CN105163762B - 对神经毒剂的暴露的治疗 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了预防和治疗对有机磷酸盐试剂的暴露的毒性作用的方法。在实施方案中，施用递送编码丁酰胆碱酯酶和富含聚脯氨酸的核酸分子的靶向阳离子脂质体复合物。适当地，施用是通过吸入或通过气雾剂。还提供了阳离子脂质体复合物和产生用于此类施用的复合物的方法。

Description

对神经毒剂的暴露的治疗
发明背景
发明领域
本申请提供了预防和治疗对有机磷酸盐试剂的暴露的毒性作用的方法。在实施方案中，施用递送编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的序列的核酸分子的靶向阳离子脂质体复合物。适当地，施用是通过吸入。还提供了阳离子脂质体复合物和产生用于此类施用的复合物的方法。
发明背景
有机磷酸盐试剂(OP)通常用作杀虫剂、杀昆虫剂和用于治疗医学病况诸如青光眼和阿尔茨海默病的药物。不幸地是，它们还已被开发用作神经毒剂诸如沙林、梭曼、维埃克斯(VX)和塔崩。这些OP化合物属于已知的最毒的化学物质。对甚至少量的暴露可以是致命的。死亡因由横隔肌和肋内肌的麻痹、大脑呼吸中枢的抑制、支气管痉挛、抽搐和唾液分泌过多引起的窒息而发生(综述于1中)。OP中毒的机理是导致酶的不可逆失活的乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性位点中的丝氨酸的羟基的磷酸化。AchE(其在突触间隙水解乙酰胆碱(Ach))是神经传递中的必需酶。AchE的失活导致Ach的快速积累，随后产生PNS胆碱能过度刺激和死亡。在CNS中，胆碱能过度兴奋增加神经元放电，从而触发抽搐和急性神经细胞死亡。
虽然存在用于暴露后使用的解毒治疗，但它们已证明疗效有限，产生严重的副作用，并且没有阻止失能(暂时性或永久性的)或不可逆的脑损伤(1，2)。因此，正在寻求预防性措施。用于抵消OP毒性的一种方法是利用生物清除剂隔离和中和这些化合物。在所测试的生物清除剂中，人血清丁酰胆碱酯酶(BChE)(也称为假胆碱酯酶，或胆碱酯酶)似乎是最适合于人使用的(3)。BChE是一种存在于几乎每一个组织 (包括血浆、脑、肌肉、肾、肝和肺)中的丝氨酸酶(4)。血清中的人 BChE(hBChE)(340kDa)是具有T1/2为11-14天的球状四聚体分子，由四个相同的亚基组成，并且通过重糖基化(5)来免受蛋白水解。个体亚基组装成四聚体需要来源于lamellipodin(5)或来自大鼠胶原蛋白尾 (AChE Q亚单位)的富含聚脯氨酸的肽(Bon的文章,Krejci的文章, Antamirano的文章)，或任何其他富含聚脯氨酸的蛋白质的存在。 BChE以相高的水平(4倍于平均基因的表达)天然表达(4)。其还在许多含酯药物中的降解中起着重要作用，并且是胆碱酯酶抑制剂(包括强效 OP神经毒剂)的天然生物清除剂。
每一个hBChE分子中和一个OP分子(6)。据报道，利用重组人 BChE和人血清BChE的预处理可以保护动物(包括啮齿动物、豚鼠、猪和非人灵长类动物)免受高达5倍LD50的神经毒剂的伤害(6，7)。 BChE与广谱的OP毒药的不可逆结合和其灭活作用使其成为用于抗神经毒剂的预防性治疗的理想候选者。除了其用于多种战时暴露前和暴露后场景的用途以外，其还具有作为对用于对故意/意外神经毒气释放起反应的第一反应者的预治疗和作为对杀虫剂过度暴露、过量服用可卡因或琥珀酰-胆碱诱导的呼吸暂停的暴露后治疗的潜在用途(8)。
据估计，在人中，250mg/70千克的BChE剂量是在用一个LD50的OP攻击后实现高效保护所需要的(3)。然而，在血液中该生物清除剂酶的天然存在的量(～8-72mg/6L)太低以至于因OP与BChE的化学计量和不可逆的结合以及其间的相互作用、不利的OP/BChE质量比和酶的老化而不能实现足够的保护(4,9)。因此，关键是开发显著升高 BChE在血浆中的表达水平和量的方法。为此目的，正在制定不同的策略。最直接的方式是直接注入大剂量高度纯化的天然hBChE以增加其在血流的量。这已被证明对于抗致死剂量的梭曼和维埃克斯的保护是成功的，但对于战场使用是不实用的。此外，转基因动物和细胞培养的使用尚未能产生足够量的hBChE来切实可行地使用。
能够自发地再活化(使得它们可用于结合并灭活另外的OP分子) 的BChE突变体的衍生是另一种具有一定成功的使用的方法。当用组氨酸取代第117位上的甘氨酸(G117H)时BChE经显示获得OP水解酶活性和增强的再活化(10,11)。该突变体在水解乙酰胆碱酯酶抑制剂二乙氧磷酰硫胆碱上是高效的并且还可高效地水解神经毒剂沙林和维埃克斯(9)。更重要的是，表达G117H突变体的转基因小鼠对OP具有抗性(12)。虽然已产生60种以上的BChE突变体，但G117H仍然是最高效的突变体之一并且迄今仍在被研究(9)。然而，迄今为止，还未开发出在通过非侵入途径施用后在体内长时间高效地递送或产生 BChE或活性mtBChE的四聚体形式的方法。
因此，存在对开发递送BChE以预防和治疗对OP试剂的暴露的技术和方法的迫切需要。本发明通过提供用于此类治疗和/或预防的基于阳离子-脂质体的药物递送系统来满足这些需要。
发明概述
在一个实施方案中，提供了治疗或预防哺乳动物的与对有机磷磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法适当地包括对哺乳动物施用阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、直接与阳离子脂质体复合(但非化学缀合于其)的配体、与阳离子脂质体结合的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和与阳离子脂质体结合的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。
在实施方案中，通过选自如下途径的途径施用所述复合物：鼻内施用、静脉内施用、口服施用、舌下施用、肌内施用、病灶内施用、皮内施用、透皮施用、眼内施用、腹膜内施用、经皮施用、气雾剂施用、器官内施用、脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓释植入物、通过渗透或机械泵的施用和通过吸入的施用。
适当地，所述配体是转铁蛋白、抗体和抗体片段，包括单链Fv 抗体片段，诸如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
在其它实施方案中，配体靶向阳离子脂质体还包含与阳离子脂质体结合的含有K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO:1)肽的肽。
适当地，编码BChE的核酸分子被包含在第一质粒中并且编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含在第二质粒中。在实施方案中，编码BChE的核酸分子被包含于第一质粒构建体，其从5'至3'包含：(a) 至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。在实施方案中，编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含于第二质粒构建体，其从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
或者，编码BChE的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子存在于相同的构建体中，但编码BChE的核酸分子被置于美国公开专利申请号2007/0065432中公开的高表达启动子的下游，而编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被置于标准启动子诸如RSV或CMV的下游。
适当地，BChE是BChE的突变形式，包括BChE的突变形式为 G117H突变体。
在示例性实施方案中，阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。适当地，配体和阳离子脂质体以在约1:1至约1:100(w:w)的范围内的比率，例如在约1:10至约 1:50(w:w)的范围内的比率或在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在。
在实施方案中，阳离子脂质体包含二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；二油酰三甲基磷酸铵与胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与胆固醇的混合物或二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物。
适当地，阳离子免疫脂质体复合物中的核酸分子以约10:1至约 1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或核酸分子以约5:1至约 1:5(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约4:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约2:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约1:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。
在实施方案中，核酸分子的总量以约1:1至约1:40(μg核酸:μg脂质体)或约1:5至约1:20(μg总核酸:μg脂质体)的重量比存，或更适当地核酸分子的总量以约1:10(μg总核酸:μg脂质体)的重量比存在。
适当地，施用复合物以治疗与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性，更适当地以治疗与对多至10x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。在实施方案中，施用复合物以预防与对至少 1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露、更适当地对多至10xLD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
在实施方案中，在对有机磷酸盐试剂暴露之前或之后立即施用复合物。在其它实施方案中，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少 6小时施用复合物。适当地，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少一周一次地施用复合物。
适当地，哺乳动物是人。
还提供了治疗人的与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法适当地包括对人鼻内或通过气雾剂吸入施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合(但非化合缀合于其)的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。适当地，TfRscFv和阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在，并且核酸分子以约1:5至约1:20(μg核酸:μg脂质体)的比率存在。适当地，阳离子免疫脂质体复合物中的核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或核酸分子以约5:1至约1:5的摩尔比(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)存在，或更适当地，核酸分子以约4:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约2:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约1:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。在实施方案中，施用复合物以治疗与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
还提供了用于预防人的与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法适当地包括对人鼻内或通过气雾剂吸放施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合(但非化学缀合于其)的抗转铁蛋白受体单链 Fv(TfRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。适当地，TfRscFv和阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在，并且核酸分子以约1:5至约1:20(μg核酸:μg脂质体)的比率存在。适当地，阳离子免疫脂质体复合物中的核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或核酸分子以约5:1至约1:5(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约4:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约2:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约1:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。在实施方案中，施用复合物以预防与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
还提供了将丁酰胆碱酯酶(BChE)递送至哺乳动物的血流的方法。此类方法适当地包括对哺乳动物鼻内或通过气雾剂吸入施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合(但非化学缀合于其)的抗转铁蛋白受体单链 Fv(TfRscFv)、阳离子脂质体、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。适当地， TfRscFv与阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在，核酸分子以约1:5至约1:20(μg核酸:μg脂质体)的比率存在。适当地，阳离子免疫脂质体复合物中的核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或核酸分子以约5:1至约1:5(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约 4:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在或更适当地，核酸分子以约 2:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约1:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。在实施方案中，施用复合物以导致至少250mg/70kg(BChE的重量/人的重量)的人血流中的 BChE的量。
或者，编码BChE的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子存在于相同的构建体中，但编码BChE的核酸分子被置于美国公开专利申请号2007/0065432(通过引用以其整体并入本文)中公开的高表达启动子的下游，而编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被置于标准启动子诸如RSV或CMV的下游。
