CN113891719A - 包含电荷修饰的珠蛋白的抗肿瘤的细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗肿瘤的细胞、脂质体或微团，其包含至少一种与所述细胞、脂质体或微团的膜相关联的电荷修饰的珠蛋白，以及其制备和使用的方法。

Description

包含电荷修饰的珠蛋白的抗肿瘤的细胞
技术领域
本发明涉及抗肿瘤的细胞、脂质体和微团，所述抗肿瘤的细胞、脂质体和微团包含与所述细胞、脂质体或微团的膜相关联，可增强细胞、脂质体或微团的抗肿瘤性能。本发明还提供了制备方法和使用方法。
背景技术
许多抗肿瘤疗法涉及使用细胞、脂质体和微团。最近的例子包括使用工程改造的免疫细胞(如CAR-T细胞)进行治疗，CAR-T细胞是细胞毒性T细胞，其通过基因工程表达具有肿瘤特异性的嵌合抗原受体(CAR)。CAR使T细胞与肿瘤细胞结合，然后T细胞可以杀死肿瘤细胞。脂质体和微团也可被用来进行治疗，脂质体和微团以与细胞毒性T细胞相似的方式与肿瘤结合并递送抗肿瘤组合物。
然而，这些尝试因肿瘤逃避免疫系统的能力而受挫。实体瘤微环境具有高度的免疫抑制作用：肿瘤细胞表达检查点抑制剂并募集抑制性细胞群，局部缺氧导致免疫抑制基因表达的级联反应。作为上述作用的一个结果，诸如细胞毒性T细胞之类的肿瘤杀伤细胞被“失活”，即它们失去识别和杀死肿瘤细胞的能力。
目前克服这种免疫抑制的方法包括系统性给药抗体，以阻断使细胞毒性T细胞失活的蛋白(如PD-1、PD-L1和CTLA4)，还包括耗竭免疫抑制调节性T细胞(一种免疫抑制性T细胞)以及使用富氧气体或促红细胞生成素来提高氧气水平。也有报道称，给药珠蛋白可以减少癌细胞中的缺氧情况，故可以尝试给药珠蛋白以增强化疗药物的有效性(例如，如US2015/0374796所述)。
本发明提供了抗肿瘤细胞、脂质体和微团，其中所述细胞、脂质体和微团的抗肿瘤活性增强，特别是通过降低肿瘤具有的逃避抗肿瘤细胞、脂质体和微团抗肿瘤作用的能力，以及降低肿瘤逃避免疫反应的能力。
发明概述
根据第一方面，本发明提供一种抗肿瘤的细胞、抗肿瘤的脂质体或抗肿瘤的微团，其包含至少一种与所述细胞、脂质体或微团的膜相关联的电荷修饰的珠蛋白。
发明人已经确定了一种用于治疗肿瘤的改进治疗组合物，特别是针对实体瘤的。令人惊讶的是，发明人发现电荷修饰的珠蛋白可成功与细胞、脂质体和微团的膜结合，所述珠蛋白尽管被电荷修饰并与细胞、脂质体或微团结合，仍然成功地保留了它们的氧转运和递送功能。此外，发明人发现这种结合可在不丢失所述细胞、脂质体或微团的关键特性的情况下实现，例如稳定性、生存能力和活性。具体而言，T细胞的实验表明，其存活能力、增殖能力以及关键的活性并未丧失。将电荷修饰的珠蛋白与抗肿瘤的细胞、脂质体或微团的膜结合的一个重要方面是，电荷修饰的珠蛋白可同时对所述细胞、脂质体或微团以及肿瘤细胞提供多种有益作用。例如，如下文详细讨论的，电荷修饰的珠蛋白可调节和/或提高抗肿瘤细胞对缺氧实体瘤细胞的活性。此外，电荷修饰的珠蛋白还可以减少缺氧实体瘤中的缺氧，从而减轻缺氧条件的影响。例如，减少缺氧可使肿瘤细胞对可能通过脂质体或微团递送的抗肿瘤细胞和/或化疗的效果敏感。因此，本发明所述的细胞、脂质体或微团具有克服肿瘤逃避所述细胞、脂质体和微团抗肿瘤作用能力的固有能力，以及降低肿瘤逃避与本发明的抗肿瘤细胞、脂质体或微团的影响同时发生的任何免疫反应的能力。电荷修饰珠的蛋白与细胞、脂质体或微团的膜的关联意味着所述细胞、脂质体或微团区域中珠蛋白的局部浓度在非结合系统中只能通过系统给药大量过量的珠蛋白来匹配。当所述细胞、脂质体或微团靶向缺氧实体瘤时，这也适用于缺氧实体瘤区域的珠蛋白局部浓度。此外，通过将电荷修饰的珠蛋白与抗肿瘤的细胞、脂质体或微团结合，所述细胞、脂质体或微团对实体瘤的抗肿瘤效应在珠蛋白作用于实体瘤的同时固有地发生。此外，当抗肿瘤的细胞、脂质体或微团与实体瘤内的特定部分结合并作用于该特定部分时，相关的电荷修饰珠的蛋白本身也作用于该实体瘤的相同部分。
珠蛋白经过电荷修饰。这意味着相对于天然(或“未修饰”或“野生型”)珠蛋白，珠蛋白的净表面电荷被修饰。换句话说，至少一个在天然蛋白中带负电或中性的残基已经修饰为带正电荷，或者至少一个在天然蛋白中带正电荷或中性的残基已经修饰成带负电荷。“带电荷的残基”可以理解为包括固有带电荷的残基(例如，蛋白原性氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，也包括经修饰被插入至少一个带一个或多个电荷的官能团的带电荷的残基。
通常，在生理pH下评估电荷，例如pH约为6-9，例如pH约为6、6.5、7、7.5、8、8.5或约9。
珠蛋白的电荷修饰可以通过各种方式实现。例如，可以提供天然珠蛋白，然后对该蛋白进行化学修饰以改变一个或多个残基的电荷状态。或者，可以通过重组表达编码电荷修饰的珠蛋白的序列来生成电荷修饰的珠蛋白。电荷修饰的珠蛋白也可以通过电荷修饰的珠蛋白的表达和化学修饰的组合来产生。
如上所述，电荷修饰的珠蛋白相对于天然蛋白具有一个或多个电荷修饰。例如，经修饰而带有的一个或多个正电荷残基的数量可以为1-100，例如，1-80、10-70、20-60或30-50，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47，48、49、50、51、52、53、54或55。此外，或着，经修饰而带有的一个或多个负电荷残基的数量可以为1-100，例如，1-80、10-70、20-60或30-50，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47，48、49、50、51、52、53、54或55。
在经修饰后总表面正电荷增加的情况下，所述电荷修饰的珠蛋白可称为阳离子化珠蛋白，或者在经修饰后总表面负电荷增加的情况下，所述电荷修饰的珠蛋白可称为阴离子化珠蛋白。对于所述阳离子化珠蛋白，表面正电荷的总体变化可能为+1至+100，例如+1至+80、+10至+70、+20至+60或+30至+50，例如约+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20、+21、+22、+23、+24、+25、+26、+27、+28、+29、+30、+31、+32、+33、+34、+35、+36、+37、+38、+39、+40、+41、+42、+43、+44、+45、+46、+47、+48、+49、+50、+51、+52、+53、+54或+55。所述阳离子化珠蛋白的总表面正电荷可为+1至+100，例如+1至+80、+10至+70、+20至+60或+30至+50，例如至少约+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20、+21、+22、+23、+24、+25、+26、+27、+28、+29、+30、+31、+32、+33、+34、+35、+36、+37、+38、+39、+40、+41、+42、+43、+44、+45、+46、+47、+48、+49、+50、+51、+52、+53、+54或+55。
对于所述阴离子化珠蛋白，表面负电荷的总体变化可能为-1至-100，例如，-1至-80，-10至-70，-20至-60、或-30至-50，例如约-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、+23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-44、-45、-46、-47、-48、-49、-50、-51、-52、-53、-54或-55。所述阴离子化珠蛋白的总表面负电荷可为-1至-100，例如，-1至-80，-10至-70，-20至-60、或-30至-50，例如至少约-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-44、-45、-46、-47、-48、-49、-50、-51、-52、-53、-54或-55。
通常，所述电荷修饰的珠蛋白包含的带有正电荷或负电荷残基的百分比被定为其在蛋白中氨基酸残基总数的百分比。正电荷或负电荷的百分比大于相应天然珠蛋白中正电荷或负电荷的百分比。例如，天然珠蛋白总氨基酸残基的5.0-40％为带正电残基，而经电荷修饰的珠蛋白可具有比相应天然珠蛋白中更高的百分比。例如，天然人肌红蛋白有14％的氨基酸残基是带正电荷的残基。同样，人血红蛋白有10％的氨基酸残基是带正电荷的残基，而马心脏肌红蛋白和黑猩猩肌红蛋白都有14％的氨基酸残基是带正电荷的残基。电荷修饰的珠蛋白可具有总氨基酸残基数的至少约18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或至少约30％作为正电荷残基。上述原理同样适用于带负电的残基。
电荷修饰的珠蛋白也可以称为超荷珠蛋白。因此，本文中使用的术语“超荷珠蛋白”可指相对于天然蛋白，其上具有一个或多个电荷修饰的任何珠蛋白，正如前所述。本领域已知超荷蛋白质的产生。Lawrence等人(J.Am.Chem.Soc.(2007)vol.129p.10110-10112)中公开了在绿色荧光蛋白(GFP)情况下生产这种超荷蛋白的实例。这种所谓的“超荷”蛋白以前曾用于促进分子穿过磷脂双层细胞膜传递到细胞内部(Zang et al.(2017)PLoS One12(6):e0180138；WO2009/134808；WO2010/129023；WO2016/069910；Thompson et al.(2012)Methods Enzymol.vol.503p.293-319；McNaughton et al.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.vol.106p.6111-6116)。因此，完全令人惊讶的是，当上述方法用于产生电荷修饰的珠蛋白和包含如本文所述的聚合物表面活性剂包被的电荷修饰的珠蛋白时，可获得抗肿瘤的细胞、脂质体或微团，其包含至少一种与所述细胞、脂质体或微团的膜相关联的电荷修饰的珠蛋白。
所述电荷修饰的珠蛋白与细胞、脂质体或微团的膜关联。在一个实施方案中，电荷修饰珠的蛋白通过结合到膜而与膜关联。这种结合可以由一个或多个共价键和/或一个或多个分子间作用力(例如静电作用力、氢键和/或疏水相互作用)介导实现。所述电荷修饰的珠蛋白也可以，或者，通过被空间锁定在适当位置而与膜关联。与膜关联的一个优点是珠蛋白可以很容易地向靶肿瘤细胞和抗肿瘤的细胞、脂质体或微团输送氧气。另一个优点是，与膜关联的珠蛋白还可以作为次级抗肿瘤分子的锚定物。
所谓“膜”，我们指的是将细胞、脂质体或微团内部与外部环境分离的结构。在自然生物产生的细胞中，所述膜是磷脂双分子层，也称为细胞膜、质膜或细胞质膜。电荷修饰的珠蛋白可通过嵌入磷脂双分子层(即膜的疏水脂质区域)与膜关联，或可与磷脂双分子层暴露于溶剂的外表面关联。这种与磷脂双分子层暴露于溶剂的表面的关联可以通过直接与亲水性磷脂头结合和/或通过与细胞表面蛋白结合来介导。在脂质体中，所述膜是类似于细胞膜的结构。换句话说，所述膜是脂质体的外膜。脂质体膜可包含磷脂双分子层。然而，值得注意的是，如本领域所知，脂质体膜可包含由不同两亲性分子形成的双层。在微团中，所述膜是微团的外周，微团由两亲分子(如磷脂)的疏水头构成。
在优选实施方案中，所述电荷修饰的珠蛋白嵌入膜中或与膜的外表面(即，暴露于溶剂)结合(例如绑定)。
细胞膜优选包含磷脂双分子层。脂质体膜可包含磷脂双分子层。微团可以包含磷脂膜。在这些实施方案中，所述电荷修饰的珠蛋白通过结合到磷脂膜而与磷脂膜结合。所述膜可包含磷脂以外的脂质，例如胆固醇。所述膜还可包含其它组分，例如整合膜蛋白。这可能特别适用于所述膜为细胞膜的情况。
在一个实施方案中，所述电荷修饰的珠蛋白结合到磷脂膜暴露于溶剂的外表面。这种结合优选由静电力介导。通常，磷脂膜暴露于溶剂的外表面包含负电荷，特别是在细胞的情况下。然而，所述膜也可能包含含有正电荷的暴露于溶剂的表面。为了调控与此类膜的静电相互作用，电荷修饰的珠蛋白可包含增加的总表面正电荷(即阳离子化珠蛋白)或增加的总表面负电荷(即阴离子化珠蛋白)。
细胞、脂质体或微团可具有膜，所述膜进一步包含可作为电荷修饰的珠蛋白结合位点的分子。例如，细胞外表面展示各种蛋白、脂质和聚糖。脂质体和微团可以在其表面展示各种标签。在一个实施方案中，所述电荷修饰的珠蛋白与展示在细胞外表面上的分子、脂质体或微团相关联。
