JP2002541875A - モデル膜システム - Google Patents

モデル膜システム

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アルティン，ジョセフ
パリッシュ，クリストファー，リチャード
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ザ オーストラリアン ナショナル ユニバーシティー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は一般に、免疫を変える目的で、又は治療効果を達成すべくイン・ビボ投与される場合薬物を特定の細胞型若しくは組織に標的化する目的で、生体膜及び／又は合成膜又はリポソーム又はそれらの組合せを改変する方法に関する。膜の改変は金属キレート基の組み込み及び／又は付着により達成され、それにより金属親和性タグを有する一つ以上の標的化分子の植え付けが可能となり、そしてイン・ビボでの特定の細胞型若しくは組織への植え付けられた膜の標的化が可能となる。こうして、本発明はワクチンとして使用する場合免疫を変え又は強化する目的で、あるいは治療効果若しくは治療応答を達成すべくイン・ビボ投与される場合封入され／組み込まれた薬物を特定の細胞型若しくは組織に標的化する目的で、又は生理学的応答若しくは生体機能を改変する目的で生体膜及び／又は合成膜及びリポソームの特性を改変する手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は一般的にモデルの生体膜システムに分子を固定する工程に関し、そし
て分子間相互作用の検定における固定された分子の使用に関し、そして生物学的
応答を改変する工程に関する。一つの形態で、本発明は、分子間相互作用に影響
を与える薬物及び他の作用物質をスクリーニングするための新規な方法の基礎を
提供する。別の一形態では、本発明は、ワクチンとして使用される場合、免疫を
変える目的で、又は治療目的か又は生理学的応答又は機能を変えるためにイン・
ビボ投与される場合、薬物及び他の作用物質の特定の細胞若しくは組織への標的
化のために、生体膜及び／又は合成膜及びリポソームの性質を変える手段を提供
する。
【０００２】 発明の背景 本明細書で数値により言及した刊行物の書誌的詳細は明細書の末尾に収録して
ある。
【０００３】 細胞、細菌又はウイルスなどの生物システムでは、表面の生体分子若しくは受
容体はしばしばサブユニットと呼ばれる二つ以上の分子成分から成る分子構造物
として存在する。これらのサブユニットは同一であっても分子的に異なっていて
もよい。天然のリガンド分子（単数又は複数）の受容体サブユニットへの結合は
、これらの受容体成分の非共有結合的会合又はオリゴマー化を誘導する。このオ
リゴマー化現象は、しばしば該受容体がそれにより膜貫通シグナルを伝達できる
機作の本質的一部であり、このシグナルは該リガンド分子（単数又は複数）によ
る生体応答誘導の引金となる。さらに、ある受容体若しくはその成分が自発的に
会合する能力はリガンドと相互作用するその能力に影響を与えうる。リガンド分
子は、該受容体に結合できる成長因子類、サイトカイン類、ホルモン類、タンパ
ク質類、糖タンパク質類、多糖類、又は細胞の表面に露出した成分又は細胞レベ
ル下の成分、ウイルス粒子若しくはウイルスレベルの下の粒子、又は他の感染体
であってもよい。
【０００４】 多量体相互作用を受けるそれらの能力のため、オリゴマー化した受容体はしば
しば低い結合親和性のリガンドと安定に相互作用する能力を有する。しかしなが
ら、多くの受容体については、自己会合の親和性又はリガンドとの相互作用の親
和性は、しばしば共有結合的標識化、界面活性剤による可溶化、又は光学バイオ
センサーの固体検出表面上への受容体若しくはリガンドの固定化を必要とする通
常の結合技法を用いる検出を可能とする程に十分高くはない。これらの方法は比
較的高い親和性の相互作用の研究に適しており、それらは一般に該分子が溶液中
で相互作用する能力又は細胞破砕後にも安定な相互作用をいじする能力に依存す
る。溶液中での有効な受容体／リガンド濃度は細胞の二次元表面（ここでは、分
子はオリゴマー化でき又は束となることができ、そして多量体相互作用により他
の分子と安定に相互作用できる）上のそれに比べ減少するから、これらの方法は
低い親和性の相互作用を検出する能力という点で制限される。
【０００５】 原子間力電子顕微鏡法（Atomic force microscopy)( 探針走査電子顕微鏡法(s
canning probe microscopy) とも呼ばれる) は、サイズで原子次元からミクロン
までに及ぶ構造物の三次元画像化及び測定を可能とし、これまでに見られること
のなかった構造物を分解するその能力において革新的である（１）。光学バイオ
センサーの開発は巨大分子の間の相互作用を実時間でモニターすることを可能と
した（２）。今日まで、これらの技法は両方とも、固体表面上に共有結合的に付
着され又は固定化された受容体分子又はリガンド分子について一般的に使用され
てきた（１〜４）。
【０００６】 最近、組換えヘキサ−ヒスチジン−標識タンパク質のニトリロトリ酢酸（ＮＴ
Ａ）との結合を用いて、ヘキサ−ヒスチジン−標識タンパク質を、ＢＩＡコア・
表面プラスモン・レゾナンス・バイオセンサーの上に逆に固定した（５）。ＢＩ
Ａコアの検出表面上のハイブリッド・オクタデカンチオール／リン脂質膜の形成
も記述され（６）、これは該二層におけるビオチン化されたホスファチジルエタ
ノールアミンへのストレプトアビジンの結合を可能にした。さらに、ヒスチジン
標識化生体分子の二層膜へのＮＴＡ−ジオクタデシルアミン様のキレーター脂質
を介する固定化がエピフルオレッセンス電子顕微鏡及びフィルム・バランス技法
により証明された（７〜８）。これらの先行技術は、受容体の横の移動を可能と
する細胞膜若しくは細胞レベル下の膜を模倣する条件、及び受容体のオリゴマー
化及びリガンドと多量体の相互作用を研究する可能性を与える条件の下では、受
容体ドメインの相互作用の分析を行うことはできない。さらに、これらの先行技
術の技法はこのような分子の相互作用に影響を与えうる薬物若しくは他の作用物
質をスクリーニングすることができない。
【０００７】 従って、例えば、薬物スクリーニング用の装置において、ワクチン調製におい
て、治療用薬物として、免疫応答を改変するための作用物質として、そして標的
に向かう薬物送達システムのために使用するため、膜物質に分子を固定する新規
な技法を開発することが必要である。
【０００８】 発明の概要 本明細書を通じ、文脈が他の意を要求しない限り、「含む（comprise) 」又は
「含む（comprises) 5」又は「含む(comprising)」などのその変形は、述べられ
た要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を含むことを意味するが、如何な
る他の要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を排除するものではないこと
を意味すると理解すべきである。
【０００９】 一つの側面で、本発明は、一つの層に配列された両親媒性分子を含む平板状支
持膜の上に受容体ドメインを固定する方法であって、金属キレート基の一部が該
膜の外部表面に向くように金属キレート基が共有結合接着することにより両親媒
性分子の一部が改変されたものであり、該方法が、該受容体ドメインが横への移
動でき、二量体化又はオリゴマー化でき、及びリガンド分子との相互作用できる
ように、ポリペプチドタグが該膜の外部に面している金属キレート残基を介して
該膜に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタグに共有結合
により付着している受容体ドメインを該膜と相互作用させる工程を含む方法を提
供する。
【００１０】 別の一側面で、本発明は、受容体ドメインが横に移動できるように脂質膜上に
該受容体ドメインを固定する方法であって、下記の工程、即ち （i) 下記のいずれかの工程により適当な平板状支持体の上に膜を形成させる
工程、 （ａ） 該支持体をある期間両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と接触させ、
インキュベートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結合に
による付着により改変されており、次いで水又は水性緩衝液の添加により膜を生
成させる工程、又は （ｂ） 両親媒性分子から構成されるミセル（例えば、リポソーム）の懸濁
液を形成させる工程であって、該両親媒性分子の一部が金属キレート基の共有結
合による付着により改変されており、次いで、該ミセル（例えば、リポソーム）
懸濁液の両親媒性分子に結合した金属キレート残基の一部が該膜の外部表面に向
いている膜層を形成させるのに十分な時間及び条件の下で、該ミセル（例えば、
リポソーム）懸濁液を適当な平板状支持体と相互作用させる工程、及び （ii) ポリペプチドタグが金属キレート結合を介して該膜の外側に面してい
る金属キレート残基に結合するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチド
タグに共有結合により付着した固定すべき受容体ドメイン（単数又は複数）を該
膜と相互作用させる工程、 を含む方法。
【００１１】 本発明の別の一側面は、受容体ドメインが膜中の二分子との相互作用を容易に
するため横に移動できるように、該受容体ドメインを脂質膜上に固定する方法で
あって、 （i) 下記の工程のいずれかにより適当な平板状支持体の上に膜を形成させる工
程、 （ａ） 両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と該支持体を接触させてインキュベ
ートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結合的付着により
変えられたものである工程、次いで水又は水性緩衝液の添加により膜を形成する
工程、 （ｂ） 第一のリン脂質及び第二のリン脂質から形成されるミセル（例えば、
リポソーム）の懸濁液を形成させる工程であって、該第二のリン脂質がニトリロ
トリ酢酸（ＮＴＡ）の共有結合的付着により改変されたものである工程、次いで
リン脂質膜層を形成させるのに十分な時間及び条件の下で該ミセル（例えば、リ
ポソーム）懸濁液を適当な平板状支持体と相互作用させる工程であって，この工
程中に該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液の第二リン脂質に結合したＮＴＡ
残基の一部が該膜の外部表面に向けられるものである工程、及び （ii) ポリペプチドタグがＮＴＡ−金属キレート結合を介して該膜の外部に面
するＮＴＡ残基に結合するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタグ
に共有結合的に付着している固定すべき受容体ドメイン（単数又は複数）を該膜
と相互作用させる工程、 を含む方法を意図する。
【００１２】 本発明のさらに別の一側面は、受容体とリガンドの間の相互作用を検定する方
法であって、下記の工程、即ち （Ａ） 下記の工程により脂質層に受容体を固定する工程、 （i) 下記の工程のいずれかにより適当な平板状支持体の上に膜を形成する工
程、 （ａ） 該支持体を、両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と、ある期間接触さ
せてインキュベートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結
合的付着により改変されたものである工程、次いで水又は水性緩衝液の添加によ
り膜を形成する工程、又は （ｂ） 両親媒性分子からミセル（例えば、リポソーム）の懸濁液を形成す
る工程であって、該両親媒性分子の一部が金属キレート基の共有結合的付着によ
り改変されたものである工程、次いで、膜層を形成させるのに十分な時間及び条
件の下で、該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液をガラス若しくは雲母などの
適当な平板状支持体と相互作用させる工程であって、この工程中に該ミセル（例
えば、リポソーム）懸濁液の両親媒性分子に付着した金属キレート残基の一部が
該膜の外部表面に向けられるものである工程、及び （ii) ポリペプチドタグが金属キレート結合を介して該膜の外方に面している
金属キレート残基に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタ
グに共有結合的に付着している固定すべき受容体ドメイン（単数又は複数）を該
膜と相互作用させる工程、 （Ｂ） 該膜上で該受容体分子を相互作用させ及び／又はオリゴマー化させる工
程、及び （Ｃ） 結合が起こるのに十分な時間及び条件の下で、該固定された受容体をリ
ガンドの有効濃度と接触させ、そして該結合を検出する工程、 を含む方法を提供する。
【００１３】 本発明のなお一層別の一側面は、受容体とリガンドの間の相互作用を検定する
方法であって、下記の工程、即ち （Ａ） 下記の工程により脂質層に受容体を固定する工程、 （i) 下記の工程のいずれかにより適当な平板状支持体の上に膜を形成する工
程、 （ａ） 該支持体を、両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と、ある期間接触さ
せてインキュベートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結
合的付着により改変されたものである工程、次いで水又は水性緩衝液の添加によ
り膜を形成する工程、又は （ｂ） 第一のリン脂質及び第二のリン脂質からの小胞の懸濁液を形成する
工程であって、該第二リン脂質がニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレー
ト基の共有結合的付着により改変されたものである工程、及び次いで炭化水素リ
ン脂質膜層を支持体の上に形成させるのに十分な時間及び条件の下で、該ミセル
（例えば、リポソーム）懸濁液をガラス又は雲母などの適当な平板状支持体と相
互作用させる工程であって、この工程で該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液
の第二リン脂質に結合したＮＴＡ残基の一部が該膜の外部表面に向けられるもの
である工程、及び （ii) ポリペプチドタグがＮＴＡ−キレート結合を介して該膜の外側に面し
ているＮＴＡ残基に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタ
グに共有結合により付着している固定すべき受容体ドメインを該膜と相互作用さ
せる工程、 （Ｂ） 該受容体分子を該膜上で相互作用させ及び／又はオリゴマー化させる工
程、及び （Ｃ） 結合が起こるのに十分な時間及び条件の下で、該固定された受容体をリ
ガンドの有効濃度と接触させ、そして該結合を検出する工程、 を含む方法を意図する。
【００１４】 本発明のさらに別の一側面では、リポソーム上に分子を植え付ける方法であっ
て、下記の工程、即ち （i) キレーター脂質を組み込まれ、且つ、薬物若しくは作用物質を封入され
又は封入されないリポソームの懸濁液を調製する工程、 （ii) 該リポソームを、適当な金属親和性タグを保持する組換えタンパク質又
は標的分子とインキュベートする工程、及び （iii) 必要ならば、過剰のタンパク質を洗浄、濾過又は他の洗浄手段により
除去し、それを適当な溶液に懸濁する工程、 を含む方法が提供される。
【００１５】 本発明の別の一側面では、組換え分子を生体膜上に直接「貼り付ける」工程で
あって、下記の工程、即ち （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 （ii) 細胞又は生体膜構造体の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベ
ートする工程、 （iii)過剰な脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該膜構造体を適当な金属親和性タグを持つ組換えタンパク質又は標的分
子の溶液とインキュベートする工程、及び （v) 過剰の可溶性タンパク質又は未結合の可溶性タンパク質を洗い流し、該
構造体をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程 を含む方法が提供される。
【００１６】 本発明のさらに別の一側面は、標的細胞又はその膜成分の免疫原性を変える方
法であって、下記の工程、即ち (i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 (ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベート
する工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該膜構造物を、固定すべき該分子の溶液とインキュベートする工程、
及び （v) 過剰の可溶性分子又は未結合の可溶性分子を洗い流し、且つ該構造物
をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程、 により該標的細胞の膜に分子を固定する工程を含む方法を意図する。
【００１７】 本発明のさらに別の一側面は、リポソーム又は膜構造物を特定の細胞又は組織
に標的として向かわせる方法であって、標的化の対象となる特定の細胞若しくは
組織の上に結合相手を有する分子を下記の工程、即ち （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 （ii) 細胞又は生体膜構造物の懸濁液を、脂質を組み込ませるため、キレータ
ー脂質の懸濁液とインキュベートする工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該リポソーム又は膜構造物を、固定すべき分子の溶液とインキュベート
する工程、及び （v) 過剰の可溶性分子又は未結合の可溶性分子を洗い流し、且つイン・ビボ
投与に適する溶液に該リポソーム又は構造物を懸濁する工程、 により固定し若しくは植え付ける工程を含む方法を意図する。
【００１８】 本発明の別の一側面は、治療法であって、活性物質を含み、且つ結合相手若し
くは標的組織を持つ固定され若しくは植え付けられた分子を任意選択的に含む、
リポソーム調製物若しくは膜物質の有効量を、被験者に投与する工程を含む方法
を意図する。
【００１９】 本発明のさらなる側面は、ワクチン投与を受ける被験者の免疫学的応答を改変
できる分子を植え付けられた細胞、リポソーム、小胞又は膜物質を含むワクチン
組成物であって、一つ以上の薬学的担体及び／又は希釈剤をさらに含むワクチン
組成物。
【００２０】 好ましい実施態様の詳細な説明 一つの実施態様では、本発明は先行技術の先に述べた欠点の一つ以上を克服す
るための、受容体の膜外ドメイン又は膜貫通ドメインを固定する方法を意図する
。
【００２１】 別の一実施態様では、本発明は膜固定分子の間の相互作用及び固定された分子
とそれと相互作用できる分子の間の相互作用を検定する方法を提供する。より具
体的には、本発明は、受容体の膜外ドメイン又は膜貫通ドメインの相互間、及び
受容体ドメインとリガンド（単数又は複数）の間の相互作用を、流動性膜システ
ムの上に受容体ドメイン（単数又は複数）を固定することにより研究するために
有用である。受容体ドメインはタンパク質、糖タンパク質又はプロテオグリカン
、オリゴサッカライド、又はそれらの断片若しくは機能的等価物からも構成しう
る。
【００２２】 本発明の重要な適用は、従って、誘導されるか若しくは自発的な受容体凝集に
影響を与え、従って受容体の機能に影響を及ぼす作用物質若しくは薬物をスクリ
ーニングするための技術を提供することにある。本発明は以下に述べるII型ＭＨ
Ｃ分子の正常に会合しているα及びβサブユニットなどの、受容体サブユニット
の既に存在する凝集体を破壊する薬物をスクリーニングする場合にも用いうる。
【００２３】 正常に膜に会合しない受容体断片若しくはタンパク質断片が工学的にヘキサ−
ヒスチジンタグを持たされ、下記のように細胞表面誘導分子ＣＤ４及びII型ＭＨ
Ｃなどの膜に固定されるならば、本発明はこれらの断片の自発的若しくはリガン
ドに誘導される凝集／解離プロセスをモニターするために有用である。または、
受容体ドメイン又は関連するタンパク質断片には、膜の層の最外側の層中に自発
的に挿入する適当に局在化された鎖を工学的に含ませることができる。このシス
テムの適用には、凝集プロセスに影響を及ぼす改変を誘導する新規なリガンド種
又は生化学的作用物質（例えば、酵素）のための薬物スクリーニング及び薬物調
査が含まれる。
【００２４】 こうして、本発明は受容体ドメイン（膜外又は膜貫通であるが）を膜に固定し
て、該受容体ドメインが該膜における生体分子との相互作用を容易にするため横
に移動できるようにする方法に関する。
【００２５】 従って、本発明は層に配列された両親媒性分子を含む平らに支持された膜の上
に受容体ドメインを固定する方法を提供する。ここで、両親媒性分子の一部は金
属キレート基の共有結合による付着により改変され、金属キレート基の一部が該
膜の外部表面に向けられる。この方法は、ポリペプチドタグが膜の外側に面して
いる金属キレート残基を介して該膜に付着するのに十分な時間及び条件の下で、
該ポリペプチドタグに共有結合により付着している受容体ドメインを該膜と相互
作用させ、該受容体ドメインが横に移動でき、二量体化若しくはオリゴマー化で
き、そしてリガンド分子と相互作用できるようにする工程を含む。
【００２６】 本発明に使用するための好ましい金属キレート基はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ
）である。
【００２７】 この膜は両親媒性分子のミセル（例えば、リポソーム）の懸濁液から形成され
うる。ここで、両親媒性分子の一部は金属キレート基の共有結合的付着により改
変される。または、該膜は有機溶媒中の両親媒性分子の溶液に水又は水性緩衝液
の添加により形成される。
【００２８】 本発明の別の一側面は、受容体ドメインが横に移動できるように、受容体ドメ
インを膜の上に固定する方法であって、下記の工程、即ち （i) 下記のいずれかの工程により適当な平板状支持体の上に膜を形成させる
工程、 （ａ） 該支持体をある期間両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と接触させ、
インキュベートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結合に
による付着により改変されており、次いで水又は水性緩衝液の添加により膜を生
成させる工程、又は （ｂ） 両親媒性分子から構成されるミセル（例えば、リポソーム）の懸濁
液を形成させる工程であって、該両親媒性分子の一部が金属キレート基の共有結
合による付着により改変されており、次いで、該ミセル（例えば、リポソーム）
懸濁液の両親媒性分子に結合した金属キレート残基の一部が該膜の外部表面に向
いている膜層を形成させるのに十分な時間及び条件の下で、該ミセル（例えば、
リポソーム）懸濁液を適当な平板状支持体と相互作用させる工程、及び （ii) ポリペプチドタグが金属キレート結合を介して該膜の外側に面してい
る金属キレート残基に結合するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチド
タグに共有結合により付着した固定すべき受容体ドメイン（単数又は複数）を該
膜と相互作用させる工程、 を含む方法を提供する。
【００２９】 両親媒性分子は通常親水性「頭」部 と一つ以上の疎水性「尾」を有する界面
活性分子である。界面活性剤は既知のタイプ、即ち、陽イオン性（例えば、第四
級アンモニウム塩）、陰イオン性（例えば、オルガノスルホネート塩）、両イオ
ン性（例えば、リン脂質：ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノール
アミン）、膜を覆う脂質、又は非イオン性（例えば、ポリエーテル物質）のいず
れでもよい。
【００３０】 この膜は一つ以上の両親媒性分子から構成されうる。好ましい実施態様では、
この膜は第一のリン脂質と第二のリン脂質とから構成される。
【００３１】 こうして、好ましい形では、本発明は、受容体ドメインが膜中の生体分子との
相互作用を容易にするため横に移動できるように、受容体ドメインを脂質膜の上
