KR20150131263A - 신경 작용제에 대한 노출을 위한 치료 - Google Patents

신경 작용제에 대한 노출을 위한 치료 Download PDF

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조지타운 유니버시티
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Abstract

본 발명은 유기인산제 노출의 독성 효과를 예방 및 치료하기위한 방법을 제공한다. 구현예에서, 부티릴콜린에스터라제 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 전달하는 표적된 양이온성 리포솜 복합체(cationic liposome complex)가 투여된다. 바람직하게, 투여는 흡입을 통해서 또는 애어로졸을 통해서 이루어진다. 또한 양이온성 리포솜 복합체 및 이러한 투여를 위한 복합체의 제조방법이 제공된다.

Description

신경 작용제에 대한 노출을 위한 치료{TREATMENT FOR EXPOSURE TO NERVE AGENT}
본 발명은 유기인산제 노출의 독성 효과를 예방 및 치료하기위한 방법을 제공한다. 구현예에서, 부티릴콜린에스터라제를 코딩하는 핵산 분자 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 전달하는 표적된 양이온성 리포솜 복합체(cationic liposome complex)가 투여된다. 바람직하게, 투여는 흡입을 통해서 이루어진다. 또한 양이온성 리포솜 복합체 및 이러한 투여를 위한 복합체의 제조방법이 제공된다.
유기인산제(OP)는 흔히 농약, 살충제 및 의학적 병태 예컨대 녹내장 및 알츠하이머병의 치료를 위한 약물로서 사용된다. 불행히도, 그들은 또한 신경 작용제 예컨대 사린, 소만(soman), VX, 및 타분으로 사용되기 위해 개발되어왔다. 이러한 OP 화합물은 공지된 심각한 독성 화학물질의 일부이다. 적은 양에 대한 노출이라도 치명적일 수 있다. 횡격막 및 늑간 근육의 마비, 뇌 호흡 중추의 저하, 기관지 경련, 경련 및 지나친 타액분비에서 기인한 질식으로부터 사망이 발생한다(1에서 리뷰됨). OP 중독의 메커니즘은 효소의 비가역적인 비활성화를 유도하는 아세틸콜린에스터라제(AchE)의 활성 부위내 세린 히드록시기의 인산화이다. 시냅스 공간(synaptic space)에서 아세틸콜린(Ach)을 가수분해하는, AchE는 신경 전달에서 필수적인 효소이다. AchE의 비활성화는 결과적으로는 PNS 콜린성 과활성 및 사망을 일으키는 Ach의 빠른 축적을 야기한다. CNS에서, 콜린성 과다흥분성은 경련 및 국소적 신경 세포 사멸을 일으키는 신경 세포 발화(neuronal firing)를 증가시킨다.
비록 노출 후 사용을 위한 해독 치료가 존재하지만, 그들은 제한된 효율을 보여왔고, 심각한 부작용을 생산하며, 무능력(일시적 또는 영구적) 또는 비가역적 뇌 손상을 예방하지 못한다(1,2). 따라서, 예방을 위한 방법이 필요하다. OP 독성에 대항하는 하나의 접근은 이러한 화합물을 격리 및 중화시키기 위한 생물 제거제(bioscavenger)의 사용이다. 시험된 생물 제거제들 중, 인간 혈청 부티릴콜린에스터라제(BChE)(또한 슈도콜린에스터라제, 또는 콜린에스터라제로도 불림)가 인간에 대한 사용에 가장 적합한 것으로 보인다(3), BChE는 혈장, 뇌, 근육, 신장, 간 및 폐를 포함하는 거의 모든 조직에 존재하는 세린 효소이다(4). 혈청 내 인간 BChE (hBChE)(340kDa)는 11-14일의 T1/2를 가지며 네 개의 동일한 서브유닛으로 구성되고 많은 글리코실화를 통해 단백질 분해로부터 보호되는 구형의 테트라머 분자이다(5). 각각의 서브유닛의 테트라머로의 조립에는 라멜리포딘으로부터 유래한(5) 또는 랫트 콜라겐 꼬리(AChE Q 서브유닛)로부터 유래한 폴리프롤린이 풍부한 펩티드의 존재(Bone paper, Krejci paper, Antamirano paper), 또는 임의의 다른 폴리프롤린이 풍부한 단백질의 존재가 요구된다. BChE는 평균 유전자 발현의 4배인, 비교적 높은 수준으로 자연적으로 발현된다(4). 또한 그것은 수많은 에스터-포함 약물의 분해에 있어 중요한 역할을 하며, 잠재적 OP 신경 작용제를 포함하는 콜린에스터라제 저해제의 천연 생물 제거제이다.
hBChE 각 분자는 OP의 한 분자를 중화시킨다(6). 재조합 인간 BChE 및 인간 혈청 BChE의 사전처리가 동물(설치류, 기니피그, 돼지 및 비-인간 영장류를 포함)을 5배까지의 LD50 신경작용제로부터 보호할 수 있다는 사실이 보고되어왔다(6,7). 넓은 범위의 OP 중독에 대한 비가역적 결합 및 BChE 기능의 비활성화는 그것을 신경 작용제에 대한 예방을 위한 치료의 이상적인 후보로 만들었다. 그것의 다양한 전시 전- 및 후- 노출 시나리오를 위한 사용에 더하여, 그것은 또한 의도적/사고적 신경 가스 방출에 반응한 첫번째 반응자를 위한 사전처리로서 그리고 농약 과다노출, 코카인 과다 복용, 또는 숙시닐-콜린-유발된 질식에 노출 후 치료로서의 잠재적 사용을 가진다(8).
인간에서, 1 LD50의 OP로 시험에 따른 효과적인 보호를 달성하기 위해서 250mg/70kg의 BChE 용량이 요구되는 것으로 평가되어왔다(3). 그러나, 화학양론적으로 그리고 OP 및 BChE 사이의 상호작용 및 비가역적 결합; 부적절한 OP/BChE 질량 비; 및 효소의 노화 때문에, 혈액 내에서 자연적으로 발생하는 이러한 생물 제거제 효소의 양(~8-72 mg/6L)은 적절한 보호를 달성하기에는 매우 적다(4,9). 따라서, BChE 발현 수준 및 혈장 내 양을 유의적으로 증가시키기 위한 방법을 개발하는 것이 결정적이다. 이러한 종료를 위하여, 다른 전략이 개발되었다. 가장 간단한 방법은 혈류 내 양을 증가시키 위해서 고도로 정제된 많은 용량의 천연 hBChE를 직접적으로 주입하는 것이다. 이것은 치사량의 소만 및 VX에 대한 보호에는 성공적인 것으로 증명되었으나, 실질적으로 사용되지는 못한다. 더욱이, 형질전환 동물 및 세포 배양의 사용은 실질적이고 실현가능한 사용을 위해 충분한 양의 hBChE를 생산하지 못한다.
즉각적으로 반응할 수 있는 BChE 돌연변이의 유도체(그들을 및 추가적인 OP 분자에 결합 및 비활성화시키도록 함)는 일부 성공한 또 다른 시도이다. 117번 위치에서 히스티딘이 글리신으로 치환되는 경우(G117H) BChE는 OP 가수분해 활성 및 증가된 재활성화를 획득하는 것으로 나타났다(10,11). 이러한 돌연변이는 아세틸콜린에스터라제 저해제 에코티오페이트(echothiophate)를 가수분해하는데 효율적이며 효율적으로 신경 작용제 사린 및 VX를 가수분해할 수 있다(9). 더욱 중요한 것은, G117H 돌연변이를 발현하는 형질전환 마우스가 OP에 저항성이 있다는 사실이다(12). 비록 60개 이상의 BChE 돌연변이가 생산되었으나, G117H가 가장 효율적인 것으로 남았고 최근까지 연구되고 있다(9). 그러나, 아직까지, 비침습적 경로를 통해서 BChE 또는 테트라머 형태의 활성 mtBChE의, 체내에 연장된 기간동안 효율적으로 전달 또는 생산되는 방법이 없다.
따라서, OP 약물에 대한 노출의 예방 및 치료를 위해 BChE를 전달하는 방법 및 기술의 개발이 절실하게 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 치료 및/또는 예방을 위한 양이온성-리포솜-기반 약물 전달 시스템의 제공에 의해 이러한 요구를 충족시킨다.
일 구현예에서, 포유동물에서 유기인산제에 대한 노출에 연관된 독성의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바람직하게 포유동물에 양이온성 리포솜 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은 리간드, 양이온성 리포솜과 연관된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 양이온성 리포솜과 연관된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
구현예에서, 복합체는 비강내 투여, 정맥내 투여, 경구 투여, 설하 투여, 근육내 투여, 병소 내 투여, 피내 투여, 경피(transdermal) 투여, 안구내 투여, 복강내 투여, 경피(percutaneous) 투여, 에어로졸 투여, 기관내 투여, 대뇌내 투여, 국소 투여, 피하 투여, 내시경 투여, 점진적 감소 이식(slow release implant), 삼투압 또는 기계적 펌프를 통한 투여 및 흡입을 통한 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여된다.
바람직하게, 리간드는 트랜스페린(transferrin), 항체 및 단일 사슬 Fv 항체 절편 예컨대 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv)를 포함하는, 항체 절편이다.
추가적인 구현예에서, 리간드-표적된 양이온성 리포솜은 양이온성 리포솜과 연관된 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (서열번호 1) 펩티드를 포함하는 펩티드를 더 포함한다.
바람직하게, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 첫번째 플라스미드에 포함되고 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 두번째 플라스미드에 포함된다. 구현예에서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는 첫번째 플라스미드 구조(plasmid construct)에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다. 구현예에서, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로 (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는 두번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다.
대안적으로 BChE를 코딩하는 핵산 분자, 및 프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 동일한 구조에 존재하나, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 미국 특허출원번호 2007/0065432에 개시된 고 발현 프로모터(high expression promoter)로부터 하류에 위치하는 반면, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 표준 프로모터 예컨대 RSV 또는 CMV의 하류에 위치한다.
바람직하게, BChE는 G117H 돌연변이인 BChE의 돌연변이 형태를 포함하는, BChE의 돌연변이 형태이다.
예시적인 구현예에서, 양이온성 리포솜은 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질(helper lipid)의 혼합물을 포함한다. 바람직하게 리간드 및 양이온성 리포솜은 약 1:1 내지 약 1:100(w:w) 범위의 비율, 예컨대 약 1:10 내지 약 1:50(w:w) 범위의 비율, 또는 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재한다.
구현예에서, 양이온성 리포솜은 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물, 또는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함한다.
바람직하게, 양이온성 면역리포솜 복합체 내 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 또는 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하고, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하고, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다.
구현예에서, 핵산 분자의 총 양은 약 1:1 내지 약 1:40(μg 핵산:μg 리포솜), 또는 약 1:5 내지 약 1:20(μg 총 핵산:μg 리포솜)의 질량 비율로 존재하고, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자의 총 양은 약 1:10(μg 총 핵산:μg 리포솜)의 질량 비율로 존재한다.
바람직하게, 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위하여, 더욱 바람직하게 적어도 10 x LD50 까지의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위하여 투여된다. 구현예에서, 복합체는 1 x LD50 까지의 유기인산제에 대한 노출, 더욱 바람직하게는 10 x LD50 까지의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 예방하기 위하여 투여된다.
구현예에서, 복합체는 유기인산제에 노출 직전 또는 직후에 투여된다. 추가적인 실시예에서, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 6시간 이상 전에 투여된다. 바람직하게, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 1주 전 1회 이상 투여된다.
바람직하게, 포유동물은 인간이다.
또한 인간에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 치료 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바람직하게 인간에게 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv), 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산은 약 1:5 내지 약 1:20(μg 핵산: μg 리포솜)의 비율로 존재한다. 바람직하게, 양이온성 면역리포솜 복합체에 있는 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 구현예에서, 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해서 투여된다.
또한 인간에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 예방 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바람직하게 인간에게 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv), 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게 TfRscFc 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 및 핵산은 약 1:5 내지 약 1:20(μg의 핵산: μg의 리포솜)의 비율로 존재한다. 바람직하게, 양이온성 면역리포솜 복합체에 있는 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 구현예에서, 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해서 투여된다.
또한 포유동물의 혈류로 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 전달하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 바람직하게 포유동물에게 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv), 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게 TfRscFc 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 및 핵산은 약 1:5 내지 약 1:20(μg의 핵산: μg의 리포솜)의 비율로 존재한다. 바람직하게, 양이온성 면역리포솜 복합체에 있는 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나, 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나 또는 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 구현예에서, 복합체는 인간 혈류 내 BChE의 양이 250mg/70kg(BChE의 질량/인간의 질량) 이상이 되도록 투여된다.
대안적으로 BChE를 코딩하는 핵산 분자, 및 프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 동일한 구조에 존재하지만, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 미국 특허출원번호 2007/0065432(전체로서 본원에 참고 문헌으로 포함된다)에 개시된 고 발현 프로모터로부터 하류에 위치하는 반면, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 표준 프로모터 예컨대 RSV 또는 CMV의 하류에 위치한다.
도 1은 표적된 양이온성 면역리포솜 전달로부터 유래한 전이성 종양 내 전달 유전자 발현의 존재를 나타낸다.
도 2는 본원에 기술된 바와 같이 고 발현 프로모터의 조절 하에서 유전자 이식의 결과로서 단백질 발현의 증가를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 GFP 유전자(도 3a)를 포함하는 pSCMV 고 발현 플라스미드를 운반하거나 형광으로 표시된 올리고뉴클레오티드(도 3b)를 운반하는 scL이 주입된 Balb/C 마우스 내 뇌로 scL 전달을 나타낸다.
도 4a-4b는 랫트에서 목정맥 카테터를 통해서 주입된 TfR을 표적하고 GFP(100μg cDNA)를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 리포솜 복합체의 뇌 단편을 나타낸다.
도 5는 Balb/c 마우스에 비강내 투여 후에 자유(Free, 캡슐화되지 않음), 또는 scL-캡슐화 된 플라스미드 DNA 중 하나의 루시퍼라제 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 6은 ERKI 및 ERKⅡ 단백질 모두를 검출하는 항체를 이용한 총 세포성 단백질의 웨스턴 분석을 나타낸다.
도 7은 wt-BChE, mt-BChE, 및 ppro 유전자가 pSCMV 벡터로 도입된 서브클로닝 결과를 나타낸다.
도 8은 pSCMV 벡터 내의 초나선(supercoiled) wt-BChE, mt-BChE, 및 ppro 유전자의 백분율을 나타낸다.
도 9는 scL-mtBChE/ppro 복합체내 증가하는 양의 DNA로 형질감염시킨 후에 CHO-K1 세포내 BChE의 발현 수준을 나타낸다.
도 10은 scL-mtBChE/ppro 복합체로 A549 세포를 시험관내 형질감염하고 16일 후에 BChE 발현을 나타낸다.
도 11은 scL-mtBChE/ppro 복합체로 A549 세포를 시험관내 형질감염하고 28일 후에 BChE 발현을 나타낸다.
