CN101801344A - 关于使用阳离子脂质体介导的核酸递送产生免疫应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明在药物递送且特别地基于阳离子脂质体的疫苗领域中。在实施方案中，本发明提供了制备用于递送分子以诱导针对病毒抗原的免疫应答或者治疗或预防病毒疾病的配体靶向的(例如，抗体或抗体片段靶向的)脂质体的方法。递送系统的特异性得自靶向性配体。

Description

关于使用阳离子脂质体介导的核酸递送产生免疫应答的方法
发明背景
发明领域
本发明在药物递送且特别地基于阳离子脂质体的疫苗领域中。在实施方案中，本发明提供了制备用于递送分子以诱导针对病毒抗原的免疫应答或者治疗或预防病毒疾病的配体靶向的(例如，抗体或抗体片段靶向的)脂质体的方法。递送系统的特异性得自靶向性配体。
发明背景
疫苗代表针对可高度传播的感染性病原体的强大武器，并且在过去一个世纪中已用于显著减少感染性疾病的负担。然而，由感染性疾病造成的对全球健康的威胁并未后退，而是已变成全国和全球优先考虑的事情。病毒病原体例如结核和疟疾的影响继续在全球规模上感受到，并且新出现的病原体例如HIV/AIDS、SARS冠状病毒和最近出现的大流行性流感或‘禽流感’病毒对公共卫生提出新挑战。
大多数疫苗技术涉及灭活的疫苗制剂、基于蛋白质亚单位或在性质方面活减毒的。例如，关于流感疫苗的目前生产和制造技术基于鸡蛋接种并且仍是时间和成本密集过程。其为活减毒病毒的天花疫苗与免疫妥协群体中的严重不利事件相关。因此，目前的疫苗技术是过时的并且不足以满足关于疫苗的全国或全球需求。
因此，存在开发新疫苗技术的迫切需要，所述新疫苗技术将解决由高度易变和新出现的病原体造成的挑战。本发明通过提供基于阳离子脂质体的药物递送系统满足了这些需要，所述药物递送系统用于在诱导针对抗原的免疫应答中使用以及用于治疗或预防患者中的病毒疾病。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了制备配体靶向的(例如，蛋白质/肽靶向的、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体的方法。在合适的实施方案中，此种方法包括制备配体(例如，转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体或抗体片段)，并且使配体与阳离子脂质体混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体。适当地，配体与阳离子脂质体直接结合/复合，但不与阳离子脂质体化学缀合。在其他实施方案中，配体可以与阳离子脂质体化学缀合。随后，配体靶向的阳离子脂质体与编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子，和/或编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体复合物。在合适的实施方案中，使用抗体片段，例如，Fab片段、或单链Fv片段，例如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。在进一步的实施方案中，该方法可以进一步包括使配体靶向的阳离子脂质体与包含K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽的肽混合。
适当地，配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)与阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100、适当地约1∶10至约1∶50(w∶w)、更适当地约1∶20至约1∶40范围的比混合。在示例性实施方案中，阳离子脂质体包含二油酰基三甲基磷酸铵(DOTAP)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
核酸适当地以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至约10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。例如，可以利用约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的比。在示例性实施方案中，阳离子免疫脂质体与编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，以约1∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)、适当地约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)，例如约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比混合。
可以由核酸分子编码的病毒蛋白质例子包括但不限于，选自下述的病毒蛋白质：HIV病毒蛋白质，流感病毒蛋白质，甲型、乙型或丙型肝炎病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质，禽流感病毒蛋白质，埃博拉病毒蛋白质，西尼罗病毒蛋白质，和天花病毒蛋白质。可以由核酸分子编码的白介素例子包括但不限于，选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23的白介素。在合适的实施方案中，核酸编码IL-2、IL-12和IL-15。本发明还提供了通过本发明的各种方法制备的阳离子免疫脂质体复合物。
在进一步的实施方案中，本发明提供了配体靶向的(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体复合物，其包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中配体与阳离子脂质体直接复合但不化学缀合。在进一步的实施方案中，配体可以与脂质体化学缀合。
本发明还提供了包含本发明的各种脂质体复合物的药物组合物。本发明的另外的药物组合物包括第一配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子，其中配体与阳离子脂质体直接复合但不化学缀合。在进一步的实施方案中，配体可以与阳离子脂质体化学缀合。在合适的实施方案中，药物组合物还进一步包括第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中配体与阳离子脂质体直接复合但不化学缀合。在进一步的实施方案中，配体可以与阳离子脂质体化学缀合。
在另外的实施方案中，本发明提供了将一种或多种活性剂递送给哺乳动物的抗原呈递细胞(APCs)的方法，其包括给哺乳动物施用抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)靶向的阳离子免疫脂质体复合物，所述复合物包括阳离子脂质体、TfRscFv和一种或多种活性剂，其中TfRscFv与阳离子脂质体直接结合/复合，但不化学缀合。在进一步的实施方案中，TfRscFv可以与阳离子脂质体化学缀合。适当地，该方法将试剂(例如，核酸)递送给专业和非专业APCs，包括位于肝、脾、淋巴结、肠和/或呼吸道中的APCs。
本发明还提供了在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给哺乳动物施用本发明的各种阳离子脂质体复合物、或本发明的药物组合物。
在进一步的实施方案中，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法，其包括给哺乳动物施用本发明的各种阳离子脂质体复合物、或本发明的药物组合物。
附图简述
本专利或申请文件包含以彩色作出的至少一个附图。本专利或专利申请公开物与一个或多个彩色附图的拷贝将在请求且支付必要费用后由USPTO或事务所提供。
图1显示在用脂质体(包括或不包括HoKC肽)转染的Hep3B细胞中的萤光素酶活性，所述脂质体与抗转铁蛋白受体单链抗体片段(sc)和萤光素酶报道基因复合。
图2显示在用3种不同脂质体(A、D和G)转染的原代黑猩猩肝细胞中的萤光素酶表达，所述脂质体与sc、Gal或L-37-pA和表达萤光素酶报道基因的DNA复合。所有数据显示为平均值+SD(n＝3)。
图3显示蛋白质印迹，其显示与未处理小鼠(UT)比较，在来自用20-25μg表达EGFP的DNA接种的一式两份小鼠的肝提取物中的GFP表达，所述表达EGFP的DNA和与脂质A缀合的TfRscFv配体(sc)(scLA)、与脂质A和HoKC缀合的TfRscFv配体(sc)(scLAHK)、与脂质D和HoKC缀合的TfRscFv配体(sc)(scLDHK)、与脂质G和HoKC缀合的TfRscFv配体(sc)(scLGHK)、与脂质A缀合的半乳糖(GalLA)和与脂质A缀合的L-37pA(L-37pALA)复合。
图4显示用表达HCV抗原NS3-NS5B的DNA质粒(pAG410)转染的细胞的蛋白质印迹。印迹用针对NS5B的单克隆抗体(左)和来自慢性感染的黑猩猩的血清(右)进行探测。
图5显示在pSCMV和CMV启动子下的IL-2的比较表达。
图6显示在i.v.注射scL复合的或游离的pAG410后小鼠肝中的NS3的DNA PCR扩增。
图7显示在用scL-HCV/scL-IL12接种的小鼠中HCV重组痘苗病毒复制的抑制。
图8A和8B显示在首次用于实验的动物(Ch1601)和恢复的动物(Ch1587)的疫苗接种和用HCV攻击过程中的HCV抗HVR1抗体(条)和RNA谱(黑色三角)。抗HVR1表示为P/N比。P/N通过将测试血清的0D405除以对于来自相同黑猩猩的疫苗前样品获得的0D405进行计算。截断值是P/N＝2。
图9A-9C显示在2只恢复的黑猩猩(Ch1588和Ch1606)和1只首次用于实验的黑猩猩(Ch6394)的基于T细胞的疫苗接种和用HCV攻击过程中的疾病曲线图。RNA滴度(黑色方块)、ALT水平(黑色三角)。免疫接种的动物的HCV攻击在第0周时执行(100CID50cHCV)。
图10A-10C显示在用scL-HCV免疫接种且用重组腺病毒加强的(Ch1611和Ch6407)，或用scL-空载体免疫接种且用非重组腺病毒加强的(Ch0257)黑猩猩中针对肽库的elispot应答。
图11A-11C显示在攻击前和后在免疫接种的(Ch6407和1611)和对照(Ch 0257)黑猩猩中的Elispot应答。
图12A-12C显示在疫苗接种的(Ch6407和1611)和对照(Ch 0257)黑猩猩中的肝内细胞因子mRNA水平。
图13显示在对照(Ch 0257)和疫苗接种的(Ch6407和1611)黑猩猩中在攻击后的HCV RNA滴度。
图14显示在对照(Ch 0257)和疫苗接种的(Ch6407和1611)黑猩猩中在攻击后的血清ALT水平。
图15显示在慢性感染的黑猩猩中的PBMC T细胞应答。
图16A-16C显示在IN施用质粒DNA，随后进行后续萤光素底物注射后的BALB/c小鼠的光学图像，所述质粒DNA表达萤光素酶基因，且作为游离(裸露)质粒DNA(LUC)(B)或封装在scL纳米免疫脂质体复合物中(scLLUC)(C)。小图A代表未处理对照。
图17A-17C显示在IV施用质粒DNA，随后进行后续萤光素底物注射后的BALB/c小鼠的光学图像，所述质粒DNA表达萤光素酶基因，且作为游离(裸露)质粒DNA(LUC)(B)或封装在scL纳米免疫脂质体复合物中(scLLUC)(C)。小图A代表未处理对照。
发明详述
在一个实施方案中，依照本发明实施方案的配体靶向的(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体或阳离子聚合物复合物适当地通过简单有效的非化学缀合方法进行制备，其中所需复合物的组分以限定比和限定顺序混合在一起。在另外的实施方案中，配体靶向的阳离子脂质体或阳离子聚合物复合物可以通过化学缀合方法进行制备，其中配体经由化学键与阳离子脂质体的表面化学缀合。
术语“免疫复合物”、“免疫脂质体”、“复合物”、“纳米复合物”、“免疫纳米复合物”、“脂质体复合物”和“纳米免疫脂质体”自始至终可互换用于指本发明的阳离子脂质体。用于在本发明的实践中使用的示例性阳离子脂质体及其生产方法公开于2006年9月14日提交的美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796中，所述申请各自的公开内容通过引用整体合并入本文。
如本文所使用的，术语“约”指所述值以及在所述值10％内的值。例如，“约100nm”包括90nm至110nm的值，包括在这个范围之间的值。
如本文所使用的，术语“配体”指任何合适的靶向性部分，其可以与阳离子脂质体化学缀合，或直接结合/复合但不化学缀合。用于在本发明的实践中使用的示例性配体包括但不限于，蛋白质(例如，转铁蛋白或叶酸)、肽(例如，L-37pA)、抗体、抗体片段(包括Fab′片段和单链Fv片段)和糖(例如，半乳糖)、以及其他靶向性分子。
其中依照本发明实施方案的复合物通过简单有效的非化学缀合进行制备的示例性方法和组合物公开于2006年9月14日提交的美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796中。其中依照本发明实施方案的复合物经由化学缀合进行制备的示例性方法和组合物公开于2001年10月1日提交的美国专利申请号09/914,046中。这些专利申请各自的公开内容通过引用整体合并入本文。
在示例性实施方案中，完整抗体或抗体片段可以用作配体以制备本发明的复合物。在一个合适的实施方案中，使用抗体片段，包括抗体的Fab片段和单链Fv片段(scFv)。一种合适的抗体是抗转铁蛋白受体(抗TfR)单克隆抗体，并且合适的抗体片段是基于抗TfR单克隆抗体的scFv。合适的抗TfR单克隆抗体是5E9(参见例如，Hayes，B.F.，等人，″Characterization of a Monoclonal Antibody(5E9)that Defines a Human Cell Surface Antigen of Cell Activation，″J.Immunol.127：347-352(1981)；Batra，J.K.，等人，″Single-chainImmunotoxins Directed at the Human Transferrin ReceptorContaining Pseudomonas Exotoxin A or Diphther ia Toxin：Anti-TFR(Fv)-PE40 and DT388-Anti-TFR(Fv)，″Mol.Cell.Biol.11：2200-2205(1991)；其公开内容通过引用合并入本文)。基于5E9抗体的scFv包含关于由这种MAb识别的TfR表位的完全抗体结合位点(作为分子量约26,000的单条多肽链)。scFv通过使来自重和轻链的组分VH和VL可变结构域分别与适当设计的肽连接而形成，所述适当设计的肽使第一个可变区的C末端与第二个的N末端桥接，顺序为VH-肽-VL或VL-肽-VH。另外的配体例如本文中描述的那些也可以在本发明的实践中使用。
在一个实施方案中，将半胱氨酸部分加入scFv的C末端中。尽管不希望受理论束缚，但相信提供游离巯基的半胱氨酸可能增强在化学缀合和非化学缀合实施方案中抗体和脂质体之间的复合物形成。无论用或不用半胱氨酸，蛋白质可以在大肠杆菌(E.coli)包含体中表达并且随后重折叠以产生活性形式的抗体片段。
除非希望在复合物形成中使用立体稳定免疫脂质体，否则在制备本发明的示例性非化学缀合复合物中的第一个步骤包括使阳离子脂质体或脂质体组合与选择的抗体或抗体片段混合。广泛多样的阳离子脂质体在本发明复合物的制备中有用。公开的PCT申请WO99/25320描述了数种阳离子脂质体的制备。合适脂质体的例子包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)以及包含二油酰基三甲基磷酸铵(DOTAP)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物的那些。可以改变脂质的比例以对于特定靶细胞类型最佳化治疗分子的摄取效率。脂质体可以包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的所需比为约1∶(0.5-3)，优选1∶(1-2)(摩尔比)。
合适的配体，例如蛋白质/肽、抗体或抗体片段，是与靶细胞的表面结合，并且优选与在靶细胞上差异表达的受体结合的那些。配体在室温下以及以约1∶10至约1∶50、适当地约1∶20至约1∶40(w∶w)范围的配体(例如，蛋白质)∶脂质比(重量∶重量)与阳离子脂质体或聚合物混合。
允许配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和脂质体在室温下温育短时间段，一般约10-15分钟，随后使混合物与选择的治疗或诊断剂混合。可以与脂质体复合物复合的治疗分子或试剂的例子包括基因、高分子量DNA(基因组DNA)、质粒DNA、反义寡核苷酸、肽、核酶、核酸(包括siRNA和反义)、小分子、病毒颗粒、免疫调节剂、用于成像的造影剂、蛋白质和化学试剂。
配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和脂质体组合与治疗试剂以在约0.5∶1至约1∶40(μg试剂∶nmol总脂质)、适当地约1∶10至约1∶20(μg试剂∶nmol总脂质)范围中的比混合，并且在室温下温育短时间段，一般约10-15分钟。脂质体复合物的大小一般在约50-500nm范围内，如通过动态光散射使用Malvern
Figure GPA00001043278100081
3000或Malvern
Figure GPA00001043278100082
NANO-ZS测量的。参见美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796，其公开内容通过引用整体合并入本文。
在本发明的一个实施方案中，用于形成复合物的脂质体是立体稳定脂质体。立体稳定脂质体是亲水聚合物例如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)、或聚(n-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)已整合到其内的脂质体。当与治疗剂复合时，此种修饰的脂质体可以是特别有用的，因为它们一般不象未如此修饰的可比较脂质体一样快速地通过网状内皮系统从血流中清除。为了制备本发明的立体稳定脂质体复合物，抗体或抗体片段、脂质体和治疗或诊断剂的混合顺序与上文阐述的顺序相反。在第一个步骤中，如上所述的阳离子脂质体首先如上所述以在约0.5∶1至约1∶40(μg试剂∶nmol脂质)、适当地约1∶10至1∶20(μg试剂∶nmol脂质)范围中的比与治疗剂混合。以约0.1∶100(nmol PEG∶nmol脂质)、适当地约0.5∶50，例如1∶40(nmol PEG∶nmol脂质)的比，向这种脂复合物中加入溶于生理学上可接受的缓冲液中的PEG聚合物溶液。所得到的溶液在室温下温育足以允许聚合物整合到脂质体复合物内的时间。配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)随后在室温下和以在约1∶5至约1∶40(w∶w)范围中的配体(例如，蛋白质)∶脂质比与稳定脂质体复合物混合。
依照本发明制备的脂质体复合物可以配制为药理学上可接受的制剂用于体内施用。复合物可以与药理学上相容的媒介物或载体组合。组合物可以配制例如用于静脉内施用于哺乳动物，例如待通过施用在复合物中的治疗分子或其他有效负荷获益的人患者。复合物具有如此合适的大小，使得它们在静脉内施用后遍及机体分布。备选地，复合物可以经由其他施用途径进行递送，例如瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。用于经由此种方法递送的制剂的制备和使用此种方法的递送是本领域众所周知的。
复合物可以就靶细胞类型进行最佳化，通过脂质的选择和比、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)与脂质体的比、配体和脂质体与治疗剂的比、以及配体和治疗剂的选择。
依照本发明的方法制备的复合物可以以试剂盒形式提供，用于在核酸、治疗分子或经由复合物的其他有效负荷的系统递送中使用。合适的试剂盒可以在分别的合适容器中包括脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、和核酸、治疗或诊断剂。组分可以在无菌条件下以合适顺序混合，并且在合理时间段内施用于患者，一般在制备后约30分钟至约24小时。试剂盒组分优选作为溶液或作为干粉提供。以溶液形式提供的组分优选连同合适缓冲剂、渗透性控制试剂等一起在无菌注射用水中配制。完整的复合物还可以配制为干粉(冻干的)(参见例如，美国公开专利申请号2005/0002998，其公开内容通过引用整体合并入本文)。
如其公开内容通过引用合并入本文的美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796中自始至终讨论的，自始至终描述的阳离子免疫脂质体复合物已成功地将各种治疗和诊断剂递送给肿瘤细胞，经由使用抗转铁蛋白单链抗体片段(TfRscFv)靶向。特别地，核酸分子例如反义和siRNA以及质粒DNA(例如p53和RB94)已使用本发明的免疫脂质体复合物成功地递送(参见美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796)。小分子也已通过自始至终公开的方法和脂质体递送(参见，2007年5月11日提交的美国专利申请号11/798,296，其公开内容通过引用整体合并入本文)。如自始至终讨论的，目前已发现疫苗构建体可以进行制备、靶向且有效转染无论存在于机体何处中的抗原呈递细胞(APCs)，包括但不限于，肝脏肝细胞、枯否细胞、肝窦状上皮细胞(LSEC)和树突细胞(使用TfRscFv作为靶向性部分)。
用于疫苗接种的阳离子脂质体复合物
在一个实施方案中，本发明提供了用于在哺乳动物(如本文所使用的，哺乳动物包括犬、猫、猪、绵羊、马、牛、大鼠、小鼠、黑猩猩、猴、类人猿等以及人)中使用阳离子脂质体复合物在病毒复制的原始位点处诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，所述原始位点例如具有丙型肝炎病毒(HCV)的肝，且特别地抗原呈递细胞(APC)。作为一个例子，在HCV中，T细胞应答已确定为在感染后的病毒复制位点(肝)处更快速和更有效。因此，本发明提供了模拟在HCV恢复的哺乳动物中发生的T细胞初敏的方法，其通过阳离子脂质体以递送重组质粒DNA和病毒载体化免疫接种而在体内诱导靶向位于肝中的细胞(例如，枯否细胞、肝窦状上皮细胞、树突细胞和肝细胞)的免疫应答(例如，预防疫苗)。本发明还提供了用作免疫治疗剂的疫苗以用于预防和治疗慢性(和急性)病原体感染。将各种配体靶向的阳离子脂质体复合物递送给机体的正常细胞(即，非肿瘤细胞)的能力是出乎意料和令人惊讶的结果。应当理解尽管本发明的示例性方法用于治疗哺乳动物(例如，人)，但本发明的方法、脂质体制剂和组合物还可以用于治疗其他动物，包括鸟类、鱼类等。
本发明的阳离子免疫脂质体复合物适当地在其表面上包括抗转铁蛋白受体单链抗体分子(TfRscFv)。已确定这种靶向性分子增强表达病毒蛋白质的封装/结合核酸(例如，质粒DNA)的递送和经由APCs的摄取。参见例如，美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796。此外，本发明提供了在相同免疫脂质体复合物中表达白介素(IL)佐剂的核酸的同时施用以刺激免疫应答。
免疫应答的细胞因子增强
细胞因子是由机体中的细胞响应激活刺激释放的小蛋白质(～25kDa)。它们通过与特定受体结合以自分泌和旁分泌的方式诱导应答，以调节先天性和适应性免疫应答。通过共施用纯化的蛋白质(Berzofsky J.A.，等人，Immunological Reviews，170：151-172(1999))或表达所需细胞因子产物的DNA质粒(Toka F.N.，等人，Immunological Reviews，199：100-112(2004))，它们已广泛用于改善疫苗活性。关于这些佐剂的基因递送的大多数研究已集中于肌内或皮内施用途径，静脉内递送未得到广泛评估(参见Toka)。CD4细胞基于其细胞因子基因转录和分泌分成个2个主要类型。Th1细胞的特征在于它们分泌IL-2和γ干扰素(IFN-γ)，而Th2细胞产生IL-4、IL-5和IL-10。佐剂可以诱导向Th1或Th2方向倾斜的T细胞应答，这可能对疫苗的结果产生深远影响。为了改善免疫接种且刺激有效的Th1类型应答，表达IL-2、IL-12或IL-15的核酸例如质粒适当地在阳离子脂质体中结合/封装，如自始至终描述的。
IL-2：大部分IL-2(15.5-kDa糖蛋白)由CD4Th1型细胞产生，并且它的主要作用是刺激辅助和细胞毒性T细胞(CTL)生长、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞。已知IL-2在抗原特异性免疫应答的起始和维持中起重要作用，并且已显示其增强由数种DNA疫苗诱导的免疫应答。机制看起来是DCs中的CD48和CD80表达上调以及其在CD8+T细胞上各自的配体CD2和CD28的上调(参见Toka)。
IL-12：人IL-12是由2个亚单位p35和p40组成的异二聚体。它是由巨噬细胞和DCs响应病原体感染而产生的促炎细胞因子，并且诱导IFN-γ产生。这种细胞因子支持Th1超过Th2细胞的分化，并且使先天性抗性与适应性免疫连接。在用基于DNA的HCV疫苗免疫接种的小鼠中，IL-12DNA的递送改善CTL应答和核-rVV的清除。
IL-15：IL-15是以多效性和多功能方式起作用的14kDa糖蛋白。它由广泛多样的细胞表达，包括单核细胞、巨噬细胞、DCs、枯否细胞、肝细胞和内皮细胞。它具有与IL-2共同的许多生物活性，因为2种细胞因子使用相同的受体组分。IL-15可以增强NK细胞的细胞裂解活性和CTL，并且诱导来自NK和T细胞的IFN-γ产生。此外，当诱导抗病毒CD8+记忆T细胞应答时，它诱导CD8+记忆和效应T细胞的增殖，使得它成为用于包括作为佐剂的吸引人的候选物。
在示例性实施方案中，阳离子脂质体包括单链转铁蛋白受体抗体，含或不含HK肽(scL或scLHK)以及表达HCV基因组的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(NS3-NS5B)部分的一种或多种质粒(scL-HCV或scLHK-HCV)。然而，应当指出，如自始至终描述的，表达任何一种或多种病毒蛋白质的任何核酸分子都可以与本发明的脂质体一起封装/结合。
在疫苗接种的首次用于实验的黑猩猩中的结果表明，全身性scL-HCV方法(包括表达作为佐剂的IL-12的质粒DNA，且用重组腺病毒加强)可以触发HCV特异性免疫应答。HCV复制在攻击后显著抑制并且与HCV特异性T细胞应答相关。在评估T细胞应答的小鼠细胞免疫实验中，在接种后用表达HCV NS3蛋白质的重组痘苗病毒的“攻击”还显示在scL-HCV/IL组中病毒复制的抑制，这些结果支持这种方法用于预防疫苗接种以诱导针对病毒抗原的免疫应答的用途。
在一个示例性实施方案中，本发明提供了制备配体靶向的(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体复合物的方法。在合适的实施方案中，此种方法包括制备配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)，并且使配体与阳离子脂质体混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体，其中配体与阳离子脂质体直接结合/复合，但不化学缀合。配体靶向的阳离子脂质体随后与编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体复合物。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了制备配体靶向的(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体复合物的方法。在合适的实施方案中，此种方法包括制备配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)，并且使配体与阳离子脂质体混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体，其中配体经由化学缀合与阳离子脂质体直接复合。配体靶向的阳离子脂质体随后与编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和/或编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体复合物。
如本文所描述的，通过在加工过程中使一种或多种核酸分子与脂质体简单混合，核酸分子适当地用本发明的脂质体复合物封装、包含或复合/结合。核酸分子∶脂质体复合物的合适比由普通技术人员容易地确定。在示例性实施方案中，核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。例如，编码一种或多种病毒蛋白质的核酸分子与编码一种或多种白介素的核酸分子以约0.1∶10至约10∶0.1、适当地约0.5∶1至约2∶1、和更适当地约1∶1范围中的摩尔比混合在一起，以形成核酸溶液，例如，在与脂质体复合前，尽管也可以使用在这些范围外的另外的摩尔比。在其他实施方案中，核酸分子可以分开地与脂质体复合(即，在不同溶液中)，同时仍维持所需摩尔比。