に固定する方法であって、 （i) 下記の工程のいずれかにより適当な平板状支持体の上に膜を形成させる工
程、 （ａ） 両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と該支持体を接触させてインキュベ
ートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結合的付着により
変えられたものである工程、次いで水又は水性緩衝液の添加により膜を形成する
工程、 （ｂ） 第一のリン脂質及び第二のリン脂質から形成されるミセル（例えば、
リポソーム）の懸濁液を形成させる工程であって、該第二のリン脂質がニトリロ
トリ酢酸（ＮＴＡ）の共有結合的付着により改変されたものである工程、次いで
リン脂質膜層を形成させるのに十分な時間及び条件の下で該ミセル（例えば、リ
ポソーム）懸濁液を適当な平板状支持体と相互作用させる工程であって，この工
程中に該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液の第二リン脂質に結合したＮＴＡ
残基の一部が該膜の外部表面に向けられるものである工程、及び （ii) ポリペプチドタグがＮＴＡ−金属キレート結合を介して該膜の外部に面
するＮＴＡ残基に結合するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタグ
に共有結合的に付着している固定すべき受容体ドメイン（単数又は複数）を該膜
と相互作用させる工程、 を含む方法を意図する。
【００３２】 本発明のこの側面の方法は、膜外の又は膜貫通の受容体ドメインを固定するた
めに特に有用である。
【００３３】 さらに好ましい形では、第一のリン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）であ
り、そして第二の脂質はホスファチジル−エタノールアミン−ＮＴＡ（ＰＥ−Ｎ
ＴＡ）であり、そしてＰＣ：ＰＥ−ＮＴＡ（ｗ／ｖ）は約１０：１である。しか
しながら、第一のリン脂質は脂質層を形成できるいかなるリン脂質又は炭化水素
でもよく、そして第二リン脂質は受容体ドメインの上に適当に工学されたタグを
用いて該ドメインを固定するために使用できる金属キレート頭部基を持ついかな
る脂質であってもよい。さらに、第一リン脂質と第二リン脂質の割合は該膜層の
上で達成すべき受容体ドメイン分子の所望の密度に応じて変えることができる。
【００３４】 本発明の一つの形では、該支持体は光学バイオセンサーキュベットのガラス様
検出表面又は原子間力電子顕微鏡法による分析に適する雲母表面である。この支
持体は平板なガラス若しくは雲母の表面であるが、支持される平板な脂質膜層の
ための基板を形成できるいかなる表面であってもよい（６、９、１０）。
【００３５】 別の一つの形では、この表面はガラス、金又は炭化水素を含む化合物（例えば
、オクタデシルトリクロロシラン及びオクタデカンチオール）の溶液と反応でき
、該表面に炭化水素の鎖を付着できるいかなる物質の層でもよい。この炭化水素
の鎖は、リン脂質のミセル（例えば、リポソーム）懸濁液と反応して平板な膜層
を形成できる脂質単分子層又は疎水性表面を形成するため該支持体の表面から外
に向いている（６、９、１０）。これらの形では、該ミセル（例えば、リポソー
ム）懸濁液の第二リン脂質に付着しているＮＴＡ残基は該膜の表面から外に向い
ている。このような表面は、膜の上に固定された受容体ドメインと溶液中のリガ
ンド分子との相互作用をモニターできる光学バイオセンサーの検出表面でありう
る。
【００３６】 該ポリペプチドタグは、ヘキサ−ヒスチジン分子などの少なくとも６個のアミ
ノ酸残基の配列を含むことが好ましいが、ＮＴＡなどの金属キレート基を含む脂
質の金属キレート成分と複合体の形成により強く結合できるいかなるアミノ酸配
列でもよい。本発明の一つの適用では、該分子は転写因子分子である。本発明の
別の一つの形では、該分子は受容体である。より具体的には、該受容体はヒト細
胞表面分子ＣＤ４又はヒトII型ＭＨＣ分子、又はこのような受容体のドメインで
ある。
【００３７】 従って、別の一側面では、本発明は受容体とリガンドの間の相互作用を検定す
る方法であって、下記の工程、即ち （Ａ） 下記の工程により膜に受容体を固定する工程、 （i) 下記の工程のいずれかにより適当な平板状支持体の上に膜を形成する工
程、 （ａ） 該支持体を、両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と、ある期間接触さ
せてインキュベートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結
合的付着により改変されたものである工程、次いで水又は水性緩衝液の添加によ
り膜を形成する工程、又は （ｂ） 両親媒性分子からミセル（例えば、リポソーム）の懸濁液を形成す
る工程であって、該両親媒性分子の一部が金属キレート基の共有結合的付着によ
り改変されたものである工程、次いで、膜層を形成させるのに十分な時間及び条
件の下で、該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液をガラス若しくは雲母などの
適当な平板状支持体と相互作用させる工程であって、この工程中に該ミセル（例
えば、リポソーム）懸濁液の両親媒性分子に付着した金属キレート残基の一部が
該膜の外部表面に向けられるものである工程、及び （ii) ポリペプチドタグが金属キレート結合を介して該膜の外方に面している
金属キレート残基に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタ
グに共有結合的に付着している固定すべき受容体ドメイン（単数又は複数）を該
膜と相互作用させる工程、 （Ｂ） 該膜上で該受容体分子を相互作用させ及び／又はオリゴマー化させる工
程、及び （Ｃ） 結合が起こるのに十分な時間及び条件の下で、該固定された受容体をリ
ガンドの有効濃度と接触させ、そして該結合を検出する工程、 を含む方法を提供する。
【００３８】 一つの実施態様では、本発明は受容体とリガンドの間の相互作用を検定する方
法であって、下記の工程、即ち （Ａ） 下記の工程により脂質層に受容体を固定する工程、 （i) 下記の工程のいずれかにより適当な平板状支持体の上に膜を形成する工
程、 （ａ） 該支持体を、両親媒性分子の有機溶媒中の溶液と、ある期間接触さ
せてインキュベートする工程であって、該分子の一部が金属キレート基の共有結
合的付着により改変されたものである工程、次いで水又は水性緩衝液の添加によ
り膜を形成する工程、又は （ｂ） 第一のリン脂質及び第二のリン脂質からの小胞の懸濁液を形成する
工程であって、該第二リン脂質がニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレー
ト基の共有結合的付着により改変されたものである工程、及び次いで炭化水素リ
ン脂質膜層を支持体の上に形成させるのに十分な時間及び条件の下で、該ミセル
（例えば、リポソーム）懸濁液をガラス又は雲母などの適当な平板状支持体と相
互作用させる工程であって、この工程で該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液
の第二リン脂質に結合したＮＴＡ残基の一部が該膜の外部表面に向けられるもの
である工程、及び （ii) ポリペプチドタグがＮＴＡ−キレート結合を介して該膜の外側に面し
ているＮＴＡ残基に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタ
グに共有結合により付着している固定すべき受容体ドメインを該膜と相互作用さ
せる工程、 （Ｂ） 該受容体分子を該膜上で相互作用させ及び／又はオリゴマー化させる工
程、及び （Ｃ） 結合が起こるのに十分な時間及び条件の下で、該固定された受容体をリ
ガンドの有効濃度と接触させ、そして該結合を検出する工程、 を含む方法を意図する。
【００３９】 該固体支持体（例えば、金）が、小胞懸濁液からの直接層形成に適当でない場
合には、上の工程（i)から(iii) の工程の前に、該固体支持体の上に単分子膜又
は疎水性表面を形成する固定が置かれる。これは、該固体支持体を、その表面に
炭化水素鎖を付着できる炭化水素含有化合物の溶液と反応させることにより達成
される。その結果、炭化水素の鎖は該支持体の表面から外に向き、脂質単分子層
又は疎水性表面を形成する。この表面は、次に、脂質両親媒性分子ミセル（例え
ば、リポソーム）、好ましくは（上の工程（i)から(ii)のような) ミセル（例え
ば、リポソーム）の懸濁液と、膜層を形成するのに必要な時間及び条件の下で反
応させられる。該金属キレート残基、好ましくは第二リン脂質などの両親媒性分
子に付着したＮＴＡ残基は該膜の外部表面に向いており、そしてヘキサ−ヒスチ
ジンタグ（上の（iii)で記述したように）を持つ分子を固定するために使用しう
る。このような表面は膜の上に固定された受容体ドメインと溶液中のリガンド分
子との相互作用をモニターできる光学バイオセンサーの検出表面であってもよい
。
【００４０】 受容体のオリゴマー化又は自己会合おリガンドへの結合は原子間力顕微鏡法又
は光学バイオセンサー技術により検出される。
【００４１】 本発明は、こうして、雲母、ガラス、金又はたの適当な表面の上に形成された
脂質層の上に、受容体ドメイン、タンパク質、糖タンパク質及び多糖類を固定し
、分子を横に拡散させそして相互作用させる方法を提供する。この技術は、好ま
しい実施態様で、光学バイオセンサー技術及び原子間力顕微鏡技術を用いて、膜
システムにおける、受容体ドメインの相互間の相互作用及び受容体ドメインとリ
ガンド間の相互作用を研究するために理想的である。
【００４２】 受容体ドメインは、標準的組換えＤＮＡ技法を用いて、工学的にヘキサ−ヒス
チジンＣＯＯＨ−尾、又はＮＨ2 −尾を持つようにすることができる。ヘキサ−
ヒスチジンタグは化学的手段により多糖類及び他の分子に共有結合により付着さ
せることもできる。
【００４３】 本発明と関連して用いられる光学バイオセンサーは固体検出表面の上に固定化
された分子と可溶性の巨大分子の結合による屈折率の変化を測定し、この相互作
用する分子達の結合親和性を測定するために使用することができる。ＩＡｓｙｓ
バイオセンサーは検出表面としての共鳴鏡を有する試料キュベットを用いる。Ｉ
Ａｓｙｓバイオセンサーのガラス様検出表面はミセル（例えば、リポソーム）の
懸濁液と反応して該検出表面の上に膜層を形成するには理想的である。
【００４４】 本発明は、金検出表面を利用するＢＩＡコア・表面・プラスモン・共鳴バイオ
センサーと共に用いることもできる。この金はまずオクタデカンチオールと反応
してオクタデカン単分子層を形成し、次いで両親媒性分子から成るミセル（例え
ば、リポソーム）の懸濁液と反応して膜層を形成する。
【００４５】 原子間力電子顕微鏡は限られた数の分子種を含むモデル膜層の上の分子構造を
地図化するために用いることができる。このような層はミセル（例えば、リポソ
ーム）の懸濁液とインキュベートすることにより雲母表面又はガラス表面のいず
れかの上に直接形成することができる。疎水性単分子層も適当な試薬で処理する
ことによりガラス又は金の表面の上に形成することができ、そして単分子層の表
面と両親媒性分子、好ましくはＰＣ及びＰＥ−ＮＴＡの適当な混合物から成るミ
セル（例えば、リポソーム）の懸濁液とを反応させて層を形成させることにより
混成膜層を形成することができる。
【００４６】 本発明のモデル膜システムの上にヘキサ−ヒスチジン標識された受容体を固定
する工程は、リポソーム又は小胞の上に受容体及び他の分子を固定又は植え付け
るために有用である。これらのリポソーム又は小胞は、植え付けられた分子の特
異性により、該リポソームがイン・ビボ投与されると、リポソーム内に封入され
得る薬物、ＤＮＡ／ＲＮＡ又は任意の治療用の作用物質を、特定の細胞又は組織
に標的化しそして送達することができる。組換え分子も、特定の生体効果又は治
療効果を得るためのワクチンを開発する目的で、合成リポソーム又は合成小胞の
上に植え付けることができる。
【００４７】 本発明のこの側面によれば、リポソームの上に分子を植え付ける方法であって
、下記の工程、即ち （i) キレーター脂質を組み込まれ、且つ、薬物若しくは作用物質を封入され
又は封入されないリポソームの懸濁液を調製する工程、 （ii) 該リポソームを、適当な金属親和性タグを保持する組換えタンパク質又
は標的分子とインキュベートする工程、及び （iii) 必要ならば、過剰のタンパク質を洗浄、濾過又は他の洗浄手段により
除去し、それを適当な溶液に懸濁する工程、 を含む方法が提供される。
【００４８】 好ましい実施態様では、該分子は下記の工程、即ち （i) ＮＴＡ−ＤＴＤＡのそれにほぼ等しい濃度のＮｉ2+又はＺｎ2+を含むＰ
ＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）などの水性溶液中の約０．５ｍＭのジ−テトラデシ
ルアミンニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）及び１−パルミトイル−２−オ
レオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などのキレーター脂質の適当な混
合物からリポソームの懸濁液を調製する工程。このリポソームはＴｍより高い温
度で５〜１０分間該混合物を超音波処理することにより調製できる。または、該
リポソームは該脂質をエタノール溶液に溶解し、次いで水性緩衝液に分散させる
ことにより、又は脂質の水性懸濁液（acqeous suspension) を適当な孔サイズの
ポリカーポネート若しくは類似のフィルターを通して押し出すことによっても調
製できる。典型的には、ＮＴＡ−ＤＴＤＡ：ＰＯＰＣの割合は、５：１であるが
、異なっていてもよい、 （ii) ペレット化（４℃で約９５，０００×ｇで３０分間の遠心分離により
）することにより該リポソームを洗浄しそしてその上清を除去する工程、又は濾
過により洗浄する工程、そして次いで標識化タンパク質（単数又は複数）とのイ
ンキュベーションを容易にするため緩衝溶液の適当容量に該リポソームを懸濁す
る工程、 (iii) 該リポソームを、組換えタンパク質（例えば、ヒトヘキサ−ヒスチジ
ン標識ＶＥＧＦ，血管内皮成長因子）、又はそれぞれが該リポソーム上にそれを
固定させるためのヘキサ−ヒスチジン若しくは他の適当な金属親和性タグを保持
する異なる組換えタンパク質の組合せとインキュベートする工程、及び （iv) 上の工程（ii) におけるように、該リポソームを洗浄することにより
過剰の可溶性タンパク質又は組み込まれなかった可溶性タンパク質を除去し、次
いでイン・ビボ投与に適するＰＢＳ若しくは他の緩衝溶液にそれを懸濁する工程
、 によりリポソーム上に固定又は植え付けることができる。
【００４９】 他の組合せ及び異なる脂質も該キレーター脂質と関連して該リポソームに特異
的性質を付与するために使用することができる。例えば、ガングリオシドＧＭ１
又はポリエチレングリコール誘導体を該混合物（上の工程（i)の) に含め、イン
・ビボワクチンとして使用される場合、マクロファージにより又は肝臓や脾臓に
より捕らえられるのを避けるための「忍び（stealth)」性（１２）を持つリポソ
ームを作成することができる。また、工程（i)は、該物質を封入し、イン・ビボ
投与されるとき、植え付けられた分子（単数又は複数）の特異性により規定され
る特定の細胞又は組織に送達されることが可能なように、薬物、ＤＮＡ又は他の
治療用の作用物質の存在下に行うことができる。例えば、ＶＥＧＦ（血管内皮成
長因子）が植え付けられたリポソームはＶＥＧＦ受容体を発現することが知られ
そして腫瘍成長に要求される血管形成性内皮を標的とするために使用できる。従
って、ＶＥＧＦが植え付けられたリポソームは、腫瘍成長のために必要な新血管
の成長を阻止できる細胞障害性薬物若しくは作用物質を送達するために使用する
ことができる。上記細胞障害性薬物若しくは細胞障害性作用物質はリポソームの
内部に封入される。
【００５０】 病気への免疫（例えば、腫瘍への免疫応答、以下を見よ）を変えるためのワク
チンとして使用するため細胞の表面を改変する現行の方法は、該細胞の表面上で
一つ以上の特異的タンパク質（単数又は複数）を発現するように細胞を誘導する
ため、一般に、腫瘍細胞のトランスフェクション又は遺伝的操作を必要とする（
１３〜１５）。例えば、動物腫瘍モデル及びヒト腫瘍モデルの両方で、細胞表面
でＢ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ４０及びＩＣＡＭ−１な
どのＴ細胞共刺激分子を発現するように細胞を誘導する遺伝子を持つ腫瘍細胞の
トランスフェクションが、腫瘍保持宿主の腫瘍免疫を増強するためのワクチン接
種に使用する細胞を調製する有用なアプローチであることが証拠により、示唆さ
れる（１６〜２２）。不幸にも、ヒトの癌の治療におけるような臨床的設定では
、このようて遺伝子を持つ腫瘍細胞のトランスフェクションは時間が掛かり且つ
不便である。こうして、トランスフェクションの頻度は一般に低く、そして複数
遺伝子のトランスフェクション（腫瘍細胞の表面で複数のタンパク質の発現を誘
導すること）を首尾よく行うことは困難である。さらに、トランスフェクション
技法は、一見無害なウイルスベクターを用いて行うときでさえも、該遺伝子の発
現又はゲノムへのその組み込みを正確に制御することの困難さのため患者への危
険を伴うことになる。
【００５１】 本発明は、ヒトにおける腫瘍や他の疾病への免疫を増強し又は改変するための
ワクチンとして使用できる（腫瘍細胞などの）細胞及び他の膜構造物（生体又は
合成いずれかの）の表面に、共刺激分子若しくは他の分子を直接植え付けるより
便利で安全な方法をさらに提供する。
【００５２】 分子間相互作用を検定するためモデル膜システムの上に受容体を固定し薬物を
スクリーニングする方法は、一旦、キレーター脂質（例えば、ＮＴＡ−ＤＴＤＡ
）が該膜に組み込まれ、それによりヘキサ−ヒスチジン又は他の適当な金属親和
性タグを持つ組換え分子を膜表面に直接植え付ける便利な方法を提供する場合は
、分子を生体膜（例えば、細胞の膜若しくは細胞レベル下の粒子の膜）の上に直
接固定し又は「植え付ける」ために使用できる。
【００５３】 本発明のこの側面では、組換え分子を直接生体膜の上に固定し又は植え付ける
方法であって、下記の工程、即ち （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 （ii) 細胞又は生体膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュ
ベートする工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該膜構造物を適当な金属親和性タグを持つ組換えタンパク質又は標的
分子とインキュベートする工程、及び （v) 過剰の可溶性タンパク質又は未結合の可溶性タンパク質を洗い流し、そ
して該構造物をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程、 を含む方法が提供される。
【００５４】 好ましい実施態様では、本発明は下記の方法、即ち （i) 細胞又は膜構造物の懸濁液を、ＰＢＳ又は他の水性緩衝溶液で洗浄して
過剰の可溶性タンパク質及び／又は緩く結合しているタンパク質を除去する工程
。これは適当な遠心分離（例えば、ネズミ及びヒトの細胞では２００〜５００×
ｇで５分）により該構造物をペレット化し、次いでこれをＰＢＳに再懸濁するこ
とにより行われる。構造物によっては、過剰の可溶性若しくは緩く結合したタン
パク質は濾過又は他の洗浄手段により除去されうる。 （ii) ＰＢＳ溶液中の脂質の適当量を５〜１０分間超音波処理することによ
り、ほぼ等しい濃度のＺｎ2+か又はＮｉ2+を含むＰＢＳ中のキレーター脂質（例
えば、約０．１ｍＭの濃度のＮＴＡ−ＤＴＤＡ）の懸濁液を調製する工程。膜構
造物の中にリポソームの融合及び組み込みを促進するため、他の脂質又はリン脂
質（例えば、ＰＯＰＣ）又は他の試薬を該キレーター脂質と共に含めることもで
きる、 （iii) 懸濁液中の脂質の一部を該構造物中に融合及び／又は組み込ませるの
に適当な時間及び温度（例えば、３７℃で３０分）の下で、該細胞又は膜構造物
をＰＢＳ中のキレーター脂質（例えば、０．１ｍＭのＮＴＡ−ＤＴＤＡ）の懸濁
液とインキュベートする工程。採用されたインキュベーション条件は、使用する
キレーター脂質の性質及び脂質が組み込まれる具体的膜構造物に適合するように
変えることができる。また脂質の融合及び組み込みを促進するため、インキュベ
ーション又は洗浄工程をポリエチレングリコールなどの添加物を含む緩衝液中で
行うこともできる。 （iv) 上の工程（i)におけるように、ペレット化及び洗浄によりＰＢＳで膜
構造物を洗浄することにより、混合物から組み込まれなかった脂質を除去する工
程、 （v) 組み込まれたキレーター脂質を含む洗浄された構造物を、組換えタンパ
ク質の溶液、又はそれぞれがヘキサ−ヒスチジン又は任意の他の適当な金属親和
性タグを含む異なる組換えタンパク質の混合物の溶液とインキュベートする工程
、及び （vi) （上の工程（i)におけると同様に）ＰＢＳで該細胞又は構造物を洗浄
して過剰な又は結合していない可溶性組換えタンパク質を除去する工程、 から成る方法を用いて細胞及び他の膜構造物の上に分子を植え付けることを可能
とする。
【００５５】 同様な手順は、標識したタンパク質を任意の細胞又は細胞レベル下の膜成分に
植え付けるために使用できる。このように処理された構造物は植え付けられたタ
ンパク質により改変された表面を含み、そしてイン・ビボの免疫学的応答を変え
るためのワクチン接種に用いることができる。イン・ビボ投与されるとき、この
構造物は体内の特定の細胞型又は組織を標的化するために使用し、それによりこ
れらの細胞の機能を変えることができる。例えば、樹状突起細胞上の受容体と結
合することが知られている分子を腫瘍細胞に植え付ける方法は、腫瘍抗原提示、
従って該腫瘍に対する免疫学的応答の増強を目的として、植え付けられた腫瘍細
胞を樹状突起細胞へ向けるために採用することができる。
【００５６】 この形において、本発明は、組換え受容体及び他の分子を、細胞の膜などの生
体膜の上に直接固定し又は植え付け、従ってこのような膜の特性を改変する方法
を意図する。とりわけ、本発明は、キレーター脂質を組み込み得る、細胞（例え
ば、腫瘍細胞）、任意の細胞の膜成分若しくは細胞レベル下の膜成分、感染体又
は感染粒子（例えば、細菌）の表面、並びに任意の生体膜又は合成小胞若しくは
リポソームを含む合成膜の表面を改変するための便利な戦術の基礎を提供する。
これらの全ての例において、組換えタンパク質はタンパク質上のぺプチドタグと
膜構造物中に組み込まれたキレーター脂質の上のＮＴＡ頭部基との間の金属キレ
ート結合の形成により植え付けられる。生体膜は適当なタグを持つ任意の組換え
タンパク質、糖タンパク質及び任意の他の分子構造物の固定により改変され、そ
してイン・ビボ投与される場合、ワクチンとしてか又はこれらの生体膜の特定の
細胞及び組織への送達を標的化するための試薬として使用される場合、疾病への
免疫を増強するように設計される。
【００５７】 本発明のこの側面に適当な分子の例としては、治療用分子、薬学的化合物及び
ＲＮＡやＤＮＡなどの核酸分子が挙げられる。特に有用な分子はＶＥＧＦ又はそ
の同族体である。ＶＥＧＦ及びその同族体はＶＥＧＦ受容体を保持する細胞へリ
ポソームを標的化するのに有用でもある。従って、本発明のこの側面により意図
される分子には、標的組織上に結合相手を有する分子が含まれる。該分子はリポ
ソーム内に植え付けられ、固定され又は封入されることが好ましい。
【００５８】 本発明のさらなる側面は、標的細胞の免疫原性を変える方法を提供する。これ
は、外来ポリペプチド、多糖類、糖タンパク質、受容体、リガンド、及び他の分
子を導入することにより容易に達成されうる。腫瘍細胞などの細胞の免疫原性を
変えることは腫瘍細胞に対する免疫応答を増強する手段として有用である。
【００５９】 従って、本発明の別の一側面は、標的細胞又はその膜成分の免疫原性を変える
方法であって、下記の工程 (i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 (ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベート
する工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該膜構造物を、固定すべき該分子の溶液とインキュベートする工程、
