JP2023542341A - 標的化された抗原送達システム及びその使用 - Google Patents
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Abstract
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、抗原送達システムが開示される。がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含む、方法が開示される。がん細胞を殺傷する方法であって、がん細胞を本明細書に開示される抗原送達システムのいずれかと接触させることを含み、リポソームががん細胞に入ると、がん細胞は、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、がん細胞は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を生成し、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。がん細胞を標的とする非がん二次免疫応答を生成する方法であって、がん細胞を有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含む、方法が開示される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年9月21日に出願された米国仮特許出願第63/081,178号の利益であり、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年9月21日に出願された米国仮特許出願第63/081,178号の利益であり、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府の資金による研究に関する声明
本発明は、USA Medical Research Acquisition Activity(USAMRAA)によって授与されたW81XWH-16-1-0262の下での政府の支援、並びに米国国立衛生研究所によって授与された7R01CA164447及び5R01CA164447の下での支援によってなされた。政府は、この発明に対する一定の権利を有している。
本発明は、USA Medical Research Acquisition Activity(USAMRAA)によって授与されたW81XWH-16-1-0262の下での政府の支援、並びに米国国立衛生研究所によって授与された7R01CA164447及び5R01CA164447の下での支援によってなされた。政府は、この発明に対する一定の権利を有している。
配列表の参照
2021年9月21日に作成され、3,894バイトのサイズを有する「37794_0097Pl_Sequence_Listing.txt」という名前のテキストファイルとして2021年9月21日に提出された配列表は、米国特許法施行規則(37C.F.R.)第1.52条第(e)項(5)に従って参照により本明細書に組み込まれる。
2021年9月21日に作成され、3,894バイトのサイズを有する「37794_0097Pl_Sequence_Listing.txt」という名前のテキストファイルとして2021年9月21日に提出された配列表は、米国特許法施行規則(37C.F.R.)第1.52条第(e)項(5)に従って参照により本明細書に組み込まれる。
がん治療のための細胞媒介(CM)免疫療法は、悪性腫瘍に対する身体の適応免疫応答を活性化するように設計されている。一般に、CM応答の目的は、腫瘍に対して細胞傷害性T細胞応答を活性化して、がん細胞を排除することである。これらの治療の原理は単純であるが、腫瘍微小環境の複雑さを研究する現在の研究、及び腫瘍抗原に対してT細胞を直接活性化しようとする方法は、腫瘍に対する免疫応答を生成することに関連する困難性を実証する。
PD-1阻害剤、腫瘍への生ウイルス又はウイルス粒子の注射、及び養子T細胞療法を含むいくつかのCMがん免疫療法が今日存在する。しかし、有効性、安全性、及び/又はコストに関する懸念は、これらの治療法の多くの使用を制限している。これらの懸念に対処するために、生ウイルス、ウイルスサブユニット、又は生物学的に誘導された材料を使用することなく、特異的にがん細胞上でのヒト白血球抗原(HLA)クラスI制限免疫原性ペプチドの提示を容易にする完全合成の最小送達システムを開発することに基づく処置を使用して、HLAクラスIペプチドに対する免疫応答を生成することができる。
合成的に製造された免疫原性HLAクラスI制限ペプチドをカプセル化する中性ステルスリポソームからなるリポソームベースの薬剤が開発されている。加えて、リポソームは、がん細胞に特異的に蓄積すること、及びHLAクラスI分子における免疫原性ペプチドの提示を促進することの両方を行う標的化ペプチドを外面上に有する。本明細書に開示されるのは、抗原送達システムにおいてより良好な有効性を示す標的化ペプチドである。
がん細胞における非がんHLAクラス1制限免疫原性ペプチドの提示を容易にし、がん細胞に対して二次免疫応答をもたらす、抗原送達システムに基づく免疫療法が開示される。
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、抗原送達システムが開示される。開示される抗原送達システムの例は、PEG化リポソームを含む抗原送達システムであって、PEG化リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、抗原送達システムである。
がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含む、方法が開示される。例えば、がんを有する対象を治療する方法であって、PEG化リポソームを含む抗原送達システムを投与することを含み、PEG化リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性ヒト白血球抗原(HLA)クラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、方法が開示される。
がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含む、方法が開示される。例えば、がんを有する対象を治療する方法であって、PEG化リポソームを含む抗原送達システムを投与することを含み、PEG化リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、方法が開示される。
がん細胞を殺傷する方法であって、がん細胞を本明細書に開示される抗原送達システムのいずれかと接触させることを含み、リポソームががん細胞に入ると、がん細胞が、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、がん細胞が、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を生成し、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答が、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。
がん細胞を標的とする非がん二次免疫応答を生成する方法であって、がん細胞を有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含み、リポソームが対象におけるがん細胞に入ると、がん細胞が、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、対象が、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する非がん二次免疫応答を生成し、非がん二次免疫応答が、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。
開示される方法及び組成物の追加の利点は、一部は続く説明に記載され、一部は説明から理解されるか、又は開示される方法及び組成物の実施により学ぶことができる。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組み合わせによって実現され、達せられるであろう。前述の概要及び以下の発明を実施するための形態は両方とも、単に例示的及び説明的であり、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示される方法及び組成物のいくつかの実施形態を図示し、説明ともに、開示される方法及び組成物の原理を説明するのに役立つ。
開示される方法及び組成物は、特定の実施形態の以下の詳細な説明、及びそれに含まれる実施例、並びに図及びそれらの前後の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。
別段の定めがない限り、開示される方法及び組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、又は特定の試薬に限定されず、したがって、変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語が単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、制限することが意図されないことも理解されたい。
開示される方法及び組成物のために使用することができる、それらと併用することができる、それらのための調製において使用することができる、又はそれらの生成物である材料、組成物、及び成分が開示される。これら及び他の材料が本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、基などが開示されるとき、これらの化合物の各々の様々な個々及び集合的な組み合わせ及び置換の具体的な参照が明示的に開示されない場合があるが、各々が本明細書に具体的に企図及び説明されることが理解される。したがって、分子A、B、及びCのクラス並びに分子D、E、及びFのクラス並びに組み合わせ分子の例が開示されている場合、A~Dが開示され、各々が個別に列挙されていなくても、各々が個別及び集合的に企図される。したがって、この例では、A~E、A~F、B~D、B~E、B~F、C~D、C~E、及びC~Fの組み合わせの各々が具体的に企図されており、A、B、及びC;D、E、及びF;及び例示的な組み合わせA~Dの開示から開示されたとみなされるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に企図され、開示される。したがって、例えば、A~E、B~F、及びC~Eのサブグループは、具体的に企図され、A、B、及びC;D、E、及びF;及び例示的な組み合わせA~Dの開示から開示されたとみなされるべきである。この概念は、開示される組成物を作製及び使用する方法における工程を含むがこれらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実行可能であり、そのような組み合わせは、具体的に企図され、開示されたとみなされるべきであることが理解される。
A.定義
開示される方法及び組成物は、これらが変化し得るために、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語が単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろう本発明の範囲を制限することが意図されないことも理解されたい。
開示される方法及び組成物は、これらが変化し得るために、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語が単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろう本発明の範囲を制限することが意図されないことも理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数参照を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「標的化ペプチド」への言及は、複数のそのような標的化ペプチドを含み、「そのリポソーム」への言及は、当業者に既知の1つ以上のリポソーム及びその等価物への言及である、などである。
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、互換的に使用され得、本発明のタンパク質又は組成物が、例えば、実験、診断、及び/又は治療目的のために投与され得る任意の生物を指すことができる。典型的な対象としては、動物(例えば、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳類;鳥類;ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、及びブタなどの家庭用動物又は家畜;マウス、ラット、及びモルモットなどの実験動物;ウサギ;魚類;爬虫類;動物園の動物及び野生動物)が挙げられる。典型的には、「対象」は、ヒト及び霊長類などの哺乳類を含む動物などである。
「治療」とは、疾患若しくは状態の影響の悪化を防止若しくは遅延させるため、又は疾患若しくは状態の影響を部分的若しくは完全に逆転させるために、がんを発症する感受性が増加した、又はがんを有するヒト又は他の哺乳動物(例えば、動物モデル)などの対象に、本発明の抗原送達システム又は組成物を投与することを意味する。
