JP2022524753A - 電荷修飾グロビンを含む抗腫瘍細胞 - Google Patents

Abstract

細胞、リポソーム、又はミセルの膜に会合した少なくとも１つの電荷修飾グロビンを含む、抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセル、並びにそれを作製し使用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

この発明は、抗腫瘍の細胞、リポソーム、及びミセルであって、細胞、リポソーム、又はミセルの抗腫瘍特性を高めるため、該細胞、リポソーム、又はミセルの膜に会合した電荷修飾グロビンを含むものに関する。また製造方法及び使用も提供する。

数多くの抗腫瘍治療方法が細胞、リポソーム、又はミセルの使用に関与している。近年の例には、腫瘍特異性を備えたキメラ化抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子学的に改変された細胞傷害性Ｔ細胞であるＣＡＲ－Ｔ細胞などの改変免疫細胞による処置を含む。ＣＡＲにより、Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合することができ、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させることができる。また、細胞傷害性Ｔ細胞と同様に腫瘍に結合して抗腫瘍組成物を送達する、リポソーム及びミセルを使用して、処置を行うことができる。

しかしながら、これらの取り組みは、腫瘍が免疫系を回避する能力によって頓挫している。固形腫瘍の微小環境は極めて免疫抑制性である。腫瘍細胞はチェックポイント阻害剤を発現して、抑制性細胞個体群を動員し、局在性低酸素により、免疫抑制遺伝子発現カスケードをもたらす。この作用の１つは、細胞傷害性Ｔ細胞などのがん死滅細胞がスイッチオフされる、すなわち、腫瘍細胞を特定して死滅させるというその能力を失うということである。

この免疫抑制の解決に向けた現在の手法は、細胞傷害性Ｔ細胞を非活性化するタンパク質（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ４など）を阻害する抗体の全身性投与、免疫抑制調節性Ｔ細胞（免疫抑制Ｔ細胞類）枯渇、並びに酸素レベルを増加させるための酸素富化空気又はエリスロポエチンの使用を含む。また、がん細胞の低酸素は、化学療法剤の有効性を試して高めるために投与され得るグロビンの投与によって低下させることができるということが報告されている（例えば、特許文献１に記載される）。

本発明は、特に、抗腫瘍細胞、リポソーム、及びミセルの抗腫瘍作用を回避する腫瘍の能力を低下させることによって、並びに免疫応答を回避する腫瘍の能力を低下させることによって、細胞、リポソーム、及びミセルの抗腫瘍活性を高めた、抗腫瘍細胞、リポソーム、及びミセルを提供する。

米国特許出願公開第２０１５／０３７４７９６号明細書

第１の態様において、本発明は、抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセルを提供し、これは、該細胞、リポソーム、又はミセルの膜に会合した少なくとも１つの電荷修飾グロビンを含む。

本発明者らは、腫瘍、特に固形腫瘍の処置のための改良した治療用組成物を特定した。驚いたことに、電荷修飾グロビンは、細胞、リポソーム、及びミセルの膜に正常に会合すること、並びに電荷修飾され、細胞、リポソーム、又はミセルに会合しているにもかかわらず、その酸素輸送及び送達機能を正常に保持することが分かった。さらに、この会合は、安定性、生存度、及び活性などの細胞、リポソーム、又はミセルの主要な特徴を失うことなく生じるということが分かった。特に、Ｔ細胞における実験により、生存度、増殖能、及び特に活性が失われないことが示された。電荷修飾グロビンを抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルの膜と会合させることの重要な要素は、電荷修飾グロビンが細胞、リポソーム、又はミセルに対して及び腫瘍細胞に対して共に有益な作用をもたらすことができるということである。例えば、以下で詳細に検討するように、電荷修飾グロビンは、低酸素固形腫瘍細胞に対する抗腫瘍細胞の活性を調節する及び／又は高めることができる。さらに、電荷修飾グロビンはまた、低酸素固形腫瘍における低酸素を低減して、低酸素状態の影響を軽減することができる。例えば、低酸素の低減によって、腫瘍細胞が抗腫瘍細胞及び／又はリポソーム若しくはミセルによって送達され得る化学療法処置の作用を受けやすくすることができる。したがって、本発明の細胞、リポソーム、又はミセルは、該細胞、リポソーム、又はミセルの抗腫瘍作用を回避するという腫瘍の能力を克服する特有の能力を備えており、また本発明の抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルの作用と同時発生的な任意の免疫応答を回避するという腫瘍の能力を低下させる。電荷修飾グロビンと細胞、リポソーム、又はミセルの膜との会合は、細胞、リポソーム、又はミセルの領域におけるグロビンの局所濃度が、グロビンの過剰量の全身性投与によってのみ、非会合システムにおいて一致し得るということを意味する。細胞、リポソーム、又はミセルが低酸素固形腫瘍を標的とする場合、低酸素固形腫瘍の領域におけるグロビンの局所濃度においても同様である。さらに、電荷修飾グロビンと抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルとを会合させることによって、固形腫瘍に対する細胞、リポソーム、又はミセルの抗腫瘍効果は、本質的に、グロビンが固形腫瘍に対して作用するときに起こる。さらに、抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルが固形腫瘍内の特定の部分に会合して作用する場合、会合した電荷修飾グロビンはまた、本質的に、固形腫瘍の同じ部分に対して作用する。

グロビンは電荷修飾されている。これは、グロビンの実効表面電荷が天然（又は「未修飾」若しくは「野生型」）のグロビンに対して修飾されていることを意味する。言い換えると、天然タンパク質において負荷電又は中性である少なくとも１つの残基が正電荷を有するように修飾されている、又は、天然タンパク質において正荷電又は中性である少なくとも１つの残基が負電荷を有するように修飾されている。「電荷を有する残基」とは、本質的に荷電した残基（例えば、タンパク質を構成するアミノ酸のグルタメート、アスパルテート、アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、並びに、１つ以上の電荷を有する少なくとも１つの官能基を挿入するように修飾したため荷電した残基を含むとして理解することができる。

典型的には、この電荷は、生理学的なｐＨにおいて、例えば約ｐＨ６～９において、例えば約ｐＨ６、６．５、７、７．５、８、８．５、又は約９において、評価される。

グロビンの電荷修飾は、種々の手段によって行うことができる。例えば、天然グロビンタンパク質を準備してから、１つ以上の残基の電荷状態を変化させるように、タンパク質を化学的に修飾することができる。あるいは、電荷修飾グロビンは、電荷修飾グロビンをコードする配列を組み換え発現させることによって作製することができる。また、電荷修飾グロビンは、電荷修飾グロビンの発現と化学修飾との組合せによって作製することができる。

上述のように、電荷修飾グロビンは、天然タンパク質に対して１つ以上の電荷修飾を有する。例えば、１つ以上の正電荷を有するように修飾した残基の数は、１～１００、例えば、１～８０、１０～７０、２０～６０、又は３０～５０であり得、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５などであり得る。さらに、又はあるいは、１つ以上の負電荷を有するように修飾した残基の数は、１～１００、例えば、１～８０、１０～７０、２０～６０、又は３０～５０であり得、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５などであり得る。

電荷修飾グロビンは、全体で正の表面電荷が増加する修飾の場合にカチオン化グロビン、又は全体で負の表面電荷が増加する修飾の場合にアニオン化グロビンと呼ばれ得る。カチオン化グロビンでは、正の表面電荷における全体的変化は、＋１～＋１００、例えば、＋１～＋８０、＋１０～＋７０、＋２０～＋６０、又は＋３０～＋５０であり得、約＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、＋２５、＋２６、＋２７、＋２８、＋２９、＋３０、＋３１、＋３２、＋３３、＋３４、＋３５、＋３６、＋３７、＋３８、＋３９、＋４０、＋４１、＋４２、＋４３、＋４４、＋４５、＋４６、＋４７、＋４８、＋４９、＋５０、＋５１、＋５２、＋５３、＋５４、又は＋５５などであり得る。カチオン化グロビンにおける全体的な正の表面電荷は、＋１～＋１００、例えば、＋１～＋８０、＋１０～＋７０、＋２０～＋６０、又は＋３０～＋５０であり得、少なくとも約＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、＋２５、＋２６、＋２７、＋２８、＋２９、＋３０、＋３１、＋３２、＋３３、＋３４、＋３５、＋３６、＋３７、＋３８、＋３９、＋４０、＋４１、＋４２、＋４３、＋４４、＋４５、＋４６、＋４７、＋４８、＋４９、＋５０、＋５１、＋５２、＋５３、＋５４、又は＋５５などであり得る。

アニオン化グロビンでは、負の表面電荷における全体的変化は、－１～－１００、例えば、－１～－８０、－１０～－７０、－２０～－６０、又は－３０～－５０であり得、約－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、－１７、－１８、－１９、－２０、－２１、－２２、－２３、－２４、－２５、－２６、－２７、－２８、－２９、－３０、－３１、－３２、－３３、－３４、－３５、－３６、－３７、－３８、－３９、－４０、－４１、－４２、－４３、－４４、－４５、－４６、－４７、－４８、－４９、－５０、－５１、－５２、－５３、－５４、又は－５５などであり得る。アニオン化グロビンにおける全体的な負の表面電荷は、－１～－１００、例えば、－１～－８０、－１０～－７０、－２０～－６０、又は－３０～－５０であり得、少なくとも約－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、－１７、－１８、－１９、－２０、－２１、－２２、－２３、－２４、－２５、－２６、－２７、－２８、－２９、－３０、－３１、－３２、－３３、－３４、－３５、－３６、－３７、－３８、－３９、－４０、－４１、－４２、－４３、－４４、－４５、－４６、－４７、－４８、－４９、－５０、－５１、－５２、－５３、－５４、又は－５５などであり得る。

典型的に、電荷修飾グロビンは、タンパク質におけるアミノ酸残基総数のパーセンテージとして決定される、正又は負の電荷を有する所定のパーセンテージの残基を含む。正又は負の電荷のいずれかのパーセンテージは、対応する天然グロビンにおける正又は負の電荷のいずれかのパーセンテージよりも大きい。例えば、天然グロビンは、その総アミノ酸残基の５．０～４０％を正荷電残基として有することができ、電荷修飾グロビンは、対応する天然グロビンにおけるものより大きいパーセンテージを有することができる。例えば、天然ヒトミオグロビンはその総アミノ酸残基の１４％を正荷電残基として有する。同様に、ヒトヘモグロビンはその総アミノ酸残基の１０％を正荷電残基として有する一方、ウマ心臓ミオグロビン及びチンパンジーミオグロビンは両方とも１４％である。電荷修飾グロビンは、その総アミノ酸残基の少なくとも約１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は少なくとも約３０％を正荷電残基として有することができる。負荷電残基においても同様である。

また、電荷修飾グロビンは超荷電グロビンとも呼ばれ得る。したがって、本明細書において使用する「超荷電グロビン」という用語は、既に記載したように、天然タンパク質に対して１つ以上の電荷修飾を有する任意のグロビンを指し得る。超荷電タンパク質の作製は当該技術分野で既知である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に関する、そうした超荷電タンパク質の作製例は、Ｌａｗｒｅｎｃｅら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）ｖｏｌ．１２９ ｐ．１０１１０－１０１１２）によって公開されている。そうしたいわゆる「超荷電」タンパク質は、リン脂質二重層細胞膜を介して細胞内部へと分子の送達を可能にするためこれまでに使用されている（Ｚａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（６）：ｅ０１８０１３８；国際公開第２００９／１３４８０８号；国際公開第２０１０／１２９０２３号；国際公開第２０１６／０６９９１０号；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｖｏｌ．５０３ ｐ．２９３－３１９；ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．ｖｏｌ．１０６ ｐ．６１１１－６１１６）。したがって、本明細書に記載するような電荷修飾グロビン及びポリマー界面活性剤コーティングを含む電荷修飾グロビンに使用するとき、細胞、リポソーム、又はミセルの膜と会合した少なくとも１つの電荷修飾グロビンを含む抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルが得られるということは実に驚くべきことである。

電荷修飾グロビンは、細胞、リポソーム、又はミセルの膜に会合する。一実施形態において、電荷修飾グロビンは、膜に結合することによって該膜に会合する。この結合は、１つ以上の共有結合、並びに／又は静電力、水素結合、及び／若しくは疎水性相互作用などの１つ以上の分子間力によって媒介することができる。電荷修飾グロビンは、また、又はあるいは、所定位置に立体的にロックすることで膜に会合させることができる。膜と会合させることの利点は、グロビンが標的腫瘍細胞及び抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルの両方に即座に酸素を供給することができるということである。さらなる利点は、膜に会合したグロビンはさらに、二次抗腫瘍分子のアンカーとして機能できるということである。