在一个实施方案中，所述电荷修饰的珠蛋白嵌入所述膜中。细胞膜、脂质体和脂质体通常包含至少一个脂质双层，其具有疏水性内部，在每个表面上由亲水性官能团限定。所述电荷修饰的珠蛋白可被疏水性涂层包覆，下文更详细讨论提供了可嵌入脂质双层内的疏水性电荷修饰的珠蛋白。术语“嵌入”表示所述疏水性电荷修饰的珠蛋白至少部分位于磷脂双层内或微团层内。即，所述疏水性电荷修饰的珠蛋白至少部分地与磷脂双分子层或磷脂层相交，而不仅仅与磷脂双层分子或磷脂层的表面相互作用。
在优选实施方案中，所述电荷修饰的珠蛋白不被内化。换句话说，电荷修饰的珠蛋白与所述膜保持接触，不会释放到细胞或脂质体内部。
在优选实施方案中，所述抗肿瘤的细胞、抗肿瘤的脂质体或抗肿瘤的微团为抗肿瘤的细胞。“抗肿瘤的细胞”可以指任何具有抗肿瘤特性的细胞。就其本身而言，所述细胞可以为自然细胞、人工细胞、修饰的细胞或细胞器。术语“修饰的细胞”包括已在体外修饰的细胞和已在体内(例如通过体内基因编辑)修饰的细胞。在本说明书中，术语“细胞”包括原生质体或原生质球，即通常包含细胞膜但至少有部分所述膜被移除或破坏(例如通过机械或酶处理)的细胞。这可包括，例如，包含细胞的试剂盒，其中至少部分所述膜已被移除或破坏以协助对细胞的进一步修饰，例如通过细胞转化。
通常，所述细胞为动物细胞，例如哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以为人、小鼠、狗、猫或马的细胞，或牛、猪或羊的细胞。在优选实施方案中，所述细胞为人细胞。或者，所述细胞可以来自人源化动物，例如人源化小鼠。人或人源化细胞是特别优选地方案，因其免疫原性应该更低所以更受青睐。
通常，所述细胞为一种免疫细胞，具有细胞毒性特性，可杀死肿瘤细胞。优选地，所述免疫细胞为肿瘤浸润细胞，例如淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞或巨噬细胞。更优选地，所述细胞为淋巴细胞，例如细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞或自然杀伤细胞。特别优选所述细胞为T细胞，例如CD3+T细胞。所述CD3+T细胞优选为CD4+或CD8+亚型，优选为CD8+亚型。在一个实施方案中，所述T细胞为嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞。
重要的是，已经证明某些蛋白(即电荷修饰的GFP)与T细胞膜的结合对T细胞有毒性作用(图2)。相反，与GFP相比，具有代表性的电荷修饰的珠蛋白(肌红蛋白)与小鼠T细胞膜关联，其毒性意外降低(图2b)，更令人惊讶的是，其对人Jurkat T细胞没有明显毒性(图2a)。
此外，T细胞的活性取决于暴露于溶剂的T细胞膜外表面的结构和组成，其中需要一组蛋白来识别介导免疫反应的配体。本发明所述的珠蛋白与所述T细胞膜关联，但该关联必须在不干扰T细胞功能。一个非常重要且令人惊讶的结果是，所述珠蛋白可以与人类Jurkat T细胞膜结合，而不会造成任何明显的T细胞活性损失(图3)。这表明所述珠蛋白对T细胞受体及其配体之间的相互作用不存在空间或其他干扰。
与作为实体瘤环境代表性模型的缺氧环境中的行为相比，在常氧环境中的T细胞行为可观察到更多令人惊讶的效果。检测小鼠T细胞的CD4+和CD8+亚型。当暴露于常氧环境中时，肌红蛋白与T细胞膜结合后，T细胞增殖减少，但在缺氧环境中增殖恢复(图4a和b)。对于CD4+亚型，活性也有类似的模式。在常氧环境中，T细胞/肌红蛋白复合物中T细胞的活性降低，但在缺氧环境中，T细胞/肌红蛋白复合物的活性恢复(图4c)。这一意外的结果推断这些T细胞/肌红蛋白复合物特别适合于缺氧的实体瘤环境。也就是说，在常氧条件下减少T细胞/肌红蛋白复合物的增殖有助于确保在每次T细胞增殖时不稀释珠蛋白(即，通过增殖期间在T细胞子代之间的稀释)，从而产生具有降低珠蛋白浓度的T细胞子代。同样，图4c中T细胞/肌红蛋白复合物的活性被抑制，直到细胞处于缺氧环境中，这使这些细胞特别适合于靶向和作用于缺氧实体瘤。观察到更令人惊讶的效果是CD8+细胞/肌红蛋白复合物的活性。在缺氧环境中，T细胞活性实际上显著增强，这使其成为抗肿瘤治疗中特别令人兴奋的复合物。
可通过使所述细胞与所述电荷修饰的珠蛋白接触而让所述电荷修饰的珠蛋白与细胞关联，该关联可在根据本发明的所述细胞形成后发生1-30天或1-15天或1-10天或1-5天。例如，所述电荷修饰的珠蛋白可关联约1、2、3、4、5、6、7、8、9或约10天。
在一个实施方案中，所述抗肿瘤的细胞、脂质体或微团为抗肿瘤的脂质体或微团。所述脂质体或微团通常为水溶性脂质体或微团。所述脂质体或微团将包含赋予脂质体或微团杀死瘤特性的组分。在优选实施方案中，所述抗肿瘤的细胞、脂质体或微团包含治疗剂，例如检查点抑制剂、免疫治疗剂或化疗剂。检查点抑制剂包括但不限于结合并阻断PD-1、PDL-1和/或CTLA-4的肽或蛋白，例如通过噬菌体展示技术生成的对PD-1、PDL-1和/或CTLA-4具有高亲和力和抑制性的肽，或募集或设计的对PD-1、PDL-1和/或CTLA-4具有高亲和力和抑制性的抗体或抗体片段。许多检查点抑制剂属于本领域已知的。
所述脂质体或微团还可包含靶向组分，例如抗体或其他靶向蛋白，其使所述脂质体或微团特异性靶向肿瘤细胞。
所述珠蛋白可以为血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白或细胞珠蛋白。在优选实施方案中，所述珠蛋白为肌红蛋白。所述珠蛋白可逆地结合和运输氧气。因此，珠蛋白结合氧气并携带氧气，直到需氧时释放氧气。尤其是肌红蛋白，也被认为是一种弱过氧化物酶和自由基清除剂。
所述珠蛋白可以连接到次级抗癌分子上。或者，所述珠蛋白可以连接到用于连接至次级抗肿瘤分子的反应性官能团。例如，所述反应性官能团可以为生物结合系统的一半，生物结合系统例如SpyCatcher/SpyTag系统(Reddington&Howarth(2015)Curr.Op.Chem.Biol.vol.29p94-99；WO2014/176311)或链霉亲和素/生物素。
因此，珠蛋白作为一种“锚蛋白”，将次级抗肿瘤分子锚定到细胞、脂质体或微团上。这意味着与细胞、脂质体或微团的膜相结合的电荷修饰的珠蛋白提供了至少两个重要的优点。第一个优点是能够容易地向肿瘤细胞和抗肿瘤的细胞、脂质体或微团输送氧气。第二个优点是能够将次级抗肿瘤分子锚定到膜上。由于电荷修饰的珠蛋白与膜结合，次级分子有利地呈现在抗肿瘤的细胞、脂质体或微团的外表面上。
次级分子可以为非阳离子化蛋白或非阴离子化蛋白的蛋白。如PCT/GB2018/052534所述，在电荷修饰的珠蛋白嵌入膜中的情况下，次级抗肿瘤分子可在被定位的同时不嵌入膜中。
所述次级抗肿瘤分子可从本领域已知的任何抗肿瘤分子中选择。例如，所述次级抗肿瘤分子可以为抗体、凝集素、整合素或粘附分子中的任意一种。具体而言，抗肿瘤分子可以为以下任一种：
(1)肿瘤细胞结合分子。所述肿瘤细胞结合分子有助于对肿瘤细胞的靶向和持续结合。持续结合有助于确保抗肿瘤的细胞、脂质体或微团在肿瘤细胞区域保留一段时间，从而使细胞、脂质体或微团和珠蛋白对肿瘤细胞有更强的效应。
(2)检查点抑制剂。检查点抑制剂有助于降低肿瘤逃避免疫系统的能力，补充珠蛋白降低肿瘤缺氧的作用，这也降低了肿瘤逃避抗肿瘤治疗(如抗肿瘤的细胞、脂质体和微团)的能力。
(3)重组肿瘤细胞外基质的酶，以增强免疫细胞对肿瘤块的渗透。
(4)一种代谢肿瘤相关化合物的酶。例如，肿瘤的三磷酸腺苷代谢率增加，导致肿瘤微环境中的腺苷过量。这刺激了导致免疫抑制作用的腺苷能受体。在免疫细胞表面呈现一种酶，如腺苷脱氨酶，将减少这种免疫抑制信号。
在一个实施方案中，所述珠蛋白和所述次级抗癌分子包含在融合蛋白内。
所述珠蛋白为一种电荷修饰的珠蛋白。所述珠蛋白可以是阳离子化珠蛋白或阴离子化珠蛋白。
阳离子化珠蛋白可通过将阳离子或多阳离子连接物与母体珠蛋白上的酸性氨基酸侧链共价键合来获得。例如，在诸如N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)或二环己基碳二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide,DCC)等碳二亚胺的存在下，这可通过将蛋白与N,N'-二甲基-1,3-丙二胺(N,N’-dimethyl-1,3-propanediamine,DMPA)或其类似物混合来实现。反应如下所示，这展示了通过添加零长度交联剂EDC(2)以形成激活的o-酰基脲基(3)，酸性残基(1)被激活以进行亲核攻击。亲核DMPA(4)然后攻击活性羰基并消除异脲以形成阳离子化残基(5)。因此，阳离子化珠蛋白可包含连接剂-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+。在与EDC混合之前，可将DMPA或其类似物添加到蛋白中，以确保存在过量的DMPA或其类似物，从而避免蛋白相互交联。
Figure GDA0003396928260000091
阳离子连接物与蛋白上酸性氨基酸侧链的共价键合步骤可在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其水溶性类似物磺基NHS存在下进行，以提高静电偶联的稳定性。
在本发明中，可允许蛋白与DMPA或其类似物在碳化二亚胺存在下的混合持续有限的时间，以避免蛋白变性和/或聚合。这种有限的时间可以是，例如，最多或大约2小时，或者最多或大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或大约90分钟。或者或另外，在碳二亚胺存在下与DMPA混合的产物随后可进行尺寸排除色谱，色谱产物用作阳离子化蛋白。本领域技术人员能够确定所需电荷修饰的珠蛋白的理论尺寸，以便例如通过使用校准色谱柱来确定用于收集的合适色谱洗脱液。
DMPA的类似物可以为N,N'-二甲基己烷-1,6-二胺(N,N′-dimethylhexane-1,6-diamine，DMHA)、N,N'-二甲基乙二胺(N,N′dimethylethylenediamine,DMEA)、3-二甲氨基丙胺(3-dimethylamino propylamine,DMAPA)、乙二胺(ethylenediamine,EN)、1,3-二氨基丙烷(1,3-diaminopropane,DAP)、1,4-二氨基丁烷(1,4-diaminobutane,DAB)、1,5-二氨基丙烷(1,5diaminopropane,DAP)、1,6-二氨基己烷(1,6-diaminohexane,DAH)、六亚甲基二胺(hexamethylenediamine,HMA)、1,7-二氨基庚烷(1,7diaminheptane,DAH)、1,8-二氨基辛胺(1,8-diaminooctane,DAO)和2-(2-氨乙基)胍(2-(2-aminoethyl)guanidine,AEG)。本领域技术人员可考虑其他合适的亲核试剂，例如，带电亲核试剂。例如，所述亲核试剂还可以包括其他伯胺、仲胺和叔胺，以及如果相对末端包含伯胺、仲胺或叔胺，则以季胺封端的烷基二胺。聚烷基胺亦是可预期的，例如作为线性链或分支结构的聚乙烯亚胺。
或者，可通过蛋白的阴离子化获得静电修饰的蛋白。这可通过例如将二羧酸(HOOC-R-COOH)亲核加成到天然蛋白的赖氨酸侧链来实现。
在另一替代方案中，可通过重组表达相对于天然珠蛋白具有改变电荷的序列来获得所述电荷修饰的珠蛋白，尤其是相对于天然珠蛋白具有更正或更负的总电荷的序列。所述重组修饰可包括重组表达电荷修饰的珠蛋白，其为一种变体，与非变体珠蛋白的序列相比，在其整个氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸替换。相对于天然珠蛋白，所述氨基酸替换通过向位于或每个取代位置的天然氨基酸提供不同的氨基酸电荷，将不同的表面电荷分布引入电荷修饰的珠蛋白。
例如，在蛋白的三级结构和/或生物活性没有显著改变的前提下，具有不带电荷的侧基的氨基酸可以被具有带正电或带负电侧链基团的氨基酸替换(以分别给出+1或-1的总电荷变化)，或者具有带负电侧链基团的氨基酸可以被具有带正电侧链基团的氨基酸替换(使总电荷变化为+2)，或具有带正电侧链基团的氨基酸可被具有带负电侧链基团的氨基酸取代(使总电荷变化为-2)。如果蛋白的功能/活性取决于特定氨基酸的参与，例如具有带电侧链基团的氨基酸，既然使用者可以对非关键氨基酸的位置进行珠蛋白表面电荷的改变，这种合理的设计方法可能更为优越；这在本文其他地方描述的化学修饰方法中并不总是可行的。
通常，在天然珠蛋白和重组修饰的电荷修饰的珠蛋白之间，总体水平上确定的氨基酸序列同一性(也称为“总体序列同一性”)为至少约60％，例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％。可使用例如Needleman-Wunsch总体序列比对工具在总体水平上确定序列同一性，该工具可通过NCBI