용어 "복합체", "나노복합체", "리포솜 복합체" 및 "나노리포솜"은 본원에 기술된 양이온성 리포솜을 지칭하기 위해 전체에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 분야에서 사용되는 예시적인 양이온성 리포솜 및 그들의 생산 방법은 미국 특허출원번호 2003/0044407 및 2007/0065499에 개시되어 있고, 이러한 개시는 각각 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "약"은 언급된 값 뿐만 아니라 언급된 값의 10% 이내의 값을 지칭한다. 예를 들어, "약 100 nm"는 범위 내의 값을 포함하는 90 nm 내지 110 nm의 값을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "리간드"는 양이온성 리포솜에 화학적으로 접합된, 또는 직접적으로 연관/복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은 임의의 적절한 표적 부분을 지칭한다. 본 발명의 분야에서 사용되는 예시적인 리간드는 단백질(예컨대 트랜스페린(transferrin) 또는 엽산(folate)), 펩티드(예컨대 L-37pA), 항체, 항체 절편(Fab' 절편 및 단일 사슬 Fv 절편을 포함) 및 당류(예컨대 갈락토오스), 뿐만 아니라 다른 표적 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구현예에 따른 복합체가 간단하고 효율적인 비-화학적 접합에 의해서 만들어지는 예시적인 방법 및 조성물은 미국 특허출원번호 2003/0044407 및 2007/0065499에 개시되어있다. 본 발명의 구현예에 따른 복합체가 화학적 접합을 통해서 만들어지는 예시적인 방법 및 조성물은 미국 특허번호 7,479,276에 개시되어있다. 이러한 특허 및 특허 명세서의 각각의 개시는 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
예시적인 구현예에서, 전체 항체 또는 항체 절편은 본 발명의 복합체를 제조하기 위해 리간드로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체의 Fab 절편 및 단일 사슬 Fv 절편(scFv)을 포함하는 항체 절편이 사용된다. 하나의 적절한 항체는 항-트랜스페린 수용체(항-TfR) 단일 클론 항체이고, 적절한 항체 절편은 항-TfR 단일 클론 항체에 기초한 scFv다. 적절한 항-TfR 단일 클론 항체는 5E9 (예컨대 Hayes, B.F., et al., "Characterization of a Monoclonal Antibody (5E9) that Defines a Human Cell Surface Antigen of Cell Activation," J. Immunol . 127:347-352 (1981); Batra, J.K., et al., "Single-chain Immunotoxins Directed at the Human Transferrin Receptor Containing Pseudomonas Exotoxin A or Diphtheria Toxin: Anti-TFR(Fv)-PE40 and DT388-Anti-TFR(Fv)," Mol . Cell. Biol . 11:2200-2205 (1991) 참조) (이의 개시가 본원에 참고 문헌으로 포함된다). 전체 항-TfR 단일 클론 항체에 기초한 scFv는 적절한 분자량 26,000의 단일 폴리펩티드 사슬로서 이러한 MAb에 의해서 인식되는 TfR 의 에피토프(epitope)에 대한 완전한 항체 결합 부위를 포함한다. scFv는 각각 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)에서 유래한 성분 VH 및 VL 가변 영역(variable domain)과 첫번째 가변 영역의 C-말단과 두번째의 N-말단을 연결하는 적절하게 설계된 펩티드와의 연결에 의해서 VH-펩티드-VL 또는 VL-펩티드-VH 중 하나의 순서로 형성된다. 전체에서 기술된 것과 같은 추가적인 리간드가 또한 본 발명의 분야에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 시스테인 모이어티(cysteine moiety)가 scFv의 C-말단에 첨가된다. 비록 이론적으로 결합을 바라지는 않지만, 시스테인이 화학적으로 접합된 및 비-화학적으로 접합된 구현예 모두에서 항체 및 리포솜 사이의 복합체 형성을 향상시킬 수 있는 자유 설프하이드릴기(free sulfhydryl group)를 제공하는 것으로 생각된다. 시스테인과 함께 또는 시스테인 없이, 단백질은 E. coli 봉입체(inclusion body)내에서 발현될 수 있고 이후에 활성 형태의 항체 절편을 생산하기 위해서 다시 접힌다.
복합체의 형성에 있어 입체적으로 안정화된 리포솜의 사용이 요구되지 않는다면, 본 발명의 비-화학적으로 접합된 복합체의 예시적인 제조에 있어서 첫번째 단계는 양이온성 리포솜 또는 리포솜과 항체 또는 선택된 항체 절편의 조합을 혼합하는 단계를 포함한다. 다양한 양이온성 리포솜은 본 발명의 복합체의 제조에 있어서 유용하다. PCT 명세서 WO99/25320호(이의 개시는 본원에 전체로서 참고문헌으로 포함된다)는 몇몇의 양이온성 리포솜의 제조를 기술한다. 바람직한 리포솜의 예는 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS)을 포함하고 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트(dioleoyltrimethylammonium phosphate; DOTAP) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), DOTAP 및 DOPE 및/또는 콜레스테롤(chol); 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide; DDAB) 및 DOPE 및/또는 chol의 혼합물, 또는 DDAB 및 DOPE의 혼합물을 포함한다. 지질의 비율은 특이적 표적 세포 유형을 위한 치료적 분자의 흡수의 효율을 최적화하기 위해 다양해질 수 있다. 리포솜은 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 양이온성 지질(들) 대 중성 또는 헬퍼 지질(들)의 적절한 비율은 약 1:(0.5-3), 바람직하게는 1:(1-2) (몰비)이다.
적절한 리간드, 예를 들어, 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편은 표적 세포의 표면에, 및 바람직하게는 표적 세포에 별도로 발현된 수용체에 결합할 것이다. 리간드는 양이온성 리포솜 또는 중합체와 상온에서 그리고 약 1:10 내지 약 1:50, 바람직하게는 약 1:20 내지 약 1:40(w:w)의 범위의 리간드(예컨대 단백질):지질 비율(질량:질량)로 혼합된다.
리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편) 및 리포솜은 상온에서 짧은 기간, 전형적으로 약 10-15분 동안 배양될 수 있고, 이후 혼합물은 선택된 치료제 또는 진단제와 혼합된다. 리포솜 복합체에 복합될 수 있는 치료적 분자 또는 제제의 예는 유전자, 고분자량 DNA(genomic DNA), 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 리보자임, 핵산(siRNA, miRNA 및 안티센스를 포함), 작은 분자, 바이러스 입자, 면역조절 물질, 화상용 조영제, 단백질 및 화학적 물질을 포함한다.
리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편) 및 리포솜 조합은 치료제와 약 0.5:1 내지 약 1:40(μg의 제제:nmol의 총 지질), 바람직하게는 약 1:10 내지 1:20(μg의 제제:nmole의 총 지질) 범위의 비율로 혼합되고 상온에서 짧은 기간, 전형적으로 약 10 내지 15분 동안 배양된다. 생체내 사용을 위해서, 50% 텍스트로스 또는 50% 수크로오스가 최종 농도 5-20%(V:V)가 되도록 첨가되고 5-10초 동안 부드럽게 뒤집어서 혼합되거나, 더 큰 부피에 대해서는 1-2분 동안 20-30 RPM에서 회전된다. 리포솜 복합체의 크기는 전형적으로 Malvern ZETASIZER® 300 또는 Malvern ZETASIZER® NANO-ZS를 사용한 동적 광산란에 의해 측정된 바와 같이 약 50-500 nm의 범위 이내이다. 미국 특허출원번호 2003/0044407 및 미국 특허출원번호 11/520,796 참조, 이의 개시는 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
본 발명의 일 구현예에서, 복합체 형성을 위해 사용된 리포솜은 입체적으로 안정화된 리포솜이다. 입체적으로 안정화된 리포솜은 친수성 중합체, 예컨대 PEG, 폴리(2-에틸아크릴산), 또는 폴리(n-이소프로필아크릴아미드(PNIPAM)로 도입된 리포솜이다. 이러한 변형된 리포솜은 그들이 이렇게 변형되지 않은 리포솜에 비교할 만큼 빠르게 세망내피계에 의해서 전형적으로 혈류로부터 제거되지 않기 때문에 치료제에 복합되는 경우에 특별히 유용할 수 있다. 본 발명의 입체적으로 안정화된 리포솜 복합체를 제조하기 위해서, 항체 또는 항체 절편, 리포솜 및 치료제 또는 진단제의 혼합 순서가 상기 제시된 순서로 보존된다. 첫번째 단계에서, 상기 기술된 것과 같은 양이온성 리포솜은 첫번째로 상기 기술된 것과 같은 치료제와 약 0.5:1 내지 약 1:40(μg의 제제:nmol의 지질), 바람직하게는 약 1:10 내지 1:20(μg의 제제:nmole의 지질)범위의 비율로 혼합된다. 이러한 리포플렉스(lipoplex)에 약 0.1:100(nmol의 PEG:nmol의 리포솜), 바람직하게는, 약 0.5:50, 예를 들어, 약 1:40(nmol의 PEG:nmol의 리포솜)의 비율로 생리학적으로 허용가능한 완충액내 PEG 중합체의 용액에 첨가된다. 그에 따른 용액은 상온에서 중합체가 리포솜 복합체로 도입되기에 충분한 시간 동안 배양된다. 이후 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)은 안정화된 리포솜 복합체와 상온에서 그리고 약 1:5 내지 약 1:40(w:w) 범위의 리간드(예컨대 단백질):지질 비율로 혼합된다. 생체내 사용을 위해서, 50% 텍스트로스 또는 50% 수크로오스가 최종 농도 5-20%(V:V)가 되도록 첨가되고 5-10초 동안 부드럽게 뒤집어서 혼합되거나, 더 큰 부피에 대해서는 1-2분 동안 20-30 RPM으로 회전된다.
본 발명에 따라 제조된 리포솜 복합체는 생체내 투여를 위한 약학적으로 허용가능한 제제로 제제화될 수 있다. 복합체는 약학적으로 양립할 수 있는 비히클(vehicle) 또는 담체와 조합될 수 있다. 조성물은, 예를 들어 치료적 분자, 또는 복합체 내의 다른 페이로드(payload)의 투여에 의해서 이익을 얻는 포유동물, 예를 들어 인간 환자에게 정맥 투여를 하기위해서 제제화될 수 있다. 복합체는 그들이 정맥내 투여 이후에 체내를 통해 분산되기 위해 적절한 크기이다. 대안적으로, 복합체는 투여의 다른 경로, 예컨대 종양내(IP), 병소 내(IL), 에어로졸, 경피, 경구, 내시경, 국소적, 근육내(IM), 피내(ID), 안구내(IO), 복강내(IP), 경피(TD), 비강내(IN), 대뇌내(IC), 기관내(예컨대 간장내), 점진적 감소 이식(slow release implant), 또는 피하 투여, 또는 삼투압 또는 기계적 펌프를 이용한 투여를 통해서 또는 흡입을 통해서 전달될 수 있다. 이러한 방법을 통한 전달을 위한 제제의 제조, 및 이러한 방법을 이용한 전달은 당업계에 공지되어있다.
복합체는 선택 및 지질의 비율, 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편) 대 리포솜의 비율, 리간드 및 리포솜 대 치료제의 비율, 및 리간드 및 치료제의 선택을 통해서 표적 세포 유형에 대해 최적화될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 제조된 복합체는 핵산, 치료적 분자, 또는 복합체에 의한 다른 페이로드의 전신 전달에의 사용을 위한 키트 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 키트는, 분리된, 적절한 용기, 리포솜, 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편), 및 핵산, 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 성분은 멸균 조건 하에서 적절한 순서로 혼합될 수 있고 적절한 기간, 일반적으로 제조 후 약 30분 내지 약 24시간 이내로 환자에게 투여된다. 바람직하게 키트 성분은 용액으로서 또는 건조 분말로 제공된다. 용액 형태로 제공된 성분은, 바람직하게는 적절한 완충액, 삼투압 조절제 등과 함께 멸균 조사용수내 제제화된다. 완전한 복합체는 또한 건조 분말(동결 건조된)로 제제화될 수 있다(미국 특허출원번호 2005/0002998 참조, 개시는 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다).
이의 개시가 본원에 참고 문헌으로 포함된, 미국 특허출원번호 2003/0044407 및 2007/0065499에 논의된 바과 같이, 양이온성 리포솜 복합체는 전반적으로 다양한 치료제 및 진단제를, 항-트랜스페린 단일 사슬 항체 절편(TfRscFv)을 사용한 표적화를 통해서 종양 세포로 성공적으로 전달함이 전반적으로 기술되어있다. 구체적으로, 핵산 분자, 예컨대 안티센스 및 siRNA, 뿐만 아니라 플라스미드 DNA(예컨대 p53 및 RB94)는 본 발명의 리포솜 복합체를 이용해서 성공적으로 전달되었다(미국 특허출원번호 2003/0044407 및 2007/0065499 참조).
유기인산제와 연관된 독성의 예방 또는 치료를 위한 양이온성 리포솜 복합체
상기 기술된 바와 같이, OP 생물 제거제로서 BChE의 사용은 예방을 위한 물질로서 사용될 수 있다. 그러나, 필요한 경우에 생산 및 충분한 양의 빠른 전달의 불가능은 이러한 화합물의 이용을 수행하는 데 주요한 장애물이다. 따라서, 순환계 및 다른 조직 예컨대 폐, 간 및 뇌에서 BChE의 발현 증가를 위한 방법의 개발이 결정적이다.
재조합 인간 BChE가 포유동물의 세포 배양, 형질전환 염소, 식물 및 누에 유충을 사용하여 생산되어왔다(23). 비록 이러한 재조합 BChE가 치사량의 소만 및 VX에 대한 보호에 성공적인 것으로 증명되었지만, 이러한 방법을 통한 생산은 많은 양의 GMP 원료 생산에 있어 많은 비용 및 잠재적 안정성 및 안전성 문제를 고려한다면 실현 불가능하다. 따라서, 다른 접근이 시도되어왔다. Parikh와 그의 동료들(23)은 마우스 BChE의 전달을 위해 아데노바이러스를 사용했다. 그들은 이러한 정맥내 투여된 Ad-MoBChE가 순수한 BChE의 멀티밀리그램(multimilligram) 주입과 동등한 수준에서 다중 LD50 용량의 OP VX로부터 및 에코티오페이트로부터 마우스를 보호할 수 있음을 발견했다. 비록 향상된 양의 BChE가 생산되지만, 그 성취된 수준은 최소한 250mg/70kg으로 측정된, 인간을 보호하기 위해 요구되는 BChE의 양의 생산을 의미하는 것은 아니다. 이에 대해 가능한 하나의 이유는 마우스에서 생산된 BChE 단백질이 테트라머 형태가 아니라, 대부분 포유동물에서 빠르게 제거되는 다이머(85%)라는 것이다. BChE의 치료적 잠재성은 연장된 기간 동안 순환계에 남아있는 그것의 능력에 의존한다. 이러한 안정성은 결과적으로 테트라머 구조의 유지에 의존한다. 더욱이, 전달 시스템에 있어 바이러스 벡터의 사용은 잠재적 면역원성 문제 및 정맥내 투여 및 단복 투여를 위한 필요성과 연관된 단점을 가진다.
따라서, 반복 투여와 연관된 면역원성 문제를 가지지 않고; 당업계에서 용이하게 자가 투여될 수 있으며; 더욱 중요한 것은, 순환계에서 증가된 시간으로 바람직한 테트라머 형태의 BChE의 유의적으로 높은 발현 수준을 야기하는 다른 방법이 개발되는 것이 필요하다. 본원에 기술된 리포솜 접근은 유전자 전달에 있어서 바이러스 방법론보다 뛰어난 면역원성의 결핍을 포함하는 많은 장점을 제공한다(24). 양이온성 리포솜은 안정하고 생체내 유전자 전달에 있어 효율적인 것으로 증명되었다(25,26). DNA 전달을 위해 양이온성 리포솜을 사용한, 미국 내에서의 85번을 포함하는 110번의 임상적 시도가 승인되었고(27) 6개 이상의 리포솜-기반 제품이 시장에 나와 있다(28).
본원에 기술된 바와 같이, 돌연변이 형태 예컨대 더욱 활성화된 BChE의 G117H 돌연변이 형태(예컨대 참고 문헌 11 참조, 개시는 전체로서 본원에 참고 문헌으로 포함된다)를 포함하는 BChE를 코딩하는 플라스미드, 및 테트라머화를 촉진하기 위해 프롤린이 풍부한 펩티드 유전자를 코딩하는 플라스미드(예컨대 rQ45)를 모두 운반하는 표적된 리포솜 복합체가 제공된다. 잠재적 OP 노출의 치료에 투여되는 경우, 유전자는 효율적으로 폐, 뇌 및 간을 포함하는 다양한 조직에, 신선하고, OP 저항성 있으며, 테트라머 hBChE이며, 지속적으로 생산되고 연장된 기간(예컨대 1일 내지 14일 또는 그 이상) 동안 순환계에 남아있는 상당히 높은 발현 수준으로 전달된다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 방법은 바람직하게는 신경 가스 노출의 가능성이 있는 경우에 보호를 위해서 설계된 예방을 위한 방법이고, 노출 후 치료적 OP 보호 조치로서의 방법이다. OP에 대한 개체의 감수성을 증가시킬 수 있는 인간 BChE의 유전적 변이체가 일반적인 것으로 확립되었다(29,30). 본원에 기술된 방법은 이러한 내재적인 유전적 감수성을 없애고 이러한 집단(subset) 및 일반적 집단 모두를 보호할 수 있는 높은 수준의 외인성, 활성 BChE를 제공할 수 있다.
