KR100401022B1 - 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암제-폴리에틸렌이민(polyethylene imine) 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민에 단일 또는 복수의 소수성 항암제를 결합시켜 소수성 항암제를 수용화시키고 복수 항암제를 단일 제제화시킬 수 있는 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체는 촉매 및 계면활성제 없이 제조되어 부작용 및 독성이 낮고, 수용액내에서의 안정성 및 온도 안정성이 우수하여 수용액에서 높은 용해도와 약효 지속성을 나타내며, 다양한 소수성 항암제를 단일 제제화시켜 암세포의 내성을 유발시키지 않으므로 종양을 효과적으로 치유할 수 있는 화학요법으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법{Anti-cancer drug-polyethylene imine complex and a preparation method thereof}
본 발명은 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민에 단일 또는 복수의 소수성 항암제를 결합시켜 소수성 항암제를 수용화시키고 복수 항암제를 단일 제제화시킬 수 있는 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
제일 처음으로, 현재까지 다양한 항암제가 개발되어 암을 치료하는데 이용되고 있는데, 구체적으로 탁솔(Taxol), 시스플라틴(cisplatin), 아드리아마이신(adriamycin), 빈브라스틴(vinblastine), 에토포사이드(etoposide), 악티노마이신 D(actinomycin D), 블레오마이신(bleomycin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 알킬레이팅 화합물(alkylating agent) 등이 항암제로 개발되어 이용되고 있다.
상기 항암제는 유기용매에 용해되는 소수성 화합물이므로 계면활성제를 이용하여 수용화시킨 후 임상에 이용하고 있는데, 계면활성제로는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 2 분자와 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 1 분자로 이루어진 삼중 공중합체 고분자인 폴록사머(poly[ethylene oxide-propylene oxide-ethylene oxide])와 폴리아미노산(polyamino acid) 등이 이용되고 있다. 그러나, 계면활성제를 이용하여 수용화된 항암제는 수용액내에서의 안정성 및 온도 안정성이 낮아 수용액내에서 침전될 수 있고 특정 온도에서만 사용 가능하며 장기간 동안 보관하면서 사용될 수 없다는 단점을 가지고 있다. 또한,계면활성제를 이용하여 항암제를 수용화시킬 경우에는 계면활성제로 인한 부작용이 유발될 수 있으며, 계면활성제내의 항암제 함량이 낮다는 단점을 가지고 있다.
상기와 같은 단점을 해결하기 위하여 항암제의 관능기에 수용성 고분자가 결합된 수용성 복합체형 항암제가 개발되었는데, 상기 수용성 복합체형 항암제는 수용액에서 높은 용해성을 나타내나, 항암효과가 감소되며 고분자와 항암제를 결합시킬 때 사용되는 촉매로 인하여 신체에 치명적인 독성을 유발시킨다는 문제점을 가지고 있어 아직까지 실용화되지 못하고 있다.
일례로, 제 4세대 항암제로서 닥나무로부터 추출되는 탁솔은 암세포의 세포질 뼈대를 구성하고 있는 마이크로 튜블(microtubules)에 부착하여 암세포의 성장을 억제함으로써 기존의 다른 항암제보다 탁월한 항암효과를 나타내며, 특히 자궁암 및 유방암에 대해 뛰어난 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있으나, 항암제 중에서 가장 낮은 수용성을 가져 임상에 사용하기가 용이하지 않기 때문에 폴리아미노산 또는 폴록사머 고분자를 결합시켜 탁솔-폴리아미노산 복합체 또는 탁솔-폴록사머 복합체 상태로 임상에 사용하고 있다. 그러나, 상기 고분자내에 함유되어 있는 탁솔의 함량이 매우 낮고 특히, 폴리아미노산을 이용하여 탁솔을 수용화시킬 경우에는 탁솔과 폴리아미노산의 중합에 사용되고 있는 촉매가 완전히 제거되지 않아 촉매가 잔류하게 되고 이로 인하여 부작용이 유발될 수 있으며 탁솔의 항암효과가 약화된다는 문제점을 가지고 있다.