附图概述
图1显示在来自靶向阳离子免疫脂质体递送的转移瘤中转基因表达的存在。
图2显示作为将基因置于本文中所述的高表达启动子的控制下的结果的蛋白质表达的增加。
图3A和3B显示至利用具有含有GFP基因的pSCMV高表达质粒(图3A)或具有荧光标记的寡核苷酸(图3B)的scL注射的Balb/C小鼠的脑的scL递送。
图4A-4B显示通过颈内静脉置管在大鼠中注射的靶向TfR并且具有编码GFP的质粒(100μg cDNA)的脂质体复合物的脑切片。
图5显示在对Balb/c小鼠鼻内施用后，以游离(未被封装的)或scL 封装的质粒DNA形式存在的荧光素酶基因的表达水平。
图6显示使用检测ERKI和ERKII蛋白的抗体进行的总细胞蛋白质的Western分析。
图7显示将wt-BChE、mt-BChE和ppro基因亚克隆进pSCMV 载体的结果。
图8显示wt-BChE、mt-BChE和ppro基因在pSCMV载体中的超螺旋结构的百分比。
图9显示在用递增量的scL-mtBChE/ppro复合物中的DNA转染后CHO-K1细胞中的BChE的表达水平。
图10显示在用scL-mtBChE/ppro复合物体外转染A549细胞后 16天BChE的表达。
图11显示在用scL-mtBChE/ppro复合物体外转染A549细胞后 28天BChE的表达。
发明详述
术语"复合物"、"纳米复合物"、"脂质体复合物"和"纳米脂质体" 在本说明书中可互换地用于指本文中公开的阳离子脂质体。用于本发明的实践的示例性阳离子脂质体及其产生方法公开于美国公开专利申请号2003/0044407和2007/0065499中，其每一个的公开内容通过引用以其整体并入本文。
如本文中所用，术语"约"是指引用值，以及在该引用值的10％内的值。例如，"约100nm"包括90nm至110nm的值，包括在该范围之间的值。
如本文中所用，术语"配体"是指可化学缀合于阳离子脂质体或与其直接结合/复合(但非化学缀合于其)的任何合适的靶向部分。用于本发明的实践的示例性配体包括，但不限于，蛋白质(例如，转铁蛋白或叶酸)、肽(例如，L-37pA)、抗体、抗体片段(包括Fab'片段和单链Fv 片段)和糖类(例如，半乳糖)以及其它靶向分子。
示例性方法和组合物公开于美国公开专利申请号2003/0044407和 2007/0065499中，其中按照本发明的实施方案的复合物通过简单高效的非化学缀合来产生。示例性方法和组合物公开于美国专利号 7,479,276中，其中按照本发明的实施方案的复合物通过化学缀合来产生。这些专利和专利申请的每一个的公开内容通过引用以其整体并入本文。
在示例性实施方案中，完整抗体或抗体片段可用作制备本发明的复合物的配体。在适当的实施方案中，使用抗体片段，包括抗体的Fab 片段和单链Fv片段(scFv)。一种合适的抗体是抗转铁蛋白受体(抗TfR) 单克隆抗体，并且合适的抗体片段是基于抗TfR单克隆抗体的scFv。合适的抗TfR单克隆抗体是5E9(参见，例如，Hayes,B.F.，等人， "Characterization of a Monoclonal Antibody(5E9)that Defines a Human CellSurface Antigen of Cell Activation,"J.Immunol. 127:347-352(1981)；Batra,J.K.，等人，"Single-chain Immunotoxins Directed at the Human Transferrin ReceptorContaining Pseudomonas Exotoxin A or Diphtheria Toxin:anti-TFR(Fv)-PE40 andDT388-anti-TFR(Fv),"Mol.Cell.Biol.11:2200-2205(1991)(其公开内容通过引用并入本文)。基于完全抗TfR单克隆抗体的scFv含有被该MAb识别的TfR的表位的完整抗体结合部位(作为分子量约为 26,000的单链多肽)。scFv通过将分别来自重链和轻链的组分VH和 VL可变结构域与适当地设计的肽连接来形成，所述肽桥连第一可变区的C末端和第二可变区的N末端，顺序为VH-肽-VL或VL-肽-VH。另外的配体，诸如本说明书中描述的配体，也可用于本发明的实践。
在一个实施方案中，将半胱氨酸部分(moiety)添加至scFv的C 末端。虽然不希望受理论束缚，但据信，提供游离巯基的半胱氨酸可在化学缀合和非化学缀合实施方案中增强抗体与脂质体之间的复合物的形成。在使用或不使用半胱氨酸的情况下，可在大肠杆菌(E.coli)的包涵体中表达蛋白，随后重折叠以产生呈活性形式的抗体片段。
除非想要在复合物的形成中使用空间上稳定的脂质体，否则制备本发明的示例性非化学缀合的复合物中的第一步骤包括将阳离子脂质体或脂质体与选择的抗体或抗体片段的组合混合。各种阳离子脂质体可用于本发明的复合物的制备。公开的PCT申请WO99/25320(其公开内容通过引用以其整体并入本文)描述了几种阳离子脂质体的制备。合适的脂质体的实例包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和包含二油酰三甲基磷酸铵(DOTAP)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的混合物、DOTAP与DOPE和/或胆固醇(chol)的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)和DOPE和/或chol的混合物或DDAB与DOPE 的混合物。脂质的比率可被改变以优化特定靶细胞类型对治疗性分子的摄取效率。脂质体可包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。所需的阳离子脂质对中性或辅助脂质的比率为约1:(0.5-3)，优选地1:(1-2)(摩尔比)。
适当的配体，例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段，是可结合靶细胞的表面，和优选地结合在靶细胞上差异表达的受体的配体。将配体在室温下以在约1:10至约1:50、适当地约1:20至约1:40(w:w)的范围内的配体(例如，蛋白质):脂质比率(重量:重量)与阳离子脂质体或聚合物混合。
让配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和脂质体在室温下短暂温育，通常约10-15分钟，随后将混合物与选择的治疗剂或诊断剂混合。可与脂质体复合物复合的治疗性分子或试剂的实例包括基因、高分子量DNA(基因组DNA)、质粒DNA、反义寡核苷酸、肽、核酶、核酸(包括siRNA、miRNA和反义核酸)、小分子、病毒颗粒、免疫调节剂、用于成像的造影剂、蛋白质和化学试剂。
将配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)和脂质体组合以在约0.5:1至约1:40(μg的试剂:nmol的总脂质)，适当地约1:10至1:20(μg 的试剂:nmole的总脂质)的范围内的比率与治疗剂混合，并在室温下短暂温育，通常约10至15分钟。对于体内使用，将50％葡萄糖或50％蔗糖添加至5-20％(V:V)的终浓度并通过轻轻翻转混合5-10秒，或对于更大体积，以20-30RPM旋转1-2分钟。如使用Malvern 3000或MalvernNANO-ZS通过动态光散射测量的，脂质体复合物的尺寸通常在约50-500nm的范围内。参见美国公开专利申请号2003/0044407和美国专利申请号11/520,796，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
在本发明的一个实施方案中，用于形成复合物的脂质体是空间上稳定的脂质体。空间上稳定的脂质体是已将亲水性聚合物诸如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)或聚(n-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)整合进其中的脂质体。当与治疗剂复合时，此类经修饰的脂质体可以是特别有用的，因为它们被网状内皮系统从血流清除的速度通常没有未被这样修饰的可比较的脂质体快。为了制备本发明的空间上稳定的脂质体复合物，将混合抗体或抗体片段、脂质体和治疗剂或诊断剂的顺序从上文所示的顺序反过来。在第一步骤中，首先将上述阳离子脂质体与上述治疗剂以在约0.5:1至约1:40(μg的试剂:nmol的脂质)、适当地约1:10至 1:20(μg的试剂:nmole的脂质)的范围内的比率混合。以约0.1:100(nmol 的PEG:nmol的脂质体)、适当地约0.5:50(例如约1:40(nmol的 PEG:nmol的脂质体))的比率向该脂复合物中添加生理上可接受的缓冲液中的PEG聚合物溶液。将所得溶液在室温下温育足以允许聚合物整合进脂质体复合物的时间。随后将配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)在室温下以在约1:5至约1:40(w:w)的范围内的配体(例如，蛋白质):脂质比率与稳定的脂质体复合物混合。对于体内使用，将50％的葡萄糖或50％的蔗糖添加至5-20％(V:V)的终浓度，通过轻轻翻转混合5-10秒，或对于更大的体积，以20-30RPM旋转1-2分钟。
根据本发明的制备的脂质体复合物可被配制为用于体内施用的药学上可接受的制剂。将复合物与药学上相容的媒介物或载体组合。组合物可以以复合物的形式被配制来例如用于对哺乳动物(例如将通过施用治疗剂或其它有效负载(payload)受益的人)静脉内施用。复合物具有适当的尺寸，以便它们在i.v.施用后遍布身体。或者，复合物可通过其它施用途径递送，诸如瘤内(IT)、病灶内(IL)、气雾剂、透皮、口服、内窥镜、局部、肌内(IM)、皮内(ID)、眼内(IO)、腹膜内(IP)、经皮(TD)、鼻内(IN)、脑内(IC)、器官内(例如肝内)、缓释植入物、或皮下施用、或通过使用渗透或机械泵的施用、或通过吸入的施用。用于通过此类方法的递送的制剂的配制以及使用此类方法的递送在本领域中是公知的。
可通过脂质的选择和比率、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)对脂质体的比率、配体和脂质体对治疗剂的比率以及配体和治疗剂的选择来针对靶细胞类型对复合物进行优化。
可将根据本发明的方法制备的复合物以试剂盒的形式提供用于通过复合物的形式进行的核酸、治疗性分子或其它有效负载的全身性递送。合适的试剂盒可在单独的合适容器中包含脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)以及核酸、治疗剂或诊断剂。可将组分在无菌条件下以适当的顺序混合，并且在制备后在合理的时间内(通常约 30分钟至约24小时)对患者施用。试剂盒组分优选以溶液或干燥粉剂的形式提供。优选地将以溶液形式提供的组分连同适当的缓冲液、克分子渗透压浓度控制剂等配制于无菌注射用水中。还可将完全复合物配制为干燥粉剂(冻干的)(参见，例如，美国公开专利申请号 2005/0002998，其公开内容通过引用以其整体并入本文)。
如在整个美国公开专利申请号2003/0044407和2007/0065499(其公开内容通过引用并入本文)中论述的，本说明书中描述的阳离子脂质体复合物已通过使用抗转铁蛋白单链抗体片段(TfRscFv)的靶向成功地将各种治疗剂和诊断剂递送至肿瘤细胞。具体地，核酸分子例如反义核酸和siRNA以及质粒DNA(诸如p53和RB94)已通过使用本发明的脂质体复合物成功地递送(参见美国公开专利申请号2003/0044407 和2007/0065499)。
用于预防或治疗与有机磷酸盐试剂相关的毒性的阳离子脂质体复合物
如上所述，BChE作为OP生物清除剂的用途可用作预防剂。然而，当需要时不能产生并快速递送充足的量是实现该化合物的这些用途的主要障碍。因此，非常重要的是开发在循环中和在其它组织诸如肺、肝和脑中增加BChE的表达的方法。
重组人BChE已使用哺乳动物细胞培养物、转基因山羊、植物和家蚕幼虫来产生(23)。虽然该重组BChE被证明对于抗致死剂量的梭曼和维埃克斯的保护是成功的，但鉴于生产大量GMP材料的高成本以及潜在的稳定性和安全性问题，通过这类方法的生产是不现实的。因此，正在探索其它方法。Parikh和同事(23)已使用腺病毒来递送小鼠BChE。他们发现该静脉内施用的Ad-MoBChE能够在等价于纯 BChE的多个毫克注射的水平上保护小鼠免受多个LD50剂量的OP(维埃克斯和二乙氧磷酰硫胆碱)侵害。虽然产生了增加量的BChE，但获得的水平不转变成保护人所需的BChE的量(最低估计为250mg/70kg) 的产生。该情况的一个可能原因是小鼠中产生的BChE蛋白不是四聚体形式，而主要是在哺乳动物中被快速消除的二聚体(85％)。BChE的治疗性潜能依赖于其长期保留在循环中的能力。该稳定性又取决于维持四聚体结构。此外，病毒载体用于递送系统的用途具有与需要静脉内施用和重复施用相关的潜在的免疫原性问题和缺点。
因此，需要开发其它方法，所述方法不具有与重复施用相关的免疫原性问题；在本领域中本身可被容易施用；以及，更重要地，可导致在循环中具有增加的时间的BChE的优选四聚体形式的显著高水平的表达。本文中描述的脂质体方法提供了许多优于用于基因递送的病毒法的有利方面，包括缺乏免疫原性(24)。阳离子脂质体已证明对于体内基因递送是安全和高效的(25,26)。超过110例使用阳离子脂质体进行DNA递送的临床试验(包括在美国的85例)已被批准(27)，并且至少6种基于脂质体的产品已在市面上销售(28)。
如本文中所述，提供了具有编码BChE(包括BChE的突变形式，诸如活性更高的G117H突变形式(参见例如，参考文献11，其公开内容通过引用以其整体并入本文))的质粒和编码富含脯氨酸(以促进四聚化)的肽(诸如rQ45)的基因的质粒的靶向脂质体复合物。当在潜在OP 暴露威胁时施用时，基因被有效地递送至各种组织，包括肺、脑和肝，随后高水平的新的抗OP四聚体hBChE的表达连续产生，并且长期 (例如，1天至14天或更长)存在于循环中。如本文中所述，此类方法适当地是被设计来用于保护(如果存在神经毒气暴露的可能性的话)的预防措施，和作为暴露后治疗性OP干预措施。已确定可增强个体对 OP的敏感性的人BChE的遗传变体是共同的(29,30)。本文中描述的方法可提供高水平的外源活性BChE来消除该固有的遗传敏感性并保护该亚组和一般群体。
脂质体复合物的制备
在示例性实施方案中，本发明提供了制备配体靶向(例如，蛋白质 /肽、抗体靶向或抗体片段靶向)阳离子脂质体复合物的方法。在适当的实施方案中，此类方法包括制备配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)，和将配体与阳离子脂质体混合以形成配体靶向阳离子脂质体，其中将配体与阳离子脂质体直接结合/复合(但非化学缀合于其)。随后将配体靶向阳离子脂质体与一种或多种核酸分子混合。
在实施方案中，核酸分子包含与阳离子脂质体结合的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和与阳离子脂质体结合的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子，以形成配体靶向阳离子脂质体复合物。编码BChE 的核酸分子的序列在本领域中可被容易地知道，或以其它方式描述于本文中。参见，例如，McTiernan，等人，“Brain cDNA clone for humancholinesterase,”Proc.Natl.Acad.Sci.84:6682-6686(其公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文)，图2。