리포솜 복합체의 제조
예시적인 구현예에서, 본 발명은 리간드-표적된(단백질/펩티드, 항체- 또는 항체 절편-표적된) 양이온성 리포솜 복합체의 제조방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 방법은 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)를 제조하는 단계, 및 리간드-표적된 양이온성 리포솜을 형성하기 위해서 리간드를 양이온성 리포솜과 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 리간드는 양이온성 리포솜에 직접 연관/복합되지만, 화학적으로 접합되지 않는다. 이후 리간드-표적된 양이온성 리포솜은 하나 또는 그 이상의 핵산 분자와 혼합된다.
구현예에서 핵산 분자는 양이온성 리포솜과 연관된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자 및 리간드-표적된 양이온성 리포솜 복합체를 형성하기 위해 양이온성 리포솜과 연관된 폴리프폴린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. BChE를 코딩하는 핵산 분자의 서열은 당업계에 이미 공지되어 있거나 그렇지 않으면 본원에 기술되어 있다. 예컨대 McTiernan, et al., “Brain cDNA clone for human cholinesterase,” Proc . Natl . Acad . Sci . 84:6682-6686, FIG. 2 참조, 이것의 개시는 모든 목적을 위해서 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 서열은 본원에 기술되어 있거나 그렇지 않으면 당업계에 공지되어 있다. 폴리프롤린이 풍부한 펩티드 도메인(프롤린-풍부 부착 도메인(PRAD)라고도 불림)을 포함하는 예시적인 랫트 콜라겐 꼬리의 아미노 말단 45 잔기(rQ45)를 코딩하는 예시적인 핵산은 예를 들어, Altamirano and Lockridge, Chemico -Biological Interactions 119-120:53-60 (1999) (57 페이지, 2.9 섹션 참조); Krejci et al., The Journal of Biological Chemistry 272:22840-22847 (1997) (22842 페이지, FIG. 1 참조); 및 Bon et al., The Journal of Biological Chemistry 272:3016-3021 (1997) (섹션 bridging 3016-3017 페이지 참조)에 개시되어 있다 (각각의 개시는 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다).
또 다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 리간드-표적된(예컨대 단백질/펩티드, 항체- 또는 항체 절편-표적된) 양이온성 리포솜 복합체의 제조방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 방법은 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)을 제조하는 단계, 리간드-표적된 양이온성 리포솜을 형성하기 위해서 리간드와 양이온성 리포솜을 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 리간드는 양이온성 리포솜에 화학적 접합을 통해서 직접적으로 복합화된다. 이후 리간드-표적된 양이온성 리포솜 복합체를 형성하기 위해서, 리간드-표적된 양이온성 리포솜을 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 핵산 분자와 혼합한다.
본원에 기술된 바와 같이, 핵산 분자는 공정 과정에서 하나 또는 그 이상의 핵산 분자와 리포솜의 단순한 혼합에 의해서 본 발명의 리포솜 복합체에 적절하게 캡슐화, 포함 또는 복합/연관되는 핵산 분자를 포함하는, 양이온성 리포솜과 연관된다. 핵산 분자:리포솜 복합체의 바람직한 비율은 이미 당업자에 의해서 정해져 있고 본원에 기술되어 있다.
구현예에서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 첫번째 플라스미드에 포함되고 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 두번째 플라스미드에 포함된다. 즉, 단백질은 다른 플라스미드로부터 코딩된다. 그러나, 또 다른 구현예에서, 단백질은 동일한 플라스미드로부터 코딩될 수 있다, 즉 유전자가 모두 동일한 플라스미드에 포함된다.
바람직하게, 핵산 분자를 코딩하기 위해 사용되는 두개의 구별된 플라스미드는, 그들이 코딩하는 유전자를 제외하고는 동일하다. 바람직한 구현예에서 BChE를 코딩하는 핵산 분자, 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 핵산 프로모터, 예를 들어, 이의 개시는 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된, 미국 특허출원번호 2007/0065432에 기술된 바와 같은 프로모터로부터 하류에 위치한다. 바람직하게는, 핵산 분자는, 5'에서 3'으로 (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는 플라스미드 구조(construct)에 위치하고, 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다. 구체적으로 본원에 참고 문헌으로 포함된, 미국 특허출원번호 2007/0065432의 FIG. 3 참조.
대안적으로 BChE를 코딩하는 핵산 분자, 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 동일한 구조에 존재하고, 그러나 BChE를 코딩하는 핵산 분자는 미국 특허출원번호 2007/0065432에 개시된 고 발현 프로모터로부터 하류에 위치하는 반면, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 RSV 또는 CMV와 같은 표준 프로모터로부터 하류에 위치한다.
예시적인 구현예에서, 핵산은 약 10:01 내지 약 0.1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 예시적인 구현예에서, 핵산은 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 예를 들어, 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10, 또는 5:1 내지 약 1:5, 또는 더욱 바람직하게는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰) 범위의 몰비로 리포솜에 존재하거나, 더욱 바람직하게는 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하거나 또는 더욱 바람직하게는 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 추가적으로 이러한 범위 밖의 몰비 또한 사용될 수 있다.
바람직하게, 핵산 분자 대 리포솜 복합체의 몰비는 약 0.5:1 내지 약 1:40(μg 총 핵산: μg 리포솜), 또는 약 1:1 내지 약 1:40(μg 총 핵산: μg 리포솜), 바람직하게는 약 1:5 내지 약 1:20(μg 총 핵산: μg 리포솜), 더욱 바람직하게는 약 1:10(μg 총 핵산: μg 리포솜)의 범위이다. 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자 대 리포솜 복합체의 몰비는 핵산 분자의 “집단(populations)”, 즉 하나 또는 그 이상의 BChE를 코딩하는 핵산 분자, 및 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 핵산의 총 양을 모두 포함한다.
전반적으로 기술된 바와 같이, 핵산 분자의 전달을 위한 적절한 양이온성 리포솜의 예는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트(DOTAP) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 및/또는 콜레스테롤(chol)의 혼합물; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB) 및 DOPE 및/또는 chol의 혼합물을 포함하는 양이온성 리포솜을 포함한다. 지질의 비율은 특정 표적 세포 유형을 위한 핵산 분자의 흡수 효율을 최적화하기 위해 다양해질 수 있다. 리포솜은 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 양이온성 지질(들) 대 중성 또는 헬퍼 지질(들)의 적절한 비율은 약 1:(0.5-3), 바람직하게는 약 1:(1-2) (몰비)이다. 본 발명의 분야에서 유용한 다양한 지질의 비율의 예는,
LipA DOTAP/DOPE 1:1 몰비
LipB DDAB/DOPE 1:1 몰비
LipC DDAB/DOPE 1:2 몰비
LipD DOTAP/Chol 1:1 몰비
LipE DDAB/Chol 1:1 몰비
LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
(DOTAP = 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트(dioleoyltrimethylaminnonium phosphate), DDAB = 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide); DOPE = 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine); chol = 콜레스테롤(cholesterol)).
을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
전반적으로 논의된 바와 같이, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 리간드는 항체 절편, 예를 들어 단일 사슬 Fv 절편, 예컨대 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv)이다. 바람직하게, 항체 또는 항체 절편은 표적된 양이온성 리포솜을 형성하기 위해서 양이온성 리포솜과 약 1:1 내지 약 1:100, 바람직하게는 약 1:10 내지 약 1:50(w:w), 더욱 바람직하게는 약 1:30, 또는 약 1:33(항체 또는 항체 절편:지질) 범위의 비율로 혼합된다. 추가적인 구현예에서, 리포솜은 또한 리포솜과 연관된, 엔도솜 방해 펩티드(endosomal disrupting peptide), 예컨대 Sigma-Genosys (The Woodlands, TX)로부터 제조된 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (HK) (서열번호 1) 펩티드를 포함할 수 있다. 엔도솜 방해 펩티드 HoKC는 세포의 세포질내 물질의 방출을 도와줄 수 있다.
예시적인 구현예에서, 양이온성 리포솜 제제 A(몰비 1:1로 DOTAP:DOPE), B (1:1로 DDAB:DOPE), G (1:1:1로 DOTAP:DOPE:콜레스테롤) 및 H (1:1:1로 DDAB:DOPE:콜레스테롤) 또는 전반적으로 기술된 임의의 지질 제제를 본원 및 실시예에 기술된 것과 같은 에탄올 주입 방법을 사용하여 제조한다. 펩티드(예컨대 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (HK) 펩티드)가 복합체에 포함된 경우에만, 각각의 리포솜 제제는 또한 바람직하게 총 지질의 5 몰 백분율로 MPB-DOPE를 포함한다. 펩티드 없이 제조된 복합체는 MPB-DOPE 를 포함하지 않고 따라서 리간드는 화학적 접합을 통해서 리포솜에 결합할 수 없다.
HoKC 펩티드 (K[K(H)KKK]5-K(H)KKC)가 말단 시스테인을 운반하기 때문에, 리포솜에 펩티드를 접합시키기 위해서 모든 리포솜 조성내에 MPB-DOPE를 포함하였다. Lip-HoKC 리포솜을 말레이미드기(maleimide group)를 운반하는 양이온성 리포솜(Lip-MPB) 및 펩티드의 짝지음 반응(coupling reaction)을 이용하여 제조하였다. 0.1 mMol 펩티드의 앨리쿼트와 시스테인의 자유 티올기(free thiol group)를 함께 10mM HEPES, pH 7.4 내 2mMol의 Lip-MPB 용액에 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 회전시킨다(20-30 r.p.m). 결과물인 Lip-HoKC는 1.4 mM 지질 농도를 갖는다.
HoKC 없이 TfRscFv:Lip:DNA 복합체를 생산하는 데 사용된 것과 동일한 방법으로 전체 복합체를 형성한다. 여기서 또한 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 항체 절편(TfRscFv)을 Lip-HoKC와 함께 부드럽게 뒤집으면서 특정 비율로 혼합하고, 상온에서 10분 동안 배양한다. 이후 핵산을 TfRscFv:Lip-HoKC 용액에 첨가하고, 부드럽게 뒤집어서 혼합하고 다시 15분 동안 상온에서 배양한다, 이후에 덱스트로스 또는 수크로오스를 최종 농도 5-10%가 되도록 첨가하고 다시 부드럽게 뒤집으며 혼합한다. TfRscFv:Lip-HoKC:핵산 복합체의 바람직한 비율은 0.3 mg:7 nmol:1 mg이다.
추가적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)를 제조하는 단계, 및 양이온성 면역리포솜을 형성하기 위해서 양이온성 리포솜의 표면에 리간드를 화학적으로 접합시키는 단계를 포함한다. 이후 리간드-표적된 리포솜 복합체의 형성을 위해서 양이온성 리포솜을 BChE를 코딩하는 플라스미드 구조(벡터), 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 플라스미드 구조(벡터)와 혼합한다. 양이온성 리포솜에 대한 화학적 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편) 접합의 예시적인 방법, 조성물, 비율 및 조건은 이의 개시가 전체로서 본원에 참고 문헌으로 포함된 미국 특허번호 7,479,276에 개시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단백질" "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 임의의 사슬 또는 두개 또는 그 이상의 아미노산의 서열을 의미하기 위해 사용되고, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질" ,"아미노산 사슬", 또는 사슬 또는 두개 또는 그 이상의 아미노산의 사슬을 지칭하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는, 용어 "단백질", "폴리펩티드," 및 "펩티드"의 정의 내에 포함된다.
또한 본 발명은 전반적으로 기술된 본 발명의 방법에 따라 제조된 양이온성 리포솜 복합체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 양이온성 리포솜, 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편), BChE를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자, 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함하는 리간드-표적된(예컨대 단백질/펩티드, 항체- 또는 항체 절편-표적된) 양이온성 리포솜 복합체를 제공하고, 여기서 리간드는 양이온성 리포솜에 직접적으로 복합/연관되지만 화학적으로 접합되지 않는다. 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)은 바람직하게 리간드 및 리포솜 사이의 상호작용(interaction) (예컨대 정전기적, 반 데르 발스, 또는 다른 비-화학적으로 접합된 상호작용)을 통해서 리포솜과 연관된다. 일반적으로, 링커 또는 스페이서 분자(예컨대 중합체 또는 다른 분자)는 비-화학적 접합의 경우에 리간드 및 리포솜에 부착되는데 사용되지 않는다.
본원에 기술된 바와 같이, 추가적인 구현예에서, 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)는 양이온성 리포솜에, 예를 들어 말레이미딜기 또는 다른 설프하이드릴-반응기를 포함하는 양이온성 리포솜, 및 리간드(예컨대 단백질/펩티드, 항체 또는 항체 절편)의 황 이온 사이의 화학적 상호작용을 통해서, 화학적으로 접합된다. 이후 리포솜-DNA 복합체를 형성하기 위해 핵산을 리포솜에 첨가하거나, 핵산을 우선 첨가하고 나중에 리간드와 복합시킬 수 있다. 이러한 방법은 이것의 개시가 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된 미국 특허번호 7,479,276에 개시되어 있다.
핵산 분자는 양이온성 리포솜 내에 캡슐화되고, 양이온성 리포솜의 탄화수소 사슬 부분에 포함되고, 양이온성 리포솜의 안쪽 또는 바깥쪽 단층(monolayer) (예컨대 헤드-기(head-group) 부위)과 연관, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 비록 몇몇의 동심원의 이중층을 포함하는 다중라멜라 리포솜 또한 사용될 수 있으나, 바람직하게, 본 발명의 양이온성 리포솜은 단일라멜라 리포솜(즉, 단일 이중층)이다. 본 발명의 단일 이중층 양이온성 리포솜은 핵산 분자가 캡슐화될 수 있는 내부의 수성 용적을 포함한다. 그들은 또한 핵산 분자가 탄화수소 사슬 부위(즉, 지질의 지질 사슬 부위)를 갖고 중성 또는 큰 전하를 띠지 않도록 조절된 핵산 분자가 포함될 수 있는 단일 이중층을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 예컨대 음전하 핵산 분자 및 양전하 리포솜 사이의 전하-전하 상호작용을 통해서 리포솜 막의 내부 단일막 및/또는 외부 단일막(즉, 지질의 헤드-기 부위) 각각 또는 모두와 복합 또는 연관될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 핵산 분자는 본 발명의 양이온성 리포솜 복합체의 임의의 또는 모든 이러한 부위에 캡슐화/연관/복합될 수 있다.
전반적으로 논의된 바와 같이, 핵산 분자는 바람직하게 약 0.1 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 10 몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 내지 10 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 0.1 몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰비로 존재한다; 추가적인 구현예에서 핵산 분자는 약 1 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 10몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 내지 10몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰비로 존재하고, 더욱 바람직하게는 핵산 분자는 약 5몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 내지 1몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 5몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 특히, 약 4몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 특히, 약 2몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 특히, 약 1몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 리포솜 복합체에 이용될 수 있다. 바람직한 지질, 표적 리간드 및 핵산 분자의 양/비율은 또한 전반적으로 기술되어 있다.
예시적인 구현예에서, 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자, 및 리포솜은 약 0.5:1 내지 약 1:40(μg 총 핵산:μg 지질), 바람직하게는 약 1:1 내지 약 1:40(μg 총 핵산:μg 지질), 또는 약 1:5 내지 약 1:20(μg 총 핵산:μg 지질), 예컨대 약 1:10(μg 총 핵산:μg 지질)의 질량 비율로 존재한다. 본 발명의 예시적인 리포솜 조성물은 약 1:10:0.33(μg 총 핵산:μg 지질:μg 단일 사슬 항체)(본원에 또한 scL로 지칭된다)의 질량 비율로, 총 핵산, 지질 및 리간드, 예컨대 단일 사슬 항체(예컨대 TfscFv)를 포함한다.
또한 본 발명은 전반적으로 기술된 리간드-표적된 양이온성 리포솜 복합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 항균제(예컨대 암포테리신 B, 클로레트라사이클린(chlortetracycline), 젠타마이신, 네오마이신), 하나 또는 그 이상의 보존제(예컨대 벤즈에토늄 클로라이드, EDTA, 포름알데히드, 2-페녹시에탄올), 하나 또는 그 이상의 완충액(예컨대 포스페이트 완충액, 소듐 보레이트, 소듐 클로라이드), 하나 또는 그 이상의 계면활성제(폴리소르베이트 20, 80), 하나 또는 그 이상의 단백질 안정제(예컨대 알부민, 락토오스, 포타슘 글루타메이트), 당류 예컨대 수크로오스 또는 덱스트로스, 및 애쥬번트(예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 부형제를 더 포함한다. 추가적인 부형제는 당업계에 공지되어 있고 이미 본 발명의 분야에서 사용될 수 있다.