适当地，核酸分子与脂质体复合物的摩尔比在约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)、适当地约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)、更适当地约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)范围中。如本文所使用的，核酸分子与脂质体复合物的摩尔比包括两种核酸“群体”，即核酸总量包括编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。
如自始至终描述的，用于递送核酸分子的所需阳离子脂质体的例子包括包含二油酰基三甲基磷酸铵(DOTAP)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物；和双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)与DOPE和/或胆固醇的混合物的那些。可以改变脂质的比例以对于特定靶细胞类型最佳化核酸分子的摄取效率。脂质体可以包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的所需比为约1∶(0.5-3)，优选1∶(1-2)(摩尔比)。在本发明的实践中有用的各种脂质的比的例子包括但不限于：
LipA DOTAP/DOPE        1∶1摩尔比
LipB DDAB/DOPE         1∶1摩尔比
LipC DDAB/DOPE         1∶2摩尔比
LipD DOTAP/Chol        1∶1摩尔比
LipE DDAB/Chol         1∶1摩尔比
LipG DOTAP/DOPE/Chol   2∶1∶1摩尔比
LipH DDAB/DOPE/Chol    2∶1∶1摩尔比
(DOTAP＝二油酰基三甲基磷酸铵，DDAB＝双十八烷基二甲基溴化铵；DOPE＝二油酰基磷脂酰乙醇胺；chol＝胆固醇)。
如自始至终讨论的，在合适的实施方案中，在本发明的组合物和方法中使用的配体是抗体片段，例如单链Fv片段，例如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。适当地，抗体或抗体片段与阳离子脂质体以在约1∶1至约1∶100、适当地约1∶10至约1∶50(w∶w)、更适当地约1∶30或约1∶33(抗体或抗体片段∶脂质)范围中的比混合，以形成靶向的阳离子免疫脂质体。在另外的实施方案中，脂质体还可以包含与脂质体结合的内体破裂肽，例如由Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)制造的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(HK)(SEQ ID NO：1)肽。内体破裂肽HoKC可以帮助试剂在细胞的细胞质中释放。
在示例性实施方案中，阳离子脂质体制剂A(以1∶1摩尔比的DOTAP∶DOPE)、B(以1∶1的DDAB∶DOPE)、G(以1∶1∶1的DOTAP∶DOPE∶胆固醇)和H(以1∶1∶1的DDAB∶DOPE∶胆固醇)或自始至终讨论的任何脂质制剂，使用如本文所描述的乙醇注射法进行制备。每种脂质体制剂还适当地包括以总脂质的5摩尔百分比的MPB-DOPE。因为HoKC肽(K[K(H)KKK]5-K(H)KKC)携带末端半胱氨酸，所以MPB-DOPE包括在所有脂质体组合物中，以允许肽与脂质体缀合。Lip-HoKC脂质体使用携带马来酰亚胺基团的阳离子脂质体(Lip-MPB)和肽之间的偶联反应进行制备。将在半胱氨酸上具有游离巯基的0.1mmol肽等分试样加入溶于10mM HEPES，pH 7.4溶液中的2mmol Lip-MPB，并且在室温下旋转(20-30r.p.m.)2小时。所得到的Lip-HoKC具有1.4mM的脂质浓度。
完全复合物以与用于产生不含HoKC的TfRscFv∶Lip∶DNA复合物等同的方式形成。此处，还通过轻轻倒转以特定比使抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)与Lip-HoKC混合，并且在室温下温育10分钟。随后将DNA加入TfRscFv∶Lip-HoKC溶液中，通过轻轻倒转混合，并且再次在室温下温育15分钟，这之后加入右旋糖或蔗糖至5-10％的终浓度，并且再次通过轻轻倒转混合。关于TfRscFv∶Lip-HoKC∶DNA复合物的合适比是0.3mg∶7nmol∶1mg。
在另外的实施方案中，本发明的方法包括制备配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)，并且使配体与阳离子脂质体的表面化学缀合，以形成阳离子免疫脂质体。阳离子脂质体随后与编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子混合，以形成配体靶向的脂质体复合物。用于使配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)与阳离子脂质体化学缀合的示例性方法、组合物、比和条件公开于2001年10月1日提交的美国专利申请号09/914,046，其公开内容通过引用整体合并入本文。
用于在本发明的实践中使用的示例性核酸分子包括DNA和RNA，包括质粒和载体。编码一种或多种病毒蛋白质的核酸分子可以编码任何病毒蛋白质。如本文所使用的，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换用于意指2个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指2个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语，包括在术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”的定义内。
可以由使用本发明递送的核酸编码的病毒肽/蛋白质的例子包括病毒病原体(例如，流感、HIV、埃博拉、痘病毒(天花)、西尼罗病毒、SARS等)等。可以由本发明中利用的核酸编码的病毒蛋白质的另外例子包括但不限于，腺病毒多肽，甲病毒多肽，杯状病毒多肽例如杯状病毒衣壳抗原，冠状病毒多肽，温热病病毒多肽，埃博拉病毒多肽，肠病毒多肽，黄病毒多肽例如西尼罗病毒E糖蛋白，肝炎病毒(AE)多肽例如甲型肝炎、乙型肝炎和/或丙型肝炎，疱疹病毒多肽例如单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白，免疫缺陷病毒多肽例如人免疫缺陷病毒包膜或蛋白酶，感染性腹膜炎病毒多肽，流感病毒多肽例如A型流感多肽例如血凝素或胞外M2蛋白质(M2e)、神经氨酸酶或核蛋白，白血病病毒多肽，马尔堡病毒多肽，正粘病毒多肽，乳头状瘤病毒多肽，拉沙热多肽，副流感病毒多肽例如血凝素/神经氨酸酶，副粘病毒多肽，细小病毒多肽，瘟病毒多肽，细小RNA病毒多肽例如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，痘病毒多肽例如痘苗病毒多肽(例如，天花)，狂犬病病毒多肽例如狂犬病病毒糖蛋白G，呼肠病毒多肽，逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。编码此种病毒蛋白质的核酸分子是本领域可获得的，包括包含此种核酸分子的载体和质粒。例如，公共数据库例如
Figure GPA00001043278100171
包含可以在本发明的实践中利用的核酸分子的各种例子。
编码一种或多种白介素的核酸分子也是本领域众所周知的，并且可从公共数据库例如
Figure GPA00001043278100172
中容易获得。可以由本发明实践中有用的核酸分子编码的示例性白介素包括但不限于，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。在合适的实施方案中，核酸编码IL-2、IL-12或IL-15。
本发明还提供了根据自始至终描述的方法制备的阳离子免疫脂质体复合物。例如，本发明提供了配体靶向的(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段靶向的)阳离子脂质体复合物，其包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中配体与阳离子脂质体直接复合/结合，但不化学缀合。配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)经由在配体和脂质体之间的相互作用(例如，静电、范德华或其他非化学缀合的相互作用)与脂质体适当地结合。一般而言，当非化学缀合时，接头或间隔分子(例如，聚合物或其他分子)不用于使配体和脂质体附着。
如本文所描述的，在另外的实施方案中，配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)与阳离子脂质体化学缀合，例如经由在包含马来酰亚胺基团或其他巯基反应基团的阳离子脂质体和配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)上的硫原子之间的化学相互作用。随后将核酸加入脂质体中，以形成脂质体-DNA复合物，或可以首先加入核酸，并且随后与配体复合。此种方法公开于2001年10月1日提交的美国专利申请号09/914,046中，其公开内容通过引用整体合并入本文。
包含核酸的转铁蛋白(Tf)缀合的脂质体(Tf-Lip-DNA)根据先前描述的配制方法(Xu，等人，″Transferrin-liposome-mediatedsystemic p53 gene therapy in combination with radiation resultsin regression of human head and neck cancer xenografts，″HumGene Ther.10(18)：2941-2952.(1999)，其公开内容通过引用整体合并入本文)进行制备。与辐射组合的转铁蛋白-脂质体介导的全身性p53基因疗法导致人头与颈癌异种移植物的消退。简言之，对于合适的制备，使25ml Tf(5mg/ml，铁饱和的全-转铁蛋白；Sigma，St.Louis，MO)和50ml Lip(2mM总脂质)加上75ml水在聚丙烯管中混合，并且在室温下温育5-15分钟，伴随频繁摇动。将在120ml 20mM HEPES缓冲液，pH 7.4中的10微克质粒DNA加入管中，立即且充分混合，并且在室温下温育20分钟，伴随频繁摇动。随后将30微升50％右旋糖溶液加入管中。最终DNA∶脂质∶Tf比为约1∶10∶12.5(mg/nmol/mg)。在另外的实施方案中，HEPES缓冲液可以由水替换。
核酸分子可以封装在阳离子脂质体内，包含在阳离子脂质体的烃链区域内，与阳离子脂质体的内部或外部单层(例如，首基区域)结合，或其任何组合。适当地，本发明的阳离子免疫脂质体是单层脂质体(即，单个双层)，尽管也可以使用包含数个同心双层的多层脂质体。本发明的单个双层阳离子脂质体包含其中可以封装核酸分子的内部水容积。它们还包含具有烃链区域(即，脂质的脂质链区域)的单个双层，其中可以包含已是中性或大部分不带电的核酸分子。此外，核酸分子可以与脂质体膜的任一或两个，内部单层和/或外部单层(即，脂质的首基区域)复合或结合，例如经由带负电核酸分子和带正电阳离子脂质体之间的电荷-电荷相互作用。在进一步的实施方案中，核酸分子可以在本发明的阳离子脂质体复合物的任何或所有这些区域中封装/结合/复合。
如自始至终讨论的，适当地核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在；特别地，约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子可以在脂质体复合物中使用。自始至终还描述了脂质、靶向性配体和核酸分子的合适量/比。在示例性实施方案中，编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和脂质体，以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质)、适当地约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质)，例如约1∶10(μg总核酸∶μg脂质)的重量比存在。本发明的示例性脂质体组合物包括以约1∶10∶0.33(μg总核酸∶μg脂质∶μg单链抗体)重量比的总核酸、脂质和配体，例如单链抗体(例如，TfRscFv)。
可以由在本发明的阳离子脂质体中利用的核酸分子编码的示例性病毒蛋白质包括自始至终讨论的那些，例如，HIV病毒蛋白质，流感病毒蛋白质，SARS病毒蛋白质，甲型、乙型和/或丙型肝炎病毒蛋白质，禽流感病毒蛋白质和天花病毒蛋白质，以及其他。可以由在本发明的阳离子脂质体中利用的核酸分子编码的示例性白介素包括自始至终描述的那些，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23，并且适当地，IL-2、IL-12和IL-15。
在示例性实施方案中，将用于在本发明的实践中使用的编码病毒蛋白质和/或白介素的核酸置于核酸启动子，例如，如美国公开专利申请号2007/0065432中描述的启动子下游。
本发明还提供了包含自始至终描述的配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物。在合适的实施方案中，药物组合物进一步包括选自下述的一种或多种赋形剂：一种或多种抗菌剂(例如，两性霉素B、金霉素、庆大霉素、新霉素)、一种或多种防腐剂(例如，苄索氯铵、EDTA、甲醛、2-苯氧乙醇)、一种或多种缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、硼酸钠、氯化钠)、一种或多种表面活性剂(聚山梨醇酯20、80)、一种或多种蛋白质稳定剂(例如，白蛋白、乳糖、谷氨酸钾)、糖例如蔗糖或右旋糖、和佐剂(例如，氢氧化铝、磷酸铝)。另外的赋形剂是本领域众所周知的，并且可以容易地在本发明的实践中使用。
本发明还提供了包括第一配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物，所述复合物包括阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、和编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子，其中配体与阳离子脂质体直接复合/结合，但不化学缀合。在进一步的实施方案中，配体可以与阳离子脂质体化学缀合。药物组合物还适当地包括第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包括阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中配体与阳离子脂质体直接复合/结合，但不化学缀合。在进一步的实施方案中，配体可以与阳离子脂质体化学缀合。
在特定的此种实施方案中，编码一种或多种病毒蛋白质的核酸分子在与编码一种或多种白介素的核酸相同的组合物中递送，而不是与相同阳离子脂质体封装/结合，它们与2种(或更多种)不同阳离子脂质体结合，并且随后在相同组合物(即，2种不同脂质体群体混合在一起)中递送。在其他实施方案中，编码一种或多种病毒蛋白质和编码一种或多种白介素的核酸分子可以一起包含在相同质粒载体内。本发明还包含给哺乳动物施用2种分开的免疫脂质体组合物，一种包含编码病毒蛋白质的核酸，并且一种包含编码白介素的核酸。自始至终描述了本发明的药物组合物使用的合适脂质、靶向性分子和核酸分子的例子、以及此种组分的比。
本发明还提供了将一种或多种活性剂递送给哺乳动物的抗原呈递细胞(APCs)的方法。在合适的实施方案中，此种方法包括给哺乳动物施用抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)靶向的阳离子免疫脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、TfRscFv和一种或多种活性剂，其中TfRscFv与阳离子脂质体直接复合/结合，但不化学缀合。在进一步的实施方案中，TfRscFv与阳离子脂质体化学缀合。本发明的此种方法可以用于将试剂递送给在机体的任何器官或组织中的APCs，例如肝、淋巴结、肠和/或呼吸道中的APCs。适当地，APCs可以是例如专业或非专业APCs。“专业APCs”指在其表面上表达MHCII类分子的那些。
在合适的实施方案中，递送的试剂是核酸分子，尽管也可以递送其他试剂，例如化学试剂，包括小分子，以及肽和蛋白质。试剂可以递送给专业以及非专业APCs，包括位于肝、脾、淋巴结、肠和/或呼吸道中的APCs。在示例性实施方案中，递送的试剂编码一种或多种病毒蛋白质(例如，HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质或天花病毒蛋白质)和/或一种或多种白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18或IL-23)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物。在合适的实施方案中，阳离子脂质体复合物包括阳离子脂质体；与阳离子脂质体直接复合/结合但不化学缀合的配体；与阳离子脂质体结合的编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和与阳离子脂质体结合的编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。在进一步的实施方案中，配体与阳离子脂质体化学缀合，例如，通过配体上(例如，在抗体或抗体片段上)的硫基团和脂质体上的基团例如马来酰亚胺基团之间的化学缀合。自始至终描述了示例性配体，并且包括但不限于半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段(例如，scFv抗体片段例如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv))。
如本文所使用的，“诱导针对病毒抗原的免疫应答”指通过其触发哺乳动物(例如任何哺乳动物，例如人)的免疫系统，以鉴定且去除或以其他方式响应病毒抗原的存在的过程。抗原包括引起针对其的抗体产生的任何病毒物质。通过诱导针对一种或多种特定病毒抗原的免疫应答，哺乳动物从而接种疫苗，并且通过抗原的任何进一步妥协将导致抗原的应答/清除。
可以产生针对其的免疫应答的病毒抗原例子包括本领域已知的任何病毒抗原，包括自始至终描述的那些，例如与肝炎(甲型、乙型或丙型)病毒、流感病毒、HIV病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、禽流感病毒、天花病毒等相关的抗原。阳离子脂质体靶向APCs的能力使得核酸分子能够直接且有效地递送给参与引发免疫应答的细胞，从而提供在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的非常有效和有力的方法。
自始至终描述了可以由在本发明的治疗方法中利用的核酸分子表达的合适病毒蛋白质，并且包括但不限于HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。可以由核酸分子编码的示例性白介素包括自始至终描述的那些，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。在示例性实施方案中，在本发明的各种方法中递送的配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
在另外的实施方案中，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法。适当地，该方法包括给哺乳动物施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包括：阳离子脂质体；与阳离子脂质体直接复合但不化学缀合的配体；与阳离子脂质体结合的编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和与阳离子脂质体结合的编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。施用方法包括但不限于，静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。它们可以作为推注或作为输注进行施用。在另外的实施方案中，配体可以使用本文描述的各种方法或本领域已知的其他方法与阳离子脂质体化学缀合。
可以使用本发明的方法治疗或预防的病毒疾病例子包括本领域已知的任何病毒疾病，包括但不限于，自始至终描述的那些，例如肝炎(甲型、乙型或丙型)、流感、HIV、埃博拉、SARS、禽流感、天花等。因此，除在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答外，本发明还提供了治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法。这包括已在近期时间段(例如，小于约1年、适当地小于约6个月或小于约1个月)内感染的哺乳动物，以及具有慢性感染的哺乳动物(例如，已感染例如1年或更久的哺乳动物)。
自始至终描述了用于在本发明的治疗或预防方法中使用的示例性配体，并且包括，各种肽和蛋白质，例如转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段(例如单链Fv抗体片段，例如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv))。自始至终描述了可以由核酸分子编码的示例性病毒蛋白质和白介素，所述核酸分子使用本发明的各种治疗和预防方法递送。在示例性实施方案中，在本发明的各种治疗和预防方法中递送的配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
本发明还提供了在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给哺乳动物施用通过自始至终描述的各种方法制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物。此外，治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法包括给哺乳动物施用通过本发明的各种方法/过程制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物。自始至终描述了用于在这些方法中使用的合适配体、脂质体和核酸。
在本发明的各种治疗/预防方法中(包括诱导免疫应答和治疗或预防病毒疾病，以及递送给APCs)，本发明的各种脂质体复合物可以经由任何所需途径施用。示例性递送途径包括但不限于，静脉内、经口、局部、经由吸入、肌内注射、瘤内注射、皮内注射、经皮注射、皮下注射、腹膜内注射、鼻内注射、眼内注射或滴剂、颅内注射、器官内施用(例如肝内)或其他途径，例如缓慢释放埋植剂或经由渗透或机械泵。它们可以作为推注或作为输注进行施用。
本发明还提供了包括本发明的各种配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物。本发明的药物组合物还可以进一步包括一种或多种赋形剂，例如一种或多种抗菌剂、一种或多种防腐剂、一种或多种缓冲剂和/或一种或多种表面活性剂。
在另外的实施方案中，本发明还提供了包含2种或更多种配体靶向的阳离子脂质体复合物的药物组合物。例如，组合物可以包括第一配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体和编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子。在合适的实施方案中，配体与阳离子脂质体直接复合，但不化学缀合。在其他实施方案中，配体与阳离子脂质体化学缀合。
组合物可以进一步包括第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。适当地，配体与所述阳离子脂质体直接复合，但不化学缀合，而在其他实施方案中，配体与阳离子脂质体化学缀合。
虽然下文阐述的实施例描述了用于递送丙型肝炎病毒(HCV)蛋白质的免疫脂质体复合物的产生，以及HCV感染的哺乳动物的预防性疫苗接种/治疗，但应当理解编码任何病毒蛋白质的核酸分子都可以在本发明的各种方法中利用，并且在自始至终描述的免疫脂质体复合物中结合/封装。由核酸分子编码的最终病毒蛋白质对形成本发明的免疫脂质体复合物的能力没有影响。简单地，核酸分子的负电荷看起来允许核酸分子在阳离子免疫脂质体中结合/封装。因此，本发明并不限于HCV蛋白质的递送，并且相反，包括编码任何病毒蛋白质和/或任何一种或多种白介素的任何核酸(例如，质粒、载体)的递送。
此外，编码不同病毒蛋白质的数种不同核酸可以与免疫脂质体复合物一起封装/结合，并且，本发明因此提供了用于疫苗接种/治疗广泛多样的病毒感染的复合物和方法，所述复合物和方法使用单个脂质体系统，或使用多个不同的脂质体复合物。
对于相关领域中的普通技术人员显而易见的是，无需背离本发明的范围或其任何实施方案，即可对本文描述的方法和应用进行其他合适的修饰和改变。目前已详细描述了本发明，这通过参考下述实施例将更容易理解，所述实施例仅用于举例说明的目的并且不希望是本发明的限制。
实施例1
基于阳离子脂质体的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗接种和治疗系统的制备和使用
与在黑猩猩中天然感染不诱导不受HCV再感染的保护(Farci P.，等人，Science 258：140(1992)；Prince A.M.，等人，J.Infect.Dis.，165：438-443(1992))的先前想法形成对比，目前显而易见的是尽管再感染的确发生，但在恢复的人和黑猩猩中存在导致再感染后病毒复制的立即控制和快速清除的记忆免疫应答。从HCV自发恢复后，静止HCV特异性记忆T细胞可以数十年地在外周血中检测出，在许多情况下不存在可检测的HCV抗体(Takaki A.，等人，Nat.Med.，6：578-582(2000))。HCV特异性细胞免疫应答也在肝中持续，如在恢复的黑猩猩中证实的，并且介导对再感染的保护性免疫(参见例如，Bassett S.E.，等人，Hepatology，33：479-1487(2001))。与初次感染比较，二次感染具有短持续时间且在血液和肝中具有减少的病毒滴度，并且减少肝炎症，如通过丙氨酸氨基转移酶水平(ALT)指示的(Bassset等人)。患者研究表明，类似的记忆应答也在先前暴露后的人中存在，所述记忆应答可以快速控制且清除HCV感染(MehtaS.H.，等人，Lancet，359：1478-1483(2002))。如自始至终描述的，本发明提供了基于T细胞的疫苗，其集中于HCV的非结构蛋白质，且有效递送给APCs(包括但不限于在肝中的那些)用于预防和治疗。肝是HCV复制的主要位点，并且因此在肝中免疫应答的诱导模拟在天然感染过程中诱导的免疫应答，并且在攻击后导致保护或病毒的快速清除。
丙型肝炎病毒(HCV)是具有单链、正义RNA基因组的包膜病毒。RNA长度是～9.6kb，并且由～341个碱基的5′非翻译区(NTR)、编码所有病毒特异性蛋白质的长开放读码框(～3011个氨基酸)和3′NTR组成。基因组RNA的翻译不依赖于帽，并且由充当内部核糖体进入位点的5′NTR介导。所得到的多聚蛋白通过2种宿主和2种病毒蛋白酶进行共翻译和翻译后切割，以产生下述产物：NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH。结构蛋白质(C、E1和E2)位于N末端；非结构(NS)组分在其余部分中编码(关于综述参见(Major M.E.，等人，Hepatitis C Viruses.In：FieldsVirology，Knipe D.M.和Howley P.M.(编辑)，Lippincott，Williams& Wilkins，第1127-1161页(2001)，其公开内容通过引用整体合并入本文)。与所有RNA病毒一样，HCV RNA复制是易错的，导致变体的连续产生。此种变体提供可以快速适应选择压力例如由免疫应答施加的压力的库或“准种”。这种变异性可能对于HCV存活和进化是重要的，但它也使得关于HCV分子生物学、发病机理、免疫应答和最终疫苗开发的精确研究变得困难。
HCV的传播一般通过肠胃外途径，但也的确发生粘膜传播，例如性和母婴传播。在慢性丙型肝炎的治疗中已取得显著进展。用聚乙二醇化IFN-α和利巴韦林的目前疗法在约50％病例中清除HCV感染，但治疗仍是非常昂贵的，需要6-12个月的治疗，并且携带严重副作用的显著危险。预防疫苗在美国和全世界对于HCV相关疾病的最后控制是重要的。还需要免疫方法以进行治疗。