따라서, 수용액내에서의 안정성 및 온도 안정성이 우수하여 수용액내에서 높은 용해도를 나타내고 장기간 동안 보관이 용이하며, 촉매를 사용하지 않아 부작용없이 우수한 항암효과를 나타내는 항암제-고분자 복합체를 개발할 필요성이 요구되고 있다.
한편, 한 종류의 항암제를 장기간 동안 사용하면 암세포에 내성이 유발되어 항암제의 약효가 현저히 감소하게 되는데, 이를 방지하기 위하여 여러 가지 항암제가 혼합된 복수 항암제를 투여하여 암을 치료하는 화학요법이 임상에 적용되고 있다. 그러나, 복수 항암제의 제조시 여러 가지 항암제를 혼합하고 투여하는 과정이 복잡하고 수용성이 낮은 항암제들을 사용할 경우에는 이들끼리 서로 엉켜 침전되므로 실제 투여되는 항암제의 양 보다 흡수되는 항암제의 양이 훨씬 적으며, 여러 가지 항암제를 동시투여하는 것이 아니므로 항암효과가 미약하다는 단점을 가지고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 여러 가지 항암제를 하나의 고분자에 결합시켜 항암제끼리 엉켜 침전되는 것을 방지하면서 복수의 항암제를 동시에 투여하여 단일 항암제의 투여에 의한 암세포의 내성을 방지할 수 있는 복수 항암제의 단일 제제화 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
폴리에틸렌이민은 3 차원적 측쇄화된 구조를 갖는 양이온성 중합체로서 유전자를 세포내로 형질전환시키는 효율이 매우 높은 고분자로 보고되어 있다(Boussifet al., Gene Therapy3, 1074-1080, 1996). 예를 들어, 생체외에서 폴리에틸렌이민을 이용하여 외부 유전자를 3T3 섬유아세포에 형질전환시켰을 경우에는 형질전환율이 96% 이상으로 향상되었고, 생체내에서 마우스(mouse) 뇌세포에 외부 유전자를 형질전환시켰을 경우에는 아데노바이러스(adenovirus)를 이용한 경우와 동일한 수준의 형질전환율이 나타나는 것을 확인하였다(Abdallahet al., Hum. Gene Ther. 7, 1947-1954, 1996). 전술한 바와 같이 세포내로 유전자를 전달하는데 이용하는 폴리에틸렌이민은 가교된 구조 및 높은 전하 밀도를 가지고 있어 플라스미드(plasmid)를 고도로 축합 및 복합화시켜 플라스미드-폴리에틸렌이민 복합체를 형성시키는 것으로 알려져 있는데, 이러한 복합체가 형성되는 기작에 관해서는 아직까지 밝혀져 있지 않다.
상기 플라스미드-폴리에틸렌이민 복합체의 플라스미드에 함입되어 있는 외부 유전자는 폴리에티렌이민과의 복합체 형태로 엔도좀(endosome) 및 리소좀(lysosome)내에 포함되어 세포내로 도입된다. 이렇게 도입된 플라스미드-폴리에틸렌이민 복합체의 폴리에틸렌이민은 pH 변화에 따라 그 구조를 변화시켜 엔도좀 및 리소좀 막을 붕괴시킴으로써 세포질로 방출되는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 폴리에틸렌이민의 아미노기는 상이한 pKa 값을 가지고 있기 때문에 양성자 스폰지(proton sponge)로 작용하여 폴리에틸렌이민에 우수한 완충능력을 부여하는 것으로 밝혀져 있다. 우수한 완충능력을 갖는 폴리에틸렌이민과 플라스미드의 복합체인 플라스미드-폴리에틸렌이민 복합체를 포함하는 엔도좀과 리보좀의 내부 pH가 산성화되면, ATP 분해효소에 의해 양성자가 엔도좀 및 리보좀내로 유입되면서 동시에 음이온 클로라이드(Cl-) 역시 수동적으로 유입되어 엔도좀과 리보좀내 전체 이온 농도가 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 엔도좀과 리보좀내 삼투압이상승하게 되어 엔도좀 및 리보좀의 막이 파괴됨으로써 플라스미드-폴리에틸렌이민 복합체가 세포질로 방출되는 것으로 보고되어 있다(Behret al., Chimia, 51, 34-36, 1997).