编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的序列描述于本文中或以其它方式在本领域中是已知的。编码大鼠胶原蛋白尾的氨基末端45个残基 (rQ45)，包括富含聚脯氨酸的肽结构域(也称为富含脯氨酸的附接结构域(PRAD))的示例性核酸公开于例如Altamirano和Lockridge, Chemico-Biological Interactions 119-120:53-60(1999)(参见第57页，第2.9节)；Krejci等人，The Journal of Biological Chemistry 272:22840-22847(1997)(参见第22842页，图1)和Bon等人，The Journal of Biological Chemistry 272:3016-3021(1997)(参见桥页第 3016-3017页)(其每一个的公开内容通过引用以其整体并入本文)中。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了制备配体靶向(例如，蛋白质/肽、抗体靶向或抗体片段靶向)阳离子脂质体复合物的方法。在适当的实施方案中，此类方法包括制备配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)，和将配体与阳离子脂质体混合以形成配体靶向阳离子脂质体，其中将配体通过化学缀合与阳离子脂质体直接复合。随后将配体靶向阳离子脂质体与本文中描述的一种或多种核酸分子混合以形成配体靶向阳离子脂质体复合物。
如本文中所述，在加工过程中通过简单地将一种或多种核酸分子与脂质体混合将核酸分子与阳离子脂质体结合，所述阳离子脂质体包含被适当地封装、包含在本发明的脂质体复合物中或与本发明的脂质体复合物复合/结合的核酸分子。核酸分子:脂质体复合物的适当比率可由本领域普通技术人员来容易地确定以及描述于本文中。
在实施方案中，编码BChE的核酸分子被包含在第一质粒中，并且编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含在第二质粒中。即，从不同质粒编码蛋白质。然而，在其它实施方案中，可从相同的质粒编码蛋白质，即，两个基因都被包含在相同的质粒中。
适当地，除它们所编码的基因外，用于编码核酸分子的两个不同质粒是相同的。在适当的实施方案中，编码BChE的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被置于核酸启动子，例如，美国公开专利申请号2007/0065432(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中描述的启动子下游。适当地，核酸分子被置于质粒构建体中，所述质粒从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV) 启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE的核酸分子或编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。参见美国公开专利申请号2007/0065432(其明确地通过引用并入本文)的图3。
或者，编码BChE的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子存在相同的构建体中，但编码BChE的核酸分子被置于美国公开专利申请号2007/0065432中公开的高表达启动子的下游，而编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被置于标准启动子诸如RSV或CMV的下游。
在示例性实施方案中，核酸以约10:01至约0.1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。在示例性实施方案中，核酸以约10:1至约 1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。例如，编码丁酰胆碱酯酶 (BChE)的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子以在约10:1 至约1:10，或约5:1至约1:5，或更适当地约4:1(编码丁酰胆碱酯酶 (BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的范围内的摩尔比存在于脂质体中，或更适当地，核酸分子以约2:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，或更适当地，核酸分子以约1:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。也可使用在这些范围之外的另外的摩尔比。
适当地，核酸分子对脂质体复合物的摩尔比在约0.5:1至约 1:40(μg总核酸:μg脂质体)或约1:1至约1:40(μg总核酸:μg脂质体)，适当地约1:5至约1:20(μg总核酸:μg脂质体)，更适当地约1:10(μg总核酸:μg脂质体)的范围内。如本文中所利用的，核酸分子对脂质体复合物的摩尔比包括核酸的两种"群体"，即核酸的总量包括一种或多种编码BChE的核酸分子，以及一种或多种编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。
如本说明书中所述，用于核酸分子的递送的所需的阳离子脂质体的实例包括这样的阳离子脂质体，所述阳离子脂质体包含二油酰三甲基磷酸铵(DOTAP)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol) 的混合物；和双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)与DOPE和/或chol的混合物。脂质的比率可被改变以优化特定靶细胞类型对核酸分子的摄取效率。脂质体可包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性脂质或辅助脂质的混合物。阳离子脂质对中性或辅助脂质的所需比率为约 1:(0.5-3)，优选地约1:(1-2)(摩尔比)。用于本发明的实践的各种脂质的比率的实例包括，但不限于：
表1用于本发明的实践的各种脂质的比率的实例
(DOTAP＝二油酰三甲基磷酸铵，DDAB＝二甲基十八烷基溴化铵； DOPE＝二油酰磷脂酰乙醇胺；chol＝胆固醇)。
如本说明书中论述的，在适当的实施方案中，用于本发明的组合物和方法的配体是抗体片段，例如单链Fv片段，诸如，抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。适当地，将抗体或抗体片段以在约1:1至约 1:100，适当地约1:10至约1:50(w:w)，更适当地约1:30或约1:33(抗体或抗体片段:脂质)的范围内的比率与阳离子脂质体混合，以形成靶向阳离子脂质体。在另外的实施方案中，脂质体还可包含内体破坏性肽，诸如与脂质体结合的、由Sigma-Genosys(The Woodlands,TX)制造的K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(HK)(SEQ ID NO:1)肽。内体破坏性肽HoKC可帮助将试剂释放在细胞的细胞质中。
在示例性实施方案中，使用如本文中和实施例中描述的乙醇注射法制备阳离子脂质体制剂A(1:1的摩尔比的DOTAP:DOPE)、B(1:1 的DDAB:DOPE)、G(1:1:1的DOTAP:DOPE:胆固醇)和H(1:1:1的 DDAB:DOPE:胆固醇)或本说明书中描述的任何脂质制剂。只有当将肽(诸如K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(HK)肽)包含在复合物中，每一种脂质制剂才也适当地包含总脂质的5摩尔百分比的MPB-DOPE。不用肽制备的复合物不含MPB-DOPE，从而配体不能通过化学缀合结合于脂质体。
由于HoKC肽(K[K(H)KKK]5-K(H)KKC)具有末端半胱氨酸，因此将MPB-DOPE包含在所有脂质体组合物中以使肽能够缀合于脂质体。使用具有马来酰亚胺基团的阳离子脂质体(Lip-MPB)与肽之间的偶联反应制备Lip-HoKC脂质体。将0.1mMol的在半胱氨酸上具有游离硫醇基的肽的等分添加至2mMol的10mM HEPES,pH 7.4中的 Lip-MPB溶液中，在室温下(20-30r.p.m.)旋转2小时。所得的 Lip-HoKC具有1.4mM的脂质浓度。
以与用于产生不具有HoKC的TfRscFv:Lip:DNA复合物的方式相同的方式形成完全复合物。此处也通过以特定比率轻轻翻转将抗转铁蛋白受体单链抗体片段(TfRscFv)与Lip-HoKC混合，并于室温温育 10分钟。随后将核酸添加至TfRscFv:Lip-HoKC溶液，通过轻轻翻转混合，并再次于室温温育15分钟，随后将葡萄糖或蔗糖添加至5-10％的终浓度，并再次通过轻轻翻转混合。用于TfRscFv:Lip-HoKC:核酸复合物的适当比率为0.3mg:7nmol:1mg。
在另外的实施方案中，本发明的方法包括制备配体(例如，蛋白质 /肽、抗体或抗体片段)，和将配体化学缀合于阳离子脂质体的表面以形成阳离子免疫脂质体。随后将阳离子脂质体与编码BChE的质粒构建体(载体)和编码富含聚脯氨酸的肽的质粒构建体(载体)混合，以形成配体靶向脂质体复合物。用于将配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)化学缀合于阳离子脂质体的示例性方法、组合物、比率和条件公开于美国专利号7,479,276(其公开内容通过引用以其整体并入本文) 中。
如本文中所用，术语"蛋白质"、"肽"和"多肽"可互换使用，意指两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、"蛋白质"、"氨基酸链"或用于指两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语包括在术语"蛋白质"、"多肽"和"肽"的定义内。
本发明还提供根据本说明书中描述的方法制备的阳离子脂质体复合物。例如，本发明提供包含阳离子脂质体、配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)、编码BChE的一种或多种核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的配体靶向(例如，蛋白质/肽、抗体靶向或抗体片段靶向)阳离子脂质体复合物，其中所述配体与阳离子脂质体直接复合/与其结合(但非化学缀合于其)。所述配体(例如，蛋白质 /肽、抗体或抗体片段)适当地通过配体与脂质体之间的相互作用(例如，静电、范德华或其它非化学缀合的相互作用)与脂质体结合。一般地，当非化学缀合时，不使用接头或间隔子分子(例如，聚合物或其它分子) 来附接配体和脂质体。
如本文中所述，在另外的实施方案中，将配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)，例如，通过含有马来酰亚胺基团或其它巯基反应性基团的阳离子脂质体与配体(例如，蛋白质/肽、抗体或抗体片段)上的硫原子之间的化学相互作用化学缀合于阳离子脂质体。随后将核酸添加至脂质体以形成脂质体-DNA复合物，或可首先添加核酸，随后将其与配体复合。此类方法公开于美国专利号7,479,276(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中。
可将核酸分子封装在阳离子脂质体内，包含在阳离子脂质体的烃链区域内，与阳离子脂质体的外或内单层(例如，头部基团区域)结合，或其任意组合。尽管也可使用包含几个同心双层的多层脂质体，适当地，本发明的阳离子脂质体是单层脂质体(即单个双分子层)。本发明的单个双分子层阳离子脂质体包含其中可封装核酸分子的内部含水体积。它们还包含具有烃链区域(即，脂质的脂质链区域)的单个双分子层，在所述烃链区域中可包含已被条件为中性或大体上不带电荷的核酸分子。此外，可将核酸分子例如通过带负电荷的核酸分子与带正电荷的阳离子脂质体之间的电荷间相互作用与脂质体膜(即，脂质的头部基团区域)的内部单层和/或外部单层或这两个层复合或结合。在其它实施方案中，可将核酸分子封装/结合/复合在本发明的阳离子脂质体复合物的这些区域中的任何区域或所有区域中。
如本发明论述的，适当地，核酸分子以约0.1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约10摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子；至10摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE) 的一种或多种核酸分子对约0.1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比存在；在其它实施方案中，核酸分子以约1 摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约10摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子；至10摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比存在，更适当地，核酸分子以约5摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1 摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子；至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约5摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比存在；具体地，可在脂质体复合物中使用约4摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子，具体地，约2摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子，具体地，约1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子。适当量/ 比率的脂质、靶向配体和核酸分子也在本说明书中进行了描述。
在示例性实施方案中，编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子、编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子和脂质体以约 0.5:1至约1:40(μg总核酸:μg脂质)、适当地约1:1至约1:40(μg总核酸:μg脂质)或约1:5至约1:20(μg总核酸:μg脂质)，例如约1:10(μg总核酸:μg脂质)的重量比存在。本发明的示例性脂质体组合物以约 1:10:0.33(μg总核酸:μg脂质:μg单链抗体)的重量比包含总核酸、脂质和配体，诸如单链抗体(例如，TfscFv)(在本文中也称为scL)。
本发明还提供包含本说明书中描述的配体靶向阳离子脂质体复合物的药物组合物。在适当的实施方案中，药物组合物还包含一种或多种选自如下物质的赋形剂：一种或多种抗菌剂(例如，两性霉素B、氯四环素、庆大霉素、新霉素)、一种或多种防腐剂(例如，苄索氯铵、 EDTA、甲醛、2-苯氧基乙醇)、一种或多种缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、硼酸钠、氯化钠)、一种或多种表面活性剂(聚山梨醇酯20，80)、一种或多种蛋白质稳定剂(例如，白蛋白、乳糖、谷氨酸钾)、糖类例如蔗糖或葡萄糖和佐剂(例如，氢氧化铝、磷酸铝)。另外的赋形剂在本领域中是公知的，并且可在本发明的实践中容易地使用。
在某些此类实施方案中，将编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子在与编码富含聚脯氨酸的肽的核酸相同的组合物中递送，而非将其封装在相同的阳离子脂质体中/与相同的阳离子脂质体结合，将它们与两种(或更多种)不同的阳离子脂质体结合，随后在相同组合物(即，混合在一起的两种不同脂质体群体)进行递送。在其它实施方案中，可将编码BChE的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子一起包含在相同的质粒载体中。本发明还包括向哺乳动物施用两种分离的脂质体组合物(包含编码BChE的核酸的一种脂质体组合物，和包含编码富含聚脯氨酸的肽的核酸的一种脂质体组合物)。合适的脂质、靶向分子和核酸分子以及用于本发明的药物组合物的此类组分的比率的实例描述于本说明书中。