이러한 특정 구현예에서, 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자는 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산과 같이 동일한 조성물 내에 전달되지만, 동일한 양이온성 리포솜에 캡슐화/연관되어서 보다는, 두개(또는 그 이상)의 다른 양이온성 리포솜과 연관되고 이후 동일한 조성물 내에 전달된다(즉, 두 개의 다른 리포솜 집단이 함께 혼합된다). 다른 구현예에서 BChE를 코딩하는 핵산 분자 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 함께 동일한 플라스미드 벡터 내에 포함될 수 있다. 또한 본 발명은 하나는 BChE를 코딩하는 핵산을 포함하고 하나는 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는, 두 개의 분리된 리포솜 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물의 사용을 위한 적절한 지질, 표적 분자 및 핵산 분자, 및 이러한 성분의 비율의 예는 전반적으로 기술되어 있다.
치료 및/또는 예방 방법
또한 본원에는 포유동물에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 치료 및/또는 예방 방법이 포함된다. 바람직하게 이러한 방법은 포유동물에 양이온성 리포솜 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합되지만 화학적으로 접합되지 않은 리간드, 양이온성 리포솜과 연관된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자(하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함하는), 및 동일한 또는 다른 양이온성 리포솜과 연관된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자(하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함하는)를 포함한다.
본원에 기술된 방법은 인간, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 원숭이 등을 포함하는 임의의 포유동물에 사용될 수 있다.
바람직하게, 방법은 유기인산제에 대한 노출에 연관된 독성의 치료를 위한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, OP 제제에 대한 노출과 연관된 독성의 “치료를 위한” 방법은 포유동물이 OP 제제에 노출된 이후, 포유동물이 OP 제제에 대한 노출과 연관된 독성을 극복하기 위해 BChE 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드의 치료적으로 유효한 양을 제공한다.
추가적인 구현예에서, 방법은 유기인산제에 대한 노출에 연관된 독성의 예방을 위한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, OP 제제에 대한 노출과 연관된 독성의 “예방을 위한” 방법은 포유동물이 OP 에 노출되기 전(즉 만약에), 포유동물이 미래의 OP 제제에 대한 노출과 연관된 독성을 극복하기 위해 BChE 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드의 치료적으로 유효한 양을 제공한다.
용어 “약학적으로 유효한 양”은 여기서 10 퍼센트 이상, 바람직하게는 20 퍼센트 이상, 또는 30 퍼센트 이상, 또는 40 퍼센트 이상, 더욱 바람직하게는 50-90 퍼센트 이상을 감소시키는 데 충분한 양을 의미하고, 더더욱 바람직하게는 예방(즉, 100 퍼센트 감소), 활성, 기능 및 OP 제제와 연관된 독성에 대한 포유동물의 반응에 있어 임상학적으로 유의한 결핍을 의미한다. 또한,“치료적으로 유효한 양"은 바람직하게는 포유동물에서 임상학적으로 유의한 병태의 개선을 야기하기에 충분하다.
해독제(즉, BChE)의 문맥에서, 종종 효율의 수준은 독성 물질(OP)의 특정 양의 보호/제거/해독의 관점으로 정의된다. 유용한 미터법 “LD50”은 화학 제제에 노출된 동물의 절반이 치사되기 위한 양이다. 따라서, “약학적으로 유효한 양”은 또한 일 LD50(즉, 1 x LD50 -- 1배 LD50) 이상의 독성 물질(OP)에 대항해 보호하기에 충분한 양이다. 본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게 제공된 방법은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 배(또는 그 이상) 이상의 LD50 의 OP 제제에 대한 노출을 치료할 수 있거나, 잠재적 노출을 치료할 수 있는 해독제의 양을 전달한다.
바람직하게 복합체는 1 x LD50의 유기인산제제, 5 x LD50 이하의 유기인산제제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해서 투여된다.
다른 구현예에서, 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제, 5 x LD50 이하의 유기인산제에 대한 잠재적 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해서 투여된다.
임의의 바람직한 방법은 복합체를 본원에 기술된 바와 같이 포유동물에 투여하는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 복합체는 비강내 투여, 정맥내 투여, 경구 투여, 설하 투여, 근육내 투여, 병소 내 투여, 피내 투여, 경피(transdermal) 투여, 안구내 투여, 복강내 투여, 경피(percutaneous) 투여, 에어로졸 투여, 기관내 투여, 대뇌내 투여, 국소 투여, 피하 투여, 내시경 투여, 점진적 감소 이식(slow release implant), 삼투압 또는 기계적 펌프를 통한 투여 및 흡입을 통한 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여된다. 가장 바람직하게, 복합체는 복합체 및 핵산의 폐 전달을 야기하는 비강내 또는 에어로졸 흡입 투여를 통해서 투여된다.
본원에 기술된 복합체의 투여용 폐 전달 장치는 당업계에 공지되어 있다. 폐 전달 장치는 개체에 의해 흡입되는, 전형적으로 약 0.01 μm 내지 약 4 μm의 활성제의 입자를 발생시킨다. 폐 전달 장치는 액체 또는 현탁액 유래의 활성제(즉, 본원에 기술된 리포솜복합체)의 흡입, 또는 선택적으로 부형제와 혼합된 건조 분말 형태로의 활성제의 흡입을 위해 널리 사용된다. 폐 전달 장치의 예는 정량흡입기(MDIs), 네뷸라이저(nebulizer), 및 분말식 흡입기(DPIs)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폐 전달 장치는 선택적으로 가압될 수 있고, 추진 시스템을 사용할 수 있다. 폐 전달 장치는 또한 에어로졸화된 활성제가 공중으로 달아나는 것을 방지하고, 개체가 흡입하는데 더 많은 시간을 허용하기 위해 고정 챔버(holding chamber), 예컨대 스페이서(spacer)를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 본 발명에 사용된 폐 전달 장치는 흡입에 의해 활성화될 수 있다, 예컨대 자동적으로 개체에 의해서 흡입되도록 활성제를 조제하고, 활성제를 포함하고 선택적으로 추진제를 포함하는 에어로졸 용기와 함께 사용될 수 있다. 이러한 장치는, 개체의 기관지 및 폐 상피로 조절된 일정한 용량의 활성제를 허용하게하는, 조절된 방법으로 많은 양의 정량을 투여할 수 있다. 폐 전달 장치의 예는 본원에 참고 문헌으로 포함된 미국 특허번호 5,290,539, 6,615,826, 4,349,945, 6,460,537, 6,029,661, 5,672,581, 5,586,550, 및 5,511,540에 개시되어 있다.
정량흡입기(MDIs)는 개체에 의해 흡입되는 일정한 부피의 활성제의 배출을 위한 추진제의 사용에 의해 작동한다. MDI는 또한 활성제의 응집을 예방하기 위해 계면활성제를 포함한다. 활성제는 용액에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추진제를 사용하는 MDI는 흡입 및 MDI의 활성이 동시에 일어나는 것이 요구될 수 있다. 고정 챔버, 예컨대 스페이서는 활성화 및 흡입의 동시 발생에 대한 요구를 제거하기 위해서 에어로졸화된 활성제를 저장하기 위해 사용될 수 있다. MDI는 일정한, 정량의 활성제를 제공하고, 일정한 투여량을 가능하게 한다. MDI의 예는 미국 특허번호 6,615,826 및 5,290,539에 개시되어 있다.
네뷸라이저는 분무의 생성, 즉 분무화(nebulizing) 또는 미립화(atomizing)에 의해서, 개체에 의해 흡입되는 용액내 활성제의 제제화를 발생시킨다. 활성제는 용액에 용해되거나 현탁될 수 있다. 물방울(droplet)은 팬(fan), 진동 멤버(vibrating member), 또는 초음파 장치의 사용을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서 생성된다. 네뷸라이저는 MDI 및 DPI보다 더 부드럽고 흡입제를 사용할 수 없는 개체, 예컨대 유아, 어린이, 및 심하게 아프거나 장애가 있는 개체를 위하여 적절하다. 네뷸라이저의 예는 미국 특허번호 6,748,945, 6,530,370, 6,598,602, 및 6,009,869에 개시되어 있다.
분말식 흡입기(DPIs)는 추진제를 사용하지 않고, 개체에 의해 흡입되는 건조 분말을 투여한다. 건조 분말을 분배하기 위해서, DPI는 활성제를 추진하기 위해, 공압 시스템(pneumatic system), 분말화된 팬, 또는 기계적 추진, 예컨대 용기의 압착을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 대신 DPI는 단순한 개체의 흡입에 의존할 수 있다. DPI에 활성제와 추진제의 혼합은 요구되지 않으며, 더 많은 페이로드의 활성제의 전달을 가능하게 한다. DPI의 예는 미국 특허 번호 6,029,661에 개시되어 있다.
종종, 폐 흡입을 위한 액체 또는 건조 분말 제제의 에어로졸화는 추진제를 필요로 한다. 추진제는 일반적으로 당업계에서 사용되는 임의의 추진제일 수 있다. 이러한 유용한 추진제의 구체적이고 비-제한적 예는 클로로틀로우로카본, 하이드로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 또는 트리플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라피오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 이들의 조합을 포함하는 하이드로카본이다. 추진제 제제의 예는 본원에 참고 문헌으로 포함된 미국 특허번호 5,672,581에 개시되어 있다.
폐 투여를 위한 당업계에 공지된 다른 방법 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 기관내 투여, 흡입제, 또는 삽관법 예컨대 주사기, 튜브, 또는 유사한 장치에 의한 용액, 분말, 또는 분무의 폐로의 전달을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 복합체에 사용되기 위한 리간드는 바람직하게 트랜스페린, 항체 및 항체 절편이다. 예시적인 항체 및 항체 절편은 전반적으로 기술되어있고 단일 사슬 Fv 항체 절편, 예컨대 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TgRscFv)를 포함한다.
구현예에서, 리간드-표적된 양이온성 리포솜은 양이온성 리포솜과 연관된 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (서열번호 1) 펩티드를 포함하는 펩티드를 더 포함한다. 양이온성 리포솜과 펩티드와 연관된 예시적인 방법은 본원에 개시되어 있다.
바람직한 구현예에서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 첫번째 플라스미드에 포함되고 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 두번째 플라스미드에 포함된다. 즉, 핵산 분자는 분리된 플라스미드에 포함되고, 각각의 플라스미드는 동일한 또는 다른 양이온성 리포솜과 연관되어있다(즉, 캡슐화되어있다). 또 다른 구현예에서, BChE를 코딩하는 핵산 분자 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 동일한 플라스미드에 포함될 수 있다, 즉 동일한 플라스미드로부터 발현된다. 그러나, 두 가지 분리된 플라스미드의 사용에 의해서, 각각의 핵산의 양, 및 이에 따라서 발현되는 각각의 단백질의 양은 분리되어 조절될 수 있고 핵산의 비율이 다양한 치료 또는 예방 프로토콜 및 효과에 최적화될 수 있다.
바람직하게, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다. 구현예에서, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 두번째 플라스미드 구조에 포함되고, 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다. 이러한 구조를 기술하고, 본원에 참고 문헌으로서 구체적으로 포함된 미국 특허출원번호 2007/0065432의 FIG.3 참조. 추가적인 구현예에서, 핵산은 당업계에 공지된 다른 프로모터에 의해 발현될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 핵산에 의해 발현되는 BChE는 BChE의 돌연변이 형태이다. 적절한 BChE의 돌연변이는 당업계에 공지되거나 그렇지 않으면 본원에 기술되어 있고, 바람직하게는 각각의 개시가 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된, Millard, C. B., Lockridge, O., & Broomfield, C. A. (1995), “Design and expression of organophosphorus acid anhydride hydrolase activity in human butyrylcholinesterase,” Biochemistry 34: 15925-15933; 및 Lockridge, O., Blong, R. M., Masson, P., Froment, M. T., Millard, C. B., & Broomfield, C. A. (1997), “A single amino acid substitution, Gly117His, confers phosphotriesterase (organophosphorus acid anhydride hydrolase) activity on human butyrylcholinesterase,” Biochemistry 36:786-795에 개시된 바와 같은 G117H 돌연변이를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게 양이온성 리포솜은 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함한다. 리간드:양이온성 리포솜의 예시적인 비율은 전반적으로 기술되어 있고, 바람직하게는 리간드 및 양이온성 리포솜이 약 1:1 내지 약 1:100(w:w) 범위의 비율로 존재하는 경우, 바람직하게는 리간드 및 양이온성 리포솜이 약 1:10 내지 약 1:50(w:w) 범위의 비율로 존재하는 경우, 또는 더욱 바람직하게는 리간드 및 양이온성 리포솜이 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하는 경우를 포함한다.
구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용되기 위한 양이온성 리포솜은 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드 및 다이올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물, 디에틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물, 또는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함한다. 추가적인 리포솜 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 핵산 분자는 약 8:1 내지 약 1:8(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 또는 약 7:1 내지 약 1:7(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 약 6:1 내지 약 1:6(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 약 4:1 내지 약 1:4(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 약 3:1 내지 약 1:3(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 약 2:1 내지 약 1:2(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비, 또는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다.
총 양의 핵산(즉 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자와 조합된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 양) 대 리포솜의 양의 바람직한 비율은 본원에 기술되어 있다. 바람직한 구현예에서, 질량 비율은 약 1:1 내지 약 1:40(μg 핵산:μg 리포솜), 더욱 바람직하게는 질량 비율은 약 1:5 내지 약 1:20(μg 총 핵산:μg 리포솜), 또는 질량 비율은 약 1:10(μg 총 핵산:μg 리포솜) 이다.
바람직하게, 비록 다른 구현예에서 핵산 분자가 양이온성 리포솜의 내부 또는 외부 단일막(예컨대 헤드-기 부위)과 연관될 수 있지만, 핵산 분자는 양이온성 리포솜의 내부에서 캡슐화된다.
OP 제제에 대한 노출과 연관된 독성의 치료방법의 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 복합체는 유기인산제에 대한 노출 직후에 투여된다, 즉 포유동물이 OP 제제와 접촉한 후 초(10, 20, 30, 초 등등) 분(1, 5, 10, 15, 20, 또는 30 또는 그 이상의 분), 시(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 시) 또는 일(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 일) 내에 투여된다. 일반적으로, 이러한 OP 제제와의 접촉은 제제의 흡입 및/또는 포유동물의 피부, 눈 또는 점막 접촉을 통해서 일어날 수 있다.
OP 제제에 대한 노출과 연관된 독성의 예방방법의 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출의 6시간 이상 전에 투여된다. 바람직하게, 본원에 기술된 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출의 10시간 이상, 12시간 이상, 15시간 이상, 20시간 이상, 24시간 이상, 36시간 이상 또는 48시간 이상 전에 투여된다. 추가적인 구현예에서 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출의 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상 또는 14일 이상 전에 투여된다. 바람직하게, 복합체는 OP 제제에 대한 잠재적인 노출 전 일주일에 1번 이상, 더욱 바람직하게는 일주일에 2번 이상 등 투여된다. 추가적인 구현예에서, 투여는 OP 제제에 대한 잠재적 노출 전, 매 10-14일에 한번씩 가능하다.
추가적인 구현예에서, 인간에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 치료방법이 제공된다. 바람직하게 이러한 방법은 인간에게 본원에 기술된 바와 같은 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합되지만 화학적으로 접합되지 않은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv), 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산은 약 1:5 내지 약 1:20(μg 핵산:μg 리포솜)의 비율로 존재한다. 구현예에서 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제의 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해서 투여된다.
또한 인간에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 예방방법을 제공한다. 바람직하게 이러한 방법은 인간에게 본원에 기술된 바와 같은 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접적으로 복합되지만 화학적으로 접합되지 않은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv), 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산은 약 1:5 내지 약 1:20(μg 총 핵산:μg 리포솜)의 비율로 존재한다. 바람직하게 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산화제제의 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해서 투여된다.
전반적으로 기술된 바와 같이, 바람직하게 BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다. 구현예에서 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다.
구현예에서, BChE는 BChE의 돌연변이 형태, 예컨대 G117H 돌연변이다.
예시적인 지질, 핵산 대 리포솜의 비율 및 리포솜과 연관된 핵산의 예시적인 비율은 본원에 기술되어 있다.
바람직하게 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하고, 더욱 바람직하게 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하고, 가장 바람직하게 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰), 또는 약 2 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1 몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 약 1 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1 몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰비로 존재한다.
바람직하게 핵산 분자는 양이온성 리포솜의 내부에서 캡슐화된다.