폴리에틸렌이민-플라스미드 복합체를 이용하여 세포내로 유전자를 전달하는데에는 고분자량의 폴리에틸렌이민 제제가 바람직한 것으로 알려져 있었으나, 상기 고분자량의 폴리에틸렌이민 제제는 세포에 매우 강한 독성을 나타내고 구조적으로 효소에 의해 가수분해되지 않으므로 세포내에서 생분해되지 않는 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, 현재 50,000 Da 이하의 저분자량을 갖는 폴리에틸렌이민을 유전자 전달용 매개체로 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 현재까지 폴리에틸렌이민을 이용하여 유전자외의 다른 약물을 효과적으로 전달한 연구결과는 보고되어 있지 않다. 따라서, 폴리에틸렌이민을 이용하여 항암제 등과 같은 약물을 효율적으로 세포내로 전달하기 위한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
이에, 본 발명자들은 수용액내에서 높은 용해도를 나타내고 장기간 동안 보관이 용이하며, 복수 항암제를 단일 제제화시켜 암세포의 내성을 유발시키지 않으면서 우수한 항암효과를 나타내는 항암제-고분자 복합체를 개발하기 위하여 노력한 결과, 촉매 및 계면활성제를 사용하지 않고 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민에 단일 또는 복수의 항암제를 결합시켜 소수성 항암제를 수용화시키고 복수 항암제를 단일 제제화시킬 수 있는 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 개발하였다. 본 발명자들은 상기 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 촉매 및 계면활성제 없이 제조되어 부작용 및 독성이 낮고, 수용액내에서의 안정성 및 온도 안정성이 우수하여 수용액에서 높은 용해도와 약효 지속성을 나타내며, 다양한 소수성 항암제를 단일 제제화시켜 암세포의 내성을 유발시키지 않으므로 종양을 효과적으로 치유할 수 있는 화학요법으로서 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소수성 항암제를 수용화시키고 복수 항암제를 단일 제제화시켜 종양을 효과적으로 치유하기 위하여 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 폴리에틸렌이민을 인간 간암세포에 처리한 후 FACS(flow activated cell sorter, 이하 "FACS"라 약칭함)를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 1b는 폴리에틸렌이민을 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 2a는 시스플라틴(cisplatin)을 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 2b는 시스플라틴을 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 3a는 탁솔(toxol)-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 3b는 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 4a는 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 4b는 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 5a는 탁솔 10 mg + 시스플라틴 10 mg-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 5b는 탁솔 10 mg + 시스플라틴 10 mg-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 6a는 탁솔 20 mg + 시스플라틴 10 mg-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 6a는 탁솔 20 mg + 시스플라틴 10 mg-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 7a는 탁솔 10 mg + 시스플라틴 20 mg-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 7b는 탁솔 10 mg + 시스플라틴 20 mg-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 8a는 탁솔 10 mg + 시스플라틴 10 mg + 5-FU(5-fluorouracil)-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 8b는 탁솔 10 mg + 시스플라틴 10 mg + 5-FU-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 수를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 9는 폴리에틸렌이민을 인간 간암세포에 처리한 후 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 10은 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 11은 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 12는 탁솔 + 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체를 인간 간암세포에 처리한 후 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리에틸렌이민에 단일 또는 복수의 항암제를 결합시켜 소수성 항암제를 수용화시키고 복수 항암제를 단일 제제화시킨 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 제공한다.