及び （v) 過剰の可溶性分子又は結合していない可溶性分子を洗い流し、且つ該
構造物をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程、 により該標的細胞の膜に分子を固定する工程を含む方法を意図する。
【００６０】 さらに具体的実施態様においては、本発明は、リポソーム又は膜構造物を特定
の細胞型又は組織に標的として向かわせる方法であって、標的化の対象となる特
定の細胞若しくは組織の上に結合相手を有する分子を下記の工程、即ち （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 （ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液を、キレーター脂質の懸濁液とインキュベー
トする工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該リポソーム又は膜構造物を、固定すべき分子の溶液とインキュベート
する工程、及び （v) 過剰の又は結合していない可溶性分子を洗い流し、そしてイン・ビボ投
与に適する溶液に該構造物を懸濁する工程、 により固定し若しくは植え付ける工程を含む方法を意図する。
【００６１】 上述したように、本発明の方法は細胞の免疫原性を変える方法を提供する。従
って、本発明は、活性物質及び任意選択的に固定され又は植え付けられた、結合
相手又は標的組織を有する分子を含むリポソーム調製物又は膜物質の有効量を被
験者に投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００６２】 活性物質の例としては、組換えポリペプチド、共刺激分子、治療用薬物又は核
酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。一つの例では、ＶＥＧＦがリポ
ソームに組み込まれ、腫瘍の成長に必要な新血管の成長を阻止するため、細胞障
害性薬物を標的化する。
【００６３】 本発明の別の一側面は、ワクチンが投与される被験者の免疫学的応答を改変で
きる分子が植え付けられた細胞又は膜物質を含むワクチン組成物であって、該ワ
クチンが一つ以上の薬学的担体及び／又は希釈剤をさらに含むものである組成物
を提供する。細胞又は膜物質に植え付けられる分子は共刺激分子であることが好
ましい。さらに、該ワクチンは下記の工程、即ち （i) 細胞又は膜物質をＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのキレーター脂質とインキュベ
ートして該脂質を該細胞又は膜に組み込ませる工程、 （ii) 組み込まれていない脂質を遠心分離又は濾過により洗い流し、該構造物
の懸濁液を適当な溶液又は緩衝液に再懸濁する工程、 （iii) キレーター脂質が組み込まれた該膜構造物を、植え付けるべき該分子と
インキュベートする工程、及び （iv) 組み込まれなかった分子物質を洗い流す工程、 により製造することが好ましい。
【００６４】 従って、本発明は、ＮＴＡ−ＤＴＤＡのようなキレーター脂質の腫瘍細胞膜へ
の組み込み、それに続く適当な標識を持つ組換え共刺激分子及び／又は他の分子
（又は分子の組合せ）を植え付けることを可能とし、腫瘍免疫を増強するための
細胞系ワクチンの開発における便利なアプローチでありうる。従って、その証明
された腫瘍免疫を変える能力と同様に、本技術は、特定の共刺激分子及び／又は
他の細胞表面分子（又はこのような分子の組合せ）を、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び樹状
突起細胞などの他の細胞型の上に植え付け、このような分子が免疫機能を調節す
る際にどのような役割を果たすかを調べるための便利なアプローチを提供するこ
とも期待できる。従って、癌免疫治療法におけるその潜在的使用に加え、本明細
書に記述した技法は免疫機能のわれわれの理解を顕著に高めうるであろう分野へ
の適用も生ずる。
【００６５】 本発明は動物における免疫応答を改変するための医薬の製造における、薬物が
植え付けられ、封入され及び／又は固定された膜システムの使用をさらに提供す
る。
【００６６】 本発明の好ましい動物はヒト、霊長類、家畜、実験室試験動物及び捕獲された
野性動物である。
【００６７】 「固定する」及び「植え付ける」などの用語は、本明細書を通じて相互変換可
能なように使用されうる。「植え付ける」という用語は「移植する」という用語
も包含する。「膜」及び「脂質膜」という用語は脂質層と同様に生体膜及び合成
膜への言及を含む。「層」又はその複数形である「層（layers) 」という用語は
単分子膜層及び二分子膜層などの複分子膜層を含む。「キレーター脂質」は、Ｎ
ＴＡ−ＤＴＤＡなどの適当なキレーター脂質であるが、これに限定されない。
【００６８】 下記の材料及び方法は、以下に述べる実施例のいくつかに関する。
【００６９】試薬 分析等級の試薬を全実験で用いた。パラホルムアルデヒドはＢＤＨケミカルズ
社から入手した。ＺｎＳＯ4 は緩衝液及び増殖培地へのＺｎ2+の添加全てに使用
した。ＲＰＭＩ１６４０及びＥＭＥＭ（イーグルス最小必須培地）の両方はギブ
コ社（ライフ・テクノロジーズ、メルボルン、オーストラリア）から入手した。
胎児仔牛血清（ＦＣＳ）はトレース・サイエンティフィック社（ノーブル・パー
ク、ビクトリア州、オーストラリア）から入手した。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビ
オチンはピアス社（ロックフォード、イリノイ州）から入手した。Ｎａ51ＣｒＯ 4 、［ 3Ｈ］−チミジン、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
共役ストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ）はアマーシャム社（
英国）から入手した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ
）、α−パルミトイル−β−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、イソパーク（Isopaque）
、フィコール、プロピルガレート（propyl gallate）、並びにポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）調製物のＰＥＧ400 、ＰＥＧ600 、ＰＥＧ900 、及びＰＥＧ15 00 は、シグマ−アルドリッチ社（キャッスル・ヒル、ニューサウスウェールズ、
オーストラリア）から入手した。マイクロサイント（MicroScint）シンチレーシ
ョン液並びにトップカウント（Topcount）ＮＸＴマイクロプレートシンチレーシ
ョンカウンターとともに使用する９６穴プレート用のフィルター及びシールなど
他の品目は、キャンベラ・パッカード社（キャンベラ、オーストラリアン・キャ
ピタル・テリトリー、オーストラリア）から入手した。
【００７０】マウス及び細胞系統 雌及び雄のＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｈ−２d ）は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞細胞障害
の測定、並びにワクチン接種及びインビボでの腫瘍成長の観察のためのリンパ組
織（脾臓）の単離に用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｈ−２ｂ）はＴ細胞増殖
の同種異系刺激を評価する実験に用いた。このマウスは６〜８週齢で使用しアニ
マル・ブリーディング・エスタブリッシュメント、ジョン・カルティン・スクー
ル・オブ・メディカル・リサーチ（ＪＣＳＭＲ）、オーストラリア国立大学（Ａ
ＮＵ）、キャンベラから入手した。マウス細胞系統のＰ８１５[ マウスＤＢＡ／
２（Ｈ−２d ）マスト細胞腫] 及びＥＬ４[ マウスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b ）
] Ｔ細胞リンパ腫は、それぞれピイ・ヴァーリング博士（免疫学及び細胞生物学
の部門、ＪＣＳＭＲ）及びエイチ・オニール博士（生化学及び分子生物学の部門
、ＡＮＵ）から得た。両細胞系統は１０％v/v のＦＣＳを含有するＥＭＥＭから
成る完全培地で培養した。
【００７１】ＮＴＡ−ＤＴＤＡの合成 ジテトラデシルアミン（ＤＴＤＡ）に共有結合したニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ
）の頭部基から成るキレート剤−脂質のニトリロトリ酢酸ジテトラデシルアミン
（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）は、先述したもの（２５）と同様な手順に従ってシイ・イ
ーストン博士（リサーチ・スクール・オブ・ケミストリー、ＡＮＵ）により合成
された。簡潔に述べれば、このＤＴＤＡはブロモテトラデカン及びアンモニアか
ら合成した。次いで、ＤＴＤＡは無水コハク酸でＮ−スクシニル化し、Ｎ−スク
シニル−ＤＴＤＡ（ＤＴＤＡ−ｓｕｃ）を生産し、これをＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（ＮＨＳ）と反応させ、Ｎ−[ （ヒドロキシスクシンイミジル）スクシ
ニル] −ＤＴＤＡ（ＤＴＤＡ−ｓｕｃ−ＮＨＳ）を生産した。ＤＴＤＡ−ｓｕｃ
−ＮＨＳのスクシンイミジル基はＮα−タアト−ブチルオキシカルボニル−リシ
ン（Ｎ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ）基で置換し、このブチロキシカルボニル（Ｂｏｃ）基
を取り除いてＮε−[ （ＤＴＤＡ）スクシニル] −Ｌ−リシン（ＤＴＤＡ−ｓｕ
ｃ−Ｌｙｓ）を生産した。最後にＤＴＤＡ−ｓｕｃ−Ｌｙｓはブロモ酢酸と反応
させＮα，Ｎα−ビス[ カルボキシメチル] −Ｎε−[ （ＤＴＤＡ）ｓｕｃ] −
Ｌ−リシンを生産し、これをＮＴＡ−ＤＴＤＡと呼ぶ。各産物の純度は薄層クロ
マトグラフィーにより測定し、最終産物の同定は核磁気共鳴分光法、フーリエ変
換赤外分光法、及び質量分光法により確認した。最終産物の純度は９９％を上回
ると見積もられた。
【００７２】ＮＴＡ−ＤＴＤＡリポソーム懸濁液の調製 ＮＴＡ−ＤＴＤＡを細胞内へ組み込むため、乾燥させたＮＴＡ−ＤＴＤＡは、
最大振幅で２分間ＴＯＳＣＯ１００Ｗ超音波破砕器による音波処理により、0 ．
5 ｍＭのＺｎ2+を含有するＰＢＳ中に0 ．5 ｍＭの濃度になるよう懸濁した。こ
の同一手順は、ＤＭＰＣ懸濁液、並びにＮＴＡ−ＤＴＤＡとＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ
、又はＤＯＰＥとの混合液を作製するために用いた。脂質の保存用懸濁液は−２
０℃で貯蔵し、実験の使用前に常に再音波処理し指示濃度まで希釈した。
【００７３】モノクローナル抗体 該モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びそれらの起源は下記の通りであった：マ
ウス抗−ＣＤ４０（クローン３／２３、ラットＩｇＧ2a）及びマウス抗−ＣＤ３
（クローン１４５−２Ｃ１１、アメリカハムスターＩｇＧ）のｍＡｂは両方とも
ファーミンゲン社から入手した；マウス抗−Ｂ７．１（クローン１６−１０Ａ１
、アメリカハムスターＩｇＧ）ｍＡｂはケイ・ショートマン博士、ＷＥＨＩ、メ
ルボルンにより快く提供された。指摘する場合、ｍＡｂは先述したように（２６
）スルホ−ＬＣ−ビオチン（ピアス社）と反応させることによりビオチン化した
。
【００７４】組換えタンパク質 マウスＴ細胞共刺激分子のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＣＤ４０の細胞外領域、
並びにヒトのエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）の細胞外領域の組換え形態は
、各々がヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）タグを備えており、それぞれＢ７．１−
６Ｈ、ＣＤ４０−６Ｈ、及びＥＰＯＲ−６Ｈと示し、バキュロウイルス発現系を
用いて生産した。簡潔に述べれば、マウスのＢ７．１、ＣＤ４０及びＥＰＯＲの
細胞外ドメインをコードする遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増
幅し、６Ｈｉｓタグの配列は該タグ配列を含むプライマーを用いたＰＣＲにより
各遺伝子の末端（該タンパク質のカルボキシル末端に対応する）内に組み込んだ
。次いで、該構築物は個々に該ｐＶＬ１３９３プラスミドバキュロウイルストラ
ンスファーベクター内に連結し大腸菌を形質転換するために用いた。適切な形質
転換体を選別し、これらの形質転換体から得た組換えｐＶＬ１３９３プラスミド
は該バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶとともにＳＦ９昆虫細胞内に共トランスフェ
クションした。ｐＶＬ１３９３プラスミドをウイルスゲノム内に組込ませたウイ
ルスに感染した細胞は、プラーク検定により選別し、更に増幅し、これらのウイ
ルス保存液はエクスプレス−５培地中で増殖させたハイ−５昆虫細胞を感染させ
るために使用した。組換えタンパク質は、Ｎｉ2+−ＮＴＡ親和クロマトグラフィ
ー（Ｎｉ2+−ＮＴＡスーパーフローを用いる、キアーゲン社、シフトン・ヒル、
ビクトリア州、オーストラリア）後、スーパーデックス−７５ＨＲ１０／３０カ
ラムを用いてＦＰＬＣ（ファルマシア・バイオテク社、アップサラ、スウェーデ
ン）上でのサイズ排除ゲル濾過により組換えウイルスに感染したハイ−５細胞の
上清から精製した；各タンパク質の最終純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断して
＞９５％であった。幾つかの実験用に、組換えタンパク質は先述したように（２
６）スルホ−ＬＣ−ビオチン（ピアス社）と反応させることによりビオチン化し
た。このタンパク質は０．２〜０．６ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に常套的に−
２０℃で保存した後、各実験の使用前に３７℃で解凍し穏やかにボルテックスし
た。
【００７５】ＮＴＡ−ＤＴＤＡ組み込み並びに組み込みの最適化 培養したＰ８１５腫瘍細胞はＰＢＳ中で二回洗浄し、該培地からタンパク質を
得て１×１０7 細胞／ｍＬになるようＰＢＳ中に懸濁した。次いで、該細胞は、
９６穴Ｖ字底のセロクラスタープレート（コースター、コーニング社、ニューヨ
ーク）内に１．８×１5 細胞／穴で分注し、１２５μＭのＺｎ2+を含有するＰＢ
Ｓ中で１２５μＭのＮＴＡ−ＤＴＤＡ（単独で又は指示した他の脂質との混合物
として）又は１２５μＭのＤＭＰＣ（対照）とともに３７℃で４０分間インキュ
ベートした。インキュベーション後、組み込まれていない脂質は０．１％v/v の
ＢＳＡ（ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで三回洗浄することに
より取除いた。組み込まれたＮＴＡ−ＤＴＤＡの相対レベルは、該細胞をビオチ
ン化６Ｈｉｓペプチド（Ｂ−６Ｈｉｓ）（０．２μｇ／ｍＬ）とともに４℃で３
０分間インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄し、次いでス
トレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した後、ＦＡＣＳ分析（以下を参照）により
常套的に評価した。該細胞は、１％v/v のＢＳＡ（ＰＢＳ−１％v/v ＢＳＡ）を
含有するＰＢＳ中で４℃で３０分間ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（３３μｇ／
ｍＬ）とともにインキュベートし、ＰＢＳ−１％v/v ＢＳＡで三回洗浄し、ＰＢ
Ｓ中で２％v/v のパラホルムアルデヒドで固定した後、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣ
−フルオレセンスについて分析した。
【００７６】 ＮＴＡ−ＤＴＤＡリポソームの融合を促進するため、従って細胞膜内へのＮＴ
Ａ−ＤＴＤＡの組み込みを促進するため、細胞と脂質層をもつ小胞との融合を強
力にすることが以前に報告されている幾つかの薬剤を試験した。上述した９６穴
Ｖ字底のセロクラスタープレート内に分注されたＰ８１５細胞は、１２５μＭの
ＮＴＡ−ＤＴＤＡ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、若しくはＤＯＰＥとともに、又は１２
５μＭのＮＴＡ−ＤＴＤＡとＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、若しくはＤＯＰＥ（示したモ
ル比で）とともに、３７℃で４０分間１２５μＭのＺｎ2+を含有するＰＢＳ中で
インキュベートした。幾つかの実験用に、該細胞はインキュベーション後にＰＥ
Ｇで処理した。即ち、該細胞は、ペレット化し、１５％のＰＥＧ400 中に懸濁し
、無血清ＥＭＥＭと混合し１０倍に希釈した後、血清を含有するＥＭＥＭで一回
、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄し、ビオチン化組換えタンパク質（以
下参照）を該細胞に植え付けられた後、ＦＡＣＳ分析用に上記のストレプトアビ
ジン−ＦＩＴＣで染色した。
【００７７】組換えタンパク質を細胞上に植え付ける 組み込まれたＮＴＡ−ＤＴＤＡを含む細胞は、精製されたＢ７．１−６Ｈ及び
ＣＤ４０−６Ｈ（又は示したようにこれらのビオチン化形態）と、単独（それぞ
れ５０μｇ／ｍＬで）又は組合わせ（１００μｇ／ｍＬの全タンパク質、４：１
のＢ７．１−６Ｈ：ＣＤ４０−６Ｈモル比）のいずれかで、４℃で１時間、９６
穴Ｖ字底のセロクラスタープレート内でインキュベートした。次いで、未結合の
タンパク質は、該タンパク質を植え付けられた細胞を免疫又はＴ細胞増殖検定の
いずれかで用いる前に、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄することにより
除去した。ＦＡＣＳ分析により結合タンパク質のレベルを決定する実験用に、該
細胞は、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（植え付けられビオチン化されたタンパ
ク質を保持する細胞について）で染色した、又はまず適切なビオチン化ｍＡｂ（
Ｂ−ｍＡｂ）で（４℃で３０分間）インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％v/v Ｂ
ＳＡで二回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。
【００７８】時間経過 植え付けられたＣＤ４０−６Ｈの存在下又は不在下でＮＴＡ−ＤＴＤＡ及びＤ
ＭＰＣを組み込んだ細胞を、１０％v/v のＦＣＳ及び５０μＭのＺｎ2+を含有す
るＥＭＥＭ中に懸濁し、３７℃で約２分間（時間０）、若しくは４分間若しくは
２４時間、１２穴平底の組織培養用プレート（リンブロ、ＩＣＮバイオメディカ
ル社、オーロラ、オハイオ州）でインキュベートした。上記のインキュベーショ
ン時間後に、細胞は該１２穴平底プレートから回収し、９６穴Ｖ底型セロクラス
タープレートに移し、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄した。その後、（
ＮＴＡ−ＤＴＤＡ及びＢ−ＣＤ４０−６Ｈを植え付けられた細胞について）スト
レプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した、又は（ＮＴＡ−ＤＴＤＡのみを含む細胞
について）まずＢ−ＣＤ４０−６Ｈでインキュベートした後ＰＢＳ−０．１％v/
v ＢＳＡで洗浄しストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。
【００７９】フローサイトメトリー 蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析は、Ｂ−６Ｈｉｓの結合後に細胞膜内
に組み込まれたＮＴＡ−ＤＴＤＡの相対レベル、並びに組み込まれた該ＮＴＡ−
ＤＴＤＡを介して該細胞表面に固定されたビオチン化組換えタンパク質のレベル
を定量するために用いた。フローサイトメトリー分析は、１５ｍＷのアルゴンイ
オンレーザーを備えたＦＡＣソートフローサイトメーター（ベクトン・ディッキ
ンソン社、サンジョゼ、カリフォルニア州）を用いて実施した。細胞は、前方光
散乱（ＦＳＣ）、側方光散乱（ＳＳＣ）及びＦＩＴＣ蛍光に基づいて分析した。
バックグラウンドより上の蛍光強度における相関シフトは、ＮＴＡ−ＤＴＤＡ組
み込みのレベル及び細胞表面上のペプチド又は組換えタンパク質のレベルの半定
量的測定を提供する。通常、10,000個の細胞の蛍光情報は対数増幅器を用いて各
状態について集められ、データはセルクエスト（ベクトン・ディッキンソン社）
ソフトウェアを用いて処理された。データは、ＦＳＣ対ＳＳＣのドットプロット
により判断されるように生細胞をゲーティングし、蛍光プロファイルをヒストグ
ラムとしてプロットすることにより分析した。該対照試料をバックグラウンドと
して使用しピークからピークまでの蛍光強度のシフトを測定することにより、バ
ックグラウンドより上の蛍光強度の増加が決定された。次いで、独立実験の結果
は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
【００８０】共焦点顕微鏡法 Ｐ８１５細胞の表面上の該ＮＴＡ−ＤＴＤＡの分布は、ビオチン化ＣＤ４０−
６Ｈを植え付けられたＮＴＡ−ＤＴＤＡを組み込んだ細胞を用いてレーザー走査
型共焦点顕微鏡法により研究し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。簡
潔に述べれば、該細胞は、包埋液（８７％v/v のグリセロール中２％のプロピル
ガレート）に懸濁し、穴をあけたスコッチ４６５粘着性転写テープを用いて形成
された顕微鏡スライド上の深さ0.05ｍｍのチャンバー内に入れ、次いで該チャン
バーはガラスカバー片で密封した。この細胞は、ニコン共焦点蛍光顕微鏡（×６
０ニコン対物レンズ）、バイオラッドＵＶレーザースキャナー、及びアルゴンイ
オンレーザーを備えたイオンレーザーテクノロジーレーザーヘッド（モデル５４
２５、バイオラッド社）から成るＭＲＣ−５００レーザー走査型共焦点画像シス
テム（バイオラッド社）を用いて５２０ｎｍの蛍光について調べた。該画像は、
１０の連続的なレーザー走査のカルマン平均により得て、イメージプロセッサー
ＰＣ（バイオラッド社）を用いて保存し分析し、ＮＩＨイメージ１．６１ソフト
ウェアを用いて処理した。
【００８１】Ｔ細胞増殖検定 Ｔ細胞増殖検定で使用するマウスＴ細胞は、上記の同種異系マウス又は同系マ
ウスのいずれかの脾臓から単離し精製した。簡潔に述べれば、該脾臓は単細胞懸
濁液に解離し、死細胞及び赤血球細胞はイソパーク−フィコール勾配を用いる密
度勾配遠心分離により取除いた。遠心分離（４００×ｇで２０分間）後、主にリ
ンパ球の生細胞は、該勾配の最上層から回収し、１０％v/v のＦＣＳ、５×１０ -5 Ｍの２−β- メルカプトエタノール、１００i.u.／ｍＬのペニシリン、１００
μg ／ｍＬのネオマイシン、IL−２、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰ
ＭＩ１６４０中に懸濁した。Ｔ細胞は平衡化したナイロンウールカラム（２８）
を用いて精製した。次いで、この精製されたＴ細胞は、５％ＣＯ２の大気中３７
℃で培養のため９６穴平底プレート（セルウェルズ、コーニング社、ニューヨー
ク）内で２×１０4 細胞／５０μＬ／穴の濃度で培地中に懸濁した。
【００８２】 Ｔ細胞増殖検定は上記のように（２８）実施した。次いで、同系リンパ球又は
応答細胞は２×１０4 細胞／５０μＬ／穴の濃度でγ−照射された（５０００ラ
ド）刺激細胞とともに共培養した。刺激細胞は、記載したように先天性Ｐ８１５
腫瘍細胞、表面上にＮＴＡ−ＤＴＤＡを組み込んだＰ８１５細胞、並びに組換え
タンパク質を植え付けられたＰ８１５細胞を含んでいた。３７℃で４日間の共培
養後、該細胞は１穴につき１μＣｉの［ 3Ｈ］−チミジンを用いて６時間パルス
した。次いで、この細胞はフィルターメイト１９６細胞ハーベスター（パッカー
ド社）を用いて回収し、マイクロサイントシンチラント及びトップカウントソフ