「予防する」とは、がんを発症する感受性が増加した対象が実際に疾患を発症するか、又はそうでなければその症状の原因を発症する機会を最小限に抑えることを意味する。
本明細書で使用される場合、「投与すること」及び「投与」という用語は、開示されるペプチド、組成物、又は医薬品調製物を対象に提供する任意の方法を指す。かかる方法は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼科投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、及び非経口投与が含まれ、注入、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与を含む。投与は、連続的又は断続的であり得る。様々な態様では、調製物は、治療的に投与されてもよく、すなわち、既存の疾患又は状態を治療するために投与されてもよい。更なる様々な態様では、調製物は、予防的に投与されてもよく、すなわち、疾患又は状態の予防のために投与されてもよい。ある態様では、当業者は、対象を治療するか、又は免疫応答を誘導するように、開示される組成物又は開示されるタンパク質の有効用量、有効スケジュール、又は有効な投与経路を決定することができる。ある態様では、当業者はまた、開示される抗原送達システム又は医薬品調製物の有効性を改善するように、投与工程の態様を変更又は修正することができる。
「パーセント(%)の同一性」という用語は、本明細書では、「パーセント(%)の相同性」という用語と互換的に使用することができ、配列アラインメントプログラムを使用して野生型配列と並べたときの核酸又はアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される場合、80%の相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定される80%の配列同一性と同じものを意味し、したがって、所与の配列の相同性は、所与の配列の長さにわたって80%を超える配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、本明細書に記載されるような、所与の配列、例えば、本発明のタンパク質のうちのいずれか1つのコード配列に対する80、85、90、95、98%以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されない。2つの配列間の同一性を決定するために使用することができる例示的なコンピュータプログラムとしては、インターネット上で公開されているBLASTプログラムのスイート、例えば、BLASTN、BLASTX、及びTBLASTX、BLASTP、及びTBLASTNが挙げられるが、これらに限定されない。また、Altschul,et al.,1990及びAltschul,et al.,1997を参照されたい。配列検索は、典型的には、GenBank DNA配列及び他の公開データベースにおける核酸配列と比較して所与の核酸配列を評価するときに、BLASTNプログラムを使用して実施される。BLASTXプログラムは、GenBankタンパク質配列及び他の公開データベースにおけるアミノ酸配列に対して全ての読取フレームで翻訳されている核酸配列を検索するために好ましい。BLASTNとBLASTXの両方が、11.0のオープンギャップペナルティ及び1.0の拡張ギャップペナルティのデフォルトパラメータを使用して実行され、BLOSUM-62マトリックスを利用している。(例えば、Altschul,S.F.,et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997を参照されたい)。2つ以上の配列間の「%の同一性」を決定するための選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、10.0のオープンギャップペナルティ、0.1の拡張ギャップペナルティ、及びBLOSUM 30類似性マトリックスを含む、デフォルトパラメータで動作する、Mac Vectorバージョン13.0.7のCLUSTAL-Wプログラムを使用して実行される。
置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸改変を使用して、最終的な誘導体、変異体、又は類似体に到達することができる。一般に、これらの変化は、分子の改変を最小限に抑えるために、いくつかのヌクレオチド上で行われる。しかしながら、より大きな変化は、ある特定の状況において許容され得る。
一般に、個々の変異体配列間のヌクレオチド同一性は、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%であり得る。したがって、「変異体配列」は、1つ以上のアミノ酸改変を含み、親配列の特異性及び/又は活性の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を含むがこれらに限定されない、生物学的機能を共有する、本発明の親又は参照配列(例えば、野生型配列)に対する特定された同一性を有するものであり得る。いくつかの態様では、変異体標的化ペプチドは、本発明の親又は参照配列と比較して1、2、3、4、又はそれ以上のアミノ酸塩基変化を含有し、親配列の生物学的機能、特異性、及び/又は活性を共有又は改善する配列であり得る。したがって、変異体標的化ペプチドは、本発明の親配列(例えば、配列番号1)に対する特定された同一性を有するものであり得、親配列の特異性及び/又は活性の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を含むがこれらに限定されない、生物学的機能を共有する。変異体配列はまた、参照配列(例えば、配列番号1)の特異性及び/又は活性の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を共有することができる。
「変異体」及び「突然変異体」又は「修飾された」という用語は、互換的に使用され得る。本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、参照核酸又はタンパク質配列と比較した場合に同じ特徴を示す修飾核酸又はタンパク質を指す。修飾標的化ペプチドは、参照配列に対して少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%相同性であり得る。いくつかの態様では、参照配列は、配列番号1であり得る。変異体はまた、本明細書に開示される配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を含むことができる。「変異体」又は「その変異体」は、N末端及び/又はC末端アミノ酸残基又は複数の残基の単純な欠失以外の参照配列との何らかの差を意味し得る。変異体がアミノ酸残基の置換を含む場合、その置換は、保存的又は非保存的とみなすことができる。変異体は、少なくとも1つの置換及び/又は少なくとも1つの付加を含み得、少なくとも1つの欠失も存在し得る。変異体はまた、1つ以上の非天然の残基を含み得る。
本明細書で使用される場合、アミノ酸「置換」は、異なるアミノ酸残基による1つのアミノ酸残基の置き換えを指す。置換アミノ酸は、ヒトタンパク質に一般的に見られる20個のアミノ酸のいずれか、並びに非定型又は非天然のアミノ酸であってもよい。アミノ酸残基の置換は、保存的又は非保存的とみなすことができる。保存的置換は、以下の群内のものである。Ser、Thr、及びCys;Leu、ILe、及びVal;Glu及びAsp;Lys及びArg;Phe、Tyr、及びTrp;並びにGln、Asn、Glu、Asp、及びHis。いくつかの態様では、置換は、非天然の置換であり得る。例えば、置換は、システインの代わりを含む、任意の位置のセレノシステイン(例えば、セレノ-L-システイン)を含み得る。多くの他の「非天然の」アミノ酸代替物が当該技術分野で既知であり、商業的供給源から入手可能である。非天然アミノ酸の例としては、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸残基、ペグ化アミノ酸、並びに式NH2(CH2)nCOOHのオメガアミノ酸が挙げられ、式中、nは、2~6中性の非極性アミノ酸、例えば、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、及びノルロイシンである。フェニルグリシンは、Trp、Tyr、又はPheの代わりになり得、シトルリン及びメチオニンスルホキシドは、中性非極性であり、システイン酸は、酸性であり、オルニチンは、塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換され得、プロリンの特性を付与する配座を保持し得る。
「任意選択の」又は「任意選択で」は、続いて記載される事象、状況、又は材料が生じ得るか、若しくは生じ得ないか、又は存在し得るか、若しくは存在し得ず、かつその記載が、その事象、状況、又は材料が生じるか、又は存在する場合、及びそれが生じないか、又は存在しない場合を含むことを意味する。
範囲は、本明細書において「約」1つの特定の値から、及び/又は「約」別の特定の値までとして表され得る。かかる範囲が表される場合、文脈が他に具体的に示さない限り、1つの特定の値から、及び/又は他の特定の値までの範囲も具体的に企図され、開示されるとみなされる。同様に、値が先行詞「約」の使用により近似として表される場合、特定の値は、文脈が他に具体的に示さない限り、開示されたとみなされるべき別の具体的に企図された実施形態を形成すると理解されるであろう。範囲の各々のエンドポイントは、文脈が他に具体的に示さない限り、他のエンドポイントに関して、かつ他のエンドポイントと関係なく重要であることも更に理解されるであろう。最後に、明示的に開示された範囲内に包含される値の個々の値及び値のサブ範囲の全てもまた、文脈が他に具体的に示さない限り、具体的に企図され、開示されたとみなされるべきであることが理解されるべきである。上記は、特定の場合において、これらの実施形態の一部又は全てが明示的に開示されているかどうかにかかわらず、適用される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本方法及び組成物の履行又は試験において使用することができるが、特に有用な方法、デバイス、及び材料は、記載される通りである。本明細書で引用される刊行物、及びそれらが引用される資料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。いかなる言及も先行技術を構成することを認めない。参考文献の議論は、著者が主張することを述べており、出願人は引用された文書の正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。いくつかの刊行物が本明細書で言及されるが、かかる言及は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことが明確に理解されるであろう。
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通して、「含む(comprise)」という用語、並びに「含むこと(comprising)」及び「含む(comprises)」などのこの用語の変形は、「~を含むがこれらに限定されない」ということを意味し、例えば、他の添加剤、構成成分、整数、又は工程を除外することを意図しない。特に、1つ以上の工程又は動作を含むとして述べられる方法では、各工程は、(その工程が「~からなる」などの限定用語を含まない限り)列挙されているものを含むことが具体的に企図され、各工程が、例えば、工程に列挙されていない他の添加剤、構成成分、整数、又は工程を除外することを意図しないことを意味する。
B.抗原送達システム
がん細胞における非がんHLAクラス1制限免疫原性ペプチドの提示を容易にし、がん細胞に対して二次免疫応答をもたらす、抗原送達システムに基づく免疫療法が開示される。開示される免疫療法は、がんワクチン開発における主要なハードルである、腫瘍関連抗原を特定するか、又は腫瘍に対して一次免疫応答を生成する必要性を回避する。免疫調節物質とは異なり、開示される抗原送達システムによって生成される免疫応答は、抗原特異的であり、免疫応答の全体的な一般的な活性化を伴わない。これは、自己免疫及びオフターゲット効果の問題を最小限に抑えることができる。
がん細胞における非がんHLAクラス1制限免疫原性ペプチドの提示を容易にし、がん細胞に対して二次免疫応答をもたらす、抗原送達システムに基づく免疫療法が開示される。開示される免疫療法は、がんワクチン開発における主要なハードルである、腫瘍関連抗原を特定するか、又は腫瘍に対して一次免疫応答を生成する必要性を回避する。免疫調節物質とは異なり、開示される抗原送達システムによって生成される免疫応答は、抗原特異的であり、免疫応答の全体的な一般的な活性化を伴わない。これは、自己免疫及びオフターゲット効果の問題を最小限に抑えることができる。
細胞(例えば、がん細胞)における抗原提示のための抗原(例えば、ウイルス抗原)を送達するために使用される標的化ナノ粒子が開示される。細胞内への抗原カーゴの特異的送達に好適である合成抗原送達システムが開示される。