「膜」によって、細胞、リポソーム、又はミセルの内部を外部環境と隔てる構造を指す。自然の生体が産生した細胞において、膜はリン脂質二重層であり、また細胞膜、形質膜、又は原形質膜として知られている。電荷修飾グロビンは、リン脂質二重層（すなわち膜の疎水性脂質領域）に包埋することよって膜と会合することができる、又は溶媒に暴露したリン脂質二重層の外面と会合することができる。溶媒に暴露したリン脂質二重層の表面とのこの会合は、親水性リン脂質頭部と直接結合することによって、及び／又は細胞表面タンパク質と結合することによって媒介することができる。リポソームにおいて、膜は細胞膜と類似する構造である。言い換えると、膜はリポソーム外膜である。リポソーム膜はリン脂質二重層を含むことができる。しかしながら、リポソーム膜は、当該技術分野で知られるように、様々な両親媒性分子から形成した二重層を含むことができるということが留意される。ミセルにおいて、膜は、リン脂質などの両親媒性分子の疎水性頭部から形成したミセルの外周部である。

好ましい実施形態において、電荷修飾グロビンは、膜に包埋される、又は膜の外部（すなわち溶媒に暴露した）面に会合する（例えば結合する）。

細胞の膜は、好ましくはリン脂質二重層を含む。リポソームの膜はリン脂質二重層を含むことができる。ミセルはリン脂質膜を含むことができる。これらの実施形態において、電荷修飾グロビンは、リン脂質膜に結合することによってリン脂質膜に会合する。膜は、リン脂質以外の脂質、例えばコレステロールを含むことができる。また、膜は内在性膜タンパク質などの他の成分も含むことができる。これは、膜が細胞膜である場合に特に当てはまり得る。

一実施形態において、電荷修飾グロビンは、溶媒に暴露したリン脂質膜の外面に結合する。この結合は、好ましくは静電力によって媒介される。典型的に、溶媒に暴露したリン脂質膜の外面は、特に細胞の場合、負電荷を含む。しかしながら、膜が、正電荷を含む、溶媒に暴露した表面を含むことができるということも可能である。そうした膜との静電的相互作用を媒介するため、電荷修飾グロビンは、全体の正の表面電荷の増加（すなわちカチオン化グロビン）、又は全体の負の表面電荷の増加（すなわちアニオン化グロビン）を含むことができる。

細胞、リポソーム、又はミセルは、電荷修飾グロビンのための結合部位として機能可能なさらなる分子を含む膜を有することができる。例えば、細胞には、外部面に種々のタンパク質、脂質、及びグリカンが存在する。リポソーム及びミセルは、その表面に種々の標識を示すように構成することができる。一実施形態において、電荷修飾グロビンは、細胞、リポソーム、又はミセルの外部面に存在する分子に会合する。

一実施形態において、電荷修飾グロビンは膜に包埋される。細胞及びリポソームの膜は、親水性官能基によってそれぞれの表面との境界を定める疎水性内部分を有する少なくとも１つの脂質二重層を典型的に含む。電荷修飾グロビンは、以下でさらに詳細に検討するように、疎水性コーティングでコーティングすることができ、これにより、脂質二重層内に包埋可能な疎水性電荷修飾グロビンを提供する。「包埋」という用語は、疎水性電荷修飾グロビンが少なくとも部分的にリン脂質二重層内、又はミセルの場合リン脂質層内に位置するということを示す。すなわち、疎水性電荷修飾グロビンは、リン脂質二重層又はリン脂質層の表面のみと相互作用するのではなく、リン脂質二重層又はリン脂質層と少なくとも部分的に交わる。

好ましい実施形態において、電荷修飾グロビンは内在化されない。言い換えると、電荷修飾グロビンは、膜と接触するにとどまり、細胞又はリポソーム内部に放出されない。

好ましい実施形態において、抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセルは抗腫瘍細胞である。「抗腫瘍細胞」は、抗腫瘍特性を有する任意の細胞を意味し得る。ゆえに、細胞は、自然細胞、人工細胞、改変細胞、又は細胞小器官とすることができる。「改変細胞」という用語は、インビトロで改変した細胞、及び例えばインビボの遺伝子編集によって、インビボで改変した細胞を含む。本明細書において、「細胞」という用語は、プロトプラスト又はスフェロプラスト、すなわち、通常細胞膜を含むが、例えば機械的又は酵素的プロセスによって該膜の少なくとも一部が除去されている又は崩壊している細胞、を包含する。これは、例えば細胞の形質転換による細胞のさらなる改変を支援するため、膜の少なくとも一部が除去されている又は崩壊している細胞を含むキットを例えば含むことができる。

典型的に、細胞は、哺乳動物細胞などの動物細胞である。哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、若しくはウマの細胞、又はウシ、ブタ、若しくはヒツジの細胞であり得る。好ましい実施形態において、細胞はヒト細胞である。あるいは、細胞は、ヒト化マウスなどのヒト化動物からのものであり得る。これは、ヒト又はヒト化細胞はあまり免疫原性ではないと考えられるので有利であることから、特に好ましい。

典型的に、細胞は、腫瘍細胞を死滅させることができる細胞傷害性特性を有する免疫細胞である。好ましくは、免疫細胞は、リンパ球、好中球、樹状細胞、又はマクロファージなどの腫瘍浸潤性細胞である。より好ましくは、細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、又はナチュラルキラー細胞などのリンパ球である。細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞などのＴ細胞であることが特に好ましい。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ４＋又はＣＤ８＋のサブタイプ、好ましくはＣＤ８＋サブタイプである。一実施形態において、Ｔ細胞はキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞である。

重要な点として、所定のタンパク質（すなわち電荷修飾ＧＦＰ）のＴ細胞膜との会合がＴ細胞に毒性作用を呈するということが示されている（図２）。一方で、代表的な電荷修飾グロビン（ミオグロビン）は、ＧＦＰと比較して予期しなかった少ない毒性でマウスＴ細胞の膜と会合し（図２ｂ）、さらにより驚いたことに、ヒトジャーカットＴ細胞には毒性が観察されない（図２ａ）ことが示されている。

さらに、Ｔ細胞の活性は、免疫応答を媒介するリガンドの認識に一連のタンパク質が必要とされる、溶媒に暴露したＴ細胞膜の外面の構造及び組成に対応する。本発明のグロビンはこのＴ細胞膜と会合するが、Ｔ細胞機能と干渉せずに会合する必要がある。非常に重要な驚くべき結果は、Ｔ細胞活性を明らかに喪失することなく、グロビンがヒトジャーカットＴ細胞膜と会合可能であることである（図３）。これは、Ｔ細胞受容体とそのリガンドとの間の相互作用の際、グロビンによって引き起こされる、立体上又はその他の干渉は存在しないということを示唆する。

さらなる驚くべき作用は、固形腫瘍環境の代表モデルとして使用した低酸素環境における挙動と比較した、正常酸素環境におけるＴ細胞挙動に見受けられた。マウスＴ細胞におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋のサブタイプの両方を検討した。正常酸素環境に暴露したとき、ミオグロビンとＴ細胞膜とを会合させると、Ｔ細胞増殖は低下したが、低酸素環境において増殖は回復した（図４ａ及び図４ｂ）。ＣＤ４＋サブタイプでは、同様のパターンが活性について見受けられた。正常酸素環境におけるＴ細胞／ミオグロビン複合体では、Ｔ細胞活性は低下したが、Ｔ細胞／ミオグロビン複合体の活性は低酸素環境において回復した（図４ｃ）。この予期しない結果により、このＴ細胞／ミオグロビン複合体が特に低酸素固形腫瘍環境に適応するということが推論される。すなわち、正常酸素状態におけるＴ細胞／ミオグロビン複合体の増殖の低下は、Ｔ細胞が増殖するたびにグロビンが希釈されて（すなわち、Ｔ細胞の子孫における増殖時の希釈によって）、グロビン濃度が低下したＴ細胞の子孫を産生することはないということを確実にすることができる。同様に、図４ｃにおけるＴ細胞／ミオグロビン複合体の活性は細胞が低酸素環境になるまで抑えられ、この細胞が低酸素固形腫瘍を標的として作用することに特に適応するものとする。さらにより驚くべき作用を、ＣＤ８＋細胞／ミオグロビン複合体活性において観察した。低酸素環境において、Ｔ細胞活性は実際に顕著に高まり、これを抗腫瘍治療に特に期待される複合体とした。

電荷修飾グロビンは、細胞を電荷修飾グロビンに接触させることによって、本発明における細胞を形成した後１～３０日間、又は１～１５日、又は１～１０日、又は１～５日間、細胞膜に会合させることができる。例えば、電荷修飾グロビンは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は約１０日間会合させることができる。

一実施形態において、抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルは、抗腫瘍リポソーム又はミセルである。リポソーム又はミセルは、典型的に水溶性リポソーム又はミセルである。リポソーム又はミセルは、該リポソーム又はミセルに腫瘍死滅特性を与える成分を含み得る。好ましい実施形態において、抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルは、チェックポイント阻害剤、免疫療法剤又は化学療法剤などの治療剤を含む。チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、及び／又はＣＴＬＡ－４に結合して遮断するペプチド又はタンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、及び／若しくはＣＴＬＡ－４に高親和性を有し、それらに対して阻害性となるようにファージディスプレイ技術によって作製したペプチド、又は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、及び／若しくはＣＴＬＡ－４に高親和性を有し、それらに対して阻害性となるように作製若しくは設計した抗体若しくは抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。数多くのチェックポイント阻害剤が当該技術分野で既知である。

また、リポソーム又はミセルは、該リポソーム又はミセルが腫瘍細胞を特異的に標的可能とする抗体又は他の標的タンパク質などの標的成分を含むことができる。

グロビンは、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、又はサイトグロビンとすることができる。好ましい実施形態において、グロビンはミオグロビンである。グロビンは、酸素と可逆的に結合して輸送する。ゆえに、グロビンは酸素と結合し、酸素需要により酸素を放出するまで酸素を運搬する。また、ミオグロビンは特に、弱いペルオキシダーゼ及びラジカル捕捉剤として作用することが知られている。

グロビンは、二次抗がん分子に連結することができる。あるいは、グロビンは、二次抗腫瘍分子に連結するための反応性官能基に連結することができる。例えば、反応性官能基は、スパイキャッチャー／スパイタグシステム（Ｒｅｄｄｉｎｇｔｏｎ＆Ｈｏｗａｒｔｈ（２０１５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２９ ｐ９４－９９；国際公開第２０１４／１７６３１１号）、又はストレプトアビジン／ビオチンなどのバイオコンジュゲートシステムの一半であり得る。

ゆえに、グロビンは、二次抗腫瘍分子を細胞、リポソーム、又はミセルに固定する「アンカータンパク質」として作用する。これは、細胞、リポソーム、又はミセルの膜に会合した電荷修飾グロビンが少なくとも２つの重要な利点を提供するということを意味している。第１の利点は、腫瘍細胞及び抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルの両方に即座に酸素を供給するという能力である。第２の利点は、二次抗腫瘍分子を膜に固定するという能力である。電荷修飾グロビンが膜と会合すると、二次分子は有利に、抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルの外面に提示される。

二次分子は、カチオン化又はアニオン化タンパク質ではないタンパク質とすることができる。電荷修飾グロビンが膜に包埋される場合、二次抗腫瘍分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５２５３４号に記載されるように、包埋されないように位置することができる。

二次抗腫瘍分子は、当該技術分野で既知である、任意の抗腫瘍分子から選択することができる。例えば、二次抗腫瘍分子は、抗体、レクチン、インテグリン、又は接着分子のいずれか１つとすることができる。具体的に、抗腫瘍分子は、以下のいずれか１つとすることができる。
（１）腫瘍細胞結合分子。腫瘍細胞結合分子は、腫瘍細胞を標的とすること及び持続的に結合することを支援する。持続的な結合により、抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルは、該細胞、リポソーム、又はミセル及びグロビンの両方が腫瘍細胞に対して作用を高めることができる所定の期間、腫瘍細胞の領域に保持されるということ確実にすることができる。
（２）チェックポイント阻害剤。チェックポイント阻害剤は、免疫系を回避するという腫瘍の能力を低下させることを支援し、腫瘍の低酸素の低減におけるグロビンの作用と相補的であり、また、抗腫瘍細胞、リポソーム、及びミセルなどの抗腫瘍治療を回避するという腫瘍の能力を低下させる。
（３）免疫細胞の腫瘍量部への侵入を高めることができるように腫瘍の細胞外マトリックスを再構築する酵素。
（４）腫瘍関連化合物を代謝する酵素。例えば、腫瘍は、アデノシン三リン酸代謝速度を高め、腫瘍微小環境において過剰なアデノシンをもたらす。これが、免疫抑制作用をもたらすアデノシン作動性受容体を刺激する。免疫細胞表面においてアデノシンデアミナーゼなどの酵素を提示することで、この免疫抑制シグナリングを低下させ得る。

