mg/ml
DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺)
从Avanti Polar Lipids,Inc.获得，目录号(#)850725E，MW744.04
浓度：25mg/mL乙醇溶液。
在使用之前，用无水乙醇稀释脂质至20mg/ml
替莫唑胺(TMZ，M.W.194.15)，粉末
从Sigma获得，目录号(#)T2577–100mg
将TMZ溶解于纯DMSO中至所需的浓度。举例来说，19.415mg/ml=100mM的TMZ；28mg/ml=144.218mM的TMZ
超纯、无内毒素的LAL试剂水(例如BioWhittaker，目录号(#)W50-500，内毒素<0.005EU/ml)
注入器：汉密尔顿(Hamilton)气密注射器，具有22号针头，部件#81365)的1ml(汉密尔顿#81230)
程序：
1)通过将TMZ溶解在DMSO中至所需的浓度，并通过高速涡旋5min至10min来制备新鲜的TMZ溶液(必须是澄清的)。在室温下保持所述溶液，直到被用于与脂质混合。
2)在37℃下将脂质溶液放置10min至15min。然后将脂质溶液放置于65℃水浴中，并偶尔摇动5min。
3)制备脂质-TMZ：将具有搅拌棒的棕色玻璃瓶放置于被设置在50℃至60℃的热板上。当在无飞溅的高速下搅拌时，按以下顺序将脂质和TMZ添加至瓶中。应注意的是，如本文所述的其它组分比例和浓度可以使用如下所示的相同方案来制备。
对于0.5:1(脂质:TMZ)摩尔比(2mM TMZ在制剂中)
DOTAP 87.5μl(的20mg/ml)=2.5μmol或1.75mg
DOPE 93.75μl(的20mg/ml)=2.5μmol或1.875mg
添加TMZ-HCl溶液，100μl(的19.41mg/ml)=10μmol，
在添加所有3种组分之后，连续搅拌3min。
对于1:1(脂质:TMZ)摩尔比(2mM TMZ在制剂中)
DOTAP 175μl(的20mg/ml)=5μmol或3.5mg
DOPE 187.5μl(的20mg/ml)=5μmol或3.75mg
添加TMZ-HCl溶液，100μl(的19.41mg/ml)=10μmol，
在添加所有3种组分之后，连续地搅拌3min。
对于1∶1(脂质:TMZ)摩尔比(8mM TMZ在制剂中)
DOTAP 560μl(的25mg/ml)=20μmol或14mg
DOPE 600μl(的25mg/ml)=20μmol或15mg
添加TMZ溶液，277.36μl(的28mg/ml)=40μmol，
在添加所有3种组分之后，连续地搅拌3min。
对于2:1(脂质:TMZ)摩尔比(2mM TMZ在制剂中)
DOTAP 350μl(的20mg/ml)=10μmol或7mg
DOPE 375μl(的20mg/ml)=10μmol或7.5mg
添加TMZ-HCl溶液，100μl(的19.41mg/ml)=10μmol，
在添加所有3种组分之后，连续地搅拌3min。
4)在水浴中，在具有搅拌棒的棕色玻璃瓶中，将4mL LAL水温热至65℃。在添加脂质-TMZ溶液之前，立即将瓶移至热板(50℃至60℃)。在无飞溅的高速下搅拌水，搅拌几秒，以便从搅拌棒上去除气泡。
5)将所述水保持在热板上。在脂质添加期间，在高速(无飞溅)下连续搅拌水。如上混合脂质与TMZ之后，立即并且尽可能快地使用汉密尔顿注射器用于注入，将混合物注入热板(50℃至60℃)上的热水中直接进入涡旋的中心。在添加脂质混合物同时宽松地遮盖之后，在高速(无飞溅)下继续搅拌1min。
6)将玻璃瓶移至室温搅拌板，并且继续缓慢地搅拌直到被宽松遮盖的溶液冷却至20℃至25℃(室温)。
7)用室温LAL水将体积调至5ml。
8)如果需要的话，则使用0.22μm孔的Milex GV过滤器过滤溶液。
9)如果需要的话，则测量粒径和ζ电势。
这些制备方法的结果证明了大致至少30%至40%、适合地至少50%至55%的TMZ和脂质体的负载量，所述TMZ和脂质体具有约20nm至约60nm的粒径和约30mV至约50mV的ζ电势。
实施例2
制备没有化学偶联(通过简单混合)的scL-TMZ
使用根据实施例1中描述的程序来制备的包含TMZ的阳离子脂质体，通过简单混合组分并且无化学偶联来制备如本文所述的配体靶向的TMZ阳离子脂质体复合物。根据以下一般程序制备所述复合物：
向脂质体-水(或缓冲液)，添加适当量的靶向部分以给予所需的比例，并且通过轻轻倒置来混合5至10秒。靶向部分可以是配体，其包括但不限于转铁蛋白或叶酸酯或其它蛋白质。靶向部分还可以是靶向细胞表面受体的抗体或抗体片段，其包括但不限于转铁蛋白或HER-2受体(例如，TfRscFv)。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。为产生所需的最终体积，将靶向部分-脂质-TMZ掺合物与得到所需的体积需要的任何体积(包括零体积)的水(适合地去离子水)或任何pH的缓冲液(包括但不限于Tris缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲盐水)混合，并且轻轻倒置5至10秒来混合。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。
通常，用于体外分析时，希望的是最终复合物中TMZ的量是在每个孔约1μM至300μM的范围内；用于体内用途时，希望每次注入提供约1mg/kg至约50mg/kg的TMZ。用于体内时，最后添加右旋糖或蔗糖至约1%至50%(V:V)最终浓度的右旋糖或蔗糖，适合地5%右旋糖或10%蔗糖，并且通过轻轻倒置来混合5至10秒。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。
在1:30(抗体片段:脂质体，w:w)的适合比例和1:1脂质体:TMZ(摩尔比)下的具体实施例如下：对于大致700μL的最终体积，在每次注入25mg/kg的TMZ浓度下，将319μL的脂质:TMZ(8mM原料)与305μL的抗体片段(在0.2mg/mL的抗转铁蛋白受体单链抗体片段[TfRscFv]浓度下)混合。添加6μL的水或缓冲液，并且作为最后一步，添加70μL的50%右旋糖或无水或缓冲液，以及140μL的50%蔗糖。
在1:30(抗体片段:脂质体，w:w)的优选比例和1:1脂质体:TMZ(摩尔比)下的第二种具体实施例如下：对于大致1.8mL的最终体积，在每次注入25mg/kg的TMZ浓度下，将1276μL的脂质:TMZ(2mM原料)与305μL的抗体片段(在0.2mg/mL的抗转铁蛋白受体单链抗体片段[TfRscFv]浓度下)混合。添加39μL的水或缓冲液，并且作为最后一步添加180μL的50%右旋糖。
在1:30(抗体片段:脂质体，w:w)的优选比例和1∶1脂质体:TMZ(摩尔比)下的另一个具体实施例如下：对于大致400μL的最终体积，在每次注入5mg/kg的TMZ浓度下，将280μL的脂质:TMZ(2mM原料)与64μL的抗体片段(在0.2mg/mL的抗转铁蛋白受体单链抗体片段[TfRscFv]浓度下)混合。添加16.5μL的水或缓冲液，并且作为最后一步添加40μL的50%右旋糖。
如通过使用Malvern电位仪ZS动态光散射所测定，通过所述方法来制备的最终复合物的大小(数均值)是在约10至800nm之间、适合地约20至400nm、最适合地约25至200nm，并具有介于约1与100mV之间、更适合地10至60mV、并且最适合地25至50mV的ζ电势。这种大小足够小，可以有效地通过肿瘤毛细血管床或越过血脑屏障，并且到达肿瘤细胞。
实施例3
包含替莫唑胺的靶向的阳离子脂质体的体外疗效
从ATCC(Manassas，VA)中获得人多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞系U87MG和T98G。U87从IV级成胶质细胞瘤中得到，并且带有wtp53(Van Meir EG、Kikuchi T、Tada M、Li H、Diserens AC、Woicik B E、Huang H J S、Friedmann T、Detribolet N以及Cavenee WK(1994)Analysis of the P53Gene and Its Expression in HumanGlioblastoma Cells.Cancer Research54：第649-652页)。稳定表达荧光素酶基因的U87MG的一种型式已经从Caliper Life Sciences获得以用于体内研究中，其中肿瘤生长和反应将通过
成像系统，Xenogen来监视。从Frederick(Frederick，MD)的美国癌症研究所的癌症治疗和诊断部门肿瘤存库中获得人GBM细胞系U251。在用10%热灭活的胎牛血清(Omega Scientific,Tarzana,CA)、2mmol/L L-谷氨酰胺(Mediatech,Manassas,VA)和各为50μg/mL的青霉素、链霉素和新霉素(PSN)补充的改进IMEM(Gibco，Grand Island，NY；U87和U87MG-luc2细胞)、MEM(Mediatech Manassas，VA；T98G细胞)、或RPMI1640培养基(Gibco；U251细胞)中，将细胞维持在37℃下5%CO2环境中。在通过使用TrypLE Express(Gibco)的胰酶消化的下一段或进一步实验之前，使细胞生长至70%至80%融合。3′-[1-(苯氨基-羰基)-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)购自Polysciences(Warrington,PA)。
在用10%热灭活的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺和各为50μg/mL的各青霉素、链霉素和新霉素(PSN)补充的RPMI1640培养基中，将人多发性骨髓瘤细胞系KMS-11维持在37℃下5%CO2环境中。在下一段或进一步实验之前，使细胞生长至70%至80%融合。这些细胞在悬浮液中生长，并且不呈单层。
U87MG被分类为对TMZ敏感(Patil R、Portilla-Arias J、Ding H、Inoue S、Konda B、Hu J W、Wawrowsky K A、Shin P K、Black K L、Holler E以及Ljubimova J Y(2010)Temozolomide Delivery to TumorCells by a Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(Beta-L-MalicAcid).Pharmaceutical Research27：第2317-2329页)。建立了良好的GBM的正位小鼠模型(Liu Y、Lang F、Xie X、Prabhu S、Xu J、SampathD、Aldape K、Fuller G以及Puduvalli V K(2011)Efficacy ofAdenovirally Expressed Soluble TRAIL in Human Glioma OrganotypicSlice Culture and Glioma Xenografts.Cell Death&Disease2)。当在无胸腺裸鼠中颅内注入5×105细胞时，在10天内U87MG细胞再生地发育成肿瘤。小鼠在30至40天内死于肿瘤负担。还从人成胶质细胞瘤中分离出T98G。然而，已知这种细胞系是抗TMZ的(Patil R、Portilla-Arias J、Ding H、Inoue S、Konda B、Hu J W、Wawrowsky KA、Shin P K、Black K L、Holler E以及Ljubimova JY(2010)Temozolomide Delivery to Tumor Cells by a Multifunctional NanoVehicle Based on Poly(Beta-L-Malic Acid).Pharmaceutical Research27：第2317-2329页)，并且带有p53基因的突变形式(Van Meir EG、Kikuchi T、Tada M、Li H、Diserens A C、Wojcik B E、Huang H J S、Friedmann T、Detribolet N以及Cavenee W K(1994)Analysis ofthe P53Gene and Its Expression in Human Glioblastoma Cells.Cancer Research54：第649-652页)。经由在MatrigelTM中皮下接种5-10×106个细胞来诱导T98G异种移植肿瘤(Torres S、Lorente M、Rodriguez-Fornes F、Hernandez-Tiedra S、Salazar M、Garcia-Taboada E、Barcia J、GuzmanM以及Velasco G(2011)A Combined Preclinical Therapy ofCannabinoids and Temozolomide Against Glioma.Molecular CancerTherapeutics10：第90-103页)。两种细胞系均可提升TfR表达(Sang H、Kelley P Y、Hatton J D以及Shew J Y(1989)Proto-OncogeneAbnormalities and Their Relationship to Tumorigenicity in Some HumanGlioblastomas.Journal ofNeurosurgery71：第83-90页)。