いくつかの態様では、開示される抗原送達システムは、標的化ペプチド、ナノ粒子、及びHLAクラスI制限ペプチドを含み、要素の各々が本明細書に記載される。
いくつかの態様では、抗原送達システムは、いかなるウイルス粒子、毒素、又は生物由来材料をも含まない。したがって、開示される抗原送達システムにおける安全性の懸念は低減される。
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、抗原送達システムが開示される。開示される抗原送達システムの例は、PEG化リポソームを含む抗原送達システムであって、PEG化リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、抗原送達システムである。
1.標的化ペプチド
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、標的化ペプチドで表面修飾されている、抗原送達システムが開示される。例えば、リポソームを含む抗原送達システムであって、リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されている、抗原送達システムが開示される。
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、標的化ペプチドで表面修飾されている、抗原送達システムが開示される。例えば、リポソームを含む抗原送達システムであって、リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されている、抗原送達システムが開示される。
いくつかの態様では、標的化ペプチドは、細胞特異的標的化ペプチドである。いくつかの態様では、標的化ペプチドは、がん細胞特異的標的化ペプチドである。がん特異的細胞標的化ペプチドが開示される。いくつかの非限定的な例では、がん特異的細胞標的化ペプチドは、肺がん、膵臓がん、乳がん、及び/又は膠芽腫を標的とする。
標的化ペプチドは、周知であり、過去にはナノ粒子を細胞型に標的化するために使用されてきた。1つの特定の標的化ペプチド、LQWRRDDNVHNFGVWARYRL(配列番号2)は、がん特異的細胞標的化ペプチドであるが、それは、その疎水性、精製が困難、及び不安定な特性のために、開示される抗原送達システムでの使用に対して有効性が低いことが見出されている。標的化ペプチドが本明細書に開示されており、そこで、配列番号2のアミノ酸6~10は、除去されており、C末端及びN末端は、一緒に融合されており、結果として、配列番号2のペプチドよりも増加した細胞結合及びより良好な生理化学的特性を有する標的化ペプチドをもたらす。したがって、いくつかの態様では、得られる標的化ペプチドは、LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、配列番号1の疎水性の減少は、ペプチドの溶解度及び安定性を劇的に増加させ、したがって、リポソームなどのナノ粒子へのカップリングを改善する。
LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)のアミノ酸配列を含む標的化ペプチドが開示される。いくつかの態様では、配列番号1のアミノ酸配列を含む標的化ペプチドは、がん特異的細胞標的化ペプチドである。
いくつかの態様では、開示される標的化ペプチドは、がん細胞に特異的に蓄積し、HLAクラスIの提示を促進する。
いくつかの態様では、標的化ペプチドは、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して、リポソームなどのナノ粒子の表面に共役され得る。例えば、標的化ペプチドは、リポソーム上に存在するマレイミドへの、標的化ペプチド上の単一のスルフヒドリル基のマイケル付加から生じるチオール-エステル結合によって、リポソームの表面に共役され得る。いくつかの態様では、標的化ペプチドは、アミド化学及び/又はクリック化学を使用して、ナノ粒子の表面に共役され得る。
いくつかの態様では、標的化ペプチドは、N末端上でアセチル化され得る。いくつかの態様では、標的化ペプチドは、C末端上にリンカーを含むことができる。例えば、いくつかの態様では、リンカーは、PEGリンカーであり得る。
いくつかの態様では、開示される抗原送達システムは、標的化ペプチド二量体とも呼ばれる、開示される標的化ペプチドの二量体を含むことができる。開示される抗原送達システムのいくつかの態様では、がん特異的細胞標的化ペプチドは、二量体であり、2つの標的化ペプチドのうちの少なくとも1つが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む。いくつかの態様では、二量体中の標的化ペプチドの両方が、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む。いくつかの態様では、標的化ペプチド二量体は、PEGなどのリンカー及び分岐点を介して接続される。いくつかの態様では、分岐点は、リジン残基であり得る。例えば、いくつかの態様では、二量体は、配列(CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11)2K(配列番号3)を含む。
いくつかの態様では、少なくとも2つのリンカーが存在し、各標的化ペプチドの末端に1つ存在する。いくつかの態様では、2つ以上のリンカーが使用され得る。いくつかの態様では、リンカーは、PEG11であり得る。いくつかの態様では、より多いか、又はより少ないエチレングリコールサブユニットが使用され得る。例えば、PEGは、2~24個のエチレングリコールを有することができる。
いくつかの態様では、標的化ペプチド二量体は、分岐点のC末端側に共役部分を更に含むことができ、共役部分は、リポソームへの共役を可能にする。例えば、いくつかの態様では、二量体は、配列(CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11)2K-X(配列番号4)を含み、式中、Xは、共役のためのタグ又は反応性部分である。
いくつかの態様では、開示される標的化ペプチドは、オートファジーを使用してHLAクラスIの提示を容易にすることができる。いくつかの態様では、開示される標的化ペプチドは、細胞内の自己貪食小胞に蓄積することができる。自己貪食小胞中の標的化ペプチドの蓄積は、自己貪食小胞中の抗原送達システム全体の蓄積につながり、これは、抗原送達システムのHLAクラスI制限ペプチドの提示をもたらし得る。
いくつかの態様では、標的化ペプチドは、配列番号1に対して少なくとも75、80、85、90、95、99%の同一性を有する配列を含むことができる。したがって、配列番号1の変異体が本明細書に開示され、開示される抗原送達システムにおいて使用され得る。
2.ナノ粒子
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、標的化ペプチドで表面修飾されている、抗原送達システムが開示される。いくつかの態様では、ナノ粒子は、カーゴを修飾することなく、カーゴ、具体的にはペプチドを運搬する能力を有する任意のビヒクルであり得る。いくつかの態様では、ビヒクルは、HLAクラスI分子における提示がアミノ酸残基のサイズ及び位置によって制限されるため、高いペイロード容量を有し、修飾を有さない免疫原性ペプチドカーゴをシールドする必要がある。
ナノ粒子を含む抗原送達システムであって、ナノ粒子が、標的化ペプチドで表面修飾されている、抗原送達システムが開示される。いくつかの態様では、ナノ粒子は、カーゴを修飾することなく、カーゴ、具体的にはペプチドを運搬する能力を有する任意のビヒクルであり得る。いくつかの態様では、ビヒクルは、HLAクラスI分子における提示がアミノ酸残基のサイズ及び位置によって制限されるため、高いペイロード容量を有し、修飾を有さない免疫原性ペプチドカーゴをシールドする必要がある。
いくつかの態様では、ナノ粒子は、無機、リポソーム、ウイルス様粒子、又はポリマーであり得る。ナノ粒子を合成することができる様々な材料が存在する。かかる材料の例としては、脂質(ウイルスエンベロープ又はリン脂質)、ポリ(塩酸アリルアミン)(PAH)、ポリ(アクリル酸)(PAA)、及びポリ(メタクリル酸)(PMA)などの合成ポリマー、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、並びにポリ-L-リジン(PLL)などのポリペプチド、キトサンなどの天然ポリマー、及びアルブミンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、開示される抗原送達システムは、リポソームを含む。いくつかの態様では、リポソームは、水性コアを有する自己組織化リン脂質二重層である。いくつかの態様では、リポソームは、多層構造で製造することができるため、それらは、異なる層間における親水性及び疎水性抗原の両方のカプセル化を可能にすることができる。リポソームは、合成材料から容易に製造され得、合成ペプチドで容易に装填され得、標的化ペプチドによる修飾に適している。いくつかの態様では、リポソームは、強化された透過性及び保持効果に基づいて腫瘍に受動的に蓄積し、したがって、治療の特異性を強化する。いくつかの態様では、ナノ粒子は、デンドリマー、ミセル、及びリポソームを含む、金属、有機、無機、及び高分子ナノ構造であり得る。
いくつかの態様では、開示される抗原送達システムは、PEG化リポソームを含む。PEG化リポソームは、合成ポリマーポリ-(エチレングリコール)(PEG)を含む。いくつかの態様では、リポソームの表面上のPEGの存在は、単核貪食細胞系の取り込みを低減させながら、血液循環時間を延長することができる。したがって、いくつかの態様では、PEG化リポソームは、ステルスリポソームとしても知られている。いくつかの態様では、マレイミドで修飾されたDSPE PEG2000は、リポソームの脂質製剤に組み込まれ、チオール含有標的化ペプチドのリポソームへの共役を可能にし得る。
いくつかの態様では、リポソームは、30nM~350nMであり得る。いくつかの態様では、リポソームは、約100nMであり得る。合成的に製造された免疫原性ペプチドをカプセル化する100nMのステルスリポソームが開示される。
いくつかの態様では、ナノ粒子は、検出可能な標識を更に含み得る。いくつかの態様では、検出可能な標識は、化学発光標識、蛍光標識、又は酵素標識であり得る。本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、検出され得るか、又は検出可能な応答をもたらし得る核酸、タンパク質、又は化合物である。本発明による検出可能な標識は、直接的若しくは間接的にナノ粒子に共役されるか、又はナノ粒子内にカプセル化され得、放射性同位体、酵素、ハプテン、検出可能な色を付与する染料又は粒子などの発色団(例えば、ラテックスビーズ又は金属粒子)、発光化合物(例えば、生物発光、リン光又は化学発光部分)、量子ドット、及び蛍光タンパク質などの蛍光化合物を含む。
好適な蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はその変異体、GFPの青色蛍光変異体(BFP)、GFPのシアン蛍光変異体(CFP)、GFPの黄色蛍光変異体(YFP)、高感度GFP(EGFP)、高感度CFP(ECFP)、高感度YFP(EYFP)、GFPS65T、エメラルド、トパーズ(TYFP)、ヴィーナス、シトリン、mシトリン、GFPuv、不安定化型EGFP(dEGFP)、不安定化型ECFP(dECFP)、不安定化型EYFP(dEYFP)、mCFPm、セルリアン、T-サファイア、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-モノマー、J-Red、二量体2、t-二量体2(12)、mRFPl、ポシロポリン(pocilloporin)、Renilla GFP、モンスターGFP、paGFP、カエデタンパク質及びkindlingタンパク質、フィコビリタンパク質、並びにB-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質共役体が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例としては、mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner et al.(2005)Nat.Methods 2:905-909)などが挙げられる。例えば、Matz et al.(1999)Nature Biotechnol.17:969-973に記載されるような、アントゾアン種由来の様々な蛍光及び着色タンパク質のいずれも使用に好適である。
好適な酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ベータ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ(GO)などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、ナノ粒子は、当該技術分野で既知の方法を使用して、本明細書に記載される標的化ペプチドに共役される。