一実施形態において、グロビン及び二次抗がん分子は融合タンパク質内に包含される。

グロビンは電荷修飾グロビンである。グロビンは、カチオン化又はアニオン化グロビンとすることができる。

カチオン化グロビンは、カチオン又はポリカチオンリンカーの親グロビンにおける酸性アミノ酸側鎖への共有結合によって得ることができる。例えば、これは、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）のなどのカルボジイミドの存在下で、タンパク質を、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）又はその類似体と混合することによって得ることができる。反応を以下に示し、酸残基（１）が、ゼロレングスクロスリンカーＥＤＣ（２）の付加によって求核攻撃に向けて活性化されて、活性化ｏ－アシルイソ尿素基（３）を形成することを示す。その後、求核剤ＤＭＰＡ（４）は活性化カルボニルを攻撃し、イソ尿酸を脱離して、カチオン化残基（５）を形成する。ゆえに、カチオン化グロビンは、リンカー－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ_３（ＣＨ_２）_３Ｎ（ＣＨ_３）_２Ｈ^＋を含むことができる。ＤＭＰＡ又はその類似体は、ＥＤＣとの混合前にタンパク質に付加されて、過剰なＤＭＰＡ又はその類似体の存在を確保することでタンパク質が互いに架橋結合することを回避する。

カチオンリンカーのタンパク質における酸性アミノ酸側鎖への共有結合のステップは、静電的カップリングの安定性を向上させるため、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又はその水溶性類似体のスルホ－ＮＨＳの存在下にて行うことができる。

本発明において、カルボジイミドの存在下におけるタンパク質のＤＭＰＡ又はその類似体との混合は、タンパク質変性及び／又は凝集を回避するため、所定の時間継続することができる。そうした所定の時間は、例えば、最大若しくは約２時間、又は最大若しくは約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、若しくは約９０分であり得る。あるいは又はさらに、カルボジイミドの存在下におけるＤＭＰＡとの混合の生成物は、その後にサイズ排除クロマトグラフィーを行い、クロマトグラフィーの生成物をカチオン化タンパク質として使用することができる。当業者は、所望の電荷修飾グロビンの理論上のサイズを決定して、例えばキャリブレーションしたクロマトグラフィーカラムを使用することによって捕集するため適切なクロマトグラフィー溶離液を決定することができる。

ＤＭＰＡの類似体は、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヘキサン－１，６－ジアミン（ＤＭＨＡ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＡ）、３－ジメチルアミノプロピルアミン（ＤＭＡＰＡ）、エチレンジアミン（ＥＮ）、１，３－ジアミノプロパン（ＤＡＰ）、１，４－ジアミノブタン（ＤＡＢ）、１，５－ジアミノプロパン（ＤＡＰ）、１，６－ジアミノヘキサン（ＤＡＨ）、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＡ）、１，７－ジアミンヘプタン（ｄｉａｍｉｎｈｅｐｔａｎｅ）（ＤＡＨ）、１，８－ジアミノオクタン（ＤＡＯ）、及び２－（２－アミノエチル）グアニジン（ＡＥＧ）であり得る。他の適切な求核剤は、例えば荷電求核剤など、当業者が検討することができる。例えば、求核剤はまた、他の第１級、第２級、及び第３級アルキルジアミン、及び、対向末端が第１級、第２級、又は第３級アミンのいずれかを含む場合第４級アミンで終端するアルキルジアミンを含むことができる。また、直鎖又は分岐構造としてのポリエチレンイミンなどのポリアルキルアミンも考慮される。

あるいは、静電的改変タンパク質は、タンパク質のアニオン化によって得ることができる。これは、例えばジカルボン酸（ＨＯＯＣ－Ｒ－ＣＯＯＨ）を天然タンパク質のリジン側鎖に求核付加することによって得ることができる。

さらなる他の態様において、電荷修飾グロビンは、天然グロビンに対して変化させた電荷、特に、天然グロビンと比較してより正又はより負の全体電荷を有する配列の組換え発現によって得ることができる。組換え改変は、非突然変異グロビンの配列と比較してアミノ酸配列全体内に１つ以上のアミノ酸置換を含む突然変異体である電荷修飾グロビンを組み換えで発現させることを含むことができ、アミノ酸置換は、置換位置又は各置換位置において天然アミノ酸に異なるアミノ酸電荷を与えることで、天然グロビンと比較して電荷修飾グロビンに異なる表面電荷分布を導入する。

タンパク質の３次構造及び／又は生物学的活性を有意に変化させない限り、例えば、無荷電側鎖を有するアミノ酸は、（それぞれ＋１又は－１の全体の電荷変化を与えるため）正荷電又は負荷電側鎖を有するアミノ酸によって置換されることができる、又は、負荷電側鎖を有するアミノ酸は、（＋２の全体の電荷変化を与えるため）正荷電側鎖を有するアミノ酸によって置換されることができる、又は、正荷電側鎖を有するアミノ酸は、（－２の全体の電荷変化を与えるため）負荷電側鎖を有するアミノ酸によって置換されることができる。この合理的設計手法は、ユーザーがグロビン表面電荷の変更を重要でないアミノ酸位置に行うことができるので、タンパク質の機能／活性が特定のアミノ酸、例えば荷電側鎖を有するものの関与によって決まる場合に特に有利であり得る。これは、本明細書の他の個所に記載の化学修飾方法では常に可能であるわけではない。

典型的には、天然グロビンと組換え改変電荷修飾グロビンとの間で、グローバルレベルで判定されるアミノ酸配列同一性（又は「グローバル配列同一性」として既知である）は、少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％である。グローバルレベルにおける配列同一性の判定は、例えば、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔインターネットサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を介してインターネット上で利用可能なニードルマン・ウンシュグローバルシーケンスアライメントツールを使用して行うことができる。このツールにより、ユーザーが２つの配列をその全長にわたって比較することが可能になる。グロビンが融合タンパク質の一部である場合、比較は融合タンパク質の一部のグロビンに対して行う。

典型的には、天然グロビンは、自然起源である、例えばタンパク質を構成するアミノ酸（標準的アミノ酸を含む）から選択される、アミノ酸からなる。タンパク質を構成するアミノ酸は、自然の翻訳プロセスでタンパク質に組み込まれるものである。電荷修飾グロビン内に含まれ得るアミノ酸の非限定的例を、以下の表１及び表２に示す。

表１は、タンパク質を構成するアミノ酸の例である。太字は正荷電アミノ酸を示し、斜体は負荷電アミノ酸を示す。

タンパク質を構成しないアミノ酸に関与する改変も考慮される。また、自然起源ではないアミノ酸も含むことができる（特有のコドン及び対応するアミノアシル－ｔＲＮＡシステムを使用してタンパク質に導入され得るものなど）。

表２は、タンパク質を構成しないアミノ酸の例である。

一実施形態において、さらに電荷を修飾するため、組換え発現電荷修飾グロビンに、化学カチオン化又はアニオン化を行うことができる。

組換え技術を使用するとき、組換えＤＮＡ配列は、上述のような電荷修飾グロビンとタンパク質を構成する二次抗腫瘍分子とを含む融合タンパク質をコードし得る。

電荷修飾グロビンはポリマー界面活性剤コーティングを含み、ポリマーコーティング電荷修飾グロビンをもたらすことができる。このコンストラクトは、タンパク質の表面において荷電アミノ酸残基と静電的に会合する１つ以上の界面活性剤分子を有する電荷修飾グロビンを含む。同様のコンストラクトの調製、例えばＰｅｒｒｉｍａｎら（２０１０；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２，６２２－６２６）、Ｂｒｏｇａｎら（２０１３；Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ｖｏｌ．１１７，８４００－８４０７）及びＳｈａｒｍａら（２０１３；Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．ｖｏｌ．２５，２００５－２０１０）によって記載されている。コンジュゲートは、全体構造の少なくとも一部の周りに、本明細書に記載されるように、両親媒性界面活性剤コロナを有するタンパク質である。そうしたコロナの存在は、コンジュゲートを対応する天然グロビンと比較して、電荷及び／又はサイズの変化を検出することによって確認することができる。そうした変化を検出するため、質量分析法、ゼータ電位差測定法、Ｘ線小角散乱法、及び／又は動的光散乱法、特にこれらの２つ以上の組合せなどの技術を使用することができる。

ポリマーコーティング電荷修飾グロビンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有界面活性剤を含むことができる。例えば、界面活性剤は、以下の化学式Ｉの一般構造を有することができる。

化学式Ｉにおいて、ｎは、５～１５０を含む又は５～１５０の任意の整数、例えば８～１１０を含む又は８～１１０の任意の整数であり得る。例えば、ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、又は１１０であり得る。

Ｒ_１は

であり得る。

Ｒ_２は、Ｃ_ｘＨ_{（２ｘ＋１）}であり得、式中、ｘは８～１８を含む又は８～１８の任意の整数であり、例えばｘ＝１１、１２、又は１３であり得る。また、Ｒ_２は、８～１８個の炭素原子、例えば１１、１２、又は１３個の炭素原子を有する不飽和炭化水素であり得る。さらなる他の態様において、Ｒ_２は

であり得る。

界面活性剤は、Ｓ６２１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈのカタログ４６３２２１番）、Ｓ９０７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈのカタログ４６３２５６番）、Ｓ１１９８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈのカタログ４７３１９７番）、又はＳ１７８３（グリコール酸エトキシレート４－ノニルフェニルエーテルの酸化形態、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈのカタログ２３８６７８番）など本明細書に記載されるものの１つであり得る。

これらのアニオン界面活性剤は以下の構造を有する。

Ｓ６２１及びＳ９０７では、ｘ＝１１～１３である。
Ｓ６２１では、ｙ＝７～９である。
Ｓ９０７では、ｙ＝１４～１５である。

分子量及び多分散性を質量分析によって測定し、以下のとおりであると分かった。
表３は界面活性剤の分子量及び多分散性を示す。

「多分散性」は、化学反応から生成される合成ポリマーが重合の内在性エントロピープロセスから生じる分子量分布を有するということを反映している。ばらつきの程度は、反応メカニズムと反応条件との両方に対応する。このばらつきの程度は、近年まで「多分散性」として既知であった分散性（Ｄ）によって定められる。これは式Ｄ_Ｍ＝Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎによって定められ、式中、Ｍ_ｗは重量平均モル質量であり、Ｍ_ｎは数平均モル質量である。

ポリマーの分散性は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を使用して推定することができる。

タンパク質－ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、少なくとも約５００Ｄａ、例えば少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００又は少なくとも約４０００Ｄａの分子量を有する界面活性剤を含むことができる。

タンパク質－ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、Ｓ１７８３（すなわち酸化グリコール酸エトキシレート４－ノニルフェニルエーテル）である界面活性剤を含むことができる。あるいは又はさらに、タンパク質－ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、カチオン界面活性剤、例えばＰＥＧ－１５水素化獣脂メチルアンモニウムクロリド（Ｅｔｈｏｑｕａｄ（登録商標）ＨＴ２５として販売）を含むことができる。

本発明における細胞、リポソーム、又はミセルは、少なくとも１つのさらなる成分、例えば水、バッファー溶液、以下に記載されるような医薬組成物の形成に必要な１つ以上の成分、をさらに含む複合体組成物内に存在することができる。

第２の態様において、本発明は、第１の態様における抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルを含み、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルをさらに含む、医薬組成物を提供する。

第３の態様において、本発明は、がんの処置における使用のための、第１の態様における細胞、リポソーム、若しくはミセル、又は第２の態様に記載の医薬組成物を提供する。

この明細書にわたって言及する「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルを含む組成物である。例えば、本明細書にて言及する医薬組成物は、水性若しくは油性懸濁剤、又は非経口に許容される非毒性の希釈剤又は溶媒内の懸濁剤であり得る無菌注射剤の形態であり得る。水性懸濁剤は、例えば、マンニトール、水、リンゲル液、又は生理食塩水内において調製することができる。あるいは、水性懸濁剤はリン酸緩衝食塩水内において調製することができる。油性懸濁剤は、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、脂肪酸、又は薬学的に許容可能な天然油内において調製することができる。脂肪酸は、オレイン酸又はオレイン酸グリセリド誘導体であり得る。薬学的に許容される天然油は、オリーブ油、ヒマシ油、又はポリオキシエチル化オリーブ油若しくはヒマシ油であり得る。油性懸濁剤は、例えば欧州薬局方及び／又はスイス薬局方に準拠する、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含むことができる。医薬組成物は、本発明のリン脂質組成物に加えて１つ以上の薬学的あるいは生物学的活性剤を含むことができる。例えば、組成物は、従来の薬剤、抗体、又は他のタンパク質成分などの治療剤を含むことができる。

第４の態様において、本発明は、第１の態様における抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルを作製する方法を提供し、該方法は、（ａ）電荷修飾グロビンを準備するステップ、及び（ｂ）抗腫瘍細胞、リポソーム、又はミセルを該グロビンに接触させるステップを含む。