본원에 기술된 바와 같이, 바람직한 복합체는 5 x LD50 까지의 유기인산제의 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해서 투여된다. 구현예에서, 복합체는 유기인산제에 대한 노출 이후에 즉시 투여된다
본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게 복합체는 5 x LD50 까지의 유기인산제의 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해서 투여된다. 바람직하게 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 6시간 이상 전에 투여된다. 구현예에서, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 1주 전 1회 이상 투여된다.
또한 본원에 포유동물에 양이온성 리포솜 복합체를 비강내 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하는 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 포유동물(예컨대 인간)의 혈류에 전달하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게 양이온성 리포솜 복합체는 양이온성 리포솜, 양이온성 리포솜에 직접 복합되지만 화학적으로 접합되지 않은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv), 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 및 동일한 또는 상이한 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
바람직하게 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산 분자는 약 1:5 내지 약 1:20(μg 핵산:μg 리포솜)의 비율로 존재한다.
본원에 기술된 다양한 방법의 구현예에서, 바람직하게 복합체는 인간의 혈류내 BChE의 양이 250mg/70kg(BChE의 질량/인간의 질량) 이상 존재하도록 투여된다. 바람직하게, 복합체는 인간의 혈류내 BChE의 양이 200mg/70kg(BChE의 질량/인간의 질량) 이상, 더욱 바람직하게는 225 mg/70kg 이상, 250 mg/70kg 이상, 275 mg/70kg 이상, 300 mg/70kg 이상, 325 mg/70kg 이상, 350 mg/70kg 이상, 또는 400 mg/70kg 이상 존재하도록 투여된다.
전반적으로 기술된 바와 같이, 바람직하게 BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다. 바람직하게 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는다.
대안적으로 BChE를 코딩하는 핵산 분자, 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 동일한 구조에 존재하고, 그러나 BChE를 코딩하는 핵산 분자는 미국 특허출원번호 2007/0065432에 개시된 고 발현 프로모터로부터 하류에 위치하는 반면, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 RSV 또는 CMV와 같은 표준 프로모터로부터 하류에 위치한다.
구현예에서, BChE는 BChE의 돌연변이 형태, 예컨대 G117H 돌연변이다.
예시적인 리포솜의 조성물 및 다양한 성분에 대한 비율은 본원에 기술되어 있다. 바람직하게, 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재한다.
바람직하게 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하고, 더욱 바람직하게는 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하고, 더욱 바람직하게는 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰) 또는 약 2 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 2 몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 1 몰의 하나 또는 그 이상의 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자, 대 약 1 몰의 하나 또는 그 이상의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰비로 존재한다.
바람직하게 본원에 기술된 리포솜 복합체는 BChE 유전자(예컨대 돌연변이 BChE) 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드 유전자를 운반하는 두 개의 공동-캡슐화된 플라스미드 벡터를 포함하고, 1 내지 21일 동안 순환계에서 활성화 상태인 테트라머 BChE의 수준(40% 이상, 더욱 바람직하게는 70%-90%의 테트라머 형태)을 생산한다. 바람직하게 본원에 기술된 방법은 치료적으로 유효한 양을 얻을 수 있는 수준의 효소를 생산한다. 고 발현 프로모터의 조절 하에 BChE를 코딩하는 플라스미드 벡터 및 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 플라스미드를 캡슐화하는 본 발명의 복합체가 활성 수준, 및 활성 BChE의 단백질 발현 길이를 달성할 수 있다는 사실은 뜻밖이었다.
방법에 대한 다른 적절한 변형 및 적용 및 본원에 기술된 설명이 본 발명의 범위 또는 이들의 임의의 구현예로부터 벗어나지 않고 만들어진다는 것은 당업자에게 자명하다. 지금까지 본 발명에 자세하게 기술된 것, 동일한 것은 하기의 실시예를 참조하여 더욱 명확히 이해될 것이고, 단지 예시적인 목적을 위한 것으로 포함되며 본 발명을 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1
scL 전달된 wtp53 유전자의 제1상 임상실험에서 개체에서 유래한 전이성 종양 내 형질전환 유전자(외인성 p53)의 존재
본 실시예는, 외인성 wtp53 DNA, SGT-53를 코딩하는 scL 나노복합체(약 1:10:0.33(μg 총 핵산:μg 지질:μg 단일 사슬 항체)무게의 비율로 총 핵산, 지질 및 단일 사슬 항체 TfscFv를 포함하는 본 발명의 리포솜 조성물) (본원에서 scL로도 지칭된다)에 의해 성공적으로 전달된 형질전환 유전자가 치료받은 환자의 종양에 존재함을 증명한다. SGT-53의 종양 전달을 평가하기 위해서, 오픈 라벨, 단일 기관, 순차적인 용량 증가, 안전성, 약리역학을 평가하는 제1상 임상실험에 있는 개체로부터 유래한 종양 내의 SGT-53 복합체에 의해 전달된 외인성 p53 유전자 및 고형 종양을 가진 개체 및 모든 표준 또는 승인된 치료를 제공받은 자 안에서 SGT-53의 잠재적 활성을 결정하기 위해 DNA PCR을 수행했다. 개체에 투여된 SGT-53의 용량을 0.6mg DNA/주입에서 3.6mg/ DNA/주입으로 확대했다. 연구 약물을 매주 두번씩 5주 동안 총 10번의 주입으로 투여했다. 2 개체에서 SGT-53의 마지막 투여 후 24 내지 96시간 이내에 가장 접근이 용이한 종양의 생검을 수행했다. 20 mg 이상의 종양 조직을 얻었다. 시료가 종양을 포함하는지 확인하기 위해서 동결 시료에 대해 현미경 검사를 수행했다. 종양 조직을 동결 상태로 만들었고 종양내 외인성 wtp53의 존재 및 수준을 동정하기 위해 DNA PCR에 사용했다. 두 가지 경우 모두에서, 종양 시료를 전이 병소로부터 얻었다. 벡터에 있는 하나의 프라이머 및 p53 인서트(insert)에 있는 하나의 프라이머를 이용해서 700bp 조각을 증폭하였다. 이러한 접근을 사용해서, 외인성 p53 형질전환 유전자만을 증폭하였다. 가장 낮은 용량(0.6mg/주입)(T1) 및 3.6mg/주입 용량(T2)으로 한 치료의 종료 이후에 종양 생검을 환자로부터 얻었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 외인성 p53의 증폭된 700bp 조각이 두 종양에 모두 명백히 존재했다. 더욱 중요한 것은, 형질전환 유전자가 표적된 전달로 예측되는 것과 같이 용량 의존적 방법으로 존재한다는 것이다.
실시예 2
pSCMV 벡터로의 클로닝 이후 단백질 발현의 증가
본원에 개시된 바와 같이, 고 발현 프로모터의 조절 하에 유전자를 위치시키는 것의 결과로서 단백질 발현이 증가를 도 2에 나타내었다. 인간 세포를 pSCMV 벡터로 클로닝된 유전자를 운반하거나, 또는 원래의 구조 내에 있는 scL(하기의 실시예 7에 기술된 것과 같이 제조하였다)로 형질감염(transfection)시켰다. 형질감염 24시간 후에, 특정 유전자의 발현을 웨스턴 분석방법으로 측정하였다. 이러한 특정 유전자로부터 발현된 정제된 단백질이 양성 대조군으로 그리고 단백질 위치를 확인하기 위해 겔에 포함되었다. 표준 프로모터를 사용한 원래의 구조(X457)의 단백질 발현과 비교하여 pSCMV 클론(X455)에서 10배 이상 높은 수준의 특정 단백질 발현을 관찰하였다(도 2). 더 긴 노출을 하면 특정 밴드가 X457에 존재한다(데이터는 나타내지 않음). GAPDH 수준이 동일한 단백질이 로딩됨을 증명한다. UT = 처리되지 않은 세포(untreated cells); + Con = 위치를 확인하기 위해 정제된 단백질.
실시예 3
혈액뇌장벽 및 표적 신경 세포(neuronal cell)를 가로지르는 scL 리포솜 복합체의 능력
뇌에서 혈액뇌장벽 및 표적된 신경 세포의 가로지르는 능력을 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3에서, Balb/C 마우스에 하기의 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조된 GFP 유전자를 포함하는 pSCMV 고 발현 플라스미드(도 3a) 또는 형광으로 표시된 올리고뉴클레오티드(6-FAM-ODN)(도 3b)를 운반하는 scL을 주입하였다. 24 또는 48시간 후 뇌를 절개하여 Maestro® In Vivo Imaging System (Perkin Elmer)을 사용하여 이미지화했다. 두 가지 경우 모두에서, 자유(캡슐화되지 않은) GFP DNA 또는 자유(캡슐화되지 않은) 6-FAM-ODN로 축적/신호의 수준을 비교한 경우 scL-전달된 페이로드로 주입된 마우스의 뇌에서 유의적으로 더 높은 수준의 형광 신호 축적을 발견하였다.
하기의 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조된, TfR을 표적하고 GFP(100 μg cDNA)를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 리간드-리포솜 복합체를 랫트의 목 정맥 카테터를 통해서 주입했다. 수술 후 회복 24-36 시간 후, 동물을 희생하였고 관상 40μm뇌 단면을 형광 현미경을 통해서 분석하였다. 예상한 바와 같이, 비-표적된 리포솜-GFP는 뇌에서 검출가능한 EGFP(+) 세포를 생성하지 못했다(도 4b). 반면, Tf-Lip-DNA 주입은 피질 및 해마에서 넓은 EGFP 발현(대부분 신경 세포내)을 나타내었고, 이는 TfR-표적된 벡터가 생체내에서 성인 뉴런에 유전적 페이로드를 전달하기 위해 혈액뇌장벽을 가로지름을 나타낸다. Tf-Lip-EGFP cDNA의 정맥내 주입에 따라 많은 EGFP(+) 뉴런(화살표) 및 신경망(화살표)가 해마에서(CA1 영역)(A1) 및 피질(A2)에서 발견되었다. 파브알부민 IF 염색은 EGFP(+) 뉴런의 신경 분포를 나타낸다.
실시예 4
비강내 투여 후 scL 전달에 의해 향상된 루시퍼라제 발현 및 조직 흡수
하기의 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조된, 자유(캡슐화되지 않은), 또는 scL-캡슐화된 플라스미드 DNA 중 하나로서 루시퍼라제 유전자를 Balb/c 마우스에 비강내로 투여하였다. 마우스에 비강내 투여 24시간 후에 복강내로 루시페린(Luciferin)을 주입했고 IVIS® (Xenogen) In Vivo Imaging system (Perkin Elmer)으로 이미지화했다. 도 5에 유전자 발현의 수준 차이를 나타내었다.
이러한 마우스 실험에서 비강내 투여 이후 scL 전달된 레포터의 흡수의 시간 및 수준을 측정하였다. FITC 표시된 분자(100 μg)를 캡슐화하는 상기 개시된 비율을 이용해서 제조된 scL 나노복합체를 면역력이 있는 마우스에 비강내로 투여했다. 투여 후 6-48 시간에, 동물을 인도적으로 안락사시켰다. 간, 폐 및 뇌 조직을 절개하였고 각각의 시간에 각 기관의 FITC 양성 세포의 수를 결정하기 위한 유세포 분석을 수행하였다. 세 개의 모든 기관에서 FITC 양성 세포의 백분율이 16 내지 30시간 사이에서 피크임을 발견했다. 피크 시간에서 형질감염된 각 조직내 세포의 백분율은 다양했다. 예상과 다르지 않게, 가장 많은 %의 FITC 양성 세포가 폐에서 발견(~20-40%)된 반면, 3-4% 양성 세포가 뇌에서 발견되었고 간 세포의 ~1.5%가 scL 전달된 분자를 운반했다. 그러나, Marino (20)에 기초하면, 간은 가장 큰 기관이기 때문에, 간 세포의 1.5%가 비교적 많은 숫자인 ~2.25 x 107 세포임을 알아야 한다. 유사하게, 폐내의 20-40% 양성 세포는 ~5.7 x 107 세포를 나타내는 반면, 뇌내의 3-4% 양성 세포는 ~4.4 x 106 세포와 동일하다.
실시예 5
시험관내 카르바콜(Carbachol)에 의한 ERKI/Ⅱ 발현의 도입
카르바콜(carbachol)은 아세틸콜린 수용체에 결합하고 활성화시키는 약물이다(작용제). 따라서 카르바콜의 처리는 OP 제제의 모방 효과를 낸다. 카르바콜은 뇌에서 ERKI/Ⅱ 발현을 유도함이 증명되었다(21). 카르바콜의 폐 암 세포의 처리는 ERKI/Ⅱ의 발현을 유도할 수 있고 무스카린성 아세틸콜린 수용체의 경쟁적 저해제(길항제)인 아트로핀(atropine)의 사전 처리는 이러한 유도를 저해할 수 있다(도 6). 인간 A549 세포를 이러한 반응을 시험하기 위한 모델로 사용했다. 100μM 아트로핀(최종 농도)으로 30분 동안 사전 처리한 또는 사전처리 하지 않은 A549를 100 μM(최종 농도) 카르바콜로 처리했다. 30분 후 세포를 수확하였고, 단백질을 분리하고 60μg의 총 세포 단백질을 ERKI 및 ERKⅡ 단백질 모두를 검출하는 항체를 사용한 웨스턴으로 분석하였다. Lane 1=단백질의 낮은 기초 수준을 나타내는 처리되지 않은(유도되지 않은) 세포; Lane 3=카르바콜 처리 후 유도된 발현; Lane 2=아트로핀으로 사전처리한 후 카르바콜의 처리 이후 ERKI/Ⅱ 유도의 결핍. 따라서, 이러한 카르바콜 유도된 ERKI/Ⅱ의 발현 저해는 시험관내 및 생체내 모두에서 scL-mtBChE/scL-ppol 처리의 효율을 평가하기 위한 하류의 분자적 대용물(surrogate)로 사용될 수 있다.
실시예 6
고 발현 벡터 pSCMV로 클로닝
wt 인간 BChE(huBChE), 인간 BChE의 돌연변이 형태(mtBChE) G117H(이의 개시가 본원에 모든 목적으로 전체로서 참고 문헌으로 포함된, 예컨대 McTiernan, et al., “Brain cDNA clone for human cholinesterase,” Proc . Natl . Acad . Sci . 84:6682-6686, FIG. 2 참조) 또는 미국 특허출원번호 2007/0065432에 개시된 고 발현 프로모터의 하류의 폴리프롤린이 풍부한 펩티드(ppro) (Altamirano and Lockridge, Chemico -Biological Interactions 119-120:53-60 (1999) (57 페이지, 2.9 섹션 참조); Krejci et al., The Journal of Biological Chemistry 272:22840-22847 (1997) (22842 페이지, FIG. 1 참조); 및 Bon et al., The Journal of Biological Chemistry 272:3016-3021 (1997) (섹션 bridging 3016-3017 페이지 참조) 참조, 각각의 개시는 본원에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다) 중 하나를 포함하는 플라스미드 벡터를 제조했다. 플라스미드 벡터(pSCMV)는 표준 구조보다 2-10배 더 높은 관심 유전자의 발현 수준을 야기했다. 이러한 고 발현 플라스미드, pSCMV는 pBR322 플라스미드 백본에서 유래하고 또한 다중 클로닝 부위를 포함하고, 항생제 카나마이신에 저항성을 부여하는 유전자를 가진다. 이러한 플라스미드를 인간 임상 실험에 사용하기 위해서 cGMP 조건 하에서 두 개의 다른 종양 억제 유전자를 운반하도록 제조했다. 따라서 구조는 인간에 사용하기 위한 FDA에 승인될 수 있다. 표준 공정, 및 당업자에게 공지된 제한효소 부위(restriction site)를 사용해서, 원래의 백터에서 유래한 1.8Kb BChE 및 ~300Bp ppro 인서트(11)를 pSCMV의 다중 클로닝 부위에 서브클로닝하였다(도 7). 그 결과로 얻은 플라스미드를 상업적으로 구입할 수 있는 박테리아 숙주인 TOP 10 F1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 접종하였다. 이후 플라스미드 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법을 이용해서 제조하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드를 시험하였다. 분석은 260:280 비율이 >1.9 임, 집단 내에 >75%의 초나선 분자가 존재함(도 8), 측정되지 않는 수준의 내독소를 나타내었다.