いくつかの態様では、ナノ粒子は、本明細書に記載されるHLAクラスI制限ペプチドのうちの1つ以上をカプセル化するか、又はそれで装填される。いくつかの態様では、ナノ粒子は、同じHLAクラスI制限ペプチドの1つ以上を含む。例えば、ナノ粒子は、本明細書に記載される単一のHLAクラスI制限ペプチドのうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上をカプセル化することができる。いくつかの態様では、ナノ粒子は、同じHLAクラスI制限ペプチドのうちの1つ以上を含むが、1つのHLAクラスI制限ペプチドを含むナノ粒子と、異なるHLAクラスI制限ペプチドを含むナノ粒子との両方が、開示される抗原送達システムで使用され得る。例えば、抗原送達システムにおいて複数のHLAクラスI制限ペプチドを使用するが、各HLAクラスI制限ペプチドは、それ自体のナノ粒子内にある。
3.HLAクラスI制限ペプチド
HLAクラスI分子は、脊椎動物の全ての有核細胞の表面に見られる。いくつかの態様では、HLAクラスI分子は、細胞傷害性T細胞にペプチド断片を提示又は表示するように機能する。いくつかの態様では、HLAクラスI分子は、細胞の内部からのペプチド(すなわち、内因性ペプチド)を提示する。いくつかの態様では、HLAクラスI分子は、HLAクラスI制限ペプチドとして知られる、8~10個のアミノ酸残基、又は場合によっては、11~14個のアミノ酸の処理されたペプチドを収容するクラスIペプチド結合溝を含む。したがって、いくつかの態様では、開示されるHLAクラスI制限ペプチドは、8~14個のアミノ酸の長さである。いくつかの態様では、開示されるHLAクラスI制限ペプチドは、8~10個のアミノ酸の長さである。
HLAクラスI分子は、脊椎動物の全ての有核細胞の表面に見られる。いくつかの態様では、HLAクラスI分子は、細胞傷害性T細胞にペプチド断片を提示又は表示するように機能する。いくつかの態様では、HLAクラスI分子は、細胞の内部からのペプチド(すなわち、内因性ペプチド)を提示する。いくつかの態様では、HLAクラスI分子は、HLAクラスI制限ペプチドとして知られる、8~10個のアミノ酸残基、又は場合によっては、11~14個のアミノ酸の処理されたペプチドを収容するクラスIペプチド結合溝を含む。したがって、いくつかの態様では、開示されるHLAクラスI制限ペプチドは、8~14個のアミノ酸の長さである。いくつかの態様では、開示されるHLAクラスI制限ペプチドは、8~10個のアミノ酸の長さである。
いくつかの態様では、開示されるHLAクラスI制限ペプチドは、対象が以前に曝露したことがあるペプチドであり得る。例えば、ペプチドは、対象が以前に曝露したことがある(感染したことがある)ウイルス、細菌、又は真菌に由来し得る。いくつかの態様では、ペプチドは、対象がワクチン接種を介して以前に曝露されたペプチドに由来し得る。したがって、いくつかの態様では、開示されるHLAクラスI制限ペプチドは、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり得る。いくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、HLAクラスI制限ペプチドが、開示される抗原送達システムのうちの1つを受けている対象に免疫を与えるために以前に使用されたワクチンに由来することを意味する。例えば、対象がインフルエンザワクチンの接種を受けている場合、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、インフルエンザワクチンに由来するペプチドであり得る。ワクチン依存性とは、HLAクラスI制限ペプチドが、そのペプチドを含むワクチンに由来し、HLAクラスI制限ペプチドを含む抗原送達システムを受ける対象が、既にそのワクチンの接種を受けていることを意味する。二次免疫原性とは、HLAクラスI制限ペプチドが、HLAクラスI制限ペプチドに対する二次免疫応答を誘導することを意味する。例えば、HLAクラスI制限ペプチドは、それがワクチン依存性HLAクラスI制限ペプチドであり、したがって、対象が既にワクチン接種を受けており、ペプチドに対して一次免疫応答を生成しため、二次免疫応答を誘導する。いくつかの態様では、二次免疫応答は、より迅速かつ効率的である。
HLAクラスI制限ペプチドへの以前の曝露のため、ペプチドはまた、以前の免疫応答依存性の二次免疫原性HLAクラスI制限ペプチドとも呼ばれ得る。例えば、ワクチン依存性の二次免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが開示される。以前の免疫応答依存性又はワクチン依存性は、対象がHLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を以前に生成したことを意味し得、したがって、この送達システムにおいてHLAクラスI制限ペプチドに対して生成された免疫応答が二次免疫応答であるため、それは、二次免疫原性である。
いくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、そのペプチドを含むワクチンに由来する任意のHLAクラスI制限ペプチドであり得る。いくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、麻疹ウイルスヘマグルチニンペプチドH250であり得る。いくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチドHAであり得る。いくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、天然痘ウイルスH-2Kd制限ワクシニア特異的ペプチド、A5275-83(VACV-A52)であり得る。いくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドは、H250(SMYRVFEVGV、配列番号5)、C166(SLWGSLLML、配列番号6)、H38(LLAVIFVMFL、配列番号7)、H516(ILPGQDLQYV、配列番号8)、H3L(SLSAYIIRV、配列番号9)、E2L(KIDYYIPYV、配列番号10)、又は0IL(GLNDYLHSV、配列番号11)であり得る。
いくつかの態様では、HLAクラスI制限ペプチドは、開示される抗原送達システムを受ける対象の特定のHLAタイプに基づき得る。
4.治療剤
いくつかの態様では、開示される抗原送達システムのナノ粒子は、治療剤を更に装填され得る。したがって、細胞は、HLAクラスI制限ペプチド、及びナノ粒子からの治療剤の両方を受けるであろう。
いくつかの態様では、開示される抗原送達システムのナノ粒子は、治療剤を更に装填され得る。したがって、細胞は、HLAクラスI制限ペプチド、及びナノ粒子からの治療剤の両方を受けるであろう。
いくつかの態様では、治療剤は、がん治療剤である。いくつかの態様では、がん治療剤は、任意の既知のがん治療剤であり得る。いくつかの態様では、がん治療剤は、メトトレキサート、ドセタキセル-ゲムシタビン、ベバシズマブ、シクロホスファミド、エルロチニブ、ゲムシタビン、クリゾチニブ、アテゾリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、エストロゲン調節物質、ホルモンベースの化学療法、フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、ロイコボリン、カルムスチン、テモゾロミドであり得るが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、治療剤は、オートファジーを誘導する薬物である。オートファジーは、抗原提示にとって重要であり得るため、HLAクラスI制限ペプチドと組み合わせて、オートファジーを誘導する薬物を送達することは、提示されているHLAクラスI制限ペプチドの有効性を増加させることができる。いくつかの態様では、オートファジーを誘発する薬物は、L型Ca2+チャネル遮断薬(ベラパミル、ロペラミド、アミオダロン)、カルパイン阻害剤(カルパスタチン)、ATP感受性K+チャネルアゴニスト(ミノキシジル)、cAMP還元剤(リルメニジン、クロニジン)、イノシトール低下剤(バルプロ酸)、クラスI PI3Kに対する阻害剤(LY294002)、mTOR(ラパマイシン)、AKT(ペリホシン)、及びIMPアーゼ(Li+)であり得るが、これらに限定されない。
C.組成物
開示される抗原送達システムを含む組成物が開示される。例えば、抗原送達システムを含む組成物であって、抗原送達システムが、ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、組成物が開示される。
開示される抗原送達システムを含む組成物が開示される。例えば、抗原送達システムを含む組成物であって、抗原送達システムが、ナノ粒子を含み、ナノ粒子が、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、組成物が開示される。
1.薬学的組成物
いくつかの態様では、開示される組成物は、薬学的組成物であり得る。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つ以上を含む組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物が開示される。「薬学的に許容される」とは、当業者に周知のように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために選択されるであろう材料又は担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル(DMPC)、リン酸緩衝生理食塩水、又は多胞リポソームが挙げられる。例えば、PG:PC:コレステロール:ペプチド又はPC:ペプチドは、本発明において担体として使用され得る。他の好適な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA 1995に記載される。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩が、製剤を等張にするために製剤中で使用される。薬学的に許容される担体の他の例としては、生理食塩水、リンガーの溶液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のpHは、約5~約8、又は約7~約7.5であり得る。更なる担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの持続放出調製物が挙げられ、このマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、ステント(血管形成術の間に血管に移植される)、リポソーム、又は微粒子の形態である。ある特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。これらは、最も典型的には、生理学的pHの滅菌水、生理食塩水、及び緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体である。
いくつかの態様では、開示される組成物は、薬学的組成物であり得る。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つ以上を含む組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物が開示される。「薬学的に許容される」とは、当業者に周知のように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために選択されるであろう材料又は担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル(DMPC)、リン酸緩衝生理食塩水、又は多胞リポソームが挙げられる。例えば、PG:PC:コレステロール:ペプチド又はPC:ペプチドは、本発明において担体として使用され得る。他の好適な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA 1995に記載される。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩が、製剤を等張にするために製剤中で使用される。薬学的に許容される担体の他の例としては、生理食塩水、リンガーの溶液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のpHは、約5~約8、又は約7~約7.5であり得る。更なる担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの持続放出調製物が挙げられ、このマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、ステント(血管形成術の間に血管に移植される)、リポソーム、又は微粒子の形態である。ある特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。これらは、最も典型的には、生理学的pHの滅菌水、生理食塩水、及び緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体である。