本発明の第４の態様における方法では、細胞を使用するとき、ステップ（ｂ）は、低くとも約１℃の温度で少なくとも約２分の時間、例えば低くとも約１０℃の温度で少なくとも約２分の時間インキュベートすることに関与し得る。温度は、典型的には、約３０～４０℃、例えば約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は約４０℃、例えば約３７℃±約１℃であり得る。あるいは、特定の細胞、リポソーム、又はミセルは、約１～８℃、２～７℃、又は３～６℃、例えば約１、２、３、４、５、６、７、又は約８℃などのより低い温度で処理することで利益を得る。時間は、典型的には、約２～６０分、例えば約２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又は約６０分、例えば約１５、約２０、又は約３０分であり得る。ステップは約０～１０％ＣＯ_２、例えば５％ＣＯ_２の雰囲気中にて行うことができる。リポソーム又はミセルを使用するとき、ステップ（ｂ）は、１％未満ＣＯ_２、例えば空気中において室温（例えば約１５℃～約２５℃）で行うことができる。

本発明の第４の態様における方法のステップ（ｂ）は任意で、その後に、例えば２つ以上の洗浄ステップで、例えばリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）などのバッファーを使用して、細胞、リポソーム、又はミセルを洗浄するステップ（ｃ）を行うことができる。当業者は、必要に応じたそうしたステップの適応、洗浄ステップが求められるときの判定を容易に行うことができる。

ステップ（ａ）は、ポリマー界面活性剤をグロビンに静電コンジュゲーションさせる条件下で電荷修飾グロビンとポリマー界面活性剤とを準備することを含むことができる。界面活性剤は、固体又は液体形態においてグロビンの溶液に添加することができる。界面活性剤は、タンパク質のカチオン部位につき０．５～５モルの界面活性剤、例えば、タンパク質のカチオン部位につき約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は約３．０モルの界面活性剤に相当する量で添加することができる。タンパク質は、ＣｏＣｌ_２有り若しくは無しで、ＨＥＰＥＳバッファーなどの適切なバッファーとともに溶液内において、又はトリス－ＨＣｌバッファー内において、存在することができる。適切なバッファーの選択は、当業者の通常の能力内のことである。条件は、５～８のｐＨ、例えば約５、６、７、又は約８のｐＨ（５．１～５．９、６．１～６．９、及び７．１～７．９の任意の個々のｐＨ中間値含む）を含むことができ、０～２５℃の温度、例えば約４℃の温度又はおよそ室温において、０～３０時間、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は約１２時間混合物をかく拌することを含むことができる。例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１５）Ｊｕｎ １７；６：７４０５）によって記載されるようなコンジュゲーション条件が適し得る。

「カチオン部位」は、正荷電側鎖を伴う又はカチオン（すなわち正荷電）リンカーを含むアミノ酸を有するタンパク質のアミノ酸配列内の位置である。グロビン内のカチオン部位の数は、当業者によって創作能力を用いることなく測定することができる。

界面活性剤は、例えば、少なくとも約５００Ｄａ、例えば少なくとも約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、又は少なくとも約４０００Ｄａの分子量を有し得るポリエチレングリコールを含むことができる。界面活性剤は、５～５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約１０、１５、２０、２５、又は約３０ｍｇ／ｍＬの濃度でバッファー溶液内に存在することができる。

界面活性剤はＳ１７８３（すなわち酸化グリコール酸エトキシレート４－ノニルフェニルエーテル）であり得る。あるいは、界面活性剤コンジュゲートは、カチオン界面活性剤、例えばＰＥＧ－１５水素化獣脂モニウム（ｔａｌｌｏｗｍｏｄｉｕｍ）クロリド（Ｅｔｈｏｑｕａｄ（登録商標）ＨＴ２５として販売）を含むことができる。

電荷修飾グロビンは、界面活性剤との接触前に、上述のように、二次抗腫瘍分子に連結することができる。

また、ステップ（ａ）は、細胞、リポソーム、又はミセルをグロビンに接触させる前に、バッファー交換ステップを含むことができる。バッファー交換ステップは、カチオン化又はアニオン化タンパク質を界面活性剤に接触させるステップの生成物のスピン濃縮を含むことができる。あるいは、バッファー交換ステップは透析ステップを含むことができる。そうした方法は、当業者の通常の能力内のことである。

電荷修飾グロビンは、天然グロビンにおける電荷を化学修飾することによって作製することができる。例えば、少なくとも１つの酸性アミノ酸側鎖は、－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ_３（ＣＨ_２）_３Ｎ（ＣＨ_３）_２Ｈ^＋リンカーを含み得る。これは、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）の存在下で、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）又はその類似体の溶液を、（上述のような）天然グロビンと混合する方法によって得ることができる。ＤＭＰＡの類似体は、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヘキサン－１，６－ジアミン（ＤＭＨＡ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＡ）、３－ジメチルアミノプロピルアミン（ＤＭＡＰＡ）、エチレンジアミン（ＥＮ）、１，３－ジアミノプロパン（ＤＡＰ）、１，４－ジアミノブタン（ＤＡＢ）、１，５－ジアミノプロパン（ＤＡＰ）、１，６－ジアミノヘキサン（ＤＡＨ）、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＡ）、１，７－ジアミノヘプタン（ＤＡＨ）、１，８－ジアミノオクタン（ＤＡＯ）、及び２－（２－アミノエチル）グアニジン（ＡＥＧ）であり得る。他の適切な求核剤は、例えば荷電求核剤など、当業者が検討することができる。例えば、求核剤はまた、他の第１級、第２級、及び第３級アルキルジアミン、及び、対向末端が第１級、第２級、又は第３級アミンのいずれかを含む場合第４級アミンで終端するアルキルジアミンを含むことができる。また、直鎖又は分岐構造としてのポリエチレンイミンなどのポリアルキルアミンも考慮される。

したがって、グロビン（すなわち、電荷修飾グロビン前駆物質）は、
（ｉ） グロビンの溶液をＮ，Ｎ’－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）又はその類似体のｐＨ中和溶液と混合するステップ、及び任意で混合物をｐＨ５～７に調節するステップ、
（ｉｉ） その後又は同時に、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを添加するステップ、及び混合物をｐＨ４～７に調節するステップ、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）の混合物をｐＨ４～７において０～２５℃の温度で１～３０時間かく拌するステップ、
（ｉｖ） 水又はバッファーに対して（ｉｉｉ）の混合物内のタンパク質をｐＨ６．５～８．５において少なくとも４時間透析するステップ、
（ｖ） 必要であれば、（ｉｖ）の混合物のｐＨをｐＨ６．５～８．５に調節するステップ、を含む方法によって電荷修飾グロビンに変換することができる。

この方法において、ステップ（ｉｉｉ）は約１２０分以下、例えば約９０分以下継続される、及び／又は、この方法は、ステップ（ｉｖ）、若しくは存在する場合はステップ（ｖ）の混合物にサイズ排除クロマトグラフィーを行って、要求される分子量の電荷修飾グロビンを含む溶離液を得るステップ（ｖｉ）をさらに含む。これらの限定のいずれか又は両方は、プロセスが、タンパク質変性及び／又は凝集を少なくする又は防ぐように制御される、ということを確実にする。

ステップ（ｉ）において使用する天然グロビンの溶液は、任意の従来のバッファー、例えばＨＥＰＥＳ内において調製することができる。天然グロビンは、１００：１～４００：１、例えば約１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、又は約３００：１のＤＭＰＡモル：タンパク質のアニオン部位数の比でＤＭＰＡと混合される。ＥＤＣは、３０：１～６０：１、例えば約３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、４０：１、４５：１、又は約５０：１のＥＤＣモル：タンパク質のアニオン部位数の比で添加される。

「アニオン部位」は、負荷電側鎖を伴うアミノ酸を有するグロビンのアミノ酸配列内の位置である。グロビン内のアニオン部位数は、当業者の通常の能力を用いて測定することができる。

ステップ（ｉｉ）はステップ（ｉ）とともに完了させることができる、すなわち、タンパク質溶液、ＤＭＰＡ、及びＥＤＣは同時に混合することができる。ステップ（ｉｉ）をステップ（ｉ）の後に完了させるとき、ステップ（ｉｉ）は、上述のような単一のステップであって、その後直ちにステップ（ｉｉｉ）が続き得、又は、ＥＤＣの一部をステップ（ｉ）の混合物に添加し、混合物を約２、３、４、５、６、７、又は約８時間０～２５℃の温度でかく拌するステップ（ｉｉａ）、その後、さらなるＥＤＣをステップ（ｉｉａ）の混合物に添加して、かく拌を継続するステップ（ｉｉｂ）が続くという、２つのステップに分けることができ、ステップ（ｉｉｂ）の後にステップ（ｉｉｉ）が続く。

ステップ（ｉｉｉ）において要求されるかく拌は、例えばかきまぜることなどの任意の従来の手法によって行うことができ、ｐＨは約４、約５、約６、又は約７（４．１～４．９、５．１～５．９、及び６．１～６．９の任意のｐＨ中間値を包含する）であり得る。ステップ（ｉｉｉ）における時間は１２０分を超え、約２０～３０時間、例えば約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は約３０時間、例えば約２４時間継続され得る。すべてのステップは、例えば、およそ室温で、例えば１８～２３℃で行うことができる、又は約４℃で行うことができる。

当業者は、その後のサイズ排除クロマトグラフィーステップが存在するか否かに関わらず、ステップ（ｉｉｉ）の最適な時間を決定するため、種々の時間ステップ（ｉｉｉ）を行うとともに、グロビン活性の保持性を試験することによって、ステップ（ｉｉｉ）の適切な時間を決定することができる。

他の一般の方法において、ポリマー界面活性剤コーティング電荷修飾グロビンは、上述のようなアニオン化グロビンである電荷修飾グロビンを、カチオン界面活性剤である界面活性剤に接触させることで調製することができる。例えば、グロビンは、ジカルボン酸（ＨＯＯＣ－Ｒ－ＣＯＯＨ）を天然タンパク質のリジン側鎖に求核付加することによってアニオン化することができる。

上述の修飾に代えて又は追加して、電荷修飾グロビンは、電荷修飾グロビンをコードする組換えＤＮＡ配列を発現することを含む方法によって得ることができる。例えば、電荷修飾グロビンは、電荷修飾タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列を発現することを含む方法によって得ることができる。電荷修飾グロビンである得られたタンパク質は、その後に単離することができる。

例えば、電荷修飾グロビンの調製は、タンパク質の３次構造及び／又は生物学的活性を著しく変化させない限り、無荷電側鎖を有するアミノ酸を荷電側鎖を有するアミノ酸と置換すること、又は荷電側鎖を有するアミノ酸を反対の電荷を有する側鎖と置換すること、に関与し得る。これは、ユーザーがタンパク質表面電荷の変更を重要でないアミノ酸位置に行うことができるので、タンパク質の機能／活性が荷電側鎖を有するアミノ酸の関与によって決まる場合に特に有利であり得る。

典型的には、組換え改変タンパク質（すなわち、電荷修飾グロビン）と天然グロビンとの間で、グローバルレベルで判定されるアミノ酸配列同一性（又は「グローバル配列同一性」として既知である）は、少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％である。グローバルレベルにおける配列同一性の判定は、例えば、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔインターネットサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を介してインターネット上で利用可能なニードルマン・ウンシュグローバルシーケンスアライメントツールを使用して行うことができる。上述のように、機能的に重要なドメインの配列同一性は、電荷修飾グロビンと天然グロビンとの間において、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％同一であり得る。

組換えＤＮＡ配列は、当業者の通常の能力によって、任意の従来の方法に従って、例えば大腸菌での発現など任意の発現系を使用して発現することができる。また、発現したアンカータンパク質の発現系からの単離は当業者の通常の能力内のものである。

第５の態様において、本発明は、がんを処置する方法を提供し、該方法は、第１の態様における細胞、リポソーム、若しくはミセル、又は第２の態様における医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与することを含む。

好ましい実施形態において、本発明の第３又は第５の態様におけるがんは固形腫瘍がんである。特に、がんは、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、子宮頸部がん、又は膵臓がんから選択することができる。これらは、最も頻発する固形腫瘍がんである。より具体的には、がんは、２０１６年版ＩＣＤ－１０（世界保健機関発行の国際疾病分類１０版，ｉｃｄ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｒｏｗｓｅ１０／２０１６／ｅｎ）のコードＣ００～Ｃ７５．９から選択することができる。

第６の態様において、本発明は、配列番号１～１２のいずれかを含む電荷修飾グロビン、又は配列番号１～１２のいずれかと少なくとも約６０％の配列同一性を有するもののいずれかの機能的変異体を提供する。例えば、電荷修飾グロビンは、配列番号１～１２のいずれかと少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有することができる。電荷修飾グロビンは任意で、融合タンパク質などの、より大きいコンストラクトの一部を形成することができる。