トウェアを用いるトップカウントＮＸＴマイクロプレートシンチレーションカウ
ンター（パッカード社）により［ 3Ｈ］−チミジンの取り込みを評価した。
【００８３】細胞障害性検定 インビボの腫瘍に特異的なＣＴＬについての検定はチェンら（２９）により記
載されているものと同様な手法により実施した。同系ＤＢＡ／２マウスは、ＰＢ
Ｓ（対照）又は組換えタンパク質を植え付けられた１×１０5 個のγ−照射され
た（５０００ラド）Ｐ８１５細胞のいずれかを用いて皮下に免疫した。免疫後１
４日目にマウスから脾臓を取り出し、上述したようにイソパーク−フィコールを
用いる密度勾配遠心分離及びナイロンウール分画によりＴリンパ球（エフェクタ
ーＴ細胞）を単離した。次いで、エフェクターＴ細胞は、インキュベーション培
地に懸濁し、１×１０5 細胞／穴の濃度で２４穴平底プレート内に分注し、１×
１０5 個のγ−照射（５０００ラド）した先天性Ｐ８１５細胞とともに共培養し
た。共培養の５日後、該エフェクター細胞の細胞障害活性は、上述したように（
２９）標準的な51Ｃｒ遊離検定で評価した。簡潔に述べれば、２×１０6 個の先
天性Ｐ８１５細胞は２５０μＣｉの51Ｃｒ（Ｎａ51ＣｒＯ4 ）で９０分間標識し
た。標識された標的細胞は三回洗浄し培地に再懸濁した。エフェクター及び標的
細胞は、上述したように、エフェクターの標的に対する異なる比でエフェクター
細胞とともに３７℃で６時間共培養した。上清は回収し、51Ｃｒの遊離はトップ
カウントソフトウェア（パッカード社）を用いるトップカウントＮＸＴマイクロ
プレートシンチレーションカウンター（パッカード社）により評価した。百分率
比の溶解は下記の通りに算出した。
【００８４】
【数１】
【００８５】動物の免疫化及びインビボの腫瘍攻撃 マウスは、上記（２９）と同様なプロトコルを用いて免疫化した。簡潔に述べ
れば、ＰＢＳ（対照）又は上記の植え付けられた組換えタンパク質を含む１×１
０5 個のγ−照射されたＰ８１５細胞は、０．２ｍＬ容積のＰＢＳ中に懸濁し、
２５ゲージの針及び１ｍＬの注射器を用いて同系ＤＢＡ／２マウスの毛剃りされ
た右背に注射した。１４日後に、該マウスは、該マウスの脾臓から単離されたＴ
細胞を用いる細胞障害検定に使用した、または毛剃りされた左背に皮下注射する
ことにより１×１０5 個の先天性Ｐ８１５細胞で攻撃誘発した。腫瘍成長を観察
するために、該マウスはカリパスを用いて二つの直角をなす直径をミリメーター
で測定することにより（２９）一週間に一度腫瘍の大きさを記録した。生存デー
タは、記録時にまだ存命していた動物を表し；死にかけていた動物は記録後に安
楽死させ腫瘍で死んだと考えられた。各実験条件の群における合計１０又は１２
匹のマウスについてのデータを示す。
【００８６】 実施例１ ＩＡｓｙｓバイオセンサーは、該脂質層に固定し且つヘキサヒスチジンで標識
化されたタンパク質の相互作用を研究するために使用できる。
【００８７】 ＰＣ及びＮＴＡ−ＤＴＤＡから成る平板な膜層は、該ＩＡｓｙｓバイオセンサ
ーキュベットの感知表面上に形成した。図２（ａ）は該層の形成による屈折率の
変化を示す（Ｍｅｍｂで示す）；ＴＢＳによる二回の洗浄後シグナルはなく（印
されたように）、安定な層が形成されたことを示す。次に、該バイオセンサーは
ＢＳＡの添加時に屈折率の変化を示さず（図２（ｂ）参照）、これは低レベルの
非特異的結合を示している。しかしながら、ヘキサヒスチジンタグ（図２（ｂ）
ではＮＨで示す）をもつ１３ｋＤａの転写因子を添加すると強力なシグナルが得
られ、これは該ＮＴＡキレート結合を介して該膜のＮＴＡ−ＰＥにこのタンパク
質が結合したことを示している。この固定したタンパク質は洗浄及びＴＢＳ中で
のインキュベーション後も剥れなかったが、該キレート結合を破壊することが知
られている２００ｍＭのイミダゾールを用いると剥れた（Ｉｍｉｄ＋ＴＢＳで示
す）。更に、他の分子とこのタンパク質との相互作用も容易に検出できた。この
結果は、ヘキサヒスチジンで標識化したタンパク質が安定に且つ効果的に該層上
に固定するため該バイオセンサーとの分子相互作用を研究できることを示してい
る。
【００８８】 実施例２ 該脂質層上に固定した分子は側方に拡散し相互作用できる。
【００８９】 顕微鏡のスライドはオクタデシルトリクロロシランと反応し（上述したように
）オクタデカン単層を形成した。次に、一滴のミセル（例えばリポソーム）懸濁
液（ＰＣとｂｉｏｔ−ＰＥ、１０：１）を載せ２時間インキュベートすることに
よりリン脂質層が該単層上に形成された。洗浄後、該層の表面をフルオレセイン
化ストレプトアビジンで染色し、４℃でＢｉｏｔ−ＢＳＡとインキュベートした
後、フルオレセインの蛍光について調べた。予備研究は、これらの条件下で該蛍
光が該表面全体に均一に見られることを示している。しかし、37℃、３０〜６０
分の該スライドのインキュベーション後、該蛍光は不連続なパッチで観察され、
これはフルオレセイン化ストレプトアビジンがｂｉｏｔ−ＢＳＡとの凝集を形成
したことを示している。これは、該層上の分子が温度に応じて側方に拡散し相互
作用できることを示している。
【００９０】 実施例３ 本発明の技術を用いて、ＣＤ４−ＭＨＣクラスＩＩ相互作用の理解における現
時の難題を解決する。
【００９１】 本明細書に記載された本発明の一つの適用は、白血球細胞による免疫応答の開
始に関与する二つの重要な分子である主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラ
スＩＩ分子とＣＤ４との相互作用を研究することである。抗原特異的な免疫応答
の開始に重要なことはＭＨＣクラスＩＩ分子上の不可変領域とＣＤ４との相互作
用であり、これはＴ細胞受容体と提示された抗原との間に付着を生じ相互作用を
安定化する。細胞免疫実験はこのような相互作用が効果的なＴ細胞の活性化並び
に免疫応答の誘発に重要であることを強く示唆しているが、これまでに、この相
互作用又はそれがどのように起きるのかについての直接的な証拠は得られていな
い。
【００９２】 ヒトのＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ１）分子の細胞外部分の三次元構造に
ついての最近のＸ線結晶学研究は、この分子が非共有的に結合したヘテロ二量体
の一方の二量体として結晶化することを示した。これは、該ＭＨＣクラスＩＩの
二量体形成能力がおそらくＣＤ４受容体に対する結合力の増大を導くことを示唆
している。ヒトの可溶性ＣＤ４の結晶構造は、ＣＤ４のＤ１−Ｄ２領域及びＤ３
−Ｄ４領域が多量体の形態で結晶することを示したが、多量体は溶液中で形成さ
れないため自己会合の親和性は低いに違いない。結晶中の過度の可溶性ＣＤ４濃
度はオリゴマー形成についての本来の性向を呈しうることを示唆した。興味深い
ことに、生化学的証拠により、幾つかのＣＤ４はヒツジのリンパ球の溶菌液から
ジスルフィド結合したホモ二量体として免疫沈降することが示されている。最近
、ヒトのＣＤ４がオリゴマー形成できるという証拠も、トランスフェクタントの
ＣＤ４キメラを用いて、並びに該細胞表面上に隣接したＣＤ４分子を化学的に架
橋することにより得られた。しかしながら、これらの結果は、オリゴマー形成が
ＣＤ４−ＭＨＣクラスＩＩ相互作用の結合力を増大するために必須であるか否か
を明確にしていない。以下に記載する技法の適用はこの欠如を軽減するための意
味を付与するであろう。
【００９３】 実施例４ 本実施例のねらいは、ＣＤ４の側方移動が可能な膜層上に固定した場合マウス
及びヒトのＣＤ４の細胞外領域がオリゴマー形成できるか否かについて決定する
ことである。
【００９４】 原子間力顕微鏡は、脂質層上に固定された際のＣＤ４のオリゴマー形成を研究
するために使用できる。９０％のＰＣ及び１０％のＰＥ−ＮＴＡから成るリン脂
質層が新たに切断され極微に平坦な雲母の表面上に形成され高解像原子力間顕微
鏡を可能にし得る。この手順はバイオセンサー表面上に層を形成するために用い
られる手順（上記参照）と同様である。または、ガラス様物質の表面、若しくは
スパッタリング技法を用いて均一な金の層（厚さ４００〜１０００Ａ）で被覆さ
れた表面は、オクタデシルトリクロロシラン及びオクタデカンチオールなどの化
合物でそれぞれ適切に処理され該表面に共有的に付着した疎水性の炭化水素鎖の
単層を形成でき、該層はミセル（例えばリポソーム）の懸濁液と反応でき、付着
したオクタデカン炭化水素鎖の単層並びにＰＣ／ＰＥ−ＮＴＡを含むリン脂質層
から構成されるハイブリッド層を生じる。
【００９５】 ヘキサヒスチジン尾部をもつＣＤ４の組換え細胞外領域は、原子間力顕微鏡で
の使用に適したガラス上又は雲母表面上に形成された層上に該ＮＴＡキレート結
合を用いて固定できる。ＰＣ／ＰＥ−ＮＴＡ膜層を作製するために使用される具
体的なＰＣは、該膜転移温度が約２３℃である（例えばジミリストイルホスファ
チジルコリン）ような鎖長をもって選択できる。次いで、原子間力の測定は、Ｃ
Ｄ４の側方移動を防止するため１０℃で維持される系でまず実施し単量体状態の
ＣＤ４で該力構造を位置づける。次に、該温度を３０〜６０分間で３７℃まで上
げＣＤ４が側方に拡散し相互作用できるようにした後、再度、該系を１０℃まで
冷却し該構造を位置づける。異なる条件下におけるＣＤ４分子の三次元の力地図
を比較することにより、マウスＣＤ４がオリゴマー形成できるか否かを決定でき
る。
【００９６】 該ＩＡｓｙｓバイオセンサーは、該バイオセンサーキュベットの感知表面上に
形成された層上に固定したＣＤ４を用いて、１０℃及び３７℃でのＣＤ４−ＭＨ
ＣクラスＩＩ相互作用についての結合親和性（会合定数及び解離定数）を測定す
るために使用できる。膜転移温度を上回る温度に曝した後に可溶性ＭＨＣクラス
ＩＩとＣＤ４の相互作用での結合親和性が高くなるという発見は、ＣＤ４の細胞
外領域がオリゴマー形成したという更なる証拠を提供する。初めに、これらの実
験は結合したペプチドの存在下及び不在下でマウスのＣＤ４及びＭＨＣクラスＩ
Ｉを用いて実施できる。同様な実験は固定されたヒトのＣＤ４及び可溶性のヒト
のＭＨＣクラスＩＩを用いて実施できる。オリゴマー形態で存在することが予想
される条件下において層上に固定されたＣＤ４の力構造は、可溶性ＭＨＣクラス
ＩＩに結合後に位置づけすることもでき、該相互作用が安定で分析できる場合、
ＭＨＣクラスＩＩの結合が該構造の変化を誘導できるか否かを確かめる。
【００９７】 実施例５ 本実施例のねらいは、ＭＨＣクラスＩＩが側方移動できる層上に固定された場
合にマウス及びヒトのＭＨＣクラスＩＩの細胞外領域がオリゴマー形成するか否
かを決定することである。
【００９８】 上記のＣＤ４についての研究と類似して、該層上に固定された場合のマウスＭ
ＨＣクラスＩＩの原子間力構造は、１０℃で維持される系を用いて位置づけする
ことができ、３７℃に曝した後に観察される系と比較でき、オリゴマー形成が起
きるか否かを確かめる。この研究は、ＭＨＣクラスＩＩのグローブに結合したペ
プチドの存在下及び不在下でも実施でき（該マウスの系について）、結合ペプチ
ドがＭＨＣクラスＩＩのオリゴマー形成に影響を及ぼすか否かを決定する。該原
子間力構造は、可溶性マウスＣＤ４に結合後に位置づけすることもでき、これが
該力構造の変化を誘導でき並びに／又はＭＨＣクラスＩＩのオリゴマー形成を促
進できるか否かを確かめる。該バイオセンサーは膜に固定したＭＨＣクラスＩＩ
とともに使用し、該ＭＨＣクラスＩＩが単量体形態又はオリゴマー形態のいずれ
かで存在することが予想される条件下で可溶性ＣＤ４との相互作用の結合親和性
を測定することができる。該系を該膜転移温度を上回る温度に曝した後、可溶性
ＣＤ４に対する該ＭＨＣクラスＩＩの結合親和性が高くなるという発見は、ＭＨ
ＣクラスＩＩがオリゴマー形成できるという更なる証拠を提供しうる。
【００９９】 実施例６ 本実施例のねらいは、ＣＤ４のオリゴマー形成並びにＭＨＣクラスＩＩのオリ
ゴマー形成の両方がＣＤ４−ＭＨＣクラスＩＩ相互作用に必要であるという仮説
を試験することである。
【０１００】 上記に略述した実験において、可溶性ＭＨＣクラスＩＩに対する単量体若しく
はオリゴマーいずれかのＣＤ４の結合、並びに可溶性ＣＤ４に対する単量体若し
くはオリゴマーいずれかのＭＨＣクラスＩＩの結合を検出できなかったことによ
り、ＣＤ４及びＭＨＣクラスＩＩのオリゴマー形成が両方とも安定な相互作用を
必要とすることが示された。ＣＤ４及びＭＨＣクラスＩＩの両方が該膜系でオリ
ゴマー形成することを示し得る場合、両方がオリゴマーの形態で存在することが
予想される条件下でＣＤ４及びＭＨＣクラスＩＩが相互作用できるか否かを試験
することにより、この可能性を試すことができる。これは、該ＮＴＡキレート結
合を用いてヘキサヒスチジンで標識化されたＭＨＣクラスＩＩを単層小胞上に固
定させ、該小胞を３７℃に曝してＭＨＣクラスＩＩをオリゴマー形成させ、並び
に該ＩＡｓｙｓバイオセンサーを用いてこれらの小胞のオリゴマーＣＤ４との相
互作用能力を研究することにより、実施できる。これは、マウス及びヒトの系の
両方で実施できるが、該グローブのペプチドの存在下及び不在下でマウスのＭＨ
ＣクラスＩＩが利用できるので、該相互作用に必要な正確な分子的立証を得るた
めに、結合したペプチドの存在下におけるマウスのＭＨＣが必要とされうる。
【０１０１】 このアプローチの実現可能性は、該ＩＡｓｙｓバイオセンサー表面上に形成さ
れた脂質層上に固定したストレプトアビジンとビオチン−ＰＥ及びＰＣを含有す
る小胞との相互作用を示す最近の研究により証明された。図３は、該キュベット
の感知表面とＰＣ及びｂｉｏｔ−ＰＥから成る小胞の懸濁液との反応後、ＩＡｓ
ｙｓバイオセンサーキュベットへの添加による屈折率の変化を示すバイオセンサ
ーのトレースである。屈折率の初期の変化は該層の形成によるものである。続い
て、該キュベットはトリス緩衝液で洗浄した。平衡後、ＢＳＡ（上記ＢＳＡ）を
添加しても屈折率に変化は無く、これは低レベルの非特異的結合を示している。
ストレプトアビジン（上記Ｓｔｒｅｐ）を添加すると屈折率が変化し、これはト
リス緩衝液（上記トリス）で洗浄時に変化しなかった。ＰＣ（上記ＰＣ）から成
る小胞の懸濁液を添加しても該膜に結合しなかったが、ＰＣ及びｂｉｏｔ−ＰＣ
から成る小胞を添加すると該膜と相互作用し、これは該膜上に固定したストレプ
トアビジンと該ｂｉｏｔ−ＰＥを含有する小胞との結合を反映している。
【０１０２】 実施例７ 上記の実施例は受容体分子の細胞外領域の組換え形態を使用するため、オリゴ
マー形成が該分子の細胞外領域を介する相互作用から生じる場合のみ検出される
。膜貫通領域及び細胞内領域の両方が短くオリゴマー形成に関与しそうにないた
め、多くの受容体にとって問題が起こりそうもない。確かに、上記のＣＤ４及び
ＭＨＣクラスＩＩについて、この見解は、該分子の細胞外領域のそれぞれが他分
子（例えば細胞質中の分子）の不在下で自然に二量体形成／オリゴマー形成でき
ることを示すＸ線結晶学研究によっても支持される。しかしながら、該技法の他
の適用は、オリゴマー形成並びに／又は関連する他の膜若しくはシグナル伝達に
関与する細胞質分子との相互作用における関与を研究するために、受容体分子の
細胞質ドメイン若しくは膜貫通ドメインの該モデル膜上への固定も包含する。
【０１０３】 当技術の他の有用な適用は、ＣＤ２とそのリガンドとの相互作用を研究するこ
とである。従って、多量体結合法の使用によりグリコシルホスファチジルイノシ
トール（ＧＰＩ）に固定した分子のＣＤ５９はヒトＣＤ２の代替リガンドとして
同定されたが、バイオセンサー研究はＣＤ２と単量体の可溶性ＣＤ５９との相互
作用を確認できなかった。これは、この相互作用が低親和性であり且つＣＤ５９
のオリゴマー形成がＣＤ２との安定な相互作用を形成するために必要とされうる
ことを示している。ＣＤ４−ＭＨＣ相互作用を研究するため上記で用いた技法と
類似して、明らかに、バイオセンサー及び原子間力分析と共役させた脂質層上へ
のＣＤ５９の固定化は、ＣＤ５９のオリゴマー形成がＣＤ２との相互作用に必要
であるか否かを決定する際に非常に有用である。この技法は、他のＧＰＩに固定
させた受容体分子の相互作用を研究するための適用にも特に適している。このよ
うな受容体分子は、本来のＧＰＩアンカーに直接介して又はヘキサヒスチジンタ
グを工作して本来のＧＰＩ部分と置換することにより該膜に固定され、並びにヘ
キサヒスチジン−ＮＴＡキレート結合を用いて該受容体を該膜上に固定させる。
【０１０４】 本明細書に記載された実施例は、略述した技術と連係させた該技法が他の低親
和性分子相互作用の分析に非常に有用であることを立証する。当技術は、適切な
ヘキサヒスチジンタグの付着及び該層膜系上への分子の固定後、受容体ドメイン
、タンパク質、糖タンパク質、 多糖類、又はそれらの断片の間の相互作用若しく
は凝集事象について検定するためにも使用できる。これは、このような受容体の
相互作用に影響しうる薬剤又は薬物についてのスクリーニング法を提供する。従
って、本発明は、受容体の相互作用に影響し、結果として膜貫通シグナルを変換
し並びに／又は生物系での応答を誘発する該受容体の能力に影響する薬物又は他
の薬剤についての新規なスクリーニング法の基礎を提供する。
【０１０５】 実施例８ ワクチンの開発及び薬物標的化を目的として、細胞の表面並びに他の生物膜及
び合成膜の上にヘキサヒスチジンで標識化された分子を固定又は植え付ける（図
４参照）ために本発明を用いること。
【０１０６】 図５のヒストグラムは、植え付けられた組換えヘキサヒスチジン標識化マウス
のＢ７．１及びＣＤ４０を含むマウスのマスト細胞腫Ｐ８１５細胞の蛍光標示式
細胞分取器（ＦＡＣＳ）プロファイルを示す。Ｐ８１５細胞は、対照脂質のジミ
リストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ；ｄｉ−Ｃ１４−ＰＣとも呼ぶ；対
照）又はキレート剤脂質のＮＴＡ−ＤＴＤＡの懸濁液（０．１ｍＭ）とともに３
７℃で３０分間予めインキュベートし、ＰＢＳで洗浄後、ヘキサヒスチジンで標
識化されたＢ７．１及びＣＤ４０（それぞれ〜２０ｍｇ／ｍＬ）の混合物とイン
キュベートした。次いで、該細胞は、ＰＢＳで再度洗浄し、上記のビオチン化１
６−１０Ａ１又はビオチン化Ｂ−３／２３のモノクローナル抗体（即ち、ビオチ
ン化された抗−Ｂ７．１又は抗−ＣＤ４０）のいずれかとともにインキュベーシ
ョン（４℃で３０分間）することにより染色した後、ＦＩＴＣ共役ストレプトア
ビジンとインキュベートした。ＤＭＰＣ及び組換えタンパク質とインキュベート
した細胞は、いずれかのモノクローナル抗体で染色した後、低レベルの蛍光を示
す（対照）。ＮＴＡ−ＤＴＤＡと予めインキュベートしたＰ８１５細胞の蛍光は
ＤＭＰＣで予めインキュベートした細胞の蛍光（対照）よりも１０〜１００倍強
い。各結果は反復実施した二回の実験を示す。この結果は、キレート剤脂質（こ
の場合ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）がこれらの細胞の膜内に組み込まれ得ること且つこの
組み込まれた脂質が該ＮＴＡ−ＤＴＤＡを介してヘキサヒスチジンで標識化され
たＢ７．１及びＣＤ４０をＰ８１５細胞の表面上に直接固定又は植え付けるため
に使用できることを示している。他の研究において、本発明者らは、ヘキサヒス
チジンタグをもつ組換えマウスのＢ７．１及びＣＤ４０が試験された全ての異な
る細胞系統表面上に植え付けられ得ることを示した。これらには、マウスのＰ８
１５細胞及びＥＬ４細胞、ヒトの白血病ジャルカット細胞並びに酵母細胞が含ま
れる。
【０１０７】 実施例９ 本実施例は、腫瘍免疫を強化するため腫瘍細胞の表面を改変することに関する
。
【０１０８】 最近の研究から、Ｂ７−１及びＢ７−２の膜貫通領域及び細胞質領域はＴ細胞
の共刺激に必要とされないこと（２３）、並びに該Ｂ７−１がＧＰＩに固定され
た形で腫瘍細胞表面上に発現する場合にＴ細胞の共刺激も起きること（２４）が
示されている。また、任意の細胞表面受容体分子（例えば、マウスＴ細胞共刺激
分子のＢ７．１及びＣＤ４０）の細胞外領域は、カルボキシル末端上にヘキサヒ
スチジンタグ又は他の適切なペプチドタグを含有するよう生産できる。この形態
において、本発明は、これらの共刺激分子を該細胞表面上に正しい方向で直接固
定させ、それにより抗原提示細胞の表面上でこれらの分子の共刺激機能を模倣す
る方法を提供する。従って、本発明は、腫瘍に対する免疫を強化するための免疫
化で使用するため、共刺激物質及び／又は他の関連分子を腫瘍細胞上に設けるた
めのトランスフェクションに対するより簡便で安全な代替法を提供することによ
り腫瘍ワクチン開発に密接な関係を有する。
【０１０９】 植え付けられた分子を使用できる可能性は、植え付けられた該分子に依存した
機能的応答について検定することにより試験できる。従って、植え付けられヘキ
サヒスチジンで標識化されたＢ７−１及び／又はＣＤ４０を含むマウスＰ８１５
マスト細胞腫（ＤＢＡ／２、Ｈ−２ｄ）細胞が同種異系におけるＴ細胞増殖応答
を刺激する能力は、適切な数のγ−照射されたＰ８１５細胞（対照として）、又
はヘキサヒスチジンで標識化されたＢ７−１及び／又はＣＤ４０で植え付けられ
たＰ８１５細胞とともに共培養されたＣ５７Ｂ１／６（Ｈ−２ｂ）マウスから単
離された脾臓細胞を用いて調べた。Ｔ細胞の増殖を測定するため３Ｈ−チミジン
の取り込みを用いる予備実験は、植え付けられヘキサヒスチジンで標識化された
Ｂ７−１及び／又はＣＤ４０を含むＰ８１５細胞がこの混合細胞反応における増
大したＴ細胞の増殖レベルを刺激できることを示している。これらの結果は、本
発明が抗腫瘍応答を強化するためのワクチンで用いる細胞を改変するのに役立つ
ということと一致している。
【０１１０】 実施例１０ 植え付けられた共刺激分子を保持するＰ８１５細胞のインビボでの抗腫瘍応答
を誘導する能力を試験するために、植え付けられた該分子を含むＰ８１５細胞で
マウスを免疫化し、これがＣＴＬ活性を刺激し及び／又は同系間動物での腫瘍成
長に影響を及ぼし得るか否かを確認した。ＤＢＡ／２マウスの個々の群は、ＰＢ
Ｓ又は植え付けられたＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、若しくはＢ７．１−６
ＨとＣＤ４０−６Ｈを含むγ−照射されたＰ８１５細胞のいずれかで免疫化した
。免疫化２週間後、該マウスから脾臓を摘出し、脾臓Ｔ細胞を単離し、標準的な 51 Ｃｒ遊離検定を用いて天然のＰ８１５細胞を殺す能力を評価した。図６のデー
タは、上記の全てのエフェクターと標的細胞の比（0.5 ：１、１：１、５：１）
において、ＰＢＳ（対照として）で免疫化されたマウスから得られたＴ細胞によ
り、ほんの低レベル（２〜５％）の溶解しか誘導されなかったことを示している
。Ｐ８１５−ＥＰＯＲ（対照タンパク質として）で免疫されたマウスから得られ
るＴ細胞の溶解活性も７〜１６％の低範囲であった。興味深いことに、試験した
全てのエフェクター：標的細胞の比において、腫瘍細胞に特異的な溶解のレベル
は、エフェクターＴ細胞が一つ以上の植え付けられた共刺激分子を含むＰ８１５
細胞で免疫されたマウスに由来するという条件の場合に、より高かった（図６参
照）。最も高い細胞溶解活性はエフェクター：標的細胞の比が５：１で観察され
た。そして、Ｂ７．１を植え付けられたＰ８１５細胞及びＢ７．１とＣＤ４０を
植え付けられたＰ８１５細胞でそれぞれ免疫化されたマウスから得られるＴ細胞
により誘導される特異的な溶解は、対照タンパク質を植え付けられたＰ８１５細
胞で免疫化されたマウスから得られたＴ細胞の特異的溶解より、それぞれ３倍及
び５倍高かった（図６参照）。Ｐ８１５細胞のかわりに天然のＥＬ４細胞を用い
た平行実験は、バックグラウンドレベルの溶解しか示さなかった、これは細胞溶
解応答が標的のＰ８１５細胞に対して特異的なものであったことを示している。
この結果は、Ｐ８１５細胞に対するＣＴＬ応答が、Ｂ７／ＣＤ４０を植え付けら
れたＰ８１５細胞で免疫化されたマウスで生じ得ることを示している。
【０１１１】 共刺激分子を植え付けられたＰ８１５細胞によるマウスの免疫化が腫瘍免疫を
誘導できるか否かを決定するために、タンパク質を植え付けられたγ−照射細胞
で免疫されたマウスの群も、天然のＰ８１５細胞による攻撃後における腫瘍の成
長及び生存をモニターした。これらの研究により、対照タンパク質を保持する細
胞で免疫化されたマウスと比較して、共刺激分子を植え付けられたＰ８１５細胞
で免疫化されたマウスでは腫瘍成長の速度がより遅いことを示した。こうして、
腫瘍の攻撃５週間後における、平均の腫瘍直径は、Ｂ７．１−６Ｈ及びＢ７．１
−６ＨとＣＤ４０−６Ｈを植え付けられたＰ８１５細胞で免疫されたマウスにつ
いてはそれぞれ３．３６±１．０ｍｍ及び１．１±０．９ｍｍ、ＰＢＳ及びＥＰ
ＯＲ−６Ｈを植え付けられたＰ８１５細胞で免疫されたマウスについてはそれぞ