治疗和/或预防的方法
本文中还提供了治疗和/或预防哺乳动物的与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。适当地，此类方法包括向哺乳动物施用阳离子脂质体复合物，其中阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合物(但非化学缀合于其)的配体、与阳离子脂质体结合的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子(包括一种或不止一种核酸分子)，和与相同或不同的阳离子脂质体结合的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子(包括一种或不止一种核酸分子)。
本文中描述的方法可用于任何哺乳动物，包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、猴等。
适当地，所述方法用于治疗与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。如本文中所用，“用于治疗”与对OP试剂的暴露相关的毒性的方法提供治疗有效量的BChE和富含聚脯氨酸的肽，以在哺乳动物已暴露于OP试剂之后使哺乳动物能够战胜与对OP试剂的暴露相关的毒性。
在其它实施方案中，所述方法用于预防与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。如本文中所用，“用于预防”与对OP试剂的暴露相关的毒性的方法在哺乳动物暴露于OP试剂之前(即，如果哺乳动物暴露于OP试剂)提供治疗有效量的BChE和含聚脯氨酸的肽，以使哺乳动物能够战胜与将来对OP试剂的暴露相关的毒性。
短语"治疗有效量"在此处用于指足以减少至少约10％，适当地至少20％、或至少30％、或至少40％、更适当地至少50-90％和更适当地预防(即减少100％)哺乳动物对与OP试剂相关的毒性的活性、功能和反应的临床上显著的缺乏的量。此外，“治疗有效量”适当地也足以引起哺乳动物的临床上显著病况的改善。
在解毒剂(即，BChE)的上下文中，通常效力的水平根据保护/清除 /解毒一定量的毒性剂(OP)来定义。有用的度量为“LD50”，其为对于一半暴露于化学试剂的动物是致命的化学试剂的量。因此，“治疗有效量”也是足以保护免受至少一个LD50(即，1x LD50–1倍的LD50)的毒性剂 (OP)侵害的量。如本文中所述，所述方法适当地提供可治疗对至少1 倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍(或更多)LD50的OP试剂的暴露的作用或预防对所述量的OP试剂的潜在暴露的递送量的解毒剂。
适当地，施用复合物以治疗与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂、达到和包括5xLD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
在其它实施方案中，施用复合物以预防与至少1x LD50的有机磷酸盐试剂、达到和包括5x LD50的有机磷酸盐试剂的潜在暴露相关的毒性。
任何合适的方法可用于将本文中描述的复合物施用至哺乳动物。在实施方案中，通过选自如下途径的途径施用复合物：鼻内施用、静脉内施用、口服施用、舌下施用、肌内施用、病灶内施用、皮内施用、透皮施用、眼内施用、腹膜内施用、经皮施用、气雾剂施用、器官内施用、脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓释植入物、通过渗透或机械泵的施用和通过吸入的施用。最适当地，通过鼻内或气雾剂吸入给药施用复合物，从而导致复合物和核酸的肺部递送。
用于施用本文中描述的复合物的肺递送装置在本领域中是公知的。肺递送装置产生活性剂的颗粒，通常约0.01μm至约4μm，其可被受试者吸入。肺递送装置被广泛用于从溶液或悬浮液吸入活性剂 (即，本文中描述的脂质体复合物)，或以干燥粉剂形式(任选地与赋形剂混合的)吸入活性剂。肺递送装置的实例包括，但不限于，定量吸入器(MDI)、喷雾器和干粉吸入器(DPI)。肺递送装置可任选地被加压，并且可利用助推剂系统。肺递送装置还可包括引入储雾罐(holding chamber)，例如腔体状储雾罐(spacer)，以防止雾化活性试剂逸入空气中，并且使得受试者有更多时间吸入。
本文中描述的方法中使用的肺递送装置可通过吸入激活，例如，一旦被受试者吸入将自动地分配活性剂，并且可与装有活性剂和任选地装有助推剂的气雾剂容器一起使用。这些装置可以以受控方式施用多个定量剂量，从而使得活性剂受控并一致地给药进入受试者的支气管通道和肺上皮。肺递送装置的实例描述于美国专利号5,290,539、 6,615,826、4,349,945、6,460,537、6,029,661、5,672,581、5,586,550和 5,511,540(其通过引用并入本文)中。
定量吸入器(MDI)通过使用助推剂喷射恒定体积的活性来运行，所述活性剂被受试者吸入。MDI还可包含表面活性剂来阻止活性剂的聚集。可将活性剂溶解或悬浮于溶液中。使用助推剂的MDI可需要 MDI的同时吸入和活化。储雾罐，例如腔体状储雾罐，可用于贮存雾化的活性剂，消除对同时活化和吸入的需要。MDI提供恒定的、定量的活性剂，并且允许一致给药。MDI的实例描述于美国专利号 6,615,826和5,290,539中。
喷雾器通过产生雾，即喷雾或雾化溶液中的活性剂的制剂来运行，所述活性剂制剂被受试者吸入。可将活性剂溶解或悬浮于溶液中。可通过本领域中已知的任何方法，包括风扇、振动膜或超声装置的使用来产生微滴。喷雾器比MDI和DPI更温和，并适合用于不能使用吸入器的个体，诸如婴儿、年幼的儿童和患有严重疾病或失能的个体。喷雾器的实例描述于美国专利号6,748,945、6,530,370、6,598,602和 6,009,869中。
干粉吸入器(DPI)不使用助推剂，并且施用被受试者吸入的干粉。为了分配干粉，DPI可使用本领域已知的任何方法来推进活性剂，包括气动系统、电动风扇或机械推进，例如，容器的挤压。DPI可相反地简单地依赖于受试者的吸入。对于DPI来说不需要将活性剂与助推剂混合，从而允许递送更大有效负载的活性剂。DPI的实例描述于美国专利号6,029,661中。
通常，用于吸入肺的液体或干粉制剂的雾化作用将需要助推剂。助推剂可以是本领域通常使用的任何助推剂。此类有用的助推剂的具体非限制性实例是含氯氟烃、氟代烷烃、氟氯烃化合物或烃，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇(dichlorotetrafiioroethanol)和 1,1,1,2-四氟乙烷或其组合。助推剂制剂的实例描述于美国专利号 5,672,581(其通过引用并入本文)中。
也可使用本领域已知的用于肺施用的其它方法。例如，这些方法包括通过气管内吸入、吹入或插管的递送，例如通过注射器、试管或类似装置进行的溶液、粉剂或雾至肺内的递送。
如本文中描述的，适当地，用于复合物的配体是转铁蛋白、抗体和抗体片段。示例性抗体和抗体片段描述于本说明书中，并且包括单链Fv抗体片段，诸如抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
在实施方案中，配体靶向阳离子脂质体还包含与阳离子脂质体结合的含有K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO:1)肽的肽。本文中描述了将肽与阳离子脂质体结合的示例性方法。
在适当的实施方案中，将编码BChE的核酸分子包含在第一质粒中，并且将编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子包含在第二质粒中。即，核酸分子被包含在分开的质粒中，所述质粒的每一种与相同或不同的阳离子脂质体结合(即，封装)。在其它实施方案中，可将编码BChE 的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子包含在相同的质粒中，即从相同的质粒表达。然而，通过使用两种分开的质粒，每一种核酸的量和从而每一种表达的蛋白质的量可被分开地控制，并且可针对不同的治疗或预防方案和效果优化核酸的比率。
适当地，将编码BChE的核酸分子包含在第一质粒构建体，所述构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE的核酸分子；和 (e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。在实施方案中，将编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子包含在第二质粒构建体中，所述构建体从 5'至3'包含：(a)至少一种人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV) 启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和 (e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。参见，美国公开专利申请号2007/0065432(其明确地通过引用并入本文)的图3，其描述了此类构建体。在其它实施方案中，核酸可通过本领域中已知的其它启动子表达。
在示例性实施方案中，由核酸表达的BChE是BChE的突变形式。 BChE的合适突变体在本领域中是已知的或以其它方式描述于本文中，并且适当地包括G117H突变体，如描述于Millard,C.B., Lockridge,O.,&Broomfield,C.A.(1995),“Design and expression oforganophosphorus acid anhydride hydrolase activity in humanbutyrylcholinesterase,”Biochemistry 34:15925-15933；和Lockridge, O.,Blong,R.M.,Masson,P.,Froment,M.T.,Millard,C.B.,& Broomfield,C.A.(1997),“A singleamino acid substitution, Gly117His,confers phosphotriesterase(organophosphorus acid anhydride hydrolase)activity on humanbutyrylcholinesterase,” Biochemistry 36:786-795(所述文献的每一篇的公开内容通过引用以其整体并入)中。
如本文中所述，适当地，阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。配体:阳离子脂质体的示例性比率描述于本说明书中，并且适当地包括其中配体与阳离子脂质体以在约1:1至约1:100(w:w)的范围内的比率存在，适当地，其中配体与阳离子脂质体以在约1:10至约1:50(w:w)的范围内的比率存在，或更适当地，其中配体与阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在。
在实施方案中，用于本文中描述的方法的阳离子脂质体包含二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇铵和胆固醇的混合物；二油酰三甲基磷酸铵与胆固醇的混合物、双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇铵和胆固醇的混合物、双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇铵的混合物、双十八烷基二甲基溴化铵与胆固醇的混合物、或二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇铵的混合物。可用于所述方法的另外的脂质体组合物描述于本文中。
在适当的实施方案中，核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。更适当地，核酸分子以约8:1至约1:8(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比、或约7:1至约1:7(编码丁酰胆碱酯酶 (BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比、约6:1至约1:6(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比、约 5:1至约1:5(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比、约4:1至约1:4(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比、约3:1至约1:3(编码丁酰胆碱酯酶(BChE) 的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比、约2:1至约1:2(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比或约1:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。
本文中描述了核酸的总量(即与编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子组合的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的量)对脂质体的量的适当比率。在适当的实施方案中，重量比为约1:1至约1:40(μg核酸:μg 脂质体)的重量比，更适当地约1:5至约1:20(μg总核酸:μg脂质体)，或重量比为约1:10(μg总核酸:μg脂质体)。
尽管在其它实施方案中可将核酸分子与阳离子脂质体的内部或外部单层(例如，头部基团区域)结合，适当地，将核酸分子封装在阳离子脂质体的内部。
在治疗与对OP试剂的暴露相关的毒性的方法的适当的实施方案中，可在暴露于有机磷酸盐试剂后立即(即，在哺乳动物与OP试剂接触后数秒(10、20、30秒等)、数分钟(1、5、10、15、20或30或更多分钟)、数小时(即，1、2、3、4、5或更多小时)或数天(即，1,2、3,4、 5或更多天)内)施用本文中描述的复合物。一般而言，与OP试剂的此类接触将为通过试剂的吸入和/或与哺乳动物的皮肤、眼或粘膜的接触。
在预防与对OP试剂的暴露相关的毒性的方法的适当的实施方案中，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少6小时施用本文中描述的复合物。适当地，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少10小时、至少12小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时或至少48小时施用本文中描述的复合物。在另外的实施方案中，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天施用本文中描述的复合物。适当地，在对OP试剂的潜在暴露之前，至少每周一次，更适当地至少每周二次等施用复合物。在其它实施方案中，施用可以是在对OP试剂的潜在暴露之前每10-14天进行一次。