进行研究来比较标准游离的(未包囊的)TMZ和未配位的含有TMZ的脂质体(脂质-TMZ)的疗效；脂质-TMZ如上在实施例1中所述，使用2mM浓度的脂质体来制备。脂质-TMZ分子的ζ电势在35.6mV至40.1mV范围。使用的TMZ浓度是从1μM至约250μM变化。脂质体对TMZ的比例是0.5:1、1:1或2:1(摩尔比)。
将人脑肿瘤衍生的U251细胞按每个孔2×103个一式三份接种在96孔板中。在孵育过夜之后，用无血清培养基代替所述培养基，并用100μL的规定浓度的脂质-TMZ或无TMZ覆盖，孵育5h，然后用胎牛血清补充。在另外孵育91h之后，通过如先前所述的XTT分析来测定细胞活力(Rait A、Pirollo KF、Rait V等Inhibitory effects of thecombination of HER-2antisense oligonucleotide and chemotherapeuticagents used for the treatment of human breast cancer.Cancer Gene Ther2001；8：728–39.)。在450nm处使用酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA)来测定与细胞活力相关的甲臜(formazan)吸收。从药物浓度对数相对存活细胞分数的关系的图形中内插IC50值(导致50%细胞死亡的药物浓度)。
图1证明在人脑肿瘤(GBM)细胞系U251中，与游离的TMZ的作用相比，用如本文所述的脂质体包囊的TMZ的体外治疗导致人GMB细胞中IC50值的明显减小。然而，在用以治疗细胞的TMZ的浓度下，未包囊的TMZ几乎不具有细胞杀伤作用，当包囊在脂质体中时，50%的细胞分别在仅46.3μM、28.8μM和16μM的TMZ浓度下，在0.5:1、1:1和2:1的脂质/TMZ摩尔比下被杀死。脂质与TMZ的比例越高，细胞杀伤作用增加越多，从而产生较低的IC50值。熟悉本领域的技术人员所众所周知的是，游离的未包囊的TMZ是最常用于治疗患者的肿瘤的药物形式。
图2中示出使用人GBM肿瘤细胞系U87时的类似结果，其中比较了游离的TMZ以及脂质体与TMZ的摩尔比是1:1和2:1的脂质-TMZ。再一次，未包囊的TMZ几乎对这些脑肿瘤细胞不具有细胞杀伤作用。相比之下，当使用本发明的方法以1:1或2:1(脂质:TMZ)的摩尔比包囊在脂质体中时，分别仅11.4和21.5μM的TMZ浓度就导致明显的肿瘤细胞死亡。
实施例4
与游离的(未包囊的)TMZ比较，scL-TMZ对肿瘤细胞的作用增加
如上在实施例1至2中所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1:1的脂质:TMZ摩尔比(大小=46.2nm；ζ电势=42.5mV)(脂质体浓度=2mM)，以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备scL-TMZ复合物。scL-TMZ复合物的大小是约27.5nm。使用XTT分析，在抗TMZ的人脑肿瘤细胞系T98G中，将scL-TMZ的体外细胞杀伤能力与游离的、未包囊的TMZ进行比较。
图3A示出与游离的TMZ比较，肿瘤靶向的scL-TMZ复合物的抗癌疗效明显提高。游离的TMZ具有>1000μM的IC50值。相比之下，当根据本文描述的方法制备，并且借助肿瘤靶向复合物输送至肿瘤细胞时，至少不到20倍的TMZ有效地杀死了癌症细胞。这是尤其重要的，因为这种GBM细胞系在本领域中众所周知是对TMZ的杀伤作用有抗性的。抗性的这种反转是由于借助将靶向配体(蛋白质、抗体或抗体片段)结合至它在细胞上的配体并且经由被动方式或通过像受体介导的胞吞作用的主动运输机制来触发摄入，从而将TMZ有效负载有效的输送和摄入到肿瘤细胞中。这种方法用药物来“淹没”细胞，从而克服了肿瘤细胞在位修复由TMZ引起的DNA损坏的机制(如上调MGMT)，和/或将TMZ泵出细胞的机制。因此，细胞会死亡。
有许多分支结果是归结于TMZ经由本文描述的靶向的阳离子脂质体的肿瘤靶向输送。
1)疗效增加意指被输送至患者以便观察到抗肿瘤效果改善所需要得药物较少。
2)肿瘤特异性输送(肿瘤特异性)将减少目前与TMZ相关的有害副作用，因为药物将不会被非靶向细胞所吸收。
3)有效输送TMZ至肿瘤细胞克服了在大多数脑肿瘤(GBM和星形细胞瘤)和其它癌症类型中固有的对TMZ的抗性，所述癌症类型包括但不限于：前列腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈部癌、肾癌、胃癌以及黑素瘤。抗性的这种反转扩展了TMZ作为抗癌治疗的使用范围。
图3B证明了本发明的方法不限于脑肿瘤细胞对TMZ的敏化作用。在多发性骨髓瘤细胞系KMS-11中，将scL-TMZ的杀伤作用与游离的(未包囊的)TMZ的杀伤作用比较。如上所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1:1的脂质:TMZ摩尔比(脂质体浓度=8mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例，用不同递增剂量的TMZ(0μM至100μM TMZ)来制备scL-TMZ复合物。scL-TMZ复合物的大小是约143nm。在多发性骨髓瘤细胞系KMS-11中，将scL-TMZ的体外细胞杀伤能力与游离的、未包囊的TMZ的体外细胞杀伤能力比较。进行了转染并且评估了转染后48小时KMS-11的活力。先前TMZ没有被用于治疗多发性骨髓瘤，因此，令人惊奇的是，通过在scL复合物中的包囊将TMZ输送至这些细胞，将导致明显细胞死亡，甚至在非常低的TMZ浓度(25μM)下也如此。
使用以上描述的相同方法和程序来制备脂质-TMZ和scL-TMZ，并且所得到的scL-TMZ纳米复合物还被用于转染前列腺(DU145)细胞、肺(A549)细胞、卵巢(Hey-A8)细胞、胰腺(PANC-1)细胞以及肝细胞癌(HEP-G2)细胞。在所有情况下，当包囊在scL纳米复合物中，当与游离的(未包囊的)TMZ(目前标准的输送方法)比较时，肿瘤细胞对TMZ的反应明显增加。
实施例5
越过血脑屏障的TfRscFV脂质体
进行研究以测定在静脉内(i.v)注入之后，TfRscFV靶向的脂质体(scL)复合物(scL)是否可以越过血脑屏障(BBB)和靶肿瘤。通过颅内接种5×105个U87细胞，在裸鼠中诱导脑肿瘤。三周之后，给小鼠静脉内注入未复合的游离Cy5-ODN、scL-Cy5-ODN、或未配位的脂质-Cy5-ODN(无靶向部分；unL-Cy5-ODN)(25μg/小鼠)(2只小鼠/组)。注入后二十四小时，使小鼠安乐死，并且使用MaestroTM体内荧光成像系统使携带肿瘤的脑成像。使用MaestroTM软件比较脑肿瘤的荧光强度。静脉注入scL-Cy5-ODN明确地在脑肿瘤中产生强的荧光信号(图4A)。相比之下，在注入游离的Cy5-ODN或unL-Cy5-ODN之后，在肿瘤中仅观察到低水平的荧光。这种结果证明了scL越过BBB和有效输送有效负载至脑肿瘤的能力。
实施例6
与游离的、未包囊的TMZ比较，scL-TMZ在脑癌的动物模型中的疗效
通过立体定位接种稳定带有荧光素酶基因的U87MG-luc2细胞，在5至6周龄无胸腺雌性裸鼠中诱导颅内GBM肿瘤。接种后七至十天，通过使用Xenogen IVIS体内成像系统(Caliper Life Sciences)的生物发光来评价肿瘤，并且将小鼠平均分成治疗组。治疗始于随机化的那天(第0天)。经由尾静脉给动物静脉内(i.v.)注入5mg/kg(每只小鼠每次注入)的单独TMZ或TfRscFv靶向的TMZ阳离子脂质体复合物(scL-TMZ)。如上在实施例1至2中所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1:1的脂质:TMZ摩尔比(脂质体浓度=2mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备scL-TMZ复合物。每周两次给小鼠注入每种试剂持续5周。对照动物(媒介物)仅接受脂质体(无TMZ、无TfRscFv)。在这项研究期间，发现静脉内注入小鼠的scL-TMZ复合物的大小是平均约100.5+14.7nm(数均)(平均值+均方差)。
评估体内疗效：基于肿瘤生长的变化、体重变化和总存活率评价对治疗的体内反应。在指定日期的治疗之前、期间和之后，通过使用Xenogen IVIS体内成像系统的生物发光成像(BLI)来监视肿瘤生长。当用基质荧光素治疗时，将U87MG-luc2细胞基因改造以表达导致生物发光信号发射的荧光素酶基因。测量脑肿瘤的生物发光强度，所述生物发光强度是肿瘤大小/生长的一种量度，并且在治疗组之间进行比较。治疗到一半时(小鼠接受用每种试剂的治疗3周之后)，所有动物用磁共振成像(MRI)扫描以评价脑肿瘤。动物成像是利用7T BrukerBiopsin(Billerica,MA)，使用呼吸门控的(BioPac生理学数据监视器)T1-加权的二维涡轮多层多回波成像序列来进行。根据MRI计算出肿瘤体积，并且在治疗组之间进行比较。每周监视体重变化。通过Kaplan-Meier方法记录和绘出总存活率。
图4B示出scL-TMZ与游离的未包囊的TMZ对颅内U87MG-luc2成胶质细胞瘤肿瘤异种移植的体内抗肿瘤疗效的比较。在治疗开始之前和再次在小鼠接受3周的治疗(6次注入)之后，使用MRI使脑肿瘤成像。勾勒出轮廓的区域指示成胶质细胞瘤肿瘤。如所预料的，经过这3周的时间，对照小鼠的肿瘤明显地生长得更大。因为已知这种细胞系对TMZ反应，所以预料了一些肿瘤生长抑制并且在接受游离的TMZ的小鼠中明显可见一些肿瘤生长抑制。然而，在接受scL-TMZ的动物中，不仅明显可见肿瘤生长抑制，而且还出现肿瘤消退，甚至经过这种短期的治疗也是如此，从而暗示出scL-TMZ作为治疗剂的效果增加。这是出人意料的结果。
在图5中用图形示出所有三组动物的肿瘤大小的比较，并且示出用scL-TMZ治疗的小鼠的一致的显著反应和小的肿瘤大小。
图6示出从治疗前起历经治疗时间再到治疗后，经由来自每组的代表性动物的Xenogen的BLI成像。与肿瘤大小相关的生物发光信号的强度在彩色图中示出：红色=较强的信号，紫色=较弱的信号。游离的TMZ(用于脑肿瘤的目前施用方法)能够控制肿瘤生长约2.5周。然而，一旦在5周之后结束治疗，就会出现明显的肿瘤生长。事实上，甚至在治疗的第31天就会复发。相比之下，在用scL-TMZ治疗的动物中，不仅在整个治疗中和治疗后维持了肿瘤生长抑制，而且在治疗结束之后至少2周仍持续观察到肿瘤消退的意外结果(见第51天)。图7示出结果的其它比较。来自图6中小鼠的BLI信号强度的图形表示在图8中示出(在图形底部的条柱指出治疗的持续时间)。对于每个组中所有小鼠的信号强度随时间变化的类似曲线图在图9中给出。再一次，在scL-TMZ治疗的组中，在治疗结束之后，肿瘤没有复发的意外结果是明显可见的。这是出人意料的，因为肿瘤复发是所有类型的癌症(包括脑癌)中常见的问题。
在治疗期间和治疗后，通过体重测量来示出scL-TMZ治疗没有毒性(图10)。在媒介物(第21天)组和游离的TMZ(第51天)组中动物的重量急剧减轻是由晚期的疾病状态引起的。与这些其它的组比较，在实验过程期间，用scL-TMZ治疗的动物没有显示体重的减轻，并且甚至在治疗结束时体重增加了。这证明了这种方法没有毒性。
在本实验中动物的长期存活率在Kaplan–Meier曲线图中示出(图11)。第30天，媒介物组中的所有小鼠均死亡。虽然与对照组比较，游离的TMZ延长了这些小鼠的寿命，但用scL-TMZ治疗之后，与游离的TMZ组比较，长期存活率明显增加。
在第二个实验中，比较了如本文所述来制备的scL-TMZ每周注入的不同剂量/次数。在以下条件下，给携带U87MG-luc2成胶质细胞瘤颅内异种移植肿瘤的小鼠组静脉内尾静脉注入scL-TMZ5周：2.5mg/kg，每周注入一次；5mg/kg，每周注入一次；或5mg/kg，每周注入两次，并且测定存活率。图12中的Kaplan-Meier曲线图示出剂量依赖反应，并且甚至在5mg/kg的剂量下进行单次注入就可以延长携带颅内脑肿瘤的小鼠的寿命。此外，如果每周的注入次数增加，那么以较低剂量的TMZ来注入也可以是有效的。
结果概述：与用游离的TMZ治疗比较，用scL包囊的TMZ的静脉内治疗对通过MRI或BLI监视的肿瘤生长产生可靠的抑制，并且延长了颅内U87MG-luc2GBM肿瘤异种移植模型中的存活。然而，与游离TMZ治疗的动物的那些结果比较，在scL-TMZ治疗的动物中，没有观察到通过体重变化而评估出的毒性的明显增加。此外，出人意料的结果是：在治疗已经结束之后，维持了肿瘤反应(包括肿瘤退化)至少2周。
