KR100707711B1 - 에어로졸 전달용 폴리에틸렌이민:ｄｎａ 제형 - Google Patents

에어로졸 전달용 폴리에틸렌이민:ｄｎａ 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다가양이온성의 비-지질:DNA 제형이 분무기-유도된 분해 문제를 극복하고 생체내에서 호흡기 조직을 형질감염시키는데 있어서 지질계 제형 보다 훨씬 더 특이적이고 효율적이라는 것을 입증해준다. 본원에 제시된 결과는 폴리에틸렌이민(PEI) 제형이 제트 분무기에 의해 생체내 전달될 때 기존의 지질계 제형 보다 약 10배 이상 더 유효하다는 것을 입증해준다. 따라서, 에어로졸화 폴리에틸렌이민계 제형은 본원에서 호흡기를 통해 유전자 치료 요법을 표적화하는데 사용하도록 제공된다.
에어로졸 전달용 폴리에틸렌이민:DNA 제형, 리포좀, 치료학적 유전자, 폴리에틸렌이민, 제트 분무기

Description

에어로졸 전달용 폴리에틸렌이민:ＤＮＡ 제형{Polyethyleneimine:DNA formulations for aerosol delivery}
발명의 배경
본 발명은 일반적으로 유전자 치료 요법 및 약제학적 약물 전달 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 치료학적 유전자를 에어로졸화 폴리에틸렌이민을 사용하여 전달하는 것에 관한 것이다.
유전자를 [노출된(naked) DNA, 바이러스 또는 리포좀의 형태로] 폐에 에어로졸 전달하는 것과 관련된 심각한 문제점은 시험관내 형질감염(transfection)에 의해 수득된 결과와 비교해서 분무화 공정에 따른 효율이 현저하게 저하된다는 것이다[참조: Crook et al., 1996; Schwartz et al., 1996; Eastman et al., 1997a,b, 1998]. 또한, 폐의 계면활성 지질과 단백질이 양이온성 리포좀-매개 형질감염을 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: Duncan et al., 1997; Tsan et al., 1997]. 이들 효과는 아마도, 지질계 에어로졸화 제형의 생체내 유전자 전달이 낮다고 보고된 사실에 대한 원인이며 DNA를 폐에 효율적으로 전달하게 될 시스템의 개발을 부진하게 하였다.
최근, 한 가지 특정한 양이온성 지질(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤: BGTC)을 함유하는 제형이 기존에 시험된 몇몇 지질 보다 분무화 공정 동안 더욱 안정한 것으로 보고되었다. 이와 같은 에어로졸에 의한 생체내 형질감염에 있어서의 기술 증진에도 불구하고, 이러한 치료법을 임상적으로 적용하는 데에는 이 보다 훨씬 더 효율적인 전달용 벡터가 요구될 수 있다. 최근 수 년간, 다가양이온(polycation)이 세포를 시험관내 및 생체내에서 형질감염시키는데 효과적인 것으로 보고되었다. 현저한 활성을 나타내는 한 가지 유도체가 폴리에틸렌이민(PEI)이다[참조: Boussif et al., 1995, 1996]. 본원에서는, PEI-DNA 제형이 분무기로 인한 형질감염 효율 감소 문제를 극복할 뿐만 아니라 생체내에서 폐 조직을 형질감염시키는데 있어서 지질계 제형 보다 훨씬 더 효율적이어서, 폴리에틸렌이민-기제 제형이 제트 분무기를 통해 생체내로 전달될 때 기존의 최적화된 지질계 제형 보다 대략 10배 이상 유효한 것으로 보고되어 있다. 이러한 폴리에틸렌이민-기제 제형은 폐를 형질감염시키는데 있어서는 보다 효과적이지만, 마우스의 비내로 도입하는데 있어서의 형질감염 수준은 비교적 낮다. 폴리에틸렌이민-기제 제형은 폐 종양을 포함한 각종 유전적 폐 질환을 치료하기 위해 유전자를 에어로졸 전달하는데 있어서 우수한 후보 제형으로 여겨지므로, 비침해성의 유전적 면역화 수단일 수 있다.
선행 기술 분야에서는 호흡기를 통해 표적화된 유전자 치료 요법에 사용하기 위한 DNA 또는 치료학적 유전자를 에어로졸로 전달하기 위한 비-지질 비히클 및 제형이 미흡하였다. 본 발명은 이러한 당 업계의 오랜 요망과 숙원을 충족시켜 준다.
발명의 요약
폐에 플라스미드 DNA의 에어로졸 전달은 각종 유전적 폐 질환 치료에 있어서 비침해성 수단을 제공한다. 그러나, 분무화 공정으로 인해 종종, 많은 벡터:DNA 제형의 형질감염 효율이 급격히 감소한다. DNA 전달에 적당한 에어로졸 전달 시스템을 고안하는 것과 관련해서, 본원에서는 DNA와 같은 거대분자와 폴리에틸렌이민을 사용한 제형이 고 수준의 폐 형질감염을 유발하고 분무화 동안에도 안정한 것으로 보고되고 있다. PEI-DNA 제형은 또한, 폐에 대한 높은 특이도를 나타내며 또한 무독성이다. 시험관내 및 생체내 형질감염 모두에 대한 최적의 PEI-DNA 비율 및 농도가 결정되었다. 혈청 인자는 PEI-매개 형질감염을 증진시키는 것으로 나타난 반면, 계면활성제는 최소 억제 효과를 나타낸다.
본 발명의 한 가지 목적은 호흡기를 통해 표적화된 유전자 치료 요법용 DNA 또는 치료학적 유전자를 에어로졸로 전달하는데 사용될 양이온성의 비-지질 비히클 및 제형을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에서는, 유전자 치료 요법이 필요한 개개인의 호흡기를 통해 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성한 치료학적 유전자의 수성 분산제를 소립자 에어로졸을 통하여 전달하는 단계를 포함하는, 호흡기를 통해 유전자 치료 요법을 표적화하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 치료학적 유전자를 암호화하는 DNA와 폴리에틸렌이민을 포함하는, 소립자 에어로졸을 통하여 치료학적 유전자를 전달하기 위한 다가양이온-DNA 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에서는, 치료학적 유전자를 암호화하는 DNA를 적당한 용액에 용해시키는 단계; 폴리에틸렌이민을 적당한 용액에 용해시키는 단계; 이와 같이 용해된 DNA와 폴리에틸렌이민 간에 복합체를 형성시켜 폴리에틸렌이민-DNA 조성물을 생성시키는 단계; 및 이러한 폴리에틸렌이민-DNA 조성물을 분무 가능한 장치 내에 도입되어, 소립자 에어로졸을 통하여 치료학적 유전자를 전달하기 위한 폴리에틸렌이민-DNA 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된, 소립자 에어로졸을 통하여 치료학적 유전자를 전달하기 위한 폴리에틸렌이민-DNA 조성물이 제공된다.
본 발명의 기타 및 추가의 국면, 양태 및 이점은 다음의 본 발명의 바람직한 양태에 관한 기재 내용으로부터 명백할 것이다. 이들 양태는 서술 목적으로 제시된다.
첨부된 도면이 포함되어 본 발명의 상기 양태, 이점 및 목적이 명백해지고 상세히 이해될 수 있다. 이들 도면은 본 명세서의 일부이다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 예시하고자 함이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것을 인지해야 한다.
도 1은 혈청 부재하에서 각종 N:P 비의 PEI-DNA에 의한 A549 세포의 형질감염을 도시한다. N:P 비 증가에 따른 PEI-pCMVβ및 PEI-루시퍼라제 제형이 기재된 바와 같이 제조되었다. 실험 내내 일정한 농도의 DNA가 사용되었는데, 단 "0"은 형질감염되지 않고 그 밖의 다른 동일한 배지 대체물에 노출된 것을 의미한다. A549 세포를 6시간 동안 형질감염시키고, 형질감염을 개시한지 48시간 후에 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 활성을 알아보기 위해 상기 세포를 추출하였다. 도 1A는 각 조건에 대해 검출된 β-갈락토시다제의 수준을 예시한 것이고, 도 1B는 각 조건에 대해 측정된 루시퍼라제의 수준을 예시한 것이다. 도 1C는 PEI-pCMVβ로 형질감염된 세포(도 1A에 예시된 바와 동일한 실험으로부터의 것임)에 대해 측정된 단백질 수준(세포 밀도 및 이에 따른 세포독성의 대략적인 측정치)을 예시한 것이다. 모든 그룹에 대해 N은 3이다. 바(bar)는 표준 오차를 지시한다.
도 2는 혈청 존재하에 상이한 N:P 비에서 증가하는 농도의 PEI-DNA를 사용한 A549 세포의 형질감염을 도시한다. 제시된 N:P 비에서의 증가 농도의 PEI-루시퍼라제 제형이 제조되었다. A549 세포를 6시간 동안 형질감염시키고, 형질감염을 개시한지 24시간 후에 루시퍼라제 활성을 알아보기 위해 상기 세포를 추출한다. 모든 그룹에 대해 N은 3이다.
도 3은 시험관내에서의 PEI-pCMVβ형질감염 효율에 대한 혈청의 효과를 도시한 것이다. A549 세포를 6시간 동안 지시된 첨가와 함께 일정한 N:P 비 20에서 일정 농도의 DNA(1㎍/웰)와 PEI(15nmol/웰)로 형질감염시키고, 형질감염을 개시한지 48시간 후에 β-갈락토시다제 활성을 알아보기 위해 추출하였다. 모든 그룹에 대해 N은 3이다. 바는 표준 오차를 지시한다.
도 4는 시험관내에서의 PEI-pCMVβ형질감염 효율에 대한 계면활성제 및 BAL 유체의 효과를 도시한 것이다. A549 세포를 6시간 동안 지시된 첨가와 함께 일정한 N:P 비 20에서 일정 농도의 DNA(1㎍/웰)와 폴리에틸렌이민(15nmol/웰)으로 형질감염시키고, 형질감염을 개시한지 48시간 후에 β-갈락토시다제 활성을 알아보기 위해 검사하였다. 모든 그룹에 대해 N은 3이다. 바는 표준 오차를 지시한다.
도 5는 분무화 동안의 형질감염 안정성에 대한 폴리에틸렌이민 및 양이온성 지질의 효과를 도시한 것이다. 분무기 저장기로부터 샘플을 취하고 기재된 바와 같이 배양물 중의 A549 세포를 사용하여 시험관내 형질감염(CPRG) 검정법으로 정성적으로 모니터링하기 전에 제시된 시간 동안 PEI-pCMVβ 및 지질-pCMVβ제형을 분무시켰다. 모든 그룹에 대해 N은 3이다.
도 6은 Balb/c 마우스의 시험관내 비내 처리를 도시한 것이다. 이 실험에서는, 폴리에틸렌이민 또는 양이온성 지질 BGTC:DOPE로 제형화시킨 pCMVHi-CAT 플라스미드(CAT 유전자 함유)를 마우스에게 비내 투여하였다(도 6A). 등량의 DNA(24㎍)를 모든 동물에게 투여하였다. 동물들을 먼저 마취시키고 DNA-벡터 용액을 비내 투여하였다. 점적 주입한지 48시간 후에 상기 동물을 희생시키고, 폐를 꺼낸 다음, 조직을 추출하여 CAT 활성 발현을 알아보기 위해 이를 검정하였다(ELISA 이용). 폴리에틸렌이민 또는 BGTC:DOPE로 제형화시킨 루시퍼라제 발현 플라스미드(pGL3)를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다(도 6B). 점적 주입한지 48시간 후에 동물들을 희생시키고, 폐와 비 조직을 꺼내고 추출한 다음, 지시된 바와 같이 루시퍼라제 발현을 알아보기 위해 이를 검정하였다. 각 처리 그룹은 6마리로 구성되었다. 바는 표준 오차를 지시한다.