尽管具有嵌合人肝的SCID小鼠模型的开发，但黑猩猩仍是唯一建立的关于HCV感染的动物模型(在Grakoui A.，等人，Hepatoiogy，33：489-495(2001)中综述)。因此，它是其中可以施用实验疫苗并且评估其有效性的唯一模型。参与黑猩猩免疫系统的许多蛋白质与人直向同源物等同或非常紧密相关，从而使得检测所需的试剂是可互换的。由于极端的成本，不可能在黑猩猩中测试所有有希望的HCV疫苗方法。迄今为止的疫苗研究已使用正常免疫能力小鼠以测试许多免疫接种策略(参见例如，Forns X.，等人，Vaccine，17：1992-2002(1999))。表达人I类MHC分子的转基因小鼠已用于特异性HCV表位分析和替代保护系统(Qiao M.，等人，Hepatology，37：52-59(2003))。迄今的疫苗策略已基于重组蛋白质、病毒载体、病毒样颗粒和基于DNA的免疫接种。存在急性感染的清除中涉及针对HCV NS3的免疫应答的强烈支持(Diepolder H.M.，等人，J.Virol，71：6011-6019(1997))。这种抗原目前视为任何HCV T细胞疫苗的重要组分。报告已指出在表达NS3蛋白质的构建体中包括NS4A在小鼠中导致更佳的表达和改善的免疫应答(Frelin L.，等人，Gene Ther.，10：686-699(2003))。也已鉴定广泛的多特异性T细胞应答在HCV感染的清除中是重要的，因此NS5A和NS5B蛋白质将是重要的T细胞疫苗组分。
HCV与美国40-60％的慢性肝病相关。在这些患者中，三分之一继续发展进行性纤维化和肝硬化(Liang T.J.，等人，.Ann.Intern.Med.，132：296-305(2000))。丙型肝炎目前已取代乙型肝炎成为日本的肝细胞癌(HCC)主因，并且根据CDC，每年仅在美国就存在8,000-10,000例由于HCV相关肝硬化和癌症的死亡。HCV相关HCC的机制未知。主要假定它由经过多年感染的慢性免疫介导的肝细胞损伤和再生诱导。HCV核心基因产物已显示与许多细胞蛋白质相互作用。它包含核定位信号，具有RNA结合活性，并且已显示在细胞中执行多种功能，例如反式激活和阻遏(Matsumoto M.，等人，J.Virol，71：1301-1309(1997))。鉴定HCV核心的反式激活子或阻遏子功能的这些研究已使用比生物水平高数个数量级的体外表达水平。然而，此种蛋白质以低水平表达数十年可能在受感染细胞中导致不利事件，这可能对HCC进展起作用。对抗HCC的最佳方法是通过预防、早期检测和更佳治疗。因此，通过预防丙型肝炎病毒感染，还可以预防HCC。
关于HCV复制的主要储库被认为是肝，与受感染个体中的肝病理学一致，尽管仍未鉴定支持HCV复制的特定细胞类型。正常肝在介导免疫应答中起重要作用。与大多数器官不同，存在抗原在肝中的呈递可以导致幼稚T细胞激活的证据(Bertolino P.，等人，Cell Biol，80：84-92(2002))。在进入肝后，血液中的抗原首先与窦状细胞群体——肝窦状上皮细胞(LSEC)和枯否细胞接触。抗原递送给肝导致T细胞的局部激活(可能通过上述2种细胞，这两者已显示充当抗原呈递细胞)。抗原在肝中的呈递可以导致T细胞初敏或T细胞耐受。
与阳离子免疫脂质体用于癌症治疗和肿瘤靶向的用途(如在美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796中)相反，呈现的实施例利用TfRscFv-脂质体(包括或不包括HK肽)复合物，以将待有效摄取的表达HCV蛋白质的DNA(受体介导的内吞作用和增强的内体释放)和呈递的抗原递送给T细胞，无论它们存在于机体内何处(包括在肝中)。
TfRscFv的存在提供了受体介导的内吞作用，以使阳离子脂质体复合物有效移动到细胞内，同时HK肽增强(尽管不是必需的)DNA内体释放到细胞质内。
已执行在体外使用数种脂质体复合物以测定在体内用于肝细胞的最合适制剂的比较研究。测试了2种肝细胞特异性配体——半乳糖(GAL)(与去唾液酸糖蛋白受体结合)和L-37pA(与清道夫受体SR-B1——关于HCV的假定受体结合)。这些与未修饰的脂质体制剂和用转铁蛋白(Tf)受体的单链Fv片段(TfRscFv)修饰的复合物进行比较。在这些分析中使用3种脂质类型：脂质A(DOTAP∶DOPE，1∶1摩尔比)；脂质D(DOTAP∶Chol，1∶1摩尔比)；和脂质G(DOTAP∶DOPE∶Chol，1∶1∶1摩尔比)。比较了3种样品制备方法。方法A：其中使DNA与配体修饰的脂质体直接混合的预包被法。方法B：其中在配体与脂复合物的表面缀合前，使DNA与脂质体混合以形成阳离子脂质/DNA核心(脂复合物)的后包被法。方法C：其中使DNA与脂质体或具有组氨酰化寡聚赖氨酸(HoKC)肽修饰的脂质体混合以形成脂复合物，这之后加入携带特定配体的阴离子(PSchol)或中性(PCchol)脂质体以封装脂复合物。
A.方法
1.复合物形成
通过化学缀合的复合物形成
用于制备包含抗体或抗体片段的阳离子免疫脂质体的示例性方法公开于2001年10月1日提交的美国专利申请号09/914,046中，所述抗体或抗体片段与脂质体的表面直接化学缀合，所述美国专利申请的公开内容通过引用整体合并入本文。例如，4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸盐-DOPE(MPB-DOPE)(Avanti Polar Lipids)包括在上文描述的7种脂质体制剂中，至5-8％摩尔的总脂质。MPB-脂质体通过本领域众所周知的方法进行制备。例如，从Campbell MJ(Biotechniques1995 Jun；18(6)：1027-32)描述的那种改良的乙醇注射法可以在本发明中使用。简言之，使所有脂质溶解于乙醇中且混合，用Hamilton注射器注入50-60℃的涡旋纯水内。使溶液涡旋另外10-15分钟。终浓度是1-2mM总脂质。加入1M HEPES，pH 7.5(pH7.0-8.0)至10-20mM的终浓度。因为马来酰亚胺基团在pH＞7的水溶液中不稳定，所以脂质体应在水(pH 5-6.5)中制备。在与scFv-SH连接前，pH可以用1MHEPES缓冲液，pH7.0-8.0调整至7.0-8.0，以促进后包被反应。
以约1∶1至约1∶100、适当地约1∶10至约1∶50(w∶w)、更适当地约1∶20至约1∶40的蛋白质/脂质比，将scFv-SH加入MPB-脂质体中。溶液通过轻轻旋转(～20-30RPM)在室温下混合30分钟，以产生scFv-Lip。scFv-Lip无需纯化而使用，尽管它也可以通过SepharoseCL-4B柱层析进行纯化。将质粒DNA稀释于水中，并且以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质)、适当地约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质)，例如约1∶10(μg总核酸∶μg脂质)的DNA/脂质比加入scFv-Lip中，以产生scFv-Lip-DNA复合物。scFv-Lip-DNA无需纯化而使用，尽管它也可以通过Sepharose CL-4B柱层析进行纯化。可以预期80-100％scFv与脂质体缀合。
通过简单混合的复合物形成
缀合的TfRscFv-免疫脂质体保留其免疫活性。也已确定cys-TfRscFv可以与脂复合物化学缀合(参见2001年10月1日提交的美国专利申请号09/914,046)，并且可以在体外和体内有效转染人前列腺肿瘤细胞。使用各种化学缀合方法使单链抗体片段与脂质体附着是通常的实践。也已确定cys-TfRscFv和阳离子脂质体(其不包含任何具有可还原基团的脂质例如马来酰亚胺DOPE或任何可还原基团)的简单混合，而非化学缀合，导致免疫活性复合物形成，其中配体与脂质体直接结合，无需使用接头或化学缀合分子，所述复合物仍与肿瘤细胞有效结合且转染肿瘤细胞(参见例如美国公开专利申请号2003/0044407，其公开内容包括其中公开的组合物和方法通过引用合并入本文)。
通过在混合的复合物中使cys-TfRscFv与脂质体复合物A以在自始至终描述的范围中的单链蛋白质比脂质体和DNA比n moles(或ug)总脂质的限定比混合，制备cys-TfRscFv-免疫脂质体复合物。下文描述的复合物制备依照下述一般操作。使合适量的2mM脂质体(上文描述的A-H)与所需的任何水(例如，DI水)混合，以给出所需体积，并且倒转以混合。向脂质体-水混合物中，加入合适量的cys-TfRscFv，以给出所需比，并且通过轻轻倒转混合约1秒至约2分钟。使这种混合物保持在室温下约10分钟至约20分钟(在约5分钟后轻轻倒转5-10秒)。同时，通过倒转使合适量的DNA与所需的任何水混合约1秒至约2分钟，以给出所需体积。一般地，对于在体外测定法中的使用，希望DNA浓度在约0.01μg至约2μg/孔的范围中；对于体内使用，希望提供约5μg至约100μg DNA/注射。将DNA溶液快速加入cys-TfRscFv-脂质体溶液中，并且使混合物倒转约1秒至约2分钟。使最终的混合物维持在室温下约10分钟至约20分钟，在约5分钟后轻轻倒转5-10秒。对于体内使用，加入50％右旋糖或50％蔗糖至1-20％(V∶V)、适当地5-20％(V∶V)终浓度，并且通过轻轻倒转混合约1秒至约2分钟。以1∶30(cys-TfRscFv∶脂质体，w∶w)和1∶14(μgDNA∶nmole总脂质)的合适比的具体例子如下。对于终体积800μl的40μg DNA，使183μl水与280μl 2mM脂质体溶液混合。加入34μl cys-TfRscFv(具有0.4μg/ml的浓度)。使183μl水与40μl 1μg/1μl DNA混合。加入80μl 50％右旋糖作为最后一个步骤。
通过本发明的方法制备的最终复合物大小为约100至400(nm)，具有正ζ电位，如通过动态光散射使用Malvern
Figure GPA00001043278100301
3000或Malvern
Figure GPA00001043278100302
NANO-ZS测定的。这个大小足够小以有效经过肿瘤毛细血管床并且到达肿瘤细胞，并且也足够小以有效经过毛细血管床并且到达靶APC细胞。
2.评估针对HCV特异性抗原的免疫应答
靶HCV抗原
在疫苗研究中包括的HCV抗原是NS3直到NS5B。这些序列得自基因型1aH77株系。参见Major M.E.，等人，Hepatitis CViruses.In：Fields Virology，Knipe D.M.和Howley P.M.(编辑)，Lippincott，Williams & Wilkins，第1127-1161页(2001)，其公开内容通过引用整体合并入本文。在恢复的动物中单独针对这种抗原的T细胞应答的增强导致短暂、临床上不显著的感染(参见下文)。对于在CMV启动子的控制下表达抗原的质粒，已使用293-T和Huh 7.5细胞。对于腺病毒载体，使用AD-293细胞系。通过免疫荧光染色且通过用特异性抗体的蛋白质印迹测定表达。
腺病毒载体
使用
Figure GPA00001043278100311
系统表达HCV基因的人腺病毒血清型5重组体适当地在本发明中使用(Stratagene，CA)。这个载体已通过E1和E3基因的缺失使得复制有缺陷。通过在大肠杆菌中重组将目的基因引入腺病毒主链。随后将重组质粒转化到AD-293细胞内，在其中补充缺失的病毒装配基因以产生病毒颗粒。腺病毒也是关于HCV治疗的吸引人的病毒载体，因为这种病毒可以在肝中有效表达转基因。
白介素-12(免疫增强)
白介素-12(IL-12)诱导IFN-γ产生，支持Th1超过Th2细胞的分化，并且使先天性抗性与适应性免疫连接。在感染过程中DCs和吞噬细胞响应病原体产生IL-12。为了改善免疫接种且刺激有效的Th1型应答，在阳离子免疫脂质体制剂中包括表达IL-12的质粒。已制备表达小鼠和人IL-12的质粒，以便达到小鼠和灵长类动物研究之间的一致性。
小鼠接种
研究涉及使用表达HCV抗原的重组载体的DNA引发/腺病毒加强。在第0和4周时用在本文公开的脂质体复合物中的20-30μg DNA接种小鼠，并且在10-12周时用重组腺病毒(108感染单位，皮下(s.c.))加强。这次加强后4周，通过流式细胞术分析肝和脾，以测定在肝中的T细胞特征。T细胞可以使用Ficoll梯度与肝细胞分开，并且使用标记抗体就特异性表面标记进行染色。作为对照，包括PBS处理的小鼠，肌内(i.m.)(1至50μg/小鼠)、腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)和皮内(i.d.)(1-50μg/小鼠)注射的无配体脂质体/DNA复合物、携带空载体的复合物、裸露DNA，和用复合物i.m.或i.d.接种的小鼠。最佳化剂量和时机，并且评估经过6个月时期T细胞在肝中的持续和回忆，以基于肝内T细胞数目和标记确定最佳系统。因为转铁蛋白受体在树突细胞上表达，并且通过受体介导的内吞作用摄取复合的DNA，scL-HCV或scLHK-HCV复合物的i.m.和/或i.d.接种预期导致比裸露质粒DNA更佳的全身应答。T细胞群体可以基于CD45RA、CD62L、CD27和CCR7的表达进行鉴定。IL-7Rα提供了可以区分短效的效应细胞与发育成功能记忆细胞的那些的有用标记。这些标记在初步小鼠研究中使用，以分析候选疫苗建立长期免疫的潜力。存在关于在黑猩猩中HCV清除后记忆CD8+T细胞在肝中的选择性保留的证据，与在清除后6个月的血液比较，在肝中具有高～10倍的水平。
脾和肝内T细胞的特异性通过体外免疫测定法进行评估。最初，使用纯化的HCV抗原或重叠18肽的Elispot测定法用于分析分泌IFN-γ或IL-4的细胞。还使用从免疫接种小鼠的脾中分离的细胞和购自Mikrogen(Germany)的全蛋白质执行增殖测定法。利用HLA-A2转基因小鼠。这些小鼠表达HLA-A2MHC分子，并且可以呈递HLA-A2表位。这些转基因小鼠可以使用与用于BALB/c小鼠的那种相同的方案进行免疫接种，但可以在免疫学测试中使用由HLA-A2单元型识别的肽。对于这些分析，使用对于这种单元型特异的NS5A和NS5B鉴定的HLA-A2四聚体和表位。在FACS缓冲液(1％BSA，在不含钙的PBS中的0.1％叠氮化钠)中，用呈递特异性肽的四聚体-藻红蛋白(PE)和对于表面标记(CD4，CD8)特异的FITC标记的抗体在室温下或在冰上染色肝衍生细胞30分钟。使用软件Cellquest(Becton Dickenson)在FACS-Calibur(Becton Dickenson)上获得事件用于分析，使用7AAD(BD Pharmigen)以排除死细胞。使用得自首次用于实验或模拟接种小鼠的T细胞测定非特异性背景染色。对于克隆，淋巴细胞进行抗原刺激且以有限稀释与γ辐射的同基因APCs加上IL-2和IL-7共培养，并且就HCV特异性增殖进行测试。
B.结果
1.在体外使脂质体复合物靶向人肝细胞癌(Hep3B)细胞。
使Hep3B HCC细胞(5×104)种在24孔皿中，并且用如上述所述的与DNA质粒(0.05ug/孔)复合的脂质体转染，所述DNA质粒在哺乳动物启动子的控制下表达萤光素酶基因。用于scL-HCV的比是0.33ug∶10ug(14nmol)∶1ug(TfRscFv∶LipA∶DNA)，并且对于scLHK-HCV，它们是0.33ug∶7nmol∶1ug(TfRscFv∶LipA-HoKC∶DNA)。转染后24小时，使用Luciferase Assay System(Promega，Madison，WI)测定萤光素酶活性。结果在图1中作为平均值+SD(n＝3)显示。使用与抗转铁蛋白受体单链抗体片段(sc)复合的脂质体获得有效转染，对于sc/LipA和sc/LipA-HoKC复合物分别具有257,815RLU和1,120,643RLU的萤光素酶值(图1)。使这与对于与未修饰的脂质A(LipA)复合的萤光素酶质粒的538.9RLU/μg蛋白质的萤光素酶值比较。当HoKC肽掺入脂质体复合物时，DNA进入这种肝细胞系内的转染效率的这种增加与使用前列腺和胰腺细胞系的先前观察一致。
2.在体外使脂质体复合物靶向原代黑猩猩肝细胞。
正常肝细胞不具有与肝细胞癌细胞相同的受体水平，因此在原代黑猩猩肝细胞中比较与TfRscFv(sc)、半乳糖(GAL)和L-37pA配体缀合的脂质复合物组。将50,000个原代黑猩猩肝细胞种在24孔板中，并且用含或不含HoKC肽的携带萤光素酶报道基因的复合物转染(0.1μg DNA质粒/孔)。通过上文公开的简单混合方法制备sc/Lip-HoKC/DNA(泳道1-3)和sc/Lip/DNA(泳道7-9)复合物，即，以0.33ug sc∶7nm Lip-HoKC和0.33ug sc∶14nmol Lip的比，使TfRscFv与合适脂质体(含或不含HoKC)混合，通过用手轻轻倒转10次或在20-30PRM下旋转15-60秒混合，并且在室温下保持10-15分钟。随后将DNA加入sc/Lip-HoKC或sc/Lip混合物(以1ug DNA∶7nmol(对于Lip-HoKC)和1ug DNA∶14nmol(对于Lip)的比)，并且通过用手轻轻倒转10次或在20-30PRM下旋转15-60秒混合溶液，并且在室温下保持10-15分钟。无配体的复合物也以相同比并且根据相同操作制备为对照(泳道4-6和10-12)。通过使L-37pA配体与脂质体(A，D或G)化学缀合形成使用L-37pA配体的复合物(泳道19-21)，所述脂质体包含6.7％摩尔比的Lip-马来酰亚胺。Lip-Mal与L-37pA以14∶7(nmol∶nmol)(Lip∶L-37pA)的比混合，并加入1.5mM HEPES缓冲液(终浓度)，并且在20-30RPM下在室温下旋转3小时。然后，以1ug DNA∶14nmol Lip的比加入DNA，如上所述混合，并且在室温下保持15分钟。为了比较，还使用不同方法以形成具有GAL配体的复合物(泳道13-18)。此处，将DNA加入任何所需水中，并且如上混合。将脂质体A、D或G(含或不含HoKC)加入任何所需水中，并且如上混合。使2种溶液在室温下保持15分钟，随后加在一起，如上混合并且在室温下保持15分钟，以形成阳离子脂质体/DNA核心。GAL配体先前以1∶1∶0.05(PS∶chol∶GAL)的摩尔比与阴离子(磷脂酰丝氨酸∶胆固醇)脂质体缀合。这种PScholGAL混合物随后加入预形成的阳离子脂质体/DNA复合物，溶液如上混合并且在室温下保持15分钟，以封装阳离子脂质体/DNA核心。用于这些复合物的组分比是：7nmol∶7nmol∶1ug(PScholGAL∶Lip-HoKC∶DNA)和7nmol∶14nmol∶1ug(PScholGAL∶Lip∶DNA)。转染后48小时，使用如上所述的萤光素酶测定系统测定萤光素酶活性。图2显示在原代黑猩猩肝细胞中通过萤光素酶RLU/μg蛋白质测定的转染效率。用所有3种方法且使用所有3种配体形成的复合物能够转染这些原代黑猩猩肝细胞。使用原代黑猩猩肝细胞，与使用的脂质无关，与sc复合的脂质体给出比使用不同方法与GAL(15,509RLU)或L-37pA(19,662RLU)复合的最佳脂质体几乎高10倍的转染效率(～150,000RLU)。如预期的，由于在正常肝细胞上假定的低数目Tf受体，sc/脂质体的总体转染效率比相同复合物在Hep3B细胞中时低直至16倍。然而，HoKC肽的包括使得使用TfRscFv的转染效率增加10倍。如先前使用Hep3B细胞观察到的，当HoKC肽与GAL配体一起包括时，观察到用GAL和L-27pA配体的最佳转染效率。因此，这些研究证实scLHK-DNA复合物在将DNA递送到正常肝细胞内方面高度有效，并且其他配体也可以在复合物中用于转染正常肝脏肝细胞。
3.在体内使脂质体复合物靶向肝脏细胞。
在体外实验后，使用非荷瘤BALB/c小鼠和特定脂质体复合物在体内执行测试。用在400μl脂质体复合物中的表达EGFP的20-25μg DNA质粒经由尾部静脉i.v.接种6-9周大的动物，所述脂质体复合物如上所述以上文给出的比制备，经过24小时的时间段接种2-3次。在最后一次接种后24-48小时时，使来自肝、脾、肾、肺和心脏的组织小片在液氮中速冻并且贮存于-70℃。此外，使肝组织小片在福尔马林中固定用于组织学分析。对于蛋白质印迹分析，使用包含蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的T-PER组织提取试剂(Pierce，Rockford，IL)提取肝组织，并且在离心后收集上清液以去除细胞碎片。使用BCA蛋白质测定试剂试剂盒(Pierce，Rockford，IL)评估蛋白质浓度，并且使用单克隆抗GFP抗体(BAbCo)和ECL蛋白质印迹试剂盒(Yu W，等人，Nucleic Acids Research，32.e48(2004))分析40μg总蛋白质。用抗GAPDH抗体处理相同膜以建立相等蛋白质装载/孔。图3显示与未处理小鼠(UT)比较，来自用与脂质A(scLA)、脂质A和HoKC(scLAHK)、脂质D和HoKC(scLDHK)、脂质G和HoKC(scLGHK)缀合的TfRscFv配体(sc)、与脂质A缀合的半乳糖(GalLA)和与脂质A缀合的L-37pA(L-37pALA)接种的一式两份小鼠的肝提取物的蛋白质印迹。左手泳道显示关于GFP和GAPDH的阳性对照(PC)。所有脂质体复合物导致GFP在接种的小鼠的肝中的表达。当使用脂质A时(比较scLA和scLAHK)，HoKC肽的包括改善DNA至小鼠肝的递送。用scLGHK脂质体复合物观察到最高水平的表达，尽管这仅在2只小鼠的1只中出现，并且scLAHK复合物看起来在重复动物中给出更一致强烈的GFP蛋白质表达。GalLA和L-37pALA修饰的脂质体也导致GFP的表达，但处于更低的水平。
总之，这个数据表明，尽管可以使用所有3种配体，但在脂质体中包含靶向性配体TfRscFv和HoKC肽的基因递送媒介物对于肝脏细胞比半乳糖或L-37pA肽更佳。这些结果是出乎意料的，因为半乳糖通常用于靶向肝脏细胞(Wu，J.，等人，″Targeting Hepatocytes for Drugand Gene Delivery：Emerging Novel Approaches and Applications，″Frontiers in Bioscience 7：d717-725(2002)。
4.诱导针对HCV的免疫应答的DNA和病毒载体的构建
使用本领域技术人员众所周知的标准克隆方法，已构建DNA载体以在高表达启动子(pAG410)的控制下表达HCV的NS3直到NS5B蛋白质。用于表达这些HCV特异性蛋白质的主链载体已由FDA批准用于临床使用，并且目前处于使用癌症特异性制剂的患者I期临床试验中。已在体外使用293T和Huh7.5(肝细胞)细胞测试表达，并且通过蛋白质印迹(图4)和免疫荧光(数据未显示)分析显示特异性表达HCV抗原。使用制造商的方案使用Lipofectin(Invitrogen，CA)转染6孔皿中的细胞。48小时后，细胞就特异性基因表达进行分析。对于蛋白质印迹分析，使用包含蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的250μlM-PER试剂(Pierce，Rockford，IL)裂解细胞。使用8-20％SDS-PAGE梯度凝胶(Invitrogen)通过蛋白质印迹分析80微克总蛋白质。将蛋白质转移至PVDF膜，并且用1∶500稀释的针对NS5B的单克隆抗体或1∶500稀释的慢性黑猩猩血清探测。使用抗人或抗小鼠IgG HRPO缀合物和化学发光(West Pico system，Pierce，Rockford，IL)显现蛋白质。图4显示与用pAGVec(空载体)转染的细胞比较，对于NS3、NS4B、NS5A和NS5B观察到的特异性条带。也已使用标准克隆方法构建腺病毒重组体，以个别表达这些相同抗原中的每一种。来自这些病毒载体的每一个的表达也通过蛋白质印迹分析加以验证(数据未显示)。
5.克隆到高表达启动子内的人IL-2的增强效率
对于充当有效佐剂分子的ILs，它们必须以足够高的水平表达，以有效刺激Th-1T细胞应答。将它们置于高表达启动子的控制下是实现这点的一种方法。为了证实通过这种方法可能实现ILs高水平表达，将人IL-2克隆到在高表达启动子的控制下的pSCMV载体内(参见公开的美国专利申请号2007/0065432，其公开内容通过引用并入本文)。测试在体内的表达水平，并且与来自标准CMV启动子的那种比较。在2种情况下，通过如本文所述制备的不含HoKC肽的靶向的脂质体纳米复合物递送质粒。通过皮下接种PANC-1肿瘤组织，在4-6周大的雌性无胸腺裸鼠中诱导PANC-1人胰腺癌异种移植物肿瘤。约3周后，肿瘤平均为400-700mm3，并且动物经过6天用纳米免疫脂质体复合物给予6次i.v.(尾部静脉)注射，所述复合物使用比(0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA))并且通过如上所述的简单混合进行制备，携带在标准CMV启动子或高表达启动子的控制下的IL-2基因(40ug DNA/注射)。在最后一次注射后24小时处死小鼠。收集肿瘤和肺组织，在液氮中闪冻，并且使用标准技术，通过使用针对hIL-2的商业多克隆抗体和ECL检测的蛋白质印迹分析就hIL-2蛋白质表达水平进行分析。如图5中所示，来自接受携带psCMV-hIL-2质粒的复合物的动物的所有肿瘤证实在肿瘤中的高表达水平。相比之下，hIL-2表达在其中hIL-2基因处于标准CMV启动子的控制下的肿瘤中不明显。
6.在经由scL i.v.递送后在小鼠组织中的HCV DNA序列/表达的检测
执行实验以评估在scL-pAG410复合物的全身施用后，在各种非荷瘤小鼠组织中编码NS3直到NS5B的基因的存在。BALB/c小鼠(3只/组)用与scL(单链转铁蛋白抗体靶向的阳离子脂质体)复合或作为游离质粒DNA的质粒pAG410DNA(25ug/小鼠/注射)i.v.注射2次(相隔8小时)。通过如上所述的简单混合以(0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA))的比制备复合物。一组小鼠接受以相同方式和相同比制备的携带空pSCMV载体的scL。注射后48小时处死动物。收集肝、肺、脾和胸腺，并且在液N2中闪冻。部分样品使用DNeasyExtraction Kit(Qiagen)用于分离DNA，以用于PCR。在分开的反应中使用Taq Gold聚合酶执行DNA PCR(1ug DNA)，使用引物以扩增NS3、NS5A和NS5B。PCR条件如下：在50ul总体积中的6ng DNA、2mMMgCl2；各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP；300nM各种引物；和1.25单位AmpliTaq。通过使反应混合物在94℃下温育10分钟，随后为在94℃下15秒和60℃30秒的40个循环，然后60℃7分钟来执行扩增。图6显示关于在肝中的NS3基因的PCR数据，尽管信号差异对于NS5A和NS5B是相似的。在接受复合的对游离的pAG410的小鼠之间在所有器官中在拷贝水平上存在显著差异。与肝相似(图6)，在肺、脾和胸腺中，scL-pAG410具有强PCR条带，同时用游离DNA不存在检测出的信号。如预期的，不存在来自载体处理的小鼠的信号。因此，复合的HCV质粒DNA的i.v.递送导致在肝和其他器官中的细胞的有效摄取。这些结果证实且支持这种方法用于将HCV抗原全身递送给正常肝和其他正常细胞的可行性。
7.小鼠的免疫应答
小鼠无法被HCV感染。然而，为了评估诱导的T细胞应答的功效，表达HCV的NS3蛋白质的重组痘苗病毒(rVV)用作替代病毒攻击模型。这种类型的rVV模型是本领域众所周知的，并且是评估T细胞应答的体内功效的公认方法。小鼠(3只/组)在0和4周时用HCV和IL-12质粒DNA进行I.V.接种，所述质粒DNA是如上所述scL复合的或作为游离质粒DNA。通过如上所述的简单混合使用0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)的比制备TfRscFv/Lip/DNA复合物。DNA以等摩尔量(总共50ug/小鼠/注射)混合。小鼠在8周时用表达HCV的NS3蛋白质的106噬斑形成单位(pfu)rVV进行攻击。在攻击后5天时，从小鼠中取出卵巢，在PBS中匀浆化，并且实施3轮冻/融和超声处理。对于滴定，使卵巢提取物(100ul)与100ul胰蛋白酶和100ul PBS组合，并且在37℃下温育30分钟。在2％FBS/EMEM中执行稀释(从10-1到10-6的10倍稀释)，并且250ul用于感染在12孔皿中的一式两份孔的BSC-1细胞。在转染后2天时，去除培养基并且使细胞固定且用结晶紫(20％乙醇、20％甲醛、0.3％结晶紫)染色。组1接受PBS，组2接受scL复合的pAG410和IL-12质粒，组3接受scL复合的空载体和IL-12质粒，并且组4接受作为裸露DNA的pAG410和IL-12质粒。图7显示在每个组中表示为pfu/卵巢的rVV滴度。点表示单独的小鼠，并且黑色条表示平均滴度/组。与PBS组比较，用scLpAG410/IL-12复合物的免疫接种导致病毒滴度的高度显著的减少(p＝0.002)，如使用斯氏T分布评估的。Gp2中的104平均滴度对Gp1中的106。有趣的是，用scL复合的IL-12载体连同空主链载体一起接种小鼠也导致病毒滴度的显著减少(2×105pfu/卵巢的平均滴度)，尽管不如与pAG410质粒组合时可见的那种减少那么多。对病毒复制的这种作用是使用scL递送的结果，因为用作为裸露DNA的pAG410和IL-12的免疫接种(Gp 4)不导致病毒滴度的显著减少。这个数据表明，用scL复合的DNA免疫接种导致T细胞应答的诱导，这种T细胞应答可以保护免受病毒攻击，并且这些免疫应答优于使用裸露DNA诱导的那些。这个数据表明表达细胞因子的质粒单独的scL递送也可以诱导抑制病毒复制的免疫应答。
8.在用scL复合的DNA免疫接种后的肝内T细胞浸润