本発明のポリペプチド、ペプチド、又は共役体の意図される活性が損なわれない限り、薬学的組成物はまた、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤などを含むことができる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの1つ以上の活性成分を(本発明の組成物に加えて)含んでもよい。
本明細書に開示されるような薬学的組成物は、経口又は非経口投与のために調製することができる。非経口投与のために調製される薬学的組成物としては、静脈内(又は動脈内)、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜(例えば、鼻腔内、膣内、又は直腸)、又は経皮(例えば、局所)投与のために調製される薬学的組成物が挙げられる。エアロゾル吸入はまた、融合タンパク質を送達するために使用され得る。したがって、水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水(例えば、PBS)などの水性担体を含むがこれらに限定されない、許容される担体に溶解又は懸濁された融合タンパク質を含む組成物が、非経口投与のために調製され得る。pH調整剤及び緩衝剤、張力調整剤、湿潤剤、界面活性剤など、含まれる賦形剤のうちの1つ以上は、おおよその生理学的状態を補助することができる。組成物が(経口投与のためにしてもよいように)固体成分を含む場合、賦形剤のうちの1つ以上は、結合剤又は充填剤(例えば、錠剤、カプセルなどの製剤のために)として機能し得る。組成物が皮膚又は粘膜表面への適用のために製剤化される場合、賦形剤のうちの1つ以上は、クリーム、軟膏などの製剤のための溶媒又は乳化剤であり得る。
非経口投与の調製物としては、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性/水溶液、エマルション、又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤(リンゲルデキストロースに基づくものなど)などが挙げられる。防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在し得る。
光学投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体、及び粉末が挙げられ得る。従来の薬学的担体、水性、粉末、又は油性塩基、増粘剤などは、必要であり得るか、又は望ましい場合がある。
経口投与のための組成物としては、粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性媒体中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、サッシェ、又は錠剤が挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤が望ましい場合がある。組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸などの有機酸との反応によってか、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、並びにモンアルキル、ジアルキル、トリアルキル及びアリールアミン、並びに置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、薬学的に許容される酸又は塩基添加塩として潜在的に投与されてもよい。
薬学的組成物は、従来の滅菌技術によって無菌であり、かつ滅菌され得るか、又は細菌濾過され得る。水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化されるか、又は凍結乾燥され得、本開示によって包含される凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わせることができる。薬学的組成物のpHは、典型的には、3~11(例えば、約5~9)又は6~8(例えば、約7~8)であろう。固体形態の得られた組成物は、複数の単回用量単位でパッケージ化することができ、各々、錠剤又はカプセルの密封されたパッケージなどで固定量の上記の薬剤を含有する。固体形態の組成物はまた、局所的に適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された圧縮可能なチューブ中など、適応性のある量のための容器中にパッケージ化することができる。
上述の薬学的組成物は、治療上有効な量の、本明細書に開示される組成物を含むように製剤化することができる。いくつかの態様では、治療的投与は、予防的適用を包含する。遺伝子検査及び他の予後方法に基づいて、医師は、患者と相談して、患者が、1つ以上の自己免疫疾患に対する臨床的に決定された素因又は増加した感受性(場合によっては、大幅に増加した感受性)を有する場合、又は患者が、がんに対する臨床的に決定された素因又は増加した感受性(場合によっては、大幅に増加した感受性)を有する場合、予防的投与を選択することができる。
本明細書に記載される薬学的組成物は、臨床疾患の発症を遅延、低減、又は好ましくは予防するのに十分な量で、対象(例えば、ヒト対象又はヒト患者)に投与され得る。したがって、いくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。治療用途において、組成物は、状態、その合併症、及び結果の徴候若しくは症状を少なくとも部分的に改善する、又はそれらの症状の進行を阻害する(及び好ましくは停止する)のに十分な量で、既にがんを有している、又はがんと診断された対象(例えば、ヒト対象)に投与される。これを達成するのにふさわしい量が、「治療上有効な量」として定義される。治療上有効な量の薬学的組成物は、治癒を達成する量であり得るが、その結果は、達成可能ないくつかのうちの1つにすぎない。前述のように、治療上有効な量には、がんの発症若しくは進行が遅延、阻害、若しくは予防される、又は自己免疫疾患若しくは自己免疫疾患の症状が改善される治療を提供する量が含まれる。症状のうちの1つ以上は、それほど重症ではない可能性がある。治療を受けた個人の回復は、加速され得る。
本明細書に開示される薬学的組成物中の共役体の総有効量は、ボーラスとして又は注入によってのいずれかで、比較的短い期間にわたって単回用量として哺乳動物に投与され得るか、又は複数回用量がより長期間にわたって投与される分画治療プロトコル(例えば、4~6、8~12、14~16、又は18~24時間ごと、又は2~4日ごと、1~2週間ごと、又は1ヶ月に1回の用量)を使用して投与され得る。代替として、血液中の治療的に有効な濃度を維持するのに十分な連続的な静脈内注入もまた、本開示の範囲内である。
薬学的組成物は、局所的又は全身的治療が所望されるかどうか、及び治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。
D.治療する方法
がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含む、方法が開示される。いくつかの態様では、対象は、最初にがんと診断され、次に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与される。
がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含む、方法が開示される。いくつかの態様では、対象は、最初にがんと診断され、次に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与される。
がんを有する対象を治療する方法であって、ナノ粒子を含む抗原送達システムを投与することを含み、ナノ粒子が、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、方法が開示される。例えば、がんを有する対象を治療する方法であって、PEG化リポソームを含む抗原送達システムを投与することを含み、PEG化リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性ヒト白血球抗原(HLA)クラスI制限ペプチドを含み、HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含む、方法が開示される。
いくつかの態様では、抗原送達システムは、対象におけるがん細胞を標的とし、リポソームが対象におけるがん細胞に入ると、がん細胞は、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドをHLAクラスI分子におけるその表面上に提示し、対象は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を生成する。言い換えれば、リポソームなどのナノ粒子は、標的化ペプチド(例えば、LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含むペプチド)とともに、がん細胞の内部でHLAクラスI制限ペプチドを得るのに役立ち、そこで、がん細胞は次いで、HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を生成する方法で、HLAクラスI制限ペプチドを提示することができる。開示される方法のいくつかの態様では、ワクチン依存性の免疫原性抗原に対する免疫応答は、ワクチン依存性の免疫原性抗原を提示するがん細胞を標的とし、殺傷する。
開示される方法のいくつかの態様では、がん特異的細胞標的化ペプチドは、ナノ粒子(例えば、リポソーム)をがん細胞に対して標的化する。
いくつかの態様では、開示される方法は、対象に治療剤を投与することを更に含むことができる。いくつかの態様では、治療剤は、がん治療剤である。いくつかの態様では、がん治療剤は、チェックポイント阻害剤であり得る。いくつかの態様では、がん治療剤は、化学療法剤であり得る。いくつかの態様では、治療剤は、オートファジーの誘導剤である。いくつかの態様では、治療剤は、HLAクラスI制限ペプチドと同様に、ナノ粒子にカプセル化される。いくつかの態様では、治療剤は、ナノ粒子とは別に投与される。
いくつかの態様では、開示される方法は、対象におけるワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を検出することを更に含むことができる。対象におけるワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を検出する工程により、治療が有効であることを確認することができる。いくつかの態様では、対象におけるワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する免疫応答を決定することは、抗原送達システムにおいて使用するためにどのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが最良であるかを決定する上で重要な要因となり得る。
いくつかの態様では、対象は、治療の前にまずHLAタイプ化される。HLAタイプ化は、抗原送達システムにおいて使用するHLAクラスI制限ペプチドを特定することを可能にすることができる。
E.がん細胞を殺傷する方法
がん細胞を殺傷する方法であって、がん細胞を、本明細書に開示される抗原送達システムのうちのいずれかと接触させることを含み、リポソームががん細胞に入ると、がん細胞は、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、がん細胞は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答を生成し、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原を提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。いくつかの態様では、がん細胞が、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するとき、それは、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが、がん細胞の表面上のHLAクラスI分子上に提示されることを意味することが意図される。
がん細胞を殺傷する方法であって、がん細胞を、本明細書に開示される抗原送達システムのうちのいずれかと接触させることを含み、リポソームががん細胞に入ると、がん細胞は、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、がん細胞は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答を生成し、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原を提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。いくつかの態様では、がん細胞が、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するとき、それは、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが、がん細胞の表面上のHLAクラスI分子上に提示されることを意味することが意図される。