도 7은 Balb/c 마우스를 생체내 에어로졸 처리한 것을 도시한 것이다. 이 실험에서는, PEI-DNA(클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자) 또는 지질-DNA(동일한 플라스미드, 동일한 DNA 농도)를 동물에게 간헐적으로 에어로졸 노출시키거나 전혀 에어로졸 노출시키지 않았다(대조군). 이러한 노출은 해당 동물들을 퓨리탄 베넷(Puritan Bennett) 1600 단일 제트 분무기가 부착된 밀폐된 방에 놓아 두고, 1분 간 에어로졸 처리한 다음 이러한 에어로졸을 동물들이 들이 마실 수 있도록 9분간 처리를 중단하고, 이 주기를 반복함으로써 이루어졌다. 이는 분무기 유체(총 40ml)가 모두 고갈될 때까지(대략 16시간) 반복하였다. 마지막 에어로졸 처리한지 48시간 후에 동물을 희생시키고, 폐를 꺼낸 다음 조직을 추출하여 CAT 활성 발현을 알아보기 위해 이를 검정하였다(ELISA 이용). 각 처리 그룹은 6마리로 구성되었다. 바는 표준 오차를 지시한다.
도 8은 PEI-pCMV-hGH로의 유전적 면역화에 의한 항체 유도를 도시한 것이다. 5마리 마우스 그룹을 에어로졸 또는 비내 점적 주입을 통해 PEI-pCMV-hGH 제제에 노출시키고, 그 결과를 근육내 주사로써 제공된 노출된 DNA를 이용하여 수득된 결과와 비교하였다. 혈청 샘플을 2주 간격으로 수득하고, 항-hGH 항체의 존재 여부를 ELISA로 측정하였다. 1:500의 희석율에서의 각 그룹에 대한 평균 흡광 밀도와 표준 편차가 도시되어 있다. 본 검정에서 면역 처리되지 않은 마우스로부터의 혈청의 배경 OD는 0.1이었다. 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 공기를 사용하여 발생된 PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐에서의 CAT 발현과 5% CO2를 함유하는 공기를 사용하여 발생된 PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐에서의 CAT 발현을 비교를 도시한 것이다. CAT 플라스미드 1mg을 N:P 비 10:1로 PEI와 복합체를 형성시키고, 이로써 생성된 복합체를 마우스에게 30분 동안 에어로졸 처리하였다. 24시간 후에 폐를 수거하고 CAT 검정을 기재된 바와 같이 수행하였다. 값은 평균±SD이다(그룹당 n은 6마리 마우스이고, p는 0.001이다).
도 10은 PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐에서의 유전자 발현이 용량 의존적이라는 것을 도시해준다. 증가 용량의 CAT 플라스미드를 10:1의 고정된 N:P 비로 5% CO2 함유 공기를 사용하여 에어로졸 처리하였다. DNA의 총 전달량과 PEI-DNA의 전달 농도 모두가 증가된다. 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 폐를 수거한 다음, CAT 단백질을 검정하였다. 값은 평균±SD이다(그룹당 n은 5마리 마우스이다).
도 11은 에어로졸에 의한 폐로의 PEI-DNA 전달 효율에 대한 N:P 비의 효과를 도시한 것이다. CAT 플라스미드(2mg)의 양은 고정시키고 상이한 PEI-DNA(N:P) 비를 사용하였다. 5% CO2 함유 공기를 사용하여 상기 복합체를 에어로졸 처리하였다. 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 폐를 수거한 다음, CAT 검정을 수행하였다. 값은 평균±SD이다(그룹당 n은 5마리 마우스이다).
도 12는 폐에서의 루시퍼라제 유전자 발현에 대한 N:P 비의 효과를 도시한 것이다. 고정 량의 루시퍼라제 플라스미드(2mg)를 상이한 N:P 비로 전달하였다. 5% CO2 함유 공기를 사용하여 상기 복합체를 에어로졸 처리하였다. 에어로졸 전달한지 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 폐를 수거한 다음, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 값은 평균±SD이다(그룹당 n은 5마리 마우스이다).
도 13은 단일 PEI-DNA 에어로졸 노출 후 시간에 따른 형질전환된 유전자 발현을 도시한 것이다. 도 13A: 15:1의 N:P 비에서 CAT 플라스미드 2mg을 5% CO2 함유 공기를 사용하여 마우스에게 에어로졸 처리하였다. 마우스를 상이한 시점에서 희생시키고, 폐를 수거한 즉시 동결시켰다. 최종 시점 후에 CAT 검정을 수행하였다. 값은 평균±SD이다(매 시점마다 n은 5마리 마우스이다). 도 13B: 두 가지 상이한 N:P 비를 사용한 CAT 발현의 영속성. 15:1 또는 10:1 N:P 비에서 CAT 플라스미드 2mg을 5% CO2 함유 공기를 사용하여 양 그룹의 마우스(매 시점마다 그룹당 n은 5마리 마우스이다)에게 전달하였다. 10:1 비에 대한 시점은 에어로졸 노출 후 1, 2, 3 및 6일이고, 15:1 비에 대한 시점은 에어로졸 노출 후 1, 3, 7 및 10일이다.
도 14는 단일 PEI-DNA 에어로졸 노출 후 형질전환된 유전자의 조직 분포를 도시한 것이다. 도 13에서와 동일한 마우스 그룹이 사용되었다(10:1 그룹). 상이한 조직을 수거한 즉시 동결시켰다. 최종 시점 후에 CAT 단백질을 검정하였다. 값은 평균±SD이다(매 시점마다 n은 5마리 마우스이다).
도 15는 B16-F10 흑색종 에어로졸 유전자 치료 요법에 대한 종양 지수를 도시한 것이다. 0일째 종양 세포를 주사하고, 1일째부터 치료를 시작하였다. PEI-p53과 PEI-RB를 3주 동안 매주 2회씩 에어로졸 전달하였다. 종양 주사 후 24일째에 마우스를 희생시키고 폐를 칭량하였다. 폐 전이를 1 내지 4점으로 등급을 매겼다. 이러한 전이와 폐 중량을 고려하여 종양 지수를 산정하였다(p53 그룹과 Rb 그룹 모두에 대한 대조군에 대해 p<0.01).
도 16은 M109 선암에 대한 에어로졸 조합 치료 요법의 효과를 도시한 것이다. 0일째 종양 세포를 주사하고, 1일째부터 치료를 시작하였다. PEI-p53을 4주 동안 매주 2회씩 전달하고, 약물 9NC 또한 4주 동안 매주 2회씩 전달하였다. 4주 후에 마우스를 희생시키고 폐를 칭량한 다음, 종양 병소를 계수하였다. 폐 중량, 종양 병소수 및 종양 병소 크기를 고려하여 종양 지수를 산정한다(p53 그룹과 p53+9NC 그룹 모두에 대한 대조군에 대해 p<0.0001).
도 17은 사람 골육종 폐 전이의 누드 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 PEI와 p53 유전자의 조성물의 효과를 도시한 것이다.
플라스미드 DNA를 폐에 에어로졸로 전달하는 것은 각종 유전적 폐 질환을 치료하기 위한 한 방법으로서 유전자 제제를 폐의 표면에 직접적으로 적용할 수 있는 가능성을 부여해준다. 그러나, 제트 분무화 공정으로 인해, 노출된 DNA, 바이러스성 벡터 및 많은 지질계 제형이 급격하게 분해된다. DNA가 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 것이 플라스미드 DNA를 상당히 안정화시키는 것으로 밝혀지긴 하였지만, 분무화 동안에 활성 손실이 일어나, 이러한 많은 복합체의 에어로졸 전달 효율을 심각하게 제한시킨다. DNA 전달에 적절한 에어로졸 전달 시스템을 고안하는 것과 관련해서, 고 수준의 폐의 형질감염(양이온성 지질 보다 10 내지 100배 더 높음)을 가져다 주고 분무화 과정 동안 높은 안정성을 나타내는, DNA와 같은 거대분자와 폴리에틸렌이민(PEI, 다가양이온성 중합체)을 사용한 제형이 개발되었다. 또한, 이들 폴리에틸렌이민-기제 제형은 DNA-리포좀 복합체와 비교해서 폐에 대한 특이도가 높으며, 또한 무독성이다. 시험관내 및 생체내 형질감염에 대한 최적의 폴리에틸렌이민 제형 및 폴리에틸렌이민-DNA 비율과 농도가 결정되었다. 분무화 공정에 따른 문제점을 극복하고 폐 부위에 대한 DNA 전달용 벡터로서 효율적인 폴리에틸렌이민-기제 제형의 성질이 조사되었다. 혈청 중의 열-불안정한 인자는 폴리에틸렌이민-매개 형질감염을 증진시키는 것으로 여겨지는 반면, 계면활성제는 최소의 억제 효과를 나타낸다. 이러한 기술의 적용 분야로는 유전적 면역화를 위해 에어로졸화 폴리에틸렌이민-DNA을 사용하는 분야이다.
본 발명은 분무기를 통한 전달을 목적으로 한다. 수 많은 제트 분무기가 수성 현탁제의 단일 용량 또는 저 용량 전달에 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리에틸렌이민:DNA 제형은 또한, 초음파 분무화를 통하여 전달될 수도 있다. 부가적으로, 폴리에틸렌이민과 DNA의 혼합물은 "계량된 용량 흡입기" 내의 압축 공기 또는 기체에 의해 투여될 수도 있다.
구체적으로 언급하면, 본 발명은 유전자 치료 요법이 필요한 개개인의 호흡기를 통해 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성한 치료학적 유전자와 같은 유전적 거대분자의 수성 분산제를 소립자 에어로졸을 통하여 전달하는 단계를 포함하는, 호흡기를 통해 유전자 치료 요법과 같은 치료법을 표적화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라서 전달될 수 있는 유전적 거대분자의 대표적인 예에는 DNA, RNA, 촉매적 활성 핵산, 예를 들면, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 기타 유형의 변형된 핵산이 포함된다. 이러한 본 발명의 방법은 낭포성 섬유증, 천식, 폐암, 식도암, 결장암, 백혈병, 유방암, 육종 또는 흑색종과 같은 질환이 있는 개개인을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 수성 분산제 중에서 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성한 유전적 거대분자는 다음에 상세히 기재되는 바와 같이 폴리에틸렌이민의 효과를 증대시키도록 10% 이하의 이산화탄소 기체를 함유하는 공기 혼합물로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 폴리에틸렌이민과 유전적 거대분자를 포함하는, 소립자 에어로졸을 통하여 치료학적 유전자와 같은 유전적 거대분자를 전달하기 위한 다가양이온-유전적 거대분자 조성물에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 유전적 거대분자의 대표적인 예에는 DNA, RNA, 촉매적 활성 핵산, 예를 들면, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 기타 유형의 변형된 핵산이 포함된다.
본 발명은 추가로, 유전적 거대분자를 적당한 용액에 용해시키는 단계; 폴리에틸렌이민을 적당한 용액에 용해시키는 단계; 이와 같이 용해된 유전적 거대분자와 폴리에틸렌이민 간에 복합체를 형성시킴으로써, 폴리에틸렌이민-유전적 거대분자 조성물을 생성시키는 단계; 및 이러한 폴리에틸렌이민-유전적 거대분자 조성물을 분무 가능한 장치 내에 도입하여, 소립자 에어로졸을 통하여 유전적 거대분자를 전달하기 위한 폴리에틸렌이민-유전적 거대분자 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된, 소립자 에어로졸을 통하여 치료학적 유전자를 전달하기 위한 다가양이온-유전적 거대분자를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 유전적 거대분자의 대표적인 예에는 DNA, RNA, 촉매적 활성 핵산, 예를 들면, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 기타 유형의 변형된 핵산이 포함된다.
상기 언급된 방법 및 조성물에 대한 전달 방법에는 경구 흡입 및 비내 흡입 방법, 안면 마스크 또는 경구용 튜브에 의한 방법 및 산소를 투여하기 위해 사용되어 온 어린이용 산소 후드에 의한 방법이 포함된다. 일반적으로, 소립자 에어로졸은 분무화 공정에 의해서 창출된 것이다. 바람직하게는, 분무화 공정이 제트 분무기에 의해 수행된다. 추가로, 치료학적 유전자가 발현에 필요한 작동적으로 연결된 요소를 포함하는 것이 바람직하고, 대표적인 치료학적 유전자에는 낭포성 섬유증 트랜스멤브레인 컨덕턴스(conductance) 조절인자 유전자, p53 또는 망막아종과 같이 종양 억제인자를 암호화하는 유전자, 또는 유전 공학적으로 처리된 이들 유전자의 변이체, 사이토킨 유전자, 예를 들면, 인터루킨-2 또는 인터루킨-12, 및 종양 또는 기타 감염성 제제에 대한 직접 면역 반응을 자극할 DNA 백신으로서 사용하게될 유전자가 포함된다. 또 다른 대표적인 치료학적 유전자는 HSV 티미딘 키나제 유전자이다. 전형적으로, 폴리에틸렌이민 중의 치료학적 유전자의 최종 농도는 약 10㎍ DNA/50nmol 폴리에틸렌이민 질소/ml 이하 및 약 0.1㎍ DNA/50nmol 폴리에틸렌이민 질소/ml 이상이다. 부가적으로, 혈청을 상기 언급된 조성물에 가할 수 있다. 추가로, 세포-특이적 리간드를 상기 폴리에틸렌이민에 공유적으로 접합시킬 수 있으며, 대표적인 세포-특이적 리간드는 트랜스페린이다.