본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체에서 폴리에틸렌이민과 항암제의 비율은 10 : 3 내지 10 : 6이 바람직하다.
본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 온도 안정성을 조사한 결과, 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 온도와 관계없이 균일하고 투명한 용액상태를 장기간 동안 유지할 수 있는 것으로 나타나 상기 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 우수한 온도 안정성을 가지고 있어 장기간 동안 보관이 가능하고 다양한 온도에서 이용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암효과를 조사한 결과, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 처리된 대부분의 간암세포에서 아폽토시스가 유도됨을 알 수 있었고 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 기존의 항암제인 시스플라틴과 유사하거나 시스플라틴 보다 우수한 항암효과를 나타냄을 확인하였다(도 1a내지도 8b참조).
아울러, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체와 기존 항암제인 시스플라틴에 의해 사멸된 암세포의 형태학적 특성을 비교한 결과, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 처리된 간암세포 대부분이 사멸되었고, 사멸된 간암세포는 바닥에 부착되어 존재함을 확인하였는데, 이러한 결과는 항암제에 결합된 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민의 점도로 인하여 대부분의 간암세포가 바닥에 부착되어 있는 상태로 사멸되는 것임을 의미한다(도 10,도 11및도 12).
마지막으로, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 생체내 약효 지속성을 항암제에 표지된 방사성 동위원소의 반감기를 측정하여 조사한 결과, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 기존의 항암제 보다 매우 긴 반감기를 가지고 있는 것으로 확인되어 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 폴리에틸렌이민에 의해 생체내에서 항암제의 안정성이 증가되어 우수한 약효 지속성을 나타냄을 알수 있었다.
또한, 본 발명은 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은
1) 폴리에틸렌이민을 유기용매에 용해시켜 폴리에틸렌이민 용액을 제조하는 단계(단계 1);
2) 상기 폴리에틸렌이민 용액에 항암제를 첨가한 후 항암제와 폴리에틸렌이민을 반응시키는 단계(단계 2);
3) 단계 2의 반응용액을 투석막에 붓고 물로 여러번 투석하는 단계(단계 3); 및
4) 단계 3으로부터 얻은 투석막 내부의 용액을 건조시켜 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 얻는 단계(단계 4)로 구성된다.
상기 제조방법을 구체적으로 설명하면, 단계 1의 폴리에틸렌이민은 7,500 내지 10,000 g/몰의 분자량을 가지는 것이 바람직하고, 선형 및 가지형(branch) 폴리에틸렌이민 등이 이용될 수 있으며, 이들 폴리에틸렌이민을 용해시키기 위한 용매로는 DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethylsulfoxide) 및 PEI와 같이 항암제를 용해시킬 수 있는 용매는 모두 이용가능하다.
또한, 단계 2의 항암제로는 소수성 항암제가 바람직하며 소수성 항암제로는 기존에 개발된 탁솔 (taxol), 시스플라틴 (cisplatin), 5-FU, 아드리아마이신 (Adriamycin), 빈브라스틴 (Vibrastin), 에토포사이드, 악티노마이신 D(actinomycin D), 블레오마이신 (bleomycin), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 알킬레이팅 화합물, 알케란 (Alkeran), Ara-C, BiCNU, 부설판 (Busulfan), CCNU, 시스플라티눔 (Cisplatinum), 시톡산 (Cytoxan), 다우노루비신 (Daunorubicin), DTIC, 하이드레아 (Hydrea), 이포스파미드 (Ifosfamide), 미트라마이신 (Mithramycin), 마이토마이신 (Mitomycin), 미토크산트론 (Mitoxantrone), 질소 머스타드 (Nitrogen Mustard), 벨란 (Velban), 빈크리스틴 (Vincristine), VP-16, 카보플라티눔 (Carboplatinum), 플루다라빈 (Fludarabine), 젬시타빈 (Gemcitabine), 이다루비신 (Idarubicin), 이리노테칸 (Irinotecan), 류스타틴 (Leustatin), 나벨바인 (Navelbine), 탁소테레 (Taxotere), 토포테칸 (Topotecan) 등이 이용가능하다. 상기 소수성 항암제와 폴리에틸렌이민의 결합반응에는 촉매 또는 계면활성제가가 이용되지 않으며, 37℃ 내지 80℃에서 6 내지 12 시간 동안 반응시켜 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 형성시킨다.