在其它实施方案中，提供了治疗哺乳动物的与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法适当地包括鼻内或通过气雾剂吸入对人施用本文中描述的阳离子脂质体复合物。适当地，阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合(但非化学缀合于其)的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。适当地，TfRscFv与阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在，核酸分子以约1:5至约1:20(μg核酸:μg脂质体) 的比率存在。在实施方案中，施用复合物以治疗与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
还提供了预防人的与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的方法。此类方法适当地包括鼻内或通过喷雾剂吸入对人施用阳离子脂质体复合物。适当地，阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合(但非化学缀合于其)的抗转铁蛋白受体单链 Fv(TfRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和包含在与阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。适当地，TfRscFv与阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在，核酸分子以约1:5至约1:20(μg核酸:μg脂质体)的比率存在。在实施方案中，施用复合物以预防与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
如本说明书中所述，适当地，将编码BChE的核酸分子包含在第一质粒构建体，所述构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE 的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。在实施方案中，将编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子包含在第一质粒构建体中，所述构建体从5'至3'包含：(a)至少一种人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
在实施方案中，BChE是BChE的突变形式，诸如G117H突变体。
本文中描述了示例性脂质、核酸对脂质体的比率以及与脂质体结合的核酸的示例性比率。
适当地，核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE) 的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，更适当地，核酸分子以约5:1至约1:5(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，最适当地，核酸分子以约4:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比，或约2摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比，或约1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
适当地，将核酸分子封装在阳离子脂质体的内部。
如本文中所述，施用适当的复合物以治疗与对高至5x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。在实施方案中，在暴露于有机磷酸盐试剂后立即施用复合物。
如本文中描述的，适当地，施用复合物以预防与对高至5x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。适当地，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少6小时施用复合物。在实施方案中，在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前每周至少一次施用复合物。
本文中还提供了将丁酰胆碱酯酶(BChE)递送至哺乳动物(例如，人)的血流的方法，其包括鼻内或通过气雾剂吸入对哺乳动物施用阳离子脂质体复合物。如本文中所述，适当地，阳离子脂质体复合物包含阳离子脂质体、与阳离子脂质体直接复合(但非化学缀合于其)的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)、包含在与阳离子脂质体结合的第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子和包含在与相同或不同的阳离子脂质体结合的第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子。
适当地，TfRscFv与阳离子脂质体以在约1:20至约1:40(w:w)的范围内的比率存在，以及核酸分子以约1:5至约1:20(μg核酸:μg脂质体)的比率存在。
在本文中描述的各种方法的实施方案中，适当地，施用复合物以导致至少250mg/70kg(BChE的重量/人的重量)的人的血流中的BChE 的量。适当地，施用复合物以导致至少200mg/70kg(BChE的重量/人的重量)，更适当地至少225mg/70kg、至少250mg/70kg、至少275mg/70kg、至少300mg/70kg、至少325mg/70kg、至少350mg/70kg 或至少400mg/70kg的人的血流中的BChE的量。
如本说明书中所述，适当地，将编码BChE的核酸分子包含在第一质粒构建体，所述构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE 的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。适当地，将编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子包含在第一质粒构建体中，所述构建体从5'至3'包含：(a)至少一种人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
或者，编码BChE的核酸分子和编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子存在于相同的构建体中，但编码BChE的核酸分子被置于美国公开专利申请号2007/0065432中公开的高表达启动子的下游，而编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被置于标准启动子诸如RSV或CMV的下游。
在实施方案中，BChE是BChE的突变形式，诸如G117H突变体。
本文中描述了脂质体的示例性组合物和各种组分的比率。适当地，核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在。
适当地，核酸分子以约10:1至约1:10(编码丁酰胆碱酯酶(BChE) 的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，更适当地，核酸分子以约5:1至约1:5(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比存在，最适当地，核酸分子以约4:1(编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子的摩尔数:编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔数)的摩尔比，或以约2摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比，或约1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的一种或多种核酸分子对约1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的一种或多种核酸分子的摩尔比存在。
适当地，本文中描述的脂质体复合物包含具有BChE基因(例如，突变型BChE)和富含聚脯氨酸的肽基因的两种共封装的质粒载体，产生在循环中具有1至21天的活性的水平的四聚体BChE(至少40％，更优选70％-90％的四聚体形式)。本文中描述的方法适当地产生获得治疗有效量的酶水平。预料之外的是，在高表达启动子的控制之下，封装编码BChE的质粒载体和编码富含聚脯氨酸的肽的质粒载体的本发明的复合物可实现活性BChE的活性水平和蛋白质表达的长度。
对于相关领域内的普通技术人员显而易见的是，可在不背离本发明的范围的情况下进行对本文中描述的方法和应用的其它适当的修饰和改造或其任意组合。在现已详细地描述本发明后，通过参考下列实施例，这将被更清楚地理解，所述实施例被包含在本文中仅为了举例说明的目的，并且无意限制本发明。
实施例1
转基因(外源p53)在来自scL递送的wtp53基因的I期临床试验中的受试者的转移瘤中的存在
本实施例证明通过scL纳米复合物(以约1:10:0.33(μg总核酸:μg 脂质:μg单链抗体)的重量比包含总核酸、脂质和单链抗体TfscFv的本发明的脂质体组合物(在本文中也称为scL))递送的编码外源wtp53 DNA的成功转基因SGT-53存在于被治疗的患者的肿瘤中。为了评估 SGT-53的肿瘤递送，在评价SGT-53在患有实体瘤和已被提供所有标准或批准的疗法的受试者中的安全性、药代动力学和潜在活性的开放标签、单中心、连续剂量递增、I期研究中，进行DNA PCR以测定通过SGT-53复合物在受试者的肿瘤中递送的外源p53基因。对受试者施用的SGT-53的剂量从0.6mg DNA/融合物上升至3.6mg DNA/融合物。对于总共10种融合物，每周2次施用研究药物，进行总共5 周。在2个受试者中，在SGT-53的最后一次施用后24至96小时内进行大多数可获得的肿瘤的活组织检查。获得至少20mg的肿瘤组织。对冷冻样品进行显微镜检查以确保所述样品含有肿瘤。将肿瘤组织快速冷冻，并用于DNA PCR以鉴定肿瘤中外源wtp53 DNA的存在和水平。在这两种情况下，从转移病灶获得肿瘤样品。使用载体中的一个引物和p53插入物中的一个引物扩增700bp片段。通过使用该方法，只有外源p53转基因被扩增。肿瘤的活组织检查获自利用最低剂量 (0.6mg/融合物)(T1)和利用3.6mg/融合物剂量(T2)的处理结束后的患者。如图1中所示，外源p53基因的扩增的700bp片段明确地存在于两种肿瘤中。更重要地，转基因以剂量依赖性方式存在，这对于靶向递送是可预期的。
实施例2
在克隆进pSCMV载体后蛋白质表达的增加
作为将基因置于如本文中公开的高表达启动子的控制下的结果的蛋白质表达的增加示于图2中。用具有克隆进pSCMV载体中或在原始构建体中的基因的scL(如下文中的实施例7中所述制备的)转染人细胞。转染后24小时，通过Western分析评估特定基因的表达。将纯化的从该特定基因表达的蛋白质包含在凝胶上作为正对照并用于验证蛋白质定位。相较于使用标准启动子的原始构建体(X457)的特定蛋白质表达，对于pSCMV克隆(X455)观察到高达至少10倍的所述蛋白质表达(图2)。在更长的暴露后，特定条带存在于X457中(数据未显示)。 GAPDH水平显示相等的蛋白质上样。UT＝未处理细胞；+Con＝确认位置的纯化的蛋白质。
实施例3
scL脂质体复合物穿过血脑屏障和靶向神经元细胞的能力
在脑中穿过血脑屏障和靶向神经元细胞的能力示于图3和4中。在图3中，用如下文中实施例7中所述制备的具有含有GFP基因的 pSCMV高表达质粒(图3A)或具有荧光标记的寡核苷酸 (6-FAM-ODN)(图3B)的scL注射Balb/C小鼠。24或48小时后，切取脑，并使用体内成像系统(Perkin Elmer)进行成像。在这两种情况下，当与用游离的(未封装的)GFP DNA或游离的(未封装的)6-FAM-ODN的积累/信号的水平相比较时，在用scL-递送的有效负载注射的小鼠的脑中观察到显著更高水平的荧光信号的积累。
通过颈内静脉置管在大鼠中注射如下文中实施例7中所述制备的靶向TfR并且具有编码如编码GFP的质粒(100μg cDNA)的配体-脂质体复合物。在24-36小时的手术恢复后，处死动物，并通过荧光显微镜检查分析冠状的(coronal)40μm脑切片。如所预期的，非靶向脂质体-GFP在脑中未产生可检测的EGFP(+)细胞(图4B)。相反， Tf-Lip-DNA注射在皮层和海马中产生广泛的EGFP表达(主要在神经元细胞中)，这表明TfR-靶向载体穿过血脑屏障，将遗传有效负载体内递送至成熟神经元。在Tf-Lip-EGFP cDNA的iv注射后，在海马 (CA1区域)(A1)和皮层(A2)观察到许多EGFP(+)神经元(箭头)和神经毡(箭头)。
实施例4
在鼻内施用后通过scL递送产生的增强的荧光素酶表达和组织摄取
将荧光素酶基因(如下文中实施例7中所述制备的游离的(未封装的)或scL-封装的质粒DNA)鼻内施用至Balb/c小鼠。鼻内施用后24 小时，用萤光素腹膜内注射小鼠，并用(Xenogen)体内成像系统 (Perkin Elmer)进行成像。基因表达水平的差异示于图5中。
在这些小鼠实验中，评估了鼻内施用后scL递送的报告基因摄取的时间顺序(timing)和水平。向具有免疫能力的小鼠鼻内施用使用上文中公开的比率制备的封装FITC标记的分子的scL纳米复合物 (100μg)。在施用后6-48小时的时间点上，将小鼠人道地无痛致死。切取肝、肺和脑组织，将其经历流式细胞术以测定每一个时间点上的每一个器官中的FITC阳性细胞的数目。对于所有3种器官，发现FITC 阳性细胞的百分比在16至30小时之间达到峰值。在峰值时间转染的每一个组织中的细胞的百分比发生变化。果不其然，在肺(～20-40％) 中发现最大的FITC阳性细胞的百分比，而在脑中发现3-4％的阳性细胞，并且～1.5％的肝细胞具有scL递送的分子。然而，应当指出，由于肝是大器官，因此基于Marino(20)，1.5％的肝细胞为～2.25x 107个细胞，是个相对大的数目。类似地，肺中20-40％的阳性细胞代表～5.7 x 107个细胞，而脑中3-4％的阳性细胞等于～4.4x 106个细胞。
实施例5
卡巴胆碱对ERKI/II表达的体外诱导
卡巴胆碱是结合并激活乙酰胆碱受体的药物(激动剂)。利用卡巴胆碱的处理模拟OP试剂的作用。已显示卡巴胆碱在脑中诱导ERKI/II 的表达(21)。利用卡巴胆碱对肺癌细胞的该处理诱导ERKI/II的表达，并且利用阿托品(一种毒蕈碱型乙酰胆碱受体的竞争性抑制剂(拮抗剂)) 的该预处理可抑制该诱导(图6)。人A549细胞用作测试这些反应的模型。用100μM(终浓度)卡巴胆碱处理利用或不利用100uM阿托品(终浓度)预处理30分钟的A549。30分钟后，收获细胞，分离蛋白质，并使用既检测ERKI又检测ERKII蛋白的抗体通过Western分析60μg 总细胞蛋白质。泳道1＝显示低基线水平的蛋白质的未处理(未诱导的) 细胞；泳道3＝在卡巴胆碱处理后诱导的表达；泳道2＝在用阿托品预处理，接着利用卡巴胆碱处理后ERKI/II诱导的缺乏。因此，该卡巴胆碱诱导的ERKI/II的表达的抑制可用作下游分子替代物来评估 scL-mtBChE/scL-ppol处理的体外和体内效力。
实施例6
克隆进高表达载体pSCMV