いくつかの態様では、本方法は、がん細胞を治療剤と接触させることを更に含むことができる。いくつかの態様では、治療剤は、がん治療剤である。したがって、開示される抗原送達システム及び既知のがん治療剤を含む併用療法が使用され得る。いくつかの態様では、がん治療剤は、チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、がん治療剤は、化学療法、抗体療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、幹細胞療法、又は標的療法であり得るが、これらに限定されない。任意の既知のがん治療剤は、本明細書に記載される抗原送達システムと組み合わせて使用され得る。
いくつかの態様では、がん細胞は、対象内にある。したがって、いくつかの態様では、がん細胞の抗原送達システムとの接触は、抗原送達システムを対象に投与することを含む。
F.非がん二次免疫応答を生成する方法
がん細胞を標的とする非がん二次免疫応答を生成する方法であって、がん細胞を有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含み、リポソームが対象におけるがん細胞に入ると、がん細胞は、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、対象は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する非がん二次免疫応答を生成し、非がん二次免疫応答は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。
がん細胞を標的とする非がん二次免疫応答を生成する方法であって、がん細胞を有する対象に本明細書に開示される抗原送達システムのうちの1つを投与することを含み、リポソームが対象におけるがん細胞に入ると、がん細胞は、抗原送達システムからのワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、対象は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドに対する非がん二次免疫応答を生成し、非がん二次免疫応答は、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、方法が開示される。
本明細書に記載されるように、非がん二次免疫応答は、がん抗原以外の抗原に対する二次免疫応答である。いくつかの態様では、非がん二次免疫応答は、がん抗原以外の抗原を対象とするが、その表面上に非がん抗原を提示するがん細胞を標的とすることができる。したがって、本明細書に記載されるように、非がん二次免疫応答は、非がん抗原を提示するがん細胞を標的とし、殺傷することができる。例えば、(本明細書に記載される抗原送達システムに起因して)麻疹ペプチドを提示するがん細胞は、麻疹ペプチドに対する二次免疫応答を生成することができ、麻疹ペプチドを提示するがん細胞の殺傷をもたらす。
いくつかの態様では、対象はまず、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含むワクチンの接種を受けていると決定される。
いくつかの態様では、対象は、抗原送達システムを投与する前にまずHLAタイプ化される。HLAタイプ化は、抗原送達システムにおいて使用するHLAクラスI制限ペプチドを特定することを可能にすることができる。
G.がん細胞への特異的局在化を増加させる方法
がん細胞への特異的局在化を増加させる方法であって、がん細胞を有する対象に、開示される抗原送達システムのうちのいずれかを投与することを含み、ナノ粒子(例えば、リポソーム)の大部分は、がん細胞に局在する、方法が開示される。がん細胞への特異的局在化を増加させる方法であって、がん細胞を有する対象に、開示される抗原送達システムのうちのいずれかを投与することを含み、ナノ粒子(例えば、リポソーム)の少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%が、がん細胞に局在する、方法が開示される。
がん細胞への特異的局在化を増加させる方法であって、がん細胞を有する対象に、開示される抗原送達システムのうちのいずれかを投与することを含み、ナノ粒子(例えば、リポソーム)の大部分は、がん細胞に局在する、方法が開示される。がん細胞への特異的局在化を増加させる方法であって、がん細胞を有する対象に、開示される抗原送達システムのうちのいずれかを投与することを含み、ナノ粒子(例えば、リポソーム)の少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%が、がん細胞に局在する、方法が開示される。
いくつかの態様では、ナノ粒子の10%未満、20%未満、30%未満、又は40%未満の非特異的局在が存在する。
H.キット
上記の材料並びに他の材料は、開示される方法の実行若しくはその実行における補助、又は開示される抗原送達システムの調製に有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒にパッケージ化することができる。所与のキット内のキット成分が、開示される方法で一緒に使用するように設計及び適合されている場合、有用である。例えば、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含むがん特異的細胞標的化ペプチドを含むキットが開示される。
上記の材料並びに他の材料は、開示される方法の実行若しくはその実行における補助、又は開示される抗原送達システムの調製に有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒にパッケージ化することができる。所与のキット内のキット成分が、開示される方法で一緒に使用するように設計及び適合されている場合、有用である。例えば、配列LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)を含むがん特異的細胞標的化ペプチドを含むキットが開示される。
キットはまた、リポソーム又はワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを含有することができる。
開示されるキットはまた、開示される抗原送達システムを作製又は使用するための説明書を含み得る。
HLAクラスIの提示を促進するために送達リガンドを利用することは、クラス1制限免疫原性ペプチドに融合されたコレラ又は滋賀毒素を使用して以前に達成されている(17~19)。しかし、これらの毒素は、細胞内に無差別に蓄積し、がん細胞に対して特異的に標的化されていない。親ペプチド、H1299.3は、がん細胞に選択的に蓄積し、正常なヒト気管支上皮細胞への限定的な結合を実証し、したがって、より大きな治療濃度域を提供する可能性があることが見出された(20、21)。配列番号1のアミノ酸配列を有する開示される標的化ペプチドは、親ペプチドH1299.3に基づき、溶解度及び安定性が増加した同じ特性を有する。
更に、コレラ又は志賀毒素の製造には、生物学的合成が必要であり、毒素担体の免疫原性に関する懸念が残っている。加えて、現在の研究は、標的薬剤が細胞表面にハプテンを送達し、抗体動員をもたらす、ハプテンペインティング又は抗体動員戦略とは異なる。開示される免疫療法は、細胞表面上のハプテン固定化から抗体依存性の細胞傷害性を生成するのではなく、内在化メカニズムを介して、がん細胞におけるHLAクラスI制限抗原の特異的提示によってT細胞を直接活性化するように設計されている。
いくつかの態様では、開示される免疫療法は、ウイルス産物又は生ウイルスが使用されていないため、現在のウイルスベースの免疫療法とは異なり、これらのタイプの療法に関連する安全性の懸念を低減する。
腫瘍に対して細胞媒介性免疫応答を生成するように設計されたがん免疫療法は、がんの最前線の治療選択肢として浮上しているが、有効性、安全性、及び費用効果に関する懸念は、これらの治療法の使用を制限している。これらの弱点に対処するために、以前に遭遇した抗原ペプチドをがん細胞に特異的に送達し、MHCクラスI経路を介してそれらの提示を容易にすることができる免疫療法が開発されている。免疫療法の一例は、中性ステルスリポソーム、麻疹ウイルス(MV)由来のカプセル化合成免疫原性HLAクラスI制限ペプチド、及びリポソームの外表面上の腫瘍標的化ペプチド(H1299.3又はSRI_MGS5_V1と呼ばれる)の3つの成分を含むモジュラー合成ナノ粒子送達システムを利用する。標的化ペプチドは、がん細胞内でリポソームの特異的な蓄積をもたらし、HLAクラスI分子におけるMV由来免疫原性ペプチドの提示を容易にする。このシステムは、TALL(Targeted Antigen Loaded Liposomes:標的化抗原装填リポソーム)と呼ばれる。したがって、TALLは、以前にMVに対してワクチン接種を受けたか、又はMVに感染した患者における標的化された腫瘍細胞に対して特異的に二次免疫応答を生成することができる。要するに、免疫療法は、ウイルス粒子を使用することなく、がん細胞がMVに感染したかのように、免疫系を応答させる。TALLを用いた腫瘍成長の著しい減少は、侵襲的LLC1(肺)マウスモデルにおいて示されている。結果は、腫瘍に対して特異的に強い細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答である。このアプローチは、現在の免疫療法よりも利点がある。1)腫瘍関連抗原(TAA)を特定するか、又は一次免疫応答を介して免疫系を教育する必要性を回避する、2)TAAに依存しておらず、突然変異負荷が低い腫瘍に対して有効である可能性がある。
残念ながら疎水性であり、精製が困難であり、かつ不安定であることが証明されている、親ペプチドLQWRRDDNVHNFGVWARYRL(配列番号2)の最適化実験が開示される。これにより、リポソームへのカップリングが問題となった。このペプチドが臨床的に実行可能な標的薬剤になるためには、その後のペプチド最適化が必要であった。その結果は、LQWRRNFGVWARYRL(配列番号1)の特定であった。
現在の研究の3つの主な目的がある。目的1-以前に特定されたMHCクラスI制限免疫原性ペプチドを使用して、TALLの免疫原性ペプチドペイロードを最適化する。目的2-ファージディスプレイ方法論を使用して、がん細胞に特異的に内在化し、HLAクラスI経路に入り込む新しいがん標的リガンドを単離し、特徴付ける。目的3-腫瘍モデルにおいてTALLの抗腫瘍有効性を評価する。
これらの目的の背後にある論理的根拠は、次の通りであった。麻疹ウイルスに由来する単一の免疫原性ペプチドは、以前の研究で使用されている。複数の免疫原性ペプチドの添加は、追加のメモリT細胞を活性化することによって、腫瘍に対して免疫応答を強化することができる。元のシステムは、1つの標的化ペプチドの有効性を実証した。しかし、1つのペプチドが臨床で遭遇する全ての腫瘍に結合する可能性は低い。複数の標的化リガンドを特定することは、TALLから治療上の利益を得ることができる患者の幅を広げるであろう。最終的な目標は、臨床的に有用ながん治療法を開発することである。したがって、インビボ抗腫瘍有効性試験は、マウス腫瘍モデルを使用して実施される。
H250は、HLAクラスI制限され、HLA A*02:01患者において強いCD8特異的IFNγ応答を誘発する、TALLシステムにおいて免疫原性ペプチドとして以前に利用されている。しかしながら、多数のペプチドが、病原体によって誘発される免疫原性応答に寄与し、開示されるシステムによって送達される抗原ペプチドのレパートリーを拡大することが有用であり得る。
現在の研究の目的の1つは、追加の免疫原性ペプチドを合成し、既存のTALLシステムに追加することである。
固相Fmoc化学を使用して、表1に示される麻疹ウイルス(MV)及びワクシニアウイルス(VACV)由来の特定された抗原ペプチドを95%超の純度で合成及び精製した。これらの抗原ペプチドは、HLA A*02:01ハプロタイプに結合する。MV及びVACVは、Th1応答を誘導し、集団における病原体に対するワクチン接種の高いカバレッジを有する、よく特徴付けられた病原体である。H250ペプチドはまた、ペプチドのC末端に配置されたシステインを介して付着したAlexaFluor546染料で合成した。これにより、リポソームの装填効率が抗原ペプチドのインビトロ及びインビボ送達で追跡及び定量化され得るように、標識されたペプチドに少量のドーピングをリポソーム内にドーピングすることが可能になる。
1つの目的は、(LQWRRDDNVHNFGVWARYRL(配列番号2)の親配列の生物物理的特性及び生物学的特性を改善することであった。これは、LQWRRDDNVHNFGVWARYRL(配列番号2)の最小結合モチーフを決定し、N末端及びC末端修飾を試験し、足場上でペプチドを多量体化して達成した。
最小限の結合ドメインを決定することにより、機能性を犠牲にすることなく、ペプチドを修飾したり、又は更にはペプチドを切断したりすることができる場所を知ることができる。ペプチド長の減少はまた、合成収率を改善しながら、望ましくないタンパク質分解及び潜在的な免疫応答を減少させ、標的化部分の合成コストを低下させることが期待される。更に、溶解性及び安定性の改善のためにペプチドの重要な領域に焦点を当てることができる。アミノ酸1~5(A1)、6~10(A2)、11~15(A3)、又は16~20(A4)をアラニンに置き換えた各ペプチド配列について、4つのペプチドのセットを合成した(表2)。以前のデータは、親ペプチドの二量体形態、配列番号2が最適な価数であることを示した。このように、各ペプチドを、ビオチンタグを含有するリジンコアに連結して、図1に示されるペプチドを作成した。フローサイトメトリーを使用して、ペプチドをNSCLC株への結合について試験した。結合領域が決定されると、個々のアミノ酸がアラニンに変化した第2ラウンドのペプチドを作製した(表2)。