为了评估用scL复合的DNA的免疫接种是否导致在用嗜肝病毒感染后更佳的肝内T细胞浸润，在免疫接种后8周用3×108感染颗粒的表达NS3、NS5A和NS5B HCV蛋白质的非复制腺病毒重组体I.V.攻击上文描述的相同4组(在0和4周时用如上等同的复合物进行免疫接种)。攻击后10天，收获肝组织，进行福尔马林固定，并且使用本领域众所周知的标准方案包埋在石蜡块中。切片进行H&E染色并且就T细胞浸润进行分析。在不同小鼠组中评估肝浸润T细胞的数目。对于3只小鼠/组的每一只计数3个视野。使关于每个组的计数组合且求平均值以给出T细胞数目/视野(fov)。数据通过斯氏T检验进行分析。在接受scL pAG410/IL-12的小鼠中的平均T细胞浸润显著高于在接受PBS的小鼠中的那种，118.8个T细胞/fov对70.2个T细胞/fov(p＝0.000007)。这与关于接受scL-载体/IL-12的小鼠的71.5个T细胞/fov比较。在接受裸露pAG410/IL-12的小鼠中也存在显著更高水平的T细胞浸润，108.75个T细胞/fov(p＝0.001)，但以比用scL-pAG410/IL-12少的程度。这些观察证实用表达HCV抗原的scL复合的质粒的免疫接种导致在用重组嗜肝病毒感染后在肝中更佳的T细胞应答。
9.关于HCV特异性RNA、抗原和免疫应答的表达和测试的工具的开发。
使用Sindbis表达系统，已改造表达重组病毒以表达HCV的核心、E1E2和NS3蛋白质。这些蛋白质随后进行组氨酸标记，以促进使用镍柱的纯化。执行有效纯化并且通过蛋白质印迹分析测定特异性(使用小鼠单克隆或兔多克隆抗体)。已从具有针对HCV的E1E2、NS3和NS5A蛋白质的高滴度抗体的受感染黑猩猩鉴定慢性期血清。这种灭活血清已在数种蛋白质印迹和免疫荧光测定法中用于成功检测来自重组DNA和病毒载体的HCV抗原表达。从Mikrogen(Germany)商购可得的NS3、NS5A和NS5B蛋白质也已用于检测在黑猩猩中针对HCV的T细胞应答(使用ELISpot、增殖测定法和流式细胞术分析)。已也从NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program获得与1a H77基因型序列对应的一组重叠18肽，所述1a H77基因型序列也已在使用黑猩猩外周血单核细胞(PBMCs)的Elispot测定法中成功使用。已开发ELISAs用于测试针对大多数HCV抗原，核心、E1E2、NS2、NS3、NS5A和NS5B的抗体。近期研究已显示使用ELISA获得的抗E1E2滴度已证明是在受感染黑猩猩中的中和抗体滴度的良好指示物。已也开发巢式和实时PCR测定法，以检测且定量在血清中的HCV RNA。已评估了这些测定法的灵敏度和特异性，并且使用巢式PCR可以检测出少至40个RNA拷贝/mL，并且使用实时PCR可以检测出少至200个RNA拷贝/mL(74WHOIU/mL)。所有这些试剂和检测系统对于来源于在黑猩猩中在感染的早期急性期过程中收集的血浆的单克隆病毒特异，所述黑猩猩用由HCV基因型1a(HCV-H)感染性克隆转录的RNA接种。
10.在HCV攻击前首次用于实验和恢复的黑猩猩的预防疫苗接种
已检查了疫苗引发糖蛋白特异性或非结构蛋白质特异性免疫应答以改变HCV感染病程的能力。这些研究显示中和抗体(nAb)和疫苗诱导的T细胞可以改变在黑猩猩模型中的HCV感染。
a)基于包膜的疫苗改变HCV感染。
已开发了产生用于在疫苗实验中使用的HCV E1E2蛋白质的表达和纯化系统。使用Sindbis表达系统表达组氨酸标记的E1E2蛋白质，并且使用GNL凝集素和镍柱——本领域良好建立的方法纯化至＞80％纯度。通过使用针对E1和E2的单克隆抗体的蛋白质印迹和SDS PAGE凝胶的银染色评估特异性和纯度。2只黑猩猩，一只首次用于实验(Ch1601)和一只从急性HCV感染恢复(Ch1587)，用肌内递送的25μgrE1E2蛋白质进行免疫接种，并且用100黑猩猩感染剂量(CID50)的克隆HCV进行攻击(图8A和8B)。攻击结果与未接种疫苗的对照动物中的感染进行比较。除强和特异性T细胞增殖应答外，2只动物的免疫接种产生针对E1E2的高抗体滴度，包括针对E2的高变区(HVR1)的抗体。这个区域已显示在天然分离株中是最可变的，并且也认为代表nAb表位。使用完整蛋白质E1E2和HVR1肽ELISA测定法测量抗体，所述ELISA测定法利用由BSC-1细胞纯化的生物素化HVR1肽或E1E2蛋白质开发，所述BSC-1细胞用表达E1E2的重组痘苗病毒感染。在2只接种疫苗的动物中病毒血症延迟3周。在Ch1601中，HCV RNA滴度维持在5×104拷贝/ml以下，并且ALT水平被最低限度升高。肝内细胞因子mRNA水平的增加与HCV RNA下降至无法定量水平一致。不管这个对照，随着抗体滴度减弱病毒血症再现，并且动物被慢性感染，这个再现与免疫逃逸无关。从急性HCV感染恢复的黑猩猩不发展nAbs。将nAb加入原发感染中诱导的已存在的记忆T细胞应答，产生能够保护动物不受再感染的免疫应答。在Ch1587中，病毒血症在3周时在唯一一份样品中可检测(＜104拷贝/ml)，无肝炎的证据。
b)T细胞疫苗改变HCV感染
构建不使用本发明的方法的疫苗，其仅包含HCV NS抗原NS3、NS5A和NS5B。恢复的黑猩猩(Ch1588)用DNA引发/rVV(重组痘苗病毒)加强方案针对NS3进行免疫接种。第二只恢复的黑猩猩(Ch1606)用包括NS3、NS5A和NS5B的疫苗进行免疫接种。黑猩猩用100CID50的克隆HCV进行攻击。在2只动物中，在疫苗接种后加强T细胞应答。2只动物的攻击导致亚临床感染(在注射(p.i.)后6周时仅持续1(Ch1606)或2(Ch1588)周的低水平病毒血症(图9A-9C))。相比之下，未接种疫苗的恢复的黑猩猩在p.i.1周时发展病毒血症，这在至少直到14周时可检测。
首次用于实验的黑猩猩(Ch6394)随后用NS3-NS5疫苗进行疫苗接种，并且用100CID50的单克隆H77进行攻击。使用采用完整抗原和重叠肽的增殖和Elispot测定法测试T细胞应答。Ch6394在疫苗接种后发展针对所有疫苗抗原的特异性T细胞应答。在攻击后，这只动物在p.i.1周时变得病毒血症，但具有＜105拷贝/ml的最大限度滴度和病毒复制的立即控制(图9A-9C)。在首次用于实验的动物中，滴度每7天增加～2倍，而在Ch6394中，滴度在相同时期内减少30倍。然而，在第10周时，丧失病毒控制，并且动物发展慢性感染。这种丧失伴随NS3特异性免疫应答(IFN-γ产生T细胞频率和增殖)的丧失，并且与2个氨基酸突变的出现相关，2个突变一个在NS3区中并且一个在NS5A区中。Elispot测定法已显示与野生型肽比较，携带这些突变的肽不再由来自Ch6394的PBMCs识别，表明这些改变代表免疫逃逸突变。从CD4T细胞逃逸可能已导致辅助功能的丧失，这可以解释NS3特异性应答在这个动物中的丧失。这些结果暗示基于T细胞的针对HCV的疫苗具有控制感染的潜力。
11.在HCV攻击前首次用于实验的黑猩猩的预防疫苗接种
a)使用i.v.配体-脂质体纳米复合物(scL-HCV)疫苗策略在首次用于实验的黑猩猩中引发特异性T细胞应答，并且其在攻击后增强。
已执行在首次用于实验的黑猩猩中使用如自始至终描述的scL-HCV纳米复合物的疫苗研究。使用scL-HCV复合物在0、4和8周时进行注射以引发免疫应答，随后为重组腺病毒(rAd)加强(16周)。用于给动物接种疫苗的复合物0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)的比制备，用5％右旋糖作为赋形剂，以约0.164mgDNA/Kg/注射使用(基于黑猩猩的重量)。将制备的复合物注入250ml5％右旋糖的袋内用于i.v.输注，并且施用于动物。动物在32周(加强后16周)时进行攻击。用纳米复合物的输注和腺病毒加强是良好耐受的，在任何动物中无不良反应。
疫苗接种后：Elispot研究在2只接种疫苗的动物(Ch1611、Ch6407)中在疫苗接种后16周时显示强烈、广泛反应的HCV特异性IFN-γ应答(图10A-10C)，在接受空载体纳米复合物和非-rAd的对照动物(Ch0257)中具有最低限度或无法检测的应答。在用sclHK-HCV接种后在Ch1611和Ch6407中可见低水平IFN-γ特异性T细胞应答，指示针对疫苗的这种引发组分的免疫应答。在免疫接种后在2只接种疫苗的动物中还观察到肝内IFN-γ和CD3mRNA水平的增加(图12A-12C，第12、16和32周)。数据表示为相对于第0周(接种疫苗前)时的mRNA水平，并且对内源对照(GAPDH)进行标准化。在第16和32周时CD3mRNA的增加也指示肝中的T细胞浸润。对于对照动物(Ch0257)，在免疫接种后的任何时间和在攻击前(第32周)未见细胞因子的增加(图12A-12C)。这个数据表明在使用本文公开的复合物和方法接种疫苗后，在肝以及外周血中诱导T细胞应答，并且这个数据通过在Ch6407和对照Ch0257中的血清细胞因子分析(使用TransSignal Cytokine Antibody Array试剂盒(Panomics))得到支持。第一次scL-HCV DNA纳米复合物处理后2周，仅在接种疫苗的黑猩猩中，而不是在对照动物中观察到细胞因子的上调，包括ICAM-1、各种白介素、TGF-α和IFN-γ。
攻击后：使用本领域众所周知的标准方法在第32周时用100感染剂量的HCV攻击免疫接种的黑猩猩。在攻击后，2只接种疫苗的动物都显示病毒复制的立即控制，这与如通过Elispot测定法测量的增加的HCV特异性T细胞应答(图11A-11C)和增加的肝内细胞因子应答(图12A-12C)一致。在攻击后，2只动物仍具有对疫苗抗原(NS3-NS5B)特异的可检测的T细胞应答。在攻击后并且响应病毒复制，这些应答增加。使用来自对照黑猩猩的PBMCs的Elispot测定法显示无HCV特异性应答(图11A-11C)。在首次用于实验的受感染动物的急性期中可检测免疫应答的这种不存在与其他公开的观察一致。在2只免疫接种的动物中紧在攻击后肝内IFN-γmRNA水平增加(图12A-12C)，如由在第34周(攻击后2周)时，对于Ch6407和Ch1611分别超过基线8和10倍的增加证明的。这些增加指示在肝中对病毒复制的立即免疫应答。肝内细胞因子水平在对照动物中仅在攻击后数周开始增加，并且直至第41周时才达到与免疫接种动物中的那些可比较的水平。
从第0到8周时使用实时PCR测定法测量病毒滴度，并且从第0到6周时测量血清ALT水平。图13显示2只接种疫苗的动物在攻击后都显示比在对照黑猩猩中观察到的那些明显更低的病毒滴度。此外，滴度在前5周过程中并不指数增加(如在对照黑猩猩中可见的以及如在所有首次用于实验的动物中可见的)。事实上，在2只接种疫苗的动物中，到第5周时病毒滴度比对照动物低超过4log10。2只接种疫苗的动物但不是对照黑猩猩，也证实在感染后2周的ALT升高，证实指示在肝中早期的免疫应答的肝内细胞因子数据(图14)。如预期的，在对照动物中的ALT水平直至感染晚期时才增加。在攻击后预期所有动物的感染，因为这是T细胞疫苗，并且不设计为诱导中和抗体和消除性免疫。病毒的最初复制是刺激先前诱导的T细胞应答所需的。这个数据表明这种I.V.scLHK-HCV疫苗策略诱导记忆T细胞，所述记忆T细胞在用病毒感染后被回忆，并且这种回忆应答在立即控制病毒复制方面是有效的。
12.在慢性感染的黑猩猩中测试免疫治疗策略
构建包括HCV NS3、NS5A和NS5B的疫苗，以测定T细胞免疫治疗疫苗是否可以证明在慢性HCV感染的黑猩猩中是有效的。裸露DNA引发(非scL-HK)(i.m.)/重组痘苗病毒(rVV)加强方案用于处理慢性感染的黑猩猩，所述黑猩猩用NS3、NS5A和NS5B疫苗进行i.m.免疫接种，随后为rVV加强，所述疫苗递送与作为佐剂的CpGs组合的3剂量裸露DNA。接种rVV后，在外周血中针对NS3、NS5A和NS5B的T细胞应答增加12-20倍(图15)。然而，HCV RNA和肝酶水平不受影响；RNA滴度保持在～104RNA拷贝/ml，类似于处理前水平。在分析肝内IFN-γ和TNF-mRNA后，未注意到这些细胞因子中任一种的增加，暗示在血液中增加的T细胞活性不导致在HCV复制位点处的增加。无法控制病毒可能已起因于T细胞无法在肝中起作用。
4只不同的慢性感染的黑猩猩用本发明的scL-HCV复合物进行i.v.注射，所述复合物通过如本文描述的简单混合制备，封装携带编码NS3、NS4B、NS5A和NS5B的基因，携带编码IL-2的基因的pSCMV质粒DNA或空载体。通过简单混合以0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)的比以0.2mg/Kg/注射(基于体重)制备复合物。加入5％右旋糖作为赋形剂。在复合物制备前，对于HCV∶IL-2以1∶1摩尔比或对于空载体∶IL-2以2.5∶1混合DNAs。3只动物用scL/HCV-IL-2进行疫苗接种，并且1只接受携带空载体-IL-2的复合物。每只动物接受相隔4-6周的3次注射。在最后一次疫苗接种后4周用重组腺病毒载体加强。
研究涉及使用等摩尔量的表达HCV抗原和IL-2的重组载体i.v.递送scL-DNA或scLHK-DNA接种物。因为所有表达的基因在相同主链载体中，所以使DNA比基于摩尔量确保所有表达的插入片段相等递送。分开的HCV和IL DNAs以等摩尔比的载体插入片段混合，并且封装到scL或scLHK内。DNA作为不含内毒素的制剂(＜5EU/mg DNA)在GLP条件下(Aldevron，ND)产生。DNA(～7mg/动物/注射)在复合物中基于黑猩猩重量进行施用(0.17mg/kg)。这个剂量大致等价于施用于60kg人的那种，并且是先前用于疫苗接种首次用于实验的黑猩猩的剂量。制备复合物，冻干且送至动物场所用于重构和注射。scL-HCV/IL-2或scLHK-HCV/IL-2在0、4、8和12周时在3只动物中i.v.递送。使用这个时间表，以便给予免疫系统响应接种的时间。如果在4周后未见对T细胞应答或RNA滴度的影响，那么在无另外的接种的情况下将不预期看见任何新作用。第4只(对照动物)在相同时间点时接受scL或scLHK复合的空载体和IL-2质粒。这区分这种细胞因子单独对HCV感染的作用。如果在4次剂量后未观察到病毒应答，那么如在预防疫苗研究中使用的，给予用表达HCV抗原NS3-NS5B的rAd(1011感染单位)的加强，并且继续监控免疫应答和病毒滴度。嗜肝病毒载体的使用还达到靶向肝区室的目的。
C.取样
研究动物直至24周。样品收集在第一次接种前4周开始；这些样品用作基线和阴性对照。取样持续直至最后一次接种后8周时，允许其中测定处理是否产生阳性应答的时间。研究自始至终，如通过NIRCSOPs限定的，通过Menghini技术每2周执行肝活组织检查，并且每周经由股静脉抽血用于在下文详述的研究中使用。在偶数周(第-4、-2、0、2周等)时获得40mL全血，并且在奇数周(-3、-1、1等)时获得5mL血浆。为了测定质粒的稳定性，在剂量前以及在第一次接种后15分钟、1、3、8、24、48和72小时时收集1mL血液。抽取所有其他血液，并且在接种前获得肝活组织检查。这个抽血时间表基于由NIRC产生的用于在非人灵长类动物中的血液收集的指导。收集90mL/月，完全在可允许的限制内。用肝素作为抗凝剂收集血液。血浆通过在2700rpm下离心10分钟得自5mL和1mL体积。将血浆样品分成500ul等分试样并且贮存于-80℃。一半肝活组织检查在福尔马林中固定，一半分成2mm切片且在液N2中速冻。
D.测定scL-HCV或scLHK-HCV复合物在肝中的存在和在血液中的稳定性
在小鼠中的初步研究表明封装显著增加在肝中发现的核酸量，并且延长其中它可以在血液中检测出的时间。在黑猩猩中用封装的HCVNS3-NS5B质粒证实这些发现。为了测定在注射后HCV DNA在循环中存在多久，在剂量前和第一次注射后15分钟、1、3、8、24、48和72小时收集1mL血液。将血浆分成2个等分试样并且在-80℃下冷冻。一个等分试样用于分离质粒(High Pure PCR Template Preparation试剂盒(Roche))。从一片2mm速冻肝组织分离DNA(DNeasy ExtractionKit(Qiagen))。阴性对照样品是来自相同动物的在接种前获取的血浆和肝组织。通过PCR评估外源HCV质粒。在不存在逆转录酶的情况下使用PCR使质粒与由于慢性感染存在的任何病毒RNA区分。此外，使用位于pSCMV主链中的一个引物和在HCV插入片段中的一个引物。因此，仅扩增外源DNA。这种方法已成功地用于pSCMV载体中的其他插入片段(IND生物分布研究的p53)。为了定量，通过将已知量的NS3-NS5B质粒加入来自未感染黑猩猩的血浆或肝组织中随后提取来制备信号标准。FDA具有来自使用的动物的大量存档样品。扫描的凝胶使用图像分析软件(Molecular Dynamics)进行定量，并且通过与标准比较计算质粒的量。从血浆的第二个等分试样和第二片速冻肝组织中分离DNA用于DNA分析，使用Stratagene DNAExtraction试剂盒。在接种前获取的血浆和肝组织作为阴性对照。使用Gene Image Alkaline Phosphatase DNA Labeling and DetectionSystem(Amersham)执行杂交。如上，用于通过DNA分析检测外源DNA的探针跨越在载体和插入片段之间的连接处。这种探针由IDT，Inc.(Coralville，IA)合成。这种方法也已用于分析在组织中的外源DNA。如上制备标准。随后通过琼脂糖凝胶、印迹和杂交分析样品。10至50倍过量的探针用于确保所有条带的饱和。扫描的放射自显影照片使用
Figure GPA00001043278100472
软件(Molecular Dynamics)进行定量，并且通过与标准比较计算质粒DNA的量。如果这种非放射性方法的灵敏度水平太低，那么可以使用由γ32P-ATP标记的′5末端或可以如先前所述(Fernandez J.，等人，J.Virol，78，9782-9789(2004))执行巢式PCR。使用2种方法评估在血液和肝中的DNA帮助确保即使一种方法不成功也能获得结果。测试一式三份地执行，并且使用t检验使来自每只动物的顺次血浆样品与在15分钟时观察到的那种进行统计比较，以评估随着时间过去DNA浓度的显著减少。未对肝进行统计比较，因为关于这种组织的研究是为了证实DNA在这种器官中的存在而不是随着时间的稳定性。
E.在慢性感染的黑猩猩I.V.接种后测试对scLHK-HCV复合物的应答
1.评估在外周血中的免疫应答
在接受治疗疫苗的慢性HCV感染的黑猩猩的外周血中增加的特异性T细胞活性不一定导致在肝中更高的T细胞活性和减少的病毒滴度。因此，分析在这些动物的肝中的T细胞浸润和细胞因子应答是关键的。然而，外周血可以用作评估诱导的免疫应答的程度和特异性的第一个来源。肝活组织检查是昂贵且有限的，并且更多T细胞得自外周血。肝的研究用于确定在外周血中增加的免疫应答是否与在肝中更大的T细胞活性相关。如本领域先前描述的(Puig M.，等人，Vaccine，22，991-1000(2004))，使用Ficoll梯度离心从每2周获得的全血中分离PBMCs。从梯度的顶端取出血浆，并且以1mL和200uL等分试样贮存于-80℃。约108PBMCs和15mL血浆得自40mL全血。解冻冷冻细胞(107/mL)的单个等分试样，并且在AIM-V培养基(Invitrogen)加上2％人AB血清(Biowhittaker)中洗涤。评估活细胞数目，并且通过Elispot(Shoukry N.H.，等人J.Exp.Med.，197，1645-1655(2003))测试细胞。用于每种分析的细胞总数目依赖于在一次测定中测试的抗原数目。使用整组重叠肽(重叠11aa的18聚体，NIHReagent Program)，其覆盖1a基因组且与1a基因组对应。这些肽与用于感染黑猩猩的病毒以及在scL-HCV或scLHK-HCV中的HCV质粒中使用的序列对应。使用包含30-45个重叠肽的10个肽库以筛选样品。在每种测定法中包括阴性卵白蛋白肽对照、阳性植物血凝素对照和培养基对照。使用105细胞/孔一式三份地测试样品。样品针对覆盖整个病毒基因组的肽进行测试。尽管预期疫苗刺激针对抗原NS3-NS5B的应答，但这种刺激可能导致改善的T辅助应答或增加的IL-2生产，这导致针对在疫苗中不包括的病毒抗原的增强的应答。在96孔板中以1μg/ml每种单独的肽和人Elispot测试试剂盒(U-Cytech，Netherlands)(Shoukry N.H.，等人J.Exp.Med.，197，1645-1655(2003))执行PBMCs的预刺激以及产生IFNγ、IL4、IL2和IL10的细胞的Elispot分析。通过从一式三份测试孔的平均值中扣除一式三份对照(无抗原)的平均值计算特异性点形成单位(SFU)数目。如本领域先前所述的(Puig M.，等人，Vaccine，22，991-1000(2004))，使用96孔板(105细胞/孔，一式三份)对PBMCs执行T细胞增殖测定法。用1ug/mL蛋白质(NS3、NS5A或NS5B)(Mikrogen，Germany)或肽刺激细胞。对于后期研究，使用抗人CD4+或CD8+免疫磁珠(Dynal)(Puig M.，等人，Hepatology，44，736-745(2006))从总群体中耗尽CD4+和CD8+T细胞，且进行测试以测定识别特异性抗原的特定细胞类型。由这些研究产生的数据给出增强的HCV特异性T细胞应答的最佳指示。对于每只动物在疫苗前和后样品之间比较结果。t检验用于评估在疫苗接种后SFU的显著增加。对外周血的研究结果与肝内T细胞浸润分析、细胞因子应答和病毒RNA水平的改变结合，以测定这种治疗策略的功效。
2.血浆细胞因子水平的改变的检测。
在用scL-HCV接种首次用于实验的黑猩猩后血清细胞因子的分析显示在接种疫苗的动物而不是对照中的大量细胞因子(ICAM-1、TGF-β和IFN-β)的改变。在治疗疫苗接种后检查一组血清细胞因子的改变，并且与处理前样品和对照动物比较。使用TransSignal HumanCytokine Antibody Array试剂盒，用在疫苗接种前和后获取的1-2mL血浆分析细胞因子。来自未感染黑猩猩的正常血浆作为阴性对照。在血清细胞因子(类型和水平)中可见的改变与在肝中在mRNA水平下发现的那些比较。除mRNA的肝内分析外，对血清细胞因子执行这些研究。定量mRNA分析，进行统计分析，并且提供在肝中的细胞因子水平的指示。重要的是使这些分析偶联以测定外周血中的应答是否反映在肝中观察到的那些。细胞因子模式中的任何改变与记忆T细胞的持续关联。正相关是关于发展测定与清除相关的特异性T细胞的存在的更简化方法的第一个步骤。
3.通过组织学和细胞因子分析评估在肝中的HCV特异性应答
a)关于肝浸润T细胞的存在的测试。
通过组织学分析和细胞因子应答测试关于肝中浸润T细胞的存在。在接受治疗疫苗的慢性感染黑猩猩的外周血中增加的HCV特异性T细胞活性不一定导致在肝中更高的T细胞活性和减少的病毒滴度。因此，分析在这些动物的肝中的T细胞浸润和细胞因子应答是关键的。
b)福尔马林固定的肝组织的分析：
使福尔马林固定的石蜡包埋组织切片，就特定蛋白质和细胞标记进行染色：CD4；CD8；穿孔素；IFN-γ；IL-2；CD45RA/RO和CCR-7。基于CD45RA和CCR7的表达可以鉴定T细胞群体(Campbell J.J.，等人，Journal of Immunology，166，877-884(2001)；Sallusto F.，等人Nature，401，708-712(1999)；Seder R.A.和Ahmed R.，NatureImmunology，4，835-842(2003))。执行肝切片的免疫组织学分析，以对于每个活组织检查区分肝中存在的淋巴细胞的数目、类型和定位。使切片在二甲苯中脱蜡，在乙醇中水合，随后在PBS中洗涤。对于抗原检测，用10mM柠檬酸缓冲液pH 6.0在100℃下处理组织10分钟。在与特异性抗体温育前，在组织切片上的非特异性位点用5％牛奶封闭。在感染前(历史贮存样品)和在处理前得自相同动物的肝活组织检查用于比较。用标记的链霉亲和素-生物素技术和使用DAB开发的产品执行这些研究。对于处理前和后的切片分析6个视野，并且计数阳性细胞类型。用这种染色方法，评估细胞在肝内相对于门静脉的定位或特定肝细胞类型。使用t检验就T细胞浸润执行统计分析。
c)速冻肝组织的分析：
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，CA)从部分速冻组织中分离总RNA。使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)逆转录RNA，并且通过实时PCR就细胞因子mRNA水平进行测试，使用针对IFN-γ、IL2、CD3、CD8和CD4的特异性引物探针组，如本领域先前所述的(Major M.E.，等人Hepatology，39，1709-1720(2004))。这些细胞因子的水平对内源对照(GAPDH)进行标准化，并且与每只动物的处理前活组织检查中的水平进行统计比较(Thimme R.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，99，15661-15668(2002))。同时，小部分冷冻肝组织用于同时分析一组36种细胞因子的蛋白质水平，使用TransSignal Human Cytokine Antibody Array kit(Panomics)。
F.评估毒性。
研究在慢性感染个体中的肝相关治疗疫苗的作用是特别重要的。尽管疫苗可以导致减少的病毒滴度，但由于在肝中增强的免疫应答，它可能加重肝炎且导致肝病。来自黑猩猩的血清和肝组织就肝特异性酶和指示毒性的组织病理学改变进行分析。通过商业实验室(ANTECHDiagnostics)就对肝功能特异的一组标记每周测试等分试样(2mL)的血浆：总胆红素、ALT、碱性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。在任何接种后这些标记水平超过正常范围的增加持续＜2周视为可接受的。超过正常范围的持续水平指示毒性。因为这是对肝病特异的少数测试之一(McIntyre，N.和Rosalki，S.Biochemical investigations in the managementof liver disease.In：Oxford Textbook of Clinical HepatologyMcIntyre，Benhamou，Bircher，Rizzetto和Rodes(编辑).OxfordUniversity Press，293-309.(1991))，所以对于每只动物比较处理前和后的ALT水平以统计评估毒性。
为了评估细胞凋亡，用改良的荧光TUNEL测定法使组织染色，使用原位细胞死亡检测试剂盒TMR Red(Roche)。这种信号在远红外范围中发出，并且优于FITC，因为在肝切片中关于细胞凋亡的信号在氩激光器下为红细胞自体荧光。使用Laser Scanning Cytometer(LSC)评估荧光强度和分布。这是基于载玻片的仪器，其以类似于流式细胞仪的方式执行，并且检测FITC、PE、PI、Cy5和DAPI。最佳化扫描设置并且应用于所有样品，用相同方案测量背景、阴性和阳性信号。作为直方图显示的数据允许信号通过Compucyte程序进行统计分析和定量评估组织中阳性细胞凋亡信号的百分比区域以及信号强度。
H&E染色的肝切片通过委员会证明合格的兽医病理学家就组织病理学改变进行评估。处理前和后的切片使用用于评估慢性肝炎的Ishak评分系统(0-4级)(Ishak K.，等人，Journal of Hepatology，22，696-699(1995))进行分级。这是建立的用于分级肝活组织检查的方法并且在临床背景中广泛使用。分级包括门静脉、门静脉周围和腺泡内的炎症细胞浸润以及肝细胞损伤和坏死的评估。使用这3种方法分析肝毒性，提供了这种治疗疫苗对这种器官的作用的完全描述，以评估未来临床使用的安全性。
G.监控病毒滴度的改变。
免疫应答的初次测试和scL-HCV或scLHK-HCV治疗方法的成功是血液中HCV RNA滴度的改变。这些使用内部的、实时RT-PCR测定法(Major M.E.，等人，J.Virol，73，3317-3325(1999)；Major M.E.，等人，J.Virol，73，3317-3325(1999))进行测定。使用TriZol(Invitrogen)从来自处理前和后采血的200uL血清分离总RNA，并且如本领域先前所述(Major M.E.，等人，J.Virol，73，3317-3325(1999)；Fernandez J.，等人，J.Virol，78，9782-9789(2004))执行RT PCR。使RNA分成重复孔(n＝4)，使用一组HCV RNA标准计算RNA浓度并且表示为RNA拷贝/mL血浆。我们具有在干净、受控条件下扩增HCV序列的广泛经验(Major M.E.，等人，J.Virol，73，3317-3325(1999)；Fernandez J.，等人，J.Virol，78，9782-9789(2004))。在分开的房间执行操作以避免污染，并且在所有情况下使用指定的移液管和试剂。在所有提取中，包括来自未感染黑猩猩的阴性对照血浆，并且在RT-PCR测定法中使用提取的RNA。比较处理前和后的RNA滴度，以测定滴度的统计学显著改变。血浆而不是肝就病毒RNA滴度进行分析。肝活组织检查是有限的，并且血浆中的滴度直接指示肝中的水平。仅当动物显示病毒的清除时，通过更灵敏的巢式PCR就病毒RNA测试肝，所述巢式PCR检测出少至40个RNA拷贝/mL(Major M.E.，等人Hepatology，39，1709-1720(2004)，Puig M.，等人J.Virol Methods，105，253-263(2002))。
如果靶向的治疗疫苗导致RNA滴度的减少，肝内T细胞、肝内细胞因子和外周HCV T细胞应答的增加，那么这是HCV特异性应答在肝中起作用的强烈指示，特别是当与对照动物比较时。如果肝内T细胞和细胞因子水平增加但病毒RNA滴度不下降，那么这暗示由于逃逸突变或T细胞功能障碍，诱导的T细胞不识别病毒表位。RNA滴度暂时下降随后复发至处理前水平指示在病毒中的突变发展，以逃逸新近诱导的T细胞应答。这通过在复发前和后的病毒序列分析进行研究。如果观察到突变，那么T细胞逃逸可以在体外使用PBMCs和肽进行测试，所述肽代表跨越发现包含突变的区域的新和旧氨基酸序列。