已制备了质粒载体，所述载体在美国公开专利申请号 2007/0065432中公开的高表达启动子的下游含有wt人 BChE(huBChE)、人BChE的G117H突变形式(mtBChE)(参见，例如， McTiernan，等人，“Brain cDNA clone for human cholinesterase,”Proc.Natl.Acad.Sci.84:6682-6686(其公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文)，图2)或富含聚脯氨酸的肽(ppro)(参见Altamirano和 Lockridge,Chemico-BiologicalInteractions 119-120:53-60(1999)(参见第57页，第2.9节)；Krejci等人，The Journalof Biological Chemistry 272:22840-22847(1997)(参见第22842页，图1)；和Bon等人，The Journal of Biological Chemistry 272:3016-3021(1997)(参见桥页第 3016-3017页)，其公开内容通过引用以其整体并入本文)。所述质粒载体(pSCMV)导致为利用标准构建体的2-10倍的目标基因的表达水平。该高表达质粒pSCMV衍生自pBR322质粒主链并且还含有多克隆位点和赋予对抗生素卡那霉素的抗性的基因。该质粒已在cGMP条件下被制备来具有两个不同的肿瘤抑制基因以用于人临床试验。因此，所述构建可被FDA接受用于人。通过使用标准操作和本领域普通技术人员公知的限制性位点，将1.8Kb BChE和来自原始载体的～300Bp ppro 插入物(11)亚克隆进pSCMV中的多克隆位点(图7)。在商购可得的细菌宿主TOP 10F1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中扩增所得的质粒。随后使用本领域中公知的标准方法制备质粒DNA。测试所得的质粒。分析显示>1.9的260:280比率，>75％的超螺旋分子存在于群体中(图8)和检测不到的外毒素水平。
实施例7
实施例6中产生的克隆的体外表征
针对BChE活性的水平、T1/2表征具有huBChE、mtBChE或ppro 基因的pSCMV质粒，并且针对活性和四聚化测定BChE对ppro的最佳比率。对于下文中描述的研究，使用商购可得的(来自ATCC)细胞系、CHO(中国仓鼠卵巢)、人肺癌A549或人前列腺癌DU145细胞。出于连续性目的，使用具有基线水平的BChE活性的CHO，因为这些细胞先前已被其他研究者(包括Lockridge及同事)在BChE活性的研究中使用(11)。
评估BChE表达的水平
将pSCMV-wtBChE或pSCMV-mtBChE载体与pSCMV-ppro 载体一起封装在scL纳米复合物中以形成scL-wtBChE/ppro和 scL-mtBChE/ppro复合物。将载体以4:1的摩尔比(pSCMV-mtBChE 对pSCMV-ppro)的插入物混合以用于封装。TfRscFv配体、脂质体和总质粒DNA的比率为0.33ug对10ug对1ug(TfRscFv对脂质体对 DNA)。通过以确定的比率简单地混合组分来形成复合物(32)。
示例性脂质体组分
LipA DOTAP/DOPE 1:1的摩尔比
LipB DDAB/DOPE 1:1的摩尔比
LipC DDAB/DOPE 1:2的摩尔比
LipD DOTAP/Chol 1:1的摩尔比
LipE DDAB/Chol 1:1的摩尔比
LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1的摩尔比
LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1:1的摩尔比
(DOTAP＝二油酰三甲基磷酸铵，DDAB＝双十八烷基二甲基溴化铵；DOPE＝二油酰磷脂酰乙醇铵；chol＝胆固醇)。
通过从由Campbell,MJ(Biotechniques 1995Jun.18(6):1027-32) 描述的方法改进的乙醇注射法来制备脂质体。简而言之，将所有脂质溶解在乙醇中，并且混合，利用汉密尔顿注射器注射进50-60℃的涡旋纯水中。将溶液再涡旋10-15分钟。终浓度为1-8mM的总脂质。
通过将TfRscFv与脂质体组合物A(或上文中给出的任何脂质体组合物)以确定的混合复合物中的单链蛋白对脂质体和DNA的比率混合来制备TfRscFv-免疫脂质体复合物(其它配体也可如本文中所述进行使用)。
将适当量的2mM至8mM脂质体(上述A-H)与提供所需体积所需的任何水(例如，DI水)混合，并轻轻翻转10次以进行混合，或对于更大的体积，以20-30RPM旋转1-2分钟。向脂质体-水混合物中添加适当量的TfRscFv、抗体或抗体片段以产生所需比率，并且通过轻轻翻转约5-10秒或对于更大体积以20-30RPM旋转1-2分钟进行混合。将该混合物在室温保持10-20分钟(在约5分钟后再次轻轻翻转5-10秒)。同时，将适当量的包含pSCMV-wtBChE载体或pSCMV-mtBChE载体和pSCMV-ppro载体构建体(以10:1至1:10，更优选地5:1至1:5，最优选地4:1、2:1或1:1的BChE对ppro插入物的摩尔比)的DNA 与产生所需体积所需的任何水通过翻转5-10秒混合，或对于更大的体积以20-30RPM旋转1-2分钟。通常，对于体内使用，期望提供每次施用(包括IN、口服、气雾剂、IV、IP、IM等)约5μg至约100mg 的DNA。
将DNA溶液快速添加至TfRscFv(或抗体或抗体片段)-脂质体溶液，将混合物翻转5-10秒或对于更大的体积以20-30RPM旋转1-2 分钟。将最终混合物在室温保持10-20分钟，在约5分钟后再次轻轻翻转5-10秒。对于体内使用，将50％的葡萄糖或50％的蔗糖添加至5-20％(V:V)的终浓度，并通过轻轻翻转5-10秒混合，或对于更大的体积以20-30RPM旋转1-2分钟。0.33μg对10μg对1μg的TfRscFv 对脂质体对DNA的适当比率(w:w)的具体实例如下。对于800μl的终体积的40μg的总DNA，将183μl水与280μl的2mM脂质体溶液混合。添加34μl的TfRscFv(具有0.4μg/ml的浓度)。将183μl水与40μl 的1μg/1μl DNA混合。添加80μl的50％的葡萄糖或160ul的50％的蔗糖作为最后步骤。
当将{K[K(H)KKK]5-K(H)KKC}肽(HoKC)包含在复合物中时，使用上述乙醇注射法制备阳离子脂质体制剂A(1:1摩尔比的 DOTAP:DOPE)、B(1:1的DDAB:DOPE)、G(1:1:1的DOTAP:DOPE: 胆固醇)和H(1:1:1的DDAB:DOPE:胆固醇)(或上文中给出的任何脂质体制剂)。每一种脂质体制剂还以5摩尔百分比的总脂质包含 MPB-DOPE。由于HoKC肽具有末端半胱氨酸，因此，将MPB-DOPE 包含在所有脂质体组合物中以使得肽能够缀合于脂质体。使用如下具有马来酰亚胺基团的阳离子脂质体(Lip-MPB)与肽之间的偶联反应来制备Lip-HoKC脂质体。将0.1mmol的在半胱氨酸上具有游离硫醇基的肽的等分添加至2mmol的10mMHEPES、pH 7.4的Lip-MPB 溶液中，并在室温旋转(20-30r.p.m.)2小时。所得的Lip-HoKC具有 1.4mM的脂质浓度。
当脂质体包含HoKC时，以与用于产生不具有HoKC的 TfRscFv-Lip-DNA复合物的形式相同的形式形成完全复合物。此处也将TfRscFv或任何抗体或抗体片段(包括Fab’或Mab)与Lip-HoKC(通过轻轻翻转10次或对于更大的体积以20-30RPM旋转1-2分钟)以特定比率混合，并在室温温育10-20分钟。随后将DNA添加至 TfRscFv(或抗体或抗体片段)-Lip-HoKC溶液，通过轻轻翻转10次混合或对于更大的体积以20-30RPM旋转1-2分钟，并且再次在室温温育10-20分钟，随后将葡萄糖或蔗糖添加至5-20％的终浓度，通过轻轻翻转10次混合，或对于更大的体积，以20-30RPM旋转1分钟，并在室温下温育10-20分钟。复合物中的TfRscFv:LipA-HoKC:DNA 的比率为0.3mg:7nmol:1mg。
将利用Malvern Zetasizer NanoZS的动态激光光散射(DLS)用于测量scL纳米复合物的尺寸。复合物的尺寸适当地小于400nm。该仪器还具有测量ζ-电位(纳米复合物的总电荷的决定子)的能力。对于这些复合物，电荷适当地是正的，在约20至50mV之间。需要时，可容易地通过改变组分的比率以控制scL-wtBChE/ppro或 scL-mtBChE/ppro的尺寸、电荷和/或活性。
如上所述制备的纳米复合物尺寸示于表2中
表 2
ζ电位在20-40的范围内。
将CHO细胞、DU145或A549细胞以～2x105个细胞/6孔板的孔或以2x104个细胞/24孔板的孔进行铺板。用于这些初步实验的转染的总DNA剂量为0.1至2μg/孔。该剂量基于先前的转染经验，所述经验显示当转染该数目的细胞时，该剂量通常是最合适的。24小时后，用使用上述方法制备的scL-wtBChE/ppro或scL-mtBChE/ppro复合物转染细胞。还用封装具有未修饰的CMV或RSV启动子的原始载体构建体的scL转染CHO细胞来作为对照。也在所有实验中包括未转染的细胞。基于先前关于pSCMV质粒的经验，在24小时内存在显著的蛋白质表达。因此，在转染后～24小时，通过在4-30％梯度凝胶上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和通过Karnovsky和Roots的方法(23, 33)利用2mM丁酰硫胆碱染色来评估每一个样品(细胞和上清液中)中的BChE四聚体、二聚体和单体的相对量。将纯化的血浆huBChE包括来作为对照。转染后检测到的BChE的至少2倍的增加被认为是阳性结果。
此类实验的结果的实例示于图9-11中。将CHO细胞或A549细胞以～2x104个细胞/24孔板的孔进行铺板。scL纳米复合物被制备来封装编码突变型BChE的质粒+编码ppro基因的第二质粒。在这些质粒中，基因处于标准巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下或处于本申请中描述的高表达载体(pSCMV)的控制下。
在利用CHO-K1细胞的实验中，使用上述方法制备复合物。每一个scL纳米复合物中的总DNA为1ug/孔(于30ul中)。对于封装具有在pSCMV启动子的控制下的mtBChE基因的载体和具有在pSCMV 启动子的控制下的ppro基因的载体的scL纳米复合物，将22.4μl的2 mM脂质体溶液添加至63.5ul水中。将脂质体-水与5.08μl的 TfRscFv(具有0.34μg/ml的浓度)混合。向阳离子脂质体-TfRscFv混合物中添加3.2μg的总DNA(特定的BChE+ppro载体)，终体积为5.02 μl。在最终的scL纳米复合物中，将3、9或18ul(分别代表0.1、0.3 和0.6ug总DNA)的scL纳米复合物添加至细胞。
在这些实验中，BChE质粒DNA对ppro质粒DNA的摩尔比为 4:1。外源BChE的表达通过在4-30％梯度凝胶上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和通过Karnovsky和Roots的方法(23,33)利用2mM丁酰硫胆碱染色来进行评估。如图9中所示，对于利用scL-mtBChE/ppro 纳米复合物转染的CHO-K1细胞，存在明显的BChE的表达的DNA 剂量依赖性增加。出乎意料地，将近100％的BChE以活性四聚体形式存在。
利用使用上述方法制备的scL-CMV mtBChE/ppro或 scL-pSCMV mtBChE/ppro转染A549细胞。对于封装具有在CMV启动子的控制下的mtBChE基因的载体和具有在CMV启动子的控制下的ppro基因的载体的scL纳米复合物，或封装具有在pSCMV启动子的控制下的mtBChE基因的载体和具有在pSCMV启动子的控制下的 ppro基因的载体的scL纳米复合物，将14μl的2mM脂质体溶液添加至32.83ul水中。将脂质体-水与3.17μl的TfRscFv(具有0.21μg/ml的浓度)混合。以10.19(CMV启动子)或31.39μl(pSCMV启动子)的终体积，向阳离子脂质体-TfRscFv混合物中添加3.2μg的总DNA(特定的BChE+ppro载体)。添加足够的无血清培养基以使终体积多至 100ul。在最终的scL纳米复合物中，将25ul(代表0.5ug总DNA)的 scL纳米复合物添加至细胞。在这些实验中，BChE质粒DNA对ppro 质粒DNA的摩尔比为4:1。
通过在4-30％梯度凝胶上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和通过 Karnovsky和Roots的方法(23,33)利用2mM丁酰硫胆碱染色来在两个时间点评估每一个scL复合的质粒的BChE表达的水平。如图10(转染后16天)和图11(转染后28天)中显示的，在两个时间点上，在利用具有在高表达pSCMV启动子的控制下的BChE和ppro的scL转染的细胞中相较于利用在标准CMV启动子控制下的质粒转染的那些细胞存在显著更高水平的BChE表达。出乎预料地，该表达的增加随时间的推移(第28天)甚至更大。
评估BChE活性的水平
利用scL-wtBChE/ppro或scL-mtBChE/ppro、利用在高表达 pSCMV启动子或标准CMV启动子的控制下的质粒和利用上述对照进行CHO DU145和A549细胞的转染。转染后24小时，通过Ellman 测定(34,35)来测定细胞和上清液中BChE活性的水平。利用1mM的 0.1M磷酸钾中的丁酰硫胆碱、0.5mM二硫代双硝基苯甲酸在25℃测定BChE活性，在412nm监测吸光度。使用13,600M-1cm-1的摩尔消光系数计算功能活性。这些实验被设计来确认mt相对wtBChE克隆(当在pSCMV载体中时)的增强的活性，与先前报导的针对原始未修饰的载体的发现类似(10,11)。对于pSCMV-mtBChE克隆相较于 pSCMV-wt BChE克隆的BChE活性的至少2倍增加是期望的。
DU145细胞中的此类实施的实例示于下文中。在DU145细胞中进行scL纳米复合物中的编码mtBChE的pSCMV质粒DNA对编码 ppro的pSCMV质粒DNA的不同摩尔比。在这些实验中，使用2:1(表 3)和4:1(表4)的摩尔比。每24孔板的孔接种2.5x 104个DU145细胞， 24小时后将其进行转染。使用上文中实施例7中描述的方法，利用 0.33ug TfRscFv对10ug脂质体对1ug总DNA的相同比率制备scL 纳米复合物。对于每一种scL纳米复合物，使用5.3μl的终体积(根据需要利用另外的1X Tris:EDTA缓冲液产生5.3ul)中的2μg的总 DNA(适当比率的pSCMV-BChE和pSCMV-ppro)。向3.17μl的 TfRscFv(具有0.34μg/ml的浓度)添加4.7ul水和14μl的2mM脂质体。向该TfRscFv-脂质体混合物中添加5.3ul上述DNA。添加3ul的无血清培养基，通过轻轻翻转混合所得溶液，随后添加至细胞。每一个scL 纳米复合物中的总DNA为0.5ug/孔(于25ul中)。通过Ellman测定评估的BChE活性的水平示于下文中的表3和4中。
表3利用0.5ug DNA(mtBChE:ppro比率＝2:1)对DU145细胞的转染：
表4利用0.5ug DNA(mtBChE:ppro比率＝4:1)对DU145细胞的转染:
在两种比率上，相较于当将基因处于标准CMV启动子的控制下时，当将所述基因克隆进高表达启动子时，在转染后BChE活性的水平更高，从而显示该方法与目前被本领域其它研究人员使用的方法之间的差异。
在确认mtBChE克隆具有比wt高的活性后，在另外的实验中只使用mtBChE克隆。在确认被克隆进构建体的在高表达启动子的控制下的基因具有比当在标准CMV启动子的控制下时更高的活性，在另外的实验中只使用这些克隆。
确定最佳摩尔比
改变用于CHO和/或A549细胞的转染的scL复合物中的 pSCMV-mtBChE插入物对pSCMV-ppro插入物的摩尔比以确定导致最高量的四聚体和活性的比率。摩尔比(pSCMV-mtBChE对 pSCMV-ppro)为4:1；1:1和1:4。转染后24小时，收获细胞和上清液，通过Ellman测定来测定活性。四聚体、二聚体和单体的相对量通过如上所述的非变性凝胶电泳来评估。期望scL-mtBChE/ppro插入物产生至少40％、更适当地70％-90％的四聚体形式。比率的改变可用于获得所需水平的四聚体。