Figure GDA0003396928260000101
网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在互联网上获得。该工具允许用户在全长范围内比较两个序列。如果珠蛋白是融合蛋白的一部分，则该比较是在融合蛋白的珠蛋白部分进行。
通常，天然珠蛋白由天然存在的氨基酸组成，例如从蛋白原性氨基酸(包括标准氨基酸)中选择的氨基酸。蛋白源性氨基酸是通过自然翻译过程并入蛋白质的氨基酸。以下表1和表2中提供了可包含在电荷修饰的珠蛋白中的氨基酸的非限制性示例：
丙氨酸 苯基丙氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 硒代半胱氨酸
异亮氨酸 色氨酸 丝氨酸 组氨酸 吡咯赖氨酸
亮氨酸 酪氨酸 苏氨酸 赖氨酸
甲硫氨酸 天冬酰胺 天门冬氨酸 甘氨酸
缬氨酸 半胱氨酸 谷氨基酸 脯氨酸
表1：蛋白源性氨基酸示例；粗体表示带正电荷的氨基酸，斜体表示带负电荷的氨基酸。
还考虑涉及非蛋白源性氨基酸的修饰。本发明也可包括非天然存在的氨基酸(例如可通过使用唯一密码子和相应的氨基酰-tRNA系统引入蛋白的氨基酸)。
Figure GDA0003396928260000102
Figure GDA0003396928260000111
表2：非蛋白源性氨基酸示例
在一个实施方案中，可对重组表达的电荷修饰的珠蛋白进行化学阳离子化或阴离子化，以进一步修饰电荷。
当使用重组技术时，如上文所述，重组DNA序列可编码包含电荷修饰的珠蛋白和蛋白原性次级抗肿瘤分子的融合蛋白。
电荷修饰的珠蛋白可包含聚合物表面活性剂包被，以提供聚合物包覆的电荷修饰的珠蛋白。该构建体可包含电荷修饰的珠蛋白，所述珠蛋白具有一个或多个表面活性剂分子，所述表面活性剂分子与蛋白表面的带电氨基酸残基静电络合。例如，Perriman等人(2010年；Nature Chem.vol.2622-626)、Brogan等人(2013年；J.Phys.Chem.Bvol.1178400-8407)和Sharma等人(2013年；Adv.Mate.vol.252005-2010)描述了类似构建体的制备。偶联物如本文所述，在整个结构的至少一部分周围具有两亲性表面活性剂冠状物的蛋白。可通过将偶联物与相应的天然珠蛋白进行比较来确认这种冠状物的存在，以检测电荷和/或大小的变化。诸如质谱、zeta电位测定法、小角度X射线散射和/或动态光散射等技术，尤其是其中两种或两种以上的组合可用于检测此类变化。
聚合物包覆的电荷修饰的珠蛋白可包含含聚乙二醇(PEG)的表面活性剂。例如，表面活性剂可具有以下式I的一般结构：
Figure GDA0003396928260000121
在式I中，n可以为包括或介于5和150之间的任何整数，例如，包括或介于8和110之间的任何整数。例如，n可以为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或110。
R1可以为：
Figure GDA0003396928260000122
R2可以为CxH(2x+1)，其中x为包括或介于8-18之间的任何整数；例如，x＝可以为11、12或13。R2也可以为具有8-18个碳原子的不饱和烃，例如11、12或13个碳原子。在另一备选方案中，R2可以为：
Figure GDA0003396928260000123
所述表面活性剂可以为本文所述的其中一种，例如S621(Sigma-Aldrich目录号463221)、S907(Sigma-Aldrich目录号463256)、S1198(Sigma-Aldrich目录号473197)或S1783(乙醇酸乙氧基4-壬基苯醚(glycolic acid ethoxylate 4-nonylphenyl ether)的氧化形式，Sigma-Aldrich目录号238678)。
这些阴离子表面活性剂具有以下结构：
Figure GDA0003396928260000124
对于S621和S907，x＝11-13
对于S621，y＝7-9
对于S907，y＝14-15
通过质谱法测量分子量和多分散性，结果如下所示：
表3-表面活性剂的分子量和多分散性
Figure GDA0003396928260000131
“多分散性”反映了这样一个事实，即由化学反应生成的合成聚合物具有的分子质量分布，该分子质量分布源于由聚合的内在熵过程。变化程度取决于反应机理和反应条件。这种变化程度由分散度
Figure GDA0003396928260000132
来定义，其直到最近才被称为“多分散性”。它由以下等式定义：
Figure GDA0003396928260000133
式中，Mw为重量平均摩尔质量，Mn为数量平均摩尔质量。
聚合物的分散性可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)进行估算。
蛋白聚合物表面活性剂偶联物可包含分子量至少约为500Da的表面活性剂，例如，至少约为1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或至少约为4000Da的表面活性剂。
蛋白-聚合物表面活性剂偶联物可包含S1783(即，氧化乙醇酸乙氧基4-壬基苯醚)这一表面活性剂。或者或另外，蛋白-聚合物表面活性剂偶联物可包含阳离子表面活性剂，例如PEG-15氢化牛脂基甲基氯化铵(由
Figure GDA0003396928260000134
HT25出售)。
如本发明所述的细胞、脂质体或微团可存在于复合组合物内，所述复合组合物进一步包含至少一种附加组分，例如水、缓冲溶液、形成下述药物组合物所需的一种或多种组分。
根据第二方面，本发明提供包含如第一方面所述的抗肿瘤的细胞、脂质体或微团的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或载体。
根据第三方面，本发明提供如第一方面所述的细胞、脂质体或微团，或如第二方面所述的药物组合物在治疗癌症中的应用。
本说明书通篇提及的术语“药物组合物”可以为包含药上学可接受的载体、稀释剂或载体的组合物。例如，本文所述的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，其可以是水性或油质悬浊液，或者是无毒的肠道外可接受稀释剂或溶剂中的悬浮液。水性悬浊液可在例如甘露醇、水、林格溶液或等渗氯化钠溶液中制备。或者，可在磷酸盐缓冲盐溶液中制备。所述含油悬浊液可在人造单甘酯、人造二甘酯、脂肪酸或药学上可接受的天然油中制备。所述脂肪酸可以是油酸或油酸甘油酯衍生物。药学上可接受的天然油可以是橄榄油、蓖麻油或聚氧乙烯化橄榄油或蓖麻油。所述油质悬浊液可包含长链乙醇稀释剂或分散剂，例如，符合欧洲药典和/或Helv药典。除了本发明的磷脂组合物外，所述药物组合物还可包含一种或多种药学活性剂或其他生物活性剂。例如，所述组合物可包括治疗剂，如常规药物、抗体或其他蛋白成分
根据第四方面，本发明提供了制备如第一方面所述的抗肿瘤的细胞、脂质体或微团的方法，包括a)提供电荷修饰的珠蛋白；和b)将抗肿瘤的细胞、脂质体或微团与所述珠蛋白接触。
在如本发明第四方面所述的方法中，当使用细胞时，步骤(b)可包括在最低约1℃的温度下培养至少约2分钟，例如在最低约10℃的温度下培养至少约2分钟。温度通常可为约30-40℃，例如约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或约40℃，例如约37℃±约1℃。或者，某些细胞、脂质体或微团受益于在较低温度下处理，例如1-8℃、2-7℃或3-6℃，例如约1、2、3、4、5、6，7或约8℃。时间段通常为2-60分钟，例如约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或约60分钟，例如约15、约20或约30分钟。该步骤可在约0-10％CO2(例如约5％CO2)的气氛中进行。当使用脂质体或微团时，步骤(b)可在CO2含量小于1％的室温下进行(例如，在约15℃至约25℃之间)，例如在空气中进行。
如本发明第四方面所述的方法的步骤(b)可任选地接着步骤(c)洗涤所述细胞、脂质体或微团，例如使用诸如磷酸盐缓冲盐(PBS)的缓冲液，例如使用两个或多个洗涤步骤。本领域技术人员能够容易根据需要调整这些步骤，并确定何时需要洗涤步骤。
步骤(a)可包括在能够使聚合物表面活性剂和珠蛋白静电偶联的条件下提供电荷修饰的珠蛋白和聚合物表面活性剂。所述表面活性剂可以固体或液体形式添加到珠蛋白溶液中。所述表面活性剂可以相当于蛋白上每个阳离子位点0.5-5摩尔表面活性剂的量添加，例如相当于蛋白上每个阳离子表面活性剂位点约0.5、0.6、0.7、0.8、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.1、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或约3摩尔的量。所述蛋白可存在于具有适当缓冲液的溶液中，例如HEPES缓冲液、含或不含CoCl2，或存在于Tris-HCl缓冲液中。适当缓冲液的选择在本领域技术人员的常规能力范围内。所述条件可包括介于5和8之间的pH值，例如约5、6、7或约8(包括介于5.1和5.9之间、介于6.1和6.9之间以及介于7.1和7.9之间的任何中间pH值)，并可包括将混合物搅拌0-30小时，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或约12小时，也可包括在0-25℃的温度下，例如在约4℃或在约室温下。例如，Armstrong等人(Nat.Commun.(2015)Jun 17；6:7405)描述的偶联条件可能是合适的。
“阳离子位点”是蛋白氨基酸序列中的一个位点，其具有带有带正电侧链的氨基酸或包含阳离子(即带正电)的连接子。本领域技术人员可在不使用本发明技术的情况下确定珠蛋白内阳离子位点的数量。
所述表面活性剂可包含聚乙二醇，其可例如具有至少约500Da的分子量，例如至少约1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800或至少约4000Da。所述表面活性剂可在浓度为5-50mg/mL的缓冲溶液中，例如，约10、15、20、25或约30mg/mL。
所述表面活性剂可以为S1783(即，氧化乙醇酸乙氧基4-壬基苯醚)。或者，表面活性剂偶联物可包含阳离子表面活性剂，例如PEG-15氢化牛脂基氯化铵(由
Figure GDA0003396928260000151
HT25出售)。
如上所述，在与所述表面活性剂接触之前，所述电荷修饰的珠蛋白可连接到次级抗肿瘤分子。
步骤(a)还可包括在将所述细胞、脂质体或微团与所述珠蛋白接触之前的缓冲液交换步骤。所述缓冲液交换步骤可包括阳离子化或阴离子化蛋白与表面活性剂接触步骤产物的旋转浓缩。或者，所述缓冲液交换步骤可包括透析步骤。此类方法在本领域技术人员的常规能力范围内。
所述电荷修饰的珠蛋白可以通过化学修饰天然珠蛋白上的电荷来生成。例如，至少一个酸性氨基酸侧链可包含-CH2C(O)NCH3(CH2)3N(CH3)2H+连接子。这可通过以下方法实现：在N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)存在下，将N,N'-二甲基-1,3-丙二胺(DMPA)或其类似物的溶液与天然珠蛋白(如上所述)混合。DMPA的类似物可以是N,N'-二甲基己烷-1,6-二胺(DMHA)、N,N'-二甲基乙二胺(DMEA)、3-二甲氨基丙胺(DMAPA)、乙二胺(EN)、1,3-二氨基丙烷(DAP)、1,4-二氨基丁烷(DAB)、1,5-二氨基丙烷(DAP)、1,6-二氨基己烷(DAH)、六亚甲基二胺(HMA)、1,7-二氨基庚烷(DAH)1,8-二氨基辛胺(DAO)和2-(2-氨乙基)胍(AEG)。本领域技术人员可考虑其它合适的亲核试剂，例如带电亲核试剂。例如，所述亲核试剂还可以包括其他伯胺、仲胺和叔胺，以及如果相对末端包含伯胺、仲胺或叔胺，则以季胺封端的烷基二胺。聚烷基胺亦是可预期的，例如作为线性链或分支结构的聚乙烯亚胺。
因此，珠蛋白(即电荷修饰的珠蛋白前体)可通过包括以下内容的方法转化为电荷修饰的珠蛋白：
i)将珠蛋白溶液与N,N'-二甲基-1,3-丙二胺(DMPA)或其类似物的pH中和溶液混合，并任选地将混合物的pH调节至5-7；