본 발명에 따르면, 당해 기술 분야 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 다음 문헌에 상세하게 언급되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)]. 따라서, 본원에 제시되는 경우, 다음 용어들은 다음에 제시된 정의를 지닌다.
"DNA 분자"는 일본쇄 형태 또는 이본쇄 나선형의 데옥시리보뉴클레오티드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체성 형태를 지칭한다. 이 용어는 상기 분자의 1차 및 2차 구조만을 지칭하며, 이를 어떠한 특정한 3차 형태로 제한하지는 않는다. 따라서, 상기 용어에는 특히 선형 DNA 분자(예를 들면, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이본쇄 DNA가 포함된다.
"유전적 거대분자"에는 치료학적 유전자를 포함한 DNA, RNA, 촉매적 활성 핵산, 예를 들면, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 기타 유형의 변형된 핵산이 포함된다.
"프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 규정하기 위해, 이러한 프로모터 서열은 이의 3' 말단에 전사 개시 부위가 결합되고, 배경 이상의 탐지 가능할 만한 수준으로 전사를 개시시키는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소가 포함되도록 상류(5' 방향)으로 연장된다. 이러한 프로모터 서열 내에서는, 전사 개시 부위 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)이 발견될 것이다. 진핵성 프로모터는 항상은 아니지만 종종, "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 함유한다. 원핵성 프로모터는 -10 및 -35 컨센서스 서열 이외에도 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열을 함유한다.
DNA "암호화 서열"은 적당한 조절 서열의 제어 하에 놓여진 경우에 생체내에서 전사되어 폴리펩타이드로 해독되는 이본쇄 DNA 서열이다. 이러한 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서의 개시 코돈과 3'(카복실) 말단에서의 해독 종결 코돈으로써 결정된다. 암호화 서열에는 원핵성 서열, 진핵성 mRNA 로부터의 cDNA, 진핵성(예를 들면, 포유류) DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
전사 및 해독 제어 서열은 숙주 세포 내에서 암호화 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 시그날, 종결인자 등이다. "cis-요소"는 뉴클레오티드 서열이고, 이는 또한, 특정 유전자 좌의 발현을 상향 조절하거나 하향 조절할 수 있는 기타 단백질과 상호작용하는 "컨센서스 서열" 또는 "모티브(motif)"로 칭해진다. "시그날 서열"이 또한 상기 암호화 서열에 포함될 수 있다. 이러한 서열은 숙주 세포에 도입되어 폴리펩타이드가 적당한 세포내 위치로 이동하도록 지시해주는, 이러한 폴리펩타이드에 대한 N-말단인 시그날 펩타이드를 암호화한다. 시그날 서열은 원핵 생물 및 진핵 생물 본래의 각종 단백질과 결합된 상태로 발견될 수 있다. 폴리아데닐화 시그날과 전사 종결 서열은 통상적으로, 암호화 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
"발현 제어 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사와 해독을 제어하고 조절해 주는 DNA 서열이다. 암호화 서열은, RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA로 전사시킨 다음 이것이 상기 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독될 때, 특정 세포 내의 전사 및 해독 제어 서열의 "제어 하"에 있으며 "작동적으로 연결"된다.
"유전자"는 이 유전자가 천연 상태로 존재하는 경우에 본래의 유전자, 즉 천연적으로 발견되는 바와 같은 프로모터 및/또는 부가 서열에 의해 구동되는 암호화 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 유전자는 암호화 서열; 및 이러한 암호화 서열을 발현시키기 위한 이종(heterologous) 프로모터(이종 전사 및/또는 해독 제어 서열을 함유하거나 함유하지 않음)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료학적 유전자"는 전형적으로, 치료학적 효과를 지니고 있는 단백질을 암호화하는, 이의 본래의 프로모터 또는 발현시키는 이종 프로모터를 지닌 유전자, 예를 들면, 세포에는 존재하지 않지만 필요한 효소를 암호화하는 유전자이다.
일반적으로, 삽입된 DNA 단편의 효율적인 전사와 해독을 촉진시켜 주는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터는 숙주와 연계해서 사용된다. 발현 벡터는 전형적으로, 복제 오리진(origin), 프로모터(들), 종결인자(들) 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공해줄 수 있는 특정 유전자를 함유한다. 최적의 세포 성장을 달성해 주는 것으로 당해 분야에 공지된 수단에 따라서 상기 형질전환된 숙주를 발효 및 배양할 수 있다.
DNA 작제물의 "이종" 영역은 천연 상태의 보다 큰 분자와 관련해서는 발견되지 않는, 이러한 보다 큰 DNA 분자 내에서 동정 가능한 DNA 절편이다. 따라서, 이종 영역이 포유류 유전자를 암호화하는 경우, 이러한 유전자는 통상적으로, 공급원 유기체의 게놈 내의 포유류 게놈 DNA 양쪽에 위치하지 않는 DNA에 의해 플랭킹될 것이다. 또 다른 예에서는, 암호화 서열이, 암호화 서열 자체가 천연 상태에서는 발견되지 않는 경우의 작제물이다(예를 들면, 게놈 암호화 서열이 인트론, 또는 본래의 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열을 함유하는 경우의 cDNA). 대립유전자성 변이 또는 천연 돌연변이는 본원에서 정의된 바와 같은 DNA의 이종 영역을 유발하지 않는다.
"벡터"는 또 다른 DNA 절편이 부착되어 이와 같이 부착된 절편의 복제를 유발시킬 수 있는, 플라스미드, 파아지 또는 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘(replicon)이다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 자가 복제 단위로서 작용하는, 즉 자체 제어 하에 복제할 수 있는 모든 유전적 요소(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. "복제 오리진"은 DNA 합성에 참여하는 DNA 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "에어로졸"은 상대적인 부유(airborne) 안정성을 지니기에 충분히 미세한 크기와 이에 따른 낮은 침강 속도를 지닌 고형 또는 액상 입자의 공기 중의 분산물을 지칭한다[참조: Knight, V., Viral and Mycoplasmal Infections of the Respiratory Tract, 1973, Lea and Febiger, Phila, PA, pp.2].
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분무화" 또는 "분무화 공정"은 액상 공급물, 즉 환류성의 배플을 갖는(baffled) 연무-생성 장치의 생성물로부터 미세한 에어로졸을 생성시키는 것을 지칭한다[May, 1973].
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "제트 분무기"는 압축 공기가 노즐 내로 팽창되고, 이로 인해 부착된 튜브를 통하여 분무기 저장기로부터 유체를 흡인시켜 주는 정압의 감소가 발생하는 장치를 지칭한다. 이러한 유체를 에어 제트로 세분시켜 광범위한 크기의 소적 분산물이 되도록 한다. 대부분의 소적(약 99.92%)은 밀폐형 플라스크 벽에 충돌되어 저장기로 환류된다. 나머지 적은 비율(약 0.02%)의 소적이 충돌로부터 빠져 나와 압축 공기 스트림에 의해 분무기로부터 유출된다. 이들이 미세한 소적 에어로졸을 구성한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "비내 점적 주입"은 절대적으로 코로만 숨쉬는 생물인 마취된 동물의 코에 액체을 투여함으로써, 결과적으로 동물이 상기 액체를 기도 또는 폐 내로 흡입하게 해주는 과정이다.
본 발명의 약제학적 폴리에틸렌이민(PEI):DNA 조성물은 수성 분산제를 개개인 또는 동물의 호흡기에 에어로졸 전달하도록 제조할 수 있다는 것을 특별히 고려해야 한다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 과도한 실험없이 에어로졸 제형의 적당한 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 표적화된 유전자 치료 요법을 위해 생체내에서 사용된 경우, 본 발명의 폴리에틸렌이민:DNA 조성물은 치료학적 유효량, 즉 치료학적 유전자를 효율적으로 발현시킴으로써 해당 질환을 없애거나 완화시키는 양으로 환자 또는 동물에게 투여된다. 용량 및 투여량 섭생은 질환의 종류, 특정한 폴리에틸렌이민:DNA 조성물의 특징, 예를 들면, 이의 치료학적 지수, 환자, 환자의 병력 및 기타 요인들에 좌우될 것이다. 투여된 폴리에틸렌이민:DNA 조성물의 양은 전형적으로 약 0.01 내지 약 1.0mg/환자 체중 kg일 것이다. 치료의 역효과에 대해 균형을 맞추어 가면서 효능을 최적화시키는 치료 과정이 지속될 것이다[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; and Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8th Ed (1990) Pergamon Press; 본원에 참조문헌으로 인용됨]. 당해 조성물 및 제형은 미량의 부가제, 예를 들면, 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질(예: 완충제 및 방부제)을 함유할 수 있다. 폴리에틸렌이민:DNA 조성물은 전형적으로 약 0.1㎍ DNA/20nmole PEI 질소/ml 내지 10㎍ DNA/150nmole PEI 질소/ml의 농도로 제형화될 것이다.
다음 실시예는 본 발명의 각종 양태를 예시하고자 제시된 것이며 이로써 본 발명이 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다.
실시예 1
PEI-DNA 제형
알드리히 케미칼(Aldrich Chemical: Milwaukee, WI)로부터 PEI(25kD)를 수득하였다. PEI의 스톡 용액을 인산염 완충 식염수(PBS)에서 4.3mg/ml의 농도(질소 중 0.1M)로 제조하였다. DNA는 인산염 3nmol/㎍을 함유하며, 적당한 농도를 PBS 중에 제조하였다. 용액을 격렬하게 와동시키면서 PBS 중의 목적 량의 DNA를 PEI에 서서히 가함으로써 상기 목적 량의 DNA와 PEI가 복합체를 형성하도록 하였다. 이어서, 상기 용액을 사용하기에 앞서 15 내지 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이로써 생성된 충전 비는 PEI 질소:DNA 인(N:P)으로서 표현하였다.
실시예 2
플라스미드 DNA
이. 콜라이(E. coli) β-갈락토시다제 리포터 유전자(pCMVβ; CLONTECH, Palo Alto, CA) 및 젤리피쉬(jellyfish) 녹색 형광성 단백질 유전자(pEGFP; CLONTECH)와 함께 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV)를 사용하여 시험관내에서 포유류 세포 발현을 평가하였다. 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(pCMVHiCAT)(Genzyme, Inc., Framingham, MA로부터의 증여물)를 사용하여 생체내 형질감염을 평가하였다. CMV 프로모터/인핸서 및 사람 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(공급처: Michael A. Barry at Baylor)을 삽입함으로써 변형시킨 루시퍼라제 플라스미드(pGL3, Promega, Madison, WI)를 시험관내 및 생체내 형질감염 모두에 대한 리포터 유전자로서 사용하였다. 면역화 연구에 사용된 플라스미드인 pCMV-hGH는 사람 성장 호르몬을 발현하고, 또한 마이클 에이. 베리로부터 수득하였다. 세균성 배양물을 상기 플라스미드로 형질전환시키고, 다량의 플라스미드 DNA를 생성시키며, 내독소가 없는 DNA용 시약과 칼럼(공급처: Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 정제한 다음, 이를 내독소가 없는 물에 용해시켜 목적하는 농도가 되도록 하였다.
실시예 3
양이온성 지질의 합성
양이온성 지질은 합성한 것이거나 증여받은 것이었다. 문헌[참조: Gao and Huang (1991)]의 방법에 따라서 DC-콜레스테롤 (3-[N-[(N',N'-디메틸-아미노)에탄]카바모일] 콜레스테롤)을 합성하였다. 문헌[참조: Vigneron et al. (1996)]의 방법에 따라서 구아니디늄 콜레스테롤(비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤; BGTC)를 합성하였다. 비칼(Vical; San Diego, CA)로부터 N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데사이톡시)-1-프로파나미늄 브로마이드(DMRIE)를 수득하였다.