实施例7
在癌干细胞和分化癌细胞中，通过scL-TMZ的细胞凋亡的体内诱导
如上所述，在5至6周龄无胸腺雌性裸鼠中诱导颅内U87MG-luc2肿瘤。在孵育之后三周，随机地将携带肿瘤的小鼠分组，并且开始治疗。经由尾静脉给动物静脉内注入5mg/kg(每只小鼠每次注入)的单独TMZ或包囊在靶向肿瘤的脂质体复合物中的TMZ。如上所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1∶1的脂质:TMZ摩尔比(脂质体浓度=2mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备scL-TMZ复合物。对照动物(媒介物)仅接受脂质体(无TMZ、无TfRscFv)。在这种研究期间，发现静脉内注入小鼠的、如上所述来制备的scL-TMZ脂质体的大小是平均85.5+4.96nm(数均值)(平均值+均方差)。
每周治疗小鼠两次。在接受3次注入之后，使所有动物安乐死，并且收获脑。从正常脑组织中小心地将脑肿瘤剖切下来，并且称重。通过评估细胞凋亡的水平来评价体内抗肿瘤疗效。在称重肿瘤之后，通过在37℃下，在含有1mg/mL胶原酶(Roche)和2mmol/L DNA酶I(Sigma)的Hank’s平衡溶液中胶原酶消化1h，从肿瘤中获得单细胞悬浮液。将分级的细胞通过70μm的细胞滤器(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)，并且用PBS洗涤。为了测定细胞凋亡的水平，用针对分裂半胱天冬酶-3(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)和人CD133(Miltenyi Biotec)的抗体来染色单细胞。标记的细胞通过在BDFACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)上的流式活化细胞分选(FACS)来分析。
评估体内疗效：通过评价颅内U87MG-luc2脑肿瘤中细胞凋亡的诱导来评估抗肿瘤疗效。在3次静脉内注入媒介物(仅脂质体、无TMZ、无TfRscFv)、游离的未包囊的TMZ或scL-TMZ之后的脑肿瘤的重量在图13中示出。出人意料地，甚至在仅注入三次之后，游离的TMZ与scL-TMZ之间的肿瘤大小就有明显的差异。
癌干细胞(CSC)常常是肿瘤复发和抗化疗的原因。由于以上描述的出人意料的发现，其中在用scL-TMZ(而不是用游离的TMZ)治疗结束之后，观察到肿瘤生长抑制和甚至消退，在这些肿瘤中的癌干细胞以及在分化的癌细胞(非CSC)中评估细胞凋亡的水平。图14示出用于细胞凋亡的水平的流式细胞检测分析的结果，所述水平是通过从脑肿瘤中分离出的单细胞的分裂半胱天冬酶-3抗体染色来测定。CD133是一种GBM癌干细胞(CSC)的标记物，其被用于区分CSC和分化的癌细胞。与游离的TMZ比较，CSC群体(CD133+)清楚地示出经历细胞凋亡的细胞的百分数明显增加。因此，scL-TMZ可靶向和有效转染CSC，从而引起明显的肿瘤细胞死亡。
结果概述：在颅内U87MG-luc2GBM肿瘤异种移植模型中，与用游离的TMZ治疗的那些结果比较，用scL-TMZ的静脉内治疗产生了通过肿瘤重量而证明的肿瘤生长的明显抑制。另外，用scL-TMZ的静脉内治疗不仅在CD133-分化的癌细胞中，而且在CD133+CSC中引起对细胞凋亡诱导的明显增加。
实施例8
scL-TMZ在抗TMZ的脑癌细胞系T98G皮下异种移植肿瘤中的体内疗效
已知T98G GBM肿瘤细胞是对用TMZ的治疗有抗性的。针对抗TMZ的GBM肿瘤模型，使用了皮下T98G异种移植。通过在尾巴以上腰背部上(每只小鼠两个部位)，皮下注入T98G细胞或悬浮在基质胶胶原基膜(BD Biosciences,San Jose,CA)中的肿瘤颗粒，在无胸腺雌性裸鼠中诱导T98G异种移植肿瘤。当皮下T98G肿瘤达到约100至300mm3时，随机地将小鼠分组，并且用25或66mg/kg(每只小鼠每次注入)的游离TMZ或25mg/kg(每只小鼠每次注入)包囊在靶向肿瘤的复合物(1:1摩尔比)中的TMZ静脉内注入。如上所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1:1的脂质:TMZ摩尔比(脂质体浓度=8mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备scL-TMZ复合物。对照动物(媒介物)仅接受脂质体(无TMZ、无TfRscFv)。在这种研究期间，发现静脉内注入小鼠的、通过以上描述的方法来制备的scL-TMZ复合物的大小是平均130.8+13.5nm(数均值)(平均值+均方差)。连续5天，每天治疗小鼠一次。在最后一次注入之后48小时，使小鼠安乐死，并且收获肿瘤。治疗在第0天开始。
评估体内疗效：基于肿瘤生长变化、体重变化和细胞凋亡的诱导来评价T98G皮下肿瘤对用游离的TMZ或scL-TMZ复合物的治疗的体内反应。测量每个肿瘤的大小，并且绘制以mm3计的肿瘤体积(L×W×H)相对时间的曲线图。还在注入期间监视体重变化。通过TUNEL分析或用流式细胞法的分裂半胱天冬酶-3染色来评估细胞凋亡的水平，从而进一步评价体内疗效。在最后一次注入之后四十八小时，使小鼠安乐死，并且收获肿瘤。如上所述进行单细胞分离。为了测定细胞凋亡的水平，使单细胞染色用于TUNEL分析或用针对分裂的半胱天冬酶-3、人CD133和SSEA-1的抗体染色。已知SSEA-1是GBM肿瘤中CSC的标记物。通过FACS来分析被标记的细胞。
图15中示出经过这个短期时间后，肿瘤的肿瘤大小(以mm3计的体积数)。再一次，在25mg/kg下施用时，在接受游离的TMZ和scL-TMZ复合物的那些动物之间，这些抗TMZ肿瘤生长存在明显差异，在所述的动物中存在明显的肿瘤生长抑制。因为已知T98G肿瘤是抗TMZ的，所以TMZ可以控制肿瘤生长是新奇的和出人意料的。如上对于体内使用所讨论，抗性的这种反转是由于借助将靶向配体(蛋白质、抗体或抗体片段)结合至它在细胞上的配体并且经由被动方式或通过像受体介导的胞吞作用的主动运输机制来触发摄入，从而将TMZ有效负载有效的输送和摄入到肿瘤细胞中。这种方法用药物来“淹没”细胞，从而克服了肿瘤细胞在位修复由TMZ引起的DNA损坏的机制(如上调MGMT)，和/或将TMZ泵出细胞的机制。因此，肿瘤细胞并且因而肿瘤会死亡。基于这种体内数据，相同的机制在体内起作用，并且因此证明了scL-TMZ复合物作为抗癌试用于脑或其它肿瘤(包括目前抗TMZ的那些肿瘤)的潜在用途。经过本项短期的实验后体重变化最小，暗示出静脉内施用的scL-TMZ没有毒性(图16)。
在注入后8小时，通过从皮下T98G异种移植肿瘤中分离出的CD133+CSC和CD133-非CSC的TUNEL染色，评估来自已被静脉内注入66mg/kg(每只小鼠每次注入)的游离的TMZ或25mg/kg(每只小鼠每次注入)包囊在靶向肿瘤的复合物中的TMZ的动物的肿瘤中细胞凋亡水平。如在图17中所示，与包囊在scL中的TMZ的量比较，即使用超过两倍剂量的游离的TMZ来治疗动物，通过scL-TMZ诱导的细胞凋亡水平还是比在非CSC中的细胞凋亡水平高5倍以上，并且比在CSC中的细胞凋亡水平高8倍。
当通过来自相同皮下T98G脑肿瘤的SSEA-1+CSC的分裂半胱天冬酶-3抗体染色来评估细胞凋亡的水平时，获得类似的结果(图18)。SSEA-1是CSC的另一种标记物，其用于区分CSC和分化的癌细胞。这里，即使施用超过两倍量的游离的TMZ，scL-TMZ诱导的细胞凋亡水平还是比游离的TMZ高5倍(SSEA-1-)和9.5倍(SSEA-1+)。
结果概述：与用游离的TMZ的治疗比较，用scL-TMZ的静脉内治疗(在相同或甚至较低剂量的TMZ下)产生对抗TMZ的T98G肿瘤异种移植的生长抑制明显增强。然而，与游离的TMZ治疗的动物的那些结果比较，在scL-TMZ治疗的动物中，没有观察到基于体重变化而评估出毒性的明显增加。另外，用scL-TMZ的静脉内治疗不仅在CD133-和SSEA-1-分化的癌细胞中，而且在CD133+或SSEA-1+CSC中引起对细胞凋亡的水平明显增加。
这些结果证明了通过scL来输送TMZ可以诱导大规模的细胞凋亡，并且克服了肿瘤细胞(包括但不限于脑癌、多发性骨髓瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈部癌、肾癌、黑素瘤、胃癌)对这种药物的固有抗性。
实施例9
用于抗TMZ肿瘤的组合治疗
虽然一线化疗剂替莫唑胺(TMZ)已被证实对具有脑肿瘤的患者有益，它还是具有明显的限制治疗剂量的毒性(Villano JL、Seery T E和Bressler L R(2009)Temozolomide in Malignant Gliomas：CurrentUse and Future Targets.Cancer Chemotherapy and Pharmacology64：第647-655页)，包括骨髓抑制性。因此，用以肿瘤靶向TMZ以使得它被明确地并有效地输送至脑中的肿瘤细胞并且被脑中的肿瘤细胞吸收，从而减少非特异性毒性的方法，将对目前适合使用这种药物的那些患者是相当有益的。
但是，即使被有效地输送至肿瘤细胞，将TMZ广泛用于成胶质细胞瘤和其它脑癌仍有一个重要缺点，就是相当百分比的肿瘤是抗TMZ的。这主要是由于O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)的过度表达，这种酶通过去除O6-鸟嘌呤加合物来修复TMZ诱导的DNA损伤(Mrugala MM、Adair J和Kiem H P(2010)Temozolomide：Expanding Its Role in Brain Cancer.Drugs of Today46：第833-846页)，因此使TMZ的治疗作用无效。因此，急需开发用以克服这种抗性的方法。
用于基因治疗的靶向肿瘤的scL-p53纳米复合物
如在美国专利号7,780,822中所述(所述专利的全部内容以引用的方式并入本文)，已经成功地开发了带有编码wtp53基因的质粒DNA的并经由TfRscFv(scL-p53)来靶向的输送系统。也已经开发了与化疗/放射组合使用的scL-p53，以便增加肿瘤对这些标准的治疗模态的反应。
虽然TMZ是用于治疗脑肿瘤的一线化疗剂，但仅一部分的GBM患者对这种药物反应。根据Stupp等的研究(Stupp R、Hegi M E、MasonW P、van den Bent M J、Taphoorn M J B、Janzer R C、Ludwin S K、Allgeier A、Fisher B、Belanger K、Hau P、Brandes A A、Gijtenbeek J、Marosi C、Vecht C J、Mokhtari K、Wesseling P、Villa S、Eisenhauer E、GorliaT、Weller M、Lacombe D、Cairncross J G以及MirimanoffR O(2009)Effects of Radiotherapy With Concomitant and AdjuvantTemozolomide Versus Radiotherapy Alone on Survival in Glioblastom ain a Randomised Phase III Study：5-Year Analysis ofthe EORTC-NCICTrial.Lancet Oncology10：第459-466页)，以及Hegi等的研究(HegiME、Diserens A、Gorlia T、Hamou M、de Tribolet N、Weller M、KrosJ M、Hainfellner J A、Mason W、Mariani L、Bromberg J E C、Hau P、MirimanoffR O、Cairncross J G、Janzer R C以及Stupp R(2005)MGMTGene Silencing and Benefit From Temozolomide in Glioblastoma.NewEngland Journal of Medicine352：第997-1003页)，在对TMZ治疗的反应方面鉴别出两组不同的患者：具有下调MGMT启动子并具有更好的预后的那些患者，和具有活性MGMT启动子并具有较差预后的那些患者。