ii)随后或同时添加碳化二亚胺，例如N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)，并将所述混合物的pH调节pH至4-7；
iii)在0-25℃的温度和pH 4-7下搅拌(ii)中所述的混合物1-30小时；
iv)在pH 6.5-8.5的条件下，将(iii)中所述混合物中的蛋白与水或缓冲液分离至少4小时；
v)如有必要，将(iv)中所述混合物的pH调节至6.5-8.5。
在该方法中，任一步骤(iii)持续不超过约120分钟，例如，不超过约90分钟；和/或所述方法进一步包括步骤(vi)，对步骤(iv)或步骤(v)所述的混合物(如存在)进行尺寸排阻色谱，并获得包含所需分子量的电荷修饰的珠蛋白的洗脱液。这两个限制条件中的一个或两个可确保控制上述过程以减少或防止蛋白变性和/或聚合。
步骤(i)中使用的天然珠蛋白溶液可用任何常规缓冲液中制备，例如HEPES。天然珠蛋白，以DMPA摩尔数:蛋白上的阴离子位点数的为100:1-400:1与DMPA的混合，例如，约100:1、150:1、200:1、250:1或约300:1。EDC以EDC摩尔数:蛋白上的阴离子位点数为30:1-60:1的比例添加到蛋白上，例如，约30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、40:1、45:1或约50:1。
“阴离子位点”是珠蛋白氨基酸序列中的一个位点，其具有带有带负电侧链的氨基酸。所述珠蛋白内阴离子位点的数量可使用本领域技术人员的常规能力来确定。
步骤(ii)可与步骤(i)同时完成，即蛋白质溶液、DMPA和EDC可同时混合。如果步骤(ii)在步骤(i)之后完成，则步骤(ii)可以为上文定义的单个步骤，其后紧接着步骤(iii)；或者可以细分为两个步骤：(iia)其中将一部分EDC添加到步骤(i)中的混合物中，并将所得混合物在0-25℃的温度下搅拌约2、3、4、5、6、7或约8小时，接着是(iib)其中进一步将EDC添加到(iia)中所述的混合物中，并继续搅拌；步骤(iib)之后是步骤(iii)。
步骤(iii)中所需的搅拌可通过任何常规方式实现，例如搅动，并且pH可为约4、约5、约6或约7(包括4.1和4.9之间、5.1和5.9之间以及6.1和6.9之间的任何中间pH值)。当步骤(iii)中的时间超过120分钟时，其可持续约20-30小时，例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或约30小时，例如约24小时。例如，所有步骤可在约室温(例如18-23℃)下进行，或可在约4℃下进行。
无论是否存在后续的尺寸排除色谱步骤，本领域技术人员可通过在步骤(iii)进行一段范围时间时测试珠蛋白活性的保留，来确定步骤(iii)的最佳时长，从而确定步骤(iii)的适当时长。。
在可选的一般方法中，所述聚合物表面活性剂包覆的电荷修饰的珠蛋白可通过将电荷修饰的珠蛋白(如所述阴离子珠蛋白)与表面活性剂(如阳离子表面活性剂)接触来制备。例如，可通过将二羧酸(HOOC-R-COOH)亲核加成到天然蛋白的赖氨酸侧链使珠蛋白阴离子化。
作为上述修饰的替代或补充，可通过包含表达编码电荷修饰的珠蛋白的重组DNA序列的方法获得所述电荷修饰的珠蛋白。例如，所述电荷修饰珠的蛋白可通过包含表达编码电荷修饰蛋白的重组DNA序列的方法获得。随后可分离得到的蛋白，即电荷修饰的珠蛋白。
例如，在蛋白的三级结构和/或生物活性没有显著改变的前提下，电荷修饰的珠蛋白的制备可涉及将具有不带电荷侧链基团的氨基酸替换为具有带电荷侧链基团的氨基酸，或将具有带电荷侧链基团的氨基酸替换为具有相反电荷的侧链基团。如果蛋白的功能/活性取决于带电荷侧链基团的氨基酸的参与，既然使用者可以将蛋白表面电荷改变引导到非关键氨基酸位置，则这可能是特别优越的方案。
通常，在重组修饰的电荷修饰的珠蛋白(即电荷修饰的珠蛋白)和天然珠蛋白之间，总体水平上确定的氨基酸序列同一性(也称为“总体序列同一性”)为至少约60％，例如至少约为65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，98％或至少约99％。可使用例如Needleman-Wunsch总体序列比对工具在总体水平上确定序列同一性，该工具可通过NCBI
Figure GDA0003396928260000171
网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在互联网上获得。如上所述，在电荷修饰的珠蛋白和天然珠蛋白之间，功能上重要的结构域的序列同一性可至少约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约为99％。
重组DNA序列可根据本领域技术人员的常规能力，按任何常规方法表达，例如使用任何表达系统，例如在大肠杆菌中表达。从表达系统中分离所表达的锚蛋白也属于本领域技术人员的常规能力范围。
根据第五方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括将如第一方面上述的细胞、脂质体或微团或如第二方面所述的药物组合物施用于有需要的患者。
在优选实施方案中，本发明第三或第五方面所述的癌症为实体瘤癌症。具体而言，所述癌症可从以下癌症中选择：乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、宫颈癌或胰腺癌。这些是最常见的实体瘤癌症。更具体地说，所述癌症可从ICD-10版本：2016(国际疾病分类，第10版，由世界卫生组织出版，ICD.who.int/browse10/2016/en)代码C00-C75.9中选择。
根据第六方面，本发明提供了一种电荷修饰的珠蛋白，其包含任意一条如SEQ IDNO:1-12所示的序列或任意一种与SEQ ID NO:1-12任一具有至少约60％的序列同一性的功能性变体。例如，所述电荷修饰的珠蛋白可具有与SEQ ID NO:1-12任意一条至少约65％的序列同一性，例如至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的序列同一性。所述电荷修饰的珠蛋白可任选地构成更大构建体的一部分，例如融合蛋白。
在本说明书的通篇描述和权利要求中，词语“包括”和“包含”以及这两个词语的变体，例如“包括”(名词)和“包括”(单数)，表示“包括但不限于”，并且不排除其他组件、整数或步骤。此外，除非上下文另有要求，否则单数包含复数；特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应理解为涵盖了复数以及单数。
本发明的每个方面的优选特征可以如上所述地结合任何其他方面。在本申请的范围内，本发明的明确意图是可以独立地或以任何组合的方式考量在前述段落、权利要求和/或在以下描述和附图中列出的各个方面、实施方案、实施例和备选方案，尤其是其中的各个特征。也就是说，任何实施方案的所有方案和/或特征可以以任何方式和/或组合进行结合，除非这些特征不兼容。
附图简介
现在将结合附图仅以示例的方式描述本发明的一个或多个实施方案，其中：
图1显示了应用于人Jurkat T细胞(a和c)或小鼠T细胞(b和d)的流式细胞荧光分选技术(FACS)分析的结果，这些细胞已进行了无蛋白标记，或天然肌红蛋白(nMyo)、阳离子化肌红蛋白(Cat Myo)、偶联阳离子化肌红蛋白(Con Myo)、超荷GFP(scGFP)或偶联超荷GFP(Con scGFP)的标记程序。对Jurkat T细胞的CD3表达进行门控，然后对肌红蛋白和GFP(a)或GFP荧光(c)上存在表面呈现His-Tag的细胞染色百分比进行门控。对小鼠T细胞的CD8表达进行门控，并对肌红蛋白和GFP(b)或GFP荧光(d)上存在表面呈现His-Tag的细胞染色百分比进行门控。所有数据均以代表性数据散点图(插图)和表(显示平均值％+/-SD，n＝4)表示。
图2显示了应用于人Jurkat T细胞(a)和小鼠T细胞(b)(已进行如图1所述的标记程序)的FACS分析的结果，这些细胞用Aqua细胞活性染料染色，根据其CD3(a)或CD8(b)的表达进行门控，Aqua阴性活细胞百分比计算为平均％+/-SD，n＝4；插图为代表性数据散点图，处理后的数据由表显示。
图3显示了应用于T细胞受体转基因人Jurkat T细胞(a和b)的FACS分析结果，该T细胞已进行了(a)无蛋白标记，及天然肌红蛋白、阳离子化肌红蛋白和偶联阳离子化肌红蛋白的标记程序，或(b)无蛋白标记，及scGFP和偶联scGFP的标记程序，分析CD69在响应用0μM、1μM或10μM同源肽脉冲的C1R抗原呈递细胞时的上调。
图4显示了在常氧(方形)或缺氧(圆形)条件下(a和b)，用细胞微量紫(CTV)染色，然后在抗CD3、抗CD28和IL-2存在下激活4天的小鼠T细胞(已经历如图1所述的标记程序)的结果，在常氧(方形)或缺氧(圆形)条件下激活的小鼠T细胞的结果检测高水平的CD44(c和d)表达，按CD4表达亚型(a和c)和CD8表达亚型(b和d)进行的T细胞分离，以代表性散点图(插图)和表(显示平均值％+/-SD，n＝4)表示。
图5显示了(a)表面活性剂偶联超荷肌红蛋白(Myo14[S])对Jurkat T细胞的标记效率、Myo14[S]包被的(b)Jurkat T细胞和(c)激活的CD8+小鼠T细胞的存活率，(d)包被后3天和5天与未包被对照组(U/T)的小鼠T细胞计数，(e)包被后3天和5天分裂的CD8+小鼠T细胞的百分比，以及(f)包被的Jurkat T细胞与未包被的对照组(未处理)相比的CD69激活水平。
图6显示了(a)表面活性剂偶联超荷肌红蛋白(Myo14[S])包被的CD8+小鼠T细胞与未包被的对照组(U/T)上的耗竭标记物的水平，(b)在0.5％O2下，Myo14[S]包被和未包被的Jurkat T细胞(未处理)的缺氧敏感染料的荧光随时间的变化，以及(c)含或不含Myo14[S]和干扰素γ的人类间充质干细胞的存活率和炎症标记物水平。
实施例-材料和方法
Myo14表达
通过电穿孔的常规方法将含有适当的Myo14基因的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌细胞中表达Myo14。简单地说，选取一个菌落并将其置于10mL LB培养基中作为种子培养液，并在37℃下、以180RPM摇瓶过夜培养。然后将种子培养液接种至2.5L培养瓶中，其中含有补充了0.02％葡萄糖和50mg L-1羧苄青霉素的1L TB培养基。然后将培养瓶置于37℃、200RPM下培养。一旦TB培养液在600nm处达到0.7-1.0的光密度，则使用1mM IPTG诱导蛋白质表达。4小时后，表达培养物在4℃下以4500×g离心20分钟以使细胞成团。丢弃上清液，细胞团可冷冻储存或立即使用。
Myo14纯化
将含有20mM HEPES和1mNaCl的裂解缓冲液(pH 7.0)添加到Myo14细胞团中，使用脉冲超声裂解，并使用常规方法在离心机中匀浆。然后使用麦芽糖结合蛋白亲和层析纯化Myo14，之后在室温下完全缺氧的环境中用TEV蛋白酶过夜裂解麦芽糖结合蛋白。最后，使用尺寸排除色谱的常规方法对所得裂解产物进行优化。
构建体的制备
通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)介导的反应，用N,N-二甲基-1,3-丙二胺(DMPA)对酸性残基进行共价修饰，制备化学电荷修饰的肌红蛋白，称为阳离子化肌红蛋白。将2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液中的肌红蛋白溶液以肌红蛋白上每摩尔酸性残基300摩尔DMPA的比率添加到pH中和的DMPA溶液中。将溶液pH调节至5.5-6.0。然后以肌红蛋白上每摩尔酸性残基50摩尔EDC的比例添加EDC，并在4℃下搅拌过夜。然后对所得溶液进行脱盐，通过脱盐柱去除副产物，旋转浓缩并稀释到新鲜缓冲液中，以达到至少100万倍的稀释，或对新鲜缓冲液进行透析。
将阴离子表面活性剂加入到阳离子化肌红蛋白溶液中，以制备表面活性剂偶联的阳离子化肌红蛋白，称为偶联肌红蛋白。表面活性剂是乙醇酸乙氧基4-壬基苯醚(S1783，如上所述)的氧化形式，并以每摩尔肌红蛋白上带正电残基1摩尔表面活性剂的比率添加。表面活性剂可以固体形式添加，或在适当的缓冲液中预溶解。