れ１０．７±２．５ｍｍ及び８．３±２．７ｍｍであった。攻撃後最初の５週間
のみの平均腫瘍直径に反映されている腫瘍成長のデータが提示してある、なぜな
らこの時から腫瘍で死ぬ動物がいたためである。腫瘍の攻撃後１４週目で、生存
率は、対照マウスで約１７％、Ｂ７．１を植え付けたＰ８１５細胞で免疫化され
たマウスで約３０％、そしてＢ７．１及びＣＤ４０を植え付けたＰ８１５細胞で
免疫化されたマウスで約６０％であった（図７の（ａ）及び（ｂ）参照）。観察
されたＣＴＬ活性の増加と一致して、この結果により、共刺激分子を植え付けら
れたＰ８１５細胞による同系間動物の免疫化は、天然のＰ８１５腫瘍による攻撃
後の該動物の腫瘍成長を阻害し生存を延長させ得ることが示される。
【０１１２】 実施例１１ 血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、最も強力な血管形成分裂促進因子の一つで
あり且つ血管形成の主要な調節因子である〜４０ｋＤａのホモ二量体の糖タンパ
ク質ホルモンである（３０）。かなりの証拠により、ＶＥＧＦが腫瘍細胞及び低
酸素血症に曝された他の細胞から分泌されること且つＶＥＧＦが固体の腫瘍成長
において主要な血管形成因子であることが示唆される（３１）。その強力な血管
形成活性に加えて、ＶＥＧＦは、血管透過性を増大させ、血管外基質を通る内皮
細胞の移動、腫瘍の血管形成、腫瘍の広がり、及び転移に必須な過程を支える（
３２）。ヒトのＶＥＧＦは、キナーゼドメイン受容体（ヒトのＫＤＲ又はマウス
のｆｌｋ−１）及びＦｍｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）などの高親和
性ＶＥＧＦ受容体に結合することにより、内皮細胞の増殖及び分化を刺激するこ
とが知られている。これらの受容体は増殖している血管内皮細胞の上で専ら発現
し、これらの発現は、腫瘍がしばしば生産する幾つかの因子により増加すること
が知られている（３０〜３３）。このＶＥＧＦ及びその受容体が腫瘍成長に重要
であることは、抗体（３４）又は組換えの可溶性受容体ドメイン（３５）の使用
によるＶＥＧＦの無効化がインビボでの腫瘍成長及び転移を抑制できる薬物とし
ての治療能を示すという事実により証明された。
【０１１３】 実質的に増殖中の内皮細胞上に限られたＶＥＧＦ受容体の発現は、新生血管形
成を標的とする治療戦略において該ＶＥＧＦ受容体が標的化分子として使用でき
ることを示唆している。立体的に安定化されたリポソーム又は免疫系（例えば肝
臓及び脾臓の細網内皮細胞系）の食細胞による排除を回避できる「ステルス」リ
ポソーム（ＳＬ）の開発により、最近、癌の化学療法におけるリポソームの薬物
送達に大きな進歩がもたらされた（３６〜３８）。インビボでの投与後（しばし
ば数分以内）血液から急速に取除かれる従来のリポソームとは対照的に、ＳＬは
数日間血液循環中に存在し続ける。幾つかの研究により、漏れやすい脈管構造に
より特徴づけられるＡＩＤＳに関連したカポージ肉腫及び他の障害の治療におい
て、ドキソルビシンなどの封入された細胞障害性薬物を含むＳＬの治療利点が証
明された（３８）。最近の研究は特定の腫瘍に対するＳＬの標的化も記述してお
り、この標的化は、主として、「免疫リポソーム」、即ちリポソームの表面に特
異的抗体（又はＦ（ａｂ′）２断片）を共有結合付着させたリポソームの使用に
より達成される（３９）。抗体などの標的化タンパク質をドキソルビシンを封入
したＳＬ上に固定することは、明らかに、それらのステルス様特性を改変せず、
リポソームに特定の標的化特性を与えることができる（４０〜４３）。
【０１１４】 本発明の出現まで、標的分子のリポソームへの結合は困難であり、使用する抗
体に対して無用の抗イディオタイプ応答を誘導する可能性があった。本発明の側
面に従って、二つのキレート剤脂質であるニトリロトリ酢酸ジテトラデシルアミ
ン（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）及びニトリロトリ酢酸ポリエチレングリコール（２００
０）ホスファチジルエタノールアミン（ＮＴＡ−ＰＥＧ２０００−ＰＥ）は、Ｖ
ＥＧＦの組換え形態とともに用いられ、インビボで増殖中の血管内皮細胞を標的
とし特異的に破壊するドキソルビシンを封入されたＳＬを開発し、それにより新
生血管形成及び腫瘍の成長を遮断する。
【０１１５】 ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ受容体が実質的に血管形成内皮上に専ら発現するため、
とりわけ魅力ある標的化分子である。本発明にしたがって、封入されたドキソル
ビシン及びＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのＮＴＡ−脂質を介して固定された表面ＶＥＧ
Ｆを含有する「ステルス」リポソームを生産することが企図される。本発明に従
って、インビボ投与された場合、この薬物が増殖中の内皮細胞を標的にして破壊
し、腫瘍形成及び腫瘍転移を阻害することが企図される。
【０１１６】 卵黄のホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）など多
量の一般的な脂質、及びガングリオシドＧＭ１（３５）などの立体的に「安定化
する」少量（〜１０％）の脂質、又はポリエチレングリコール（２０００）に共
役したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ２０００−ＰＥ）（３６、３７
）から成るリポソームは、安定性を高め血液中での循環時間を長くすることが報
告されており、細網内皮細胞系による排除を大幅に回避する。ＳＬのこれらの性
質は、水との相互作用を増大する非荷電の頭部基を有する脂質の存在に寄与する
が、血漿中のタンパク質上及び細胞上で出会いそうな荷電性構造又は疎水性構造
のいずれかとの相互作用を阻害する（３５、３６）。証拠により、該ＳＬ表面上
の該ＰＥＧ鎖の遠位末端に付着した抗体分子を備えたＳＬ（即ち免疫リポソーム
）は、該ＳＬ表面上に直接付着した抗体を備えたリポソームよりそれらの標的と
より効果的に相互作用することが示唆される。これは、これらの条件下で抗原と
相互作用する抗体の能力を立体的に妨害する該ＰＥＧ鎖により説明された（４０
）。従って、ガングリオシドＧＭ１又はより短いＰＥＧ鎖長（例えばＰＥＧ２０
００−ＰＥよりむしろＰＥＧ７５０−ＰＥ）をもつＰＥＧ−脂質を用いて作製さ
れたＳＬは、リポソーム表面上のＮＴＡ−ＤＴＤＡに直接６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦを
結合すること、並びに標的細胞上のＶＥＧＦ受容体に植え付けられたＶＥＧＦを
最適に結合することにより適しているようである。ガングリオシドＧＭ１とＰＥ
Ｇ７５０−ＰＥはともに市販されており（アヴァンティ・ポラー・リピッド社）
、それぞれがＰＣ、Ｃｈｏｌ、及びＮＴＡ−ＤＴＤＡから成るリポソームを用い
て試験される。可能な立体影響を更に低減するため、本発明者らは新規な脂質、
即ちＮＴＡ−ＰＥＧ２０００−ＰＥを生産し、これは該ＰＥ上の該ＰＥＧ鎖の遠
位末端に付着したＮＴＡ基から構成される。この化合物はＰＥＧ２０００−ＰＥ
と組合わせて使用され、標的化６Ｈｉｓ−タンパク質（６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦなど
）が簡便に植え付けできるＳＬを生産する一方で、立体妨害の可能性を排除する
。これは、特定の細胞及び／又は組織に対する標的化を必要とする治療適用での
ＳＬの使用を非常に促進するアプローチである。
【０１１７】 組換え６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦを生産する。ＳＬは、ＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＮＴＡ−Ｄ
ＴＤＡ、を含む脂質、並びにガングリオシドＧＭ１、ＰＥＧ２０００−ＰＥ及び
ＮＴＡ−ＰＥＧ２０００−ＰＥなどの「ステルス」脂質の混合物から生産される
。該ＳＬは、６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦで植え付けられた（ＶＥＧＦ−ＳＬ）後、内皮
細胞を標的にする能力について評価される。培地における増殖中の内皮細胞への
該リポソームの特異的結合についての条件は、ＶＥＧＦ受容体を欠いた細胞への
それらの結合に関して最適化される。ドキソルビシンとともに封入されたＶＥＧ
Ｆ−ＳＬの特異的な細胞障害性は、インビトロでヒトの血管内皮細胞を用いて評
価される。蛍光染料及び／又は放射活性トレーサーで固有に標識されたＶＥＧＦ
−ＳＬはマウスに静脈内投与され種々の組織における経時的分布を決定する。Ｓ
Ｌを生産するために用いられるそれぞれ安定な脂質部分は、該リポソームの「ス
テルス」性質を最適化するために改変され、血管新生中の腫瘍に対応して、肝臓
、脾臓及び他の主要器官により組み込まれるリポソーム部分の減少により判断さ
れる。該ＶＥＧＦ受容体はそのリガンドへの結合時にエンドサイトーシスされる
ため、ドキソルビシンを封入するように作製されたＶＥＧＦ−ＳＬは増殖中の血
管内皮細胞により組み込まれ、それらの破壊に至る。この方法の実行可能性は、
腫瘍成長を阻害し並びに／又はインビボで定着した腫瘍を撲滅するリポソームの
能力を調べることにより試した。従って、この研究は抗血管形成の癌治療に対す
る新規なアプローチを提供する。
【０１１８】 実施例１２ 膜上にタンパク質を固定させるために用いる方法は、ワクチンがインビボでの
免疫応答を変更できる細胞上に組換え受容体を植え付けるためにも使用される。
【０１１９】 これは、該共刺激分子のＢ７．１及びＣＤ４０で植え付けられたＰ８１５細胞
が腫瘍免疫を強化するためのワクチンとして使用できるという事実により証明さ
れる。同様に、これらの又は任意の他の組換えタンパク質又は分子（適切なタグ
を有する）は、任意の他の生物膜構造（例えば、細胞及び／又は原形質膜小胞等
の細胞下構成要素に由来する膜構造）上に植え付けうる。次に、この植え付けら
れた構造物はワクチンとして用いて腫瘍免疫を強化できる並びに／又は治療目的
でインビボで免疫応答を改変できる。好ましい方法は、 (i) ＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのキレート剤脂質と該細胞又は膜物質とをインキュ
ベートして該脂質を該細胞又は膜に組み込ませる工程、 (ii)遠心分離又は濾過により組み込まれなかった脂質を洗い落とし、該構造物
を適当な溶液又は緩衝液に再懸濁する工程、 (iii) 組込まれたキレート剤脂質を含有する該膜構造物と適切な親和性タグを
有する適切な組換えタンパク質とをインキュベートする工程、並びに (iv)組み込まれなかったタンパク質材料を洗い流す工程、次いで、インビボで
の免疫応答を改変するよう治療目的で、インビボで投与可能なワクチンとして修
飾された該構造物を使用する工程を含む。
【０１２０】 当アプローチは合成の膜構造物（即ち、任意のリン脂質（例えばＰＣ若しくは
ＰＥ）と該ＮＴＡ−ＤＴＤＡの混合物から構成される合成のリポソーム又は小胞
）とともに用いることもできる。該合成構造物は該ＮＴＡ−ＤＴＤＡを組み込ん
で作製でき、従って、上記の工程（ｉｉｉ）から（ｖ）のみが必要とされる。
【０１２１】 実施例１３ 予備実験は、適切な組換え受容体タンパク質で植え付けられた合成リポソーム
（１０：１の比で該ＰＣとＮＴＡ−ＤＴＤＡから成る）が同種の受容体又はリガ
ンドをもつ細胞を特異的に標的とするために使用できることを示している（図８
参照）。このようなリポソームは生体応答を改変するためにも使用できる（図９
参照）。従って、本発明は、封入された薬物又は他の治療剤を体内の細胞若しく
は組織に送達する治療適用で用いるための組換えタンパク質をリポソーム上に植
え付ける方法を提供する。このようなリポソームは、病気治療のため、又は治療
目的で特定の細胞（例えば腫瘍細胞）を破壊するために細胞障害性薬物若しくは
薬剤の送達を該細胞に標的化するための生物応答の改変に使用される。
【０１２２】 当業者は、本明細書に記載された本発明が詳細に記載されたもの以外の変形及
び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明はこのようなあ
らゆる変形及び修飾を包含すると理解されるべきである。本発明は、この明細書
中で言及した又は示した段階、特徴、組成物及び化合物の全ても個別に又は集合
的に包含し、並びに任意の二つ以上の該段階若しくは特徴の任意の組合わせ又は
あらゆる組合わせも包含する。
【０１２３】参照文献 １ シャオ，ゼット、(1995) Quart. Revs Biophys. 28:195-251。 ２ ガーランド，ピイ・ビイ、(1996) Quart. Revs Biophys. 29:91-117 。 ３ キルコら、(1995) J. Immunol. Meth. 183:77-94。
【０１２４】 ４ ベルゲ−ロウゼルら、(1995) J. Immunol. Meth. 183:141-148。 ５ ゲルション，ピイ・ディとキルコ，エス、(1995) J. Immunol. Meth. 183
:65-67。 ６ プラントら、(1995) Analyt. Biochem. 226:342-348 。
【０１２５】 ７ ディートリッチら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:9014-9018
。 ８ ディートリッチら、(1996) Biochemistry 35:1100-1105。 ９ カルブら、(1992) Biochim. Biophys. Act. 1103:307-316。
【０１２６】 １０ マックコーネルら、(1986) Biochim. Biophys. Act. 864:95-106。 １１ カルリーら、(1992) Langmuri 8:947-954 。 １２ デュら、(1997) Biochim Biophys Acta 1326(2), 236-248。
【０１２７】 １３ オーウェンス，ティー、(1996) Current Biology 6:32-35。 １４ グイナンら、(1994) Blood 84:3261-3282 。 １５ ヘルストロムら、(1995) Immunol. Rev. 145:123-145。
【０１２８】 １６ ラ・モッテら、(1996) Cancer Immunol. Immunother. 42:161-169 。 １７ チャウックスら、(1996) Int. J. Cancer 66:244-248。 １８ フジら、(1996) Int. J. Cancer 66:219-224。
【０１２９】 １９ マーティン−フォンテッチャら、(1996) Eur. J. Immunol. 26:1851-1859
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【０１３０】 ２２ カヴァロら、(1995) Eur. J. Immunol. 25:1154-162 。 ２３ ブルンシュヴィッグら、(1995) J. Immunol. 155:5498-5505。 ２４ マックフッグら、(1995) Proc ．Natl．Acad．Sci ．92:8059-8063。
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【０１３５】 ３７ アレンら、(1991) Biochim. Biophys. Act. 1066:29-31。 ３８ ラジック，ディー．ディー．とパパハジョポウロス，ディー．、(1995) S
cience 267:1275-1276。 ３９ アーマッドら、(1993) Cancer Research 53:1484-1488 。
【０１３６】 ４０ ハンセンら、(1995) Biochim. Biophys. Act. 1239:133-144。 ４１ デメンゼスら、(1998) Cancer Research 58:3320-3330 。 ４２ キルポティンら、(1997) Biochem. 36:66-75。 ４３ バーゲら、(1999) Int. J. Cancer. 80:134-137 。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＩＡｓｙｓバイオセンサーキュベットのガラス検出表面上に形成され
たモデル膜へのヘキサ−ヒスチジン−標識タンパク質の固定化工程を示す模式図
である。図１に示すように、ＩＡｓｙｓバイオセンサーとタンパク質の相互作用
を研究する目的で膜の上にヘキサ−ヒスチジン−標識タンパク質を固定するため
、検出表面を９０％ＰＣ及び１０％ＰＥ−ＮＴＡから作成されたミセル（例えば
、リポソーム）の懸濁液と反応させる工程を含む既知の方法を用いて、まず脂質
層をバイオセンサーキュベットの検出表面上に形成する。これらの実験のための
ＰＥ−ＮＴＡは、まずＰＥを二官能性架橋剤ビス（スルホスクシニミジル）スベ
レート（bis(sulfosuccinimidyl)suberate) と反応させ、次いでその混合物をＮ
ＴＡと反応させることにより製造する。ＮＴＡ−ＰＥ生産物は薄層クロマトグラ
フィーにより精製した（そして質量分析法によりその同一性を確認した）。次い
でこの層を洗浄して過剰のミセル（例えば、リポソーム）懸濁液を除去し、、ト
リス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）で平衡化する。本発明に従って、本発明者らは、こ
の膜がヘキサ−ヒスチジン−標識分子をそれらを横に拡散させそして相互作用さ
せ、それにより細胞表面を模倣するように、固定するために使用できることを示
す。
【図２】 図２は、図２（ａ）及び図２（ｂ）共にＩＡｓｙｓバイオセンサーでモニター
したときの、分子の結合による時間の関数としての屈折率の変化を示すトレース
である。
【図３】 図３は、ＩＡｓｙｓバイオセンサキュベットの検出表面をミセル（例えば、リ
ポソーム）の懸濁液と反応させて層を形成させた後、該キュベットになされた添
加による屈折率の変化を示すバイオセンサートレースである。
【図４】 図４は、ヘキサ−ヒスチジン標識化分子を細胞膜又は他の膜構造物の上に植え
付けることができる方法の例示である。この例示は、ヘキサ−ヒスチジンタグを
保持する組換え受容体が、細胞の原形質膜又は細胞レベルの下の膜構造物の膜な
どの生体膜の上にそして人工的小胞若しくはリポソームの表面の上に、如何にし
て植え付け得るかを図示する。組換えタンパク質は、該タンパク質上のヘキサ−
ヒスチジンタグが、リン脂質膜中に組み込まれたキレーター脂質の上のＮＴＡ金
属キレート頭部基（ＮＴＡ−ＤＴＤＡと記され、これはｄｉ−Ｃ１４−ＮＴＡと
も呼ばれる）に結合することにより、膜構造物の上に植え付けられる。
【図５】 図５は、ビオチン化され且つヘキサ−ヒスチジン標識されたＣＤ４０分子及び
Ｂ７．１分子を植え付けられ次いでストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色された
Ｐ８１５細胞の、蛍光活性化セルソーティングで測定したときの蛍光の側面であ
る。
【図６】 図６は、植え付けられた共刺激分子を保持する腫瘍細胞でワクチン注射された
マウスから単離されたＴリンパ球における腫瘍特異的細胞毒の誘導を示す図式的
表示である。同遺伝子型のＤＢＡ／２マウスを、ＰＢＳか又は示された組換えタ
ンパク質、即ち、ＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、及びＢ７．１−６Ｈ＋ＣＤ
４０−６Ｈを植え付けられた１×１０5 γ−照射Ｐ８１５細胞で皮下免疫した。
免疫化後１４日のマウスから脾臓を切取り、Ｔリンパ球（エフェクターＴ細胞）
を単離し、インキュベーション培地に懸濁し、１×１０5 細胞／ウェルの濃度で
２４穴平底プレートに分配し、次いで１×１０5 γ−照射天然Ｐ８１５細胞と共
培養した。５％ＣＯ2 の存在下に３７℃で５日間共培養した後、その細胞を51Ｃ
ｒ−標識化天然Ｐ８１５細胞標的と、示されたＥ：Ｔ比で、３７℃で６時間イン
キュベートした後、上清を収穫し、特異的溶解の後に放出された51Ｃｒの量を測
定した。結果を材料と方法で記述したように計算して、特異的溶解百分率±ＳＥ
Ｍとして表す。
【図７ａ】 図７ａは、組換え共刺激分子を植え付けられたＰ８１５腫瘍細胞での免疫によ
る腫瘍免疫の誘導を示す図式的表示である。マウスを、ＰＢＳか又は示された組
換えタンパク質、即ち、ＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、及びＢ７．１−６Ｈ
＋ＣＤ４０−６Ｈを植え付けられた１×１０5 γ−照射Ｐ８１５細胞の注射によ
り免疫した。注射の２週間後に、各群のマウスに１×１０5 天然Ｐ８１５細胞を
皮下注射によりチャレンジし、次いで腫瘍の成長と生存をモニターした。各点は
最初の５週についての、時間の関数としてのマウスの各群の平均腫瘍直径を表す
。
【図７ｂ】 図７ｂは、組換え共刺激分子を植え付けられたＰ８１５腫瘍細胞での免疫によ
る腫瘍免疫の誘導を示す図式的表示である。マウスを、ＰＢＳか又は示された組
換えタンパク質、即ち、ＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、及びＢ７．１−６Ｈ
＋ＣＤ４０−６Ｈを植え付けられた１×１０5 γ−照射Ｐ８１５細胞の注射によ
り免疫した。注射の２週間後に、各群のマウスに１×１０5 天然Ｐ８１５細胞を
皮下注射によりチャレンジし、次いで腫瘍の成長と生存をモニターした。このデ
ータは時間による動物の生存百分率を示す。
【図８】 図８は、蛍光標識リポソームのＤ１０細胞（ネズミＣＤ４＋Ｔ細胞）への結合
が、リポソームが共刺激分子ＣＤ４０及びＢ７．１のいずれかを植え付けられた
場合、対照タンパク質ＥＰＯＲを植え付けられた場合よりも有意に大きいことを
示す図式的表示である（Ｄ１０細胞がＢ７．１及びＣＤ４０のリガンドを発現す
るがＥＰＯＲに対するリガンドは発現しないことに注意せよ）。ＰＣ：ＮＴＡ−
ＤＴＤＡ：ＦＩＴＣ−ＰＥ（１０：１：０．１モル比）の脂質から構成されるこ
のリポソームは、それぞれがヘキサ−ヒスチジンタグを保持する一つ以上の組換
えタンパク質（示すように、ＥＰＯＲ、Ｂ７．１及びＣＤ４０）を植え付けられ
た。この細胞の各条件（リポソームの細胞への結合の程度を反映する条件）にお
ける蛍光の側面を蛍光活性化セルソーティングにより測定した。比較のために、
細胞のバックグラウンド蛍光（「細胞」と記す）を示す。その結果は、適当な組
換えタンパク質を植え付けられたリポソームの結合は植え付けられたタンパク質
の型に特異的であり、従って、植え付けられた組換えタンパク質を保持するリポ
ソームは適当な同種の受容体を発現する細胞に標的化できることを示す。
【図９】 図９は、共刺激分子Ｂ７．１及びＣＤ４０を植え付けられた合成リポソームが
Ｄ１０細胞（ネズミＣＤ４＋Ｔ細胞）の該細胞皿への接着を特異的に刺激するこ
とを示す図式的表示である。培養したＤ１０細胞を完全成長培地（ＲＰＭＩ１６
４０プラス１０％ｖ／ｖＦＣＳ、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、抗生物質及び５０μ
Ｍのβ−メルカプトエタノール））に懸濁した。組換えタンパク質ＥＰＯＲ、Ｃ
Ｄ４０及びＢ７．１（それぞれヘキサ−ヒスチジンタグを持つ）を可溶型かＰＣ
及びＮＴＡ−ＤＴＤＡ（１０：１）（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ−ＥＰＯＲ、ＮＴＡ−Ｄ
ＴＤＡ−Ｂ７．１及びＮＴＡ−ＤＴＤＡ−ＣＤ４０と示す）からなるリポソーム
上に植え付けられた状態のいずれかで、細胞と混合した後、この細胞を１２穴リ
ンブロ組織培養プレートの別々のウェルに蒔き、３７℃で２時間成長培地中でイ
ンキュベートした。インキュベーションの後、ＰＢＳで３回洗浄することにより
接着していない細胞を除去し、残っている接着細胞を１ｍＭのＥＤＴＡの溶液で
取得して顕微鏡により数を数えた。このデータは各条件における接着細胞の割合
を示す。その結果は共刺激分子（即ち、Ｂ７．１及び／又はＣＤ４０）を植え付
けられたリポソームが免疫学的応答を改変するために使用できることを証明する
。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月６日（２００１．３．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 モデル膜システム