因此，开发用以下调MGMT的方法可以增加对TMZ反应的患者的人数。已有许多的报道，这些报道指出增加wtp53表达可以下调DNA修复基因如MGMT的表达(Bocangel D、Sengupta S、Mitra S、Bhakat K.K(2009)P53-Mediated Down-Regulation of the Human DNARepair Gene O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase(MGMT)ViaInteraction With Sp1Transcription Factor.Anticancer Research；HarrisLC、Remack J S、Houghton P J以及Brent T P(1996)Wild-Type P53Suppresses Transcription of the Human O6-Methylguanine-DNAMethyltransferase Gene.Cancer Research56：第2029-2032页；Srivenugopal KS、Shou J、Mullapudi S R S、Lang F F、Rao J S以及Ali-Osman F(2001)Enforced Expression of Wild-Type P53Curtails theTranscription ofthe O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene inHuman Tumor Cells and Enhances Their Sensitivity to Alkylating Agents.Clinical Cancer Research7：第1398-1409页)。使用被证实是有效靶向原发性和转移性肿瘤并且越过BBB的scL-p53纳米复合物，应该是克服在相当百分比的GMB和其它肿瘤中观察到的MGMT诱导的抗TMZ性的有效方式，因此扩展了这种药物用在具有原发性和转移性脑肿瘤患者中的应用范围，并且改善了预后。此外，因为还评价了TMZ在其它非脑的难治或晚期的恶性肿瘤中使用，这些恶性肿瘤包括胰腺癌、神经内分泌癌以及消化道癌(Tentori L和Graziani G(2009)Recent Approaches to Improve the Antitumor Efficacy of Temozolomide.Current Medicinal Chemistry16：第245-257页)，所以用scL-p53的治疗将增大TMZ成为用于各种癌症的有效治疗剂的潜力。
scL-TMZ和scL-p53组合治疗
本文描述的是scL-TMZ与scL-p53的组合使用。用作单一疗法的scL-TMZ的开发将对目前适合TMZ治疗的患者来说是有益的。然而，组合的方法将具有甚至更大的治疗潜力。由于scL-p53而减少的肿瘤抗性以及由scL-TMZ的肿瘤靶向输送所产生的性质改进，都将引起目前对TMZ不反应的脑肿瘤(和可能其它的癌症)转变为反应性的。因此，这种方法有潜力被开发成新型、低毒性、更有效的治疗方案以便用于治疗GBM和其它癌症。
实验方法
设计实验来证明用于GBM的新型、更有效的治疗方案的开发，所述治疗方案单独使用scL-TMZ和将scL-TMZ与scL-p53组合使用。
人脑肿瘤细胞系和体内模型
以上描述了人脑癌细胞系U87MG和T98G。稳定表达荧光素酶基因的U87MG的一种型式已经从Caliper Life Sciences获得，将其用于体内研究中，其中肿瘤生长和反应将通过
成像系统Xenogen来监视。
成像试验
用于脑肿瘤的MR成像将在配备有100高斯/厘米微成像梯度并通过Paravision4.0软件来运行的具有20cm孔的7T Bruker Biopsin(Billerica,MA)水平光谱仪/成像仪上进行。如先前所述，成像方案是采用快速增强三维成像序列的T1-加权涡轮快速采集法(Haggerty T、Credle J、Rodriguez O、Wills J、Oaks A W、Masliah E以及Sidhu A(2011)Hyperphosphorylated Tau in an Alpha-Synuclein-OverexpressingTransgenic Model of Parkinson's Disease.European Journal ofNeuroscience33：第1598-1610页)。
证明单独的scL-TMZ和scL-TMZ与scL-p53组合的体内疗效
在这些研究中，U87-Luc正位颅内(TMZ敏感的)和T98G(抗TMZ的)皮下肿瘤模型将被用于检验单独的scL-TMZ和scL-TMZ与scL-p53组合对肿瘤生长和/或消退的作用。应注意的是，虽然U87MG具有wt p53，但是当U87颅内肿瘤用scL-p53与游离的TMZ组合来治疗时，观察到体内反应增加。小鼠组(6只小鼠/组/肿瘤模型)将以下的接受静脉内(尾静脉)注入：单独游离的TMZ、单独的scL-TMZ、单独的scL-p53、scL-p53加上游离的TMZ或scL-TMZ。未治疗的小鼠将当作对照物。p53剂量将是每次注入每只小鼠30μg，并且将在5mg/kg下使用TMZ。将这两种治疗每周施用两次，持续5周。通过T98G的大小和使用颅内肿瘤的Xenogen来评估肿瘤生长抑制/消退，其中将通过MRI来测定肿瘤体积。治疗前、治疗期间每周一次、以及在治疗已经结束之后立即进行Xenogen/MRI成像。治疗到一半时，从每组中的3只小鼠中取出肿瘤和各种的正常器官和组织，并且编号。每种组织的一半将用于在目标II中描述的分析，并且剩余部分通过组织学来检验细胞凋亡的标记物(Tunnel，半胱天冬酶-3)和增殖标记物Ki67。治疗已经结束之后的第一天，人道地使3只小鼠安乐死，并且通过商用的CRO(BioReliance,Rockville MD)来尸体剖检，以便寻找与TMZ相关的骨髓毒性作用和淋巴细胞减少的差异。
体外结果
为了验证用scLp53的治疗可以下调MGMT活性，并且使抗TMZ的脑肿瘤对这种药物敏化的假设，进行了初步的XXT细胞存活率分析。将抗TMZ的T98G细胞按每个孔2×103下接种在96孔板中，并且用scL-p53与游离的TMZ或scL-TMZ组合来转染。也只用游离的TMZ或只用scL-TMZ来转染细胞。90h后进行XTT分析，并且测定IC50值(产生50%生长抑制的浓度)。在这种已知的抗TMZ细胞系中，与单一试剂TMZ比较，用scL-p53与游离的TMZ或scL复合的TMZ组合的转染引起反应水平的增加(Patil R、Portilla-Arias J、DingH、Inoue S、Konda B、Hu J W、Wawrowsky K A、Shin P K、Black KL、Holler E以及Ljubimova J Y(2010)Temozolomide Delivery toTumor Cells by a Multifunctional Nano Vehicle Based onPoly(Beta-L-Malic Acid).Pharmaceutical Research27：第2317-2329页)(图19)。此外，与单独游离的TMZ比较，用scL-TMZ纳米复合物的转染导致对药物的明显化学增敏水平。
实施例10
在小鼠脑肿瘤模型中通过全身性施用的scL复合物来体内靶向癌干细胞
通过皮下接种U251细胞，在裸鼠中诱导人脑肿瘤异种移植。三周后，给小鼠静脉内注入以下述形式施用的6FAM-ODN(每只小鼠100μg)：未复合的游离6FAM-ODN、scL-6FAM-ODN(scL-ODN)、或未配位的脂质-6FAM-ODN(无靶向部分的脂质体)(脂质-ODN)。注入后24小时，使用MaestroTM体内荧光成像系统来使肿瘤成像，以便测定肿瘤中荧光的水平。在MaestroTM成像之后，通过酶消化从肿瘤中分离出单细胞，并且通过FACS分析和量化在CD133+(癌干细胞(CSC))和CD133-(非CSC)细胞中摄入的6FAM-ODN的量。全身性施用游离的6FAM-ODN和未配位的脂质-ODN在肿瘤中均产生非常少的(如果有的话)荧光。相比之下，在来自接受scL-ODN纳米复合物的小鼠的肿瘤中，明显可见强荧光信号(图20)。
更重要地，这种明显的差异还反映在CSC的转染率中(图21)。然而用游离的或未配位的6FAM-ODN转染了小于10%的CSC和非CSC细胞，>60%的CSC和非CSC细胞群体证明了在静脉内注入之后存在有效负载。灰色的直方图代表未治疗的对照物。这些发现确认了在全身性施用时，本文描述的scL输送系统可以在体内靶向并有效输送有效负载至CSC。
实施例11
在全身性施用之后，通过scL输送的ODN在IC GBM中肿瘤特异性靶向CSC
图22示出在颅内U87MG-luc2多形性成胶质细胞瘤(GBM)脑肿瘤的动物模型中，通过靶向肿瘤的复合物、非靶向的复合物所输送的有效负载、以及无输送系统的有效负载本身的体内输送效率的比较。将荧光标记的(Cy5)寡核苷酸(Cy5-ODN)包囊在肿瘤靶向的复合物(scL-Cy5-ODN)中(如在美国专利号7,780,882中所述来制备)或无靶向肿瘤的配体的复合物(脂质-Cy5-ODN)中。将二十五微克的Cy5-ODN(游离的，或用或不用靶向部分来包囊的)静脉内注入携带U87MG-luc2颅内肿瘤的每个动物。在注入之后60小时，使动物安乐死，并且收获肿瘤，以便通过使用癌干细胞的标记物(CD133和SSEA)的流式细胞法来评估在这些颅内肿瘤中输送至癌干细胞(CSC)的效率，这两种标记物是熟悉本领域的技术人员所知的一般标记物CSC(CD133+)和脑肿瘤中标记物CSC(SSEA-1+)。从脑肿瘤中分离出单细胞，并且在用CSC标记物抗体(CD133+或SSEA-1+)染色之后，进行FACS分析。图22中每个直方图中的曲线的位移代表在癌干细胞中的Cy5-ODN摄入。只有代表从接受scL-Cy5-ODN的小鼠中分离CSC的曲线证明了明显的位移，这暗示出在脑肿瘤中，游离的Cy5-ODN、或脂质-Cy5-ODN(无靶向部分)都不能有效地转染CSC。
实施例12
通过scL-p53使脑肿瘤细胞对替莫唑胺(TMZ)体外敏化
为了评估scL输送的wtp53使脑肿瘤细胞对一线化疗剂TMZ敏化的能力，用单独的TMZ或TMZ加上scL-p53的组合来治疗从人脑肿瘤获得的U87和U251细胞(如在美国专利号7,780,882中所述)。作为对照，还用TMZ与scL输送系统的组合来治疗细胞，所述scL输送系统带有用于构建pSCMVp53质粒，但无p53插入体的相同载体(scL-vec)。将细胞接种在96孔板中，并且随后用scL-p53或scL-vec处理24小时。转染后6小时，以递增浓度添加TMZ。在添加TMZ至孔后144h，进行XTT分析，并且测定IC50值(产生50%生长抑制的浓度)。因为已知这两种细胞系是对TMZ敏感的，所以对单独的TMZ存在一些反应并不意外。然而，如在图23中所示，当与用于两种细胞系的单独的TMZ比较时，用通过scL输送系统所输送的wtp53转染细胞时，对TMZ的敏化作用明显增加。对于带有空载体的复合物，观察到最小至无的敏化作用(分别是U87和U251)，这证明了所述作用是归因于p53而并不是输送系统。
然而，因为只有一部分的脑肿瘤患者对TMZ反应，所以评估scL-p53使抗TMZ的肿瘤对这种化疗剂敏化的能力更为关键。因此，为了评估scL输送的wtp53使抗TMZ脑肿瘤细胞对这种一线化疗剂敏化的能力，用单独的TMZ或TMZ加上scL-p53的组合来治疗从人脑肿瘤获得的LN-18和T98G细胞(图23)。作为对照，还用TMZ与scL输送系统的组合来治疗细胞，所述scL输送系统带有用于构建pSCMVp53质粒，但无p53插入体的相同载体(scL-vec)。将细胞接种在96孔板中，并且随后用scL-p53或scL-vec处理24小时。转染后24小时，以递增浓度添加TMZ。在添加TMZ至孔后72h，进行XTT分析，并且测定IC50值(产生50%生长抑制的浓度)。如在图23中所示，对于LN-18细胞，在用scL-p53转染之后，现在这些抗TMZ的细胞对甚至非常低剂量的TMZ都有反应。与单独的TMZ比较，在低达约50μM的TMZ剂量下，超过50%的细胞被杀死，在使用单独的TMZ时，直到约1000μM的剂量才观察到明显的细胞死亡。对于T98G(图23)，虽然在用scL-p53治疗之后，不能如同LN-18一样对TMZ反应，但这些高抗性细胞还是对这种药物的杀伤作用敏化。在暴露于TMZ之前，用scL-p53治疗的细胞具有600μM的IC50，而仅接受TMZ的那些细胞直到约2000μM的TMZ剂量才能达到IC50。如上，在用对照scL-vec转染之后，使细胞对TMZ反应的作用最小或没有作用，这暗示了这些抗性的细胞系中的反应是归因于wtp53的存在。
实施例13
通过全身性施用的scL-p53使脑肿瘤细胞对替莫唑胺(TMZ)体内敏化
通过用scL-p53加TMZ的组合的全身性治疗来诱导脑癌的颅内
(IC)小鼠模型中的肿瘤消退
进行实验来检测通过全身性施用如在美国专利号7,780,882中所述来制备的scL-p53而使IC脑肿瘤对TMZ敏化所诱导的肿瘤生长抑制。U87MG-Luc异种移植脑肿瘤是在裸鼠中通过颅内接种U87MG-luc细胞来诱导。从Caliper Life Sciences获得的这种细胞系已经被改性来稳定表达荧光素酶基因。接种后10天，给携带肿瘤的动物静脉内(尾静脉)注入单独的TMZ(每次注入5.0mg/kg)、单独的scL-p53(每只小鼠每次注入30μgDNA)或与scL-p53组合的TMZ。作为对照，一个组接受PBS(媒介物)。每周2次施用所有的静脉内注入直到总共注入10次。为了评估肿瘤反应，使用