실시예 4
양이온성 지질:중성 공-지질-DNA 복합체의 제조
양이온성 지질:DOPE 제형 모두를 먼저, 양이온성 지질(클로로포름 중 5mg/ml)을 적당한 용적의 디올레오일 포스파티딜-에탄올아민(DOPE; Avanti Polar Lipids; 클로로포름 중 5mg/ml) 또는 콜레스테롤(클로로포름 중 5mg/ml; Sigma)와 혼합한 다음 질소 하에 건조시킴으로써 제조하였다. 이러한 지질 혼합물을 37℃ 하에 t-부탄올 중에 용해시키고, -80℃에서 동결시킨 다음, 24시간 이상 동안 동결건조시켰다. 이 지질을 사용할 때까지 -20℃에서 저장하고, 사용할 때에는 이를 실온으로 가온시키며, DNA와 복합체를 형성하기에 앞서 30분 이상 동안 멸균수[세척용수(WFI; Baxter, Deerfield, IL)]에 재현탁시켰다. 동결건조된 BGTC:DOPE 제형은 6 내지 8개월 이상 동안 -20℃에서 안정한 것으로 나타났다.
실시예 5
조직 배양
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; Rockville, MD)으로부터 A549 사람 폐 암종 세포주를 구입하였다. 세포를 10% 규정 태아 송아지 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 50㎍/ml 젠타마이신이 보충된(달리 언급되지 않는 한) 둘벡코 변형 필수 배지(D-MEM)에서 배양하거나, 또는 10% PBS를 함유하는 RPMI 1640(Gibco)에서 배양하였다. 세포를 37℃하 및 5% CO2의 존재하에 세포 배양물 항온 배양기에서 배양하였다. 처음 8회 계대된 A549 세포만을 사용하였다.
실시예 6
시험관내 형질감염
무혈청 형질감염을 위해, 형질감염시키기 전날 세포를 12 웰 플레이트에 1.5 X 105 세포/웰로 도말하였다. 세포는 형질감염시 대략 80%가 밀집되어 있다. PEI-DNA 또는 지질-DNA 복합체 형성이 완료된 후, 이러한 PEI-DNA 또는 리포좀-DNA 제형을 옵티-멤 I 환원 혈청 배지(Opti-mem; Gibco-BRL, Grand Island, NY)에서 취하여 최종 DNA 농도가 1㎍/ml가 되도록 하였다. 형질감염 직전, 세포를 옵티-멤으로 세정한 다음 웰당 형질감염 용액 1ml로 덮었다(매 시점 또는 조건 동안 일반적으로 3개 웰이 형질감염되었다). PEI(25000 MW; 1몰당 질소 581몰)와 DNA(인산염 3nmol/㎍)의 조성물을 기준으로 하여 각종 질소 대 인산염(N:P) 비율에서의 플라스미드-PEI 복합체를 제조하였다. 24시간 후(보다 짧은 형질감염 시간이 지시된 경우는 제외한다), 형질감염 용액을 제거하고, 세포를 세정하며, 보충된 DMEM 배지 1ml를 가하였다. 이어서, 상기 세포를 24시간 추가로 항온 배양하고, 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세정하며, 용해 완충액(0.1M 트리스-HCl, 0.5% 트리톤 X-100; Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 용해시킨 다음, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 발현을 알아보기 위해 이를 검정하였다.
최적의 폴리에틸렌이민 질소 대 DNA 인산염(N:P) 비를 측정하고 또한, 혈청의 존재하에 시험관내에서 적용하기에 최적인 폴리에틸렌이민 질소 농도를 결정하기 위해, 다음 프로토콜을 개발하였다: 1) PEI-DNA 복합체를 특정 범위의 N:P 비로 제조하고, 이를 사용하기에 앞서 실온에서 15 내지 20분 동안 인큐베이션하고; 2) 세포를 24웰 포맷으로 105 세포/웰로 분주한 다음, 10% PBS가 보충된 RPMI 1640 배지 1ml 중에서 37℃ 하에 밤새 항온 배양하며; 3) 이어서, 각 웰 중의 배지 용적을 조정하여 목적하는 PEI 질소 최종 농도를 수득하고; 4) 일정 용적의 PEI-DNA 용액을 각각의 특정한 N:P 비에 대해 각 웰에 가하며; 5) 이 플레이트를 37℃에서 밤새 항온 배양한 다음 GFP 발현을 검사하거나 루시퍼라제 발현 여부를 검정하였다.
실시예 7
시험관내 PEI 형질감염에 대한 혈청, 계면활성제 및 기관지폐포성 세정 유액의 효과
A549 세포를 상기 언급된 바와 같이 분주하고 형질감염시키는데, 단 복합체 형성된 제형을 형질감염에 앞서 옵티-멤으로 희석시키는 것 대신, 이들 제형을 관심있는 시약(혈청, 계면활성제 또는 기관지폐포성 세정 유액)을 함유하는 옵티-멤으로 희석시켰다. 태아 송아지 혈청(FBS)은 공급처(HyClone Laboratories, Inc.; Logan, UT)로부터 수득하고, 마우스 및 사람 혈청은 공급처(Gibco-BRL)로부터 수득하며, 합성 계면활성제(Exosurf; 주로 콜파세릴 팔미테이트를 81mg/ml의 농도로 함유함)는 공급처(Burroughs Welcome Co.; Research Triangle, N.C.)로부터 수득하였다. 기관지폐포성 세정(BAL) 유액은 메톡시플루란 마취시켜 희생시키고 복부 대동맥을 통하여 방혈시킨 처리되지 않은 마우스로부터 수득하였다. 기관을 절개 수술하여 노출시키고 PE50 튜빙(외부 직경 0.965mm, Clay Adams)으로 캐뉼라 삽입하였다. 총 2.0ml 용적의 생리 식염수를 사용하여, 상기 폐를 대략 1.0ml 용적으로 5회 세정하였다(총 2ml를 보유하는 부착된 3ml용 주사기를 사용하여, 동일한 유체 1.0ml 용적을 폐 내로 5회 펌핑한 다음 이로부터 빼내었다). 세정 유액 2ml의 회수율은 전형적으로 85%이다. 이어서, 몇몇 마우스로부터 모은 BAL 유체를 동결건조시키고, 형질감염 분석을 위해 상이한 농도로 재구성시켰다.
실시예 8
시험관내 형질감염 효율의 정량적 분석
세포를 용해시킨 후, BCA 단백질 검정(공급처: Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 상기 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 96 웰 플레이트 포맷으로 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노시드(CPRG; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 검정법을 사용함으로써 β-갈락토시다제 활성을 정량화하고, 다이나테크(Dynatech) MR5000 미세역가 플레이트 판독기(공급처: Dynatech Laboratories, Inc., Chantily, VA) 상에서 판독하였다.
제조업자(Promega, Madison, WI)의 지시에 따라서 시판용 시약을 이용하여 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 세포 배양물에서 루시퍼라제를 발현하기 위하여, 배지를 제거하고 용해 완충액(공급처: Promega, Madison, WI) 1ml를 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 회전식 진탕기 상에서 실온하에 20분 동안 인큐베이션한 후, 용해물 1 내지 10㎕를 기질 50㎕와 혼합하고 TD-20C 광도계(공급처: Turner Designs, Sunnyvale, CA)에서 15초 동안 광 출력을 측정함으로써 상기 용해물을 검정하였다.
실시예 9
분무된 PEI-DNA 및 리포좀-DNA 복합체의 기능적 안정성
DNA를 2.5ml WFI 중에 80㎍/ml로 희석시키고, 2.5ml WFI 중의 적당량의 지질을 상기 DNA에 가하거나 적당량의 DNA를 PBS 중의 PEI에 가한 다음, 분무하기 전에 실온에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션함으로써, PEI-DNA 및 지질-DNA 제형을 제조하였다. 지시된 간격으로, 50 내지 75㎕ 분취량을 분무기 저장기로부터 꺼내어 시험관내 형질감염용으로 준비하였다. pCMV-β를 이들 연구 모두에서 리포터 유전자로서 사용하고, 상기 언급된 바와 같이 12 웰 플레이트 중의 A549 세포에서 플라스미드 DNA의 기능적 안정성을 분석하였다. 제트 분무기가 소립자 에어로졸을 생성시키기 위해서는, 이들 분무기가 분무기 액체를 지속적으로 재순환시켜야만 한다는 것을 인지해야 하는데, 이는 분무기 유체의 적은 분획(1% 미만)만이 분무기 제트를 통한 각 통과시 에어로졸로서 방출되기 때문이다. 큰 지질-DNA 입자(>400nm)는 작은 크기로 신속히 처리되어 단시간 내에 분무기 저장기 내의 지질-DNA 입자 크기가 전유리 임핀저(All Glass Impinger: AGI-4, Ace Glass Co., Vineland, NJ)에서 에어로졸로부터 회수된 에어로졸 입자 크기와 매우 유사해진다.
트윈 제트 중의 하나로부터 1개 튜브를 제거함으로써, 본 연구에 사용된 퓨리탄 베넷 1600 트윈 제트 분무기(Carlsbad, CA)를 변형시켰고, 이를 퓨리탄 베넷 1600 싱글 제트(PB sj)로서 지칭한다. 이러한 PB sj는 달리 언급되지 않는 한 15L/분의 유속으로 수행하였다.
실시예 10
점적 주입에 의한 PEI-DNA 및 리포좀-DNA로의 생체내 형질감염
점적 주입 1회 용량분에 들어가는 DNA의 농도를 6㎍/40㎕(적당한 농도의 리포좀을 가하거나 적당한 농도의 폴리에틸렌이민을 가한 후)로 증가시키는 것을 제외하고는, 본원에서 기재된 바와 같이 PEI-DNA 및 지질-DNA 제형을 제조하였다. 가끔씩 발생되는 불완전한 점적 주입(동물들은 점적 주입된 물질의 일부를 종종 토해낸다)으로 인한 가변성을 최소화하기 위해, 각 동물에게 총 4회 점적 주입하는데; 이틀 연속으로 매일 오전에 한번, 오후에 한번씩 동일한 양의 DNA를 주입하였다. 상기 제형을 투여하기 직전에 동물에게 메톡시플루란을 사용하여 약하게 마취시켰다. 동물의 목덜미를 곧추 서게 만들어, 1개 콧구멍에 40㎕를 서서히 주입하여 이러한 유체가 흡입되도록 하였다. 이 동물을 단기간 동안 곧추 선 상태로 유지시켜 흡입된 유체가 폐에 도달하게 하였다. 방사성 표지된 리포좀 제제를 사용하여, 상기 방법을 이용한 경우의 폐 전달 효율을 확인하였으며, 그 결과, 대부분의 물질이 수 분 후에 폐에서 발견되었다. 이러한 처리 결과로서 동물에게서 어떠한 명백한 생리학적 손상이나 고통의 징후도 발견되지 않았으며, 폐와 다른 기관을 총체적으로 검사한 결과에서도, 이에 따른 명백한 병리학적 징후가 감지되지 않았다. 앞서의 연구에서는 점적 주입된 리포터 유전자가 발현하는데 최적인 시간이 점적 주입 후 1 내지 2일인 것으로 밝혀졌기 때문에, 첫 번째 점적 주입을 개시한지 48시간 후에 동물을 희생시켰다.
실시예 11
에어로졸에 의한 PEI-DNA 및 리포좀-DNA로의 생체내 형질감염
분무기 1회 용량분에 들어가는 DNA의 농도를 2mg/20ml(적당한 농도의 리포좀 또는 폴리에틸렌이민을 가한 후)로 증가시키는 것을 제외하고는, 본원에서 기재된 바와 같이 PEI-DNA 및 지질-DNA 제형을 제조하였다. 달리 언급되지 않는 한, PB sj 분무기를 8L/분의 유속으로 수행하였다. 마우스(통상 6 내지 8마리)가 수용되어 있는 밀폐된 플라스틱 우리(13 x 17 x 30cm) 내로 분무기 유출물을 통과시켰다. HEPA 여과기를 통하여 공기를 상기 방으로부터 배출시키는데, 전체 장비는 부가의 HEPA 여과를 통하여 외부로 통기된 층흐름 후드 아래에 놓아 두었다. 에어로졸의 사용을 최소화하기 위하여, 분무기가 10분 마다 1분간만 작동되도록 자동 제어시켰다. 첫 번째 현탁액 20ml가 소모되면, 동일한 농도의 추가분 20ml를 분무기에 새로 보충하였다. 대략 12시간 동안 노출시켜야 하는데, 이 동안에 마우스에게 음식과 물을 공급하여 방 주위를 자유롭게 움직이게 해주었다.