在DU145细胞中进行使用不同的scL纳米复合物中的编码 mtBChE的pSCMV质粒DNA对编码ppro的pSCMV质粒DNA的摩尔比的实验。在这些实验中，使用2:1、1:1或1:2(BChE:ppro)的摩尔比(表5)。每24孔板的孔接种2.5x 104个DU145细胞，24小时后转染所述细胞。使用如上文中实施例7中描述的方法，使用0.33ug TfRscFv对10ug脂质体对1ug总DNA的相同的比率制备scL纳米复合物。向1μl的TfRscFv(具有0.34μg/ml的浓度)中添加10ul水。向该溶液中添加7μl的2mM脂质体溶液。对于每一个scL纳米复合物，将5μl的终体积中的1μg的总DNA(适当比率的pSCMV-BChE与 pSCMV-ppro)与15ul的水混合，随后添加至TfRscFv-脂质体溶液。随后添加62ul的无血清培养基，通过轻轻翻转混合所得溶液，随后添加至细胞。每一个scL纳米复合物中的总DNA为0.3ug/孔(于30ul 中)。
表5以scL纳米复合物中的pSCMV-BChE对pSCMV-ppro的不同的比率进行的DU145细胞的转染：
测定表达/活性的峰值和持续时间
基于针对pSCMV质粒的先前经验，显著的蛋白质表达始于转染后～24小时并且持续达4-5天。因此，为了测定峰值BChE表达和活性的时间，用以所需摩尔比制备的scL-mtBChE/ppro转染CHO和/ 或A549细胞。从第0天(处理前)至转染后14天每天收获细胞和上清液，通过Ellman测定来测定BChE活性的水平。BChE的四聚体形式的相对量的显著增加和与正常hBChE相似的活性曲线和T1/2是期望的。来自1至14天之间或甚至更长时间的mtBChE活性是期望的。在上文中的实施例7中描述的实验的结果(图10和11和表3-5)显示使用本申请的scL纳米复合物导致的随时间推移BChE的四聚体形式的表达和BChE的活性的增加。
实施例8
体外评分效力
卡巴胆碱是结合并激活乙酰胆碱受体的药物(激动剂)。因此，利用卡巴胆碱的处理模拟OP试剂的作用。由于化学战剂的使用受到严格限制，因此卡巴胆碱可用作神经毒剂模型化合物。卡巴胆碱在人肺癌A549细胞中诱导ERKI/II表达，并且该诱导被利用毒蕈碱型受体拮抗剂阿托品的预处理逆转(图6)。在本实施例中，使用ERKI/II的表达作为替代终点研究转染的scL-mtBChE/ppro体外抵抗OP的能力。
以所需比率利用scL-mtBChE/ppro转染A549细胞。在峰值表达 /活性时间，用100μM卡巴胆碱处理细胞。30分钟后，收获细胞并通过Western分析测定ERKI/II表达水平。未处理细胞和仅用卡巴胆碱处理的那些细胞或仅scL-mtBChE/ppro用作对照。收获细胞，如先前所述分离蛋白质(13)。通过SDS PAGE电泳分离40μg的总蛋白质，将其转移至尼龙膜，用既检测ERKI又检测ERKII蛋白的抗体进行探测，并使用ECL Western印迹检测系统(GELifesciences)检测信号。
利用scL-mtBChE/ppro的预防性治疗适当地抑制卡巴胆碱诱导的ERKI/II的表达。测试各种剂量的scL纳米复合物以获得为至少 50％、更优选地70％、最优选地90％或更大的最大抑制。如果未观察到至少50％的抑制，则适当地增加(不改变比率)scL的剂量直至达到至少50％的抑制。此外，在卡巴胆碱处理时，将一部分细胞和上清液用于通过Ellman测定来测定BChE活性水平，以使活性与ERKI/II 的下调相关联。
实施例9
建立小鼠中的基线BChE水平
作为人BChE缺乏的模型的转基因纯合BChE敲除小鼠(BChE-/-) 已被开发(29)并且可从Jackson Laboratories商购获得。这些小鼠存在 C57BL/6背景(BChE+/+)。因此，通过使用本领域中公知的公开的操作(29)，通过在BChE-/-敲除小鼠和C57BL/6小鼠中进行Ellman测定来测定血浆、肺、脑和肝组织中的BChE活性的基线水平。BChE敲除小鼠(BChE-/-)中血浆、肺、脑和肝中的BChE的基线活性适当地分别在0+0.005、0.01+0.02、0.02+0.02和0.09+0.05U/ml(血浆和U/mg(组织))的范围内。C57BL/6小鼠(BChE+/+)的血浆、肺、脑和肝中的BChE 的基线活性适当地分别在1.5+0.3、0.38+0.2、0.2+0.1和3.0+0.5 U/ml(血浆和U/mg(组织))的范围内。
正常的未处理C57BL/6小鼠(BChE+/+)的血浆中的BChE活性的水平使用文献中已知的建立的操作方案(34,35)通过如上所述的 Ellman测定来评估。测试两个单独的小鼠。发现BChE的本底水平为 0.014+0.0009U/ml(平均值+标准误差)。
实施例10
建立小鼠对卡巴胆碱的基线反应
将C57BL/6小鼠用于确定导致ERKI/II表达为基线水平至少2倍的升高的卡巴胆碱的剂量。将0.15、0.55或1.5umol/Kg的剂量的卡巴胆碱(36)i.p.施用至9-12周龄雌性C57BL/6小时中，5只小鼠/剂量。施用后30分钟，人道地无痛致死小鼠，取出肺、脑和肝，分离蛋白质，和如本文中所述测定ERKI/II表达水平。产生ERKI/II表达的至少2 倍的增加并且不导致明显的对小鼠的毒性的卡巴胆碱的剂量(0.15至 1.5umol/Kg，更优选地0.55umol/Kg)是期望的。
实施例11
纯合阴性BChE敲除小鼠(BChE-/-)的体内研究
由于纯合阴性敲除小鼠实际上没有BChE活性，因此它们是其中确认scL复合物中pSCMV-mtBChE对pSCMV-ppro的最佳摩尔比、待施用的剂量以及用于体内使用的IN施用的复合物的所得的持续时间和峰值表达的良好模型。
通过Ellman法针对BChE活性评估体外测定的接近并包括 pSCMV-mtBChE对pSCMV-ppro的最佳摩尔比的总共3个比率。通过9-12周龄雌性BChE-/-小鼠(15只小鼠/组)的IN接种施用以不同比率制备的scL复合物。未处理小鼠用作对照。由于人血浆BChE的T1/2为11-14天，因此从第0天(处理前)至第14天每隔一天从每一个组无痛致死2只小鼠，通过Ellman测定评估每一个时间点上血浆中的 BChE活性水平以测定活性的时间过程和峰值。此外，通过如本文中所述的非变性凝胶电泳评估血浆中的四聚体、二聚体和单体的相对量来使之与活性相关联。产生最长持续和最高BChE活性的10:1至 1:10(pSCMV-mtBChE的插入物对pSCMV-ppro的摩尔比)，更优选地5:1至1:5，最优选4:1的比率用于发现最佳体内DNA剂量。表达的最佳时间在第4天与第11天之间。
通过使用最佳比率，改变通过scL纳米复合物IN施用的DNA剂量。最初，测试3个剂量：100、75和50ug的总DNA。通过9-12周龄雌性BChE-/-小鼠(15只小鼠/剂量)的IN接种以指定的DNA剂量施用如本文中所述制备的scL-mtBChE/ppro复合物。未处理小鼠用作对照。以50至400μL的总体积施用scL-mtBChE/ppro纳米复合物。将未麻醉的小鼠保持平躺在手掌心中。使小鼠的头以大约30度角向下倾斜，缓慢地将10uL的纳米复合物滴入动物的鼻孔。让动物休息30至 60分钟的时间，随后在另一鼻孔中施用另外的10μL。进行该过程直至整个溶液被施用。对于100uL以上的体积，在每一个100μL之后，交替接受溶液的动物，以允许施用之间有更多的时间以对小鼠产生更少的应激。在如上确定的峰值表达时间，将动物人道地无痛致死，并通过Ellman测定来测定对于每一个DNA剂量的血浆中的BChE活性的水平。此外，对于每一个DNBA剂量的血浆中的四聚体，二聚体和单体的相对量通过如本文中所述的非变性凝胶电泳来评估。最佳DNA 剂量在血浆中提供至少500U/ml的BChE活性，并导致至少40％，更优选为70％-90％的四聚体形式。
实施例12
评估BChE+/+小鼠中的外源mtBChe的活性
当小鼠的该品系是BChE+/+时，该模型与人群体更加类似。通过如本文中描述的9-12周龄雌性C57BL/6小鼠(20只小鼠/组)的IN接种施用最佳剂量/比率的scL-mtBChE/ppro复合物中的DNA。未处理小鼠用作对照。在峰值表达时间，人道地无痛致死动物，并通过Ellman 测定来测定血浆中的BChE活性水平。此外，通过如本文中所述的非变性凝胶电泳评估血浆中的四聚体、二聚体和单体的相对量。为内源基线水平至少2倍的BChE活性水平是期望的。
实施例13
体内效力研究
在这些研究中，使用4组正常C57BL/6小鼠：组1＝未处理对照；组2＝单独的卡巴胆碱处理；组3＝仅用scL-mtBChE/ppro纳米复合物的IN处理；组4＝利用scL-mtBChE/ppro纳米复合物的IN处理，随后卡巴胆碱处理。对9-12周龄雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)IN施用(如本文中描述的)具有最佳pSCMV-mtBChE对pSCMV-ppro载体的比率的scL复合物中的最佳DNA剂量(如本文中所述制备的)。在 BChE峰值表达时间，组2和4中的动物接受(i.p.)最佳剂量的卡巴胆碱(0.15至1.5μmol/Kg，更优选地0.55μmol/Kg)。在卡巴胆碱施用后 30分钟，人道地无痛致死小鼠，并通过Ellman测定评估血浆中的 BChE活性水平。还通过Western分析检查肺、脑和肝组织中的 ERKI/II表达以使活性与ERKI/II的下调相关联。测量小鼠的体重以寻找来自scL-mtBChE/ppro复合物的毒性的体征。已显示卡巴胆碱(一种毒蕈碱型激动剂)刺激毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)并激活 ERKI/II，已显示所述ERKI/II用作各种细胞外信号包括mAChR激活的汇合点。利用scL复合物的预防性治疗适当地导致卡巴胆碱诱发的ERKI/II的表达的抑制。ERKI/II的至少50％的抑制是期望的。适当地改变(比率不变)scL复合物中的DNA剂量直至达到所需抑制。或者，在用卡巴胆碱处理之前，可提供每三天一次达到总共3次施用的多次施用。
实施例14
scL-mtBChE/ppro作为抗OP试剂在小鼠中的预防性用途
通过用递增剂量的二乙氧磷酰硫胆碱(Wyeth-Ayerst)攻击来测定小鼠中通过IN施用的scL-mtBChE/ppro纳米复合物提供的保持作用的程度和持续时间，所述二乙氧磷酰硫胆碱是化学战神经毒剂-刺激性化合物。使用野生型菌株C57BL/6小鼠(BChE+/+)小鼠进行利用二乙氧磷酰硫胆碱的攻击实验。如本文中所述，以50-100μg总 pSCMV-mtBChE/pSCMV-ppro DNA(以插入物(10:1至1:10[mtBChE 对ppro]、更优选5:1至1:5、最优选4:1的优选摩尔比))的剂量IN施用scL-mtBChE/ppro。一组小鼠不接受scL-mtBChE/ppro纳米复合物。在IN施用前和在scL-mtBChE/ppro施用后第11天至第21天以指定间隔从所有小鼠收集血浆以用于BChE活性的测定。在IN施用后峰值活性当天(第4至11天)，记录基线温度、体重和观察情况。用 2x LD50的二乙氧磷酰硫胆碱(200ug/kg)皮下攻击小鼠。在二乙氧磷酰硫胆碱攻击后连续观察小鼠1小时。在整个毒性剂攻击过程中周期性观察到胆碱能毒性的轴向体温和体征(施特劳布举尾、弓背的姿势和颤栗)。对垂死的小鼠立即进行无痛致死。在第一攻击后3小时，再用另外2x或3x LD50攻击经历第一2x LD50攻击存活的动物。按照相同的操作在数小时后用另外的LD50剂量注射经历组合的4x或5x LD50剂量的二乙氧磷酰硫胆碱存活的动物。
预期对照小鼠在第一2x LD50剂量的二乙氧磷酰硫胆碱后数分钟内死亡，而预期接受scL-mtBChE/ppro的动物在经历至少2x LD50的累积剂量的二乙氧磷酰硫胆碱后存活。预期在利用二乙氧磷酰硫胆碱进行第一攻击时在血浆中表达最高水平的mtBChE的小鼠在经历最高水平二乙氧磷酰硫胆碱攻击后存活。预期存在耐受的LD50剂量与攻击时血浆BChE水平之间的相关性。
实施例15
在人暴露于OP神经毒剂之前和之后scL-mtBChE/ppro用于预防/治疗的用途
在纳米复合物的制备过程中以10:1至1:10，更优选5:1至1:5，最优选4:1的插入物的摩尔比(BChE对ppro)混合两种pSCMV质粒 DNA。当HoKC不是复合物的组分时，利用5-20％葡萄糖或蔗糖作为赋形剂，适当地以0.33ug:10ug:1ug(TfRscFv:Lip:DNA)的比率制备纳米复合物；当复合物包含HoKC时利用5-20％葡萄糖或蔗糖以0.3 mg:7nmol:1mg(TfRscFv:Lip-HoKC:DNA)的比率制备纳米复合物。复合物中DNA的总量为0.01至10mg/kg/施用。
通过这些方法制备的终复合物的尺寸适当地为约50至500(nm)，具有正ζ电位(10至50mV)，如通过使用Malvern NANO-ZS通过动态光散射测定的。该尺寸小至足以有效地穿过肺上皮并进入循环和穿过血脑屏障碍。
如上制备的复合物被适当地用作预防剂或治疗剂。对于预防，将如上制备的配体靶向阳离子脂质体纳米复合物通过许多途径(优选地吸入、鼻内、口服、舌下等)施用至人中。还可通过其它途径诸如IM、 IV、IP、ID等施用如上制备的配体靶向阳离子脂质体。
对于预防，可在对神经毒剂暴露之前至少6小时，并且适当地在大致24至48小时由自已施用纳米复合物至少一次，以产生有效量的 BChE神经毒剂中和酶，从而免受至少1xLD50和多至5x LD50的神经毒剂(包括杀虫剂)的攻击。还可在对毒性神经毒剂(包括杀虫剂)的任何潜在暴露之前由自已定期(每周一次或两次)施用所述纳米复合物至少3个月。自已施用的优选方法是通过吸入、鼻内、口服、舌下等，但也可使用自已施用的其它方法诸如IM、IV、IP、ID等。
对于治疗性用途，可在对神经毒剂(包括杀虫剂)暴露后任何时间，暴露后立即施用scL-BChE/ppro纳米复合物，由自己施用或由另一个个体施用。可将纳米复合物与其它治疗剂结合施用，并且只要医疗上所必需，可重复施用(频繁如每24小时一次)所述纳米复合物。
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本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其引用程度就如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被明确且个别地通过引用并入一样。

Claims (69)

1.阳离子脂质体复合物在制备用于治疗或预防哺乳动物中与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的药物中的用途，其中所述阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体；
(b)直接与所述阳离子脂质体复合但非化学缀合于其的配体；
(c)编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子，其被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合；和
(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子，其被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合。
2.权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗与对所述有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
3.权利要求1的用途，其中所述药物用于预防与对所述有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
4.权利要求1的用途，其中通过选自下列的途径施用所述复合物：鼻内施用、静脉内施用、口服施用、舌下施用、肌内施用、病灶内施用、皮内施用、透皮施用、眼内施用、腹膜内施用、气雾剂施用、器官内施用、脑内施用、局部施用、皮下施用、内窥镜施用、缓释植入物、通过渗透或机械泵的施用和通过吸入的施用。
5.权利要求4的用途，其中所述复合物通过鼻内施用或气雾剂吸入施用来进行施用。
6.权利要求1的用途，其中所述配体选自转铁蛋白、抗体和抗体片段。
7.权利要求1的用途，其中所述配体是单链Fv抗体片段。
8.权利要求7的用途，其中所述单链Fv抗体片段是抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)。