실시예 7
실시예 6에서 생산된 클론의 시험관내 특성
huBChE, mtBChE 또는 ppro 유전자 중 하나를 운반하는 pSCMV 플라스미드는 BChE 활성, T1/2의 수준으로 그리고 활성 및 테트라머화를 위한 ppro에 대한 BChE의 최적의 비율을 결정하는 것으로 특징지어진다. 하기에 기술된 연구를 위해 상업적으로 구매할 수 있는(ATCC로부터) 세포주, CHO(Chinese hamster ovary), 인간 폐암 A549 세포 또는 인간 전립선암 DU145 세포를 사용했다. 기초 수준의 BChE 활성을 가지는, CHO를 이러한 세포가 이전에 Lockridge 및 그의 공동 연구자들을 포함하는, 다른 연구원들에 의해서 BChE 활성의 연구에서 사용되었기 때문에(11), 지속성을 목적을 위해 사용하였다.
BChE 발현 수준의 측정
scL-wtBChE/ppro 및 scL-mtBChE/ppro 복합체를 형성하기 위해서 pSCMV-wtBChE 또는 pSCMV-mtBChE 벡터를 scL 나노복합체에서 pSCMV-ppro 벡터와 함께 캡슐화하였다. 인서트의 캡슐화를 위해서 벡터를 인서트의 4:1 몰비(pSCMV-mtBChE 대 pSCMV-ppro)로 혼합하였다. TfRscFv 리간드, 리포솜 및 총 플라스미드 DNA의 비율은 0.33μg 대 10μg 대 1μg(TfRscFv 대 리포솜 대 DNA)이다. 복합체를 성분의 단순한 혼합에 의해서 기술된 비율로(32) 형성하였다.
예시적인 리포솜 성분
LipA DOTAP/DOPE 1:1 몰비
LipB DDAB/DOPE 1:1 몰비
LipC DDAB/DOPE 1:2 몰비
LipD DOTAP/Chol 1:1 몰비
LipE DDAB/Chol 1:1 몰비
LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
(DOTAP = 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트(dioleoyltrimethylaminnonium phosphate), DDAB = 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide); DOPE = 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine); chol = 콜레스테롤(cholesterol)).
Campbell, MJ (Biotechniques 1995 Jun. 18(6):1027-32)에 개시된 것으로부터 변형된 에탄올 주입 방법에 의해서 리포솜을 제조했다. 간단히, 모든 지질을 에탄올에 용해시키고 혼합하고, Hamilton 주사기로 50-60℃의 증류수에 주입하여 볼텍싱(vortexing)하였다. 용액을 추가적으로 10-15분 동안 더 볼텍싱하였다. 최종 농도가 1-8mM 총 지질이다.
단일 사슬 단백질 대 혼합된 복합체 내의 리포솜 및 DNA의 기술된 비율로 TfRscFv-면역리포솜 복합체(본원에 기술된 바와 같이 다른 리간드 또한 사용될 수 있다)를 TfRscFv와 리포솜 조성물 A(또는 상기 제시된 임의의 리포솜 조성물)의 혼합에 의해서 제조하였다. 복합체의 제조는 하기의 일반적 방법에 따른다.
적절한 양의 2 mM 내지 8mM 리포솜(상기 기술된 A-H)을 적절한 부피를 위해 필요한 임의의 물(예컨대 DI 물)과 혼합하고 혼합하기 위해 10번 부드럽게 뒤집거나, 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RPM으로 1-2분 동안 회전시켰다. 리포솜-물 혼합에 대해, 적절한 양의 TfRscFv, 항체 또는 항체 절편을 요구되는 비율을 위해서 첨가하고 약 5-10초 동안 부드럽게 뒤집어서 혼합하거나 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RPM으로 1-2분 동안 회전시켰다. 이러한 혼합물을 상온에 10-20분 동안 방치한다(약 5분 후 다시 부드럽게 5-10초 동안 뒤집어준다). 동시에, pSCMV-wtBChE 벡터, 또는 pSCMV-mtBChE 벡터 및 pSCMV-ppro 벡터 구조(BchE 대 ppro 인서트의 몰비가 10:1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 4:1, 2:1 또는 1:1로)를 포함하는 적절한 양의 DNA를 적절한 부피를 위해 임의의 물과 5-10초 동안 뒤집어서 혼합하거나, 더 큰 부피에 대해서 20-30 RPM으로 1-2분 동안 회전시켰다. 전형적으로, 생체내 사용을 위해서, 약 5 μg 내지 약 100 mg의 DNA/투여(IN, 경구, 에어로졸, IV, IP, IM 등을 포함한다)의 제공이 바람직하다.
DNA 용액을 빠르게 TfRscFv(또는 항체 또는 항체 절편)-리포솜 용액에 첨가하고 혼합물을 5-10초 동안 뒤집어주거나 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RPM으로 1-2분 동안 회전시켰다. 최종 혼합물을 상온에 10-20분 동안 방치하고, 약 5분 후 다시 부드럽게 5-10초 동안 뒤집어준다. 생체내 사용을 위해서, 50% 덱스트로스 또는 50% 수크로오스를 최종 농도의 5-10%(V:V)가 되도록 첨가하고 부드럽게 5-10초 동안 뒤집어주거나, 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RMP으로 1-2분 동안 회전시켰다. 구체적인 실시예에서 TfRscFv 대 리포솜 대 DNA의 바람직한 비율(w:w)은 하기와 같이 0.33 μg 대 10 μg 대 1μg이다. 최종 부피 800μl 내 40μg의 총 DNA가 되도록, 183μl의 물과 280μl의 2 mM 리포솜 용액과 혼합한다. 34μl의 TfRscFv(0.4μg/ml의 농도로)를 첨가한다. 183μl 물을 40μl의 1μg/1μl DNA와 혼합한다. 마지막 단계로 80μl의 50% 덱스트로스 또는 160μl의 50% 수크로오스를 첨가한다.
{K[K(H)KKK]5-K(H)KKC} 펩티드 (HoKC)가 복합체에 포함되는 경우, 양이온성 리포솜 제제 A (몰비로 1:1의 DOTAP:DOPE), B (1:1로 DDAB:DOPE), G (1:1:1로 DOTAP:DOPE:콜레스테롤) 및 H (1:1:1로 DDAB:DOPE:콜레스테롤) (또는 상기 제시된 임의의 리포솜 제제)가 상기 기술된 바와 같이 에탄올 주입 방법의 사용에 의해서 제조된다. 또한 각각의 리포솜 제제는 총 지질의 5 몰 백분율의 MPB-DOPE를 포함한다. HoKC 펩티드가 말단 시스테인을 운반하기 때문에, MPB-DOPE는 리포솜에 펩티드의 접합을 가능하게 하기 위해서 모든 리포솜 조성물내에 포함된다. Lip-HoKC 리포솜을 말레이미드기를 운반하는 양이온성 리포솜(Lip-MPB) 및 하기와 같은 펩티드 사이의 짝지음 반응(coupling reaction)을 이용하여 제조하였다. 0.1 mmol의 펩티드의 엘리쿼트를 시스테인에 있는 자유 티올기와 함께 10 mM HEPES내에 있는 2 mmol의 Lip-MPB 용액, pH7.4에 첨가하였고, 상온에서 2시간 동안 회전시켰다(20-30 r.p.m). 그 결과로 얻은 Lip-HoKC는 1.4 mM 농도의 지질을 갖는다.
리포솜이 HoKC를 포함하는 경우, HoKC 없이 TfRscFv-Lip-DNA 복합체를 생산하기 위해 사용한 것과 동일한 방법으로 전체 복합체를 형성하였다. 또한 여기서 TfRscFv 또는 임의의 항체 또는 항체 절편(Fab' 또는 Mab를 포함한다)을 Lip-HoKC와 특정 비율로 혼합하였고(부드럽게 10번 뒤집거나 또는 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RMP으로 1-2분 동안 회전에 의해서), 상온에서 10-20분 동안 배양하였다. 이후 DNA를 TfRscFv(또는 항체 또는 항체 절편)-Lip-HoKC 용액에 첨가하고, 부드럽게 10번 뒤집거나 또는 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RPM으로 1-2분 동안 회전시키고, 다시 상온에서 10-20분 동안 배양하고, 이후에 덱스트로스 또는 수크로오스를 최종 농도 5-20%가 되도록 첨가하고, 부드럽게 10번 뒤집거나 또는 더 큰 부피에 대해서는 20-30 RPM으로 1분 동안 회전에 의해서 혼합하였고, 10-20분 동안 상온에서 배양하였다. 복합체내 TfRscFv:LipA-HoKC:DNA의 비율은 0.3 mg:7 nmol:1 mg이다.
scL 나노복합체의 크기를 측정하기 위해서 Malvern Zetasizer NanoZS 를 갖는 동적 레이저 광 산란(DLS)을 사용하였다. 복합체의 크기는 바람직하게 400nm 이하이다. 이러한 기구는 또한 나노복합체의 전반적인 전하의 결정 요인인, 제타-전위(zeta-potential)을 측정할 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 복합체에 있어서 전하는 바람직하게 양성, 약 20 내지 50mV 사이이다. scL-wtBChE/ppro 또는 scL-mtBChE/ppro의 크기, 전하 및/또는 활성의 조절을 위해서 요구에 따라 성분의 비율 의 변형을 수행할 수 있다.
상기 기술된 바와 같이 제조된 나노복합체의 크기를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00001
제타 전위는 20-40 범위 내이다.
CHO 세포, DU145 또는 A549 세포를 6개의 웰 플레이트에 ~2 x105세포/웰로 또는 24 웰 플레이트에 2x104세포/웰로 플레이팅했다. 이러한 초기 실험에서 형질감염을 위한 총 DNA 용량은 0.1 내지 2μg/웰이다. 이러한 용량은 종종 이러한 세포 수로 형질감염한 경우에 이러한 용량이 가장 적절함을 나타냈던 선행한 형질감염 경험에 기초한다. 24시간 후 세포를 상기 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 제조된 scL-wtBChE/ppro 또는 scL-mtBChE/ppro 복합체로 형질감염하였다. 또한 대조군으로 역할을 위해서 CHO 세포를 변형되지 않은 CMV 또는 RSV 프로모터를 가지는 scL 캡슐화된 원래 벡터 구조로 형질감염하였다. 모든 실험에서 형질감염되지 않은 세포가 또한 배양되었다. pSCMV 플라스미드로 한 이전의 경험에 기초하면, 24시간 이내에 유의적인 단백질 발현이 있다. 따라서, 형질감염 후 ~24시간에 Karnovsky 및 Roots (23, 33)의 방법에 의하여 4-30% 구배 겔에서 2mM의 부티릴티오콜린 염색으로 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 각각의 시료 내(세포 및 상청액 모두)BChE 테트라머, 다이머 및 모노머의 상대적 양을 측정했다. 정제된 혈장 huBChE를 대조군으로 포함하였다. 형질감염 이후 검출된 BChE 단백질에서 2배 이상의 증가가 양성 결과로 생각되었다.
이러한 실험의 결과의 예를 도 9-11에 나타내었다. CHO 세포 또는 A549 세포를 24 웰 플레이트에 ~2x104 세포/웰로 플레이팅하였다. scL 나노복합체를 돌연변이 BChE를 코딩하는 플라스미드에 ppro 유전자를 코딩하는 두번째 플라스미드를 더해서 캡슐화하여 제조하였다. 이러한 플라스미드에서 유전자는 본 명세서에 기술된 표준 거대세포바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하 또는 고 발현 벡터(pSCMV)의 조절 하에 있다.
CHO-K1 세포로 한 실험에서, 상기 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 복합체를 제조하였다. 각각의 scL 나노복합체 내의 총 DNA는 30μl 내에서 1μg/웰이다. pSCMV 프로모터의 조절 하에 있는 mtBChE 유전자를 운반하는 벡터 및 pSCMV 프로모터의 조절 하에 있는 ppro 유전자를 운반하는 벡터를 캡슐화하는 scL 나노복합체를 위해서, 22.4μl의 2 mM 리포솜 용액을 63.5μl 물에 첨가하였다. 리포솜-물을 5.08 μl의 TfRscFv(0.34μg/ml의 농도로)와 혼합하였다. 양이온성 리포솜-TfRscFv 혼합물에 3.2 μg의 총 DNA(특정 BChE + ppro 벡터)를 최종 부피가 5.02 μl로 첨가하였다. 세포에 최종 scL 나노복합체의 3, 9 또는 18μl(각각 0.1, 0.3 및 0.6 μg의 총 DNA를 나타낸다)의 scL 나노복합체를 첨가하였다.
이러한 실험에서 BChE 플라스미드 DNA 대 ppro 플라스미드 DNA의 몰비는 4:1이다. Karnovsky 및 Roots (23, 33)의 방법에 의하여 4-30% 구배 겔에서 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 2mM의 부티릴티오콜린 염색에 의해 외인성 BChE의 발현을 측정했다. 도 9에 나타낸 바와 같이 scL-mtBChE/ppro 나노복합체로 형질감염된 CHO-K1 세포에서 DNA 용량은 BChE 증거의 발현 증가에 의존한다. 예상과 달리, 거의 100%의 BChE가 활성 테트라머 형태로 존재한다.
A549 세포를 상기 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 scL-CMV mtBChE/ppro 또는 scL-pSCMV mtBChE/ppro 중 하나로 형질감염하였다. CMV 프로모터의 조절 하에 있는 mtBChE 유전자를 운반하는 벡터 및 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 ppro 유전자를 운반하는 벡터를 캡슐화하는 scL 나노복합체, 또는 pSCMV 프로모터의 조절 하에 있는 mtBChE 유전자를 운반하는 벡터 및 pSCMV 프로모터의 조절 하에 있는 ppro 유전자를 운반하는 벡터를 캡슐화하는 scL 나노복합체를 위해서, 14μl의 2 mM 리포솜 용액을 32.83μl 물에 첨가하였다. 리포솜-물을 3.17μl의 TfRscFv(0.21μg/ml의 농도로)와 혼합하였다. 양이온성 리포솜-TfRscFv 혼합물에 3.2 μg의 총 DNA(특정 BChE + ppro 벡터)를 최종 부피 10.19(CMV 프로모터) 또는 31.39μl(pSCMV 프로모터) 내에 첨가하였다. 충분한 무혈청 배지를 최종 부피가 100μl 되도록 첨가하였다. scL 나노복합체의 최종 scL 나노복합체의 25μl(0.5μg의 총 DNA를 나타낸다)를 세포에 첨가하였다. 이러한 실험에서 BChE 플라스미드 DNA 대 ppro 플라스미드 DNA의 몰비는 4:1이다.
Karnovsky 및 Roots (23, 33)의 방법에 의해서 4-30% 구배 겔에서 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 2mM의 부티릴티오콜린 염색에 의해 각각의 scL 복합된 플라스미드에 있는 BChE 발현의 수준을 두 시점에서 측정하였다. 도 10(형질감염 후 16일) 및 도 11(형질감염 후 28일)에 나타낸 바와 같이, 두 시점 모두에서 표준 CMV 프로모터에 의한 조절 하에 있는 플라스미드로 형질감염된 것에 비해서 고 발현 pSCMV 포로모터의 조절 하에 있는 BChE 및 ppro를 운반하는 scL에 의해 형질감염된 세포에서 유의적으로 더 높은 수준의 BChE 발현이 있었다. 예상과 달리, 발현에 있어서 이러한 증가는 시간이 지남에 따라서(28일) 더 커진다.
BChE 활성 수준의 측정
고 발현 pSCMV 프로모터 또는 표준 CMV 프로모터 조절 하의 플라스미드를 갖는 scL-wtBChE/ppro, 또는 scL-mtBChE/ppro 로, 그리고 상기 기술된 대조군으로 CHO DU145 및 A549 세포의 형질감염을 수행하였다. 감염 후 24시간에, Ellman 분석법(34,35)의 방법에 의해서 세포 및 상청액에서 BChE 활성의 수준을 결정하였다. 25℃에서 0.1M 포타슘 포스페이트, 0.5mM 디티오비스니트로벤조산(dithiobisnitrobenzoic acid) 내의 1mM 부티릴티오콜린으로 412nm에서의 흡광도를 관찰하는 방식으로 BChE 활성을 결정하였다. 13,600 M- 1 cm-1의 몰 흡광 계수를 이용해서 기능적 활성을 계산했다. 이러한 실험은 이전에 원래 변형되지 않는 벡터와 함께 보고된 결과에 대한 유사체인, pSCMV 벡터 내에서 wtBChE 클론 이상의 mt의 증가된 활성을 확인하기 위해서 설계되었다. pSCMV-wt BChE 클론에 비해서 pSCMV-mtBChE에서 BChE 활성의 2배 이상의 증가는 바람직하다.