아울러, 단계 3의 투석막으로는 셀룰로스(cellulose)계막 등이 이용될 수 있고, 투석은 37 내지 60℃에서 24 내지 96 시간 동안 수행하였으며, 단계 4에서 항암제-폴리에틸렌이민 복합체는 저압(진공)분사 또는 동결건조법으로 투석막 내부에 있는 용액을 건조시켜 확보하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 제조
한 종의 항암제가 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민에 결합된 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 제조하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 소수성 항암제인 탁솔 및 시스플라틴을 선형 고분자인 폴리에틸렌이민에 결합시켜 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체 및 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체를 제조하였다.
먼저, 선형 고분자인 폴리에틸렌이민 0.2 g을 DMF(dimethylformamide) 5 ㎖에 용해시켜 제조한 폴리에틸렌이민 용액에 탁솔 및 시스플라틴을 각각 10 ㎎, 20 ㎎ 및 50 ㎎ 씩 첨가하여 탁솔-폴리에틸렌이민 용액 및 시스플라틴-폴리에틸렌이민 용액을 제조하였다. 상기 탁솔-폴리에틸렌이민 용액 및 시스플라틴-폴리에틸렌이민용액을 60℃에서 6 내지 12 시간 동안 반응시킨 후 이를 셀룰로스 투석막(MWCO: 10000)에 붓고 상기 셀룰로즈 투석막을 물이 함유되어 있는 비이커에 담궜다. 상기 비이커의 물을 교체해주면서 24 시간 동안 교반하여 투석한 후 투석막 내부의 용액을 동결건조하여 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체 및 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체를 얻었다. 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체내의 탁솔 함량은 253 nm의 UV(Ultraviolet, 이하"UV"라 약칭함) 파장에서 측정하였고, 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체내의 시스플라틴 함량을 원자흡광도계를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체에 폴리에틸렌이민 1g 당 0.3 내지 0.6 g의 항암제가 결합되어 있었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 폴리에틸렌이민에 다량의 항암제가 결합되어 있음을 확인하였다.
<실시예 2> 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 제조
여러 종의 항암제가 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민에 결합된 본 발명의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 제조하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 탁솔, 시스플라틴 및 5-FU(5-flurouracil, 이하 "5-FU"라 약칭함)을 선형 및 가지형고분자인 폴리에틸렌이민에 결합시켜 탁솔+시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체 및 탁솔+시스플라틴+5-FU-폴리에틸렌이민 복합체를 제조하였다.
먼저, 선형 고분자인 폴리에틸렌이민 0.2 g을 DMF 5 ㎖에 용해시켜 제조한 폴리에틸렌이민 용액에 탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎ + 5-FU, 탁솔 20 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎ + 5-FU 또는 탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 20 ㎎ 및 탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎ + 5-FU 10 ㎎을 각각 첨가하여 복수 항암제-폴리에틸렌이민 용액을 제조하였다. 상기 복수 항암제-폴리에틸렌이민 용액을 60℃에서 6 내지 12 시간 동안 반응시킨 후 이를 셀룰로스 투석막(MWCO: 10000)에 붓고 상기 셀룰로스 투석막을 물이 함유되어 있는 비이커에 담궜다. 상기 비이커의 물을 교체해주면서 24 내지 96시간 동안 교반하여 투석한 후 투석막 내부의 용액을 동결건조하여 탁솔+시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체 및 탁솔+시스플라틴+5-FU-폴리에틸렌이민 복합체를 얻었다. 탁솔+시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체내의 탁솔 함량은 253 nm의 UV 파장에서 측정하였고 시스플라틴의 함량은 원자흡광도계를 이용하여 측정하였으며, 탁솔+시스플란틴+5-FU-폴리에틸렌이민 복합체내의 5-FU 함량은 232 nm의 UV 파장에서 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체에는 폴리에틸렌이민 1g 당 0.3 내지 0.6 g의 복수 항암제가 결합되어 있었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 폴리에틸렌이민에 다량의 폴리에틸렌이민이 결합되어 있음을 확인하였다.