この明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲において、「含む」及び「含有」という用語、並びに例えば「含むこと」及び「含む」などのその用語の変形は、「含むが限定されない」ということを意味し、他の成分、構成物、又はステップを除外するものではない。さらに、文脈において要求されない限り単数形は複数形を含み、特に不定冠詞が使用される場合、文脈において要求されない限り、明細書は単数形と同じく複数形も考慮するとして理解される必要がある。

本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関して記載されるようなものであってもよい。本願の範囲内にて、前述の段落、特許請求の範囲、並びに／又は以下の詳細な説明及び図面に述べられる種々の態様、実施形態、実施例、及び他の態様、特にその個々の特徴は、独立的に又は任意の組合せにおいてなされ得るということが明らかに意図される。すなわち、すべての実施形態及び／又は任意の実施形態の特徴は、そうした特徴が矛盾しない限り、任意の方法で、及び／又は任意の組合せで組み合わせられる。

ここで、本発明の１つ以上の実施形態を添付の図面に関して一例のみとして記載する。

図１は、タンパク質なし、天然ミオグロビン（ｎＭｙｏ）、カチオン化ミオグロビン（Ｃａｔ Ｍｙｏ）、コンジュゲートカチオン化ミオグロビン（Ｃｏｎ Ｍｙｏ）、超荷電ＧＦＰ（ｓｃＧＦＰ）、及びコンジュゲート超荷電ＧＦＰ（ｃｏｎ－ｓｃＧＦＰ）で標識作業を行ったヒトジャーカットＴ細胞（ａ及びｃ）又はマウスＴ細胞（ｂ及びｄ）に行った蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。ジャーカットＴ細胞はそのＣＤ３発現にゲートをかけ、ミオグロビン及びＧＦＰ（ａ）に存在するＨｉｓタグ又はＧＦＰ蛍光（ｃ）の表面提示のため染色した細胞のパーセンテージを示す。マウスＴ細胞はそのＣＤ８発現にゲートをかけ、ミオグロビン及びＧＦＰ（ｂ）に存在するＨｉｓタグ又はＧＦＰ蛍光（ｄ）の表面提示のため染色した細胞のパーセンテージを示す。すべてのデータは、代表的なデータプロット（挿入図）として及びチャートによって示す（平均％＋／－ＳＤを示す，ｎ＝４）。 図２は、Ａｑｕａ細胞生存度用色素で染色した（図１に記載のように標識作業を経た）ヒトジャーカットＴ細胞（ａ）及びマウスＴ細胞（ｂ）に行ったＦＡＣＳ分析の結果を示し、これらは、ＣＤ３（ａ）又はＣＤ８（ｂ）の発現にゲートをかけ、Ａｑｕａネガティブの生存細胞のパーセンテージを、平均％＋／－ＳＤ、ｎ＝４として計算し、代表的なデータプロットは挿入図にあり、処理データをチャートによって示す。 図３は、（ａ）タンパク質なし、天然ミオグロビン、カチオン化ミオグロビン、及びコンジュゲートカチオン化ミオグロビン、又は（ｂ）タンパク質なし、ｓｃＧＦＰ、コンジュゲートｓｃＧＦＰで標識作業を経たＴ細胞受容体トランスジェニックヒトジャーカットＴ細胞（ａ及びｂ）に行ったＦＡＣＳ分析の結果を示し、これらを、０μＭ、１μＭ、又は１０μＭの同族ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ抗原提示細胞に対応するＣＤ６９の上方調節について分析した。 図４は、ｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット（ＣＴＶ）で染色してから、正常酸素（四角）又は低酸素（丸）状態において抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ－２の存在下で４日間活性化させた（図１に記載のように標識作業を経た）マウスＴ細胞の結果（ａ及びｂ）、並びに正常酸素（四角）又は低酸素（丸）状態において活性化させ、ＣＤ４発現サブタイプ（ａ及びｃ）及びＣＤ８発現サブタイプ（ｂ及びｄ）のＴ細胞によって分離し、高レベルのＣＤ４４発現を試験した（ｃ及びｄ）、マウスＴ細胞の結果を示し、代表的なプロット（挿入図）として、及びチャートによって示す（平均％＋／－ＳＤを示す、ｎ＝４）。 図５は、（ａ）ジャーカットＴ細胞における界面活性剤コンジュゲート超荷電ミオグロビン（Ｍｙｏ１４［Ｓ］）の標識効率、Ｍｙｏ１４［Ｓ］コーティング（ｂ）ジャーカットＴ細胞及び（ｃ）活性化ＣＤ８＋マウスＴ細胞の生存度、（ｄ）コーティング対未コーティングコントロール（Ｕ／Ｔ）のコーティングした３日及び５日後のマウスＴ細胞の細胞カウント、（ｅ）コーティングした３日及び５日後の分裂ＣＤ８＋マウスＴ細胞のパーセンテージ、並びに（ｆ）コーティングしたジャーカットＴ細胞対未コーティングコントロール（未処理）のＣＤ６９活性化のレベルを示す。 図６は、（ａ）界面活性剤コンジュゲート超荷電ミオグロビン（Ｍｙｏ１４［Ｓ］）コーティングＣＤ８＋マウスＴ細胞対未コーティングコントロール（Ｕ／Ｔ）における疲弊マーカーのレベル、（ｂ）Ｍｙｏ１４［Ｓ］コーティング及び未コーティングジャーカットＴ細胞（未処理）における０．５％Ｏ_２での低酸素感受性色素の経時における蛍光の変化、並びに（ｃ）Ｍｙｏ１４［Ｓ］及びインターフェロンγあり又はなしでのヒト間葉系幹細胞における生存度及び炎症マーカーのレベルを示す。

〔材料と方法〕
Ｍｙｏ１４発現
慣例的な方法を用いてエレクトロポレーションによって適切なＭｙｏ１４遺伝子を含むプラスミドで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における発現によって、Ｍｙｏ１４を得た。短時間で、単一コロニーを選んで、スターター培養のために１０ｍＬのＬＢ培地に置き、１８０ＲＰＭで振とうさせて３７℃で一晩インキュベートした。その後、スターター培養物を用いて、２．５Ｌ培養フラスコにおいて０．０２％グルコース及び５０ｍｇ・Ｌ^－１カルベニシリンを補充した１ＬのＴＢ培地に播種した。培養フラスコを３７℃、２００ＲＰＭでインキュベートする。ＴＢが６００ｎｍにおいて０．７～１．０の光学密度に達すると、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘発する。４時間後、発現培養を、４５００×ｇにおいて４℃で２０分間遠心分離して、細胞をペレット状にする。上清を処分し、ペレットを保管用に凍結又は直ちに使用することができる。

Ｍｙｏ１４精製
慣例的な方法を用いて、ｐＨ７．０で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌを含む溶解バッファーをＭｙｏ１４ペレットに添加し、パルス音波処理を用いて溶解し、遠心分離にて清澄化した。その後、Ｍｙｏ１４をマルトース結合タンパク質アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、そして、マルトース結合タンパク質を、完全な嫌気環境においてＴＥＶプロテアーゼによって室温で一晩切断する。最後に、慣例的な方法を用いて、得られた切断生成物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。

コンストラクトの調製
化学電荷修飾ミオグロビンは、カチオン化ミオグロビンと称し、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）媒介反応によって、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）で酸残基を共有結合修飾して調製した。２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー内のミオグロビン溶液を、ミオグロビンにおける酸性残基モルに対して３００モルＤＭＰＡの比で、ＤＭＰＡのｐＨ中和溶液に添加した。溶液のｐＨをｐＨ５．５～６．０に調節した。その後、ＥＤＣを、ミオグロビンにおける酸性残基モルに対して５０モルＥＤＣの比で添加し、４℃で一晩かく拌させた。その後、得られた溶液を脱塩して、脱塩カラムによって副生成物を取り除き、スピン濃縮し、新しいバッファーに希釈して最小１００万倍希釈を得た、又は新しいバッファーに対して透析した。

界面活性剤をコンジュゲートしたカチオン化ミオグロビンは、コンジュゲートミオグロビンと称し、アニオン性界面活性剤をカチオン化ミオグロビンの溶液に添加することによって調製した。界面活性剤は、グリコール酸エトキシレート４－ノニルフェニルエーテルの酸性型（Ｓ１７８３、上述のとおり）であり、ミオグロビンにおける正荷電残基モルに対して１モル界面活性剤の比で添加した。界面活性剤は、固体で添加する又は適切なバッファーに事前に溶解することができる。

組換え電荷修飾（「超荷電」）ミオグロビンを、商業的な供給源から対応するＤＮＡを注文する前に、ミオグロビンのアミノ酸配列を変更することで調製した。第１の突然変異体（配列番号１）を、プロテオミクス解析によってカチオン化ミオグロビンにおいてＤＭＰＡの添加で修飾されることが判明した位置において、リジン残基を組み込むように改変した。Ｍａｘ突然変異体（配列番号２）を、すべての酸残基をリジン残基と交換するように改変した。極性化突然変異体（配列番号３）を、正残基がグルタミン酸に改変されるＣ末端の１０Å半径内は除くミオグロビンの表面において、リジン残基を組み込むように改変した。ＲＯＳＥＴＴＡ突然変異体（配列番号４）を、ロージーウェブサービス（ｒｏｓｉｅ．ｇｒａｙｌａｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ）のＲＯＳＥＴＴＡアルゴリズムが示した突然変異を組み込むように改変した。ＡＶＮＡＰＳＡ突然変異体（配列番号５）を、ロージーウェブサービスのＡＶＮＡＰＳＡアルゴリズムが示した突然変異を組み込むように改変した。ＴａＢ突然変異体（配列番号６）を、水素結合又は静電的相互作用なく、且つＰＤＢＩＤ ３ＲＧＫの結晶構造から平均Ｂファクター＋１標準偏差を超えるＢファクターを有して、表面に到達可能な位置において、リジン又はアルギニン残基のいずれかを組み込むように改変した。コンセンサスＢモデル（配列番号７）を、ＴａＢ突然変異体において設計したが、任意の相同体において突然変異することが認められない残基への突然変異を除いた。Ｍｙｏ７（配列番号８）を、近縁種の複数の相同体において認められる正電荷残基を含むように改変し、残りの配列のベースとして使用した。Ｍｙｏ１４（配列番号９）を、構造の検討によって表面に到達可能であると判定された残基を含むように改変した。ｃＭｙｏ９（配列番号１０）、ｃＭｙｏ１４（配列番号１１）、及びｃＭｙｏ１５（配列番号１２）は、Ｍｙｏ７（配列番号８）よりも、連続的にさらなる突然変異を含むように改変し、より低い頻度である及び／又はさらに遠縁の種であった。

ＴＣＲトランスジェニックジャーカットＴ細胞（ｊＴｃ）又はマウス脾臓及びリンパ節から精製したＣＤ３＋Ｔ細胞（ｍＴｃ）を、カチオン化、コンジュゲート、若しくは天然のミオグロビン又はＧＦＰ、又はコンジュゲート超荷電ＧＦＰと共に２０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、生存度、活性化、及び増殖について３つの異なる実験において分析した。

Ｍｙｏ１４［Ｓ］を含むＴ細胞を試験するため、ＴＣＲトランスジェニックジャーカットＴ細胞（ｊＴｃ）又はマウス脾臓及びリンパ節から精製したＣＤ３＋Ｔ細胞（ｍＴｃ）を使用した。Ｔ細胞を、Ｍｙｏ１４［Ｓ］と共に３７℃で３０分間インキュベーションした、又は処理しなかった（Ｕ／Ｔ）。細胞を、２回洗浄して、Ｍｙｏ１４［Ｓ］コーティング、生存度、表現型、活性化、低酸素に対する抵抗性、及び増殖について分析した。

コンジュゲートのコーティング及び生存度アッセイ
ｊＴｃを、培地から採取し、ＰＢＳで１回洗浄してから、タンパク質なし、又は３μＭコンジュゲート超荷電ＧＦＰ（ｃｏｎ－ｓｃＧＦＰ）、３μＭ超荷電ＧＦＰ（ｓｃＧＦＰ）、１０μＭ天然ミオグロビン（ｎＭｙｏ）、１０μＭカチオン化ミオグロビン（Ｃａｔ Ｍｙｏ）、若しくは１０μＭコンジュゲートミオグロビン（Ｃｏｎ Ｍｙｏ）共に、ＰＢＳ内において３７℃で２０分間インキュベートした。コーティングしたｊＴｃを、ＰＢＳ内で３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌにおいて１×１０^６ｊＴｃでＰＢＳ内に再懸濁し、αＣＤ３－ＡＦ５９４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３００４４６）、αＨＩＳ－ＴＡＧ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３６２６０５）及びＡｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３４９５７）で、４℃において３０分間染色した。染色した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０血球計数器を用いて分析した。