DU145 세포에서 이러한 실험의 예는 하기에 나타내었다. scL 나노복합체 내 mtBChE를 코딩하는 pSCMV 플라스미드 DNA 대 ppro를 코딩하는 pSCMV 플라스미드 DNA의 다른 몰비를 DU145 세포에서 수행했다. 이러한 실험에서 2:1(표 3) 및 4:1(표 4)의 몰비를 사용하였다. 24 웰 플레이트의 웰당 2.5x104 DU145 세포를 접종하고 24시간 후에 형질감염하였다. 실시예 7에 상기 개시된 공정을 이용해서 0.33μg TfRcFv 대 10μg 리포솜 대 1μg 총 DNA의 동일한 비율을 사용해서 scL 나노복합체를 제조했다. 각각의 scL 나노복합체에 대해서, 최종 부피 5.3μl내에(5.3μl를 만들기 위해 필요한 추가적인 1X 트리스:EDTA 완충액과 함께) 2μg의 총 DNA(적절한 비율로 pSCMV-BChE 및 pSCMV-ppro)를 사용하였다. 3.17μl의 TfRscFv(0.34μg/ml의 농도로)를 4.7μl 물 및 14μl의 2 mM 리포솜에 첨가하였다. 이러한 TfRscFv-리포솜 혼합물에 5.3μl의 상기 DNA를 첨가하였다. 3μl의 무혈청 배지를 첨가하고 그 결과물을 세포에 첨가하기 전에 부드럽게 뒤집어서 혼합하였다. 각각의 scL 나노복합체내 총 DNA는 25μl 내에서 0.5μg/웰이다. Ellman 분석법에 의해서 측정한 BChE 활성의 수준의 결과를 하기의 표 3 및 4에 나타내었다.
표 3 DU145 세포 0.5μg DNA의 형질감염(mtBChE : ppro 비율 = 2:1):
Figure pct00002
표 4 DU145 세포 0.5μg DNA의 형질감염(mtBChE : ppro 비율 = 4:1):
Figure pct00003
모든 비율에 있어서 표준 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 경우보다 유전자가 고 발현 프로모터에 클로닝된 경우에, 형질감염 후 BChE 활성의 수준이 더 높으며, 이는 이러한 접근 사이의 차이점을 나타내고 최근 당업계에서 다른 사람들에 의해 사용된다.
mtBChE 클론이 wt보다 더 높은 활성을 가지는 것을 확인한 후, mtBChE 클론만을 추가적인 실험에 사용하였다. 표준 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 경우 보다 고 발현 프로모터의 조절 하에 있는 구조로 유전자가 클로닝되는 경우 더 높은 활성을 가짐을 확인한 후, 이러한 클론만을 추가적인 실험에 사용하였다.
최적의 몰비 결정
CHO 및/또는 A549 세포의 형질감염을 위한 scL 복합체내 pSCMV-mtBChE 인서트 대 pSCMV-ppro 인서트의 몰비는 가장 많은 양의 테트라머 및 활성을 야기하는 비율의 설정에 따라 다양하다. 몰비(pSCMV-mtBChE 대 pSCMV-ppro)은 4:1; 1:1 및 1:4이다. 형질감염 후 24 시간에, 세포 및 상청액을 수확하고 Ellman 분석법을 통해서 활성을 결정하였다. 테트라머, 다이머 및 모노머의 상대적인 양을 상기에 기술된 바와 같은 비-변성 겔 전기영동을 통해서 측정하였다. scL-mtBChE/ppro 인서트가 40% 이상, 더욱 바람직하게는 70%-80%의 테트라머 형태를 생산하는 것이 바람직하다. 바람직한 수준의 테트라머를 달성하는 데 사용하기 위한 비율의 변형이 가능하다.
scL 나노복합체 내의 mtBChE를 코딩하는 pSCMV 플라스미드 DNA 대 ppro를 코딩하는 pSCMV 플라스미드 DNA의 다른 몰비를 사용하는 실험을 DU145 세포에서 수행하였다. 이러한 실험에서 몰비는 2:1, 1:1 또는 1:2(BChE:ppro)로 사용하였다(표 5). 24 웰 플레이트의 웰당 2.5x104 DU145 세포를 접종하고 24시간 후에 형질감염시켰다. 실시예 7에 상기 개시된 공정을 이용해서 0.33μg TfRcFv 대 10μg 리포솜 대 1μg 총 DNA의 동일한 비율을 사용해서 scL 나노복합체를 제조했다. 1μg의 TfRscFv(0.34μg/ml의 농도로)에 10μl 물을 첨가했다. 여기에 7μl의 2 mM 리포솜 용액을 첨가했다. 각각의 scL 나노복합체에 대해서, 최종 부피 5μl 내 1μg의 총 DNA(적절한 비율로 pSCMV-BChE 및 pSCMV-ppro)를 15μl의 물과 혼합하고 이후 TfRscFv-리포솜 용액에 첨가했다. 이후 62μl의 무혈청 배지를 첨가하고 그 결과물을 세포에 첨가하기 전 부드럽게 뒤집어서 혼합하였다. 각각의 scL 나노복합체에 있는 총 DNA는 30μl 내에서 0.3μg/웰이다.
표 5 scL 나노복합체내 다른 비율의 pSCMV-BChE 대 pSCMV-ppro로 DU145 세포의 형질감염:
Figure pct00004
발현/활성의 피크(peak) 및 지속의 결정
pSCMV 플라스미드로 했던 이전의 경험에 기초하면, 유의적 단백질 발현은 형질감염 후 ~24 시간에 시작하고 4-5일 까지 지속된다. 따라서, BChE 발현 및 활성의 피크 시간을 결정하기 위해서, CHO 및/또는 A459 세포를 바람직한 몰비로 제조된 scL-mtBChE/ppro로 형질감염시켰다. 0일(처리 전) 부터 형질감염 후 14일까지 매일 세포 및 상청액을 수확하였고, BChE 활성 수준을 Ellman 분석법을 통해서 결정하였다. 테트라머 형태의 BChE의 상대적 양에 있어 유의적 증가 및 정상 hBChE와 유사한 활성 커브 및 T1/2가 바람직하다. 1 내지 14일 또는 그 이상의 mtBChE 활성이 바람직하다. 실시예 7에 있는 상기 기술된 실험의 결과(도 10 및 11 및 표 3-5)는 본 명세서의 scL 나노복합체의 사용시의 시간이 지남에 따른 BChE의 테트라머 형태의 발현 및 BChE의 활성의 증가를 증명한다.
실시예 8
시험관내 효율의 측정
카르바콜은 아세틸콜린 수용체에 결합하고 활성화시키는 약물이다(작용제) 따라서, 카르바콜의 처리는 OP 제제의 모방 효과를 낸다. 화학 작용제의 사용이 엄격하게 규제되기 때문에, 카르바콜을 신경 작용제 모델 화합물로 사용된다. 카르바콜은 인간 폐암 A549 세포내 ERKI/Ⅱ의 발현을 유도하고, 이러한 유도는 무스카린성 수용체 길항제 아트로핀의 사전처리에 의해서 반전된다(도 6). 본 실시예에서, 형질감염된 scL-mtBChE/ppro의 시험관 내에서 OP에 대한 보호 능력을 대리 종점(surrogate end-point)으로서 ERKI/Ⅱ의 발현을 이용하여 조사하였다.
A549 세포를 바람직한 비율에서 scL-mtBChE/ppro로 형질감염시켰다. 피크 발현/활성 시점에서, 세포를 100 μM 카르바콜로 처리했다. 30분 후 세포를 수확하고 ERKI/Ⅱ 발현 수준을 웨스턴 분석법으로 결정하였다. 처리되지 않은 세포 및 카르바콜, 또는 scL-mtBChE/ppro 만으로 처리된 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 수확하고, 단백질을 이전에 기술된 바와 같이(13) 분리하였다. 40 μg의 총 단백질을 SDS PAGE 전기영동에 의해서 분리하고, 나일론 멤브레인에 이동시키고 ERKI 및 ERKⅡ 단백질 모두를 검출하는 항체를 프로브로 하여, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템 (GE Lifesciences)을 이용해서 신호를 검출하였다.
scL-mtBChE/ppro를 사용한 예방 치료는 바람직하게 카르바콜 유도된 ERKI/Ⅱ의 발현을 저해한다. 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70%, 가장 바람직하게는 90% 또는 그 이상의 최대의 저해를 성취하기 위해서 다양한 용량의 scL 나노복합체를 시험했다. 50% 이상의 저해가 관찰되지 않은 경우, scL의 용량을 성취될 때까지 적절하게 증가시켰다(비율 변화 없음). 더욱이, 카르바콜 처리 시점에서, Ellman 분석법에 의해서 ERKI/Ⅱ의 하향-조절과 연관된 BChE 활성의 수준을 결정하기 위해 세포 및 상청액의 일부를 사용했다.
실시예 9
마우스에서 기초 BChE 수준의 확립
인간 BChE 결핍의 모델로 형질전환 동형 접합성 BChE 넉아웃 마우스(BChE-/-)가 개발되었고(29) Jackson Laboratories 로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 이러한 마우스는 C57BL/6 백그라운드(BChE+/+)이다. 따라서, 당업계에 공지된 방법(29)을 사용하여, Ellman 분석법에 의해서 BChE-/- 넉아웃 및 C57BL/6 마우스내 혈장, 폐, 뇌 및 간 조직에서 기초 수준의 BChE 활성을 결정하였다. BChE 넉아웃 마우스(BChE-/-)내 혈장, 폐, 뇌 및 간에서 BChE의 기초 활성은 바람직하게는 각각, 0 + 0.005, 0.01 + 0.02, 0.02+ 0.02 및 0.09+ 0.05 U/ml (혈장) 및 U/mg (조직)의 범위다. C57BL/6 마우스(BChE+/+) 내 혈장, 폐, 뇌 및 간에서 BChE의 기초 활성은 바람직하게 각각 1.5 + 0.3, 0.38 + 0.2, 0.2+ 0.1 및 3.0 + 0.5 U/ml (혈장) 및 U/mg (조직)의 범위이다.
문헌(34,35) 내에 공지된 잘 확립된 프로토콜을 이용해서 상기 기술된 것과 같은 Ellman 분석법에 의해서 정상, 처리되지 않은 C57BL/6 마우스(BChE+/+)의 혈장에서 BChE 활성의 수준을 측정하였다. 두 마우스 개체를 시험하였다. BChE의 배경 수준이 0.014 + 0.0009 U/ml (평균 + 표준오차)임을 발견했다.
실시예 10
카르바콜에 대한 마우스의 기초 반응의 확립
기초 수준 이상의 ERKI/Ⅱ 발현의 2배 이상 증가 결과를 야기하는 카르바콜의 용량을 확립하기 위해서 C57BL/6 마우스를 사용했다. 0.15, 0.55 또는 1.5μmol/Kg(36) 용량의 카르바콜을 9-12주령 암컷 C57BL/6 마우스에 복강내로, 5 마우스/용량으로 투여했다. 투여 후 30분에, 마우스를 인도적으로 안락사시켰고 폐, 뇌 및 간을 제거하고, 단백질을 분리하고 ERKI/Ⅱ 발현 수준을 본원에 기술된 바와 같이 결정하였다. ERKI/Ⅱ 발현에 있어 2배 이상의 증가를 생산하고, 마우스에 외적인 독성을 야기하지 않는, 카르바콜의 용량(0.15 내지 1.5μmol/Kg, 더욱 바람직하게는 0.55 μmol/Kg)은 바람직하다.
실시예 11
동형접합성 음성 BChE 넉아웃 마우스(BChE-/-)에서 생체내 연구
동형접항성 음성 넉아웃 마우스가 BChE 활성이 거의 결여되므로, 그들은 scL 복합체에서 pSCMV-mtBChE 대 pSCMV-ppro의 최적의 몰비를 확인, 생체내 사용을 위한 비강내 투여된 복합체의 투여되는 용량 및 결과적인 기간 및 피크 발현을 확인하기 위해 좋은 모델이다.
Ellman 분석법에 의해서 BChE 활성을 위한 시험관내에서 결정된 pSCMV-mtBChE 대 pSCMV-ppro의 최적의 몰비의 주변 및 이를 포함하는 총 3개의 비율을 측정하였다. 다른 비율로 제조된 scL 복합체를 비강내 주입을 통해서 9-12 주령 암컷 BChE-/- 마우스에 투여했다(15 마우스/군). 처리되지 않은 마우스를 대조군으로 사용했다. 인간 혈장 BChE의 T1/2가 11-14일임에 따라, 0일(처리 전)부터 14일까지 매일 각 군으로부터 2마리의 마우스를 희생하였고 활성의 시간 경과 및 피크를 결정하기 위해서 각 시점에서 혈장내 BChE 활성의 수준을 Ellman 분석법에 의해서 측정하였다. 또한, 본원에 기술된 바에 따른 비-변성 겔 전기영동을 통해서 활성에 연관된 혈장 내 테트라머, 다이머 및 모노머의 상대적 양을 측정하였다. 가장 높은 BChE 활성 및 가장 긴 지속성을 나타내는 10:1 내지 1:10(pSCMV-mtBChE 대 pSCMV-ppro의 인서트의 몰비), 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 4:1의 비율을 최적의 생체내 DNA 용량을 찾기 위해서 사용하였다. 발현의 최적 시간은 4 내지 11일이다.
최적의 비율을 사용해서, scL 나노복합체를 통해서 비강내 투여된 DNA 용량은 다양하다. 초기에, 3가지 용량: 100, 75 및 50 μg의 총 DNA를 시험했다. 비강내 주입을 통해서 특정 DNA 용량으로 9-12 주령 암컷 BChE-/- 마우스(15 마우스/용량)에 본원에 기술된 것과 같이 제조된, scL-mtBChE/ppro 복합체를 투여했다. 처리되지 않은 마우스를 대조군으로 사용했다. scL-mtBChE/ppro 나노복합체를 50 내지 400 μL의 총 부피로 투여했다. 마취된 마우스 등을 손바닥에 고정했다. 마우스를 아래쪽으로 머리가 약 30도로 기울여지도록 고정하고, 10μL의 나노복합체를 천천히 동물의 콧구멍으로 떨어뜨렸다. 다른 콧구멍에 추가적으로 10 μL를 투여하기 전에 동물을 30 내지 60초 기간 동안 쉬도록 했다. 이 과정을 전체 용액이 투여될 때까지 수행하였다. 100μL 이상의 부피에 대해는, 마우스에 대한 적은 스트레스를 위해 투여 사이의 더 많은 시간을 허용하기 위해서 각 100μl 이후에 용액을 받는 동물이 교대되도록 했다. 동물이 받은 용액을 상기 결정된 피크 발현 시간에, 동물을 인도적으로 안락사시키고 각 DNA용량에서 혈장의 BChE 활성의 수준을 Ellman 분석법에 의해서 결정했다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 비-변성 겔 전기영동을 통해서 각각의 DNBA 용량에서 혈장내 테트라머, 다이머 및 모노머의 상대적인 양을 측정하였다. 최적의 DNA 용량은 혈장에서 500U/ml 이상의 BChE 활성을 나타내고 40% 이상, 더욱 바람직하게는 70%-90% 테트라머 형태를 야기한다.
실시예 12
BChE+/+ 마우스에서 외인성 mtBChe의 활성 측정
마우스의 종류가 BChE+/+ 이므로, 이러한 모델은 인간 집단에 대해 더욱 유사하다. scL-mtBChE/ppro 복합체 내 DNA의 최적의 용량/비율을 본원에 기술된 바와 같이 비강내 주입을 통해서 9-12 주령 암컷 C57BL/6 마우스(20 마우스/군)에 투여했다. 처리되지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 피크 발현 시간에서, 동물을 인도적으로 안락사시키고 혈장 내 BChE 활성의 수준을 Ellman 분석법에 의해서 결정했다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 비-변성 겔 전기영동을 통해서 혈장 내 테트라머, 다이머 및 모노머의 상대적인 양을 측정하였다. 내인성 기초 수준보다 2배 이상 더 많은 BChE 활성의 수준이 바람직하다.