<실험예 3> 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 온도 안정성 조사
본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 장기간 동안 보관이 용이한지 알아보기 위하여, 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 온도 안정성을 하기와 같은 방법으로 조사하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조된 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체와 실시예 2에서 제조된 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 수용액에 용해시킨 후 이를 4℃, 25℃, 37℃ 및 45℃에 각각 6 개월 동안 보관하면서 용액의 균일성과 투명성을 측정함으로써 이들의 온도 안정성을 조사하였다.
그 결과, 본 발명의 단일 및 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체는 온도와 관계없이 균일하고 투명한 용액 상태를 6 개월 이상 유지하였다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체는 우수한 온도 안정성을 가지고 있어 장기간 동안 보관이 용이함을 확인하였다.
<실험예 2> 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암효과 조사
본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암효과를 조사하기 위하여, 상기 항암제-폴리에틸렌이민 복합체와 기존의 항암제에 의한 암세포 사멸정도를 FACS(flow activated cel sorter, 이하"FACS"라 약칭함)를 이용하여 측정한 후 그 결과를 비교하였다.
먼저, 인간으로부터 채취한 1.3 X 104세포/㎖의 간암세포를 100 ㎎/㎖의 가나마이신(kanamycin) 및 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Low glucose with L-glutamine with pyrdoxine hydrochloride with 110mg/L Sodium pyruvate without Sodium bicarbonate , Life Technologies)에 접종한 후 37℃를 유지하는 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 실험군으로는 실시예 1의 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체와 실시예 2의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 이용하였고, 대조군으로는 폴리에틸렌이민만을 이용하였으며 비교군으로는 시스플라틴을 이용하였다. 상기 실험군, 대조군 및 비교군을 각각 간암세포 배양액에 첨가하고 시간에 따라 세포 배양액을 취한 후 FACS를 이용하여 세포주기에 따른 간암세포의 분포 양상을 확인하였으며, 아폽토시스에 의해 사멸된 간암세포의 비율을 측정하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1> 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암효과
항암제 처리군 아폽토시스 비율(%)
대조군(폴리에틸렌이민) 3.29
비교군(시스플라틴-폴록사머 복합체) 74.48
실시예 1의 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체 78.89
실시예 1의 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체 71.76
실시예 2의 탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎-폴리에틸렌이민 복합체 81.45
실시예 2의 탁솔 20 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎-폴리에틸렌이민 복합체 83.57
실시예 2의 탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 20 ㎎-폴리에틸렌이민 복합체 76.25
실시예 2의 탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎ + 5-FU 10 ㎎-폴리에틸렌이민 복합체 82.84