在从商业来源订购相应的DNA之前，通过改变肌红蛋白的氨基酸序列来制备重组电荷修饰(“超荷”)的肌红蛋白。对第一变体(SEQ ID NO:1)进行修饰以在蛋白组分析发现的位置上加入赖氨酸残基，这些位置通过在阳离子化肌红蛋白中添加DMPA进行修饰。对Max变体(SEQ ID NO:2)进行修饰，以将所有酸残基替换为赖氨酸残基。对Polarised变体(SEQID NO:3)进行修饰，使其在肌红蛋白表面加入赖氨酸残基，除了在C端
Figure GDA0003396928260000201
半径范围内，其中正电荷残基修饰为谷氨酸。对ROSETTA变体(SEQ ID NO:4)进行了修饰，以纳入ROSIE网络服务(ROSIE.graylab.jhu.edu)上ROSETTA算法建议的突变。对AVNAPSA变体(SEQ ID NO:5)进行了修饰，以纳入ROSIE网络服务上AVNAPSA算法建议的突变。对TaB变体(SEQ ID NO:6)进行修饰，使其在表面可接近位置(无氢键或静电相互作用)加入赖氨酸或精氨酸残基，且B因子高于平均B因子加上PDBID 3RGK晶体结构的一个标准差。Consensus B模型(SEQ IDNO:7)在TaB变体上设计，但排除了在任何同源物中未发现突变的残基突变。Myo7(SEQ IDNO:8)修饰为含有来自近亲源物种的几个同源物中发现的带正电荷的残基，并用作其余序列的基础。对Myo14(SEQ ID NO:9)进行修饰，以包括通过结构检查确定的表面可接近的残基。对cMyo9(SEQ ID NO:10)、cMyo14(SEQ ID NO:11)和cMyo15(SEQ ID NO:12)进行修饰，以包括比Myo7(SEQ ID NO:8)更多的突变，这些突变的频率更低和/或来自更远亲源的物种。
将从小鼠的脾脏和淋巴结(mTc)纯化得到的TCR转基因Jurkat T细胞(jTc)或CD3+T细胞与阳离子化、偶联或天然肌红蛋白或GFP或偶联超荷GFP培养20分钟。随后洗涤细胞三次，并在三个不同的实验中分析其存活率、活化程度和增殖能力。
用从小鼠的脾脏和淋巴结(mTc)纯化得到的Myo14[S]TCR转基因Jurkat T细胞(jTc)或CD3+T细胞检测T细胞。T细胞在37℃下与Myo14[S]一起或未处理(U/T)地培养30分钟。随后洗涤细胞两次，并分析Myo14[S]包被、细胞存活率、细胞表型、细胞活化程度、细胞耐缺氧和细胞增殖能力。
偶联包被与存活率测定
从培养物中获取jTc，用PBS洗涤一次，然后在不含蛋白的PBS中，或含3μM偶联超荷GFP(con-scGFP)、3μM超荷GFP(scGFP)、10μM天然肌红蛋白(nMyo)、10μM阳离子化肌红蛋白(Cat-Myo)或10μM偶联肌红蛋白(con-Myo)的PBS中在37℃培养20分钟。在PBS中洗涤被包被的jTc三次，并在PBS中以100μl/孔、1×106jTc的密度再悬浮jTc，并用αCD3-AF594(Biolegend，货号300446)、αHIS-TAG-APC(Biolegend，货号362605)和Aqua(Invitrogen，货号L34957)在4℃下培养30分钟以进行染色。用PBS洗涤被染色的细胞两次，并使用FortessaX20细胞仪进行分析。
按照厂商的说明，使用Dyna-bead阴性选择试剂盒(ThermoFisher，货号11413D)从一只Balb-c雌性小鼠的脾脏和淋巴结中纯化全部T细胞(mTc)。mTc用PBS洗涤一次，然后在不含蛋白的PBS中，或含3μM偶联超荷GFP(Con-scGFP)、3μM超荷GFP(scGFP)、10μM天然肌红蛋白(nMyo)、10μM阳离子化肌红蛋白(Cat-Myo)或10μM偶联肌红蛋白(Con-Myo)的PBS中于37℃培养20分钟。将包被的mTc在PBS中洗涤三次，并以每孔100μl的1×106mTc在PBS中再悬浮，并用αCD3-AF700(Biolegend，货号152316)、αCD4-BV785(Biolegend，货号100552)、αCD8-APCef780(Invitrogen，货号47008182)、αHIS-TAG-APC(Biolegend，货号362605)和Aqua(Invitrogen，货号L34957)在4℃下培养30分钟进行染色。用PBS洗涤被染色的细胞两次，并使用Fortessa X20细胞仪进行分析。
Jurkat T细胞活化试验
TCR转基因Jurkat T细胞(jTc)是T细胞受体(TCR)转导后的Jurkat T细胞，当呈现MHC I类HLA-A2时，TCR识别同源肽。当受同源肽刺激时，CD69的表达增加，这经FACS检测可作为T细胞激活的替代标记。
jTc和C1R于37℃保存在RPMI 1640中，其中含10％v/v FCS、2μM谷氨酰胺、50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μM 2-β-巯基乙醇和10mM HEPES(R10)。
C1R-HLA-A2用PBS洗涤两次，然后在37℃下用0μM、1μM或10μM同源肽在PBS中再悬浮50分钟。细胞在R10中洗涤两次，并在96U板中以每孔100μl的1×105个细胞进行涂板。
从培养物中获取jTc，用PBS洗涤一次，然后在不含蛋白的PBS中，或含3μM偶联超荷GFP(con-scGFP)、3μM超荷GFP(scGFP)、10μM天然肌红蛋白(nMyo)、10μM阳离子化肌红蛋白(Cat-Myo)或10μM偶联肌红蛋白(con-Myo)的PBS中，于37℃持续培养20分钟。在PBS中洗涤一次包被的jTc，然后在R10中以100μl中5×104jTc/孔重悬，并与C1R细胞混合。
在37℃的培养箱中，在环境氧气(21％)水平或缺氧氧气水平(5％)下，将带有包被的jTc和肽脉冲C1R细胞的相同培养板共培养6小时。
6小时后，用PBS洗涤平板一次，然后将细胞与αCD69-APC(Biolegend，货号310910)、αCD3-AF594(Biolegend，货号300446)和活细胞染色剂Aqua(Invitrogen，货号L34957)在4℃下培养30分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，并用2％多聚甲醛(PFA)过夜固定。细胞在PBS中洗涤两次以去除固定剂，并在Fortessa X20细胞仪的高通量模块上检测。
小鼠T细胞增殖试验
37℃下，在96个U形底板上包覆PBS中稀释的1μg/mlαCD3和5μg/mlαCD28，包覆1小时后去除PBS。
按照厂商的说明，使用Dyna-bead阴性选择试剂盒(ThermoFisher，货号11413D)从一只Balb-c雌性小鼠的脾脏和淋巴结中纯化全部T细胞(Tc)。
纯化的Tc用PBS洗涤一次，然后在不含蛋白的PBS中，或含3μM偶联超荷GFP(Con-scGFP)、3μM偶联超荷GFP(scGFP)、10μM天然肌红蛋白(nMyo)、10μM阳离子化肌红蛋白(Cat-Myo)或10μM偶联肌红蛋白(Con-Myo)的PBS中37℃培养20分钟。
将包被的Tc在PBS中洗涤两次，并在室温下用含10μM细胞微量紫(Cell TraceViolet，ThermoFisher，货号C34557)的PBS重悬20分钟。在R10中洗涤CTV染色的细胞，并在200μl R10中以4×105Tc/孔转移至含有20U/ml IL-2的αCD3和αCD28预涂板中。
在37℃的培养箱中，在环境氧气(21％)水平或缺氧氧气水平(5％)下，将包被Tc的相同平板培养4天。
4天后，将平板以500×g离心5分钟，用PBS洗涤一次，然后将细胞与两种抗体组合在4℃下孵育45分钟。
组合1：αCD3-AF700(Biolegend，货号152316)、αCD4-BV785(Biolegend，货号100552)、αCD8-APCef780(Invitrogen，货号47008182)、αCD44-BV605(Biolegend，货号103047)、αHIS-TAG-APC(Biolegend，货号362605)和Aqua(Invitrogen，货号L34957)。
组合2：αCD3-AF700、αCD4-BV785、αCD8-APCef780、αPDL-1-PE(Invitrogen，货号125982-82)、同型对照-BV605(Biolegend，货号400434)、同型对照APC(Invitrogen，货号17432181)和Aqua。
然后用PBS洗涤细胞两次，并在4℃下用2％多聚甲醛(PFA；FisherScientific，货号11586711)固定1小时。在PBS中洗涤细胞两次以去除固定剂，并在Fortessa X20细胞仪的高通量模块上检测。
Tc于37℃保存在RPMI 1640(ThermoFisher Scientific，货号21875-034)中，其中含有10％v/v FCS、2μM谷氨酰胺、50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μM 2-β-巯基乙醇和10mM HEPES(R10)。
标记效率
在偶联之前，按照厂商的说明，对Myo14标记FITC。未经处理的jTc和包被了14μMMyo14[S]-FITC的jTc均用αCD3-AF594染色，然后通过流式细胞术进行分析。FITC+CD3+Tc的平均比例用具有代表性的FACS散点图(+/-SD，n＝3)表示。
基于FACS的细胞存活率分析
对包被有用不同浓度Myo14[S]的活体jTc进行Aqua活/死细胞染色和CD3-AF594染色。将Tc门控在单态和CD3+Tc上，然后计算活细胞的平均百分比。用αCD3/CD28和IL-2在体外纯化并激活原始小鼠Tc 1天。在第1天，收集激活的Tc，并在不同浓度下包被Myo14[S]。将包被的激活Tc与αCD3/CD28和IL-2一起添加回培养基中培养1天。收集细胞，用抗CD8法和Aqua活死细胞染色法染色。将细胞门控在单细胞和CD8+细胞上，然后计算活细胞的平均百分比。
基于流式细胞仪的细胞增殖分析
从一只Balb-c小鼠的脾脏和淋巴结中纯化全部Tc。Tc不经处理或用2.5μM Myo14[S]包被。用αCD3/CD28激活Tc。在第3天和第5天收集激活的Tc，并用台盼蓝染色以排除死亡细胞，然后计数。得到平均细胞数(+/-SD，n＝3)。
纯化的全部Tc用细胞微量紫染色，然后不处理(U/T)或用2.5μM Myo14[S]包被。用αCD3/CD28和IL2激活Tc。在第3天和第5天收集激活的mTc，并用αCD4和αCD8染色。用流式细胞仪分析细胞。将细胞门控在CD8细胞上，所有CTV稀释细胞的平均值做为“分裂的CD8 Tc”(+/-SD，n＝3)。
抗原特异性的激活
TCR转基因jTc分别不经处理(U/T)或用10μM[Myo14 MBP][S]包被。随后jTc与用前述浓度同源肽脉冲的C1R-HLA-A2+细胞肽一起培养6小时。用αCD3-AF594、αCD69-APC和Aqua活/死染色对jTc进行染色，在存活的和CD3+jTc(+/-SD，n＝3)上计算激活标记物CD69的平均MFI。
缺氧染色试验
通过添加DMSO并充分混合稀释Image-iT Green缺氧监测试剂(Thermo Fisher)至5mM。然后将该原料添加到含jTc的R10培养基中至终浓度为101μM，并在37℃、20％O2和5％CO2下培养40分钟。然后将细胞以500×g离心5分钟，倒出上清液并用新鲜生长培养基代替。然后将细胞以每孔5×105个包覆在96孔板中，并随时间在荧光板读取器上读取其荧光值，其中氧气浓度固定在所需值，例如0.5％O2。
hMSC炎症试验
从四名患者中分离的人间充质干细胞不经处理或用2.5μM Myo14[S]包被并培养7天。用IFN-γ培养的细胞作为阳性对照。在第7天，收集细胞，计数并用Aqua活/死染色剂染色，和谱系标记物CD105和CD73染色，以及炎症标记物HLA-DR、HLA-ABC和PDL1染色。将细胞门控在单细胞、活细胞和CD105+CD73+细胞上，然后计算表达每个标记物的细胞的平均百分比。
2D体外肿瘤杀伤试验
肿瘤细胞的抗原特异性杀伤，如对IGR-Heu肺癌细胞、SKBR3、BT20、MCF7乳腺癌细胞、SKOV3卵巢癌细胞或HeLa-CD19细胞，是通过使用来源于PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞分离的人类细胞毒性T细胞或CAR-T细胞进行。
从外周血单个核细胞中分离T细胞后，使用刺激剂将其激活，如辐照的自体肿瘤细胞、结合HLA-A2的HER-2/neu p369-377肽、或CD3/CD28免疫磁珠以及生长因子，如IL-2。
在与肿瘤靶细胞共培养之前，T细胞包被Myo14或Myo14[S]。未包被的T细胞用作基线杀伤活性的对照。肿瘤细胞系要么转染以表达报告基因，要么与荧光标记的染料(如CFSE)孵育。在激活T细胞和肿瘤靶细胞的共培养过程中，通过成像、FACS或平板读取器监测荧光的减少，以确定肿瘤的杀伤率。