실시예 12
생체내에서의 유전자 발현의 정량적 분석
생체내 형질감염 효율을 측정하는데 있어서, 시험관내 연구에 사용되어 온 β-갈락토시다제 보다 CAT 발현이 더 민감한 방법인 것으로 밝혀졌다. 분무된 제형에 노출시킨 동물을 적당한 시점(달리 언급하지 않는 한 48시간)에서 희생시키고, 폐와 기관을 꺼낸 다음 액체 질소에서 동결시켰다. 상기 조직을 나중에 용해 완충액에서 잘게 썰은 다음 균질기(Wig-L-Bug 비이드 균질기: Crescent Dental Mfg., Lyons, IL)를 사용하여 균질화하였다. 코에서의 형질감염을 측정하기 위하여, 마우스 두골의 코 절편을 나머지 두골로부터 절단하여 액체 질소에서 동결시켰다. 이와 같이 동결시킨 코 절편을 부수고, Wig-L-Bug 비이드 균질기를 사용하여 용해 완충액에서 균질화하였다. 시판용 CAT ELISA 키트(공급처: Boehringer Mannheim Gmnh, Germany)를 사용하여 조직 추출물을 CAT 함량에 대해 분석하였다. ELISA 검정법을 이용하여 수득된 결과는 통상적인 TLC 방법 및 유기 상 분리 방법을 이용하여 수득된 결과와 동등하거나 그 보다 우수하였다. 실제적으로 모든 생체내 에어로졸 연구시 관찰된 가변성때문에, 실험 그룹 및 대조군 그룹은 통상 6 내지 8마리 동물로 구성되었다.
점적 주입 또는 에어로졸 전달 후 루시퍼라제 발현을 생체내 분석하기 위해, 동물에게 마취제를 치사량 주입하여 희생시키고, 복부 대동맥을 가로로 절개하여 방혈시킨 다음, 폐와 기관을 수거하였다. 몇몇 연구에서는, 비 조직을 또한 수거하였다. 상기 조직을 원뿔형 그라운드 유리 조직 분쇄기(Kontes Duall 23)를 사용하여 루시퍼라제 검정용 용해 완충액 1ml에서 균질화하였다. 균질물 10㎕ 분취량을 기질 50㎕에 가하고 광 발생을 측정하였다.
실시예 13
유전적 면역화
5마리 마우스 그룹을 PEI와 조합된 pCMV-hGH(N:P 비 10)에 에어로졸을 통하여 노출시키거나 비내 플라스미드에 노출시켰다. 양성 대조군 그룹으로서, 5마리 마우스에게 노출된 플라스미드(50㎕ PBS 중 50㎍)를 전경골근 내의 근육내 주사제로서 투여하였다. 2주 간격으로 일련의 혈청 샘플을 수득하고, 사람 성장 호르몬[정제된 hGH 단백질은 Cal-Biochem(San Diego, CA)로부터 수득하였다]에 대한 전체적인 특이적 항체에 대해 ELISA로 검정하였다. 면역화되지 않은 마우스로부터 수거한 혈청 푸울은 각 ELISA에서 음성 대조군으로서 사용되었다.
실시예 14
PEI-DNA 충전 비율 및 농도의 시험관내 최적화
대부분의 다가양이온-DNA 제형의 형질감염 효율에 대한 충전 비의 중요성 때문에, PEI-DNA 비와 형질감염과의 관계를 혈청 부재하에 A549 세포를 사용하여 시험관내에서 검사하였다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 폴리에틸렌이민 질소 대 DNA 인산염(N:P) 비가 약 5인 것이, β-갈락토시다제 발현으로 측정된 바와 같이, pCMVβ플라스미드로의 시험관내 형질감염에 대해 최적이다. 형질감염은 비율이 4 아래로 되면 급격하게 떨어지고 비율이 5를 초과하여 증가함에 따라 저하된다. PEI-루시퍼라제 제형을 사용한 경우에 극히 유사한 결과가 수득되었다(도 1B). (세포 밀도와 대체로 상관있는) 동일한 실험으로부터의 세포 추출물의 단백질 수준에 대한 이들 비율의 효과를 검사한 경우, 8 아래의 비율에서는 독성이 거의 없거나 전혀 없었다(도 1C). 보다 높은 비율로 처리된 그룹에 대한 단백질 수준이 감소하는 것은 아마도 세포 독성을 지시해준다.
생체내 형질감염은 세포외 유체 단백질의 존재하에서 일어나야 하고 또한 상기 언급된 독성때문에, 형질감염 효율에 대한 폴리에틸렌이민의 농도와 N:P 비율 모두의 효과는 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 배양 배지 중의 A549 세포를 사용하여 검사하였다. 도 2는 PEI 농도 50 내지 60nmol/ml과 함께 N:P 비 16이 가장 높은 형질감염율을 제공해준다는 것을 도시하고 있는데, 이는 폴리에틸렌이민의 농도와 폴리에틸렌이민 대 DNA의 비율 모두가 혈청 단백질의 존재하에 형질감염 효율에 강력하게 영향을 미친다는 것을 지시해준다. 특히 관심있는 것은 최적의 N:P 비가 혈청 부재하에서 보다 혈청 존재하에서 더 높다는 것이다(도 1B). 혈청 존재하에 최적의 조건을 이용한 경우의 전반적인 형질감염 효율은 혈청 부재하의 경우보다 실제적으로 더 높았다. 동일한 최적화 프로토콜을 다른 세포에서 사용하였는데, 이는 이러한 비교적 간단한 기술이 PEI 형질감염 조건을 특정한 적용 분야에 맞추는데 유용하다는 것을 지시해준다.
실시예 15
시험관내에서의 PEI-DNA 형질감염 효율에 대한 혈청 및 계면활성제의 효과
기존의 보고서에는 혈청 단백질이 각종 양이온성 지질과 다가양이온에 의해 매개된 형질감염을 억제시키는 경향이 있다고 언급되어 있지만, 최적의 폴리에틸렌이민 농도와 N:P 비 조건하에서 본원에서 관찰된 증진 효과로 인해, 폴리에틸렌이민의 형질감염 효율에 대한 혈청의 효과를 연구하게 되었다. 태아 송아지 혈청 농도 0 내지 50%를 검사한 경우, 5 내지 20% 농도는 시험관내에서 형질감염을 증진시킨 반면, 보다 높은 농도(50%)는 형질감염 저하를 가져다 주는 것으로 밝혀졌다(도 3). 고 농도의 혈청과 연관된 억제는 PEI:DNA의 농도를 증가시킴으로써 부분적으로 극복될 수 있었다. 혈청 효과도 몇몇 종 특이성을 나타냈는데, 태아 송아지와 사람 혈청 모두는 유사한 형질감염 증진 효과를 가져다 준 반면, 마우스 혈청은 전혀 효과를 나타내지 못하였다. 래빗 혈청 또한 PEI-매개 형질감염 증진 효과를 가져다 주었다. 이러한 혈청 효과는 열에 불안정한 것으로 여겨지는데, 95℃에서 10분 동안 가열하게 되면 증진 활성이 완전 상실되지만, 후속 실험에서 56℃에서 30분간 가열한 경우에는 증진 효과를 없애지 못하였다.
PEI-매개 형질감염에 대한 폐 계면활성제의 효과를 또한 연구하였다. 이는 마우스로부터의 기관지폐포성 세정 유액(증가 농도에서 동결건조시키고 재수화시킴)과 증가하는 농도의 합성 계면활성제(Exosurf)를 사용하여 수행하였다. 동결건조되지 않은 BAL 유체의 농도 6.25% 내지 125%와 동등한 BAL 유체 농도에 세포를 노출시켰다(각 웰에 가해진 농축된 BAL 유체는 각 웰 중의 유체 총 용적의 0.5 내지 10%와 각각 동일하였다). 세포를 콜파세릴 팔미테이트(Exosurf 중의 활성제) 4.05 내지 81㎍/ml와 동등한 엑소설프(Exosurf)의 농도에 노출시켰다. 도 4에 도시한 바와 같이, 보다 고 농도의 BAL 유체와 엑소설프 모두는 혈청 효과와는 대조적으로 형질감염 수준을 저하시키는 반면, 보다 저 농도의 계면활성제는 거의 효과를 나타내지 않는 것으로 나타났다.
실시예 16
리포좀-DNA 및 PEI-DNA 복합체의 시험관내 형질감염 효율에 대한 분무화의 효과
N:P 비 5 및 10인 PEI-DNA 복합체 제제를 대상으로 하여, 10분에 걸쳐 분무하여 형질감염 효율을 시험하였다. 하나의 실험에서, PEI-DNA 제형(N:P=10)을 사용한 결과, A549 사람 폐 종양 세포를 사용한 시험관내 검정에서 대조군(분무되지 않음) 물질의 형질감염 활성의 평균 96%, 94% 및 89.6%가 보유된 것으로 나타났다. 분무기-순환된 물질 분취량을 3분 간격으로 분무기 저장기(출발 용적이 5ml임)로부터 꺼냈다. 비교를 위해, PEI-DNA 제제, DC-콜레스테롤:DOPE:pCMVβ(2:2:1) 제제 및 DMRIE:DOPE:pCMVβ(3:3:1) 제제를 분무 건조하였다(대략 12분)(도 5). 본 실시예에서 사용된 DC-콜레스테롤:DOPE 및 DMRIE:DOPE 제형을, A549 세포의 시험관내 형질감염에 최적화되도록 하였으며, 사용된 DC-콜레스테롤:DOPE의 비는 기존에 최적의 세포 배양 형질감염에 대해 보고된[참조: Gao & Huang, 1991] 것과 유사하다. 8L/분의 분무기 유속에서 PEI-pCMVβ(N:P=10) 제제의 β-갈락토시다제 활성이 단지 약간만 상실된 반면, DC-콜레스테롤:DOPE:pCMVβ 제제는 이의 활성의 60%가 3분 내에 상실되었고 그 후로는 사실상 불활성이었다. DMRIE:DOPE:pCMVβ의 활성은 3분 후에 70% 이상이 감소되었고 6분 후에는 약 90%가 감소하였다. 보다 높은 분무기 유속에서는, 다른 양이온성 지질을 포함하는 제형[참조: Schwartz et al., 1996]의 경우의 형질감염 효율 상실이 훨씬 더 컸다. 흥미롭게도, PEI-pCMVβ의 N:P=5 제제는 분무 증가에 따라 형질감염 효율의 현저한 증가를 나타냈으며, 이는 DNA의 일부가 분해됨으로써 N:P 비를 효과적으로 증가시킨다는 것을 반영할 수 있다.
실시예 17
비내 점적 주입 후 리포좀-DNA 복합체와 PEI-DNA 복합체의 생체내 형질감염 효율 비교
PEI:pCMV-HiCAT 제형을 Balb/c 마우스에게 비내 점적 주입함으로써 생체내에서 시험한 경우(도 6A), PEI-DNA로부터의 CAT 발현이, 지금까지 생체내 형질감염에 가장 안정적이고 유효한 것으로 알려진 양이온성 지질 제형인 BGTC:DOPE:pCMV-HiCAT를 사용하여 수득된 것 보다 폐에서 10 내지 20배 정도 더 큰 것으로 나타났다. PEI-매개 발현은 폐에 대해 보다 특이적인 것으로 여겨지는데, 여기서는 형질감염이 코에서 보다 약 20배 정도 더 높았다. 이와는 달리, 점적 주입된 양이온성 지질계 제형에 의해 매개된 발현은 폐에서 보다 코에서 더 높았다. 동물에게 PEI-루시퍼라제 또는 BGTC:DOPE-루시퍼라제를 점적 주입한 경우에도 유사한 데이타가 수득되었다(도 6B).