成像系统的Xenogen来进行生物发光成像(BLI)。图24是各个组的体内抗肿瘤疗效的比较。与肿瘤大小相关的生物发光信号在彩色图中示出。红色(在标尺的顶部)：较强的信号，紫色(在标尺的底部)：较弱的信号。使用Xenogen活体成像
软件，比较了组群之间的脑肿瘤的生物发光强度，所述生物发光强度是肿瘤大小/生长的一种量度，并且在图25中绘出随时间变化的图。水平条指出治疗的持续时间(最后的治疗=第24天)。
虽然在治疗期间，单独的TMZ和单独的scL-p53对IC肿瘤生长具有一些最小的作用，但在治疗结束之后，两组中的肿瘤大小都迅速增加。相比之下，在治疗期间，接受scL-p53与TMZ组合的小鼠组中的肿瘤不仅表现出肿瘤生长抑制，而且表现出肿瘤消退。更重要地，在治疗已经结束之后，这种消退还持续了超过20天。
为了确认生物发光的结果，还在小鼠接受3周的治疗之前和之后，通过MRI(无造影剂)来使小鼠成像。在组合治疗组中通过生物发光观察到的肿瘤消退也在这里观察到。在图26中，轮廓指出了成胶质细胞瘤肿瘤。明显可见的是，在单一试剂治疗组中明显可见治疗后大小的增加，取而代之，几乎不会在接受scL-p53和TMZ的这些动物中检测到任何残留肿瘤。因此，本实验证明了存在scL输送的wtp53可以使GBM肿瘤对TMZ敏化，从而引起明显的肿瘤反应(消退)，而不只是肿瘤生长抑制。
在用scL-p53与TMZ的组合治疗之后，携带颅内GBM肿瘤的
小鼠的存活率明显增加
因为以上实验证明了明显的肿瘤反应，包括治疗后的消退，接下来评估这种组合治疗对存活率的作用。如上所述，在裸鼠中诱导U87MG-Luc异种移植脑肿瘤。接种后10天，给携带肿瘤的动物静脉内(尾静脉)注入单独的TMZ(每次注入25.0mg/g)、单独的scL-p53(每只小鼠每次注入30μgDNA)(如在美国专利号7,780,882中所述来制备)或与scL-p53组合的TMZ。作为对照，一个组接受PBS(媒介物)。每周2次施用所有的静脉内注入直到总共注入10次。每周监视动物2至3次，并且当濒临死亡时，使动物安乐死。在图27和下表1中示出通过Kaplan-Meier方法分析的结果。在图27中的灰色条柱指出治疗的持续时间。虽然单独的TMZ能够在这种TMZ反应的细胞系中延长存活一段时间，但所有小鼠到约第155天都死于它们肿瘤，中值存活112天。然而，通过将scL-p53添加至治疗方案显著地延长了存活时间。在这些动物中，60%的小鼠在第210天仍然存活。因此，对于接受这种组合方案的小鼠的存活率延长百分比是未被治疗的小鼠的>740倍，是用单独的scL-p53时的500倍，并且是用单独的TMZ时的几乎两倍。因此，这样将scL-p53添加至用TMZ的治疗引起长期存活率的明显增加。
表1
*测定为未被治疗的GBM异种移植的中值存活的比例
在用scL-p53与TMZ的组合治疗之后，携带抗TMZ的颅内GBM
肿瘤的小鼠的存活率明显增加
以上描述的体外研究暗示出通过scL-p53的转染，可以使抗TMZ的脑肿瘤细胞的转染对TMZ敏化。因此，进行实验来评估携带由抗TMZ的人GBM细胞系T98G得到的颅内肿瘤的小鼠的存活率。给无胸腺裸鼠颅内接种T98G人成胶质细胞瘤细胞系。在接种之后十天，通过MRI使动物成像，并且平均分成3组。在成像之后立即开始治疗。连续14天，每天用100mg/m2的TMZ静脉内治疗动物一次，每周静脉内施用scL-p53(每次注入30μgDNA)(如在美国专利号7,780,882中所述来制备)两次，施用2周，或两种治疗的组合。监视存活率。在图28中示出通过Kaplan-Meier方法分析的结果。指出了每个组的在第14天的每组小鼠存活数目。经过这2周时间的治疗，在接受作为单一试剂的TMZ或scL-p53的两个组中，大量的动物死于它们的疾病。相比之下，接受组合治疗的小鼠有五分之四仍然存活。因此，这种小疗效实验确认了体外数据，并且暗示出用scL-p53的治疗可以使先前有抗性的GBM肿瘤对TMZ敏化。
实施例14
通过scL-p53与TMZ的组合，增强颅内脑肿瘤中的细胞凋亡
已知肿瘤抑制基因p53在细胞凋亡路径中起作用。为了开始评价在使用scL-p53与TMZ的组合时观察到的引起肿瘤细胞反应增加和动物存活率增加的机制，使用膜联蛋白V-FITC和流式细胞计来测定各种治疗之后，在颅内U87MG-luc2脑肿瘤中诱导的细胞凋亡的水平。如上所述诱导U87MG-luc2脑肿瘤。接种细胞后10天，用单独的TMZ(每只小鼠每次注入5mg/kg，每周注入2次)、单独的scL-p53(每只小鼠每次注入30μg DNA，每周注入2次)(如在美国专利号7,780,882中所述来制备)或scL-p53与游离的TMZ的组合来治疗小鼠。在每个动物接受了总共3次注入之后，使动物安乐死，从肿瘤中分离出单细胞群体，并且进行膜联蛋白V分析。
如在图29中所示，在用scL-p53与TMZ的组合治疗之后，与任一种单独的治疗比较，细胞凋亡中肿瘤细胞的百分比明显增加。因此，这些结果暗示出通过IC肿瘤摄入全身性施用的scL-p53引起对化疗剂TMZ的细胞凋亡反应的增强。
实施例15
用scL-p53治疗抗TMZ的GBM肿瘤体外和体内下调了MGMT表达
抵抗TMZ的主要机制是O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)的过度表达，这种酶通过去除O6-鸟嘌呤加合物来修复TMZ诱导的DNA损伤。因此，下调MGMT活性的方法将增强TMZ的治疗效果。许多报道已经指出增加wtp53表达可以下调DNA修复基因(如MGMT)的表达，并且增加肿瘤细胞对烷基化剂(如TMZ)的敏感度。在以上实施例中描述的体外和体内的数据暗示出，用scL-p53的治疗可以在脑肿瘤细胞中反转对TMZ的抗性。这种敏化作用的一个可能机制是MGMT的p53依赖性下调。检测了scL输送的wtp53的摄入，以便测定它是否对体外抗TMZ的T98G人成胶质细胞瘤细胞中的MGMT表达水平和在体内皮下异种移植肿瘤中的MGMT表达水平有作用。用scL-p53(如在美国专利号7,780,882中所述来制备)转染T98G细胞。转染后16和24小时，收获细胞，分离蛋白质，并且使用Nu-PAGE预制4%至12%梯度凝胶对40μg(微克)总蛋白进行电泳分级，转移至硝化纤维素膜，并且通过蛋白质印迹分析探测MGMT和GAPDH的表达。通过ECL试剂来检测信号(图30)。
对于在图30中示出的体内实验，在24小时期间静脉内注入scL-p53(每只小鼠每次注入30μgDNA)三次。在最后的scL-p53治疗后16和24小时，使小鼠安乐死，收获肿瘤，并且提取蛋白质。在每个时间点对四只小鼠进行收获。作为对照的一个组不接受SGT-53。使用Nu-PAGE预制4%至12%梯度凝胶对40μg(微克)总蛋白进行电泳分级，转移至硝化纤维素膜，并且通过蛋白质印迹分析探测MGMT和GAPDH的表达。通过ECL试剂来检测信号。
体外，到16小时时，完全下调了MGMT表达，这在转染后持续了长达24小时。类似地，在体内研究中，在16小时明显可见MGMT的表达明显减少，并实际上消除了这些动物中的两只动物中的蛋白质。到最后注入后的24小时时，在用SGT-53治疗的所有小鼠中都明显可见MGMT的实际上完全下调。GAPDH蛋白的一致表达证明了相等的蛋白质负载量。在这些肿瘤中缺乏MGMT来修复由TMZ所诱导的DNA损坏，连同异源SGT输送的wtp53对细胞凋亡路径的积极作用，都可能对克服T98G对TMZ的杀伤作用的抗性。
更重要地，在具有T98G的颅内肿瘤模型中观察到类似的结果(图31)。在本项实验中，仅静脉内注入scL-p53(以每只小鼠30μgDNA)一次。在scL-p53注入之后的16与72小时之间的各个时间点，使小鼠安乐死，收获肿瘤，并且提取蛋白质。作为对照的一个组(UT)不接受SGT-53。使用Nu-PAGE预制4%至12%梯度凝胶对40μg(微克)总蛋白进行电泳分级，转移至硝化纤维素膜，并且通过蛋白质印迹分析探测p53、MGMT和GAPDH的表达。通过ECL试剂来检测信号。
在静脉内注入单一scL-p53之后的16和24小时，与UT动物比较，明显可见p53蛋白质的水平明显增加，这暗示出存在异源p53。到43和72小时时，这种信号减回至类似于UT对照的水平。更重要地，如对于皮下肿瘤所观察，在用scL-p53治疗之后的43和72小时，在这些颅内肿瘤中均观察到MGMT的表达明显减少。对于在MGMT信号中观察到减小的这个时机与p53通过干扰DNA修复机制来使在细胞对TMZ敏化的作用机制一致。
实施例16
具有成胶质细胞瘤或胶质肉瘤的患者中的scL-p53与TMZ的组合治疗
替莫唑胺的标准施用需要将日剂量的替莫唑胺施用21天。为了最佳化scL-p53的潜在化学增敏作用的效率，在优选的实施方案中，将在替莫唑胺治疗前1天开始scL-p53治疗。临床前研究已经证实：通过scL-p53复合物所输送的wtp53肿瘤抑制基因起到使肿瘤对化疗剂敏化的作用，从而使它们对药物具有更多的反应。因此，当施用替莫唑胺时，为了获得scL-p53的益处，p53表达是关键。使用在图中示出的建议时间计划，scL-p53在替莫唑胺治疗开始时就被表达。
在一个替代实施方案中，在替莫唑胺治疗开始之前，将施用两种scL-p53治疗。这里，scL-p53将根据图33的表中指出的相同时间计划在第1天开始施用。然而，第一种TMZ治疗将直到第6天才开始。每天(包括周末)以100至250mg/m2口服施用替莫唑胺，施用21天(从第6天至第26天)。
实施例17
制备包含美法仑(MEL)的靶向阳离子脂质体
材料：
DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷，盐酸盐)
-从Avanti Polar Lipids,Inc.获得，目录号(#)890890E MW698.55
-浓度：25mg/mL乙醇溶液
在使用之前，用无水乙醇稀释脂质至20mg/ml
DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺)
-从Avanti Polar Lipids,Inc.获得，目录号(#)850725E MW744.04
-浓度：25mg/mL乙醇溶液。
在使用之前，用无水乙醇稀释脂质至20mg/ml
美法仑盐酸盐(Mel)，粉末(M Wt=341.7)
-从Sigma获得，M2011-100mg，
-溶解在无水乙醇中至50mg/ml的浓度，具有10μL至15μL的6N HCl以帮助溶解。
超纯、无内毒素的LAL试剂水(例如BioWhittaker，目录号(#)W50-500，内毒素<0.005EU/ml)
注入器：汉密尔顿(Hamilton)气密注射器，具有22号针头，部件#81365)的1ml(汉密尔顿#81230)
程序：
1.每次通过将美法仑溶解在无水乙醇中至50mg/ml(146.3mM)的浓度，并添加6N HCl(约10μL至15μL)，通过高速涡旋直到溶解(必须是澄清的)来制备新鲜的美法仑溶液。在室温下保持直到用于与脂质混合(以下步骤3)。
2.在37℃下将脂质溶液放置10min至15min，接着将脂质溶液放置于65℃水浴中，并偶尔摇动5min。
3.为了制备脂质-美法仑：将具有搅拌棒的棕色玻璃瓶放置于被设置在50℃至60℃的热板上。当在无飞溅的高速下搅拌时，按以下顺序(重要的)将脂质和美法仑添加至瓶中：
对于1:1(脂质:美法仑)摩尔比
DOTAP 175μl(的20mg/ml)=5μmol或3.5mg
DOPE 187.5μl(的20mg/ml)=5μmol或3.75mg
添加美法仑溶液，68.3μl(的50mg/ml)=10μmol，
在已经添加了所有3种组分之后，继续搅拌3min。
4.同时，在具有搅拌棒的棕色玻璃瓶中，在水浴中将4,569μLLAL水温热至65℃。在添加脂质-美法仑溶液之前，立即将瓶移至热板(50℃至60℃)。在无飞溅的高速下搅拌水，搅拌几秒，以便从搅拌棒上去除气泡。
5.将所述水保持在热板上。在脂质添加期间，在高速(无飞溅)下连续搅拌水。如上(步骤2)混合脂质与美法仑之后，立即并且尽可能快地使用用于注入的汉密尔顿注射器，将混合物注入热板(50℃至60℃)上的热水中直接进入涡旋的中心。在添加脂质混合物同时宽松地遮盖之后，在高速(无飞溅)下继续搅拌1min。
6.将玻璃瓶移至室温搅拌板，并且继续缓慢地搅拌直到被宽松遮盖的溶液冷却至20℃至25℃(室温)。
7.用室温LAL水将体积调至5ml。
8.使用0.22μm孔的Milex GV过滤器过滤溶液。
9.如果需要的话，则测量粒径和ζ电势。
这些制备方法的结果证明了脂质体具有约20nm至60nm的粒径和约10mV至50mV的ζ电势。
实施例18
制备没有化学偶联(通过简单混合)的含有美法仑的靶向的阳离子脂质体(scL/美法仑)
使用根据上述程序来制备的包含美法仑的阳离子脂质体，通过简单混合组分并且没有化学偶联来制备如本文所述的配体靶向的美法仑阳离子脂质体复合物。根据以下一般程序制备所述复合物：