作为肿瘤杀伤的阳性对照，将抗癌药物(即星孢菌素staurosporine)单独添加到肿瘤细胞的培养基中。
三维体外肿瘤杀伤实验
将靶肿瘤细胞转染以表达GFP并培养成3D球体。在包被Myo14或Myo14[S]后，将分离的T细胞添加到肿瘤球体中。未包被的T细胞用作基线杀伤活性的对照。在共培养过程中，通过成像监测荧光的减少确定肿瘤球体细胞的死亡率。
为了监测肿瘤球体中的T细胞浸润，用不同的染料对T细胞进行荧光标记，并对共培养物进行成像。
作为肿瘤杀伤的阳性对照，将抗癌药物(即星孢菌素staurosporine)单独添加到肿瘤球体上的培养基中。
体内肿瘤杀伤试验
在体外和体内多个模型中测试基于Myo14的构建体，以进一步证明其功能和功效。对于体内疗效，为证明基于Myo14的构建体适用于多种肿瘤应用，Myo14[S]和[Myo14-PD1][S]包被在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)或转基因Clone 4T细胞上，并分别过继转移到携带MDA-MB-231人类乳腺癌肿瘤或RencaHA肿瘤的小鼠体内，下面将对每个实验进行更详细的描述。
在CAR-T/MDA-MB-231实验中，32只NSG老鼠皮下接种MDA-MB-231。当肿瘤生长到预定的时间点时，将小鼠分为4组。第1组未经处理，第2组经静脉注射CAR-T处理，第3组接受静脉注射Myo14[S]包被的CAR-T处理，第4组接受静脉注射[Myo14-PD1][S]包被的CAR-T处理。该实验至少重复一次。
使用卡尺以及荧光素酶转导的MDA-MB-231肿瘤细胞的生物发光成像定期测量肿瘤大小。对连续尾部取血进行流式细胞术分析，以确定输注的Tc的持续性和扩张性。
通过英国伯明翰癌症研究中心提供的多重染色(多色Vectra自动定量病理成像系统，并使用Definens软件进行定量分析)对治疗肿瘤组织切片进行分析。肿瘤用以下抗体组染色：
抗人CD3、泛细胞角蛋白(肿瘤标志物)、CD34(CAR标志物)、碳酸酐酶IX(缺氧标志物)、人膜联蛋白V(凋亡标志物)和人干扰素γ(功能标志物)、人PD1和人PDL1(外加DAPI核染色)。这使得免疫细胞的可视化、分析、量化和表型分析以及单个肿瘤组织切片中细胞间相互作用的识别成为可能。
通过FACS分析次级淋巴组织和肿瘤中是否存在CAR-T细胞。对过继转移的CAR-T细胞的表型进行PD-1、CD45和CD62L的表面表达分析，并对IFNY和TNFα进行细胞内细胞因子染色。通过PDL-1、MHC I类和MHC II类的表面表达分析治疗后肿瘤细胞的表型。
在另一个体内肿瘤模型中，将Myo14[S]和[Myo14-PD1][S]包被在转基因Clone 4T细胞上，该细胞从6-8周龄CL4 TCR转基因Thy1.1+BALB/c小鼠中纯化。将20×106CL4-TCR转基因Tc静脉注射到8只随机选择的雌性Balb-c小鼠体内，这些小鼠先前已被皮下注射1×106RencaHa肿瘤细胞。在未处理组、未包被的Tc处理组、Myo14[S]包被的Tc处理组和Myo14-PD1][S]包被的Tc处理组这4组中测量RencaHa肿瘤的生长。根据之前的工作，实验的科学和人道终点设定为27天。每隔一天用卡尺测量一次肿瘤二维直径，计算肿瘤进展率和最终肿瘤体积。对连续尾部取血进行流式细胞术分析，以确定输注的Tc的持续性和扩张性。
采用荧光免疫组织化学方法，在肿瘤、脾脏、肿瘤引流淋巴结和肿瘤非引流淋巴结、肺、脑和肝中鉴定具有Thy1.1同源标记的过继转移Tc，以计算经处理的Tc处理和未经处理的Tc的分布、肿瘤特异性迁移和保留。此外，用血管系统标记物(CD31/MECA-32)和缺氧标记物(碳酸酐酶IX8)对肿瘤样本切片进行染色，以确定缺氧区域。加上Tc鉴定，这些染色剂可以鉴定Myo[S]处理过的Tc迁移到缺氧区并在缺氧区持续存在。
采集并处理部分肿瘤、脾脏、肿瘤非引流淋巴结和肿瘤引流淋巴结进行FACS分析。分析从肿瘤中纯化的Tc的活性、体外杀伤肿瘤细胞的能力以及CD44、CD62L、PD1、膜联蛋白V、IFNγ和TNFα的表达。此外，还针对MHC I类和II类以及PDL1分析了肿瘤细胞的表型。
实施例-结果和讨论
用构建体标记的细胞百分比
如上文所述，立即用荧光偶联抗体和活性染料对包被活细胞进行染色，然后通过流式细胞术分析构建体的活性和其存在。经过3次洗涤后，可在Tc表面检测到GFP和HIS-TAG，表明它们与细胞表面紧密结合(图1a-d)。有结合状态阳离子化肌红蛋白(83.5％+/-0.4)的jTc的百分比和有结合状态偶联肌红蛋白(79.4％+/-0.8)的jTc百分比相当(图1a)，但与阳离子化肌红蛋白(47.7％+/-1.4)相比，结合了偶联肌红蛋白(6.7％+/-0.8)的mTc百分比显著降低(图1c)。在不希望受到理论约束的情况下，阳离子化肌红蛋白和偶联肌红蛋白与jTc和mTc差异结合的原因可能是细胞膜上的可变糖基化或检测HIS-Tag的能力差异。为了支持后一种假设，无论是超荷GFP还是偶联GFP，jTc和mTc的GFP标记均大于87％(图1b和d)，但等效HIS-Tag标记率从20％到91％不等，这表明HIS-Tag标记并未检测到所有GFP标记，需要进一步考虑改进。在不希望受到理论约束的情况下，低HIS-Tag读数和高GFP信号可能是由构建体的内化引起的，或者是通过以遮盖HIS-Tag的方向结合到mTc细胞引起的，这两者都不会影响GFP信号，但会阻止抗HIS-Tag抗体结合。
细胞存活率
未与肌红蛋白孵育的jTc，或与天然、阳离子化或偶联肌红蛋白孵育的jTc，存活率均高于94％，但与scGFP和偶联GFP孵育的jTc的存活率分别为47.75％和63.95％(图2a)，表明GFP而非肌红蛋白在测试浓度下对jTc有毒。未包被肌红蛋白的mTc的存活率(92.3％+/-1.14)和包被天然肌红蛋白的mTc的存活率(94.65％+/-0.31)显著高于包被阳离子化肌红蛋白的mTc(76.78％+/-0.50)和包被偶联肌红蛋白的mTc(79.7％+/-0.4)的mTc，表明阳离子化肌红蛋白和偶联肌红蛋白在测试浓度下会导致一些细胞死亡。在包被scGFP的mTc(63.0％+/-1.9)和偶联GFP的mTc(41.1％+/-1.12)中，细胞死亡甚至更多(图2b)。
总之，这些结果表明阳离子化肌红蛋白与jTc和mTc具有良好的细胞表面结合，尤其是对jTc的细胞毒性最小。需要进一步的mTc实验来优化偶联肌红蛋白的结合，同时提高细胞活力。mTc和jTc对相同浓度的阳离子化肌红蛋白和偶联肌红蛋白反应的差异活性很可能是由于细胞固有的健壮性，jTc细胞系比原始的小鼠Tc更健壮。
为了确定表面活性剂偶联超荷肌红蛋白(Myo14[S])处理T细胞的最佳浓度，在用不同浓度的Myo14[S]包被后测试jTc和初级mTc的活性。在最高40μM的所有测试浓度下，jTc的存活率均在90％以上(图5b)。原代小鼠T细胞在包被Myo14[S]后1天的存活率为90％或以上，所有测试浓度高达10μM(图5c)。
活性-对偶联同源肽
为了测试用构建体包被的jTc是否抑制T细胞受体(TCR)与其主要组织相容性复合体(MHC)呈现的同源肽的结合，使用了TCR转基因Jurkat T细胞，当它们识别C1R-HLA-A2(C1R)B细胞呈现的同源肽时，会上调CD69。jTc经肌红蛋白或GFP构建体包被，并与先前用0μM、1μM或10μM同源肽脉冲的C1R细胞培养6小时。流式细胞术分析激活标记物CD69的上调。添加1μM或10μM肽可将表达CD69的细胞百分比从未经处理的jTc的0.92％(+/-0.06)增加到1μM肽时的9.32％(+/-1.16)，和10μM肽时的20.97％(+/-1.80)(图3a和b)。用阳离子化肌红蛋白、偶联肌红蛋白(图3a)或超荷或偶联GFP(图3b)包被后，CD69表达的增加没有显著差异。结果表明，TCR转基因jTc与构建体的结合不会抑制T细胞激活，这表明TCR-MHC激活复合物之间不存在由构建体引起的空间干扰。
增殖能力和活性-在缺氧条件下
经肌红蛋白构建体包被后，mTc在常氧(22％氧)和缺氧(5％氧)条件下被激活。mTc在抗CD3和抗CD28抗体存在下培养4天。抗CD3和抗CD28同时与TCR和共刺激分子CD28结合，导致Tc的多克隆激活。第4天，收集mTc并通过流式细胞术进行分析。将mTc门控在CD4或CD8上，以分析这两种T细胞亚型。分析每种亚型的细胞微量紫(CTV)稀释情况和CD44的高表达，CTV为增殖标记物，CD44激活的标志。
在未经处理的细胞中，缺氧使分裂的CD4-mTc的百分比从66.23％(+/-2.54)增加到72.1％(+/-3.54)，CD8 mTc的百分比从70.75％(+/-2.63)增加到78.2％(+/-5.15)，这表明缺氧环境增加了Tc的增殖(图4a和b)。在常氧条件下，包被阳离子化肌红蛋白或偶联肌红蛋白的CD4和CD8 mTc的分裂细胞百分比均显著低于未处理或天然肌红蛋白处理的对应细胞。这一观察结果可以合理地解释为这些细胞在激活前包被肌红蛋白构建体(图2b)后活性降低。然而，当包被的CD4和CD8 Tc在缺氧条件下培养时，与常氧条件相比，分裂的mTc的百分比更高，这表明肌红蛋白和/或缺氧的存在挽救了这些细胞的增殖缺陷。
在未经处理的CD4 Tc中，与常氧相比，缺氧使激活的CD4 CD44hiTc的百分比从45.9％(+/-2.86)增加到50.83％(+/-2.16)。包被阳离子化肌红蛋白或偶联肌红蛋白并在常氧条件下激活的CD4 Tc中，其CD4 CD44hi Tc百分比显著低于未经处理或天然肌红蛋白处理的Tc，但与未经处理和天然肌红蛋白处理的mTc相比，在缺氧条件下激活的相同细胞的CD4 CD44hi Tc百分比相等(图4c)。
在未处理的CD8 Tc中，与常氧相比，缺氧显著(p＝0.001)降低了CD8 CD44hi Tc的百分比，从61.25％(+/-1.93)降至52.33％(+/-2.27)。与未经处理的对照组(61.25％+/-1.93)相比，偶联肌红蛋白(49.83％+/-2.21)的添加，而非阳离子化肌红蛋白(58.08％+/-1.34)，导致常氧条件下CD8 CD44hi Tc百分比降低。然而，在缺氧条件下，添加阳离子化肌红蛋白或偶联肌红蛋白可逆转缺氧诱导的CD8 Tc激活减少。事实上，添加两种形式的肌红蛋白显著增加了CD8 CD44hi Tc的百分比，从未处理的CD8 Tc的52.33％(+/-2.27)增加到阳离子化肌红蛋白包被的CD8 Tc的71.5％(+/-2.50)和偶联肌红蛋白包被的CD8 Tc的63.88％(+/-3.67)(图4d)。目前尚不清楚为什么肌红蛋白构建体在常氧条件下会导致CD44hi Tc下降，而在缺氧条件下则不会。这可能与Tc存活率的最初下降有关。在某种程度上，这些构建体也可能通过TCR或CD28干扰T细胞信号，其方式仅在常氧条件下才重要。然而，肌红蛋白处理在常氧条件下挽救CD8 Tc激活表型的证明非常令人鼓舞，因为CD8 Tc是CAR-T细胞和TIL治疗进一步发展的重要目标。
增殖能力
在用细胞微量紫染色并用2.5μM Myo14[S]包被后3天和5天，评估体外激活的mTc的增殖和存活率。与未处理(U/T)对照组相比，在包被2.5μM Myo14[S]后第3天或第5天，激活的T细胞的数量没有显著差异(图5d)。此外，在同一实验中，Myo14处理组和未处理组中经历一次或多次分裂的mTc百分比没有显著差异(图5e)。
抗原特异性激活
在CD69激活试验中测试了T细胞受体(TCR)转基因Jurkat T细胞在识别其同源MHC肽复合物后被激活的能力。在本试验中使用[Myo14 MBP][S]是因为麦芽糖结合蛋白(MBP)用作可与Myo14连接的任何其他蛋白的替代物，包括但不限于细胞因子(如IL-2、IL-15和IL-17)、T细胞受体(如PD-1、CTLA-4、TIM-3)或酶(如金属蛋白酶)。与未经处理的对照组相比，用[Myo14 MBP][S]包被的jTc对肽浓度增加的反应中CD69的上调没有显著差异。这些结果表明，与另一种蛋白(在本例中为MBP)连接的Myo14[S]的包被不会干扰正常的jTc与靶细胞蛋白的相互作用，因此不应干扰正常的T细胞信号(图5f)。
耗竭-标记物谱
为了证明在存在表面活性剂偶联超荷肌红蛋白(Myo14[S])的情况下，原始mTc不会应激，用2.5μM Myo14[S]包被纯化的mTc被，并用αCD3/CD28和IL-2刺激3天。在第3天，收集激活mTc并分析其激活标记物CD44和耗竭/激活标记物LAG3、PD1和TIGIT的表达。未经处理的细胞与经Myo14[S]处理的细胞在任何被检标记物方面均无显著差异(图6a)。