상기 표 1에 나타나 있듯이, 대조군에서는 아폽토시스에 의해 사멸된 간암세포의 비율이 3.29%로 측정되었고 비교군에서는 74.46%로 측정된 반면, 실시예 1에서 제조된 탁솔-폴리에틸렌이민 복합체 및 시스플라틴-폴리에틸렌이민 복합체가 처리된 실험군에서는 각각 78.89% 및 71.76%로 측정되었다. 또한, 실시예 2에서 제조된 4 가지 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 처리된 실험군에서는 아폽토시스에 의해 사멸된 간암세포의 비율이 각각 81.45%(탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎-폴리에틸렌이민 복합체), 82.57%(탁솔 20 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎-폴리에틸렌이민 복합체), 76.25%(탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 20 ㎎-폴리에틸렌 이민 복합체) 및 82.84%(탁솔 10 ㎎ + 시스플라틴 10 ㎎ + 5-FU 10 ㎎-폴리에틸렌 이민 복합체)로 측정되었다. 아울러, 대조군의 간암세포 대부분은 생존하는 세포가 존재하는 세포주기인 G1주기(Growth phase 1), G2주기(Growth phase 2), S 주기(DNA synthesis phase) 및 M 주기(Mitosis phase)에 존재하고 있었으며, 특히 S 주기에 존재하는 간암세포의 수가 가장 많은 것으로 관찰되었다(도 1a및도 1b). 반면, 시스플라틴이 처리된 간암세포와 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 처리된 간암세포 대부분은 아폽토시스를 겪는 세포가 존재하는 세포주기인 G0주기(Growth phase 0)에 존재하고 있어 항암제-폴리에틸렌이민 복합체에 의한 아폽토시스가 유발되었음을 확인하였다(도 2a내지도 8b). 상기의 결과로부터, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 비교군인 기존 항암제와 유사하거나 더 우수한 항암효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 3> 항암제-폴리에틸렌이민 복합체에 의해 사멸된 암세포의 형태학적 특징 조사
본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체와 기존 항암제에 의해 사멸된 암세포의 형태학적 특징을 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
먼저, 인간으로부터 채취한 1.3 X 104세포/㎖의 간암세포를 100 ㎎/㎖의 가나마이신 및 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM에 접종한 후 37℃, 5% CO2를 유지하는 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 실험군으로는 실시예 1의 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체와 실시예 2의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체를 이용하였고, 대조군으로는 폴리에틸렌이민을 이용하였으며 비교군으로는 시스플라틴을 사용하였다. 상기 실험군, 대조군 및 비교군 2 ㎎을 각각 간암세포 배양액에 첨가하고 이를 37℃, 5% CO2를 유지하는 배양기에서 24 내지 72시간 동안 배양한 후 세포의 형태를 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 대조군의 간암세포 대부분은 바닥에 부착된 상태로 생존하고 있었고 비교군의 간암세포는 사멸되어 있었으며, 사멸된 간암세포는 바닥으로부터 떨어져 배지내에 부유하고 있었다(도 9). 반면, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체가 처리된 실험군의 간암세포 역시 대부분이 사멸되어 있었으나, 사멸된 간암세포는 배지내에 부유하지 않고 바닥에 부착되어 있었다(도 10,도 11및도 12). 이러한 결과는 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체에 의해 사멸된 암세포가 폴리에틸렌이민의 점도로 인하여 바닥에 부착되어 존재하는 것으로 판단되었다.
<실험예 4> 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 생체내 약효 지속성 조사
본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 생체내 약효 지속성을 조사하기 위하여, 실시예 1의 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 실시예 2의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암제에 방사성 동위원소를 표지한 후 방사성 동위원소의 반감기를 하기와 같은 방법으로 측정하고 그 결과를 기존의 항암제와 비교하였다.
먼저, 실시예 1의 단일 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 실시예 2의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암제와 기존의 항암제에 방사성 동위원소인(3)H(idodine)를 표지한 후 쥐의 혈관에 주사하였다. 항암제가 투여된 쥐를 시간에 따라 희생시킨 후 쥐 혈액을 채취하여 혈액내 항암제의 방사능을 레디오카운터(radiocounter)를 이용하여 측정하였고 그로부터 항암제의 반감기를계산하였다.