向对于脂质体-水(或缓冲液)，添加适当量的靶向部分以给予所需的比例，并且通过轻轻倒置混合5至10秒。靶向部分可以是配体，其包括但不限于转铁蛋白或叶酸酯、或其它蛋白质。靶向部分还可以是靶向细胞表面受体的抗体或抗体片段，其包括但不限于转铁蛋白或HER-2受体(例如，TfRscFv)。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。为产生所需的最终体积，将靶向部分-脂质-美法仑掺合物与得到所需的体积需要的任何体积(包括零体积)的水(适合地去离子水)或任何pH的缓冲液(包括但不限于Tris缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲盐水)混合，并且轻轻倒置5至10秒来混合。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。
通常，用于体外分析时，希望的是最终复合物中美法仑的量是在每个孔约1μM至30μM的范围内；用于体内用途时，希望每次注入提供约1mg/kg至约50mg/kg的美法仑。用于体内时，最后添加右旋糖或蔗糖至约1%至50%(V:V)最终浓度的右旋糖或蔗糖，适合地5%右旋糖或10%蔗糖，并且通过轻轻倒置来混合5至10秒。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。
在1:30(抗体片段:脂质体，w:w)的适合比例和1:1脂质体:美法仑(摩尔比)下，针对体外转染的具体实施例如下：对于大致600μL的最终体积，将250μL的脂质:TMZ(2mM原料)与56.7μL的抗体片段(在0.21mg/mL的抗转铁蛋白受体单链抗体片段[TfRscFv]浓度下)混合。添加293.3μL的水或缓冲液。
通过所述方法来制备的最终复合物的大小(数均值)是在约10nm至800nm之间、适合地约15nm至400nm、最适合地约20nm至200nm，并具有如通过使用Malvern电位仪ZS的动态光散射所测定的介于约1mV与100mV之间、更适合地5mV至60mV，并且最适合地10mV至50mV的ζ电势。这种大小足够小，可以有效地通过肿瘤毛细血管床或越过血脑屏障，并且到达肿瘤细胞。
如上述来制备的、含有右旋糖或蔗糖(1%至50%，体积比体积)的复合物还可以被冻干至干燥，并且在室温、2℃至8℃、或-20℃至-80℃下存放。在使用前，用水重构样品。重构后的最终冻干复合物的大小(数均值)是在约10nm与800nm之间、适合地约15nm至400nm、更适合地约20nm至200nm，并且最适合地50nm至150nm，并具有如通过使用Malvern电位仪ZS的动态光散射所测定的约1mV至100mV之间、更适合地5mV至60mV、并且最适合地10mV至50mV的ζ电势。这些复合物保留了至少80%的原始生物活性。
实施例19
与游离的(未包囊的)美法仑比较，脂质/美法仑对肿瘤细胞的作用增加
如上所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1:1和0.75:1(大小分别=30nm和25nm)的脂质:美法仑摩尔比(脂质体浓度=2mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备scL/美法仑复合物。scL/美法仑纳米复合物的大小分别是45和57nm。在KMS-11细胞中，将scL/美法仑的体外细胞杀伤能力与游离的、未包囊的美法仑比较。
对于这些体外细胞存活率研究，使用了人多发性骨髓瘤细胞系KMS-11。这些是非粘附细胞，并且在悬浮液中生长。使2.6ml的无血清培养基中的4×105个细胞在具有400μl的scL/美法仑(在任一比例下)或未包囊的美法仑的无菌50ml离心管中孵育一小时。这种孵育后，用胎牛血清补充所述培养基至10%的最终浓度(每管0.3ml)。另外孵育47h之后，通过细胞的台盼蓝(Trypan Blue)计数来测定细胞活力。为完成此操作，在2mL微量离心管(eppendorf tube)中将一份台盼蓝溶液与一份细胞悬浮液混合(1∶1稀释)混合(例如200μL台盼蓝与200μL细胞悬浮液混合)。使用血细胞计数器和显微镜，计数活细胞(未染色的)和死细胞(染色的)的数目。计算每0.1mm3的细胞的平均数目，并且测定每mL的细胞的数目。如下计算活细胞的百分比：
活细胞%=(活细胞的数目/细胞的数目)*100
将结果绘图，并且从药物浓度相对活细胞的百分比的图形中内插IC50和IC30值(分别是导致50%和30%细胞杀死的药物浓度)。
图33示出与未包囊的美法仑比较，美法仑被包囊在脂质体中的靶向肿瘤的scL/美法仑纳米复合物具有明显提高的抗癌疗效。未包囊的美法仑具有17.6μM的IC50值。相比之下，当经由本发明的方法，在脂质体与美法仑的1:1摩尔比下包囊在脂质体中，并且借助本发明的靶向肿瘤的纳米复合物输送至肿瘤细胞时，在大致不到2倍的美法仑下，将有效地杀死癌细胞(9.6μM的IC50)。虽然不是显著的，但当在0.75:1(摩尔比)的脂质体:美法仑比例下制备脂质/美法仑时，未包囊的美法仑与scL/美法仑之间的IC50值还是存在30%的减少。用单独脂质体来转染不能引起任何明显的细胞杀死(IC50>33μM)，这暗示出对于scL/美法仑观测到的敏化作用不是通过脂质体的非特异性细胞杀死的结果。因此，当在本发明的方法中使用时，各种不同的脂质体与美法仑的摩尔比将产生一种化合物，当使用本发明的方法，通过简单混合并无化学偶联来使所述化合物复合至靶向部分时，将产生一种对多发性骨髓瘤细胞有出人意料的增强疗效的复合物。
类似的结果在图34中示出，将未包囊的美法仑与如本文所述的、无靶向部分的脂质/美法仑和完全的scL/美法仑纳米复合物，以及与单独的脂质体相比较。如在实施例1和2中所述，在1∶1的脂质体与美法仑的摩尔比(脂质体浓度=2mM)下，制备脂质/美法仑和scL/美法仑。抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)被用作靶向部分，TfRscFv与脂质体比例为1:30(w:w)的。再一次，只有脂质体对这些多发性骨髓瘤细胞实际上没有细胞杀伤作用。相比之下，即使无靶向部分，当使用本文描述的方法以1:1(脂质:美法仑)的摩尔比来包囊在脂质体中时，与游离的(未包囊的)美法仑比较还是存在IC50值明显减小。当使用完全的scL/美法仑复合物时，这种敏化作用的水平甚至更高(几乎2倍)。在经由本发明的方法包囊在脂质体中后，这种多发性骨髓瘤细胞的敏化作用水平是出人意料的。
实施例20
scL/美法仑的生物活性在冻干和重构之后维持
如上所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1∶1的脂质:美法仑摩尔比(大小=21nm)(脂质体浓度=2mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备含有蔗糖(最终浓度=10%)的scL/美法仑复合物。随后将这种复合物冻干，并且在2℃至8℃下，将样品存放在干燥器中。存放一周之后，用不含内毒素的水重构冻干的scL/美法仑复合物，并且用于转染如上所述的KMS-11细胞。重构的scL/美法仑的大小是56nm(数均值)，这个大小是在新鲜制备时，通过本发明的方法来制备的复合物的优选大小范围内。因此，冻干不能明显地改变复合物的大小。将冻干的/重构的scL/美法仑的细胞杀伤能力与新鲜制备的scL/美法仑和游离的(未包囊的)美法仑相比较。结果在图35中示出。对于新鲜制备和冻干的scL/美法仑纳米复合物来说，IC50和IC20值实际上是相同的。因此，这种冻干的复合物还能够维持其生物活性的至少80%。
实施例21
用scL/美法仑和肿瘤抑制基因p53的组合治疗
已经证实在多发性骨髓瘤细胞中，恢复或活化肿瘤抑制基因p53路径诱导了细胞凋亡(程序性的细胞死亡)(Ludwig H、Beksac M、BladeJ、Boccadoro M、Cavenagh J、Cavo M等Current MM treatment strategieswith novel agents：a European perspective.Oncologist2010；15(1)：6-25；Hurt EM、Thomas SB、Peng B、Farrar WL.Reversal of p53epigeneticsilencing in multiple myeloma permits apoptosis by a p53activator.Cancer Biology&Therapy2006；5：1154-60)。此外，调查多发性骨髓瘤疾病的分子病因的研究已经证实，骨髓瘤细胞通常具有健康的(即，未突变的)p53基因，但具有非常少的p53蛋白质。恢复p53水平会减慢多发性骨髓瘤细胞的生长，并且引起它们的死亡。因此，p53基因治疗是针对多发性骨髓瘤的合理治疗策略。
用于基因治疗的靶向肿瘤的scL-p53纳米复合物
如在美国专利号7,780,822中所述(所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文)，已经成功地开发了带有编码wtp53基因的质粒DNA的并经由TfRscFv(scL-p53)来靶向的输送系统。在许多不同肿瘤类型中，全身性施用scL-p53产生高水平的wtp53表达。也已经开发了与化疗/放射组合使用的scL-p53，以便通过诱导细胞凋亡来增加肿瘤对这些标准治疗模态的反应。
使用被证实是有效靶向并有效输送wtp53至原发性和转移性肿瘤的scL-p53，应该是增加多发性骨髓瘤细胞中p53蛋白质水平的有效方式。
scL/美法仑和scL-p53组合治疗
本文描述的是scL/美法仑与scL-p53的组合使用。用作单一疗法的scL/美法仑的开发将对患者来说是有益的，原因在于我们已经证实与未包囊的美法仑(目前用于治疗的形式)比较，在用scL/美法仑治疗之后，多发性骨髓瘤细胞死亡出人意料地增高。然而，因为多发性骨髓瘤细胞中p53表达的增加还具有治疗潜力，所以组合方法将甚至具有更大的治疗潜力。
实验方法
设计实验来证明用于多发性骨髓瘤的新型、更有效的治疗方案的开发，所述治疗方案在与scL-p53组合使用时使用scL/美法仑。
体外结果
为了验证用scL-p53治疗可以导致多发性骨髓瘤细胞死亡的假设，如上所述进行了初步的细胞活力分析。用单独的scL-p53转染上述的人多发性骨髓瘤细胞系KMS-11。通过以如在美国专利号7,780,822中所述的限定顺序，通过简单混合组分来制备scL-p53。用递增剂量的编码正常人wtp53基因的质粒制备复合物。质粒DNA剂量是在0μg至1.3μgDNA范围。使用上述相同的程序转染KMS-11细胞。在转染后24h测定活细胞的百分比，并且测定IC50和IC20值。用scL-p53的转染导致剂量依赖性水平的细胞死亡，暗示出多发性骨髓瘤细胞中的wtp53通过自身来增加表达可以导致明显水平的细胞死亡(图36)。这是出人意料的，因为本领域中关于调节多发性骨髓瘤中p53表达的报道都采用了其它的活化剂或通过阻断其它蛋白质的表达来间接、不是直接地影响p53。
同时转染scL/美法仑与scL-p53的组合以便评估KMS-11细胞对这种组合治疗的反应，所述scL/美法仑与scL-p53两者都被证实自身可增加细胞死亡水平。使用上述的程序来转染KMS-11细胞。如上所述，使用抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)作为靶向部分、1∶1的脂质:美法仑摩尔比(脂质体浓度=2mM)以及1:30(w:w)的TfRscFv与脂质体比例来制备scL/美法仑复合物。用含有递增剂量的美法仑的不同scL/美法仑复合物来转染细胞(每管4×105)。如先前所述(美国专利号7,780,822)制备scL-p53。用于所有转染的DNA剂量是0.2μg/4×105个细胞。这种剂量基于来自图36的数据，其中发现IC20是大致0.2μg的剂量。使用IC20来允许检测两种治疗的加合效应或协同效应。用单独游离的(未包囊的)美法仑、单独scL/美法仑、或游离的(未包囊的)或scL包囊的美法仑加scL-p53的组合来转染KMS-11细胞(图37)。
当与单独游离的美法仑比较时，用scL/美法仑复合物的转染产生明显的对药物的化学敏化作用。此外，当与游离的或scL复合的美法仑组合使用时，添加scL-53能够明显增强KMS-11细胞对这种化疗剂的反应，与scL/美法仑与scL-p53的组合时最有效。与未包囊的美法仑——用作治疗剂的标准形式(IC50=10.9)的IC50比较，scL/美法仑加scL-p53的IC50是4.57，细胞死亡增加大于2倍。
虽然在体外已经进行了这些研究，但完全可预料的是，当scL/美法仑与scL-p53以组合全身性地施用到人患者时，也将出现类似的结果(多发性骨髓瘤细胞死亡增加)。scL-p53的剂量预计在每次输注2.4与3.6mg之间，同时每周输注两次，输注5周。将以单次静脉内输注6mg/m2与16mg/m2之间的剂量，以两周间隔，输注四个剂量来施用scL/美法仑。
在此观察到的所述组合的出人意料的增强水平暗示出这种组合方法作为新型治疗模态以用于治疗人患者的多发性骨髓瘤的潜力。
实施例22
制备包含阿托品的阳离子脂质体
材料：
DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷，盐酸盐)
-从Avanti Polar Lipids,Inc.获得，目录号(#)890890E MW698.55