缺氧染色试验
表面活性剂偶联超荷肌红蛋白(Myo14[S])是一种携氧分子，因此发明人试图确定Myo14[S]携带的氧是否可以供应给Tc。jTc用Image iT Green缺氧监测试剂染色后，不额外处理或用10μM Myo14[S]处理。将染色和包被的jTc转移至Cytation平板读取器，并在5％二氧化碳和0.5％氧气下监测荧光22小时。未处理的jTc的相对荧光和内部缺氧状态以更高的速率增加，并达到比经Myo14[S]处理的jTc更高的水平，表明Myo14[S]正在向jTc供氧(图6b)。
hMSC炎症试验
本文描述的技术可应用于多种细胞类型和疾病适应症。发明人已经证明，表面活性剂结合的超荷肌红蛋白(Myo14[S])可以包被到人类间充质干细胞(hMSC)上。hMSC经5μMMyo14[S]包被后，在体外培养7天。在第7天收集hMSC，计数活细胞，然后用谱系标记物CD73和CD105的抗体以及炎症标记物HLA-ABC、HLA-DR和PD-L1的抗体对细胞进行染色。作为炎症标记物上调的对照，一些细胞也与炎症细胞因子IFNγ一起培养。在未经处理的hMSC和Myo14[S]处理的hMSC中，表达HLA-ABC、HLA-DR和PD-L1的细胞数量或细胞百分比没有显著差异(图6c)。
表4提供了使用上述技术产生的一系列电荷修饰(超荷)肌红蛋白的氨基酸序列：
表4-电荷修饰肌红蛋白和电荷修饰GFP的氨基酸序列
Figure GDA0003396928260000301
Figure GDA0003396928260000311
SEQUENCE LISTING
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His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Leu Phe Arg Lys Asp Met Ala Ser Lys Tyr Lys Glu Leu Gly
145 150 155 160
Phe Gln Gly
<210> 11
<211> 163
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 电荷修饰的珠蛋白
<400> 11
Met His His His His His His Gly Ser Gly Gly Leu Ser Asp Gly Glu
1 5 10 15
Trp Gln Leu Val Leu Lys Val Trp Gly Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro
20 25 30
Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg Leu Phe Lys Gly His Pro Glu
35 40 45
Thr Leu Glu Lys Phe Asp Arg Phe Lys Lys Leu Lys Ser Glu Asp Glu
50 55 60
Met Lys Arg Ser Glu Asp Leu Lys Lys His Gly Ala Thr Val Leu Lys
65 70 75 80
Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys Lys Lys Gly Lys His Glu Ala Glu Ile
85 90 95
Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr Lys His Lys Ile Pro Val Lys
100 105 110
Tyr Leu Lys Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile Lys Val Leu Gln Ser Lys
115 120 125
His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys Lys Ala
130 135 140
Leu Lys Leu Phe Arg Lys Asp Met Ala Ser Lys Tyr Lys Glu Leu Gly
145 150 155 160
Phe Gln Gly
<210> 12
<211> 163
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 电荷修饰的珠蛋白
<400> 12
Met His His His His His His Gly Ser Gly Gly Leu Arg Asp Gly Glu
1 5 10 15
Trp Gln Leu Val Leu Lys Val Trp Gly Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro
20 25 30
Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg Leu Phe Lys Gly His Pro Glu
35 40 45
Thr Leu Glu Lys Phe Asp Arg Phe Lys Lys Leu Lys Ser Glu Asp Glu
50 55 60
Met Lys Arg Ser Glu Asp Leu Lys Lys His Gly Ala Thr Val Leu Lys
65 70 75 80
Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys Lys Lys Gly Lys His Glu Ala Glu Ile
85 90 95
Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr Lys His Lys Ile Pro Val Lys
100 105 110
Tyr Leu Lys Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile Lys Val Leu Gln Ser Lys
115 120 125
His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys Lys Ala
130 135 140
Leu Lys Leu Phe Arg Lys Asp Met Ala Ser Lys Tyr Lys Glu Leu Gly
145 150 155 160
Phe Gln Gly
<210> 13
<211> 695
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 电荷修饰的珠蛋白
<400> 13
Met His His His His His His Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile
1 5 10 15
Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys
20 25 30
Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp
35 40 45
Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro
50 55 60
Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu
85 90 95
Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala
100 105 110
Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu
115 120 125
Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys
130 135 140
Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe
165 170 175
Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn
180 185 190
Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn
195 200 205
Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe
210 215 220
Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr
245 250 255
Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly
260 265 270
Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu
275 280 285
Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys
305 310 315 320
Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile
325 330 335
Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr
340 345 350
Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
370 375 380
Asn Asn Asn Leu Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Trp Asn
385 390 395 400
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
405 410 415
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
420 425 430
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Val Lys Leu Ala Ala
435 440 445
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val
450 455 460
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
465 470 475 480
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Ser Ala Ile Ser Leu Ala
485 490 495
Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
500 505 510
Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Gly
515 520 525
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu
530 535 540
Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Lys Val Trp Gly Lys Val Glu
545 550 555 560
Ala Asp Ile Pro Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg Leu Phe Lys
565 570 575
Gly His Pro Glu Thr Leu Lys Lys Phe Asp Arg Phe Lys His Leu Lys
580 585 590
Ser Glu Asp Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys His Gly Ala
595 600 605