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は生体膜及び／又は合成膜又はリポソームを改変するための金属キレー ター脂質の使用であって、イン・ビボ投与される場合、生体応答を変える目的の 、又は治療効果を得るべく特定の細胞型若しくは組織にこれらの構造物を標的と して向かわせるための金属キレーター脂質の使用に関する 。、本発明は、ワクチ
ンとして使用される場合、免疫を変える目的で、又は治療目的か又は生理学的応
答又は生体機能を変えるためにイン・ビボ投与される場合、薬物及び他の作用物
質を特定の細胞若しくは組織へ標的として向かわせるために、生体膜及び／又は
合成膜及びリポソームの特性を変える手段を提供する。
【０００２】 発明の背景 本明細書で数値により言及した刊行物の書誌的詳細は明細書の末尾に収録して
ある。
【０００３】 細胞、細菌又はウイルスなどの生物システムでは、表面の膜関連生体分子若し
くは受容体はしばしばサブユニットと呼ばれる二つ以上の分子成分から成る分子
構造物として存在する。これらのサブユニットは同一であっても分子的に異なっ
ていてもよい。天然のリガンド分子（単数又は複数）の受容体サブユニットへの
結合は、脂質膜構造物上のこれらの受容体成分の非共有結合的会合又はオリゴマ
ー化を誘導する。このオリゴマー化現象は、しばしば該受容体がそれにより膜貫
通シグナルを伝達できる機作の本質的一部であり、このシグナルは該リガンド分
子（単数又は複数）による生体応答誘導の引金となる。さらに、ある受容体若し
くはその成分が自発的に会合する能力はリガンドと相互作用するその能力に影響
を与えうる。リガンド分子は、該受容体に結合できる成長因子類、サイトカイン
類、ホルモン類、タンパク質類、糖タンパク質類、多糖類、又は細胞の表面に露
出した成分又は細胞レベル下の成分、ウイルス粒子若しくはウイルスレベルの下
の粒子、又は他の感染体であってもよい。
【０００４】 最近、組換えヘキサ−ヒスチジン−標識タンパク質とニトリロトリ酢酸（ＮＴ
Ａ）との結合を用いて、ヘキサ−ヒスチジン−標識タンパク質を、ＢＩＡコア・
表面プラスモン・レゾナンス・バイオセンサーの上に逆に固定する方法が記述さ
れた（１〜５）。ＢＩＡコアの検出表面上のオクタデカンチオール／リン脂質ハ
イブリッド膜の形成も記述され（６）、これは該二分子層におけるビオチン化さ
れたホスファチジルエタノールアミンへのストレプトアビジンの結合の分析を可
能にした。さらに、ヒスチジン標識生体分子の二分子層膜へのＮＴＡ−ジオクタ
デシルアミン様のキレーター脂質を介する固定化がエピフルオレッセンス電子顕
微鏡及びフィルム・バランス技法により証明された（７〜８）。
【０００５】 これらの先行技術は、ワクチンとして使用される場合免疫を変えるという目的 で、又は治療目的か又は生理学的応答若しくは機能を改変するためにイン・ビボ で投与される場合薬物若しくは他の作用物質を特定の細胞若しくは組織に標的と して向かわせるために、生体膜及び／又は合成膜又はリポソームの特性を改変す る手段を記述しない。
【０００６】 従って、例えば、ワクチン調製物における、免疫応答を改変するための薬物と して、治療用薬物として、及び薬物送達システムを標的化するためなどの使用の ために膜物質に分子を固定する必要がある。
【０００７】 発明の概要 本明細書を通じ、文脈が他の意を要求しない限り、「含む（comprise) 」又は
「含む（comprises) 5」又は「含む(comprising)」などのその変形は、述べられ
た要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を含むことを意味するが、如何な
る他の要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を排除するものではないこと
を意味すると理解すべきである。
【０００８】 本発明は、治療目的でイン・ビボ投与される場合、免疫を変えるために、又は 特定の細胞型若しくは組織に薬物若しくは他の作用物質を標的として向かわせる ために、生体膜及び／又は合成膜又はリポソーム又はそれらの組合せの特性を改 変する方法を提供する。この方法は、該膜又はリポソームの中に組み込まれるよ うになる一部の両親媒性分子を使用する方法であり、そして金属キレート基の一 部が該膜の外部表面に向くように金属キレート基が共有結合的に付着することに より両親媒性分子の一部が改変されたものであり、該方法は受容体ドメインが体 内の細胞及び組織の上のリガンド分子と特異的に相互作用することができるよう に、該膜の外部に面している金属キレート残基を介して該ポリペプチドタグが該 膜に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタグに共有結合に より付着している受容体ドメインと該膜又はリポソームとを相互作用させる工程 を含むものである。受容体ドメインと関連する該膜の間のこの特異的相互作用が 、ワクチンとして投与される場合免疫を変える手段を提供し、又は治療目的で又 は生理学的応答若しくは生体機能を改変するためイン・ビボ投与される場合、薬 物の封入若しくは組み込まれた膜を特定の細胞型若しくは組織に標的として向か わせる手段を提供するものであることが好ましい。
【０００９】 本発明の一つの側面は、特定の治療効果を達成するためイン・ビボ投与される 場合、免疫性を変えるために、又は薬物若しくは他の作用物質を特定の細胞型若 しくは組織に標的として向かわせるために、生体膜及び／又は合成膜又はリポソ ームを改変する方法であって、該方法が該膜若しくはリポソーム内に両親媒性分 子を組み込む工程を含むものであり、該工程中に金属キレート基の少なくとも一 部が該膜若しくはリポソームの外部表面に向くように金属キレート基が共有結合 的に付着することにより両親媒性分子の一部が改変されたものであり、該方法が 、受容体ドメインが体内の特定の細胞型若しくは組織の上に存在するリガンド分 子と特異的に相互作用できるように、ポリペプチドタグが該膜若しくはリポソー ムの外部に面している金属キレート残基を介して該膜若しくはリポソームに付着 するのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタグに共有結合的に付着し ている受容体ドメインと該膜若しくはリポソームとを相互作用させる工程をも含 むものである方法を提供する。
【００１０】 本発明の別の一側面は、特定の標的に向かう分子をリポソームの上に植え付け ることにより、薬物若しくは治療用作用物質を封入／組み込んで作られた合成リ ポソームを、イン・ビボの特定の細胞型若しくは組織に標的として向かわせる方 法であって、下記の工程、即ち （i) 第一脂質若しくはリン脂質と第二脂質若しくはリン脂質からキレーター 脂質を組み込んだリポソームの懸濁液を調製する工程であって、該第二脂質若し くはリン脂質がニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレート基の共有結合付 着により改変され、該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液の第二脂質若しくは リン脂質に付着したＮＴＡ残基の一部が該膜の外部表面に向いているものである 工程、このようなリポソームは、該リポソーム内に封入され／組み込まれ得る適 当な薬物若しくは治療用作用物質の存在下に調製することもでき、あるいは調製 後に含めることもできる、 （ii) ポリペプチドタグがＮＴＡキレート結合を介してリポソームの外部に 面しているＮＴＡ残基に付着するのに十分な時間及び条件の下で、該リポソーム を、適当な金属親和性タグを保持する組換えタンパク質又は標的分子とインキュ ベートする工程、 （iii) 必要ならば、洗浄、濾過又は他の洗浄手段により、過剰のタンパク質 を除去し、該リポソームを適当な溶液に懸濁する工程、及び （iv) 封入され／組み込まれた薬物若しくは作用物質を含む植え付けられた リポソームをイン・ビボ投与して、治療効果を達成するため特定の細胞型若しく は組織への標的化送達を可能とする工程、 を含む方法を提供する。
【００１１】 本発明のさらなる一側面は、標的細胞又はその膜成分の免疫原性を変える方法
であって、下記の工程により、該標的細胞若しくは成分の膜の上に分子を植え付 ける工程 、即ち (i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 (ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液をキレーター脂質又はキレーター脂質を含む リポソーム の懸濁液とインキュベートして、キレーター脂質を細胞の膜若しくは 膜成分中に組み込ませる 工程、 （iii) 必要ならば、過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質若しくはリポソ ーム を洗い流す工程、 （iv) 該細胞又は膜構造物を、固定すべき該分子の溶液とインキュベートす
る工程、及び （v) 必要ならば、過剰の可溶性分子又は未結合の可溶性分子を洗い流し、
且つ該細胞又は構造物をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程、 を含む方法を意図する。
【００１２】 本発明のさらに別の一側面は、イン・ビボ投与された場合、免疫応答又は他の 生体応答の誘導若しくは調節などの特定の治療効果を達成するため、生体膜及び ／又は合成膜及びリポソームを改変する方法であって、下記の工程、即ち （i) キレーター脂質又は脂質及びキレーター脂質の混合物からなるリポソー
ムの懸濁液を調製する工程、 （ii) 細胞又は膜の懸濁液をキレーター脂質を含むリポソーム懸濁液とイン キュベートすることにより、該細胞又は膜の上にキレーター脂質を組み込み、そ して必要ならば、過剰の若しくは組み込まれなかった脂質若しくはリポソームを 洗い流す工程、 （iii) リポソーム、細胞又は膜構造物を、適当な金属親和性タグを有する組 換えタンパク質（単数又は複数）又は標的分子（単数又は複数）の溶液 とインキ
ュベートする工程、及び （iv) 過剰の若しくは結合していない可溶性タンパク質を洗い流し、そして
該リポソーム、細胞、又は膜構造物をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工
程、を含む方法を提供する。
【００１３】 本発明のさらに別の一側面は、細胞、生体膜及び／又は合成膜及びリポソーム
を、体内の特定の細胞型又は組織に標的として向かわせる方法であって、標的の
対象となる特定の細胞若しくは組織の上に結合相手を有する分子を下記の工程、
即ち （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 （ii) 細胞又は生体膜構造物の懸濁液を、脂質を組み込ませるため、キレータ
ー脂質の懸濁液とインキュベートする工程、 （iii) 必要ならば、過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程
、 （iv) 該リポソーム又は膜構造物を、固定すべき分子の溶液とインキュベート
する工程、及び （v) 必要ならば、過剰の可溶性分子又は結合しなかった可溶性分子を洗い流
し、そしてイン・ビボ投与に適する溶液に該リポソーム又は構造物を懸濁する工
程、 により膜構造物の上に植え付ける工程を含む方法を意図する。
【００１４】 本発明のさらに別の一側面は、治療法であって、封入され又は組み込まれた薬 物若しくは 活性物質を含み、且つイン・ビボで標的化されるべき特定の細胞型若 しくは組織の上に結合相手を有する標的に向かう分子で植え付けられたもの を含
む、リポソーム調製物若しくは膜物質の有効量を、被験者に投与する工程を含む
方法を意図する。
【００１５】 本発明のさらなる側面は、ワクチン投与を受ける被験者の免疫学的応答を改変
できる分子を植え付けられた細胞、リポソーム、小胞又は膜物質を含むワクチン
組成物であって、一つ以上の薬学的担体及び／又は希釈剤をさらに含むワクチン
組成物。
【００１６】 好ましい実施態様の詳細な説明 一つの実施態様では、本発明は先行技術の先に述べた欠点の一つ以上を克服す
るための、受容体の膜外ドメイン又は膜貫通ドメインを生体膜及び／又は合成膜 又はリポソームの上に植え付ける 方法を意図する。
【００１７】 従って、本発明は、特定の治療効果を達成するためイン・ビボ投与される場合 、免疫性を変えるために、又は薬物若しくは他の作用物質を特定の細胞型若しく は組織に標的として向かわせるために、生体膜及び／又は合成膜又はリポソーム を改変する方法であって、該方法が該膜若しくはリポソーム内に両親媒性分子を 組み込む工程を含むものであり、この工程中に金属キレート基の少なくとも一部 が該膜若しくはリポソームの外部表面に向くように金属キレート基が共有結合的 に付着することにより両親媒性分子の一部が改変されたものであり、該方法が、 受容体ドメインが体内の特定の細胞型若しくは組織の上に存在するリガンド分子 と特異的に相互作用できるように、ポリペプチドタグが該膜若しくはリポソーム の外部に面している金属キレート残基を介して該膜若しくはリポソームに付着す るのに十分な時間及び条件の下で、該ポリペプチドタグに共有結合的に付着して いる受容体ドメインと該膜若しくはリポソームとを相互作用させる工程をも含む ものである方法を提供する。
【００１８】 受容体ドメインはタンパク質、糖タンパク質、又はプロテオグリカン、オリゴ 糖、又はそれらの断片若しくは機能性等価物であってもよい。
【００１９】 本発明に使用するための好ましい金属キレート基はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ
）である。
【００２０】 生体膜は、細胞、組織、細菌、ウイルス又はそれらの成分などの生物系から得 られる任意の膜若しくは脂質含有物質を表す。
【００２１】 合成膜及び／又はリポソームは両親媒性分子から形成されるミセル（例えばリ ポソーム）の懸濁液などの人工的脂質含有構造物であって、両親媒性分子の一部 が金属キレート基の共有結合付着により改変されたものである。この合成膜又は リポソームは水若しくは水性緩衝液中の脂質混合物の超音波により及び／又は押 し出し／濾過技法の使用により機械的振動により、又は水若しくは水性緩衝液を 有機溶媒中の両親媒性分子の適当な溶液に添加することにより、又はこれらの組 合せにより形成することができる。
【００２２】 両親媒性分子は通常親水性「頭」部 と一つ以上の疎水性「尾」を有する界面
活性分子である。界面活性剤は既知のタイプ、即ち、陽イオン性（例えば、第四
級アンモニウム塩）、陰イオン性（例えば、オルガノスルホネート塩）、両イオ
ン性（例えば、リン脂質：ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノール
アミン）、膜を覆う脂質、又は非イオン性（例えば、ポリエーテル物質）のいず
れでもよい。
【００２３】 合成膜及び／又はリポソームは一つ以上のタイプの両親媒性分子から構成され
うる。好ましい実施態様では、合成膜及び／又はリポソームは第一のリン脂質と
第二のリン脂質とから構成される。
【００２４】 こうして、好ましい形では、本発明は、膜外若しくは膜貫通の受容体ドメイン を外膜若しくはリポソームの上に植え付け、それにより治療効果を達成するため 又は生理学的応答を誘導若しくは改変することを目的としてイン・ビボ投与され る場合、これらの構造物を外受容体ドメインに対するリガンドを発現する任意の 細胞型若しくは組織に標的化されるようにするため金属キレート基を使用するこ とにより、生体膜及び／又は合成膜及びリポソームを改変する方法を意図する。
【００２５】 さらに好ましい形では、第一のリン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）であ
り、そして第二の脂質はニトリロトリ酢酸ジテトラデシルアミン（ＮＴＡ−ＤＴ ＤＡ）又は ニトリロトリ酢酸ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＮＴＡ） のいずれか であり、そしてＰＣ：ＮＴＡ−ＤＴＤＡ又はＰＣ：ＰＥ−ＮＴＡ（ｗ
／ｖ）のモル比は約１０：１である。しかしながら、第一のリン脂質は脂質懸濁 液 を形成できるいかなるリン脂質又は炭化水素又は任意のリン脂質と炭化水素の 混合物 でもよく、そして第二リン脂質は受容体ドメインの上に適当に工学された
タグを用いて該ドメインを固定又は植え付けるために使用できる金属キレート頭
部基を持ついかなる脂質であってもよい。さらに、第一リン脂質と第二リン脂質
の割合は該生体膜又はリポソームの上で達成すべき受容体ドメイン分子の所望の
密度に応じて変えることができる。
【００２６】 該ポリペプチドタグは、ヘキサ−ヒスチジン分子などの少なくとも６個のアミ
ノ酸残基の配列を含むことが好ましいが、ＮＴＡなどの金属キレート基を含む脂
質の金属キレート成分と複合体の形成により強く結合できるいかなるアミノ酸配
列でもよい。本発明の一つの適用では、該分子はＴ細胞共刺激因子Ｂ７．１（Ｃ Ｄ８０）及びＣＤ４０により表される。本発明の別の形では、該分子は血管内皮 細胞成長因子（ＶＥＧＦ）と呼ばれるリガンドである。より具体的には、この受 容体は任意の細胞表面受容体若しくはリガンド、又はこのような受容体若しくは リガンドのドメインである。
【００２７】 受容体ドメインは、標準的組換えＤＮＡ技法を用いて、工学的にヘキサ−ヒス
チジンＣＯＯＨ−尾、又はＮＨ2 −尾を持つようにすることができる。ヘキサ−
ヒスチジンタグは化学的手段により受容体ドメイン、タンパク質、糖タンパク質 、 多糖類及び他の分子に共有結合により付着させることもできる。
【００２８】 こうして、本発明は、治療目的のために、及び治療効果を達成するべくイン・ ビボで生物学的標的化を行う目的で、生体膜及び／又は合成膜及びリポソームの 特性を改変するために金属キレート脂質を利用する。この技法は、ワクチンとし て投与される場合免疫性を変える目的で、又は治療目的か又は生理学的応答若し くは生体機能を改変するためのいずれかでイン・ビボ投与される場合薬物若しく は他の作用物質を特定の細胞若しくは組織に標的として向かわせる目的で、生体 膜及び／又は合成膜及びリポソームの特性を改変するための好ましい実施態様に おいて理想的である。
【００２９】 本発明の該モデル膜システムの生物学的特性を改変するための金属キレート結 合の使用は、 リポソーム又は小胞を標的化するためにも有用である。これらのリ
ポソーム又は小胞は、リポソームに植え付けられた分子の特異性により、該リポ
ソームがイン・ビボ投与される場合、リポソーム内に封入され又は組み込まれ得
る薬物、ＤＮＡ／ＲＮＡ又は任意の治療用の作用物質を、特定の細胞型若しくは
組織に標的化しそして送達することができる。
【００３０】 本発明のこの側面によれば、リポソームの上に特定の標的に向かう分子を植え 付けることにより、薬物若しくは治療用の作用物質を封入し／組み込んで作成さ れた合成リポソームをイン・ビボで特定の細胞型若しくは組織に標的として向か わせる 方法であって、下記の工程、即ち （i) キレーター脂質を組み込まれ、且つ第一脂質若しくはリン脂質及び第二 脂質若しくはリン脂質から構成されたリポソームであって、該第二脂質若しくは リン脂質がニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレート基の共有結合付着に より改変され、該ミセル（例えば、リポソーム）懸濁液の第二脂質若しくはリン 脂質に付着したＮＴＡ残基の一部が該膜の外部表面に向いているものである リポ
ソームの懸濁液を調製する工程、この工程では、該リポソームは、該リポソーム 内に封入され／組み込まれ得る任意の薬物若しくは治療用の作用物質の存在下で も調製でき、又はこれらの薬物を調製後に含まることもできるものである 、 （ii) 該リポソームを、ポリペプチドタグがＮＴＡキレート結合を介して該リ ポソームの外部に面しているＮＴＡ残基に付着するのに十分な時間及び条件の下 で 、適当な金属親和性タグを保持する組換えタンパク質又は標的分子とインキュ
ベートする工程、及び （iii) 必要ならば、過剰のタンパク質を洗浄、濾過又は他の洗浄手段により
除去し、該リポソームを適当な溶液に懸濁する工程、 を含む方法が提供される。 （iv) 封入され／組み込まれた薬物若しくは作用物質を含む植え付けられた リポソームをイン・ビボ投与して、治療目的のために特定の細胞型若しくは組織 に標的化された送達を可能とする工程、 を含む方法が提供される。
【００３１】 好ましい実施態様では、該分子は下記の工程、即ち （i) ＮＴＡ−ＤＴＤＡのそれにほぼ等しい濃度のＮｉ2+又はＺｎ2+を含むＰ
ＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）などの水性溶液中の１−パルミトイル−２−オレオ
イル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などのリン脂質及びＮＴＡ−ＤＴＤＡ
などのキレート脂質の混合物からリポソームの懸濁液を調製する工程。このリポ
ソームはＴｍより高い温度で５〜１０分間該混合物を超音波処理することにより
調製できる。または、該リポソームは該脂質をエタノール溶液に溶解し、次いで
水性緩衝液に分散させることにより、又は脂質の水性懸濁液（acqeous suspensi
on) を適当な孔サイズのポリカーポネート若しくは類似のフィルターを通して押
し出すことによっても調製できる。典型的には、ＰＯＰＣ：ＮＴＡ−ＤＴＤＡの モル比は、１０：１である 、そして最終の総脂質濃度は約０．５ｍＭであるが、
それぞれは異なっていてもよい。 （ii) ペレット化（４℃で約９５，０００×ｇで３０分間の遠心分離による
）により該リポソームを洗浄し、その上清を除去する工程、又は濾過により洗浄
する工程、そして次いで標識化タンパク質（単数又は複数）とのインキュベーシ
ョンを容易にするため緩衝溶液の適当容量に該リポソームを懸濁する工程、 (iii) 該リポソームを、組換えタンパク質（例えば、ヒトヘキサ−ヒスチジ
ン標識ＶＥＧＦ，血管内皮成長因子）、又はそれぞれが該リポソーム上にそれを
固定させるためのヘキサ−ヒスチジン若しくは他の適当な金属親和性タグを保持
する異なる組換えタンパク質の組合せとインキュベートする工程、及び （iv) 上の工程（ii) におけるように、該リポソームを洗浄することにより
過剰の可溶性タンパク質又は組み込まれなかった可溶性タンパク質を除去し、次
いでイン・ビボ投与に適するＰＢＳ若しくは他の緩衝溶液にそれを懸濁する工程
、 によりリポソーム上に植え付けることができる。
【００３２】 異なる脂質又は脂質の異なる組合せも該キレーター脂質と関連して該リポソー
ムに特異的性質を付与するために使用することができる。例えば、ガングリオシ
ドＧＭ１又はポリエチレングリコール誘導体を該混合物（上の工程（i)の) に含
め、イン・ビボワクチンとして使用される場合、マクロファージにより又は肝臓
や脾臓により捕らえられるのを避けるための「忍び（stealth)」性（９）を持つ
リポソームを作成することができる。また、工程（i)は、該物質を封入し、イン
・ビボ投与されるとき、植え付けられた分子（単数又は複数）の特異性により規
定される特定の細胞又は組織に送達されることが可能なように、薬物、ＤＮＡ又
は他の治療用の作用物質の存在下に行うことができる。例えば、ＶＥＧＦ（血管
内皮成長因子）が植え付けられたリポソームはＶＥＧＦ受容体を発現することが
知られそして腫瘍成長に要求される血管形成性内皮を標的とするために使用でき
る。従って、ＶＥＧＦが植え付けられたリポソームは、腫瘍成長のために必要な
新血管の成長を阻止できる細胞障害性薬物若しくは作用物質を送達するために使
用することができる。上記細胞障害性薬物若しくは細胞障害性作用物質はリポソ
ームの内部に封入される。
【００３３】 本発明のこの側面に適当な分子の例としては、治療用分子、薬学的化合物及び
ＲＮＡやＤＮＡなどの核酸分子が挙げられる。特に有用な分子はＶＥＧＦ又はそ
の同族体である。ＶＥＧＦ及びその同族体はＶＥＧＦ受容体を保持する細胞へリ
ポソームを標的化するのに有用でもある。従って、本発明のこの側面により意図
される分子には、標的組織上に結合相手を有する分子が含まれる。該分子は封入 され若しくは組み込まれた薬物若しくは治療用作用物質をも含む リポソーム上に 植え付けられることが好ましい。
【００３４】 活性物質の例としては、組換えポリペプチド、共刺激分子、治療用薬物又は核 酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。一つの例では、腫瘍の成長に必 要な新血管の成長を阻止する目的で細胞障害性薬物を標的化するため、ＶＥＧＦ をリポソームの上に植え付ける。