アラニンスキャン結果(図1に示す)に基づいて、アミノ酸1~5及び11~20が重要な結合決定基を含有することが判定された。6~10アミノ内の単一のアラニン置換は、ペプチド結合に影響を及ぼさず、この領域が結合及び細胞取り込みに寄与しないことを示す。アミノ酸11~20のみからなるペプチドは、H1993細胞に結合しなかった。驚くべきことに、アミノ酸6~10の除去及び親ペプチドのC末端及びN末端の融合は、細胞結合の増加及びより良好な生理化学的特性を有するペプチドをもたらした。SRI_MGS5_V1ペプチドは、分岐リジンコア上でアセチル化及び二量体化することによって更に改善された(図2)。最終的に最適化されたSRI_MGS5ペプチドは、溶解度を増加させ、凝集を防止するように、15個のアミノ酸、アセチル化N末端、C末端上のPEG11リンカーで構成され、更なる修飾及びリポソームへの付着を可能にするコアで二量体化される。((CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11)2K-X、式中、Xは、SRI_MGS5_V2と呼ばれる、共役のためのタグ又は反応性部分である)。
最終的に最適化されたSRI_MGS5_V1ペプチド、SRI_MGS5_V2は、以下の特徴を有する。それは、親ペプチドと比較して疎水性が低く、これにより、ペプチドの溶解性及び安定性が劇的に増加し、したがって、リポソームへのカップリングが改善され、取り扱いが容易になる。フローサイトメトリーデータは、図3に示されるように、親SRI_MGS5_V1ペプチドと比較して、SRI_MGS5_V2がいくつかのNSCLC株に対してより高い結合親和性を有することを実証する。重要なことに、このデータは、SRI_MGS5_V2が複数のNSCLC細胞株に結合し、NSCLCにおいて広範な適用可能性を有する可能性が高いことを示す(図3)。更に、SRI_MGS5_V2はまた、いくつかの乳がん株(MCF-7、MDA-MB-23ランド4T1)、膵臓がん株(Pan02)、及び神経膠腫細胞株(GL-261)に結合することが示されている(図28~33を参照されたい)。SRI_MGS5_V2は、正常対照のヒト肺上皮細胞株(HBEC、図3を参照)への最小限の結合を示す。このペプチドは、NSCLCがんと肺の正常細胞との間で高い識別力を有する。
1個の細胞当たりの内在化されたペプチドの平均分子数を測定する定量的フローサイトメトリーアッセイを実施した。SRI_MGS5_V2を、3つのヒトNSCLC細胞株に内在化させる(図4)。内在化された分子の数は、100~800nMの細胞内濃度に対応して、H358細胞についての1×105個の分子/細胞から、H1993細胞についての8×105個の分子/細胞の範囲である。6時間での取り込み速度は飽和しておらず、ペプチドはこの時間を過ぎても細胞に入り続けているようである(図5及び図6)。これは、まだ飽和していない高い受容体数、又は継続的な送達を可能にする受容体の急速なリサイクルのいずれかを示し、ペプチドの高い細胞内濃度に達する。
SRI_MGS5_V2の取り込みは、4℃で実験を行うと大幅に減少し、結合及び内在化が受容体媒介性であることを示す。SRI_MGS5_V2の取り込みは、H1993細胞に対して毒性ではない。細胞を250μMの高濃度で、SRI_MGS5_V2で72時間インキュベートした場合、生存能の著しい喪失は観察されない。
共焦点顕微鏡検査の結果は、SRI_MGS5_V2が、親MGS5 V1と比較して、H1993 NSCLC細胞内の自己貪食小胞においてはるかに大きく蓄積することを示す(図7)。元の提案に示されているように、SRI_MGS5_V1は、オートファジー依存機構を介して抗原ペプチドのMHCクラスI提示を促進し、オートファジー阻害剤による処置は、IFN-γ分泌の著しい低減をもたらした。したがって、自食胞における蓄積は、この免疫療法の成功に不可欠な要素である。比較可能な結果がLLC1細胞において観察される。
SRI_MGS5_V2及び親SRI_MGS5 V1を、撮像のために近赤外線染料Alexa Fluor 750で標識した。尾静脈を介した注射の後、ペプチドは、皮下H1993腫瘍の部位にほぼ同程度に特異的に蓄積し、シグナルは72時間維持され、ペプチド染料共役体が内在化されていることを示す(図8及び9)。72Hでのエクスビボ撮像は、SRI_MGS5_V2が、NSCLC治療には望ましい品質であるアセチル化SRI_MGS5_V1親ペプチドと比較して、肺及び他の臓器における非特異的蓄積を減少させたことを示す。例えば、SRI_MGS5_V2は、SRI_MGS5_V1と比較して、肺におけるシグナルが3倍低い。同様に、SRI_MGS5_V2は、肝臓及び腎臓でそれぞれ1.6倍及び2.2倍少ないシグナルを示す(図10)。重要なことに、各ペプチドの対応する非アセチル化バージョンも同様に評価した。いずれの非アセチル化ペプチドについても腫瘍標的化は観察されず、血清安定性のためにペプチドのN末端を保護することの重要性を示す。
SRI_MGS5_V5もまた、C57BL/6マウスの後腹部に、皮下に移植されたLLC1腫瘍を有する(図11~13)。LLC1腫瘍を触知可能(約500mm3)まで成長させ、その時点で、マウスを、Alexa Fluor 750に共役させた15μgのSRI_MGS5_V2で静脈内処置した。画像を72時間毎日撮影し、その後、動物を屠殺し、その臓器を評価して、標的化ペプチドの局在化を判定した。結果は、SRI_MGS2_V2がLLC1腫瘍塊内に正常に局在したことを示す。このように、このペプチドは、同系腫瘍モデルにおける腫瘍標的化に使用され得る。
リポソーム最適化も研究した。リポソームは、SRI_MGS5_V2への共役によって最適化し、これは、NSCLC株へのより大きな結合、及びこれらの細胞の自食胞内の局在を示した。TALLシステムを最適化するために、SRI_MGS5_V2をリポソームに共役し、リポソームを特徴付け、共培養アッセイで利用して、炎症性サイトカイン産生を決定した。
TALLシステムは、DOXIL(登録商標)に使用されるステルスリポソーム製剤を使用して作製したが、SRI_MGS5_V2の共役を可能にする1.2%のDSPE-PEG2000マレイミドでドーピングした。動的光散乱を使用して、得られたリポソームのサイズを約100nmであると決定した(図14)。装填効率を決定するために、リポソームに蛍光標識された抗原ペプチドを装填し、それらを破裂させ、その装填物を放出させる界面活性剤で処置した。界面活性剤による処置後の蛍光測定を使用して、リポソーム調製技術の装填効率を推定した。リポソームの抗原ペプチド装填効率は、50%であると決定し、バッチごとに一貫している。
SRI_MGS5_V2標的化リポソームが依然として自食胞に輸送されていることを確実にするために、緑色蛍光タンパク質(GFP)を、SRI_MGS5変異体により外面上で修飾されたリポソーム内にカプセル化した。図15に示されるように、点状黄色染色によって示される、リポソームの自己貪食小胞との明確な共局在化が観察される。両方のペプチドについて共局在化が観察されるが、再度、SRI_MGS5_V2は、親ペプチドよりも優れている。
SRI_MGS5_V2及び親ペプチドを用いて共培養アッセイを行って、最適化されたペプチドがHLAクラスI分子における抗原ペプチドの送達及び提示を媒介し、結果として同等の抗原提示及びその後の免疫応答をもたらすことを確認した。リポソームにH250抗原ペプチドを装填し、SRI_MGS5_V2又はSRI_MGS5 V1を、マレイミド化学を介してリポソームの外面に共役した。リポソームをH1993細胞ともにインキュベートした後、ハプロタイプHLA A2+であり、麻疹に対してワクチン接種を受けた匿名ドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)と共培養した。ELISAの結果は、親SRI_MGS_V1に対応するTALLシステム並びにSRI_MGS5_V2が両方とも、共培養アッセイにおいて同様のレベルのTNF-α産生を示したことを示す(図16)。異なるリポソーム変異体を試験し、共培養におけるTNF-α及びINF-γを評価する更なる実験を実施した。図17及び18に示されるように、完全なTALL処置は、リポソームカプセル化H250抗原ペプチド及びリポソーム表面上の標的化Sri_MGS5_V2ペプチドを含み、共培養実験においてIFN-γ及びTNF-αの両方をもたらす。H250ペプチドを装填するが、H250を含まない標的化ペプチド又はSRI_MGS5_V2共役リポソームを含有しないリポソームは、同じ共培養アッセイにおいてIFN-γ及びTNF-αの著しい低下を呈し、したがって、標的化ペプチド及び抗原ペプチドは両方とも、免疫応答をもたらす送達及び提示を観察するために必要である。PBMCからのCD8+T細胞の枯渇は、分泌IFN-γ及びTNF-αを未然に防ぎ、免疫応答がCD8+依存性であることを示す。HAに対してワクチン接種を受けたC57B1/6マウスからの抗原提示細胞及びリンパ節リンパ球(LNL)として、マウスLLC1細胞を用いて同じ実験を完了した。類似のデータが観察され、同系腫瘍モデルを使用して、TALL療法に対するインビボ応答を評価し得ることが示されている。
SRI_MGS5_V2の能力が動物モデルにおいてリポソームを腫瘍質量に能動的に向けることができることを試験することは、標的化ペプチドがC57BL/6マウスのLLC1腫瘍質量内のリポソームを局所化することができることを確認する。これを行うために、SRI_MGS2_V2を、リポソームのリン脂質膜に挿入し、インビボで撮像されることを可能にする、親油性NIR染料DiR(1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物)で標識されたステルスリポソームに共役した。ペプチドに共役されていないリポソームは、対照としての役割を果たす。これは、リポソームが、強化された透過性及び保持効果(EPR)効果により腫瘍内に蓄積することが知られているため、特に重要である。等モルリポソーム製剤を、尾静脈を介して、皮下LLC1腫瘍を有するC57B1/6マウスにIV注射した。腫瘍をインビボで、24、48、及び72Hで撮像した。図20及び図21に見られるように、ブランクリポソーム(標的化ペプチドを含まないリポソーム)と比較して、SRI_MGS5_V2リポソームは、はるかに大きい程度に腫瘍塊内に局在した。腫瘍及び他の臓器のエクスビボ撮像は、腫瘍における非標的化リポソームと比較して、SRI_MGS5_V2標的化リポソームの3倍の蓄積を示した。SRI_MGS5_V2リポソームは、非標的化リポソームと比較して、肺において2.5倍の低減を示した。したがって、SRI_MGS5_V2は、他の臓器における標的外蓄積を低減させながら、腫瘍標的化を改善する。
抗原ペプチド最適化も研究した。H250は、TALLシステムにおいて免疫原性ペプチドとして利用し、これは、HLAクラスIが制限されており、HLA A*02:01患者において強いCD8特異的IFNγ応答を誘発する。しかしながら、多数のペプチドが、病原体によって誘発される免疫原性応答に寄与し、開示される送達システムによって送達される抗原ペプチドのレパートリーを拡大することが有用であり得る。
1つの目的は、追加の免疫原性ペプチドを既存のリポソームに追加し、共培養アッセイを介して新しいTALLシステムの有効性を試験することであった。当初、麻疹ウイルス由来のH3L及びC166ペプチドは、TALLシステムにおける追加の抗原ペプチドとして使用されたが、残念ながら、それらは疎水性であり、精製が困難であり、不安定であることが判明した。したがって、異なる抗原ペプチドH516(ILPGQDLQYV)を使用して、HLA A*02:01ハプロタイプ患者から特定されており、高免疫原性であるTALLリポソームに組み込んだ。二重抗原ペプチド(H516+H250)カプセル化リポソームを、DLS及びゼータ電位測定を用いて特徴付けた(図22及び23)。得られたリポソームのサイズは、約155nmであると決定し、そのゼータ電位は、約-25.3mVであった。
単一抗原H250と比較して、二重抗原リポソームシステムの有効性を判定するために、共培養アッセイを行った。H516及びH250ペプチドの両方を含有するSRI_MGS5_V2標的化リポソームは、H250のみのリポソームと同じレベルのIFNγ及びTNF-α分泌物を生成した(図17~19)。同様の様式で、H250及びC166抗原ペプチドの両方をカプセル化するリポソームを、共培養アッセイにおけるTNF-α分泌を刺激する能力について試験した。この場合、二重抗原ペプチドリポソームは、H250又はC166のいずれかを含有するリポソームと比較して、TNF-αの低減を示した。二重抗原リポソームが、同様の、又はいくつかの場合において、より悪い活性を示したため、焦点は、単一のH250抗原に向けられた。しかしながら、結果は、システムが他の抗原ペプチドで有効であることを実証する。TALLのモジュラー性質を考慮すると、患者のニーズに基づいて異なる抗原を使用することができる。