또한, 비내 점적 주입을 사용하여 상이한 PEI-pCMV-HiCAT 제형의 생체내 형질감염 효율을 비교하였다. 5 내지 20의 N:P 비를 검사한 경우, 10 및 20의 비는 필적할 만한 생체내 CAT 발현 수준이 되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PEI-DNA(N:P 비 10) 농도를 7배 증가시킴으로써, 동일한 점적 주입 용적에서 3배나 더 많은 용량의 DNA를 전달하게 해주는 경우에는, 생체내 리포터 유전자 발현이 추가로 증가하지 않는 것으로 관찰되었다.
실시예 18
에어로졸 전달 후 리포좀-DNA 복합체와 PEI-DNA 복합체의 생체내 형질감염 효율 비교
PEI-pCMV-HiCAT 및 BGTC:DOPE-pCMV-HiCAT 제형(동일한 농도의 DNA를 사용함)을 분무화하여 전달한 경우, 폴리에틸렌이민은 폐에서의 발현에 있어 지질 보다 10배 정도 우수한 벡터였으며(도 7), 이는 점적 주입에 의해 수득된 상기 결과를 확인시켜 주었다. 또한, 이러한 점적 주입 결과와 일치하게, 에어로졸 전달법은 PEI계 제형의 경우 코에서 보다 폐에서 약 20배 더 큰 형질감염을 가져다 주는 반면, 에어로졸화 BGTC:DOPE-pCMVβ는 코와 폐에서 필적할 만한 발현 수준을 가져다 주는 것으로 관찰되었다. 루시퍼라제의 PEI계 제형을 에어로졸로 전달한 경우에도, 이들의 폐 및 코에서의 상대적 유효성에 관해 유사한 결과가 나타났다.
실시예 19
PEI-DNA 백신의 에어로졸 및 점적 주입 투여에 의한 유전적 면역화
발현 벡터의 에어로졸 투여에 대한 잠재적으로 유용한 한 가지 적용 분야는 DNA 백신의 전달이다. 이 방법에 의해 면역화가 이루어질 수 있는지를 결정하기 위하여, pCMV-hGH 플라스미드-PEI 제제(N:P 비 10)를 에어로졸과 비내 점적 주입을 통하여 투여하고, 양성 대조군으로서, 노출된 DNA를 근육내 주사하였다. 도 8에 도시한 바와 같이, 처리 결과 모든 그룹에서 사람 성장 호르몬에 대한 고 수준의 혈청 항체가 생성되었다. 실질적인 항체 반응은 2주째 나타나며, 4주 내지 8주에서는 안정 상태를 유지하였다. 도 8에는, 면역화되지 않은 동물에서의 0.1의 배경 OD와 비교해서, 혈청 1:500 희석율에서의 광학 밀도가 제시되어 있다. 8주에서의 이들 혈청의 평균 역가는 각각 에어로졸 그룹의 경우에는 1:4,000이고, 비내 그룹의 경우에는 1:8,000이며, 근육내 그룹의 경우에는 1:16,000이었다. 그러나, 도 8에 도시된 바와 같이, 모든 그룹은 근육내 주사를 이용한 선행 결과와 유사한 상당히 큰 표준 편차를 지니고 있다. 따라서, 개개의 마우스의 반응이 고도로 가변적이긴 하지만, 플라스미드-PEI 제제의 단일 투여로부터 8주 내내 항체가 존속한다는 것은, 이러한 면역화 방법이 비내 또는 에어로졸 경로에 의해 제공된 경우에 중요하게 적용될 수 있다는 것을 제시해준다.
유전 물질을 폐와 기도에 효율적으로 전달하는 것은 광범위한 폐 질환을 치료하기 위해 표적화된 비침해성 접근법이다. 그러나, 바이러스성 전달과 관련된 병리학적 및 면역적 우려를 최소화하기 위하여 비-바이러스성 DNA 전달 벡터를 사용한 경우에는 폐 부위의 형질감염이 일반적으로 비효율적이었다. 이는 부분적으로는, 유전자 제제를 전달하기 위해 폐의 환경에 접근하는 것이 불가능하였기 때문이었다. 또한, 제트 분무화와 연관된 활성 상실이 이러한 폐 표적물로의 DNA 전달 방법의 가치를 제한하였다[참조: Crook et al., 1996; Schwartz et al., 1996]. 현 연구 결과, DNA와 다가양이온성 중합체 폴리에틸렌이민과의 복합체가 제트 분무화로써 전달될 때 상당한 기능적 안정성을 지니고 있으므로, 유전자를 폐에 전달하는데 잠재적인 수단을 제공해주는 것으로 밝혀졌다.
DNA 전달용 벡터로서 사용되어 온 기타 비-지질 다가양이온성 중합체에는, 형질 감염을 낮은 수준으로만 매개하지만 세포내 흡수를 촉진시키는 제제의 접합이나 혼입에 의해 상당히 증진되는 폴리-L-리신[참조: Wu & Wu, 1988; Tang & Szoka, 1997]; 및 폴리아미도아민 덴드리머[참조: Haensler & Szoka, 1993]이 포함된다. 또한, 트랜스페린[참조: Kircheis et al., 1997; Ogris et al., 1998; Ogris et al., 1999]과 같은 리간드와 공유적으로 접합된 변형된 형태의 PEI가 특정 세포 유형을 높은 특이성으로 표적시키는 것으로 밝혀졌다. 제형을 전신 투여한 경우에 폐에서의 PEI-매개 형질감염이 보고된 바는 있으나[참조: Goula et al., 1996)], 지금까지 에어로졸 전달용 DNA 벡터로서 비-지질 중합체를 사용하는 것에는 거의 관심이 집중되지 않았다. 본원에 제시된 결과는 PEI계 제형이 제트 분무화 공정 동안에 플라스미드 DNA에 대한 상당한 수준의 안정성을 제공한다는 것을 보여준다. 몇몇 PEI계 제형의 경우에는, 형질감염이 심지어 분무화 공정에 의해 증진되는 것으로 여겨진다. 따라서, 이것이 양이온성 지질 보다 에어로졸에 의한 폐로의 전달 후 형질감염의 더 유효한 매개인자인 것으로 여겨지며, 비교적 무독성인 부가의 이점을 지니고 있다. 폴리에틸렌이민이 부위-특이적 리간드에 용이하게 접합될 수 있다는 사실은 에어로졸 전달된 PEI계 제형의 다양성을 증가시킨다.
열에 불안정한 혈청 인자(들)에 의한 PEI-매개 형질감염의 증진 효과는 흥미를 자아내는 일이지만, 생체내 유전자 전달과 연관된 기전(들) 또는 이러한 전달 결과는 현재 공지되지 않았다. 이러한 효과가 혈청을 100℃로 가열한 경우에 상실된다는 사실은 이것이 스테로이드와 같은 작은 열 안정성 인자와 관련이 있다는 가능성을 반증해준다. 상기 증진 효과가 56℃에서는 영향을 받지 않는다는 사실은 보체 시스템에 대한 역할을 반증해준다. 이러한 형질감염-증진 인자의 동정은 궁극적으로, 생체내 유전자 전달의 전반적인 효율을 개선시키는데 유용한 것으로 입증될 것이다.
2개의 별개의 리포터 유전자를 사용하는 경우에 주목된 폴리에틸렌이민과 양이온성 지질(BGTC:DOPE)의 상이한 국부 특이성(폐 대 코)은 예기치 못한 발견이다. 동일한 분무기로부터 전달된 입자 크기가 유사하다고 가정하면, 관찰된 차이점은 점액 섬모 작용에 대한 두 종류 입자의 반응 차이점에 기인된 것이거나 비내 및 폐 부위에서의 세포 반응 차이점에 기인된 것일 수 있다. 이러한 발견은 전달된 유전자의 비내 발현이 바람직하지 못한 결과를 가져올 수 있는 적용 분야에 중요할 수 있다. 또 다른 한편, 이들 상이한 전달 벡터는 상이한 임상적 적용 분야에 적합할 수 있다. 유전적 면역화 분야에서는, 본원에 보고된 연구 결과가, PEI-DNA 복합체를 폐 조직에 전달하는 기술을 사용하여 플라스미드를 단일 투여한 경우에 지속적이고도 높은 수준의 항체 반응이 달성될 수 있다는 것을 제시해 준다.
PEI-DNA 제형이 에어로졸에 의해 폐 말초에 효율적으로 축적될 수 있기 때문에[참조: Weibel generations 17-23], 생체내에서 호흡기 상피 세포의 PEI-매개 형질감염은 플라스미드 DNA와 PEI를 폐포 공간에서 내인성 계면활성 지질과 단백질에 노출시켜야 할 것이다. 처리되지 않은 마우스로부터 유도된 기관지폐포성 세정 유액과 합성 계면활성제(Exosurf) 모두를 사용하여, PEI-매개 형질감염에 대한 계면활성제의 효과를 시험관내에서 검사하였다. 이들 물질 모두가 PEI-매개 형질감염의 농도-의존적 억제를 가져다 주었지만, 계면활성제의 효과는 양이온성 리포좀-매개 유전자 전달에 대해 보고된[참조: Duncan et al., 1997; Tsan et al., 1997] 것 보다 비교적 낮을 수 있다. 이들 보고서는 플라스미드 DNA와 플라스미드 DNA-양이온성 리포좀 복합체를 기관내 통기시키면, 폐에서 유사한 양의 유전자 발현이 일어난다는 것을 교시하고 있다. 점적 주입하는 경우, 플라스미드-DNA 단독을 사용한 경우 보다 PEI-pCMV-HiCAT를 사용한 경우에 훨씬 더 높은 수준의 폐 발현이 달성되는데, 이는 폐의 계면활성제가 몇몇 양이온성 지질 또는 양이온성 지질:공-지질 제형에 대해 명백하게 행하는 정도로 폴리에틸렌이민의 유전자 전달 특성을 무력화시키지 못한다는 증거를 제공해준다. 따라서, PEI계 제형이, 에어로졸에 의해 각종 폐 질환을 치료하기 위한 비-바이러스성 담체로서 비교적 비효율적인 양이온성 지질에 대한 유망한 대체물이다. 본원에 제시된 이러한 결과는 또한, 유전자 백신의 전달에 대한 가망성을 보여주고 있다.
실시예 20
동물
암컷 Balb/C 마우스(5 내지 7주생)을 다음 실험에 사용하였다.
실시예 21
플라스미드 DNA
세균성 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(p4119, ref.15)를 형질전환된 유전자의 발현을 측정하기 위한 리포터 유전자로서 주로 사용하였다. 이러한 CAT 유전자는 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기(early) 프로모터/인핸서 요소의 제어 하에 있다. CMV 프로모터/인핸서 요소를 삽입함으로써 루시퍼라제 플라스미드(pGL3, Promega, Madison, WI)를 변형시켰으며, 사람 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열은 마이클 배리 박사(Center for Cell and Gene Therapy, Baylor )로부터의 것이었다. 모든 플라스미드를 퀴아겐 칼럼(공급처: Qiagen, Valencia, CA) 상에서 정제하였으며, 내독소를 함유하고 있지 않았다. 이 플라스미드를 260nm에서의 UV 흡광도로 정량화하였다. 아가로즈 겔 분석 결과, 상기 플라스미드가 주로 초나선형인 플라스미드와 소량의 절단된(nicked) 플라스미드의 혼합물인 것으로 나타났다.
실시예 22
PEI-DNA 복합체의 제조
알드리히 케미칼(Milwauke, WI)로부터 PEI(25KDa, 분지됨)를 구입하였다. 폴리에틸렌이민 스톡 용액을 PBS(pH 7 내지 7.5) 중의 4.3mg/ml(질소 중 0.1M) 농도로 제조하였다. PEI와 DNA를 물 5ml에서 각자 요구되는 농도로 별도로 혼합하였다. PEI 용액을 서서히 와동시키고, DNA 용액을 이에 가하여 최종 용적이 10ml가 되게 하였다. 이 혼합물을 분무화 이전에 약 15 내지 20분 동안 실온에서 정치시켜 두었다. 이로써 생성된 충전 비를 PEI 질소:DNA 인산염(N:P)으로서 나타내는데, 이는 DNA가 3nmol/㎍의 인산염을 지니고 있으며 0.1M PEI 1㎕가 아민 질소 100nmol을 지니고 있다는 것을 고려하여 산정할 수 있다. 10:1 N:P 비는 1.29:1 PEI:DNA 중량비에 상응한다.