【００３５】 生体膜及び／又は合成膜、リポソーム又は小胞も、ワクチンを開発するため及
び／又はイン・ビボ投与の際特定の生物学的効果又は治療効果を得るため、組換
え分子を植え付けることができる。
【００３６】 病気への免疫（例えば、腫瘍への免疫応答、以下を見よ）を変えるためのワク
チンとして使用するため細胞の表面を改変する現行の方法は、該細胞の表面上で
一つ以上の特異的タンパク質（単数又は複数）を発現するように細胞を誘導する
ため、一般に、腫瘍細胞のトランスフェクション又は遺伝的操作を必要とする（ １０〜１２） 。例えば、動物腫瘍モデル及びヒト腫瘍モデルの両方で、細胞表面
でＢ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ４０及びＩＣＡＭ−１な
どのＴ細胞共刺激分子を発現するように細胞を誘導する遺伝子を持つ腫瘍細胞の
トランスフェクションが、腫瘍保持宿主の腫瘍免疫を増強するためのワクチン接
種に使用する細胞を調製する有用なアプローチであることが証拠により、示唆さ
れる（１３〜２１）。不幸にも、ヒトの癌の治療におけるような臨床的設定では
、このようて遺伝子を持つ腫瘍細胞のトランスフェクションは時間が掛かり且つ
不便である。こうして、トランスフェクションの頻度は一般に低く、そして複数
遺伝子のトランスフェクション（腫瘍細胞の表面で複数のタンパク質の発現を誘
導すること）を首尾よく行うことは困難である。さらに、トランスフェクション
技法は、一見無害なウイルスベクターを用いて行うときでさえも、該遺伝子の発
現又はゲノムへのその組み込みを正確に制御することの困難さのため患者への危
険を伴うことになる。
【００３７】 本発明は、腫瘍や他の疾病に対するヒトの免疫を増強し又は改変するためのワ
クチンとして使用できる（腫瘍細胞などの）細胞及び他の膜構造物（生体又は合
成いずれかの）の表面に、共刺激分子若しくは他の分子を直接植え付ける、より
便利で安全な方法をさらに提供する。
【００３８】 こうして、ＮＴＡ−金属キレート結合は、一旦、キレーター脂質（例えば、Ｎ
ＴＡ−ＤＴＤＡ）が該膜に組み込まれ、それによりこれらの膜の生物学的特性を 改変する 便利な方法を提供すれば、生体膜（例えば、細胞の膜若しくは細胞レベ
ル下の粒子の膜）の上に分子を直接植え付けるために使用できる。
【００３９】 本発明のさらなる側面は、こうして、標的細胞、又は膜成分又は膜構造物の免
疫原性を変える方法を提供する。これは、細胞若しくは膜構造物の上に外来ポリ
ペプチド、多糖類、糖タンパク質、受容体、リガンド、及び他の分子を植え付け る ことにより容易に達成されうる。腫瘍細胞などの細胞又はその成分の免疫原性
を変えることは腫瘍細胞に対する免疫応答を増強できる細胞系のワクチン若しく は薬物を製造 する有用な方法である。
【００４０】 従って、本発明のこの側面では、標的細胞又はその膜成分の免疫原性を変える
方法であって、下記の工程 (i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 (ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液をキレーター脂質又はキレート脂質を含むリ ポソーム の懸濁液とインキュベートして、該キレート脂質を該細胞若しくは膜構 造物の膜の中に組み込ませる 工程、 （iii) 必要ならば、過剰の又は組み込まれなかった脂質若しくはリポソーム を洗い流す工程、 （iv) 該細胞若しくは膜構造物を、固定すべき該分子の溶液とインキュベー
トする工程、及び （v) 必要ならば、過剰の若しくは結合していない可溶性分子を洗い流し、
そして該細胞若しくは構造物をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程、
により該標的細胞若しくはその成分の膜の上に分子を植え付ける工程を含む方法
が提供される。
【００４１】 好ましい実施態様では、本発明は下記の方法、即ち （i) 細胞又は膜構造物の懸濁液を、ＰＢＳ又は他の水性緩衝溶液で洗浄して
過剰の可溶性タンパク質及び／又は緩く結合しているタンパク質を除去する工程
。これは適当な遠心分離（例えば、ネズミ及びヒトの細胞では２００〜５００×
ｇで５分）により該構造物をペレット化し、次いでこれをＰＢＳに再懸濁するこ
とにより行われる。構造物によっては、過剰の可溶性若しくは緩く結合したタン
パク質は濾過又は他の洗浄手段により除去されうる、 （ii) ＰＢＳ溶液中の脂質の適当量を５〜１０分間超音波処理することによ
り、ほぼ等しい濃度のＺｎ2+か又はＮｉ2+を含むＰＢＳ中のキレーター脂質（例
えば、約０．１ｍＭの濃度のＮＴＡ−ＤＴＤＡ）の懸濁液を調製する工程。膜構
造物の中にリポソームの融合及び組み込みを促進するため、他の脂質又はリン脂
質（例えば、ＰＯＰＣ）又は他の試薬を該キレーター脂質と共に含めることもで
きる、 （iii) 懸濁液中の脂質の一部を該構造物中に融合及び／又は組み込ませるの
に適当な時間及び温度（例えば、３７℃で３０分）の下で、該細胞又は膜構造物
をＰＢＳ中のキレーター脂質（例えば、０．１ｍＭのＮＴＡ−ＤＴＤＡ）の懸濁
液とインキュベートする工程。注意：採用されたインキュベーション条件は、使
用するキレーター脂質の性質及び脂質が組み込まれる具体的膜構造物に適合する
ように変えることができる。また脂質の融合及び組み込みを促進するため、イン
キュベーション又は洗浄工程をポリエチレングリコールなどの添加物を含む緩衝
液中で行うこともできる、 （iv) 必要ならば、上の工程（i)におけるように、ペレット化及び洗浄によ
りＰＢＳで該細胞若しくは膜構造物を洗浄することにより、混合物から組み込ま
れなかった脂質を除去する工程、 （v) 組み込まれたキレーター脂質を含む洗浄された細胞若しくは構造物を、
組換えタンパク質の溶液、又はそれぞれがヘキサ−ヒスチジン又は任意の他の適
当な金属親和性タグを含む異なる組換えタンパク質の混合物の溶液とインキュベ
ートする工程、及び （vi) （上の工程（i)におけると同様に）ＰＢＳで該細胞又は構造物を洗浄
して過剰な又は結合していない可溶性組換えタンパク質を除去する工程、を用いて、標的細胞若しくはその膜成分の免疫原性を変えることを可能とする。
【００４２】 同様な手順は、任意の標的細胞又は細胞レベル下のその膜成分の免疫原性を変 える ために使用できる。このように処理された構造物はキレーター脂質の組み込 み及び タンパク質の植え付けにより改変された表面を含み、そしてイン・ビボの
免疫学的応答を変えるためのワクチン接種に用いることができる。イン・ビボ投
与される場合、これらの改変された構造物は体内の特定の細胞型又は組織を標的
化するために使用し、それによりこれらの細胞又は組織の応答を誘導し又はこれ
らの細胞又は組織の機能を変えることができる。例えば、樹状突起細胞上の受容
体と結合することが知られている分子を腫瘍細胞に植え付ける方法は、腫瘍抗原
提示、従って該腫瘍に対する免疫学的応答の増強を目的として、植え付けられた
腫瘍細胞を樹状突起細胞へ向けるために採用することができる。
【００４３】 この形において、本発明は、細胞の膜などの生体膜及び細胞レベル下の膜成分 の生体膜の生物学的及び免疫学的特性を変える 方法を意図する。とりわけ、本発
明は、キレーター脂質を組み込み得る、細胞（例えば、腫瘍細胞）、任意の細胞
の膜成分若しくは細胞レベル下の膜成分、感染体又は感染粒子（例えば、細菌）
の表面、並びに任意の生体膜又は合成小胞若しくはリポソームを含む合成膜の表
面を改変するための便利な戦術の基礎を提供する。これらの全ての例において、
組換えタンパク質はタンパク質上のぺプチドタグと膜構造物中に組み込まれたキ
レーター脂質の上のＮＴＡ頭部基との間の金属キレート結合の形成により植え付
けられる。生体膜は適当なタグを持つ任意の組換えタンパク質、糖タンパク質及
び任意の他の分子構造物の固定により改変され、そしてイン・ビボ投与される場
合、ワクチンとしてか又はこれらの生体膜の特定の細胞及び組織への送達を標的
化するための試薬として使用される場合、疾病への免疫を増強するように設計さ
れる。
【００４４】 より具体的実施態様においては、本発明は治療効果を達成することを目的とし て体内の特定の細胞型若しくは組織に細胞、生体膜及び／又は合成膜を標的化す る方法 であって、下記の工程、即ち (i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、 (ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベート して、該脂質を組み込ませる 工程、 （iii) 必要ならば、過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程
、 （iv) 該リポソーム、細胞、又は膜構造物を、固定すべき分子の溶液とイン
キュベートする工程、及び （v) 必要ならば、過剰の可溶性分子又は結合していない可溶性分子を洗い
流し、次いで該リポソーム、細胞、又は構造物をイン・ビボ投与に適する溶液に
懸濁する工程、により、標的とすべき特定の細胞型若しくは組織の上に結合相手を有する分子を 植え付ける工程を含む方法を記述する。
【００４５】 従って、本発明は、ＮＴＡ−ＤＴＤＡのようなキレーター脂質の腫瘍細胞膜へ
の組み込み、それに続く適当な標識を持つ組換え共刺激分子及び／又は他の分子
（又は分子の組合せ）を植え付けることを可能とし、腫瘍免疫を増強するための
細胞系ワクチンの開発における便利なアプローチでありうる。従って、その証明
された腫瘍免疫を変える能力と同様に、本技術は、特定の共刺激分子及び／又は
他の細胞表面分子（又はこのような分子の組合せ）を、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び樹状
突起細胞などの他の細胞型の上に植え付け、このような分子が免疫機能を調節す
る際にどのような役割を果たすかを調べるための便利なアプローチを提供するこ
とも期待できる。従って、癌免疫治療法におけるその潜在的使用に加え、本明細
書に記述した技法は免疫機能のわれわれの理解を顕著に高めうるであろう分野へ
の適用も生ずる。
【００４６】 本発明のさらに別の一側面は、イン・ビボ投与される場合、免疫応答又は他の 生理学的若しくは生物学的応答の誘導又は調節などの特定の治療効果を達成する ため生体膜及び／又は合成膜及びリポソームを改変する方法であって、下記の工 程、即ち （i) キレーター脂質又は脂質とキレーター脂質の混合物からなるリポソーム の懸濁液を調製する工程、又は （ii) 細胞又は膜の懸濁液をキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液とイン キュベートし、必要ならば、過剰の若しくは組み込まれなかった脂質若しくはリ ポソームを洗い流す工程、 （iii)該リポソーム、細胞又は膜構造物を、適当な金属親和性タグを有する組 換えタンパク質（単数又は複数）又は標的分子（単数又は複数）の溶液とインキ ュベートする工程、及び （iv) 過剰の若しくは結合していない可溶性タンパク質を洗い流し、ついでイ ン・ビボ投与に適する溶液に該リポソーム、細胞又は膜構造物を懸濁する工程、 を含む方法を提供する。
【００４７】 上述したように、本発明は細胞の免疫原性を変える方法を提供する。従って、
本発明は、活性物質及び任意選択的に固定され又は植え付けられた、結合相手又
は標的組織を有する分子を含むリポソーム調製物又は膜物質の有効量を被験者に
投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００４８】 より具体的には、本発明は、封入され若しくは組み込まれた薬物若しくは活性 物質、及びイン・ビボで標的とされるべき特定の細胞型若しくは組織の上に結合 相手を有する植え付けられた標的に向かう分子、を含むリポソーム調製物又は膜 物質の有効量を被験者に投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００４９】 本発明の別の一側面は、ワクチンが投与される被験者の免疫学的応答を改変で
きる分子が植え付けられている細胞又は膜物質を含むワクチン組成物であって、
該ワクチンが一つ以上の薬学的担体及び／又は希釈剤をさらに含むものである組
成物を提供する。細胞又は膜物質に植え付けられる分子は共刺激分子であること
が好ましい。さらに、該ワクチンは下記の工程、即ち （i) 細胞又は膜物質をＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのキレーター脂質とインキュベ
ートして該脂質を該細胞又は膜に組み込ませる工程、 （ii) 組み込まれていない脂質を遠心分離又は濾過により洗い流し、該構造物
を適当な溶液又は緩衝液に再懸濁する工程、 （iii) キレーター脂質が組み込まれた該膜構造物を、植え付けるべき該分子と
インキュベートする工程、及び （iv) 組み込まれなかった分子物質を洗い流す工程、 により製造することが好ましい。
【００５０】 関連する実施態様では、本発明はワクチンが投与される被験者の免疫学的応答 を改変できる分子を植え付けられた細胞、リポソーム、小胞又は膜物質を含むワ クチン組成物であって、一つ以上の薬学的担体及び／又は希釈剤をさらに含むワ クチン組成物を提供する。
【００５１】 本発明は、動物の免疫応答を改変するための医薬の製造における、作用物質が 植え付けられ、封入され及び／又は固定された膜システムの使用を提供する。
【００５２】 本発明の好ましい動物はヒト、霊長類、家畜、実験室試験動物及び捕獲された
野性動物である。
【００５３】 「固定する」及び「植え付ける」などの用語は、本明細書を通じて相互変換可
能なように使用されうる。「植え付ける」という用語は「移植する」という用語
も包含する。「膜」及び「脂質膜」という用語は脂質層と同様に生体膜及び合成
膜への言及を含む。「キレーター脂質」は、ＮＴＡ−ＤＴＤＡなどの適当なキレ
ーター脂質でありうるが、これに限定されない。
【００５４】 本発明のさらに別の一側面は、体内の特定の細胞型若しくは組織に、細胞、生
体膜及び／又は合成膜及びリポソームを標的として向かわせる方法であって、標
的化の対象となる特定の細胞若しくは組織の上に結合相手を有する分子を下記の
工程、即ち （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
る工程、又は （ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液を、キレーター脂質の懸濁液とインキュベー
トして、該脂質を組み込ませる工程、 （iii) 必要ならば、過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程
、 （iv) 該リポソーム又は膜構造物を、固定すべき分子の溶液とインキュベート
する工程、及び （v) 必要ならば、過剰の又は結合していない可溶性分子を洗い流し、そして
イン・ビボ投与に適する溶液に該リポソーム又は構造物を懸濁する工程、 により膜構造物の上に植え付ける工程を含む方法を意図する。
【００５５】 下記の材料及び方法は、以下に述べる実施例のいくつかに関する。
【００５６】試薬 分析等級の試薬を全実験で用いた。パラホルムアルデヒドはＢＤＨケミカルズ
社から入手した。ＺｎＳＯ4 は緩衝液及び増殖培地へのＺｎ2+の添加全てに使用
した。ＲＰＭＩ１６４０及びＥＭＥＭ（イーグルス最小必須培地）の両方はギブ
コ社（ライフ・テクノロジーズ、メルボルン、オーストラリア）から入手した。
胎児仔牛血清（ＦＣＳ）はトレース・サイエンティフィック社（ノーブル・パー
ク、ビクトリア州、オーストラリア）から入手した。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビ
オチンはピアス社（ロックフォード、イリノイ州）から入手した。Ｎａ51ＣｒＯ 4 、［ 3Ｈ］−チミジン、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
共役ストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ）はアマーシャム社（
英国）から入手した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ
）、α−パルミトイル−β−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、イソパーク（Isopaque）
、フィコール、プロピルガレート（propyl gallate）、並びにポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）調製物のＰＥＧ400 、ＰＥＧ600 、ＰＥＧ900 、及びＰＥＧ15 00 は、シグマ−アルドリッチ社（キャッスル・ヒル、ニューサウスウェールズ、
オーストラリア）から入手した。マイクロサイント（MicroScint）シンチレーシ
ョン液並びにトップカウント（Topcount）ＮＸＴマイクロプレートシンチレーシ
ョンカウンターとともに使用する９６穴プレート用のフィルター及びシールなど
他の品目は、キャンベラ・パッカード社（キャンベラ、オーストラリアン・キャ
ピタル・テリトリー、オーストラリア）から入手した。
【００５７】マウス及び細胞系統 雌及び雄のＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｈ−２d ）は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞細胞障害
の測定、並びにワクチン接種及びインビボでの腫瘍成長の観察のためのリンパ組
織（脾臓）の単離に用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｈ−２ｂ）はＴ細胞増殖
の同種異系刺激を評価する実験に用いた。このマウスは６〜８週齢で使用しアニ
マル・ブリーディング・エスタブリッシュメント、ジョン・カルティン・スクー
ル・オブ・メディカル・リサーチ（ＪＣＳＭＲ）、オーストラリア国立大学（Ａ
ＮＵ）、キャンベラから入手した。マウス細胞系統のＰ８１５[ マウスＤＢＡ／
２（Ｈ−２d ）マスト細胞腫] 及びＥＬ４[ マウスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b ）
] Ｔ細胞リンパ腫は、それぞれピイ・ヴァーリング博士（免疫学及び細胞生物学
の部門、ＪＣＳＭＲ）及びエイチ・オニール博士（生化学及び分子生物学の部門
、ＡＮＵ）から得た。両細胞系統は１０％v/v のＦＣＳを含有するＥＭＥＭから
成る完全培地で培養した。
【００５８】ＮＴＡ−ＤＴＤＡの合成 ジテトラデシルアミン（ＤＴＤＡ）に共有結合したニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ
）の頭部基から成るキレーター脂質のニトリロトリ酢酸ジテトラデシルアミン（
ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）は、先述したもの（２２）と同様な手順に従ってシイ・イー
ストン博士（リサーチ・スクール・オブ・ケミストリー、ＡＮＵ）により合成さ
れた。簡潔に述べれば、このＤＴＤＡはブロモテトラデカン及びアンモニアから
合成した。次いで、ＤＴＤＡは無水コハク酸でＮ−スクシニル化し、Ｎ−スクシ
ニル−ＤＴＤＡ（ＤＴＤＡ−ｓｕｃ）を調製し、これをＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）と反応させ、Ｎ−[ （ヒドロキシスクシンイミジル）スクシニ
ル] −ＤＴＤＡ（ＤＴＤＡ−ｓｕｃ−ＮＨＳ）を調製した。ＤＴＤＡ−ｓｕｃ−
ＮＨＳのスクシンイミジル基はＮα−tert−ブチルオキシカルボニル−リシン（
Ｎ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ）基で置換し、このブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を
取り除いてＮε−[ （ＤＴＤＡ）スクシニル] −Ｌ−リシン（ＤＴＤＡ−ｓｕｃ
−Ｌｙｓ）を調製した。最後にＤＴＤＡ−ｓｕｃ−Ｌｙｓはブロモ酢酸と反応さ
せＮα，Ｎα−ビス[ カルボキシメチル] −Ｎε−[ （ＤＴＤＡ）ｓｕｃ] −Ｌ
−リシンを調製し、これをＮＴＡ−ＤＴＤＡと呼ぶ。各産物の純度は薄層クロマ
トグラフィーにより測定し、最終産物の同定は核磁気共鳴分光法、フーリエ変換
赤外分光法、及び質量分光法により確認した。最終産物の純度は９９％を上回る
と見積もられた。
【００５９】ＮＴＡ−ＤＴＤＡリポソーム懸濁液の調製 ＮＴＡ−ＤＴＤＡを細胞内へ組み込むため、乾燥させたＮＴＡ−ＤＴＤＡを、
最大振幅で２分間ＴＯＳＣＯ１００Ｗ超音波破砕器による音波処理により、0 ．
5 ｍＭのＺｎ2+を含有するＰＢＳ中に0 ．5 ｍＭの濃度になるよう懸濁した。こ
の同一手順は、ＤＭＰＣ懸濁液、並びにＮＴＡ−ＤＴＤＡとＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ
、又はＤＯＰＥとの混合液を作製するために用いた。脂質の保存用懸濁液は−２
０℃で貯蔵し、実験の使用前に常に再音波処理し指示濃度まで希釈した。
【００６０】モノクローナル抗体 該モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びそれらの起源は下記の通りであった：マ
ウス抗−ＣＤ４０（クローン３／２３、ラットＩｇＧ2a）及びマウス抗−ＣＤ３
（クローン１４５−２Ｃ１１、アメリカハムスターＩｇＧ）のｍＡｂは両方とも
ファーミンゲン社から入手した；マウス抗−Ｂ７．１（クローン１６−１０Ａ１
、アメリカハムスターＩｇＧ）ｍＡｂはザ・ウォルター・アンド・エリザ・ホー ル・インスティチュート・オブ・メディカル・リサーチ，メルボルン，オースト ラリアから入手した 。指摘する場合、ｍＡｂは先述したように（２３）スルホ−
ＬＣ−ビオチン（ピアス社）と反応させることによりビオチン化した。
【００６１】組換えタンパク質 マウスＴ細胞共刺激分子のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＣＤ４０の細胞外領域、
並びにヒトのエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）の細胞外領域の組換え形は、
各々がヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）タグを備えており、それぞれＢ７．１−６
Ｈ、ＣＤ４０−６Ｈ、及びＥＰＯＲ−６Ｈと示し、バキュロウイルス発現系を用
いて生産した。簡潔に述べれば、マウスのＢ７．１、ＣＤ４０及びＥＰＯＲの細
胞外ドメインをコードする遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅
し、６Ｈｉｓタグの配列は該タグ配列を含むプライマーを用いたＰＣＲにより各
遺伝子の末端（該タンパク質のカルボキシル末端に対応する）内に組み込んだ。
次いで、該構築物を個々に該ｐＶＬ１３９３プラスミドバキュロウイルストラン
スファーベクター内に連結し大腸菌を形質転換するために用いた。適切な形質転
換体を選択し、これらの形質転換体から得た組換えｐＶＬ１３９３プラスミドを
該バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶとともにＳＦ９昆虫細胞内に共トランスフェク
ションした。ｐＶＬ１３９３プラスミドをウイルスゲノム内に組込ませたウイル
スに感染した細胞を、プラーク検定により選択し、更に増幅し、これらのウイル
ス保存液をエクスプレス−５培地中で増殖させた High-５昆虫細胞を感染させる
ために使用した。組換えタンパク質は、Ｎｉ2+−ＮＴＡアフィニティクロマトグ
ラフィー（Ｎｉ2+−ＮＴＡスーパーフローを用いる、キアーゲン社、シフトン・
ヒル、ビクトリア州、オーストラリア）後、スーパーデックス−７５ＨＲ１０／
３０カラムを用いてＦＰＬＣ（ファルマシア・バイオテク社、アップサラ、スウ
ェーデン）上でのサイズ排除ゲル濾過により組換えウイルスに感染した High-５
細胞の上清から精製した。各タンパク質の最終純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判
断して＞９５％であった。幾つかの実験用に、組換えタンパク質は先述したよう
に（２３）スルホ−ＬＣ−ビオチン（ピアス社）と反応させることによりビオチ
ン化した。このタンパク質は０．２〜０．６ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に常套