Ｔ細胞全体（ｍＴｃ）を、製造者の指示どおりＤｙｎａビーズネガティブセレクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ．Ｃａｔ Ｎｏ．１１４１３Ｄ）を用いて１匹のＢａｌｂ－ｃ雌マウスの脾臓及びリンパ節から精製した。ｍＴｃを、ＰＢＳで１回洗浄してから、タンパク質なし、又は３μＭコンジュゲート超荷電ＧＦＰ（ｃｏｎ ｓｃＧＦＰ）、３μＭ超荷電ＧＦＰ（ｓｃＧＦＰ）、１０μＭ天然ミオグロビン（ｎＭｙｏ）、１０μＭカチオン化ミオグロビン（Ｃａｔ Ｍｙｏ）、若しくは１０μＭコンジュゲートミオグロビン（Ｃｏｎ Ｍｙｏ）と共に、ＰＢＳ内において３７℃で２０分間インキュベートした。コーティングしたｍＴｃを、ＰＢＳ内で３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌにおいて１×１０^６ｍＴｃでＰＢＳ内に再懸濁し、αＣＤ３－ＡＦ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５２３１６）、αＣＤ４－ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．１００５５２）、αＣＤ８－ＡＰＣｅｆ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．４７００８１８２）、αＨＩＳ－ＴＡＧ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３６２６０５）及びＡｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３４９５７）で、４℃において３０分間染色した。染色した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０血球計数器を用いて分析した。

ジャーカットＴ細胞活性化アッセイ
ＴＣＲトランスジェニックジャーカットＴ細胞（ｊＴｃ）は、ＭＨＣＨクラスＩのＨＬＡ－Ａ２によって提示すると同族ペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を形質導入したジャーカットＴ細胞である。その同族ペプチドによって刺激すると、ＣＤ６９の発現が増加して、Ｔ細胞活性化の代用マーカーとしてＦＡＣＳによって検出することができる。

ｊＴｃ及びＣ１Ｒを、１０％ｖ／ｖＦＣＳ、２μＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭの２－β－メルカプトエタノール、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｒ１０）で補充したＲＰＭＩ１６４０内で３７℃において維持した。

Ｃ１Ｒ－ＨＬＡ－Ａ２を、ＰＢＳで２回洗浄してから、０μＭ、１μＭ、又は１０μＭのいずれかの同族ペプチドと共にＰＢＳ内に３７℃で５０分間再懸濁した。細胞を、Ｒ１０内で２回洗浄し、Ｕ字底の９６プレートのウェルあたり１００μｌにおいて１×１０^５細胞でプレーティングした。

ｊＴｃを、培地から採取し、ＰＢＳで１回洗浄してから、タンパク質なし、又は３μＭコンジュゲート超荷電ＧＦＰ（ｃｏｎ－ｓｃＧＦＰ）、３μＭ超荷電ＧＦＰ（ｓｃＧＦＰ）、１０μＭ天然ミオグロビン（ｎＭｙｏ）、１０μＭカチオン化ミオグロビン（Ｃａｔ Ｍｙｏ）、若しくは１０μＭコンジュゲートミオグロビン（Ｃｏｎ Ｍｙｏ）共に、ＰＢＳ内において３７℃で２０分間インキュベートした。コーティングしたｊＴｃを、ＰＢＳ内で１回洗浄し、ウェルあたり１００μｌにおいて５×１０^４ｊＴｃでＲ１０内に再懸濁し、Ｃ１Ｒ細胞と混合した。

コーティングしたｊＴｃ及びペプチドパルスＣ１Ｒ細胞を含む同じプレートを、環境酸素レベル（２１％）又は低酸素レベル（５％）のインキュベーターにおいて３７℃で６時間共培養した。

６時間後、プレートをＰＢＳで１回洗浄し、その後、αＣＤ６９－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３１０９１０）、αＣＤ３－ＡＦ５９４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３００４４６）、及び生存細胞染色Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３４９５７）で、４℃において３０分間、細胞をインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で一晩固定した。細胞をＰＢＳ内で２回洗浄して固定液を取り除き、ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０血球計数器の高スループットモジュールに流した。

マウスＴ細胞増殖アッセイ
Ｕ字底の９６プレートを、ＰＢＳ内に希釈した１μｇ／ｍｌのαＣＤ３及び５μｇ／ｍｌのαＣＤ２８で、３７℃において１時間コーティングした。ＰＢＳを取り除いた。

Ｔ細胞全体（Ｔｃ）を、製造者の指示どおりＤｙｎａビーズネガティブセレクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ．Ｃａｔ Ｎｏ．１１４１３Ｄ）を用いて１匹のＢａｌｂ－ｃ雌マウスの脾臓及びリンパ節から精製した。

精製したＴｃを、ＰＢＳで１回洗浄してから、タンパク質なし、又は３μＭコンジュゲート超荷電ＧＦＰ（ｃｏｎ ｓｃＧＦＰ）、３μＭ超荷電ＧＦＰ（ｓｃＧＦＰ）、１０μＭ天然ミオグロビン（ｎＭｙｏ）、１０μＭカチオン化ミオグロビン（Ｃａｔ Ｍｙｏ）、若しくは１０μＭコンジュゲートミオグロビン（Ｃｏｎ Ｍｙｏ）と共に、ＰＢＳ内において３７℃で２０分間インキュベートした。

コーティングしたＴｃを、ＰＢＳ内で２回洗浄し、１０μＭＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ．Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ３４５５７）と共にＰＢＳ内に室温で２０分間再懸濁した。ＣＴＶ染色した細胞を、Ｒ１０内で洗浄し、αＣＤ３及びαＣＤ２８を事前にコーティングしたプレートに、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含む２００μｌのＲ１０においてウェルあたり４×１０^５Ｔｃで移した。

コーティングしたＴｃを含む同じプレートを、環境酸素レベル（２１％）又は低酸素レベル（５％）のインキュベーターにおいて３７℃で４日間培養した。

４日後、プレートを、５００×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、細胞を２つの組合せの抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。
組合せ１：αＣＤ３－ＡＦ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．１５２３１６）、αＣＤ４－ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．１００５５２）、αＣＤ８－ＡＰＣｅｆ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．４７００８１８２）、αＣＤ４４－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．１０３０４７）、αＨＩＳ－ＴＡＧ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３６２６０５）及びＡｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３４９５７）。
組合せ２：αＣＤ３－ＡＦ７００、αＣＤ４－ＢＶ７８５、αＣＤ８－ＡＰＣｅｆ７８０、αＰＤＬ－１－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２５９８２－８２）、アイソタイプコントロール－ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．４００４３４）、アイソタイプコントロール－ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．１７４３２１８１）及びＡｑｕａ。

その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ Ｎｏ．１１５８６７１１）で４℃において１時間固定した。細胞をＰＢＳ内で２回洗浄して固定液を取り除き、ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０血球計数器の高スループットモジュールに流した。

Ｔｃを、１０％ｖ／ｖＦＣＳ、２μＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭの２－β－メルカプトエタノール、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｒ１０）で補充したＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ Ｎｏ．２１８７５－０３４）内で３７℃において維持した。

標識効率
Ｍｙｏ１４を、コンジュゲーションの前に、製造者の指示どおりＦＩＴＣで標識した。ｊＴｃを、１４μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］－ＦＩＴＣでコーティングし、又は処理せず、αＣＤ３－ＡＦ５９４で染色し、その後フローサイトメトリーによって分析した。ＦＩＴＣ＋ＣＤ３＋Ｔｃの平均比率を代表的なＦＡＣＳプロットで示す（＋／－ＳＤ、ｎ＝３）。

ＦＡＣＳによる細胞生存度分析
種々の濃度のＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした生存ｊＴｃを、Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ細胞染色及びＣＤ３－ＡＦ５９４で染色した。Ｔｃは、シングレット及びＣＤ３＋Ｔｃにゲートをかけ、その後、生存細胞の平均パーセンテージを計算した。マウスナイーブＴｃを精製し、インビトロにおいてαＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ－２で１日間活性化した。１日目に、活性化Ｔｃを採取して、種々の濃度においてＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした。コーティングした活性化Ｔｃを、αＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ－２を含む培地に１日間戻して添加した。細胞を採取し、抗ＣＤ８及びＡｑｕａ Ｌｉｖｅ ｄｅａｄ細胞染色で染色した。細胞は、シングレット及びＣＤ８＋細胞にゲートをかけ、その後、生存細胞の平均パーセンテージを計算した。

ＦＡＣＳによる細胞増殖分析
Ｔｃ全体を１匹のＢａｌｂ－ｃマウスの脾臓及びリンパ節から精製した。Ｔｃを２．５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした、又は処理しなかった。ＴｃをαＣＤ３／ＣＤ２８で活性化した。活性化したＴｃを３日目及び５日目に採取して、トリパンブルーで染色して、死細胞を除外してカウントした。平均細胞数（＋／－ＳＤ、ｎ＝３）を示す。

精製したＴｃ全体を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットで染色し、２．５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした、又は処理しなかった（Ｕ／Ｔ）。ＴｃをαＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ２で活性化した。活性化したｍＴｃを３日目及び５日目に採取して、αＣＤ４及びαＣＤ８で染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。細胞は、ＣＤ８細胞にゲートをかけ、すべてのＣＴＶ希釈細胞の平均を「分裂ＣＤ８Ｔｃ」に含んだ（＋／－ＳＤ、ｎ＝３）。

抗原特異的活性化
ＴＣＲトランスジェニックｊＴｃを、１０μＭの［Ｍｙｏ１４－ＭＢＰ］［Ｓ］でコーティングした、又は処理しなかった（Ｕ／Ｔ）。ｊＴｃを、上述の濃度の同族ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ－ＨＬＡ－Ａ２＋細胞ペプチドと共に６時間培養した。ｊＴｃをαＣＤ３－ＡＦ５９４、αＣＤ６９－ＡＰＣ、及びＡｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色で染色し、活性化マーカーＣＤ６９の平均ＭＦＩを、生存ＣＤ３＋ｊＴｃにおいて計算した（＋／－ＳＤ、ｎ＝３）。

低酸素色素アッセイ
Ｉｍａｇｅ－ｉＴ緑色低酸素用試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、ＤＭＳＯを加えて十分に混合することで５ｍＭに希釈した。その後、このストックを、Ｒ１０培地内で１０１μＭの最終濃度になるようにｊＴｃに添加し、２０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２において３７℃で４０分間インキュベートした。その後、細胞を５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を流して捨て、新しい増殖培地に置き換えた。その後、細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり５×１０^５細胞でプレーティングし、酸素濃度を所望の値、例えば０．５％Ｏ_２に固定して、経時で蛍光プレートリーダーにおいて読み取った。

ｈＭＳＣ炎症アッセイ
４人の患者から単離したヒト間葉系幹細胞を、２．５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングし、又は処理せず、７日間培養した。ポジティブコントロールとして、細胞をＩＦＮγとともに培養した。７日目に、細胞を採取し、カウントして、Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色、並びに系統マーカーのＣＤ１０５及びＣＤ７３、並びに炎症マーカーのＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＡＢＣ、及びＰＤＬ１で染色した。細胞は、シングレット及び生存細胞及びＣＤ１０５＋ＣＤ７３＋細胞にゲートをかけ、その後、各マーカーを発現する細胞の平均パーセンテージを計算した。

２Ｄのインビトロ腫瘍死滅アッセイ
ＩＧＲ－Ｈｅｕ肺がん腫細胞、ＳＫＢＲ３、ＢＴ２０、ＭＣＦ７乳がん細胞、ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞、又はＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞などの腫瘍細胞の抗原特異的死滅を、ＰＢＭＣ若しくは腫瘍浸潤性リンパ球単離由来のヒト細胞傷害性Ｔ細胞、又はＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて行った。

ＰＢＭＣからの単離の際、Ｔ細胞を、照射自己腫瘍細胞、ＨＬＡ－Ａ２－結合ＨＥＲ－２／ｎｅｕ ｐ３６９－３７７ペプチド、又はＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａビーズ、及びＩＬ－２などの成長因子などの刺激剤を用いて活性化する。

腫瘍標的細胞との共培養の前に、Ｔ細胞をＭｙｏ１４又はＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングする。未コーティングＴ細胞を、ベースライン死滅活性のコントロールとして用いる。腫瘍細胞株を、レポーター遺伝子発現のため遺伝子導入する、又は蛍光標識するためＣＦＳＥなどの色素と共にインキュベートする。活性化Ｔ細胞及び腫瘍標的細胞の共培養時に、イメージング、ＦＡＣＳによって、又はプレートリーダーを用いて蛍光の低下をモニタリングして、腫瘍死滅速度を測定する。

腫瘍死滅のポジティブコントロールとして、抗がん薬剤（すなわちスタウロスポリン）を腫瘍細胞単独の培地に添加した。

３Ｄのインビトロ腫瘍死滅アッセイ
標的腫瘍細胞を、ＧＦＰを発現するように遺伝子導入して、３Ｄ球状体に成長させる。単離したＴ細胞を、Ｍｙｏ１４又はＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした後、腫瘍球状体に加える。未コーティングＴ細胞を、ベースライン死滅活性のコントロールとして用いる。共培養時に、イメージングによって蛍光の低下をモニタリングして、腫瘍球状体細胞死速度を測定する。