在慢性HCV感染的黑猩猩中的这些研究对于评估可以在慢性感染的患者中使用的任何HCV特异性治疗疫苗是关键的。重要的是显示HCV特异性T细胞应答的增强不使肝炎症增加至临床治疗无法耐受的水平。
实施例2
免疫脂质体的鼻内(IN)施用
经由IN途径的疫苗施用对于特定类型的病毒例如具有头与颈组织(这包括鼻和咽喉)倾向的那些特别有用。例子包括诱导呼吸疾病的病毒，所述疾病不仅包括流感还包括SARS和禽流感。然而，这个途径也可以用于递送其他类型的疫苗。为了比较scL复合物当IN给予时靶向且转染局部组织的能力，给予非荷瘤BALB/c小鼠封装表达萤光素酶基因的质粒DNA的scL纳米免疫脂质体复合物(scLLUC)，或等量的游离、未复合(裸露)质粒DNA(LUC)(对于2种处理10ug/小鼠/剂量)，或不处理(CTL)。scLLUC复合物如实施例1中通过简单混合以0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)的比制备，用5％右旋糖作为赋形剂。在24小时内施用2个剂量。最后一次剂量后48小时，用萤光素底物(ip施用)以～3mg/小鼠注射动物，并且使用IVIS 100光学成像系统(Kenogen，Alameda CA.)在麻醉下显现整个动物(图16A-16C)。表达的信号强度在实际测量中通过颜色指示。红色/黄色具有对应于转染的萤光素酶基因的最高表达水平的最高强度，同时蓝色表示最低限度表达，而绿色是中等表达。这些表达水平(高/中/低)已在图16A-16C和17A-17C上指出(代替颜色表示)。在图16A-16C中显而易见的是，与游离的裸露DNA(LUC)(小图B)比较，scL复合物(scLLUC)(小图C)的IN施用导致在鼻区域中高得多的转染/表达水平。小图A表示未处理对照。令人惊讶和出乎意料的是，当两者直接施用于待转染的组织时(局部递送)，scL纳米免疫脂质体复合物将产生比裸露DNA(这将是目前使用的)好得多的结果。
A.在IV施用后，与裸露DNA比较，质粒DNA有效负荷的增强的分布和定位的证实
还使用IVIS 100光学成像系统(Xenogen，Alameda CA)，使非荷瘤BALB/c小鼠成像，所述小鼠经由IV尾部静脉注射接受封装表达萤光素酶基因的质粒DNA的scL纳米免疫脂质体复合物(scLLUC)(如上)，或等量的游离、未复合(裸露)质粒DNA(LUC)(对于2种处理25ug/小鼠/剂量)，或未处理(CTL)。在24小时内施用2个剂量。最后一次剂量后48小时，用萤光素底物(ip施用)以～3mg/小鼠注射动物，并且在处于麻醉时显现整个动物。如图17A-17C中所示，在接受裸露DNA的小鼠中(小图B)任何地方都不存在明显的信号，除在尾部中的注射部位外(LUC)。(在嘴上的小量可能是由于在注射部位处舔而导致)。相比之下，在携带相同量的质粒DNA的scL复合物的iv施用后(scLLUC)(小图C)，动物几乎各处都存在中至高水平的信号。小图A表示未处理对照。其中淋巴结和肝定位的位置更强烈。这可能是由于树突细胞和枯否细胞的确表达转铁蛋白受体并且因此可以摄取复合物的事实。然而，在正常非肿瘤组织中的这种高水平摄取和表达是出乎意料且令人惊讶的。
实施例3
使用小鼠模型最佳化scL-HCV或scLHK-HCV对肝细胞的体内递送。
在小鼠研究中使用由脂质A配制的scL或scLHK。20至30微克DNA经由脂质体复合物在脂质体复合物中经由尾部静脉递送给重复小鼠，经过24小时时期使用2-3次接种。为了跟踪内吞到特定细胞类型内的脂质体，用罗丹明-DOPE标记的磷脂以总脂质的0.05摩尔百分比使用(Avanti Polar Lipids，AL)。通过蛋白质印迹分析组织样品，在注射后24-48小时通过流式细胞术就HCV特异性蛋白质的表达进行细胞的组织学染色和高分辨率成像。对于组织学分析，组织在Tissue-Tek培养基中进行速冻或进行福尔马林固定。使用低温恒温器或切片机使组织切片，并且就特定蛋白质或细胞标记进行染色。对于石蜡包埋的福尔马林固定的组织，使切片在二甲苯中脱蜡，并且在用PBS洗涤前在乙醇中水合。对于抗原检测，用10mM柠檬酸缓冲液pH 6.0在微波中在100℃下处理组织10分钟。在冷却和洗涤后，使用0.3％H2O2达到内源过氧化物酶活性的猝灭。在与特异性抗体温育前，在组织切片上的非特异性位点用5％牛奶或正常血清封闭。
对于通过流式细胞术的肝细胞分析，已开发灌注技术用于从小鼠中分离总肝脏细胞和居住T细胞，以用于流式细胞术分析。操作自始至终小鼠维持在麻醉下，从而使得血压最初得以维持。这防止静脉萎陷并且因此增加后续套管插入术的成功。小鼠用异氟烷进行麻醉，并且操作自始至终经由鼻锥附着维持麻醉。切开腹腔以暴露肝，并且将肠移位到小鼠的左侧以暴露门静脉。将24G IV输注组插入门静脉内。用预热的Liver Perfusion Medium(Gibco；配制用于清洗肝的血液、预防凝血且起始细胞与细胞接触的松弛的缓冲平衡盐溶液)以3ml/分钟输注肝5分钟。随后灌注预热的Liver Digest Medium(Gibco；用于解离活肝细胞的合格Collagenase-Dispase培养基)，以3ml/分钟通过肝，共10-12分钟。随后从小鼠中取出肝，并且置于冰上。通过经过100μm筛随后为低速离心来从细胞碎片中取出和纯化肝细胞。使用罗丹明标记的脂质体，细胞可以通过流式细胞术直接进行分析，以测定脂质体/DNA复合物的转染效率或细胞定位。使用流式细胞术使复合物到肝细胞内的摄取与经由脾细胞的摄取或非靶向的脂复合物的摄取比较。通过低速离心使细胞与脾细胞碎片分离。用ACK裂解缓冲液(Biowhittaker，MD)使红细胞裂解，洗涤后，使细胞经过100μm细胞滤网(Falcon，BD，NJ)。取出另外的组织以分析DNA到其他器官内的摄取。具体地，取出肾、心脏和肺组织，并且通过蛋白质印迹分析蛋白质提取物。
A.scL-HCV或scLHK-HCV针对体内功效的剂量最佳化
BALB/c小鼠用于测定最佳生物剂量(OBD)，以在不存在持续肝酶升高的情况下达到良好免疫应答。作为对照，使用游离(未复合)质粒、携带空载体的修饰脂质体和缺乏HCV基因的非重组腺病毒。使用5只动物/组。施用的最高剂量是约50μg。小鼠组通过i.v.注射接受包含1、5、10、20和50μg/注射的脂质体/DNA复合物(如实施例1中所述制备)。它们接受在0和4周时的接种随后为在10周时的腺病毒加强。这次加强后4周，通过流式细胞术和体外测试分析肝和脾，以测定通过如上所述的免疫接种诱导的T细胞的特征和特异性。为了简化这个实验，对照动物仅接受最高剂量的DNA和腺病毒。动物就肝酶和肝中的组织学改变进行监控。一旦已确定OBD后，这个剂量用于每次注射，同时注射次数以4周间隔从1次到5次变化，随后为在最后一次注射后6周的腺病毒加强。4周后，如上分析肝和脾，以测定导致最佳应答的注射次数。
B.诱导的T细胞应答的交叉反应性。
尽管在美国占优势的HCV基因型是1a，但在疫苗开发中需要解决来自超过1个HCV基因型的病毒表位识别。在小鼠中评估诱导的免疫应答的交叉反应性，使用与来自基因型1b和2a的共有序列对应的重叠肽。与1a H77基因组序列对应的整组重叠18肽已由NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program提供。这个Program具有可用的与1b J4基因型对应的相似重叠肽组。2型肽组购自Mimotopes(Washington，NC)。为了更好地评估在患者群体中可能发生的交叉反应性，使用上文描述的HLA-A2转基因小鼠执行这些分析。这些小鼠表达HLA-A2MHC分子，并且可以呈递HLA-A2表位。使用Elispot测定法评估针对代表不同基因型的肽库的应答，并且用对应于用于免疫接种的1a H77序列的肽平行执行。如果未观察到交叉反应性，那么使用包含与所有3种基因型对应的DNA质粒的纳米脂复合物，随后为使用各自与3种不同基因型对应的3种rAd的加强测试三价疫苗。评估针对每种单独的基因型的免疫应答，并且与当使用单独的个别基因型序列时获得的应答比较。
C.体内安全性研究
scL-HCV或scLHK-HCV的小鼠LD10基于如上所述测定的OBD。由OBD开始，逐渐增加剂量的质粒DNA(直至100μg)一周注射一次，共5周。由于复合物中的组分比已被设定，增加质粒DNA的量也增加复合物(如实施例1中制备)中的TfRscFv和Lip或Lip-HK的量。scL-HCV或scLHK-HCV i.v.、i.p.、i.m.或i.d.注射到雄性和雌性4-6周大的BALB/c小鼠内，10只小鼠/组。动物的重量每周评估2次，并且它们每天就毒性症状(例如，消瘦)进行监控。接受游离质粒DNA或无配体脂质体-DNA的动物用作对照。为了评估短期毒性，一半小鼠在最后一次注射后2天处死。其余在最后一次剂量后2周处死，以评估长期毒性。组织学检查各种器官和组织，包括肝、生殖腺、肺、胰腺、肾、心脏、皮肤、脾、脑、肠和骨髓。肝酶水平也在每周基础上进行监控(Antech Diagnostics)。来自器官的组织样品进行速冻并且贮存于-70℃用于提取DNA。对所有组织样品执行PCR分析，以在接种后在所有组织中评估scLHK-HCV的生物分布和DNA的持续。对HCV基因特异的引物是可获得的。
一旦已确定DNA/脂质体复合物的LD10，该剂量就与渐增剂量的重组腺病毒组合用于处理雄性和雌性BALB/c小鼠。每组10只小鼠接受scL-HCV或scLHK-HCV(如实施例1中制备)的1或3次i.v.、i.p.、i.m.或i.d.注射/周，共5周，随后为每周2次皮下(s.c.)施用渐增剂量的重组腺病毒(108至109感染单位)，共3周。如上，一半小鼠在最后一次剂量后2天处死，以评估短期应答，一半在2周后处死，以评估长期应答。组织学分析各种器官和组织，包括生殖腺、肺、胰腺、肾、心脏、皮肤、脾、脑、肠和骨髓，并且特别重点关注肝组织学。在这个研究过程中每周获取血液并且评估肝酶。取出脾并且就T细胞应答进行分析，以评估任何耐受诱导是否已在这些动物中出现。
在雄性和雌性裸鼠中执行血浆药代动力学分析和生物分布研究。动物以OBD接受scL-HCV或scLHK-HCV复合物(如实施例1中制备)的一次i.v.、i.p.、i.m.或i.d.注射。在剂量前以及在复合物施用后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48和72小时时，经由心脏穿刺在麻醉下在包含肝素钠作为抗凝剂的管中获得血样。对小鼠实施安乐死，并且快速切割肝、胰腺、生殖腺、脾、肾、肺、心脏、淋巴结和脑，在冰冷的生理盐水中漂洗，并且在干冰上速冻。血样在3000rpm下于4℃离心10分钟，以使血浆与细胞分离。血浆和组织样品都贮存于-80℃。
测定在血浆和组织样品中的HCV质粒浓度。简言之，使用苯酚-氯仿提取法从血浆样品中，并且使用DNA提取试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)从组织样品中分离质粒DNA。通过将已知量的质粒加入空白血浆或空白组织样品中随后进行提取来制备HCV浓度标准。随后通过琼脂糖凝胶、印迹和杂交分析提取物。使用Gene ImageAlkaline Phosphatase DNA Labeling and Detection System(Amersham)执行杂交，使用HCV序列作为探针。10至50倍过量的探针用于确保所有条带的饱和。扫描放射自显影照片并且使用
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软件(Molecular Dynamics)进行定量，并且通过与标准比较计算各种样品中的质粒DNA的量。备选地，探针用γ32P-ATP进行5′末端标记或执行对HCV特异的巢式PCR。通过标准方法(参见例如，Gokhale，P.C，等人，Gene Therapy 4：1289-1299(1997))评估血浆药代动力学参数。
在灵长类动物中评估肝靶向的安全性和功效。
在恒河猴中用scL-HCV或scLHK-HCV(如实施例1中制备)和腺病毒重组体执行剂量应答研究。诱导携带特异性记忆标记的最佳HCV特异性T细胞的免疫接种系统和剂量用作猴模型中的起始剂量。用scL-HCV或scLHK-HCV接种恒河猴，并且用s.c.递送的直至1012感染单位的重组腺病毒加强。提议的疫苗接种方案由在0和3个月时的DNA引发和加强，随后为在6个月时的腺病毒组成。对照组用与空载体、游离质粒DNA复合的scL-HCV或scLHK和非重组腺病毒接种。
第一个研究使用4个组(3个疫苗和1个对照)，2只动物/组。组1-3接受渐增剂量的纳米复合物scL-HCV或scLHK-HCV，同时维持由在上文描述的小鼠中的剂量最佳化研究测定的水平下的rAd接种。组4是对照组，接受scL或scLHK-空载体，随后为用非重组腺病毒的加强。如果观察到应答中的稳定期，那么使用其余4只动物以在稳定期中间的scL-HCV或scLHK-HCV剂量执行免疫接种研究，并且使rAd剂量增加0.5log10。(2组动物，2只动物/组，2个增加剂量的rAd)。在研究1中来自对照组的数据提供用于这些动物的对照数据。如果未观察到稳定期，并且相对于剂量扩大免疫应答增加并且具有最低限度ALT升高，那么使用增加剂量的scLHK-HCV，在其余4只动物中执行第二个研究。
在疫苗接种的猕猴中，在外周血和肝中评估特异性免疫和记忆T细胞的存在，使用Elispot、流式细胞术和组织学分析。透皮肝活组织检查每月执行2次；一半组织样品置于培养基中，四分之一在液氮中速冻，并且四分之一在甲醛中固定。执行肝切片的免疫组织学分析，以在每次接种后以2-4周间隔区分在肝中存在的淋巴细胞数目、类型和定位。评估CD95、CD45RA/CD45RO、CD62L和CD28的表达，特别地，这看起来是这个物种中记忆T细胞亚群的鉴定中的有用标记。
测定恒河猴的单元型，并且在外周血中使用鉴定的T细胞表位。制备四聚体，并且如上所述通过用于小鼠T细胞分析的流式细胞术分析用于显示记忆T细胞的特异性。用已知T细胞表位和多色流式细胞术表型，可以使用极小数目的细胞评估与T细胞相关的细胞因子和细胞裂解分子。就ALT升高分析血液，并且针对凋亡标记使组织染色，以测定肝中的细胞是否由于在引发过程中诱导的对HCV抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用而经历凋亡。
E.用脂质体/DNA复合物处理慢性黑猩猩
scL-HCV或scLHK-HCV/腺病毒疫苗在慢性黑猩猩中用作治疗疫苗。4只慢性感染的黑猩猩最初都被与基因型1a(H77株系)对应的单个序列单克隆病毒感染。这些动物已慢性感染3.5-5年。HCV是RNA病毒，并且因此基因组在复制过程中经历突变。来自在用这种相同单克隆储备物接种后持续感染的动物的病毒在感染约6个月后积累突变(可能由于免疫压力)。已制备了在感染后38周时从Ch6412分离的病毒的序列数据。整个编码区的分析揭示9个氨基酸改变，其中6个位于NS3、NS5A和NS5B区中。尽管在循环病毒基因组中的这些突变，在这些动物中在治疗疫苗中还是使用野生型序列。使用与许多良好保守的表位对应的野生型序列在减少病毒滴度方面是有效的。作为第一终末点，在每只动物的血清中评估病毒RNA滴度的减少，相对于处理前水平(作为第二终末点)。在肝中测量增加的T细胞活性，并且肝内的细胞因子mRNA水平增加。与处理前水平比较，RNA滴度超过0.5log10的减少和T细胞数目或细胞因子mRNA水平超过2倍的增加视为显著的。2只动物用治疗疫苗接种，并且2只动物用载体对照接种。
对于治疗疫苗，scL-HCV或scLHK-HCV(如实施例1中制备)以OBD以3周间隔i.v.递送3次，或空DNA载体用于对照动物。最后一次DNA接种后4周(第13周)，施用表达相同HCV抗原的重组腺病毒(1012感染单位i.v.)或非重组病毒。动物将跟踪直至6个月。研究自始至终，每2周获得活组织检查，并且每周获得血液(20-50mL)，就血清ALT升高、HCV RNA滴度和肝内T细胞浸润监控动物。使用实时RT-PCR测定法测定HCV RNA滴度，使用靶向HCV的5′UTR和核心区的引物和探针。在外周血和肝中检查增强的特异性免疫和记忆T细胞的存在，使用Elispot、流式细胞术和组织学分析。通过Klatskin技术执行透皮肝活组织检查；一半组织样品置于培养基中，四分之一在液氮中速冻，并且四分之一在甲醛中固定。
F.新鲜肝组织的分析
通过机械匀浆从肝活组织检查中分离淋巴细胞，随后为洗涤和计数。细胞用针对CD4、CD8、CD45RA/CD45RO、CD95、CD62L和CD28的抗体(BD Pharmingen)进行染色，并且通过流式细胞术测定数目。使用FACS-Calibur(Becton Dickenson)使用软件Cellquest(BectonDickenson)获得事件用于分析，使用7AAD(BD Pharmigen)以排除死细胞。如对于小鼠和猕猴研究描述的，四聚物用于研究来自处理的黑猩猩的特异性T细胞的功能。
在黑猩猩中，MHC单元型称为Patr(黑猩猩属(Pan Troglodytes))型。已针对黑猩猩并且针对慢性动物鉴定这些Patr等位基因中的数种，已鉴定了由来自这些动物的各自的T细胞识别的Patr等位基因和HCV表位序列。这些动物中的循环病毒在持续感染过程中可能在先前鉴定的表位中已掺入突变。在T细胞表位的详细分析后，用T细胞表位合成新四聚体用于在流式细胞术分析中使用。T细胞克隆还已在体外开发用于长期分析。用100,000γ辐射的PBMCs、0.01g/ml抗CD3和100U/ml IL-2克隆淋巴细胞。
G.速冻肝组织的分析
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，CA)从速冻组织中分离总RNA。使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)逆转录RNA，并且通过实时PCR就细胞因子mRNA水平进行测试，使用针对IFN-γ、CD3、CD8和CD4的特异性引物探针组(Perkin-Elmer AppliedBiosystems，CA)。这些细胞因子的水平对内源对照(GAPDH)进行标准化，并且与每只动物处理前活组织检查中的水平进行比较。细胞因子mRNA水平超过2倍的增加或减少视为显著的。
H.福尔马林固定的组织的分析
使用切片机使福尔马林固定的组织切片，并且就特定蛋白质、细胞标记或凋亡标记进行染色，以测定肝中的细胞是否由于在疫苗接种过程中诱导的对HCV抗原特异的CTLs的作用而经历凋亡。对肝切片执行免疫组织学分析，以区分对于每个活组织检查在肝中存在的淋巴细胞数目、类型和定位。使切片在二甲苯中脱蜡，并且在用PBS洗涤前在乙醇中水合。对于抗原检测，用10mM柠檬酸缓冲液pH 6.0在微波中在100℃下处理组织10分钟。在与特异性抗体温育前，在组织切片上的非特异性位点用5％牛奶或正常血清封闭。在感染前(历史贮存样品)和在处理前得自相同动物的肝活组织检查用于比较。
I.在I期临床试验的准备中的正式药代动力学和毒理学研究
用1个对照组(30只小鼠)和2个处理组(各30只小鼠，一半雄性和一半雌性)用低(比OBD或LD10低10x)和高(比OBD或LD10高10倍)剂量的如实施例1中所述制备的scL-DNA或scL-HK-DNA复合物执行毒理学研究。以上文确定的给药时间表在第1天时开始注射复合物。在最后一次注射后2天、3周和6周处死来自每个组的10只小鼠。每天监控体重和食物摄取。评估关于对照和处理组的临床病理学(尿血液学、临床化学、特别是肝酶)和组织病理学。包括下述器官：注射部位、脑、胰腺、腹股沟淋巴结、骨髓(组织和涂片)、肝、肾、睾丸/卵巢、脾、肺、心脏。
生物分布研究：这个研究包括在复合物的单次注射后的4个时间点(2天、2周、4周和6周)以最高剂量的1个对照(10只小鼠)和4个处理组(各10只小鼠)。在所有组中对下述器官执行如上通过DNAPCR的分析：肝、骨髓、胰腺、肾、脾、注射部位、睾丸/卵巢、腹股沟淋巴结、肺、心脏、脑。
实施例4
通过经由化学缀合制备的纳米免疫脂质体在人中诱导针对病毒抗原的免疫应答
本发明还提供了用于在人(以及其他哺乳动物和动物)中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给个体施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含编码病毒蛋白质和白介素的核酸分子，例如一种或多种质粒包含编码充当抗原的病毒蛋白质的基因、编码一种或多种白介素的基因。包含各种靶向配体的复合物可以与脂质体的表面直接化学缀合，并且基本上如上文实施例1中所述如下制备：
MPB-脂质体通过由Campbell MJ(Biotechniques 1995 Jun；18(6)：1027-32)描述的那种改良的乙醇注射法制备。4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸盐-DOPE(MPB-DOPE)(Avanti Polar Lipids)包括在脂质体制剂中[脂质A(DOTAP∶DOPE，1∶1摩尔比)；脂质B(DDAB∶DOPE，1∶1摩尔比)；脂质D(DOTAP∶Chol，1∶1摩尔比)；和脂质G(DOTAP∶DOPE∶Chol，1∶1∶1摩尔比)]，至5-8％摩尔的总脂质。简言之，使所有脂质溶解于乙醇中并且混合，用Hamilton注射器注50-60℃的涡旋纯水内。使溶液涡旋另外10-15分钟。终浓度是1-2mM总脂质。加入1M HEPES，pH7.5(pH7.0-8.0)至10-20mM的终浓度。因为马来酰亚胺基团在pH＞7的水溶液中不稳定，所以脂质体适当地在水(pH 5-6.5)中制备。在与scFv-SH连接前，pH可以用1MHEPES缓冲液，pH7.0-8.0调整至7.0-8.0，以促进后包被反应。
以约1∶1至约1∶100、适当地约1∶10至约1∶50(w∶w)、更适当地约1∶20至约1∶40例如1∶30的蛋白质/脂质比，将scFv-SH或具有-SH基团的任何抗体或抗体片段(包括Fab′或Mab)加入MPB-脂质体中。溶液通过轻轻旋转(～20-30RPM)在室温下混合30分钟，以产生scFv-Lip。scFv-Lip无需纯化而使用，尽管它也可以通过SepharoseCL-4B柱层析进行纯化。为了产生scFv-Lip-DNA复合物，必要时将质粒DNA稀释于水中，并且以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质)、适当地约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质)，例如1∶10(μg总核酸∶μg脂质)的DNA/脂质比加入scFv-Lip中，并且使混合物倒转5-10秒，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟。最终的混合物在室温下保持10-15分钟，在约5分钟后再次轻轻倒转5-10秒。对于在体内的使用，加入50％右旋糖或50％蔗糖至5-20％(V∶V)的终浓度，并且通过轻轻倒转5-10秒混合，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟。scFv-Lip-DNA无需纯化而使用，尽管它也可以通过Sepharose CL-4B柱层析进行纯化。预期80-100％的scFv(或具有-SH基团的任何抗体)与脂质体缀合。
在与复合物结合/封装前，使编码病毒抗原和白介素的质粒混合在一起，以0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的插入片段比插入片段摩尔比。例如，使用1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的插入片段比1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的插入片段的比。
如果待针对其接种疫苗的疾病是HIV，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码包膜蛋白质(Vanniasinkam，T.和Ertl，H.C.(2005)：Adenoviral gene delivery for HIV-1 vaccination.Current GeneTherapy，5：203-212.；Ferrantelli，F.和Ruprecht，R.M.(2002)：Neutralizing antibodies against HIV-back in the majorleagues？Current Opinion in Immunology，14：495-502.)和/或Nef蛋白质(Vanniasinkam，T.和Ertl，H.C.(2005)：Adenoviral genedelivery for HIV-1 vaccination.Current Gene Therapy，5：203-212.；Lichterfeld，M.，Yu，X.G.，Cohen，D.，Addo，M.M.，Malenfant，J.，Perkins，B.，Pae，E.，Johnston，M.N.，Strick，D.，Allen，T.M.，Rosenberg，E.S.，Korber，B.，Walker，B.D.和Altfeld，M.(2004)：HIV-1 Nef is preferentially recognized byCD8 T cells in primary HIV-1 infection despite a relatively highdegree of genetic diversity.AIDS，18：1383-1392.)；和/或gp140(Smith，S.M.(2002)：HIV vaccine development in the nonhumanprimate model of AIDS.Journal of Biomedical Science，9：100-111.)中的一种或多种的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是流感，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码血凝素(HA)(Tamura，S.，Tanimoto，T.和Kurata，T.(2005)：Mechanisms of broad cross-protection provided byinfluenza virus infection and their application to vaccines.Japanese Journal of Infectious Diseases，58：195-207.；Cox，M.M.(2005)：Cell-based protein vaccines for influenza.CurrentOpinion in Molecular Therapeutics，7：24-29.；Ze，C，Kurata，T.和Tamura，S.(2000)：Identification of effective constituentsof influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encodingviral proteins.Japanese Journal of Infectious Diseases，53：219-228.)、和/或神经氨酸酶(NA)(Tamura，S.，Tanimoto，T.和Kurata，T.(2005)：Mechanisms of broad cross-protectionprovided by influenza virus infection and their application tovaccines.Japanese Journal of Infectious Diseases，58：195-207.；Cox，M.M.(2005)：Cell-based protein vaccines for influenza.Current Opinion in Molecular Therapeutics，7：24-29.；Ze，C，Kurata，T.和Tamura，S.(2000)：Identification of effectiveconstituents of influenza vaccine by immunization with plasmidDNAs encoding viral proteins.Japanese Journal of InfectiousDiseases，53：219-228.)、和/或核衣壳(Cox，M.M.(2005)：Cell-basedprotein vaccines for influenza.Current Opinion in MolecularTherapeutics，7：24-29.)和/或基质蛋白M2(Cox，M.M.(2005)：Cell-based protein vaccines for influenza.Current Opinion inMolecular Therapeutics，7：24-29.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是SARS，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码刺突糖蛋白、和/或核衣壳和/或结构蛋白质S1、和/或结构蛋白质M、和/或结构蛋白质N(Weiss，S.R.和Navas-Martin，S.