Thr Val Leu Lys Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys Lys Lys Gly Lys His
610 615 620
Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr Lys His Lys
625 630 635 640
Ile Pro Val Lys Tyr Leu Lys Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile Lys Val
645 650 655
Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala
660 665 670
Met Lys Lys Ala Leu Lys Leu Phe Arg Lys Asp Met Ala Ser Lys Tyr
675 680 685
Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly
690 695
<210> 14
<211> 689
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 电荷修饰的珠蛋白
<400> 14
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Glu
370 375 380
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro
385 390 395 400
Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser
405 410 415
Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser
420 425 430
Pro Ser Asn Gln Thr Val Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser
435 440 445
Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly
450 455 460
Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly
465 470 475 480
Thr Tyr Leu Cys Ser Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys
485 490 495
Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val
500 505 510
Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
515 520 525
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln
530 535 540
Leu Val Leu Lys Val Trp Gly Lys Val Glu Ala Asp Ile Pro Gly His
545 550 555 560
Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu
565 570 575
Lys Lys Phe Asp Arg Phe Lys His Leu Lys Ser Glu Asp Glu Met Lys
580 585 590
Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys His Gly Ala Thr Val Leu Lys Lys Leu
595 600 605
Gly Lys Ile Leu Lys Lys Lys Gly Lys His Glu Ala Glu Ile Lys Pro
610 615 620
Leu Ala Gln Ser His Ala Thr Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu
625 630 635 640
Lys Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile Lys Val Leu Gln Ser Lys His Pro
645 650 655
Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gly Ala Met Lys Lys Ala Leu Lys
660 665 670
Leu Phe Arg Lys Asp Met Ala Ser Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln
675 680 685
Gly
<210> 15
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 电荷修饰的GFP
<400> 15
Met Ala Ser Lys Gly Glu Arg Leu Phe Arg Gly Lys Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Lys Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Lys Gly Lys Gly Asp Ala Thr Arg Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Lys His Met Lys
65 70 75 80
Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Lys Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Lys Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Arg Thr Leu Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly
115 120 125
Arg Asp Phe Lys Glu Lys Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Arg Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Arg Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Lys Phe Lys Ile Arg His Asn Val Lys Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Arg Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Arg Asn His Tyr Leu Ser Thr Arg Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Lys Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Lys His Gly Arg Asp Glu Arg Tyr Lys
225 230 235

Claims (20)

1.一种抗肿瘤的细胞、脂质体或微团，其包含至少一种与所述细胞、脂质体或微团的膜相关联的电荷修饰的珠蛋白。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫细胞，优选肿瘤浸润免疫细胞，更优选淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞或巨噬细胞。
3.如权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，所述细胞为细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞或自然杀伤细胞。
4.如前述权利要求任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。
5.如权利要求1所述的脂质体或微团，其特征在于，所述脂质体或微团包含治疗剂；优选地，其中所述治疗剂为检查点抑制剂、免疫治疗剂或化疗剂。
6.如前述权利要求任一项所述的细胞、脂质体或微团，其特征在于，所述珠蛋白为血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白或细胞珠蛋白；优选肌红蛋白。
7.如前述权利要求任一项所述的细胞、脂质体或微团，其特征在于，所述珠蛋白连接至次级抗肿瘤分子或用于连接至次级抗肿瘤分子的反应性官能团；
优选地，其中所述次级抗肿瘤分子为抗体、凝集素、整合素或粘附分子中的任意一种；
和/或，优选地，其中所述次级抗肿瘤分子为：(1)肿瘤细胞结合分子；(2)检查点抑制剂；(3)重组肿瘤细胞外基质的酶；或(4)代谢肿瘤相关化合物的酶。
8.如权利要求7所述的细胞、脂质体或微团，其含有包括所述珠蛋白和所述次级抗癌分子的融合蛋白。
9.如前述权利要求任一项所述的细胞、脂质体或微团，其特征在于，所述珠蛋白为阳离子化珠蛋白或阴离子化珠蛋白。
10.如前述权利要求任一项所述的细胞、脂质体或微团，其特征在于，所述珠蛋白包含聚合物表面活性剂包被。
11.一种药物组合物，其包含如前述权利要求任一项所述的抗肿瘤的细胞、脂质体或微团，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或载体。
12.如权利要求1-10任一项所述的细胞、脂质体或微团、或如权利要求11所述的药物组合物，在癌症治疗中的应用。
13.一种制备如权利要求1-10任一项所述的抗肿瘤的细胞、脂质体或微团的方法，其包括：
a)提供电荷修饰的珠蛋白；和
b)将所述抗肿瘤的细胞、脂质体或微团与所述珠蛋白接触。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在能够使所述聚合物表面活性剂与所述珠蛋白静电偶联的条件下提供电荷修饰的珠蛋白和聚合物表面活性剂。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，珠蛋白通过包括以下步骤的方法转化为电荷修饰的珠蛋白：
i)将珠蛋白溶液与N,N'-二甲基-1,3-丙二胺(DMPA)或其类似物的pH中和溶液混合，并任选地将混合物的pH调节至5-7；
ii)随后或同时添加碳化二亚胺，例如N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)，并将所述混合物的pH调节pH至4-7；
iii)在0-25℃的温度和pH 4-7下搅拌(ii)中所述的混合物1-30小时；
iv)在pH 6.5-8.5的条件下，将(iii)中所述混合物中的蛋白与水或缓冲液分离至少4小时；
v)如有必要，将(iv)中所述混合物的pH调节至6.5-8.5。
16.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述电荷修饰的珠蛋白通过包含表达编码所述电荷修饰的珠蛋白的重组DNA序列的方法获得。
17.一种治疗癌症的方法，包括将如权利要求1-10任一项所述的细胞、脂质体或微团、或如权利要求11所述的药物组合物施用于有需要的患者。
18.如权利要求12所述的应用、或如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述癌症为实体瘤癌症。
19.如权利要求12或18所述的应用、或如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述癌症选自：乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、宫颈癌或胰腺癌。
20.一种多肽，其包含任意一条如SEQ ID NO:1-14所示的所述电荷修饰的珠蛋白序列或任意一种与非变体珠蛋白序列具有至少约60％的序列同一性的功能性变体。
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