腫瘍球状体におけるＴ細胞浸潤をモニタリングするため、Ｔ細胞を別の色素で蛍光標識し、共培養物をイメージングする。

腫瘍死滅のポジティブコントロールとして、抗がん薬剤（すなわちスタウロスポリン）を腫瘍球状体単独の培地に添加した。

インビボ腫瘍死滅アッセイ
Ｍｙｏ１４に基づくコンストラクトは、さらに機能性及び有効性を示すため、インビトロ及びインビボにおいて複数のモデルで試験する。インビボの有効性のため、及びＭｙｏ１４に基づくコンストラクトが複数の腫瘍学的用途に適することを示すため、Ｍｙｏ１４［Ｓ］及び［Ｍｙｏ１４－ＰＤ１］［Ｓ］をキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）又はトランスジェニッククローン４Ｔ細胞にコーティングし、それぞれＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん腫瘍又はＲｅｎｃａＨＡ腫瘍を有するマウスに養子移入した。各実験をより詳細に以下に記載する。

ＣＡＲ－Ｔ／ＭＤＡ－ＭＢ－２３１実験において、３２匹のＮＳＧマウスにＭＤＡ－ＭＢ－２３１を皮下接種する。腫瘍が所定の時点に達すると、マウスを４群に分ける。１群は処置せず、２群はＣＡＲ－Ｔで静脈内処置し、３群はＭｙｏ１４［Ｓ］コーティングＣＡＲ－Ｔで静脈内処置し、４群は［Ｍｙｏ１４－ＰＤ１］［Ｓ］コーティングＣＡＲ－Ｔで静脈内処置する。実験を少なくとも１回繰り返す。

腫瘍サイズをノギス、及びルシフェラーゼ形質導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞の生物発光イメージングで定期的に測定する。連続的な尾部出血のフローサイトメトリー分析を行って、注入したＴｃの残留性及び増殖性を測定する。

処置した腫瘍組織の切片を、がん研究英国バーミンガムがんセンターから入手可能な多重染色（多色Ｖｅｃｔｒａ自動定量病理イメージングシステム、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアを用いて定量的に分析）によって分析した。腫瘍を以下の抗体群、抗ヒトＣＤ３、汎サイトケラチン（腫瘍マーカー）、ＣＤ３４（ＣＡＲマーカー）、炭酸脱水酵素ＩＸ（低酸素マーカー）、ヒトアネキシンＶ（アポトーシスマーカー）及びヒトＩＦＮγ（機能マーカー）ヒトＰＤ１及びヒトＰＤＬ１（とＤＡＰＩ核染色）で染色する。これにより、免疫細胞の可視化、分析、定量化、及び表現型決定、及び単一腫瘍組織切片内の細胞間の相互作用特定が可能になる。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在について、二次リンパ組織及び腫瘍をＦＡＣＳによって分析する。養子移入したＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を、ＰＤ１、ＣＤ４５、及びＣＤ６２Ｌの表面発現、並びにＩＦＮγ及びＴＮＦαの細胞内サイトカイン染色について分析する。処置した腫瘍細胞の表現型を、ＰＤＬ－１、ＭＨＣクラスＩ、及びＭＨＣクラスＩＩの表面発現によって分析する。

さらなるインビボの腫瘍モデルにおいて、Ｍｙｏ１４［Ｓ］及び［Ｍｙｏ１４－ＰＤ１］［Ｓ］を、６～８週齢のＣＬ４ ＴＣＲ－トランスジェニックＴｈｙ１．１＋ＢＡＬＢ／ｃマウスから精製したトランスジェニッククローン４Ｔ細胞にコーティングする。２０×１０^６ＣＬ４ ＴＣＲ－トランスジェニックＴｃを、これまでに１×１０^６ＲｅｎｃａＨａ腫瘍細胞を皮下注入した、８匹の無作為に選別した雌Ｂａｌｂ－ｃマウスに静脈内注入する。ＲｅｎｃａＨａ腫瘍増殖を、未処置、未コーティングＴｃで処置、Ｍｙｏ１４［Ｓ］コーティングＴｃ及び［Ｍｙｏ１４－ＰＤ１］［Ｓ］コーティングＴｃで処置の４つの群において測定する。先の研究に基づいて、実験における科学的及び人道的な終了点を２７日に設定する。２次元における腫瘍直径を一日おきにノギスを用いて測定し、腫瘍進行速度及び最終腫瘍体積を計算する。連続的な尾部出血のフローサイトメトリー分析を行って、注入したＴｃの残留性及び増殖性を測定する。

Ｔｈｙ１．１類遺伝子マーカーを含む養子移入したＴｃを、蛍光免疫組織化学法によって、腫瘍、脾臓、腫瘍排出及び腫瘍非排出リンパ節、肺、脳、並びに肝臓において特定して、分布、及び腫瘍特異的遊走、並びに処理及び未処理のＴｃの貯留を示す。さらに、腫瘍サンプルの切片を、血管構造（ＣＤ３１／ＭＥＣＡ－３２）及び低酸素（炭酸脱水酵素ＩＸ８）のマーカーで染色して、低酸素領域を特定する。この染色は、Ｔｃ特定と共に、低酸素領域へのＭｙｏ［Ｓ］処理Ｔｃ遊走及び残留性の特定を可能とする。

腫瘍、脾臓、腫瘍非排出及び腫瘍排出リンパ節の一部を採取して、ＦＡＣＳ分析のために処理する。腫瘍から精製したＴｃを、その生存度、インビトロにおいて腫瘍細胞を死滅させる能力、並びにＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＰＤ１、アネキシンＶ、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの発現について分析する。さらに、腫瘍細胞の表現型を、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ、並びにＰＤＬ１について分析する。

〔結果及び検討〕
コンストラクトで標識した細胞のパーセンテージ
コーティングした生存細胞を、上述のように蛍光コンジュゲート抗体及び生存度用色素で直ちに染色してから、フローサイトメトリーによって生存度及びコンストラクトの存在について分析した。ＧＦＰ及びＨＩＳタグの両方が、３回の洗浄後、Ｔｃの表面において検出でき、これらが細胞表面にしっかりと結合していることを示唆した（図１ａ～図１ｄ）。カチオン化ミオグロビン（８３．５％＋／－０．４）及びコンジュゲートミオグロビン（７９．４％＋／－０．８）に結合したｊＴｃのパーセンテージは同等であった（図１ａ）が、カチオン化ミオグロビン（４７．７％＋／－１．４）と比較してコンジュゲートミオグロビン（６．７％＋／－０．８）に結合したｍＴｃのパーセンテージが有意に低下した（図１ｃ）。理論に縛られることを望まないが、ｊＴｃ及びｍＴｃに対するカチオン化ミオグロビン及びコンジュゲートミオグロビンの結合が異なる理由は、細胞膜におけるグリコシル化の変わりやすさ、又はＨＩＳタグ標識タンパク質を検出する能力の差のためであり得る。後者の仮説の裏付けについて、ｊＴｃ及びｍＴｃの両方におけるＧＦＰ標識は、超荷電ＧＦＰ及びコンジュゲートＧＦＰの両方で８７％より高い（図１ｂ及び図１ｄ）が、同等のＨＩＳタグ標識は、２０％から９１％まで変化し、ＨＩＳタグ標識がすべてのＧＦＰ標識を検出せず、さらなる検討が必要であることを示唆する。理論に縛られることを望まないが、低ＨＩＳタグ表示及び高ＧＦＰ信号は、コンストラクトの内部移行、又はＨＩＳタグを隠す方向におけるｍＴｃ細胞との結合に起因し得、これらの両方はＧＦＰ信号に影響しないが、抗ＨＩＳタグ抗体結合を抑止し得るということがあり得る。

細胞生存度
ミオグロビンなし、又は天然、カチオン化、若しくはコンジュゲートミオグロビンありでインキュベートしたｊＴｃの生存度は９４％を超えたが、ｓｃＧＦＰ及びコンジュゲートＧＦＰありのｊＴｃの生存度はそれぞれ、４７．７％及び６３．９５％であり（図２ａ）、ミオグロビンではなくＧＦＰが、試験した濃度でｊＴｃに毒性があることを示唆した。ミオグロビンなし（９２．３％＋／－１．１４）及び天然ミオグロビン（９４．６５％＋／－０．３１）ありのｍＴｃの生存度は、カチオン化ミオグロビン（７６．７８％＋／－０．５０）及びコンジュゲートミオグロビン（７９．７％＋／－０．４）でコーティングしたｍＴｃより有意に高く、カチオン化ミオグロビン及びコンジュゲートミオグロビンは試験した濃度でいくらかの細胞死を引き起こすことを示唆した。ｓｃＧＦＰ（６３．０％＋／－１．９）及びコンジュゲートＧＦＰ（４１．１％＋／－１．１２）でコーティングしたｍＴｃにおいてさらなる細胞死があった（図２ｂ）。

これらの結果はともに、ｊＴｃ及びｍＴｃの両方にカチオン化ミオグロビンが良好に細胞表面結合し、特にｊＴｃに対する細胞毒性が最小限であることを示す。細胞生存度を向上させながら、コンジュゲートミオグロビンの結合を最適化するため、ｍＴｃでのさらなる実験を必要とする。同じ濃度のカチオン化ミオグロビン及びコンジュゲートミオグロビンに対する異なるｍＴｃ及びｊＴｃの生存度は、ｊＴｃ細胞株が初代マウスナイーブＴｃよりも頑強であるという、特有の細胞頑強性のためであると考えられる。

Ｔ細胞処理における界面活性剤コンジュゲート超荷電ミオグロビンの（Ｍｙｏ１４［Ｓ］）の最適な濃度を確認するため、種々の濃度のＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした後、ｊＴｃ及び初代ｍＴｃの生存度を試験した。ｊＴｃの生存度は、最大４０μＭ以下の試験したすべての濃度で９０％を超えた（図５ｂ）。初代マウスＴ細胞の生存度は、Ｍｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした１日後、１０μＭ以下の試験したすべての濃度で９０％以上であった（図５ｃ）。

同族ペプチドに対する活性
ｊＴｃをコンストラクトでコーティングすることで、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）が提示するその同族のペプチドとのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の会合を阻止するかどうかを試験するため、Ｃ１Ｒ－ＨＬＡ－Ａ２（Ｃ１Ｒ）Ｂ細胞が提示する同族ペプチドを認識するとＣＤ６９を上方調節する、ＴＣＲトランスジェニックジャーカットＴ細胞を使用した。ｊＴｃは、ミオグロビン又はＧＦＰコンストラクトでコーティングし、０μＭ、１μＭ、又は１０μＭの同族ペプチドでそれまでにパルスしたＣ１Ｒ細胞と共に６時間インキュベートした。活性化マーカーであるＣＤ６９の上方調節をフローサイトメトリーによって分析した。１μＭ又は１０μＭのペプチドの添加により、ＣＤ６９を発現する細胞のパーセンテージが、未処理ｊＴｃの０．９２％（＋／－０．０６）から１μＭのペプチドの９．３２％（＋／－１．１６）に、及び１０μＭのペプチドの２０．９７％（＋／－１．８０）に増加した（図３ａ及び図３ｂ）。カチオン化若しくはコンジュゲートミオグロビンで（図３ａ）、又は超荷電若しくはコンジュゲートＧＦＰで（図３ｂ）コーティングした後、ＣＤ６９発現の増加における有意差はなかった。この結果は、コンストラクトとのＴＣＲトランスジェニックｊＴｃの結合がＴ細胞活性化を阻止せず、ＴＣＲ－ＭＨＣ活性化複合体の間でコンストラクトに起因する立体干渉は存在しないことを示唆するということを示す。

低酸素状態下の増殖及び活性
ｍＴｃを、ミオグロビンコンストラクトでコーティングした後、正常酸素（２２％酸素）及び低酸素（５％酸素）状態下で活性化させた。ｍＴｃを抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の存在下で４日間インキュベートした。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８はともに、ＴＣＲ及び共刺激分子ＣＤ２８に結合し、Ｔｃのポリクローナル活性化を引き起こす。４日目に、ｍＴｃを採取して、フローサイトメトリーによって分析した。ｍＴｃは、ＣＤ４又はＣＤ８にゲートをかけて、これらの２つのＴ細胞サブタイプを分析した。各サブタイプを、増殖のマーカーであるｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット（ＣＴＣ）の希釈、及び活性化のマーカーであるＣＤ４４の高発現について分析した。