그 결과, 기존의 항암제의 반감기는 2 내지 3 시간으로 측정된 반면, 실시예 1 및 실시예 2의 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체내 항암제의 반감기는 7 내지 15 일로 측정되었다. 상기의 결과로부터, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 항암제는 폴리에틸렌이민으로 인하여 기존의 항암제 보다 매우 긴 반감기를 가지게 되어 생체내에서 우수한 약효 지속성을 나타냄을 알 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항암제-폴리에틸렌이민 복합체는 촉매 및 계면활성제를 사용하지 않고 제조되어 부작용 및 독성이 낮고 수용액내에서의 안정성 및 온도 안정성이 우수하여 수용액에서 높은 용해도 및 약효 지속성을 나타내며, 장기간 동안 보관이 용이할 뿐만 아니라 여러 가지 항암제를 하나의 폴리에틸렌이민 고분자에 결합시켜 다양한 소수성 항암제를 단일 제제화시킴으로써 단일 항암제 투여시 나타나는 암세포의 내성을 유발시키지 않으면서 종양을 효과적으로 치유할 수 있는 화학요법으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 폴리에틸렌이민(polyethylene imine)에 복수 항암제가 결합된 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체.
  2. 삭제
  3. 1) 폴리에틸렌이민을 유기용매에 용해시켜 폴리에틸렌이민 용액을 제조하는 단계(단계 1);
    2) 상기 폴리에틸렌이민 용액에 복수 항암제를 첨가한 후 복수 항암제와 폴리에틸렌이민을 반응시키는 단계(단계 2);
    3) 단계 2의 반응용액을 투석막에 붓고 물로 여러번 투석하는 단계(단계 3); 및
    4) 단계 3으로부터 얻은 투석막 내부의 용액을 건조시키는 단계(단계 4)로 이루어지는 제 1항의 복수 항암제-폴리에틸렌이민 복합체의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 단계 1의 폴리에틸렌이민은 7,500 내지 10,000 g/몰의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 3항에 있어서, 단계 1의 유기용매로는 DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethylsulfoxide), 에탄올 (ethanol) 및 메탄올 (methanol)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 3항에 있어서. 단계 1의 폴리에틸렌이민은 선형 폴리에틸렌이민 또는 가지형(branch) 폴리에틸렌이민인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 3항에 있어서, 단계 2의 항암제는 소수성 항암제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 소수성 항암제는 탁솔 (taxol), 시스플라틴 (cisplatin), 5-FU (5-flurouracil), 아드리아마이신 (Adriamycin), 빈브라스틴 (vinblastine), 에토포사이드(etoposide), 악티노마이신 D (actinomycin D), 블레오마이신 (bleomycin), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 알킬레이팅 화합물, 알케란 (Alkeran), Ara-C, BiCNU, 부설판 (Busulfan), CCNU, 시스플라티눔 (Cisplatinum), 시톡산 (Cytoxan), 다우노루비신 (Daunorubicin), DTIC, 하이드레아 (Hydrea), 이포스파미드 (Ifosfamide), 미트라마이신 (Mithramycin), 마이토마이신 (Mitomycin), 미토크산트론 (Mitoxantrone), 질소 머스타드 (Nitrogen Mustard), 벨란 (Velban), 빈크리스틴 (Vincristine), VP-16, 카보플라티눔 (Carboplatinum), 플루다라빈 (Fludarabine), 젬시타빈 (Gemcitabine), 이다루비신 (Idarubicin), 이리노테칸 (Irinotecan), 류스타틴 (Leustatin), 나벨바인 (Navelbine), 탁소테레 (Taxotere) 및 토포테칸 (Topotecan)으로 구성되는 군에서 선택된 2종 이상을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제 3항에 있어서, 단계 2의 복수 항암제와 폴리에틸렌이민의 결합반응은 촉매 및 계면활성제가 이용되지 않고 37 내지 80℃에서 6 내지 12 시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 3항에 있어서, 단계 3의 투석막은 셀룰로스(cellulose)계 막으로 이루어지고 37 내지 60℃에서 24 내지 96 시간 동안 투석하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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