9.权利要求1的用途，其中所述配体靶向阳离子脂质体还包含与所述阳离子脂质体结合的含有K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQ ID NO:1)肽的肽。
10.权利要求1的用途，其中所述编码BChE的核酸分子被包含在第一质粒中并且所述编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含在第二质粒中。
11.权利要求10的用途，其中所述编码BChE的核酸分子被包含在第一质粒构建体中，所述第一质粒构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
12.权利要求10的用途，其中所述编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含在第一质粒构建体中，所述第一质粒构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
13.权利要求1的用途，其中所述BChE是BChE的突变形式。
14.权利要求13的用途，其中所述BChE的突变形式为G117H突变体。
15.权利要求1的用途，其中所述阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
16.权利要求1的用途，其中所述配体和阳离子脂质体以1:1至1:100的重量比存在。
17.权利要求16的用途，其中所述配体和阳离子脂质体以1:10至1:50的重量比存在。
18.权利要求17的用途，其中所述配体和阳离子脂质体以1:20至1:40的重量比存在。
19.权利要求1的用途，其中所述阳离子脂质体包含二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；二油酰三甲基磷酸铵与胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与胆固醇的混合物或二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物。
20.权利要求1的用途，其中所述核酸分子以10摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:10摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
21.权利要求20的用途，其中所述核酸分子以5摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:5摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
22.权利要求21的用途，其中所述核酸分子以4摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
23.权利要求21的用途，其中所述核酸分子以2摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
24.权利要求21的用途，其中所述核酸分子以1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
25.权利要求1的用途，其中所述核酸分子的总量以1μg核酸:1μg脂质体至1μg核酸:40μg脂质体的重量比存在。
26.权利要求25的用途，其中所述核酸分子的总量以1μg核酸:5μg脂质体至1μg核酸:20μg脂质体的重量比存在。
27.权利要求26的用途，其中所述核酸分子的总量以1μg核酸:10μg脂质体的重量比存在。
28.权利要求1的用途，其中所述核酸分子被封装在所述阳离子脂质体的内部。
29.权利要求1的用途，其中施用所述复合物以治疗与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
30.权利要求1的用途，其中施用所述复合物以治疗与对多至5x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
31.权利要求1的用途，其中施用所述复合物以预防与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
32.权利要求1的用途，其中施用所述复合物以预防与对多至5x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
33.权利要求29或权利要求30的用途，其中在对有机磷酸盐试剂暴露之后立即施用所述复合物。
34.权利要求31或32的用途，其中在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少6小时施用所述复合物。
35.权利要求31或32的用途，其中在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少一周一次地施用所述复合物。
36.权利要求1的用途，其中所述哺乳动物是人。
37.阳离子脂质体复合物在制备用于治疗人中与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的药物中的用途，其包括对人鼻内施用或通过气雾剂吸入施用所述阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体直接复合但非化学缀合于其的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)；
(c)包含在第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子，所述第一质粒被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合；和
(d)包含在第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子，所述第二质粒被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合,
其中所述TfRscFv和所述阳离子脂质体以1:20至1:40的重量比存在，并且所述核酸分子以1μg核酸:5μg脂质体至1μg核酸:20μg脂质体的比率存在，
并且其中施用所述复合物以治疗与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
38.阳离子脂质体复合物在制备用于预防人中与对有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性的药物中的用途，其包括对人鼻内施用或通过气雾剂吸入施用所述阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体直接复合但非化学缀合于其的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)；
(c)包含在第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子，所述第一质粒被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合；和
(d)包含在第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子，所述第二质粒被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合,
其中所述TfRscFv和所述阳离子脂质体以在1:20至1:40的重量比存在，并且所述核酸分子以1μg核酸:5μg脂质体至1μg核酸:20μg脂质体的比率存在，
并且其中施用所述复合物以预防与对至少1x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
39.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述编码BChE的核酸分子被包含在第一质粒构建体中，所述第一质粒构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
40.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含在第一质粒构建体中，所述第一质粒构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
41.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述BChE是BChE的突变形式。
42.权利要求41的用途，其中所述BChE的突变形式为G117H突变体。
43.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
44.权利要求43的用途，其中所述阳离子脂质体包含二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；二油酰三甲基磷酸铵与胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与胆固醇的混合物或二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物。
45.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述核酸分子以10摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:10摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
46.权利要求45的用途，其中所述核酸分子以5摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:5摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
47.权利要求46的用途，其中所述核酸分子以4摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
48.权利要求46的用途，其中所述核酸分子以2摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
49.权利要求46的用途，其中所述核酸分子以1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
50.权利要求37或权利要求38的用途，其中所述核酸分子被封装在所述阳离子脂质体的内部。
51.权利要求37的用途，其中施用所述复合物以治疗与对多至5x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
52.权利要求38的用途，其中施用所述复合物以预防与对多至5x LD50的有机磷酸盐试剂的暴露相关的毒性。
53.权利要求37的用途，其中在对有机磷酸盐试剂暴露之后立即施用所述复合物。
54.权利要求38的用途，其中在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少6小时施用所述复合物。
55.权利要求38的用途，其中在对有机磷酸盐试剂的潜在暴露之前至少一周一次地施用所述复合物。
56.阳离子脂质体复合物在制备用于将丁酰胆碱酯酶(BChE)递送至哺乳动物的血流的药物中的用途，其包括对所述哺乳动物鼻内施用或通过气雾剂吸入施用所述阳离子脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体复合物包含：
(a)阳离子脂质体；
(b)与所述阳离子脂质体直接复合但非化学缀合于其的抗转铁蛋白受体单链Fv(TfRscFv)；
(c)包含在第一质粒中的编码丁酰胆碱酯酶(BChE)的核酸分子，所述第一质粒被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合；和
(d)包含在第二质粒中的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子，所述第二质粒被封装在所述阳离子脂质体内、包含在所述阳离子脂质体的烃链区域内、与所述阳离子脂质体的外或内单层结合、或其任意组合,
其中所述TfRscFv和所述阳离子脂质体以1:20至1:40的重量比存在，并且所述核酸分子以1μg核酸:5μg脂质体至1μg核酸:20μg脂质体的比率存在，
并且其中施用所述复合物以导致至少250mg重量的BChE/70kg人的重量的人血流中的BChE的量。
57.权利要求56的用途，其中所述编码BChE的核酸分子被包含在第一质粒构建体中，所述第一质粒构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码BChE的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
58.权利要求56的用途，其中所述编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子被包含在第一质粒构建体中，所述第一质粒构建体从5'至3'包含：(a)至少一个人腺病毒增强子序列；(b)巨细胞病毒(CMV)启动子；(c)多克隆位点；(d)编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子；和(e)SV40多聚A序列，其中当与野生型腺病毒相比较时，所述质粒构建体的3'末端不包含腺病毒图谱单位9-16。
59.权利要求56的用途，其中所述BChE是BChE的突变形式。
60.权利要求59的用途，其中所述BChE的突变形式为G117H突变体。
61.权利要求56的用途，其中所述阳离子脂质体包含一种或多种阳离子脂质与一种或多种中性或辅助脂质的混合物。
62.权利要求61的用途，其中所述阳离子脂质体包含二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；二油酰三甲基磷酸铵与胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物；双十八烷基二甲基溴化铵与胆固醇的混合物或二油酰三甲基磷酸铵与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物。
63.权利要求56的用途，其中所述核酸分子以10摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:10摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
64.权利要求63的用途，其中所述核酸分子以5摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子至1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:5摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
65.权利要求63的用途，其中所述核酸分子以4摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
66.权利要求63的用途，其中所述核酸分子以2摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
67.权利要求63的用途，其中所述核酸分子以1摩尔的编码丁酰胆碱酯酶的核酸分子:1摩尔的编码富含聚脯氨酸的肽的核酸分子的摩尔比存在。
68.权利要求58的用途，其中所述核酸分子被封装在所述阳离子脂质体的内部。
69.权利要求58的用途，其中所述哺乳动物是人。
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