-浓度：25mg/mL乙醇溶液
在使用之前，用无水乙醇稀释脂质至20mg/ml
DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺)
-从Avanti Polar Lipids,Inc.获得，目录号(#)850725E MW744.04
-浓度：25mg/mL乙醇溶液。
在使用之前，用无水乙醇稀释脂质至20mg/ml
阿托品，粉末(M Wt=289.37)
-从Sigma获得
-溶解在无水乙醇中至100mM的浓度。
超纯、无内毒素的LAL试剂水(例如BioWhittaker，目录号(#)W50-500，内毒素<0.005EU/ml)
注入器：汉密尔顿(Hamilton)气密注射器，具有22号针头，部件#81365)的1ml(汉密尔顿#81230)
程序：
1.每次通过将阿托品溶解在无水乙醇中至100mM的浓度，通过高速涡旋直到溶解(必须是澄清的)来制备新鲜的阿托品溶液。在室温下保持直到用于与脂质混合(以下步骤3)。
2.在37℃下将脂质溶液放置10min至15min，接着将脂质溶液放置于65℃水浴中，并偶尔摇动5min。
3.为了制备脂质-阿托品：将具有搅拌棒的棕色玻璃瓶放置于被设置在50℃至60℃的热板上。当在无飞溅的高速下搅拌时，按以下顺序(重要的)将脂质和阿托品添加至瓶中：
对于1:1(脂质:阿托品)摩尔比
DOTAP175μl(的20mg/ml)=5μmol或3.5mg
DOPE187.5μl(的20mg/ml)=5μmol或3.75mg
添加阿托品溶液，100μl(的100mg/ml)=10μmol，
在已经添加了所有3种组分之后，继续地搅拌3min。
4.同时，在具有搅拌棒的棕色玻璃瓶中，在水浴中将4,569μLLAL水温热至65℃。在添加脂质-阿托品溶液之前，立即将瓶移至热板(50℃至60℃)。在无飞溅的高速下搅拌水，搅拌几秒，以便从搅拌棒上去除气泡。
5.将所述水保持在热板上。在脂质添加期间，在高速(无飞溅)下连续搅拌水。如上(步骤2)混合脂质与阿托品之后，立即并且尽可能快地使用用于注入的汉密尔顿注射器，将混合物注入热板(50℃至60℃)上的热水中直接进入涡旋的中心。在添加脂质混合物同时宽松地遮盖之后，在高速(无飞溅)下继续搅拌1min。
6.将玻璃瓶移至室温搅拌板，并且继续缓慢地搅拌直到被宽松遮盖的溶液冷却至20℃至25℃(室温)。
7.用室温LAL水将体积调至5ml。
8.使用0.22μm孔的Milex GV过滤器过滤溶液。
9.如果需要的话，则测量粒径和ζ电势。
这些制备方法的结果证明了脂质体具有约20nm至100nm的粒径和约10mV至50mV的ζ电势。
实施例23
制备没有化学偶联(通过简单混合)的含有阿托品的靶向的阳离子脂质体
使用根据上述程序来制备的包含阿托品的阳离子脂质体，通过简单混合组分并且没有化学偶联来制备如本文所述的配体靶向的阿托品阳离子脂质体复合物。根据以下一般程序制备所述复合物：
向对于脂质体-水(或缓冲液)，添加适当量的靶向部分以给予所需的比例，并且通过轻轻倒置混合5至10秒。靶向部分可以是配体，其包括但不限于转铁蛋白或叶酸酯、或其它蛋白质。靶向部分还可以是靶向细胞表面受体的抗体或抗体片段，其包括但不限于转铁蛋白或HER-2受体(例如，TfRscFv)。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。为产生所需的最终体积，将靶向部分-脂质-阿托品掺合物与得到所需的体积需要的任何体积(包括零体积)的水(适合地去离子水)或任何pH的缓冲液(包括但不限于Tris缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲盐水)混合，并且轻轻倒置5至10秒来混合。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。
用于体外时，最后添加右旋糖或蔗糖至约1%至50%(V:V)右旋糖或蔗糖的最终浓度，适合地5%右旋糖或10%蔗糖，并且通过轻轻倒置来混合5至10秒。将这种混合物在室温下保持10至15分钟(在大致5分钟之后，再次轻轻倒置5至10秒)。
通过所述方法来制备的最终复合物的大小(数均值)是在约10nm至800nm之间、适合地约15nm至400nm、最适合地约20nm至200nm，并具有如通过使用Malvern电位仪ZS的动态光散射所测定的介于约1mV与100mV之间、更适合地5mV至60mV、并且最适合地10mV至50mV的ζ电势。这种大小足够小，可以有效地越过肿瘤毛细血管床或越过血脑屏障。
对于相关领域一般技术人员而言容易显而易见的是，对本文描述的方法和应用的其它适合的修改和调整可以在不脱离实施方案中的任一个的范围的情况下下做出。
应当理解的是，虽然本文已经说明和描述了某些实施方案，但权力要求书不限于描述和示出的部分的特定形式或安排。在说明书中，已经公开了说明性的实施方案，并且虽然采用了特定术语，但它们仅是在一般性和描述性的意义上使用，并不为了限制。鉴于以上教授的内容而修改和变化实施方案是可能的。因此，应当理解的是，可实践除了如确切所述之外的实施方案。
在本说明书中提到的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，以达到如同每个单独的公布、专利或专利申请是被确切地和单独地指出以引用的方式并入一样。
Claims (89)
1.一种制备靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物的方法，所述方法包括：
(a)在乙醇中制备包含一种或多种阳离子脂质的脂质溶液；
(b)制备替莫唑胺的溶液；
(c)将所述脂质溶液与所述替莫唑胺的溶液混合；
(d)将脂质与替莫唑胺的所述混合物注入水溶液中，从而形成替莫唑胺阳离子脂质体；
(e)将所述替莫唑胺阳离子脂质体与配体混合以形成所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体，其中所述配体直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
3.如权利要求1所述的方法，其中在二甲亚砜(DMSO)中制备所述替莫唑胺的溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述脂质溶液包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。
5.如权利要求1所述的方法，其中在约1mM至约200mM、或约50mM至约200mM的浓度下制备所述替莫唑胺的溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其中脂质:替莫唑胺的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
7.如权利要求1所述的方法，其中配体:脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。
8.如权利要求2所述的方法，其中TfRscFv:脂质的所述重量比是约0.33:1。
9.一种制备靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物的方法，所述方法包括：
(a)在乙醇中制备包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)的脂质溶液；
(b)制备替莫唑胺的溶液；
(c)将所述脂质溶液与所述替莫唑胺的溶液混合；
(d)将脂质与替莫唑胺的所述混合物注入水溶液中，从而形成替莫唑胺阳离子脂质体；
(e)将所述替莫唑胺阳离子脂质体与抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)混合以形成所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物，其中所述TfRscFv直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
10.如权利要求9所述的方法，其中在二甲亚砜(DMSO)中制备所述替莫唑胺的溶液。
11.如权利要求9所述的方法，其中在约1mM至约200mM、或约50mM至约200mM的浓度下制备所述替莫唑胺的溶液。
12.如权利要求9所述的方法，其中脂质:替莫唑胺的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
13.如权利要求9所述的方法，其中TfRs cFv:脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1，或甚至更适合地约0.33:1。
14.靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；
(b)替莫唑胺；以及
(c)配体，其直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
16.如权利要求14所述的用途，其中以约10mg/m2至约500mg/m2或约50mg/m2至约250mg/m2的剂量对所述患者施用所述替莫唑胺。
17.如权利要求14所述的用途，其中所述阳离子脂质体中的脂质:替莫唑胺的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
18.如权利要求14所述的用途，其中配体:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。
19.如权利要求15所述的用途，其中TfRscFv:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.33:1。
20.如权利要求14所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、舌下的(SL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
21.如权利要求14所述的用途，其中所述癌症是头颈部癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤或血液的癌症，适合地，所述脑癌是神经胶质瘤、星形细胞瘤或成胶质细胞瘤。
22.如权利要求14所述的用途，其进一步包括对所述患者施用与所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物组合的另一治疗，优选地，所述另一治疗包括施用化疗剂、小分子、放射治疗或基于核酸的治疗。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述基于核酸的治疗包括施用阳离子脂质体复合物，所述阳离子脂质体复合物包含表达野生型p53的质粒DNA。
24.靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的脑癌的药物中的用途，其中所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；
(b)替莫唑胺；以及
(c)抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
25.如权利要求24所述的用途，其中以约10mg/m2至约500mg/m2或约100mg/m2至约250mg/m2的剂量对所述患者施用所述替莫唑胺。
26.如权利要求24所述的用途，其中所述阳离子脂质体中的脂质:替莫唑胺的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
27.如权利要求24所述的用途，其中TfRscFv:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1，或甚至更适合地约0.33:1。
28.如权利要求24所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、舌下的(SL)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
29.如权利要求24所述的用途，其中所述脑癌是神经胶质瘤、星形细胞瘤或成胶质细胞瘤。
30.通过权利要求1所述的方法来制备的靶向替莫唑胺阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
32.如权利要求30所述的用途，其中以约10mg/m2至约500mg/m2或约50mg/m2至约250mg/m2的剂量对所述患者施用替莫唑胺。
33.如权利要求30所述的用途，其中脂质:替莫唑胺的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
34.如权利要求30所述的用途，其中配体:脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。