(2005)：Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogensevere acute respiratory syndrome coronavirus.Microbiology &Molecular Biology Reviews，69：635-664.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是禽流感(也称为H5N1)，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码血凝素(Wong，S.S.和Yuen，K.Y.(2006)：Avian influenza virus infections in humans.Chest，129：156-168.；Stephenson，I.，Bugarini，R.，Nicholson，K.G.，Podda，A.，Wood，J.M.，Zambon，M.C和Katz，J.M.(2005)：Cross-reactivity to highly pathogenic avian influenza H5N1viruses after vaccination with nonadjuvanted andMF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine：a potential priming strategy.Journal of Infectious Diseases，191：1210-1215.；Treanor，J.J.，Wilkinson，B.E.，Masseoud，F.，Hu-Primmer，J.，Battaglia，R.，O′Brien，D.，Wolff，M.，Rabinovich，G.，Blackwelder，W.和Katz，J.M.(2001)：Safety andimmunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans.Vaccine，19：1732-1737.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是埃博拉、马尔堡、或丝状病毒科(filoviridae)中的任何一种，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码VP24、和/或VP30、和/或VP35、和/或VP40、和/或sGP、和/或糖蛋白和/或核蛋白质(Hart，M.K.(2003)：Vaccine research effortsfor filoviruses.International Journal for Parasitology，33：583-595.；Wilson，J.A.，Bosio，CM.和Hart，M.K.(2001)：Ebola virus：the search for vaccines and treatments.Cellular& Molecular Life Sciences，58：1826-1841.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是乙型肝炎，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(Hanke，T.(2006)：On DNA vaccines and prolonged expression of immunogens.European Journal of Immunology，36：806-809.；Zuckerman，J.N.(2006)：Vaccination against hepatitis A and B：developments，deployment and delusions.Current Opinion in InfectiousDiseases，19：456-459.)、和/或核衣壳(HBc)(Michel，M.L.和Mancini-Bourgine，M.(2005)：Therapeutic vaccination againstchronic hepatitis B virus infection.Journal of ClinicalVirology，34 Suppl 1：S108-S114.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是西尼罗病毒、登革热、黄热病、或黄病毒科(flaviviridae)中的任何一种，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码E糖蛋白的一种或多种基因的那种，所述蛋白质引发大多数病毒中和抗体(参见Sampathkumar，P.，″West Nile Virus：Epidemiology，Clinical Presentation，Diagnosis and Prevention，″Mayo Clinic Processings 78：1137-1144(2003)；King，N.J.C，″Immunopathology of Flavivirus Infections，Immunology，″Immunology and Cell Biology 85：33-42(2007))。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如上制备的最终复合物的大小适当地在约50-500(nm)之间，具有正ζ电位，如通过动态光散射使用Malvern
Figure GPA00001043278100671
NANO-ZS或Malvern3000测定的。这个大小足够小以有效经过毛细血管床并且到达靶APC细胞。
如上制备的复合物作为预防或治疗疫苗使用。对于预防，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗静脉内注射到哺乳动物内，例如先前未暴露于病毒疾病的人。使用复合物在0、4和8周时进行注射。用于给受试者接种疫苗的复合物适当地以0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)的比制备，用5％右旋糖作为赋形剂。复合物中的DNA总量为0.01至10mg/kg/注射。合适量是0.164mg/kg/注射，这是7-12mg DNA/注射(基于受试者的重量)。将制备的复合物注入250ml 5％右旋糖的袋内用于i.v.输注，或作为推注注射，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
对于治疗用途，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗静脉内注射到哺乳动物内，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼罗病毒)的人。包含在与用于预防用途相同的范围中的量的DNA的复合物在250ml 5％右旋糖溶液中i.v.递送，或作为推注递送，在第0、4和8周时3次，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
实施例5
通过经由简单混合制备的纳米免疫脂质体复合物在人中诱导针对病毒抗原的免疫应答
本发明还提供了用于在人(以及其他哺乳动物和动物)中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给个体施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含编码病毒蛋白质和白介素的核酸分子，例如一种或多种质粒包含编码充当抗原的病毒蛋白质的基因、编码一种或多种白介素的基因。包含与脂质体的表面直接复合/结合但不化学缀合的各种靶向性配体的复合物基本上如上文实施例1中所述如下制备：
通过由Campbell MJ(Biotechniques 1995 Jun；18(6)：1027-32)描述的那种改良的乙醇注射法制备脂质体[脂质A(DOTAP∶DOPE，1∶1摩尔比)；脂质B(DDAB∶DOPE，1∶1摩尔比)；脂质D(DOTAP∶Chol，1∶1摩尔比)；和脂质G(DOTAP∶DOPE∶Chol，1∶1∶1摩尔比)]。简言之，使所有脂质溶解于乙醇中并且混合，用Hamilton注射器注入50-60℃的涡旋纯水内。使溶液进一步涡旋10-15分钟。终浓度是1-2mM总脂质。
通过在混合的复合物中使TfRscFv与脂质体组合物A(或任何上文给出的脂质体组合物)以单链蛋白质比脂质体和DNA的限定比混合，制备TfRscFv或任何抗体或抗体片段(包括任何scFv、Fab′或Mab)-免疫脂质体复合物。复合物的制备依照下述一般操作：使合适量的2mM脂质体(上文描述的A-H)与所需的任何水(例如，DI水)混合，以给出所需体积，并且轻轻倒转10次以混合，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟。向脂质体-水混合物中，加入合适量的TfRscFv，以给出所需比，并且通过轻轻倒转约5-10秒混合或对于更大体积在20-30RPM下旋转1分钟。使这种混合物保持在室温下约10-15分钟(在约5分钟后再次轻轻倒转5-10秒)。同时，合适量的DNA通过倒转5-10秒或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟，与所需的任何水混合以给出所需体积。一般地，对于体内使用，希望提供约5μg至约100mg DNA/注射。将DNA溶液快速加入TfRscFv-脂质体溶液中，并且使混合物倒转5-10秒或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟。使最终的混合物维持在室温下10-15分钟，在约5分钟后再次轻轻倒转5-10秒。对于体内使用，加入50％右旋糖或50％蔗糖至5-20％(V∶V)终浓度，并且通过轻轻倒转5-10秒混合，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟。使用1∶30(TfRscFv∶脂质体，w∶w)和1∶14(μg DNA∶nmole总脂质)的合适比的具体例子如下。对于终体积800μl中的40μg DNA，使183μl水与280μl 2mM脂质体溶液混合。加入34μl TfRscFv(具有0.4μg/ml的浓度)。使183μl水与40μl 1μg/1μl DNA混合。加入80μl 50％右旋糖作为最后一个步骤。
根据先前描述的体内配制法来制备Tf-Lip-DNA复合物。Xu等人，Human Gene Therapy，10(18)：2941-52(1999)。与辐射组合的转铁蛋白-脂质体介导的全身性p53基因疗法导致人头与颈癌异种移植物的消退。对于最佳体内制剂的一般制备，使25ml Tf(5mg/ml，铁饱和的全-转铁蛋白；Sigma，St.Louis，MO)和50ml Lip(2mM总脂质)加上75ml水在聚丙烯管中混合，并且在室温下保持5-15分钟，伴随频繁摇动，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟。将在120ml 20mM HEPES缓冲液，pH 7.4中的10微克质粒DNA加入管中，通过轻轻倒转10次立即且充分混合，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟，并且在室温下保持10-20分钟，伴随频繁摇动。随后将30微升50％右旋糖溶液加入管中，通过轻轻倒转10次立即且充分混合，或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟，并且在室温下保持10-15分钟。最终DNA∶脂质∶Tf比为1∶10∶12.5(mg/nmol/mg)。HEPES缓冲液可以由水替换。
A.Lip-HoKC的制备
当在复合物中包括(K[K(H)KKK]5-K(H)KKC}肽(HoKC)时，使用如上文所描述的乙醇注射法制备阳离子脂质体制剂A(以1∶1摩尔比的DOTAP∶DOPE)、B(以1∶1的DDAB∶DOPE)、G(以1∶1∶1的DOTAP∶DOPE∶胆固醇)和H(以1∶1∶1的DDAB∶DOPE∶胆固醇)(或上文给出的任何脂质体制剂)。每种脂质体制剂还包括总脂质5摩尔百分比的MPB-DOPE。因为HoKC肽携带末端半胱氨酸，所以MPB-DOPE包括在所有脂质体组合物中，以允许肽与脂质体缀合。Lip-HoKC脂质体如下使用携带马来酰亚胺基团的阳离子脂质体(Lip-MPB)和肽之间的偶联反应进行制备。将在半胱氨酸上具有游离巯基的0.1mmol肽等分试样加入溶于10mM HEPES，pH 7.4溶液中的2mmol Lip-MPB，并且在室温下旋转(20-30r.p.m.)2小时。所得到的Lip-HoKC具有1.4mM的脂质浓度。
当脂质体包含HoKC时，完全复合物以与用于产生不含HoKC的TfRscFv-Lip-DNA复合物的那种等同的方式形成。此处，同样以特定比使TfRscFv或任何抗体或抗体片段(包括Fab′或Mab)与Lip-HoKC混合(通过轻轻倒转10次或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟)，并且在室温下温育10-15分钟。随后将DNA加入TfRscFv-Lip-HoKC溶液中，通过轻轻倒转10次混合或对于更大体积在20-30RPM下旋转1-2分钟，并且再次在室温下温育10-15分钟，这之后加入右旋糖或蔗糖至5-20％的终浓度，通过轻轻倒转10次混合或对于更大体积在20-30RPM下旋转1分钟，并且在室温下温育10-15分钟。在复合物中TfRscFv∶LipA-HoKC∶DNA的比为0.3mg∶7nmol∶1mg。
在复合物中封装之前，使编码病毒抗原和白介素的质粒混合在一起，以0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的插入片段比插入片段摩尔比。例如，使用1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的插入片段比1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的插入片段的比。
如果待针对其接种疫苗的疾病是HIV，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码包膜蛋白质(Vanniasinkam，T.和Ertl，H.C.(2005)：Adenoviral gene delivery for HIV-1 vaccination.Current GeneTherapy，5：203-212.；Ferrantelli，F.和Ruprecht，R.M.(2002)：Neutralizing antibodies against HIV-back in the majorleagues？Current Opinion in Immunology，14：495-502.)和/或Nef蛋白质(Vanniasinkam，T.和Ertl，H.C.(2005)：Adenoviral genedelivery for HIV-1 vaccination.Current Gene Therapy，5：203-212.；Lichterfeld，M.，Yu，X.G.，Cohen，D.，Addo，M.M.，Malenfant，J.，Perkins，B.，Pae，E.，Johnston，M.N.，Strick，D.，Allen，T.M.，Rosenberg，E.S.，Korber，B.，Walker，B.D.和Altfeld，M.(2004)：HIV-1 Nef is preferentially recognized byCD8 T cells in primary HIV-1 infection despite a relatively highdegree of genetic diversity.AIDS，18：1383-1392.)；和/或gp140(Smith，S.M.(2002)：HIV vaccine development in the nonhumanprimate model of AIDS.Journal of Biomedical Science，9：100-111.)中的一种或多种的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是流感，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码血凝素(HA)(Tamura，S.，Tanimoto，T.和Kurata，T.(2005)：Mechanisms of broad cross-protection provided byinfluenza virus infection and their application to vaccines.Japanese Journal of Infectious Diseases，58：195-207.；Cox，M.M.(2005)：Cell-based protein vaccines for influenza.CurrentOpinion in Molecular Therapeutics，7：24-29.；Ze，C，Kurata，T.和Tamura，S.(2000)：Identification of effective constituentsof influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encodingviral proteins.Japanese Journal of Infectious Diseases，53：219-228.)、和/或神经氨酸酶(NA)(Tamura，S.，Tanimoto，T.和Kurata，T.(2005)：Mechanisms of broad cross-protectionprovided by influenza virus infection and their application tovaccines.Japanese Journal of Infectious Diseases，58：195-207.；Cox，M.M.(2005)：Cell-based protein vaccines for influenza.Current Opinion in Molecular Therapeutics，7：24-29.；Ze，C，Kurata，T.和Tamura，S.(2000)：Identification of effectiveconstituents of influenza vaccine by immunization with plasmidDNAs encoding viral proteins.Japanese Journal of InfectiousDiseases，53：219-228.)、和/或核衣壳(Cox，M.M.(2005)：Cell-basedprotein vaccines for influenza.Current Opinion in MolecularTherapeutics，7：24-29.)和/或基质蛋白M2(Cox，M.M.(2005)：Cell-based protein vaccines for influenza.Current Opinion inMolecular Therapeutics，7：24-29.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是SARS，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码刺突糖蛋白、和/或核衣壳和/或结构蛋白质S1、和/或结构蛋白质M、和/或结构蛋白质N(Weiss，S.R.和Navas-Martin，S.(2005)：Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogensevere acute respiratory syndrome coronavirus.Microbiology &Molecular Biology Reviews，69：635-664.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是禽流感(也称为H5N1)，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码血凝素(Wong，S.S.和Yuen，K.Y.(2006)：Avian influenza virus infections in humans.Chest，129：156-168.；Stephenson，I.，Bugarini，R.，Nicholson，K.G.，Podda，A.，Wood，J.M.，Zambon，M.C和Katz，J.M.(2005)：Cross-reactivity to highly pathogenic avian influenza H5N1viruses after vaccination with nonadjuvanted andMF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine：a potential priming strategy.Journal of Infectious Diseases，191：1210-1215.；Treanor，J.J.，Wilkinson，B.E.，Masseoud，F.，Hu-Primmer，J.，Battaglia，R.，O′Brien，D.，Wolff，M.，Rabinovich，G.，Blackwelder，W.和Katz，J.M.(2001)：Safety andimmunogenicity of arecombinant hemagglutinin vaccine for H5influenza in humans.Vaccine，19：1732-1737.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是埃博拉、马尔堡、或丝状病毒科中的任何一种，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码VP24、和/或VP30、和/或VP35、和/或VP40、和/或sGP、和/或糖蛋白和/或核蛋白质(Hart，M.K.(2003)：Vaccine research efforts for filoviruses.International Journal for Parasitology，33：583-595.；Wilson，J.A.，Bosio，CM.和Hart，M.K.(2001)：Ebola virus：the searchfor vaccines and treatments.Cellular & Molecular LifeSciences，58：1826-1841.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是乙型肝炎，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(Hanke，T.(2006)：On DNA vaccines and prolonged expression of immunogens.European Journal of Immunology，36：806-809.；Zuckerman，J.N.(2006)：Vaccination against hepatitis A and B：developments，deployment and delusions.Current Opinion in InfectiousDiseases，19：456-459.)、和/或核衣壳(HBc)(Michel，M.L.和Mancini-Bourgine，M.(2005)：Therapeutic vaccination againstchronic hepatitis Bvirus infection.Journal of ClinicalVirology，34 Suppl1：S108-S114.)的一种或多种基因的那种。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
如果待针对其接种疫苗的疾病是西尼罗病毒、登革热、黄热病、或黄病毒科中的任何一种，那么使用的质粒DNA适当地是包含编码E糖蛋白的一种或多种基因的那种，所述蛋白质引发大多数病毒中和抗体(参见Sampathkumar，P.，″West Nile Virus：Epidemiology，Clinical Presentation，Diagnosis and Prevention，″Mayo ClinicProcessings 78：1137-1144(2003)；King，N.J.C，″Immunopa thologyof Flavivirus Infections，Immunology，″Immunology and CellBiology 85：33-42(2007))。由这种DNA编码的一种或多种蛋白质充当抗原以诱导免疫应答。此外，相同复合物适当地包含质粒，所述质粒包含编码任何白介素、适当地白介素2和/或白介素12和/或白介素15的基因。
通过这些方法制备的最终复合物的大小在约50-400(nm)之间，具有正ζ电位，如通过动态光散射使用Malvern
Figure GPA00001043278100751
3000或Malvern
Figure GPA00001043278100752
NANO-ZS测定的。这个大小足够小以有效经过毛细血管床并且到达靶APC细胞。
如上制备的复合物适当地作为预防或治疗疫苗使用。对于预防，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗静脉内注射到哺乳动物内，例如先前未暴露于病毒疾病的人。使用复合物在0、4和8周时进行静脉内注射。用于给受试者接种疫苗的复合物适当地以1∶10∶12.5(mg/nmol/mg)(DNA∶脂质∶Tf)的比制备，用5-210％右旋糖或蔗糖作为赋形剂；当HoKC不是复合物的组分时，0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)，用5-20％右旋糖或蔗糖作为赋形剂；并且当复合物包含HoKC时，以0.3mg∶7nmol∶1mg(TfRscFv∶Lip-HoKC∶DNA)的比，用5％右旋糖或蔗糖。复合物中的DNA总量为0.01至10mg/kg/注射。合适量是0.164mg/kg/注射，这是7-12mgDNA/注射(基于受试者的重量)。将制备的复合物注入250ml 5％右旋糖的袋内用于i.v.输注，或作为推注i.v.注射，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)注射、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
对于治疗用途，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗注射到哺乳动物内，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼罗病毒)的人。包含在与用于预防用途相同的范围中的量的DNA的复合物在250ml 5％右旋糖溶液中i.v.递送，或作为推注递送，在第0、4和8周时3次，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
实施例6
通过经由化学缀合制备的2种纳米免疫脂质体复合物的共注射在人中诱导针对病毒抗原的免疫应答
本发明还提供了用于在人(以及其他哺乳动物和动物)中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给个体施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含编码病毒蛋白质和白介素的核酸分子，例如一种或多种质粒包含编码充当抗原的病毒蛋白质的基因、编码一种或多种白介素的基因。包含与脂质体的表面直接化学缀合的各种靶向性配体的复合物如上文实施例4中所述制备。
携带编码充当抗原的病毒蛋白质的一种或多种基因的一种或多种质粒DNA与实施例4中描述的那种等同。使用与对于携带编码病毒蛋白质的一种或多种基因的一种或多种质粒DNA使用的等同的操作和比，制备含有包含编码例如白介素2、白介素12和/或白介素15的基因的质粒DNA的分开的配体靶向的阳离子脂质体复合物。
如上制备的最终复合物的大小在约50-500(nm)之间，具有正ζ电位，如通过动态光散射使用Malvern
Figure GPA00001043278100761
3000或Malvern
Figure GPA00001043278100762
NANO-ZS测定的。这个大小足够小以有效经过毛细血管床并且到达靶APC细胞。