실시예 23
PEI-DNA 복합체의 에어로졸 전달
에어로졸 전달하기 전에 테이프로 밀봉시킨 플라스틱 우리에 마우스를 놓아 두었다(16). 이는 무제한적인 전신 에어로졸 노출 시스템이다. 공기 또는 5% CO2 함유 공기를 이용하여 10L/분 유속으로 에어로테크 II 분무기(AT-II)(CIS-US, Inc., Bedford, MA)를 사용하여 PEI-DNA 복합체를 에어로졸 투여하였다. AT-II는 말초 폐 전달을 위해 1 내지 2㎛ 질량 평균 공기역학적 직경(MMAD)의 최적 범위로 에어로졸을 생성시키는 것으로 입증된 고 출력의 효율적인 분무기이다(17,18). 앞서 기재된 방법에 의해 안데르센 케스케이드 임팩터(Andersen Cascade Impactor: Andersen Instruments, Atlanta, GA)를 사용한 결과, PEI-DNA 에어로졸 입자 크기는 기하 표준 편차(GSD) 2.9를 나타내는 1.6㎛ MMAD인 것으로 산정되었다(18). 건조 공기의 공급원(Aridyne 3500, Timeter, Lancaster, PA)을 공기 압축기와 CO2 탱크에 부착된 버드(Bird) 3M 기체 블렌더(Palm Springs, CA)에 전달한다. 이로써 생성된 공기와 CO2의 혼합물을 상기 분무기에 전달한다. 피라이트(Fyrite) 용액(공급처: Bacharach, Pittsburgh, PA)을 사용하여 공기 중 5% CO2의 최종 농도를 측정하였다. 10ml 용액의 분무는 대략 30분 동안 수행되었다.
실시예 24
CAT 검정
마우스를 마취시키고, 각 시점 후에 희생시키며, 폐와 기타 조직을 수거한 다음 즉시 동결시켰다. 생체내 발현을 측정하기 위하여 CAT ELISA 검정용 키트(공급처: Boehringer Mannheim Gmbh, Mannheim, Germany)를 사용하였다. Wig-L-Bug 비이드 균질기(공급처: Crescent Dental Mfg., Lyons, IL)를 사용하여 상기 조직을 700㎕ CAT 검정용 용해 완충액에서 균질화하였다. 이 균질물을 원심분리시킨 후, 이 추출물 200㎕를 96 웰 플레이트 포맷으로 수행된 CAT ELISA 검정에 사용하였다. 미세역가 플레이트 판독기(공급처: Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 흡광도를 판독하였다. 실험받은 적이 없는 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 정제된 CAT 효소를 이용하여 제조된 표준 곡선을 사용하여 조직 추출물 1ml 당 CAT ng으로서 CAT 활성을 표현한다. 제조업자의 제안에 따라서 상기 검정법의 민감도를 추가로 증강시켜, 0.1 내지 0.3pg/웰 정도로 낮은 수준의 CAT 단백질도 탐지할 수 있게 되었다.
실시예 25
루시퍼라제 검정
마우스를 마취시키고 희생시킨 다음, 폐를 수거하였다. 루시퍼라제 검정용 키트(공급처: Promega, Madison, WI)를 사용하여 루시퍼라제 발현을 측정하였다. Wig-L-Bug 비이드 균질기를 사용하여 상기 폐를 1ml의 루시퍼라제 검정용 용해 완충액에서 균질화하였다. 이 균질물을 원심분리시킨 후, 추출물 10㎕를 루시퍼라제 기질 50㎕에 가하고 발광측정기(공급처: Microlumat LB 96 P, EG&G Berthold, Germany) 상의 96 웰 플레이트에서 10초 동안 발광성을 판독하였다. 실험받은 적이 없는 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 루시퍼라제 활성을 RLU/10 sec/추출물 ml로서 표현한다. 이 시스템에서는, 107 RLU가 프로메가 (Promega)로부터의 정제된 루시퍼라제를 사용한 루시퍼라제 1ng에 상응한다.
실시예 26
조직 절편의 조직학적 분석
마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 복부 대동맥을 통해 방혈시킴으로써 희생시켰다. 폐를 분리시키고, 캐뉼라를 삽입한 다음, 10% 중성 완충된 포르말린을 사용하여 팽창시켜 고정시키고, 파라핀에 봉매시킨 다음, 조직학적 분석을 위해 처리하였다. 박편을 4㎛로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용하여 염증 또는 독성의 모든 징후를 조사하기 위해 상기 절편을 현미경으로 관찰하였다. 상기 수단을 비교하기 위하여 단방향 분산 분석(ANOVA)을 수행한 후, 짝을 이루지 않는 투-테일드 스튜던츠 t-시험(a two-tailed unpaired Student's t-test)을 수행하였다. p가 ≤0.05인 경우에 유의적인 것으로 간주되었다.
실시예 27
5% CO2를 사용한 PEI-DNA 복합체의 분무
5% CO2로 PEI-DNA 복합체를 분무시키는 것은 정상적인 공기와 비교해서 폐에서 형질전환된 유전자 발현을 증진시킨다. 공기중 5% CO2로 호흡하는 것은 마우스와 사람에서의 일 호흡량과 호흡 횟수의 증가와 연관이 있었다(19,20,21). 5% CO2를 함유하는 에어로졸을 흡입함으로써, 공기에 의해 전달된 에어로졸을 이용한 경우에 성취된 것과 비교해서 에어로졸 입자를 더 많이 흡입하게 되고, 이에 따라 형질전환된 유전자 발현율이 더 높아질 수 있다. 이를 연구 조사하기 위하여, PEI-DNA 복합체를 정상적인 공기 또는 5% CO2 함유 공기를 사용하여 에어로졸에 의해 Balb/C 마우스에 전달하였다. N:P 비 10:1의 고정량의 CAT 플라스미드(1mg/용액 10ml)를 지시된 바와 같이 30분 동안 에어로졸 투여하였다. 24시간 후에 폐를 수거하고, CAT 검정을 수행하여 형질감염 정도를 측정하였다. 5% CO2 함유 공기는 공기 단독으로만 분부된 에어로졸과 비교해서 CAT 탐지 수준을 3배 증가시켰다(p=0.001)(도 9).
실시예 28
PEI에 의한 DNA 전달의 용량 의존성
형질전환된 유전자의 발현을 추가로 최적화하기 위하여, N:P 비를 10:1로 일정하게 유지시키고, DNA 양을 에어로졸화 용액 10ml 당 250㎍ 내지 4mg으로 다양하게 하였다. 이로써, 저장기 농도가 증가했을 뿐만 아니라 에어로졸 산물로 분무된 DNA 총 량이 증가한다. 당해 복합체를 5% CO2 함유 공기를 사용하여 에어로졸 투여하였으며, 2mg DNA가 폐에서 가장 높은 CAT 발현 수준을 제공해주었다(도 10). 250㎍ DNA로 측정된 CAT 수준은 대조군 폐와 통계상 상이하지 않았다(p=0.34). 또한, 4mg의 DNA을 N:P 비 10:1로 10ml에 용해시킨 경우, 일부 가시적인 DNA 침전이 일어났는데, 이는 폐에서 검출된 CAT 수준이 2mg과 비교해서 더 이상 추가로 증가하지 않았기 때문일 수 있다(p=0.51).
실시예 29
PEI-DNA 비율의 최적화
생체내 에어로졸 전달을 구현할 수 있는 충전 비율은 결정하기 위해, 상이한 PEI-DNA(N:P) 비를 대상으로 하여, 폐를 형질감염시키는 이들의 능력을 평가하였다. DNA 양을 2mg으로 일정하게 유지시키고 폴리에틸렌이민 농도를 다양하게 하여 5:1, 10:1, 12.5:1, 15:1, 17.5:1 및 20:1의 비를 수득하였다. 이들 비율은 앞서의 시험관내 및 생체내(점적 주입에 의함) 연구를 기준으로 하여 선택하였다. 5% CO2 함유 공기를 사용하여 당해 복합체를 에어로졸 투여하였다. 15:1의 N:P 비는 폐에서 가장 높은 CAT 발현 수준을 제공하는 반면, 5:1의 비는 극히 낮은 수준의 CAT 발현을 가져다 주었다(도 11). 10:1, 12.5:1, 17.5:1 및 20:1 비율 간에는 통계학상 차이점이 없지만(p>0.1), 15:1과 20:1 간에는 유의차가 있으며(p=0.05) 10:1과 15:1 간에도 유의차가 있었다(p=0.014).
CAT 이외의 플라스미드에 대한 최적 비를 결정하기 위하여, 상이한 N:P 비를 대상으로 하여, 폐에서의 루시퍼라제 유전자 발현을 시험하였다. 평가된 비율은 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1 및 40:1이었다. 루시퍼라제에 대한 최적 곡선은 CAT와 비교해서 우측으로 이동하였으며, 20:1에서 가장 높은 발현이 이루어졌다(다른 비에 비교해서 p<0.05)(도 12). 이는 상이한 플라스미드가 상이한 N:P 비를 요구할 수도 있다는 것을 제시해준다.
실시예 30
단일 에어로졸 전달 후 시간 경과에 따른 CAT 발현
단일 에어로졸 전달 후 CAT 발현의 영속성을 다음에 분석하였다. 이는 치료학적 연구를 위한 치료 섭생을 계획하는데 중요한 정보이다. 5% CO2 함유 공기를 사용하여, 2mg의 CAT 플라스미드를 두 가지 상이한 N:P 비 15:1 및 10:1로 마우스에게 에어로졸 투여하였다. 10:1 그룹에 대해 검사된 상이한 시점은 에어로졸 노출 후 1, 2, 3 및 6일이었다. 폐와 기타 조직을 상이한 시점에서 수거하고 즉시 동결시켰다. 마지막 시점(6일) 후 모든 조직을 동시에 검정하였다. 15:1 그룹의 경우에는, 마우스를 에어로졸 처리 후 1, 3, 7 및 10일에 희생시켰다. 각 시점 후 폐를 수거하고 동결시키며, 마지막 시점(10일) 후에 CAT 단백질을 검정하였다.
검사된 양 N:P 비의 경우, CAT 발현은 24시간째에 가장 높고, 3일간에 걸쳐 일정하게 유지된다(15:1 비의 경우에는 1일과 3일 간에 통계학적 유의성이 없고, p=0.4; 10:1 비의 경우에는 p가 0.12이다)(도 13A 및 13B). CAT 수준은 1주 후에 피크 수준의 약 50%로 떨어지고 심지어 10일 후에도 상당한 수준이 탐지되었다(대조군과 비교해서 p=0.001).
실시예 31
형질전환된 유전자의 조직 분포
DNA 벡터를 정맥내 또는 복강내 전달하게 되면, 일반적으로 각종 조직에서 발현이 이루어진다. PEI-DNA의 에어로졸 전달이 또한 전신 유전자 전달을 가져다줄 수 있는지를 결정하기 위하여, 상기 실험(10:1 그룹)과 동일한 마우스 그룹으로부터 상이한 조직을 수거하고, 마지막 시점 후에 CAT 검정을 수행하였다. 검사된 조직은 폐, 간, 비장, 신장, 흉선, 뇌 및 혈액이었다. 폐가 아닌 조직에서 검출된 CAT 수준은 극히 낮으며, 대조군 조직과 유의차가 없는데(모든 조직에 대해 p>0.1)(도 14), 이는 PEI-DNA 복합체의 에어로졸 전달이, 전신으로는 전달되지 않으면서 고도로 특이적인 폐의 유전자 발현을 가져다 준다는 것을 지시해 준다.
실시예 32
조직학적 분석은 어떠한 염증 징후도 나타내지 않는다
PEI-DNA 복합체의 에어로졸 전달이 본 시스템에서 어떠한 종류의 독성이나 급성 염증을 유발할 수 있는지를 결정하기 위하여, 2mg의 CAT 플라스미드를 N:P 비 15:1로 PEI와 복합체를 형성시키고, 5% CO2 함유 공기를 사용하여 마우스를 30분 동안 에어로졸에 노출시켰다. 이 마우스를 24시간 후에 희생시키고, 폐를 포르말린에 고정시킨 다음 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 폐는 도 15에 도시된 바와 같이 어떠한 조직학적 비정상을 나타내지 않았다. PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐의 유전자 전달을 최적화하기 위하여 5% CO2 함유 공기를 사용하는 것은 폐에 고도로 특이적이고 안전한 것으로 보인다.