SRI_MGS5_V2は、乳房、膵臓、及び膠芽腫細胞株に結合し、これらの腫瘍タイプの各々について、同系の同所性腫瘍モデルにおいて腫瘍を有する。これは、このペプチドが広範な有用性を有し、多くの異なる腫瘍を認識することができることを示す。このように、SRI_MGS2_V2ペプチドは、抗原ペプチドを送達する能力を有し、MHCクラス1における抗原ペプチドの提示を容易にすることが知られているため、SRI_MGS2_V2ペプチドに焦点を当てることは理にかなっている。
いくつかの実験では、LLC1細胞を発現するルシフェラーゼを開発する必要があった。インビボ実験には、マウスにおいて皮下LLC1腫瘍を生成し、続いてTALL処置を行うことが含まれた。同所性肺腫瘍モデルを生成するために、LLC1細胞株を発現する好適なルシフェラーゼを作成することが不可欠であった。安定したルシフェラーゼ発現を得るために、レンチウイルスレポーター構築物を利用した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレンチウイルスベクター構築物及びそれらとのLLC1細胞の形質導入を使用して、LLC1細胞株を発現する安定なルシフェラーゼを作成した。
形質導入に使用される疑似ウイルスベクターを生成するために、以下の手順を使用した。プラスミド-pTrip-lucを含有するルシフェラーゼ遺伝子は、BamHI部位とXhoI部位との間で、Trip-eGFPプラスミドのeGFP配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって構築した。ホタルルシフェラーゼのコード配列を、以下のプライマーを使用してpGL4-LucベクターからPCR増幅した。
5’-AGAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGAAGATGC-CAAAAAC-3’(配列番号12)(センス)
5’-ATAGCTCGAGTTAGACGTT-GATCCTGGCGC-3’(配列番号13)(アンチセンス)。
5’-AGAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGAAGATGC-CAAAAAC-3’(配列番号12)(センス)
5’-ATAGCTCGAGTTAGACGTT-GATCCTGGCGC-3’(配列番号13)(アンチセンス)。
疑似ウイルス粒子を生成するために、6*105Lenti-X 293T細胞を、トランスフェクションの24時間前に、10%のFBSを含有する4mlのDMEM培地中の6cmポリスチレン皿に播種した。翌日、ポリエチレンイミン(PEI、MW 25Kd)又はLipofectamine 2000試薬(Invitrogen)を使用して細胞をトランスフェクトした。VSV-Gpp疑似ウイルス粒子を、2μgのpTrip-Luc、2μgのCMV-dR8.2プラスミド、及び1μgのHEF-VSV-Gプラスミド(VS V-Gエンベロープタンパク質を発現する)を含む0.5mLのDNA混合物でトランスフェクションすることによってパッケージング化した。トランスフェクションの16時間後、培地を置き換えた。VS V-Gpp疑似ウイルス粒子を含有する上清を、トランスフェクションの36~48時間後に回収し、0.45-μmシリンジフィルターを通して濾過した。
LLC1細胞を、ポリブレンの添加とともに、これらの疑似ウイルスベクターで3~4時間形質導入し、続いてベクターを除去し、10%のFBSを含有する新鮮なRPMI培地で置き換えた。形質導入されたLLC1細胞を、インキュベーター内で72時間そのまま放置した。次に、血球計を使用して細胞をカウントし、1mlの培地中で100個の細胞の最終密度を得るように希釈した。100μLのこの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、これにより、ウェルの80%が単一細胞を含有した。これらの細胞を7~10日間成長させて、クローン集団を得た。それらのルシフェラーゼ発現を、Promegaルシフェラーゼアッセイシステムを使用して4週間の期間、隔週で試験して、安定したルシフェラーゼ発現を確認した。
このプロセスを通して、ルシフェラーゼ発現LLC1細胞は、経時的にドリフトすることが分かり、ルシフェラーゼ発現を制御するために細心の注意を払わなければならない。
TALLシステムの抗腫瘍有効性を同所性肺腫瘍モデルで評価した。最適化されたTALL療法の有効性を、同系の同所性肺がんモデルで試験した。免疫能のあるC57BL/6マウスでの試験は、ワクチン接種を受けた動物におけるTALL療法によって誘発される抗腫瘍免疫応答の尺度を提供することができる。
ルシフェラーゼ発現LLC1細胞を用いて、C57BL/6マウスにおいて同所性肺腫瘍モデルを生成した。C57BL/6マウスには、遺伝子免疫戦略を使用してワクチン接種した。CMVプロモーター配列を含有する完全な麻疹ヘマグルチニンタンパク質をコードするプラスミドベクターが開発され、これは、強いTh1様CTL応答を生成することができる。プラスミド(10ng)を、4週間の期間、週に1回筋肉内注射した。ワクチン接種期間の後、リンパ球を、群からのワクチン接種されたマウスの脾臓から得た。成功したワクチン接種は、ペプチドパルスリンパ球においてTALL処置による共培養アッセイを介してIFN-y分泌によって測定した。ワクチン接種が成功したことを確認した後、1×106Luc-LLC1細胞を、尾静脈IV注射を介して各マウスに送達した。2週間以内に、D-ルシフェリンの注射時に、動物の肺において生物発光が観察され、肺腫瘍の形成が成功したことが示された。
動物を、総計6回の処置の間、1日おきにTALL標的化リポソームで処置した。対照群には、いかなる処置をも与えられなかった動物が含まれていた。全てのマウスの肺からの生物発光を、全処置期間中、250μLの15mg/mLのD-ルシフェリン溶液のIP注射を介して1日おきに測定し、続いてIVIS撮像を行った。TALL処置群の動物の肺で、ルシフェリン発現の低減が観察され(図24)、これは、腫瘍サイズの減少に対応する。腫瘍サイズの増加を示す実験を通して、未処置のマウスで、ルシフェラーゼ発現の増加が観察された。残念ながら、図24に示されるように、処置を通して両方の群で何匹かの動物が死亡した。生き残った動物の腫瘍フラックスの変化を図25に示す。実験の終了時に、動物の肺を切除し、計量し、腫瘍結節の形成について観察した。TALL処置された動物の肺は、未処置の動物と比較して、ほとんど結節を有しないか、又は全く結節を有しないことが見出された(図25)。
TALLの腫瘍縮小効果を評価するために、より多くの処置群を用いてより大きな研究を実施した。処置群は以下の通りであった。1)完全なTALLリポソームの処置、2)外的な標的化ペプチドを含有するが、抗原ペプチドを含有しないTALLリポソーム、3)標的化ペプチドも抗原ペプチドも含有しないブランクリポソーム、4)標的化ペプチドを有しないTALLリポソーム。全ての4つの群では、完全なTALL処置群の動物の肺において、他の全ての処置群と比較して、フラックスの増加が観察され、ルシフェラーゼ発現の低減が観察された(図26及び27)。フラックス放出の減少は、総ルシフェラーゼ発現の減少に対応する。これは、肺内の腫瘍細胞の総数の低減、したがって、腫瘍サイズの減少を示す。標的化ペプチドを含まない処置群では、腫瘍サイズのより小さい減少が観察された。これは、細胞内への遅い内在化とともに、強化された浸透性及び保持(EPR)効果による、腫瘍塊内に観察されるいくつかのリポソーム蓄積として予想される。ブランクリポソーム処置群並びに抗原ペプチドなしで処置された群の両方で、フラックス放出の増加(したがって、腫瘍サイズ)が観察された。これは、TALL処置が成功するための、免疫付与及び抗原ペプチドの存在の重要性を強調する。
当業者は、本明細書に記載される方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる習慣的実験を使用して認識するか、又は確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲よって包含されることが意図される。
Claims (20)
- PEG化リポソームを含む抗原送達システムであって、前記PEG化リポソームが、がん特異的細胞標的化ペプチドで表面修飾されており、かつ免疫原性ヒト白血球抗原(HLA)クラスI制限ペプチドを含み、前記HLAクラスI制限ペプチドが、ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドであり、前記がん特異的細胞標的化ペプチドが、配列LQWRRNFGVWARYRLを含む、抗原送達システム。
- 前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが、麻疹ウイルスヘマグルチニンペプチドH250である、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが、インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチドHAである、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが、天然痘ウイルスH-2Kd制限ワクシニア特異的ペプチド、A5275-83(VACV-A52)である、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドが、H250(SMYRVFEVGV)、C166(SLWGSLLML)、H38(LLAVIFVMFL)、H516(ILPGQDLQYV)、H3L(SLSAYIIRV)、E2L(KIDYYIPYV)、又は0IL(GLNDYLHSV)である、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記抗原送達システムが、いかなるウイルス粒子、毒素、又は生物由来材料をも含まない、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記がん特異的細胞標的化ペプチドが、N末端上でアセチル化される、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記がん特異的細胞標的化ペプチドが、C末端上にPEGリンカーを含む、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記がん特異的細胞標的化ペプチドが、二量体であり、前記2つの標的化ペプチドのうちの少なくとも1つが、配列LQWRRNFGVWARYRLを含む、請求項1に記載の抗原送達システム。
- 前記二量体が、配列CH3CO-LQWRRNFGVWARYRL-PEG11)2Kを含む、請求項9に記載の抗原送達システム。
- 前記がん特異的細胞標的化ペプチドが、前記二量体のリジン分岐点を更に含む、請求項9に記載の抗原送達システム。
- 前記二量体が、前記リジン分岐点のC末端側に共役部分を更に含み、前記共役部分が、前記リポソームへの共役を可能にする、請求項9に記載の抗原送達システム。
- がんを有する対象を治療する方法であって、がんと診断されたか、又はがんを有する対象に請求項1に記載の抗原送達システムを投与することを含む、方法。
- 前記抗原送達システムが、前記対象におけるがん細胞を標的とし、前記リポソームが前記対象における前記がん細胞に入ると、前記がん細胞が、前記抗原送達システムからの前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、前記対象が、前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答を生成する、請求項13に記載の方法。
- 前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する前記免疫応答が、前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原を提示するがん細胞を標的とし、殺傷する、請求項14に記載の方法。
- 前記がん特異的細胞標的化ペプチドが、前記リポソームを前記がん細胞に対して標的化する、請求項13に記載の方法。
- 前記対象に治療剤を投与することを更に含む、請求項13に記載の方法。
- 前記治療剤が、がん治療剤である、請求項17に記載の方法。
- 前記対象における前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答を検出することを更に含む、請求項13に記載の方法。
- がん細胞を殺傷する方法であって、がん細胞を請求項1に記載の抗原送達システムと接触させることを含み、前記リポソームが前記がん細胞に入ると、前記がん細胞が、前記抗原送達システムからの前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチドを提示し、前記がん細胞が、前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する免疫応答を生成し、前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原に対する前記免疫応答が、前記ワクチン依存性の免疫原性HLAクラスI制限ペプチド抗原を提示する前記がん細胞を標的とし、殺傷する、方法。
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