실시예 13
생체내 효율 연구
이러한 연구에서 4가지 군의 정상 C57BL/6 마우스를 사용하였다: 군 1=처리되지 않은 대조군; 군 2=카르바콜 단독 처리; 군 3= scL-mtBChE/ppro 나노복합체 단독의 비강내 처리; 군 4= 카르바콜 처리 이후 scL-mtBChE/ppro 나노 복합체 비강내 처리. scL 복합체 내 최적의 DNA 용량을 pSCMV-mtBChE 대 pSCMV-ppro 벡터(본원에 기술된 바와 같이 제조됨)의 최적의 비율로 9-12 주령 암컷 C57BL/6 마우스(10마우스/군)에 비강내 투여했다(본원에 기술된 바와 같이). BChE 피크 발현 시점에, 군 2 및 4의 동물을 카르바콜의 최적의 용량(0.15 내지 1.5 μmol/Kg, 더욱 바람직하게는 0.55 μmol/Kg)을 받게 하였다(복강내). 카르바콜 투여 30분 후, 마우스를 인도적으로 안락사시켰고 혈장 내 BChE 활성의 수준을 Ellman 분석법에 의해서 측정하였다. ERKI/Ⅱ의 하향-조절과 연관된 폐, 뇌 및 간 조직내의 ERKI/Ⅱ 발현을 또한 웨스턴 분석법에 의해서 조사하였다. scL-mtBChE/ppro 복합체로부터 유래한 독성의 징후를 조사하기 위해 마우스의 체중을 측정했다. mAChR 활성화를 포함하는, 다양한 세포외 신호에 대한 집중 부위로서 작용함이 밝혀진, 무스카린성 작용제, 카르바콜이 무스카린성 아세틸콜린 수용체(mAChR)을 자극하고 ERKI/Ⅱ를 활성화시킴을 나타내었다. scL 복합체를 이용한 예방을 위한 치료는 바람직하게 카르바콜 유발된 ERKI/Ⅱ 발현의 저해를 야기한다. 50% 이상의 ERKI/Ⅱ 저해가 바람직하다. scL 복합체 내 DNA 용량은 성취될 때까지 바람직하게 변형된다(비율 변화 없음). 대안적으로, 카르바콜 로 처리 전에, 다중 투여, 3일마다 총 3번의 투여가 제시될 수 있다.
실시예 14
마우스에서 항-OP 제제로서 scL-mtBChE/ppro의 예방을 위한 사용
마우스에서 비강내 투여된 scL-mtBChE/ppro 나노복합체에 의해서 제공된 연장되고 지속된 보호는 화학 신경 작용제-자극 화합물인, 에코티오페이트(echothiophate) (Wyeth-Ayerst)의 증가하는 용량의 시험에 의해서 결정된다. 야생형 종류인 C57BL/6 마우스(BChE+/+) 마우스를 사용하여 에코티오페이트로 실험을 수행하였다. 50-100 μg 총 pSCMV-mtBChE/pSCMV-ppro DNA (바람직한 인서트의 몰비(10 대 1 내지 1:10 [mtBChE 대 ppro], 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 4:1로)의 용량으로 scL-mtBChE/ppro을 본원에 기술된 바와 같이 비강내 투여했다. 한 마우스 군은 scL-mtBChE/ppro 나노복합체를 받지 않았다. BChE 활성의 분석을 위해서 비강내 투여 전 및 scL-mtBChE/ppro 투여 후 11-21일동안 간격으로 나타낸 모든 마우스로부터 혈장을 수집하였다. 비강내 투여 후 피크 활성의 날(4 내지 11일)에 기초 체온, 몸무게 및 관찰을 기록하였다. 마우스를 2 x LD50의 에티오페이트(200μg/kg)으로 피하에 시험했다. 마우스를 에코티오페이트 시험 후 1시간 동안 지속적으로 관찰했다. 축방향 체온 및 콜린성 독성의 징후(서트라우브 테일(straub tail), 구부리고 있는 자세, 및 떨림)를 독물 시험 후에 주기적으로 관찰했다. 빈사 직전의 마우스를 즉시 안락사시켰다. 첫번째 2 x LD50 시험에 생존한 동물을 첫번째 시험 3시간 이후에 또 다른 2 x 또는 3 x LD50으로 시험하였다. 4 x 또는 5 x LD50 조합된 용량의 에코티오페이스트에 생존한 동물에 동일한 방법에 따라서 몇시간 이후에 추가적인 LD50 용량으로 주입하였다.
대조군 마우스는 첫번째 2 x LD50 용량의 에코티오페이트 이후 몇분 이내에 죽을 것으로 예상된 반면, scL-mtBChE/ppro를 받은 동물은 2 x LD50의 누적되는 용량의 에코티오페이트에 생존하는 것으로 예상된다. 에코티오페이트로 첫번째 시험 시간에 혈장 내 가장 높은 수준의 mtBChE를 발현하는 마우스는 가장 높은 수준의 에코티오페이트 시험에 생존할 것으로 예상된다. 용인된 LD50 용량 및 시험에서 혈장 BChE 수준 사이의 연관성이 예상된다.
실시예 15
인간에서 OP 신경 작용제에 대한 노출 전과 후의 예방/치료를 위한 scL-mtBChE/ppro의 사용
나노복합체를 제조하는 동안 두 pSCMV 플라스미드 DNA를 10:1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 4:1의 인서트의 몰비(BChE 대 ppro)로 혼합하였다. 나노복합체는 바람직하게 HoKC가 복합체의 성분이 아닌 경우 0.33μg:10μg:1μg (TfRscFv:Lip:DNA)의 비율로, 부형제로서 5-20% 덱스트로스 또는 수크로오스와 함께; 그리고 복합체가 HoKC를 포함하는 경우 0.3 mg:7 nmol:1 mg (TfRscFv:Lip-HoKC:DNA)의 비율로 5-20% 덱스트로스 또는 수크로오스와 함께 제조된다. 복합체 내 DNA의 총 양은 0.01 내지 10 mg/kg/투여이다.
이러한 방법에 의해서 제조된 복합체의 최종 크기는 Malvern ZETASIZER® NANO-ZS를 사용한 동적광산란에 의해서 결정된 것으로서 바람직하게 양성 제타 전위(10 내지 50mV)를 갖는 약 50 내지 500 (nm) 사이이다. 이러한 크기는 효과적으로 폐 상피를 통과하고 순환계로 들어가고 혈액 뇌관문을 가로지르기에 충분히 작다.
상기와 같이 제조된 복합체는 바람직하게 예방 또는 치료제로 사용된다. 예방을 위해서, 상기와 같이 제조된 리간드-표적된 양이온성 리포솜 나노복합체는 많은 경로, 바람직하게는, 흡입, 비강내, 경구, 설하 등을 통해서 인간에게 투여된다. 상기와 같이 제조된 리간드-표적된 양이온성 리포솜 나노복합체는 또한 다른 경로 예컨대 IM, IV, IP ID 등을 통해서 투여될 수 있다.
예방을 위해서, 1 x LD50 이상, 및 5 x LD50까지의 신경 작용제(농약을 포함한다)에 대한 보호를 위해 유효한 양의 BChE 신경 작용제 중화 효소를 생산하기 위해서 나노복합체는 신경 작용제에 노출되기 전 6시간 이상에 한 번 및 바람직하게는 약 24 내지 48시간에, 자가 투여될 수 있다. 또한 그것은 독성 신경 작용제(농약을 포함한다)에 대한 임의의 잠재적 노출 전 3개월 이상 전에 정기적으로(일주일에 한번 또는 두번) 자가 투여될 수 있다. 자가-투여의 바람직한 방법은 흡입, 비강내, 경구, 설하 등을 통한 것이나, 다른 자가-투여 방법 예컨대 IM, IV, IP, ID 등 또한 사용될 수 있다.
치료적 사용을 위해서, scL-BChE/ppro 나노복합체는 자가-투여 또는 다른 개체에 의한 투여에 의해서, 신경 작용제(농약을 포함한다)에 대한 노출 이후 임의의 시간에 노출 후 즉시 시작하여 투여될 수 있다. 나노복합체는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있고 의학적으로 필요한 한 반복적으로(매 24시간마다) 투여될 수 있다.
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본 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허 명세서는 각 문헌, 특허 또는 특허 명세서가 구체적인 것과 동일한 정도로 참고 문헌으로서 본원에 포함되고 각각은 참고 문헌으로서 포함된 것으로 지칭된다.
<110> Georgetown University <120> TREATMENT FOR EXPOSURE TO NERVE AGENT <130> IP_FH1503 <150> US 61/783001 <151> 2013-03-14 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized - HoKC <400> 1 Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Cys 20 25 30

Claims (69)

  1. 포유동물에 양이온성 리포솜 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는:
    (a) 양이온성 리포솜;
    (b) 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은, 리간드;
    (c) 양이온성 리포솜과 연관된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자; 및
    (d) 양이온성 리포솜과 연관된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인, 포유동물에서 유기인산제(organophosphate agent)에 대한 노출과 연관된 독성의 치료 또는 예방 방법.
  2. 제1항에 있어서, 방법은 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 치료를 위한 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 방법은 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 예방을 위한 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 복합체는 비강내 투여, 정맥내 투여, 경구 투여, 설하 투여, 근육내 투여, 병소 내 투여, 피내 투여, 경피(transdermal) 투여, 안구내 투여, 복강내 투여, 경피(percutaneous) 투여, 에어로졸 투여, 기관내 투여, 대뇌내 투여, 국소 투여, 피하 투여, 내시경 투여, 점진적 감소 이식(slow release implant), 삼투압 또는 기계적 펌프를 통한 투여 및 흡입을 통한 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해서 투여되는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 복합체는 비강내 또는 에어로졸 흡입 투여를 통해서 투여되는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 리간드는 트랜스페린, 항체 및 항체 절편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 리간드는 단일 사슬 Fv 항체 절편인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단일 사슬 Fv 항체 절편은 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv)인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 리간드-표적된 양이온성 리포솜은 양이온성 리포솜과 연관된 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (서열번호 1) 펩티드를 포함하는 펩티드를 더 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 첫번째 플라스미드에 포함되고 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 두번째 플라스미드에 포함되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 상기 BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, BChE는 BChE의 돌연변이 형태인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, BChE의 돌연변이 형태는 G117H 돌연변이인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 양이온성 리포솜은 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 리간드 및 양이온성 리포솜은 약 1:1 내지 약 1:100(w:w) 범위의 비율로 존재하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 리간드 및 양이온성 리포솜은 1:10 내지 약 1:50(w:w) 범위의 비율로 존재하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 리간드 및 양이온성 리포솜은 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 리포솜은 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물, 또는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 핵산 분자의 총 양은 약 1:1 내지 약 1:40(핵산 μg :리포솜 μg)의 질량 비율로 존재하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 핵산 분자의 총 양은 약 1:5 내지 약 1:20(총 핵산 μg :리포솜 μg)의 질량 비율로 존재하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 핵산 분자의 총 양은 약 1:10(총 핵산 μg :리포솜 μg)의 질량 비율로 존재하는, 방법.
  28. 제1항에 있어서, 핵산 분자는 양이온성 리포솜의 내부에 캡슐화되는, 방법.
  29. 제1항에 있어서, 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해 투여되는 것인, 방법.
  30. 제1항에 있어서, 복합체는 5 x LD50 까지의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해 투여되는 것인, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해 투여되는 것인, 방법.
  32. 제1항에 있어서, 복합체는 5 x LD50 까지의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해 투여되는 것인, 방법.
  33. 제29항 또는 제30항에 있어서, 복합체는 유기인산제에 대한 노출 직후에 투여되는 것인, 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 6시간 이상 전에 투여되는 것인, 방법.
  35. 제31항 또는 제32항에 있어서, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 1주 전 1회 이상 투여되는 것인, 방법.
  36. 제1항에 있어서, 포유동물은 인간인, 방법.
  37. 인간에게 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는:
    (a) 양이온성 리포솜;
    (b) 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은, 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv);
    (c) 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자; 및
    (d) 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고,
    여기서 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산 분자는 약 1:5 내지 약 1:20(핵산 μg:리포솜 μg)의 비율로 존재하며,
    여기서 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해 투여되는 것인, 인간에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 치료 방법.
  38. 인간에게 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는:
    (a) 양이온성 리포솜;
    (b) 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은, 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv);
    (c) 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자; 및
    (d) 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고,
    여기서 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산 분자는 약 1:5 내지 약 1:20(핵산 μg:리포솜 μg)의 비율로 존재하며,
    여기서 복합체는 1 x LD50 이상의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해 투여되는 것인, 인간에서 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성의 예방 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 상기 BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는 것인, 방법.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는 것인, 방법.
  41. 제37항 또는 제38항에 있어서, BChE는 BChE의 돌연변이 형태인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, BChE의 돌연변이 형태는 G117H 돌연변이인, 방법.
  43. 제37항 또는 제38항에 있어서, 양이온성 리포솜은 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 양이온성 리포솜은 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물, 또는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함하는, 방법.
  45. 제37항 또는 제38항에 있어서, 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  50. 제37항 또는 제38항에 있어서, 핵산 분자는 양이온성 리포솜의 내부에 캡슐화되는, 방법.
  51. 제37항에 있어서, 복합체는 5 x LD50 까지의 유기인산제 대한 노출과 연관된 독성을 치료하기 위해 투여되는 것인, 방법.
  52. 제38항에 있어서, 복합체는 5 x LD50 까지의 유기인산제에 대한 노출과 연관된 독성을 예방하기 위해 투여되는 것인, 방법.
  53. 제37항에 있어서, 복합체는 유기인산제에 대한 노출 직후에 투여되는 것인, 방법.
  54. 제38항에 있어서, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 6시간 이상 전에 투여되는 것인, 방법.
  55. 제38항에 있어서, 복합체는 유기인산제에 대한 잠재적 노출 1주 전 1회 이상 투여되는 것인, 방법.
  56. 포유동물에게 양이온성 리포솜 복합체를 비강내로 또는 에어로졸 흡입을 통해서 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 양이온성 리포솜 복합체는:
    (a) 양이온성 리포솜;
    (b) 양이온성 리포솜에 직접 복합된, 그러나 화학적으로 접합되지 않은, 항-트랜스페린 수용체 단일 사슬 Fv(TfRscFv);
    (c) 양이온성 리포솜과 연관된 첫번째 플라스미드에 포함된 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자; 및
    (d) 양이온성 리포솜과 연관된 두번째 플라스미드에 포함된 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고,
    여기서 TfRscFv 및 양이온성 리포솜은 약 1:20 내지 약 1:40(w:w) 범위의 비율로 존재하고 핵산 분자는 약 1:5 내지 약 1:20(핵산 μg:리포솜 μg)의 비율로 존재하며,
    여기서 복합체는 인간의 혈류 내 250mg/70kg(BChE의 질량/인간의 질량) 이상의 BChE의 양을 야기하기 위해 투여되는 것인, 포유동물의 혈류로 부티릴콜린에스터라제(BChE)를 전달하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, BChE를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 상기 BChE를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는 것인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 5'에서 3'으로: (a) 하나 이상의 인간 아데노바이러스 인핸서(enhancer) 서열; (b) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터; (c) 다중클로닝자리(multiple cloning site); (d) 폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (e) SV 40 폴리 A 서열을 포함하는, 첫번째 플라스미드 구조에 포함되고, 여기서 플라스미드 구조의 3' 말단은 야생형 아데노바이러스와 비교하는 경우에 아데노바이러스 지도 단위(adenovirus map units) 9-16을 포함하지 않는 것인, 방법.
  59. 제56항에 있어서, BChE는 BChE의 돌연변이 형태인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, BChE의 돌연변이 형태는 G117H 돌연변이인, 방법.
  61. 제56항에 있어서, 양이온성 리포솜 복합체는 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 및 하나 또는 그 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함하는, 방법.
  62. 제62항에 있어서, 상기 양이온성 리포솜은 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물, 또는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함하는, 방법.
  63. 제56항에 있어서, 핵산 분자는 약 10:1 내지 약 1:10(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 핵산 분자는 약 5:1 내지 약 1:5(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 핵산 분자는 약 4:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 핵산 분자는 약 2:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  67. 제63항에 있어서, 핵산 분자는 약 1:1(부티릴콜린에스터라제(BChE)를 코딩하는 핵산 분자의 몰:폴리프롤린이 풍부한 펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 몰)의 몰비로 존재하는, 방법.
  68. 제58항에 있어서, 핵산 분자는 양이온성 리포솜의 내부에 캡슐화되는, 방법.
  69. 제58항에 있어서, 포유동물은 인간인, 방법.
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