35.如权利要求30所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、舌下的(SL)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
36.如权利要求30所述的用途，其中所述癌症是头颈部癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤或血液的癌症，适合地，所述脑癌是神经胶质瘤、星形细胞瘤或成胶质细胞瘤。
37.如权利要求30所述的用途，其进一步包括对所述患者施用与所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物组合的另一治疗，优选地，所述另一治疗包括施用化疗剂、小分子、放射治疗或基于核酸的治疗。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述基于核酸的治疗包括施用阳离子脂质体复合物，所述阳离子脂质体复合物包含表达野生型p53的质粒DNA。
39.一种制备靶向的美法仑阳离子脂质体复合物的方法，所述方法包括：
(a)在乙醇中制备包含一种或多种阳离子脂质的脂质溶液。
(b)制备美法仑的溶液；
(c)将所述脂质溶液与所述美法仑的溶液混合；
(d)将脂质与美法仑的所述混合物注入水溶液中，从而形成美法仑阳离子脂质体；
(e)将所述美法仑阳离子脂质体与配体混合以形成所述靶向的美法仑阳离子脂质体，其中所述配体直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
41.如权利要求39所述的方法，其中在无水乙醇加盐酸中制备所述美法仑的溶液。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述脂质溶液包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。
43.如权利要求39所述的方法，其中在约1mM至约200mM或约50mM至约200mM的浓度下制备所述美法仑的溶液。
44.如权利要求39所述的方法，其中脂质:美法仑的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
45.如权利要求39所述的方法，其中配体:脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。
46.如权利要求40所述的方法，其中TfRscFv:脂质的所述重量比是约0.33:1。
47.一种制备靶向的美法仑阳离子脂质体复合物的方法，所述方法包括：
(a)在乙醇中制备包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)的脂质溶液；
(b)制备美法仑的溶液；
(c)将所述脂质溶液与所述美法仑的溶液混合；
(d)将脂质与美法仑的所述混合物注入水溶液中，从而形成美法仑阳离子脂质体；
(e)将所述美法仑阳离子脂质体与抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)混合以形成所述靶向的美法仑阳离子脂质体复合物，其中所述TfRscFv直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
48.如权利要求47所述的方法，其中在无水乙醇加盐酸中制备所述美法仑的溶液。
49.如权利要求47所述的方法，其中在约1mM至约200mM或约50mM至约200mM或约145mM至约150mM的浓度下制备所述美法仑的溶液。
50.如权利要求47所述的方法，其中脂质:美法仑的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
51.如权利要求47所述的方法，其中TfRscFv:脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1，或甚至更适合地约0.33:1。
52.靶向的美法仑阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中所述靶向的替莫唑胺阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；
(b)美法仑；以及
(c)配体，其直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
54.如权利要求52所述的用途，其中以约1mg/m2至约100mg/m2或约5mg/m2至约20mg/m2的剂量对所述患者施用所述美法仑。
55.如权利要求52所述的用途，其中所述阳离子脂质体中的脂质:美法仑的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
56.如权利要求52所述的用途，其中配体:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1，或甚至更适合地约0.33:1。
57.如权利要求52所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、舌下的(SL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
58.如权利要求52所述的用途，其中所述癌症是头颈部癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤或血液的癌症，适合地，所述癌症是多发性骨髓瘤。
59.如权利要求52所述的用途，其进一步包括对所述患者施用与所述靶向的美法仑阳离子脂质体复合物组合的另一治疗，优选地，所述另一治疗包括施用化疗剂、小分子、放射治疗或基于核酸的治疗。
60.如权利要求59所述的用途，其中所述基于核酸的治疗包括施用阳离子脂质体复合物，所述阳离子脂质体复合物包含表达野生型p53的质粒DNA。
61.靶向的美法仑阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中所述靶向的美法仑阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；
(b)美法仑；以及
(c)抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
62.如权利要求61所述的用途，其中以约1mg/m2至约100mg/m2或约5mg/m2至约20mg/m2的剂量对所述患者施用所述美法仑。
63.如权利要求61所述的用途，其中所述阳离子脂质体中的脂质:美法仑的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
64.如权利要求61所述的用途，其中TfRscFv:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1，甚至更适合地约0.33:1。
65.如权利要求61所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、舌下的(SL)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
66.如权利要求61所述的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
67.通过权利要求39所述的方法来制备的靶向的美法仑阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。
68.如权利要求67所述的用途，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
69.如权利要求67所述的用途，其中以约1mg/m2至约100mg/m2或约5mg/m2至约20mg/m2的剂量对所述患者施用美法仑。
70.如权利要求67所述的用途，其中脂质:美法仑的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
71.如权利要求67所述的用途，其中配体:脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。
72.如权利要求67所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、舌下的(SL)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
73.如权利要求67所述的用途，其中所述癌症是头颈部癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、脂肉瘤、横纹肌肉瘤、绒毛膜癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、泌尿生殖系统癌、胃癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤或血液的癌症，适合地，所述癌症是多发性骨髓瘤。
74.如权利要求67所述的用途，其进一步包括对所述患者施用与所述靶向的美法仑阳离子脂质体复合物组合的另一治疗，优选地，所述另一治疗包括施用化疗剂、小分子、放射治疗或基于核酸的治疗。
75.如权利要求74所述的用途，其中所述基于核酸的治疗包括施用阳离子脂质体复合物，所述阳离子脂质体复合物包含表达野生型p53的质粒DNA。
76.(a)阳离子脂质体复合物与(b)替莫唑胺的组合在制备用于治疗患者的脑癌的药物中的用途，其中：
(a)阳离子脂质体复合物，其包含：
(1)阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；
(2)质粒DNA，其表达野生型p53；以及
(3)抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)，其直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
77.如权利要求76所述的用途，其中与所述阳离子脂质体复合物同时或在所述阳离子脂质体复合物之前或之后施用所述替莫唑胺。
78.如权利要求76所述的用途，其中以约10mg/m2至约500mg/m2或约100mg/m2至约250mg/m2的剂量对所述患者施用所述替莫唑胺。
79.如权利要求76所述的用途，其中所述替莫唑胺也包囊在阳离子脂质体复合物中。
80.如权利要求76所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、舌下的(SL)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
81.如权利要求76所述的用途，其中所述脑癌是神经胶质瘤、星形细胞瘤或成胶质细胞瘤。
82.靶向的阿托品阳离子脂质体复合物在制备用于治疗患者的有机磷中毒的药物中的用途，其中所述靶向的阿托品阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体，其包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰乙醇胺(DOPE)；
(b)阿托品；以及
(c)配体，其直接与所述阳离子脂质体复合，但不是与所述阳离子脂质体化学偶联。
83.如权利要求82所述的用途，其中所述配体是抗体、抗体片段或蛋白质，包括单链Fv抗体片段，如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
84.如权利要求82所述的用途，其中以约1mg至约10mg或约2mg至约6mg的剂量对所述患者施用所述阿托品。
85.如权利要求82所述的用途，其中所述阳离子脂质体中的脂质:阿托品的所述摩尔比是约0.1:1至约5:1，更适合地约0.5:1至约2:1或甚至更适合地约1:1。
86.如权利要求82所述的用途，其中配体:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.01:1至约0.5:1，更适合地约0.3:1至约0.4:1。
87.如权利要求82所述的用途，其中TfRscFv:所述阳离子脂质体中的脂质的所述重量比是约0.33:1。
88.如权利要求82所述的用途，其中所述施用是静脉内的(IV)、瘤内的(IT)、病灶内的(IL)、舌下的(SL)、气溶胶的、经皮的、口服的、内窥镜的、局部的、肌肉内的(IM)、真皮内的(ID)、眼内的(IO)、腹膜内的(IP)、经真皮的(TD)、鼻内的(IN)、脑内的(IC)、器官内的(例如肝内的)、缓释植入、或皮下施用、或经由使用渗透泵或机械泵的施用。
89.如权利要求82所述的用途，其中所述脂质体越过所述血脑屏障。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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