실시예 33
동물 연구에서의 PEI-항종양 유전자 조성물 효과
도 15 및 16은 동물 연구에서의 PEI-항종양 유전자 조성물의 효과를 도시한 것이다. 도 15는 PEI와 p53 유전자의 조성물 및 PEI와 망막아세포종 유전자의 조성물이, 4주 동안 매주 2회씩 에어로졸에 의해 투여된 경우에 흑색종 동물 모델에서 종양 성장을 상당히 저하시켰다는 것을 도시하고 있다. 도 16은 PEI와 p53 유전자의 조성물, 및 PEI, p53 유전자 및 항암제인 9-니트로캄포테신(9-NC)의 조성물이, 4주 동안 매주 2회씩 에어로졸에 의해 투여된 경우에 선암 동물 모델에서 종양 성장을 상당히 저하시켰다는 것을 도시하고 있다. 도 17은 PEI와 p53 유전자의 조성물이, 4주 동안 매주 2회씩 에어로졸에 의해 투여된 경우에 사람 골육종 폐 전이(SAOS-LM6)의 누드 마우스 모델에서 종양 성장을 상당히 저하시켰다는 것을 도시하고 있다. 에어로졸 치료 요법은 동물에게 종양 세포를 이식한지 8주 후에 개시하였다. 이러한 동일한 실험에서, PEI 단독 및 CAT 또는 IL-12 유전자(비특이적 대조군으로서)와 조합된 PEI가, 처리되지 않은 대조군 보다 상당히 더 낮은 억제를 초래하지는 않았다.
본 연구에서, PEI-DNA를 분무하기 위하여 5% CO2 함유 공기를 사용한 결과, 분무화 동안에 통상적인 공기를 사용하여 달성된 것에 비해 증가된 수준의 폐에서의 유전자 발현이 나타났다. 이는 5% CO2 존재하에서의 일 호흡량과 일분 호흡량 증가에 기인된 것일 수 있다. 에어로졸 중에 5% CO2를 사용하게 되면, 설치류의 폐에 약물-리포좀 입자가 4 내지 5배 정도 더 많이 축적된다. 5% CO2 함유 공기를 사용하여 PEI-DNA 에어로졸을 전달하는 경우, 마우스가 보다 깊고 보다 신속하게 호흡하는 것이 가시적으로 관찰되었는데, 이는 폐에서의 형질전환된 유전자 발현 증가가 일 호흡량과 호흡 횟수 증가 및 이에 따른 에어로졸 입자 축적 증가에 기인된 것일 수 있다는 것을 제시해준다. 그러나, 증강된 CO2가, 몇몇 기타 생리학적 파라미터를 변화시킴으로써 PEI-DNA 복합체의 형질감염 효율에 대해 효과를 지닐 수 있다. 이들 관찰을 근거로 하여, 5% CO2 함유 공기가 기타 중합체-DNA 또는 양이온성 지질-DNA 복합체의 에어로졸 전달에 사용될 수 있고 유사한 결과를 제공할 수 있다. 5% CO2는 사람이 잘 견딜 수 있는 수준이고 일분 호흡량을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 이러한 전략을 또한 폐 질환이 있는 사람에게 잠재적으로 적용할 수 있다.
비히클로서 PEI를 사용하여 에어로졸에 의해 유전자 전달하기 위한 기타 파라미터를 또한 최적화시켰다. 모든 양이온성 비히클과 음전하를 띤 DNA 간의 전하 상호작용은 당해 복합체의 형질감염 효율을 결정하는 중요한 요인이다. 에어로졸에 의한 유전자 전달은 상이한 조건을 요구할 수 있다. 15:1의 N:P 비는 본 시스템에서 가장 높은 수준의 CAT 발현을 제공하고, 5:1의 비는 다른 비율과 비교해서 극히 낮은 발현 수준을 가져다 주었다.
이와는 달리, 루시퍼라제에 대한 가장 높은 발현은 20:1의 N:P 비에서 수득되었다. 이는 CAT 플라스미드와 비교해서, 구조적으로 상이한 PEI 복합체를 생성시키는 상이한 크기의 루시퍼라제 플라스미드에 기인된 것일 수 있다. 또한, 이는 플라스미드 순도차와 초나선형 구조 비율에 기인된 것일 수 있다. 이들 두 플라스미드의 최적의 N:P 비는 여전히 상당히 중첩된다. 상이한 플라스미드에 대한 최적 비는 상이할 수 있다. 실험상 가변성을 고려하면, 10:1 내지 20:1의 비율이 적합하게 작용한다. 10:1 보다 낮은 비는 폐에서 극히 높은 형질감염을 제공하지 못하였다.
CAT 발현의 용량 반응은, 에어로졸화 용액 10ml 당 PEI와 복합체를 형성한 DNA 2mg이 이러한 CO2 증강된 전달 시스템에서 가장 우수한 발현을 제공해준다는 것을 나타낸다. 이러한 발현은 DNA 250㎍/용액 10ml를 마우스에게 분무한 경우에 무시할 만한 수준으로 급격히 떨어진다. PEI와 복합체를 형성한 DNA 4mg(각종 상이한 비율)는 DNA를 일부 침전시키는데, 이것이 아마도 형질감염 저하의 원인이다. 전달된 DNA의 농도와 양 모두가 증가된다는 것을 인지해야 한다.
에어로테크 II 분무기로부터의 분무 산출량은 대략 80%인 것으로 산정되었다. 앞서 기재된 바와 같이 전유리 임핀저(AGI)를 사용하여 평가한 결과, 저장기 DNA의 약 72%가 흡입실로 전달되었다. 나머지는 T-연결기와 튜빙에 포획되었다. 쥐가 절대적으로 코로 호흡한다는 것, 폐의 생리학(일분 호흡량 및 축적 분획) 및 에어로졸의 산출 농도(4.8㎍/L)를 기준으로 한, 마우스의 폐에 축적된 DNA의 양은 에어로졸 노출 30분 동안에 대략 4 내지 5㎍(출발 저장기 농도 2mg DNA/ 10ml 용액의 경우)인 것으로 평가된다. 이들 산정치는 정상적인 공기 호흡을 기준으로 한 것이며, 5% CO2의 존재하에서는 침착이 보다 높을 수 있는데, 이는 일 호흡량과 호흡 횟수 증가에 따른 것이다.
CAT 발현을 이용하여 또한 시간에 따른 유전자 발현을 모니터하였다. 단일 에어로졸 노출 후, 폐에서의 CAT 발현은 24시간째에 가장 높으며, 1주 후에는 피크 수준의 약 50%로 떨어진다. 심지어 10일 후에도 매우 상당 수준의 발현(피크 수준의 30%)이 나타났다. 이는 폴리에틸렌이민 에어로졸 전달 후 유전자 발현의 영속성이 각종 임상적 적용에 적합한 수준 이상일 수 있다는 것을 제시해준다. 본 연구에서 10일 이하의 유전자 발현 영속성은 유전자를 점적 주입하거나 에어로졸 전달하기 위해 양이온성 지질을 사용하는 기타 연구에서 보고된 것과 유사하거나 이 보다 더 크다.
조직 분포 데이타는 본 시스템에서 에어로졸 전달 후 유전자 발현이 폐로 한정된다는 것을 보여주는데, 이는 최소의 전신 전달을 지시해준다. 폐와는 달리, 유전자를 정맥내 또는 복강내 투여를 통해 전달한 경우에 통상적으로 탐지 가능한 수준의 발현을 나타내는 조직, 예를 들면, 간, 비장 및 신장은 PEI-DNA 에어로졸에 의해 전달될 때 무시할 만하거나 탐지할 수 없는 수준의 CAT 발현을 나타내었다. 이는 관심있는 유전자의 발현을 폐로만 한정하고자 하는 경우에 중요하다. 에어로졸 전달은 당해 입자를 폐 전반에 걸쳐 비-침습적이고도 균일하게 분포시키는 것을 도와준다.
마지막으로 중요하게도, 폐는 어떠한 염증 징후도 나타내지 않았다. 박편을 검사한 경우 폐에 대한 어떠한 염증성 세포 침윤이나 손상도 없었다. 1주 후에도 고 수준의 발현이 탐지되긴 하였지만, 몇몇 요법들은 반복적이고도 빈번한 유전자 전달을 요구할 것이다.
유전자를 에어로졸에 의해 전달할 경우에는 5% CO2 함유 공기가 유전자 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 이 발현은 폐에서만 주로 일어나며, 에어로졸로 전달한지 1주 후에도 상당히 높은 수준이 검출된다. PEI는 또한, 생체내 발현에 최적인 농도에서 무-독성인 것으로 보인다. 분지된 PEI-DNA 복합체의 에어로졸 전달은 바이러스성 및 양이온성 지질 벡터 매개된 유전자 전달에 대한 저렴한 대체 방법을 나타내므로, 낭포성 섬유증과 페암과 같은 질환에 유용하다.
다음 참조 문헌이 본원에서 인용되었다:
Figure 112001024965146-pct00001
본 명세서에서 언급된 모든 특허 또는 공보는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련인의 수준을 지시해준다. 추가로, 이들 특허 및 공보는, 각각의 개별적인 공개공보가 구체적이고도 개별적으로 참조문헌으로 인용된다고 지시되는 경우와 동일한 정도로 본원에 참조문헌으로 인용된 것이다.
당해 분야의 숙련인은 본 발명이 당해 목적을 수행하고 언급된 용도 및 이점 뿐만 아니라 본원에 내재된 목적, 용도 및 이점을 획득하도록 잘 적응시킨 것이라는 것을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명의 실시예는 본원에 기재된 방법, 과정, 처리, 분자 및 특정 화합물과 함께, 대표적인 바람직한 양태이며, 예시적이고, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. 청구의 범위로써 규정되는 바와 같이 본 발명의 요지 내에 포괄되는 본 발명의 변화 및 기타 용도가 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.

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  14. 폴리에틸렌이민; 및 DNA, 치료학적 유전자, RNA, 촉매적 활성 핵산, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 변형된 핵산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 유전적 거대분자를 포함하고, 호흡기를 통해 투여되는 제트 분무식 에어로졸 조성물.
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  17. 제14항에 있어서, 유전적 거대분자가 치료학적 유전자를 암호화하는 DNA인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 치료학적 유전자가 발현 조절 서열을 포함하는 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 치료학적 유전자가 낭포성 섬유증 트랜스멤브레인 컨덕턴스 조절인자 유전자, HSV 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자, 종양 억제인자를 암호화하는 유전자, 사이토킨을 암호화하는 유전자, 종양-특이적 항원을 암호화하는 유전자, 감염성 제제-특이적 항원을 암호화하는 유전자 및 표적화 항체를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 폴리에틸렌이민 중의 치료학적 유전자의 최종 농도가 0.1 내지 10㎍ DNA/50nmole 폴리에틸렌이민 질소/ml인 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 0.1㎍ DNA/20nmole 폴리에틸렌이민 질소/ml 내지 10㎍ DNA/150nmole 폴리에틸렌이민 질소/ml의 농도로 제형화되는 조성물.
  22. 제14항에 있어서, 혈청을 추가로 포함하는 조성물.
  23. 삭제
  24. 제22항에 있어서, 폴리에틸렌이민이 트랜스페린을 갖는 세포-특이적 리간드와 공유적으로 접합되는 조성물.
  25. 제 14항, 제 17항 내지 제 22항 또는 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이
    유전적 거대분자를 용액에 용해시키는 단계;
    폴리에틸렌이민을 용액에 용해시키는 단계;
    상기 용해된 유전적 거대분자와 상기 용해된 폴리에틸렌이민 간에 복합체를 형성시킴으로써, 폴리에틸렌이민-유전적 거대분자 조성물을 제조하는 단계 및
    상기 폴리에틸렌이민-유전적 거대분자 조성물을 분무 가능한 장치 속에 배치하여 분무식 에어로졸을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 조성물.
  26. 제 14항에 있어서, 경구 흡입, 비내 흡입, 및 경구와 비내 흡입 둘다로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 수단에 의해 투여되는 조성물.
  27. 제 14항에 있어서, 낭포성 섬유증, 천식, 폐암, 식도암, 결장암, 백혈병, 유방암, 육종 및 흑색종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환의 치료를 위해 투여되는 조성물.
  28. 제 14항에 있어서, 10% 이하의 이산화탄소 기체를 포함하는 공기 혼합물로 투여되는 조성물.
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