如上制备的复合物作为预防或治疗疫苗使用。对于作为疫苗的用途，以反映每种复合物中的质粒DNA插入片段摩尔比的复合物∶复合物比，使2种复合物混合在一起。因此，2种复合物的比是包含0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的复合物量比包含10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的复合物量；至包含10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的复合物量比包含0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的复合物量。例如，使用包含1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的复合物量比包含1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的复合物量的比。将包含编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种质粒DNA的复合物加入包含编码一种或多种白介素的一种或多种质粒DNA的复合物中，并且使溶液轻轻倒转10次或在20-30RPM下旋转1分钟，以形成用于在人受试者中使用的最终疫苗。
对于预防，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗静脉内注射到哺乳动物内，例如先前未暴露于病毒疾病的人。使用复合物在0、4和8周时进行注射。用于形成给受试者施用的疫苗的每种复合物(包含一种或多种病毒基因的那种和包含一种或多种白介素基因的那种)适当地以0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)的比制备，用5％右旋糖作为赋形剂。疫苗中的DNA总量为0.01至10mg/kg/注射。合适量是0.164mg/kg/注射，这是7-12mg DNA/注射(基于受试者的重量)。将制备的复合物注入250ml 5％右旋糖的袋内用于i.v.输注，或作为推注i.v.注射，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
对于治疗用途，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗注射到哺乳动物内，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼罗病毒)的人。制备的包含在与用于预防用途相同的范围中的量的DNA的复合物在250ml 5％右旋糖溶液中i.v.递送，或作为推注递送，在第0、4和8周时3次，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
实施例7
通过经由简单混合制备的2种纳米免疫脂质体复合物的共注射在人中诱导针对病毒抗原的免疫应答
本发明还提供了用于在人中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给个体同时施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物包含编码病毒蛋白质和白介素的核酸分子，例如一种或多种质粒包含编码充当抗原的病毒蛋白质的基因、编码一种或多种白介素的基因。包含与脂质体的表面直接复合但不化学缀合的各种配体的复合物(含或不含HoKC肽)如上文实施例5中所述制备。携带编码充当抗原的病毒蛋白质的一种或多种基因的一种或多种质粒DNA与实施例5中描述的那种等同。使用与对于携带编码病毒蛋白质的一种或多种基因的一种或多种质粒DNA使用的等同的操作和比，制备包含含有编码任何白介素例如白介素2、白介素12和/或白介素15的基因的质粒DNA的分开的配体靶向的阳离子脂质体复合物。
如上制备的最终复合物的大小在约50-400(nm)之间，具有正ζ电位，如通过动态光散射使用Malvern3000或Malvern
Figure GPA00001043278100782
NANO-ZS测定的。这个大小足够小以有效经过毛细血管床并且到达靶APC细胞。
对于作为疫苗的用途，以反映每种复合物中的质粒DNA插入片段摩尔比的复合物∶复合物比，使2种复合物混合在一起。因此，2种复合物的比是包含0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的复合物量比包含10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的复合物量；至包含10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的复合物量比包含0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的复合物量。例如，使用包含1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子的复合物量比包含1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的复合物量的比。将包含编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种质粒DNA的复合物加入包含编码一种或多种白介素的一种或多种质粒DNA的复合物中，并且使溶液轻轻倒转10次或在20-30RPM下旋转1分钟，以形成用于在人受试者中使用的最终疫苗。
如上制备的复合物作为预防或治疗疫苗使用。对于预防，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗注射到哺乳动物内，例如先前未暴露于病毒疾病的人。使用复合物在0、4和8周时进行静脉内注射。用于给受试者接种疫苗的复合物适当地以1∶10∶12.5(mg/nmol/mg)(DNA∶脂质∶Tf)的比制备，用5-20％右旋糖或蔗糖作为赋形剂；当HoKC不是复合物的组分时，0.33ug∶10ug∶1ug(TfRscFv∶Lip∶DNA)，用5-20％右旋糖或蔗糖作为赋形剂；和当复合物包含HoKC时，以0.3mg∶7nmol∶1mg(TfRscFv∶Lip-HoKC∶DNA)的比，用5％右旋糖或蔗糖。复合物中的DNA总量为0.01至10mg/kg/注射。合适量是0.164mg/kg/注射，这是7-12mg DNA/注射(基于受试者的重量)。将制备的复合物注入250ml 5％右旋糖的袋内用于i.v.输注，或作为推注i.v.注射，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
对于治疗用途，将如上制备的配体靶向的阳离子脂质体复合物纳米脂复合物疫苗注射到哺乳动物内，例如慢性感染病毒疾病(例如，乙型肝炎)的人，或急性暴露于病毒疾病(例如，埃博拉、SARS、H5N1、天花、西尼罗病毒)的人。包含在与用于预防用途相同的范围中的量的DNA的复合物在250ml 5％右旋糖溶液中i.v.递送，或作为推注递送，在第0、4和8周时3次，通过静脉内(IV)、瘤内(IT)、损伤内(IL)、气溶胶、透皮、经口、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、大脑内(IC)、器官内(例如，肝内)、缓慢释放埋植剂或皮下施用，或经由使用渗透或机械泵的施用。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用合并入本文，其程度与明确且单独地指出每个单独的出版物、专利和专利申请通过引用合并入本文一样。
序列表
<110>Georgetown University
 
<120>关于使用阳离子脂质体介导的核酸递送
产生免疫应答的方法
 
<130>2474.012PC01
 
<140>待指定
<141>同此
 
<150>US 60/929,685
<151>2007-07-09
 
<160>1
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>化学合成的-HoKC
 
<400>1
Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys
1               5                   10                  15 
Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Cys
            20                  25                  30

Claims (213)

1.在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给所述哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包括：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体直接复合，但不与所述阳离子脂质体化学缀合的配体；
(c)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
(d)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。
2.权利要求1的方法，其中所述病毒抗原来自选自流感病毒、HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒和天花病毒的病毒。
3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自H IV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
5.权利要求1的方法，其中所述复合物作为推注或作为输注经由选自下述的途径施用：静脉内施用、经口施用、肌内施用、损伤内施用、皮内施用、经皮施用、眼内施用、腹膜内施用、透皮施用、气溶胶施用、鼻内施用、器官内施用、大脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓慢释放埋植剂和经由渗透或机械泵的施用。
6.权利要求1的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
7.权利要求1的方法，其中所述配体是单链Fv抗体片段。
8.权利要求7的方法，其中所述单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
9.权利要求1的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
10.在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给所述哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包括：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体化学缀合的配体；
(c)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
(d)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。
11.权利要求10的方法，其中所述病毒抗原来自选自流感病毒、HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒和天花病毒的病毒。
12.权利要求10的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
13.权利要求10的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
14.权利要求10的方法，其中所述复合物作为推注或作为输注经由选自下述的途径施用：静脉内施用、经口施用、肌内施用、损伤内施用、皮内施用、经皮施用、眼内施用、腹膜内施用、透皮施用、气溶胶施用、鼻内施用、器官内施用、疑为大脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓慢释放埋植剂和经由渗透或机械泵的施用。
15.权利要求10的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
16.权利要求10的方法，其中所述配体是单链Fv抗体片段。
17.权利要求16的方法，其中所述单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
18.权利要求10的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
19.治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包括：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体直接复合，但不与所述阳离子脂质体化学缀合的配体；
(c)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
(d)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。
20.权利要求19的方法，其中所述病毒疾病选自流感、HIV、SARS、禽流感、埃博拉、乙型肝炎和天花。
21.权利要求19的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
22.权利要求19的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
23.权利要求19的方法，其中所述复合物作为推注或作为输注经由选自下述的途径施用：静脉内施用、经口施用、肌内施用、损伤内施用、皮内施用、经皮施用、眼内施用、腹膜内施用、透皮施用、气溶胶施用、鼻内施用、器官内施用、大脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓慢释放埋植剂和经由渗透或机械泵的施用。
24.权利要求19的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
25.权利要求19的方法，其中所述配体是单链Fv抗体片段。
26.权利要求25的方法，其中所述单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
27.权利要求19的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
28.治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包括：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体化学缀合的配体；
(c)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
(d)与所述阳离子脂质体结合的编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子。
29.权利要求28的方法，其中所述病毒疾病选自流感、HIV、SARS、禽流感、埃博拉、乙型肝炎和天花。
30.权利要求28的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
31.权利要求28的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
32.权利要求28的方法，其中所述复合物作为推注或作为输注经由选自下述的途径施用：静脉内施用、经口施用、肌内施用、损伤内施用、皮内施用、经皮施用、眼内施用、腹膜内施用、透皮施用、气溶胶施用、鼻内施用、器官内施用、大脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓慢释放埋植剂和经由渗透或机械泵的施用。
33.权利要求28的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
34.权利要求28的方法，其中所述配体是单链Fv抗体片段。
35.权利要求35的方法，其中所述单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
36.权利要求28的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
37.将一种或多种活性剂递送给哺乳动物的抗原呈递细胞(APCs)的方法，其包括给所述哺乳动物施用抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)靶向的阳离子免疫脂质体复合物，所述复合物包括阳离子脂质体、TfRscFv和一种或多种活性剂，其中所述TfRscFv与所述阳离子脂质体直接复合，但不化学缀合。
38.权利要求37的方法，其中所述APCs是专业APCs。
39.权利要求37的方法，其中所述APCs是非专业APCs。
40.权利要求37的方法，其中所述活性剂包含一种或多种核酸分子。
41.权利要求40的方法，其中所述核酸分子编码一种或多种病毒蛋白质。
42.权利要求40的方法，其中所述核酸分子编码一种或多种白介素。
43.权利要求40的方法，其中所述核酸分子编码一种或多种病毒蛋白质和一种或多种白介素。
44.权利要求41或权利要求43的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
45.权利要求42或权利要求43的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
46.权利要求37的方法，其中所述复合物作为推注或作为输注经由选自下述的途径施用：静脉内施用、经口施用、肌内施用、损伤内施用、皮内施用、经皮施用、眼内施用、腹膜内施用、透皮施用、气溶胶施用、鼻内施用、器官内施用、大脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓慢释放埋植剂和经由渗透或机械泵的施用。
47.权利要求37的方法，其中所述APCs位于肝、脾、淋巴结、肠和/或呼吸道中。
48.将一种或多种活性剂递送给哺乳动物的抗原呈递细胞(APCs)的方法，其包括给所述哺乳动物施用抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)靶向的阳离子免疫脂质体复合物，所述复合物包括阳离子脂质体、TfRscFv和一种或多种活性剂，其中所述TfRscFv与所述阳离子脂质体化学缀合。
49.权利要求48的方法，其中所述APCs是专业APCs。
50.权利要求48的方法，其中所述APCs是非专业APCs。
51.权利要求48的方法，其中所述活性剂包含一种或多种核酸分子。
52.权利要求51的方法，其中所述核酸分子编码一种或多种病毒蛋白质。
53.权利要求51的方法，其中所述核酸分子编码一种或多种白介素。
54.权利要求51的方法，其中所述核酸分子编码一种或多种病毒蛋白质和一种或多种白介素。
55.权利要求52或权利要求54的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
56.权利要求53或权利要求54的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
57.权利要求48的方法，其中所述复合物作为推注或作为输注经由选自下述的途径施用：静脉内施用、经口施用、肌内施用、损伤内施用、皮内施用、经皮施用、眼内施用、腹膜内施用、透皮施用、气溶胶施用、鼻内施用、器官内施用、大脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓慢释放埋植剂和经由渗透或机械泵的施用。
58.权利要求48的方法，其中所述APCs位于肝、脾、淋巴结、肠和/或呼吸道中。
59.在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给所述哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物通过下述过程制备：
(a)制备配体；
(b)使所述配体与阳离子脂质体混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体，其中所述配体与所述阳离子脂质体直接复合，但不化学缀合；和
(c)使所述配体靶向的阳离子脂质体与下述混合：
编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，以形成所述配体靶向的阳离子脂质体复合物。
60.权利要求59的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
61.权利要求60的方法，其中所述配体是单链Fv片段。
62.权利要求61的方法，其中所述单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
63.权利要求60的方法，其中所述抗体片段在羧基末端处包括半胱氨酸部分。
64.权利要求59的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
65.权利要求59的方法，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
66.权利要求59的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比混合。
67.权利要求66的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比混合。
68.权利要求67的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比混合。
69.权利要求59的方法，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
70.权利要求59的方法，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
71.权利要求60的方法，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
72.权利要求59的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
73.权利要求72的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
74.权利要求73的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
75.权利要求59的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
76.权利要求59的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
77.治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物通过下述过程制备：
(a)制备配体；
(b)使所述配体与阳离子脂质体混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体，其中所述配体与所述阳离子脂质体直接复合，但不化学缀合；和
(c)使所述配体靶向的阳离子脂质体与下述混合：
编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，以形成所述配体靶向的阳离子脂质体复合物。
78.权利要求77的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
79.权利要求77的方法，其中所述配体是单链Fv片段。
80.权利要求79的方法，其中所述单链Fv片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
81.权利要求78的方法，其中所述抗体片段在羧基末端处包括半胱氨酸部分。
82.权利要求77的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
83.权利要求77的方法，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
84.权利要求77的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
85.权利要求84的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
86.权利要求85的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
87.权利要求77的方法，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
88.权利要求77的方法，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
89.权利要求88的方法，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
90.权利要求77的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
91.权利要求90的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
92.权利要求77的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
93.权利要求77的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
94.权利要求77的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
95.在哺乳动物中诱导针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括给所述哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物通过下述过程制备：
(a)制备配体；
(b)使所述配体与阳离子脂质体化学缀合，以形成配体靶向的阳离子脂质体；和
(c)使所述配体靶向的阳离子脂质体与下述混合：
编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，以形成所述配体靶向的阳离子脂质体复合物。
96.权利要求95的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
97.权利要求95的方法，其中所述配体是单链Fv片段。
98.权利要求97的方法，其中所述单链Fv片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
99.权利要求96的方法，其中所述抗体片段在羧基末端处包括半胱氨酸部分。
100.权利要求95的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
101.权利要求95的方法，其中所述配体经由硫原子与所述阳离子脂质体化学缀合，所述硫原子是在所述化学缀合前在所述配体上的羧基末端处的巯基的部分。
102.权利要求95的方法，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
103.权利要求95的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
104.权利要求103的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
105.权利要求104的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
106.权利要求95的方法，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
107.权利要求95的方法，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
108.权利要求107的方法，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
109.权利要求108的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
110.权利要求109的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
111.权利要求110的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
112.权利要求95的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
113.权利要求95的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
114.治疗或预防哺乳动物中的病毒疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用配体靶向的阳离子脂质体复合物，所述复合物通过下述过程制备：
(a)制备配体；
(b)使所述配体与阳离子脂质体化学缀合，以形成配体靶向的阳离子脂质体；和
(c)使所述配体靶向的阳离子脂质体与下述混合：
编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，以形成所述配体靶向的阳离子脂质体复合物。