未処理の細胞において、低酸素は、分裂ＣＤ４ｍＴｃのパーセンテージを６６．２３％（＋／－２．５４）から７２．１％（＋／－３．５４）に増加させ、ＣＤ８ｍＴｃを７０．７５％（＋／－２．６３）から７８．２％（＋／－５．１５）に増加させ、低酸素環境がＴｃ増殖を増加させることを示唆した（図４ａ及び図４ｂ）。正常酸素状態下では、カチオン化ミオグロビン又はコンジュゲートミオグロビンでコーティングしたＣＤ４及びＣＤ８ｍＴｃはすべて、その未処理又は天然ミオグロビン処理対応物よりも有意に低い分裂細胞のパーセンテージを有していた。この観察結果は、活性化前にミオグロビンコンストラクトでコーティングした後のこれらの細胞の生存度低下（図２ｂ）によって合理的に説明可能である。しかしながら、コーティングしたＣＤ４及びＣＤ８Ｔｃを低酸素状態下で培養したとき、正常酸素状態と比較して分裂ｍＴｃのパーセンテージより高く、ミオグロビン及び／又は低酸素の存在がこれら細胞の増殖異常を回復することを示唆した。

未処理ＣＤ４Ｔｃでは、正常酸素と比較して、低酸素が、活性化ＣＤ４ＣＤ４４ｈｉ Ｔｃのパーセンテージを４５．９％（＋／－２．８６）から５０．８３％（＋／－２．１６）に増加させた。カチオン化ミオグロビン又はコンジュゲートミオグロビンでコーティングし、正常酸素状態下で活性化したＣＤ４Ｔｃは、未処理又は天然ミオグロビン処理Ｔｃよりも有意に低いＣＤ４ＣＤ４４ｈｉ Ｔｃのパーセンテージを有していたが、低酸素状態下で活性化した同じ細胞は、未処理及び天然ミオグロビン処理ｍＴｃと比較したとき、同等のＣＤ４ＣＤ４４ｈｉ Ｔｃのパーセンテージを有していた（図４ｃ）。

未処理ＣＤ８Ｔｃでは、正常酸素と比較して、低酸素が、ＣＤ８ＣＤ４４ｈｉ Ｔｃのパーセンテージを６１．２５％（＋／－１．９３）から５２．３３％（＋／－２．２７）に有意に（ｐ＝０．００１）低下させた。カチオン化ミオグロビン（５８．０８％＋／－１．３４）ではなく、コンジュゲートミオグロビン（４９．８３％＋／－２．２１）の添加により、未処理のコントロール（６１．２５％＋／－１．９３）と比較したとき、正常酸素状態下でＣＤ８ＣＤ４４ｈｉ Ｔｃのパーセンテージの低下をもたらした。しかしながら、カチオン化ミオグロビン又はコンジュゲートミオグロビンの添加は、低酸素状態下において、ＣＤ８Ｔｃ活性化の低酸素誘発性低下を回復した。実際に、両形態のミオグロビンの添加によって、ＣＤ８ＣＤ４４ｈｉ Ｔｃのパーセンテージを、未処理ＣＤ８Ｔｃの５２．３３％（＋／－２．２７）から、カチオン化ミオグロビンコーティングＣＤ８Ｔｃの７１．５％（＋／－２．５０）に、及びコンジュゲートミオグロビンコーティングＣＤ８Ｔｃの６３．８８％（＋／－３．６７）に増加させた（図４ｄ）。ミオグロビンコンストラクトが、低酸素状態ではなく正常酸素状態下でＣＤ４４ｈｉ Ｔｃの低下を引き起こす理由は不明である。Ｔｃの生存度における当初の低下が関与し得るということがあり得る。また、コンストラクトが、正常酸素状態下においてのみ重要であるというように、ＴＣＲ又はＣＤ２８を介していくらかＴ細胞シグナリングに干渉し得るということがあり得る。しかしながら、ミオグロビンでの処理が正常酸素状態下でＣＤ８Ｔｃの活性化表現型を回復するとの示唆は、ＣＤ８Ｔｃが、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＩＬ療法の両方のさらなる開発の重要な標的であるため、非常に望みになる。

増殖
インビトロの活性化ｍＴｃの増殖及び生存度を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットで染色して２．５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした３及び５日後に、評価した。未処理（Ｕ／Ｔ）のコントロールと比較したとき、２．５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングした３又は５日後の生存活性化Ｔ細胞の数において有意差は存在しなかった（図５ｄ）。さらに、同じ実験において、１回以上の分裂をしたｍＴｃのパーセンテージは、Ｍｙｏ１４［Ｓ］処理及び未処理コントロールにおいて有意に異ならなかった（図５ｅ）。

抗原特異的活性化
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックジャーカットＴ細胞が、その同族ＭＨＣペプチド複合体を認識する際に活性化されるという能力を、ＣＤ６９活性化アッセイにおいて試験した。このアッセイでは［Ｍｙｏ１４－ＭＢＰ］［Ｓ］を使用し、これは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１７などのサイトカイン、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３などのＴ細胞受容体、又はメタロプロテアーゼなどの酵素を含むがこれらに制限されない、Ｍｙｏ１４に連結可能な任意の他のタンパク質の代理として使用されるためである。ペプチド濃度の増加に対応する、［Ｍｙｏ１４－ＭＢＰ］［Ｓ］でコーティングしたｊＴｃにおけるＣＤ６９の上方調節は、未処理コントロールと有意に異ならなかった。これらの結果は、他のタンパク質（この場合ＭＢＰ）に連結したＭｙｏ１４［Ｓ］でのコーティングは、正常なｊＴｃと標的細胞タンパク質との相互作用に干渉せず、したがって、正常なＴ細胞シグナリングに干渉することはないということを示す（図５ｆ）。

疲弊マーカープロファイリング
ナイーブｍＴｃが界面活性剤コンジュゲート超荷電ミオグロビン（Ｍｙｏ１４［Ｓ］）の存在下でストレスを受けないことを示すため、精製ｍＴｃを２．５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングし、αＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ－２で３日間刺激した。３日目に、活性化ｍＴｃを採取し、活性化マーカーＣＤ４４並びに疲弊／活性化マーカーＬＡＧ３、ＰＤ１、及びＴＩＧＩＴの発現について分析した。試験したマーカーのいずれにおいても未処理及びＭｙｏ１４［Ｓ］処理細胞の有意差は存在しなかった（図６ａ）。

低酸素色素アッセイ
界面活性剤コンジュゲート超荷電ミオグロビン（Ｍｙｏ１４［Ｓ］）は酸素輸送分子であるので、発明者らは、Ｍｙｏ１４［Ｓ］が輸送する酸素をＴｃに供給できるかを判定しようとした。ｊＴｃは、Ｉｍａｇｅ－ｉＴ緑色低酸素用試薬で染色し、その後処理しなかった、又は１０μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］で処理した。染色してコーティングしたｊＴｃをＣｙｔａｔｉｏｎプレートリーダーに移し、蛍光を５％二酸化炭素及び０．５％酸素において２２時間モニタリングした。相対蛍光性、つまり未処理ｊＴｃの内部低酸素状態は大きく増加し、Ｍｙｏ１４［Ｓ］処理ｊＴｃより高いレベルに達し、Ｍｙｏ１４［Ｓ］が酸素をｊＴｃに供給していることを示唆する（図６ｂ）。

ｈＭＳＣ炎症アッセイ
本明細書に記載の技術は、多数の細胞型及び疾患徴候に適用可能である。本発明者らは、界面活性剤コンジュゲート超荷電ミオグロビン（Ｍｙｏ１４［Ｓ］）をヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）にコーティング可能であることを示した。ｈＭＳＣを５μＭのＭｙｏ１４［Ｓ］でコーティングしてから、インビトロで７日間成長させた。７日目に、ｈＭＳＣを採取し、生存細胞をカウントしてから、細胞を、系統マーカーＣＤ７３及びＣＤ１０５並びに炎症マーカーＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＰＤ－Ｌ１の抗体で染色した。炎症マーカーの上方調節のコントロールとして、細胞をまた、炎症性サイトカインＩＦＮγと共に培養した。未処理及びＭｙｏ１４［Ｓ］処理ｈＭＳＣにおいて、細胞数、又はＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＰＤ－Ｌ１発現細胞パーセンテージの有意差は存在しなかった（図６ｃ）。

表４は、上述の技術を用いて作製した一連の電荷修飾（超荷電）ミオグロビンにおけるアミノ酸配列を示す。
表４は、電荷修飾ミオグロビン及び電荷修飾ＧＦＰのアミノ酸配列を示す。

Claims (20)

1. 抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセルであって、該細胞、リポソーム、又はミセルの膜に会合した少なくとも１つの電荷修飾グロビンを含む、抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセル。
2. 前記細胞は、免疫細胞、好ましくは腫瘍浸潤性免疫細胞、より好ましくはリンパ球、好中球、樹状細胞、又はマクロファージである、請求項１に記載の細胞。
3. 前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、又はナチュラルキラー細胞である、請求項１又は２に記載の細胞。
4. 前記細胞はＴ細胞である、請求項１～３のいずれかに記載の細胞。
5. 前記リポソーム又はミセルは治療剤を含み、好ましくは前記治療剤はチェックポイント阻害剤、免疫療法剤、又は化学療法剤である、請求項１に記載のリポソーム又はミセル。
6. 前記グロビンはヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビン、又はサイトグロビン、好ましくはミオグロビンである、請求項１～５のいずれかに記載の細胞、リポソーム、又はミセル。
7. 前記グロビンは、二次抗腫瘍分子、又は二次抗腫瘍分子に連結するための反応性官能基に連結し、好ましくは前記二次抗腫瘍分子は、抗体、レクチン、インテグリン、若しくは接着分子のいずれか１つである、及び／又は、好ましくは前記二次抗腫瘍分子は、（１）腫瘍細胞結合分子、（２）チェックポイント阻害剤、（３）腫瘍の細胞外マトリックスを再構築する酵素、若しくは（４）腫瘍関連化合物を代謝する酵素のいずれか１つである、請求項１～６のいずれかに記載の細胞、リポソーム、又はミセル。
8. 前記グロビン及び前記二次抗腫瘍分子を含む融合タンパク質を含む、請求項７に記載の細胞、リポソーム、又はミセル。
9. 前記グロビンは、カチオン化グロビン又はアニオン化グロビンである、請求項１～８のいずれかに記載の細胞、リポソーム、又はミセル。
10. 前記グロビンは、ポリマー界面活性剤コーティングを含む、請求項１～９のいずれかに記載の細胞、リポソーム、又はミセル。
11. 請求項１～１０のいずれかに記載の抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセルを含み、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルをさらに含む、医薬組成物。
12. がんの処置における使用のための、請求項１～１０のいずれかに記載の細胞、リポソーム、若しくはミセル、又は請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 請求項１～１０のいずれかに記載の抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセルを作製する方法であって、
    （ａ） 電荷修飾グロビンを準備するステップ、及び
    （ｂ） 前記抗腫瘍細胞、抗腫瘍リポソーム、又は抗腫瘍ミセルを前記グロビンに接触させるステップを含む方法。
14. ステップ（ａ）は、電荷修飾グロビンとポリマー界面活性剤とを準備し、これは、前記ポリマー界面活性剤を前記グロビンに静電コンジュゲーションさせる条件下で行うことを含む、請求項１３に記載の方法。
15. グロビンは、
    （ｉ） グロビンの溶液をＮ，Ｎ’－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）又はその類似体のｐＨ中和溶液と混合するステップ、及び任意で混合物をｐＨ５～７に調節するステップ、
    （ｉｉ） その後又は同時に、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを添加するステップ、及び前記混合物をｐＨ４～７に調節するステップ、
    （ｉｉｉ） （ｉｉ）の前記混合物をｐＨ４～７において０～２５℃の温度で１～３０時間かく拌するステップ、
    （ｉｖ） 水又はバッファーに対して（ｉｉｉ）の前記混合物内のタンパク質をｐＨ６．５～８．５において少なくとも４時間透析するステップ、
    （ｖ） 必要であれば、（ｉｖ）の前記混合物のｐＨをｐＨ６．５～８．５に調節するステップを含む方法によって、前記電荷修飾グロビンに変換される、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 前記電荷修飾グロビンは、該電荷修飾グロビン質をコードする組換えＤＮＡ配列を発現することを含む方法によって得られる、請求項１３又は１４に記載の方法。
17. がんを処置する方法であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞、リポソーム、若しくはミセル、又は請求項１１に記載の医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与することを含む方法。
18. 前記がんは固形腫瘍がんである、請求項１２に記載の使用、又は請求項１７に記載の方法。
19. 前記がんは、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、子宮頸部がん、又は膵臓がんから選択される、請求項１２若しくは１８に記載の使用、又は請求項１７若しくは１８に記載の方法。
20. 配列番号１～１４のいずれかの電荷修飾グロビン配列を含むポリペプチド、又は非変異体グロビン配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するもののいずれかの機能的変異体。
    

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