115.权利要求114的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
116.权利要求114的方法，其中所述配体是单链Fv片段。
117.权利要求114的方法，其中所述单链Fv片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
118.权利要求115的方法，其中所述抗体片段在羧基末端处包括半胱氨酸部分。
119.权利要求114的方法，其中所述配体靶向的阳离子脂质体进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
120.权利要求114的方法，其中所述配体经由硫原子与所述阳离子脂质体化学缀合，所述硫原子是在所述化学缀合前在所述配体上的羧基末端处的巯基的部分。
121.权利要求114的方法，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
122.权利要求114的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
123.权利要求122的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
124.权利要求123的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
125.权利要求114的方法，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
126.权利要求114的方法，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
127.权利要求126的方法，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
128.权利要求114的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
129.权利要求128的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
130.权利要求129的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
131.权利要求114的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自H I V病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
132.权利要求114的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
133.制备配体靶向的阳离子免疫脂质体复合物的方法，其包括：
(a)制备配体；
(b)使所述配体与阳离子脂质体混合，以形成配体靶向的阳离子脂质体，其中所述配体与所述阳离子免疫脂质体直接复合，但不化学缀合；和
(c)使所述配体靶向的阳离子脂质体与下述混合：
编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，
以形成所述配体靶向的阳离子脂质体复合物。
134.权利要求133的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
135.权利要求134的方法，其中所述配体是单链Fv片段。
136.权利要求135的方法，其中所述单链Fv片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
137.权利要求134的方法，其中所述抗体片段在羧基末端处包括半胱氨酸部分。
138.权利要求133的方法，其进一步包括混合这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQID NO：1)肽。
139.权利要求133的方法，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
140.权利要求133的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
141.权利要求140的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
142.权利要求141的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
143.权利要求133的方法，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
144.权利要求133的方法，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
145.权利要求144的方法，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
146.权利要求133的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
147.权利要求146的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所配体靶向的述阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
148.权利要求147的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述配体靶向的阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
149.权利要求133的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
150.权利要求133的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
151.制备配体靶向的阳离子免疫脂质体复合物的方法，其包括：
(a)制备配体；
(b)使所述配体与阳离子脂质体化学缀合，以形成配体靶向的阳离子脂质体；和
(c)使所述配体靶向的阳离子脂质体与下述混合：
编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子；和
编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，
以形成所述配体靶向的阳离子脂质体复合物。
152.权利要求151的方法，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
153.权利要求151的方法，其中所述配体是单链Fv片段。
154.权利要求153的方法，其中所述单链Fv片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
155.权利要求152的方法，其中所述抗体片段在羧基末端处包括半胱氨酸部分。
156.权利要求151的方法，其进一步包括混合这样的肽，所述肽包括与所述阳离子脂质体结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQID NO：1)肽。
157.权利要求151的方法，其中所述配体经由硫原子与所述阳离子脂质体化学缀合，所述硫原子是在所述直接缀合前在所述配体上的羧基末端处的巯基的部分。
158.权利要求151的方法，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
159.权利要求151的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
160.权利要求159的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
161.权利要求160的方法，其中所述配体和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
162.权利要求151的方法，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
163.权利要求151的方法，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
164.权利要求163的方法，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
165.权利要求151的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
166.权利要求165的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
167.权利要求166的方法，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
168.权利要求151的方法，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
169.权利要求151的方法，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
170.配体靶向的阳离子脂质体复合物，其通过权利要求129或权利要求151的方法制备。
171.配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体、编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中所述配体与所述阳离子脂质体直接复合，但不化学缀合。
172.配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体、编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中所述配体与所述阳离子脂质体化学缀合。
173.权利要求171或权利要求172的配体靶向的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
174.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述核酸分子封装在所述阳离子脂质体内。
175.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述核酸分子与所述阳离子脂质体的内部或外部单层结合。
176.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述配体是单链Fv片段。
177.权利要求176的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
178.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
179.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述抗体或抗体片段和所述阳离子脂质体以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
180.权利要求179的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述抗体或抗体片段和所述阳离子脂质体以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
181.权利要求180的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述抗体或抗体片段和所述阳离子脂质体以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
182.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
183.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
184.权利要求183的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
185.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
186.权利要求185的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
187.权利要求186的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
188.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、埃博拉病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
189.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
190.权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物，其进一步包括这样的肽，所述肽包括与所述复合物结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
191.药物组合物，其包括权利要求171或权利要求172的配体靶向的阳离子脂质体复合物。
192.权利要求191的药物组合物，其进一步包括选自一种或多种抗菌剂、一种或多种防腐剂、一种或多种缓冲剂和一种或多种表面活性剂的一种或多种赋形剂。
193.药物组合物，其包括：
第一配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体和编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子，其中所述配体与所述阳离子脂质体直接复合但不化学缀合；和
第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中所述配体与所述阳离子脂质体直接复合但不化学缀合。
194.药物组合物，其包括：
第一配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体和编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子，其中所述配体与所述阳离子脂质体化学缀合；和
第二配体靶向的阳离子脂质体复合物，其包括阳离子脂质体、配体和编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子，其中所述配体与所述阳离子脂质体化学缀合。
195.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述核酸分子封装在所述阳离子脂质体内。
196.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述核酸分子与所述阳离子脂质体的内部或外部单层结合。
197.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述配体选自转铁蛋白、半乳糖、L-37pA、抗体和抗体片段。
198.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述配体是单链Fv片段。
199.权利要求198的药物组合物，其中所述抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
200.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述第一和第二阳离子脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
201.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中每一所述阳离子脂质体的所述抗体或抗体片段以约1∶1至约1∶100(w∶w)范围中的比存在。
202.权利要求201的药物组合物，其中每一所述阳离子脂质体的所述抗体或抗体片段以约1∶10至约1∶50(w∶w)范围中的比存在。
203.权利要求202的药物组合物，其中每一所述阳离子脂质体的所述抗体或抗体片段以约1∶20至约1∶40(w∶w)范围中的比存在。
204.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述第一和第二阳离子脂质体包括二油酰基三甲基磷酸铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物；或双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺和/或胆固醇的混合物。
205.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述核酸分子以约0.1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约10摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子；至10摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约0.1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
206.权利要求205的药物组合物，其中所述核酸以约1摩尔编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子比约1摩尔编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
207.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中，在所述第一和第二阳离子脂质体中，所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体分别以约0.5∶1至约1∶40(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
208.权利要求207的药物组合物，其中，在所述第一和第二阳离子脂质体中，所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体分别以约1∶5至约1∶20(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
209.权利要求208的药物组合物，其中所述编码一种或多种病毒蛋白质的一种或多种核酸分子、所述编码一种或多种白介素的一种或多种核酸分子、和所述阳离子脂质体以约1∶10(μg总核酸∶μg脂质体)的重量比存在。
210.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述一种或多种病毒蛋白质选自HIV病毒蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS病毒蛋白质、禽流感病毒蛋白质、乙型肝炎病毒蛋白质和天花病毒蛋白质。
211.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其中所述一种或多种白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18和IL-23。
212.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其进一步包括这样的肽，所述肽包括与每一所述复合物结合的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO：1)肽。
213.权利要求194或权利要求195的药物组合物，其进一步包括选自一种或多种抗菌剂、一种或多种防腐剂、一种或多种缓冲剂和一种或多种表面活性剂的一种或多种赋形剂。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103655475A (zh) * 2012-09-19 2014-03-26 乔治敦大学 靶向的脂质体
CN105163762A (zh) * 2013-03-14 2015-12-16 乔治敦大学 对神经毒剂的暴露的治疗
CN105726485A (zh) * 2016-03-24 2016-07-06 东华大学 一种半乳糖化壳聚糖修饰的免疫醇质体的制备方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5573111B2 (ja) * 2009-11-06 2014-08-20 ライオン株式会社 イソプロピルメチルフェノール含有液体口腔用組成物
US20110182976A1 (en) * 2010-01-28 2011-07-28 National Taiwan Ocean University Lipoplex-patch based dna vaccine
WO2011105520A1 (ja) * 2010-02-26 2011-09-01 国立大学法人 長崎大学 抗原または薬物送達複合体
PT2611467T (pt) * 2010-08-31 2022-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas pequenos para entrega de arn que codifica um imunogénio
WO2012040101A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 University Of Miami Compositions and methods for inducing migration by dendritic cells and an immune response
WO2012040266A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 University Of Miami Gene-based adjuvants and compositions thereof to increase antibody production in response to gene-based vaccines
US20140120157A1 (en) 2012-09-19 2014-05-01 Georgetown University Targeted liposomes
CN103405386B (zh) * 2012-09-21 2016-05-18 上海泽润生物科技有限公司 一种脂质体的制备方法及制作脂质体佐剂的方法
CN111840538A (zh) * 2020-05-29 2020-10-30 中山大学 一种水痘-带状疱疹病毒亚单位纳米疫苗的制备方法和应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957735A (en) * 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5688488A (en) * 1989-04-03 1997-11-18 Purdue Research Foundation Composition and method for tumor imaging
US5753258A (en) * 1990-10-19 1998-05-19 University Of Florida Artificial viral envelopes
US6099842A (en) * 1990-12-03 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin
CA2142007C (en) * 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
US5786214A (en) * 1994-12-15 1998-07-28 Spinal Cord Society pH-sensitive immunoliposomes and method of gene delivery to the mammalian central nervous system
FR2730637B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
DE69638269D1 (de) * 1995-06-14 2010-11-18 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
PT956001E (pt) * 1996-11-12 2012-12-06 Univ California Preparação de formulações estáveis de complexos do tipo lípido-ácido nucleico para uma entrega eficiente in vivo
US6210707B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
US6794128B2 (en) * 1998-04-24 2004-09-21 The Regents Of The University Of California Methods of selecting internalizing antibodies
US20030022854A1 (en) * 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US9034329B2 (en) * 1999-02-22 2015-05-19 Georgetown University Preparation of antibody or an antibody fragment-targeted immunoliposomes for systemic administration of therapeutic or diagnostic agents and uses thereof
AU3703100A (en) * 1999-02-22 2000-09-14 Georgetown University Antibody fragment-targeted immunoliposomes for systemic gene delivery
US7780882B2 (en) 1999-02-22 2010-08-24 Georgetown University Simplified and improved method for preparing an antibody or an antibody fragment targeted immunoliposome for systemic administration of a therapeutic or diagnostic agent
US20020103165A1 (en) * 2000-02-29 2002-08-01 Alliance Pharmaceutical Corp., Engineered spray-dried lipid-based microparticles for cellular targeting
CN103251562B (zh) 2003-06-04 2016-04-27 乔治敦大学 改良脂质体复合物的稳定性和保存期的方法
JP5478886B2 (ja) * 2005-10-20 2014-04-23 ジョージタウン・ユニバーシティ 癌の早期ｍｒｉ検出を改善するための腫瘍標的化ナノ送達系

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103655475A (zh) * 2012-09-19 2014-03-26 乔治敦大学 靶向的脂质体
CN105163762A (zh) * 2013-03-14 2015-12-16 乔治敦大学 对神经毒剂的暴露的治疗
CN105163762B (zh) * 2013-03-14 2019-06-25 乔治敦大学 对神经毒剂的暴露的治疗
US10668172B2 (en) 2013-03-14 2020-06-02 Georgetown University Treatment for exposure to nerve agent
CN105726485A (zh) * 2016-03-24 2016-07-06 东华大学 一种半乳糖化壳聚糖修饰的免疫醇质体的制备方法
CN105726485B (zh) * 2016-03-24 2019-08-06 东华大学 一种半乳糖化壳聚糖修饰的免疫醇质体的制备方法

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