的に−２０℃で保存した後、各実験の使用前に３７℃で解凍し穏やかに攪拌した
。
【００６２】組み込み並びにＮＴＡ−ＤＴＤＡ組み込みの最適化 培養したＰ８１５腫瘍細胞はＰＢＳ中で二回洗浄し、該培地からタンパク質を
得て１×１０7 細胞／ｍＬになるようＰＢＳ中に懸濁した。次いで、該細胞は、
９６穴Ｖ底型のセロクラスタープレート（コースター、コーニング社、ニューヨ
ーク）内に１．８×１5 細胞／穴で分注し、１２５μＭのＺｎ2+を含有するＰＢ
Ｓ中で１２５μＭのＮＴＡ−ＤＴＤＡ（単独で又は指示した他の脂質との混合物
として）又は１２５μＭのＤＭＰＣ（対照）とともに３７℃で４０分間インキュ
ベートした。インキュベーション後、組み込まれていない脂質は０．１％v/v の
ＢＳＡ（ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで三回洗浄することに
より取除いた。組み込まれたＮＴＡ−ＤＴＤＡの相対レベルは、該細胞をビオチ
ン化６Ｈｉｓペプチド（Ｂ−６Ｈｉｓ）（０．２μｇ／ｍＬ）とともに４℃で３
０分間インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄し、次いでス
トレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した後、ＦＡＣＳ分析（以下を参照）により
常套的に評価した。該細胞は、１％v/v のＢＳＡ（ＰＢＳ−１％v/v ＢＳＡ）を
含有するＰＢＳ中で４℃で３０分間ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（３３μｇ／
ｍＬ）とともにインキュベートし、ＰＢＳ−１％v/v ＢＳＡで三回洗浄し、ＰＢ
Ｓ中で２％v/v のパラホルムアルデヒドで固定した後、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣ
−フルオレセンスについて分析した。
【００６３】 ＮＴＡ−ＤＴＤＡリポソームの融合を促進するため、従って細胞膜内へのＮＴ
Ａ−ＤＴＤＡの組み込みを促進するため、細胞と脂質層をもつ小胞との融合を強
めることが以前に報告された幾つかの薬剤を試験した。上述した９６穴Ｖ底型セ
ロクラスタープレート内に分注したＰ８１５細胞を、１２５μＭのＮＴＡ−ＤＴ
ＤＡ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、若しくはＤＯＰＥとともに、又は１２５μＭのＮＴ
Ａ−ＤＴＤＡとＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、若しくはＤＯＰＥ（示したモル比で）とと
もに、３７℃で４０分間１２５μＭのＺｎ2+を含有するＰＢＳ中でインキュベー
トした。幾つかの実験用に、該細胞はインキュベーション後にＰＥＧで処理した
。即ち、該細胞を、ペレット化し、１５％のＰＥＧ400 中に懸濁し、無血清ＥＭ
ＥＭと混合し１０倍に希釈した後、血清を含有するＥＭＥＭで一回、ＰＢＳ−０
．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄し、ビオチン化組換えタンパク質（以下参照）を該
細胞に植え付けた後、ＦＡＣＳ分析用に上記のストレプトアビジン−ＦＩＴＣで
染色した。
【００６４】組換えタンパク質を細胞上に植え付ける 組み込まれたＮＴＡ−ＤＴＤＡを含む細胞は、精製されたＢ７．１−６Ｈ及び
ＣＤ４０−６Ｈ（又は示したようにこれらのビオチン化形態）と、単独（それぞ
れ５０μｇ／ｍＬで）又は組合わせ（１００μｇ／ｍＬの全タンパク質、４：１
のＢ７．１−６Ｈ：ＣＤ４０−６Ｈモル比）のいずれかで、４℃で１時間、９６
穴Ｖ底型セロクラスタープレート内でインキュベートした。次いで、未結合のタ
ンパク質をＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄することにより除去した後、
該タンパク質を植え付けられた細胞を免疫検定又はＴ細胞増殖検定のいずれかに
用いる。ＦＡＣＳ分析により結合タンパク質のレベルを決定する実験用に、該細
胞を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（植え付けられビオチン化されたタンパク
質を含む細胞について）で染色した、又はまず適切なビオチン化ｍＡｂ（Ｂ−ｍ
Ａｂ）で（４℃で３０分間）インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで
二回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。
【００６５】時間的経過 植え付けられたＣＤ４０−６Ｈの存在下又は非存在下でＮＴＡ−ＤＴＤＡ及び
ＤＭＰＣを組み込んだ細胞を、１０％v/v のＦＣＳ及び５０μＭのＺｎ2+を含有
するＥＭＥＭ中に懸濁し、３７℃で約２分間（時間０）、若しくは４分間若しく
は２４時間、１２穴平底の組織培養用プレート（リンブロ、ＩＣＮバイオメディ
カル社、オーロラ、オハイオ州）でインキュベートした。上記のインキュベーシ
ョン時間後に、細胞を該１２穴平底プレートから回収し、９６穴Ｖ底型セロクラ
スタープレートに移し、ＰＢＳ−０．１％v/v ＢＳＡで二回洗浄した。その後、
（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ及び植え付けられたＢ−ＣＤ４０−６Ｈを含む細胞について
）ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した、又は（ＮＴＡ−ＤＴＤＡのみを含
む細胞について）まずＢ−ＣＤ４０−６Ｈでインキュベートした後ＰＢＳ−０．
１％v/v ＢＳＡで洗浄しストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。
【００６６】フローサイトメトリー 蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析は、Ｂ−６Ｈｉｓの結合後に細胞膜内
に組み込まれたＮＴＡ−ＤＴＤＡの相対レベル、並びに組み込まれた該ＮＴＡ−
ＤＴＤＡを介して該細胞表面に固定されたビオチン化組換えタンパク質のレベル
を定量するために用いた。フローサイトメトリー分析は、１５ｍＷのアルゴンイ
オンレーザーを備えたＦＡＣソートフローサイトメーター（ベクトン・ディッキ
ンソン社、サンジョゼ、カリフォルニア州）を用いて実施した。細胞は、前方光
散乱（ＦＳＣ）、側方光散乱（ＳＳＣ）及びＦＩＴＣ蛍光に基づいて分析した。
バックグラウンドより上の蛍光強度における相関シフトは、ＮＴＡ−ＤＴＤＡ組
み込みのレベル及び細胞表面上のペプチド又は組換えタンパク質のレベルの半定
量的測定を提供する。通常、10,000個の細胞の蛍光情報を対数増幅器を用いて各
状態について集め、データをセルクエスト（ベクトン・ディッキンソン社）ソフ
トウェアを用いて処理した。データを、ＦＳＣ対ＳＳＣのドットプロットにより
判断されるように生細胞をゲーティングし、蛍光強度をヒストグラムとしてプロ
ットすることにより分析した。該対照試料をバックグラウンドとして使用しピー
クからピークまでの蛍光強度のシフトを測定することにより、バックグラウンド
より上の蛍光強度における増加が決定された。次いで、独立実験の結果は、平均
値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
【００６７】共焦点顕微鏡法 Ｐ８１５細胞の表面上の該ＮＴＡ−ＤＴＤＡの分布は、ビオチン化ＣＤ４０−
６Ｈを植え付けられたＮＴＡ−ＤＴＤＡを組み込んだ細胞を用い、ストレプトア
ビジン−ＦＩＴＣで染色して、レーザー走査型共焦点顕微鏡法により研究した。
簡潔に述べれば、該細胞は、包埋液（８７％v/v のグリセロール中２％のプロピ
ルガレート）に懸濁し、穴をあけたスコッチ４６５粘着性転写テープを用いて形
成された顕微鏡スライド上の深さ0.05ｍｍのチャンバー内に入れ、次いで該チャ
ンバーをガラスカバー片で密封した。この細胞は、ニコン共焦点蛍光顕微鏡（×
６０ニコン対物レンズ）、バイオラッドＵＶレーザースキャナー、及びアルゴン
イオンレーザーを備えたイオンレーザーテクノロジーレーザーヘッド（モデル５
４２５、バイオラッド社）から成るＭＲＣ−５００レーザー走査型共焦点画像シ
ステム（バイオラッド社）を用いて５２０ｎｍの蛍光について調べた。該画像は
、１０の連続的なレーザー走査のカルマン平均により得て、イメージプロセッサ
ーＰＣ（バイオラッド社）を用いて保存し分析し、ＮＩＨイメージ１．６１ソフ
トウェアを用いて処理した。
【００６８】Ｔ細胞増殖検定 Ｔ細胞増殖検定で使用するマウスＴ細胞は、上記のように（２３）、同種異系
マウス又は同系マウスのいずれかの脾臓から単離し精製した。簡潔に述べれば、
該脾臓を単細胞懸濁液に解離し、死細胞及び赤血球細胞はイソパーク−フィコー
ル勾配を用いる密度勾配遠心分離により取除いた。遠心分離（４００×ｇで２０
分間）した後、主にリンパ球の生細胞を、該勾配の最上層から回収し、１０％v/
v のＦＣＳ、５×１０-5Ｍの２−β- メルカプトエタノール、１００i.u.／ｍＬ
のペニシリン、１００μg ／ｍＬのネオマイシン、IL−２、及び１０ｍＭのヘペ
スを含有するＲＰＭＩ１６４０中に懸濁した。Ｔ細胞は平衡化したナイロンウー
ルカラム（２５）を用いて精製した。次いで、この精製されたＴ細胞を、９６穴
平底プレート（セルウェルズ、コーニング社、ニューヨーク）内で２×１０4 細
胞／５０μＬ／穴の濃度で培地中に懸濁し、５％ＣＯ2 の大気中３７℃で培養し
た。
【００６９】 Ｔ細胞増殖検定は上記のように（２５）実施した。次いで、同系リンパ球又は
応答細胞を２×１０4 細胞／５０μＬ／穴の濃度でγ−照射された（５０００ラ
ド）刺激細胞とともに共培養した。刺激細胞は、記載したように先天性Ｐ８１５
腫瘍細胞、表面上にＮＴＡ−ＤＴＤＡを組み込んだＰ８１５細胞、並びに組換え
タンパク質を植え付けられたＰ８１５細胞を含んでいた。３７℃で４日間の共培
養後、該細胞を１穴につき１μＣｉの［ 3Ｈ］−チミジンを用いて６時間パルス
した。次いで、この細胞をフィルターメイト１９６細胞ハーベスター（パッカー
ド社）を用いて回収し、マイクロサイントシンチラント及びトップカウントソフ
トウェアを用いるトップカウントＮＸＴマイクロプレートシンチレーションカウ
ンター（パッカード社）により［ 3Ｈ］−チミジンの取り込みを評価した。
【００７０】細胞障害性検定 インビボの腫瘍に特異的なＣＴＬについての検定はチェンら（２６）により記
載されているものと同様な手法により実施した。同系ＤＢＡ／２マウスは、ＰＢ
Ｓ（対照）又は組換えタンパク質を植え付けられた１×１０5 個のγ−照射され
た（５０００ラド）Ｐ８１５細胞のいずれかを用いて皮下に免疫した。免疫後１
４日目にマウスから脾臓を取り出し、上述したようにイソパーク−フィコールを
用いる密度勾配遠心分離及びナイロンウール分画によりＴリンパ球（エフェクタ
ーＴ細胞）を単離した。次いで、エフェクターＴ細胞を、インキュベーション培
地に懸濁し、１×１０5 細胞／穴の濃度で２４穴平底プレート内に分注し、１×
１０5 個のγ−照射（５０００ラド）した天然のＰ８１５細胞とともに共培養し
た。共培養の５日後、該エフェクター細胞の細胞溶解活性を、上述したように（ ２６ ）標準的な51Ｃｒ遊離検定で評価した。簡潔に述べれば、２×１０6 個の天
然のＰ８１５細胞を２５０μＣｉの51Ｃｒ（Ｎａ51ＣｒＯ4 ）で９０分間標識し
た。標識された標的細胞を三回洗浄し培地に再懸濁した。エフェクター及び標的
細胞を、上述したように、エフェクターを標的に対する比を変えてエフェクター
細胞とともに３７℃で６時間共培養した。上清を回収し、51Ｃｒの遊離をトップ
カウントソフトウェア（パッカード社）を用いるトップカウントＮＸＴマイクロ
プレートシンチレーションカウンター（パッカード社）により評価した。特異的
溶解の百分率は下記の通りに算出した。
【００７１】
【数１】
【００７２】動物の免疫化及びインビボでの腫瘍攻撃 マウスは、上記（２６）と同様なプロトコルを用いて免疫化した。簡潔に述べ
れば、ＰＢＳ（対照）又は上記の植え付けられた組換えタンパク質を含む１×１
０5 個のγ−照射されたＰ８１５細胞を、０．２ｍＬ容積のＰＢＳ中に懸濁し、
２５ゲージの針及び１ｍＬの注射器を用いて同系ＤＢＡ／２マウスの毛剃りされ
た右背に注射した。１４日後に、該マウスを、該マウスの脾臓から単離されたＴ
細胞を用いる細胞障害検定に使用した、または毛剃りされた左背に皮下注射する
ことにより１×１０5 個の天然のＰ８１５細胞で攻撃した。腫瘍成長を観察する
ために、該マウスはカリパスを用いて二つの直角をなす直径をミリメーターで測
定することにより（２６）一週間に一度腫瘍の大きさを記録した。生存率データ
は、記録時にまだ存命していた動物を表し、死にかけていた動物は記録後に安楽
死させたが腫瘍で死んだと考えられた。各実験条件の群における合計１０又は１
２匹のマウスについてのデータが提示される。
【００７３】 実施例１ ワクチンの開発及び薬物のイン・ビボ標的化を目的として、ヘキサヒスチジン
で標識化された分子を植え付けることによる細胞並びに他の生体膜及び／又は合
成膜及びリポソームの表面を改変するために本発明を使用すること（図１参照）
。
【００７４】 図２のヒストグラムは、植え付けられた組換えヘキサヒスチジン標識化ネズミ
のＢ７．１及びＣＤ４０を保持するネズミのマスト細胞腫Ｐ８１５細胞の蛍光標
示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）データを示す。Ｐ８１５細胞は、対照脂質のジミリ
ストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ，ｄｉ−Ｃ１４−ＰＣとも呼ぶ、対照
）又はキレーター脂質のＮＴＡ−ＤＴＤＡの懸濁液（０．１ｍＭ）とともに３７
℃で３０分間予めインキュベートし、ＰＢＳで洗浄後、ヘキサヒスチジンで標識
化されたＢ７．１及びＣＤ４０（それぞれ〜２０ｍｇ／ｍＬ）の混合物とインキ
ュベートした。次いで、該細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、上記のビオチン化１６
−１０Ａ１又はビオチン化Ｂ−３／２３のモノクローナル抗体（即ち、ビオチン
化された抗−Ｂ７．１又は抗−ＣＤ４０）のいずれかとともにインキュベート（
４℃で３０分間）することにより染色した後、ＦＩＴＣ結合ストレプトアビジン
とインキュベートした。ＤＭＰＣ及び組換えタンパク質とインキュベートした細
胞は、いずれかのモノクローナル抗体で染色した後、低レベルの蛍光を示す（対
照）。ＮＴＡ−ＤＴＤＡと予めインキュベートしたＰ８１５細胞の蛍光はＤＭＰ
Ｃで予めインキュベートした細胞の蛍光（対照）よりも１０〜１００倍強い。そ
れぞれの結果は反復実施した二回の実験の代表である。この結果は、キレーター
脂質（この場合ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）がこれらの細胞の膜内に組み込まれ得ること
、且つこの組み込まれた脂質が該ＮＴＡ−ＤＴＤＡを介してヘキサヒスチジンで
標識化されたＢ７．１及びＣＤ４０をＰ８１５細胞の表面上に直接固定又は植え
付けるために使用できることを示している。他の研究において、本発明者らは、
ヘキサヒスチジンタグをもつ組換えマウスのＢ７．１及びＣＤ４０が試験された
全ての異なる細胞系統表面上に植え付けられ得ることを示した。これらには、マ
ウスのＰ８１５細胞及びＥＬ４細胞、ヒトの白血病ジャルカット細胞並びに酵母
細胞が含まれる。
【００７５】 実施例２ 本実施例は、腫瘍免疫を強化するため腫瘍細胞の表面を改変する方法に関する
。
【００７６】 最近の研究から、Ｂ７−１及びＢ７−２の膜貫通領域及び細胞質領域はＴ細胞
の共刺激に必要とされないこと（２０）、並びに該Ｂ７−１がＧＰＩに固定され
た形で腫瘍細胞表面上に発現する場合にＴ細胞の共刺激も起きること（２１）が
示されている。また、任意の細胞表面受容体分子（例えば、マウスＴ細胞共刺激
分子のＢ７．１及びＣＤ４０）の細胞外領域は、カルボキシル末端上にヘキサヒ
スチジンタグ又は他の適切なペプチドタグを含むように生産させることができる
。この形態において、本発明は、これらの共刺激分子を正しい方向で該細胞表面
上に直接固定させ、それにより抗原提示細胞の表面上でこれらの分子の共刺激機
能を模倣する方法を提供する。従って、本発明は、腫瘍に対する免疫を強化する
ための免疫化で使用するため、共刺激物質及び／又は他の関連分子を腫瘍細胞上
に設けるためのトランスフェクションに対するより簡便で安全な代替法を提供す
ることにより腫瘍ワクチン開発に密接な関係を有する。
【００７７】 植え付けられた分子を使用できる可能性は、植え付けられた該分子に依存する
機能的応答を検定することにより試験できる。従って、植え付けられヘキサヒス
チジンで標識化されたＢ７−１及び／又はＣＤ４０を含むマウスＰ８１５マスト
細胞腫（ＤＢＡ／２、Ｈ−２ｄ）細胞が同種異系におけるＴ細胞増殖応答を刺激
する能力が、適切な数のγ−照射されたＰ８１５細胞（対照として）、又はヘキ
サヒスチジンで標識化されたＢ７−１及び／又はＣＤ４０を植え付けられたＰ８
１５細胞とともに共培養されたＣ５７Ｂ１／６（Ｈ−２ｂ）マウスから単離され
た脾臓細胞を用いて調べた。Ｔ細胞の増殖を測定するため３Ｈ−チミジンの取り
込みを用いる予備実験は、植え付けられヘキサヒスチジンで標識化されたＢ７−
１及び／又はＣＤ４０を保持するＰ８１５細胞がこの混合細胞反応における増大
したＴ細胞の増殖レベルを刺激できることを示している。これらの結果は、本発
明が抗腫瘍応答を強化するためのワクチン接種に用いる細胞を改変するのに役立
つということと一致している。
【００７８】 実施例３ 植え付けられた共刺激分子を保持するＰ８１５細胞のインビボでの抗腫瘍応答
を誘導する能力を試験するために、植え付けられた該分子を含むＰ８１５細胞で
マウスを免疫化し、これがＣＴＬ活性を刺激し及び／又は同系間動物での腫瘍成
長に影響を及ぼし得るか否かを確認した。ＤＢＡ／２マウスの個々の群は、ＰＢ
Ｓ又は植え付けられたＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、若しくはＢ７．１−６
ＨとＣＤ４０−６Ｈを含むγ−照射されたＰ８１５細胞のいずれかで免疫化した
。免疫化２週間後、該マウスから脾臓を摘出し、脾臓Ｔ細胞を単離し、標準的な 51 Ｃｒ遊離検定を用いて天然のＰ８１５細胞を殺す能力を評価した。図３のデー
タは、上記の全てのエフェクターと標的細胞の比（0.5 ：１、１：１、５：１）
において、ＰＢＳ（対照として）で免疫化されたマウスから得られたＴ細胞によ
り、ほんの低レベル（２〜５％）の溶解しか誘導されなかったことを示している
。Ｐ８１５−ＥＰＯＲ（対照タンパク質として）で免疫されたマウスから得られ
るＴ細胞の溶解活性も７〜１６％の低範囲であった。興味深いことに、試験した
全てのエフェクター：標的細胞の比において、腫瘍細胞に特異的な溶解のレベル
は、エフェクターＴ細胞が一つ以上の植え付けられた共刺激分子を含むＰ８１５
細胞で免疫されたマウスに由来するという条件の場合に、より高かった（図３参
照）。最も高い細胞溶解活性はエフェクター：標的細胞の比が５：１で観察され
た。そして、Ｂ７．１を植え付けられたＰ８１５細胞及びＢ７．１とＣＤ４０を
植え付けられたＰ８１５細胞でそれぞれ免疫化されたマウスから得られるＴ細胞
により誘導される特異的な溶解は、対照タンパク質を植え付けられたＰ８１５細
胞で免疫化されたマウスから得られたＴ細胞の特異的溶解より、それぞれ３倍及
び５倍高かった（図３参照）。Ｐ８１５細胞のかわりに天然のＥＬ４細胞を用い
た平行実験は、バックグラウンドレベルの溶解しか示さなかった、これは細胞溶
解応答が標的のＰ８１５細胞に対して特異的なものであったことを示している。
この結果は、Ｐ８１５細胞に対するＣＴＬ応答が、Ｂ７／ＣＤ４０を植え付けら
れたＰ８１５細胞で免疫化されたマウスで生じ得ることを示している。
【００７９】 共刺激分子を植え付けられたＰ８１５細胞によるマウスの免疫化が腫瘍免疫を
誘導できるか否かを決定するために、タンパク質を植え付けられたγ−照射細胞
で免疫されたマウスの群も、天然のＰ８１５細胞による攻撃後における腫瘍の成
長及び生存をモニターした。これらの研究により、対照タンパク質を保持する細
胞で免疫化されたマウスと比較して、共刺激分子を植え付けられたＰ８１５細胞
で免疫化されたマウスでは腫瘍成長の速度がより遅いことを示した。こうして、
腫瘍の攻撃５週間後における、平均の腫瘍直径は、Ｂ７．１−６Ｈ及びＢ７．１
−６ＨとＣＤ４０−６Ｈを植え付けられたＰ８１５細胞で免疫されたマウスにつ
いてはそれぞれ３．３６±１．０ｍｍ及び１．１±０．９ｍｍ、ＰＢＳ及びＥＰ
ＯＲ−６Ｈを植え付けられたＰ８１５細胞で免疫されたマウスについてはそれぞ
れ１０．７±２．５ｍｍ及び８．３±２．７ｍｍであった。攻撃後最初の５週間
のみの平均腫瘍直径に反映されている腫瘍成長のデータが提示してある、なぜな
らこの時から腫瘍で死ぬ動物がいたためである。腫瘍の攻撃後１４週目で、生存
率は、対照マウスで約１７％、Ｂ７．１を植え付けたＰ８１５細胞で免疫化され
たマウスで約３０％、そしてＢ７．１及びＣＤ４０を植え付けたＰ８１５細胞で
免疫化されたマウスで約６０％であった（図４の（ａ）及び（ｂ）参照）。観察
されたＣＴＬ活性の増加と一致して、この結果により、共刺激分子を植え付けら
れたＰ８１５細胞による同系間動物の免疫化は、天然のＰ８１５腫瘍による攻撃
後の該動物の腫瘍成長を阻害し生存を延長させ得ることが示される。
【００８０】 実施例４ 血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、最も強力な血管形成分裂促進因子の一つで
あり且つ血管形成の主要な調節因子である約４０ｋＤａのホモ二量体の糖タンパ
ク質ホルモンである（２７）。かなりの証拠により、ＶＥＧＦが腫瘍細胞により
及び低酸素血症に曝された他の細胞により分泌されること且つＶＥＧＦが固形腫
瘍の成長における主要な血管形成因子であることが示唆される（２８）。その強
力な血管形成活性に加えて、ＶＥＧＦは、血管透過性を増大させ、血管外基質を
通る内皮細胞の移動、腫瘍の血管形成、腫瘍の広がり、及び転移に必須な過程を
支える（２９）。ヒトのＶＥＧＦは、キナーゼドメイン受容体（ヒトのＫＤＲ又
はマウスのｆｌｋ−１）及びＦｍｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）など
の高親和性ＶＥＧＦ受容体に結合することにより、内皮細胞の増殖及び分化を刺
激することが知られている。これらの受容体は増殖している血管内皮細胞の上で
専ら発現し、これらの発現は、腫瘍がしばしば生産する幾つかの因子により増加
することが知られている（２７〜３０）。このＶＥＧＦ及びその受容体が腫瘍成
長に重要であることは、抗体（３１）又は組換え可溶性受容体ドメイン（３２）
の使用によるＶＥＧＦの無効化がインビボでの腫瘍成長及び転移を抑制できる薬
物としての治療能を示すという事実により証明された。
【００８１】 実質的に増殖中の内皮細胞上に限られたＶＥＧＦ受容体の発現は、新生血管形
成を標的とする治療戦略において該ＶＥＧＦ受容体を標的化分子として使用でき
ることを示唆している。立体的に安定化されたリポソーム又は免疫系（例えば肝
臓及び脾臓の細網内皮細胞系）の食細胞による排除を回避できる「ステルス」リ
ポソーム（ＳＬ）の開発により、最近、癌の化学療法におけるリポソームの薬物
送達に大きな進歩がもたらされた（３３〜３５）。インビボでの投与後（しばし
ば数分以内）血液から急速に取除かれる従来のリポソームとは対照的に、ＳＬは
数日間血液循環中に存在し続ける。幾つかの研究により、漏れやすい脈管構造に
より特徴づけられるＡＩＤＳに関連するカポージ肉腫及び他の障害の治療におい
て、ドキソルビシン（doxorubicin)などの封入された細胞障害性薬物を含むＳＬ
の治療上の利点が証明された（３５）。最近の研究は特定の腫瘍に対するＳＬの
標的化も記述しており、この標的化は、主として、「免疫リポソーム」、即ちリ
ポソームの表面に特異的抗体（又はＦ（ａｂ′）2 断片）を共有結合的に付着さ
せたリポソームの使用により達成される（３６）。抗体などの標的に向かうタン
パク質をドキソルビシンを封入したＳＬ上に固定することは、明らかに、それら
のステルス様特性を改変せず、リポソームに特定の標的に向かう特性を与えるこ
とができる（３７〜４０）。
【００８２】 本発明の出現まで、標的分子のリポソームへの結合は困難であったのであり、
使用する抗体に対する望ましくない抗イディオタイプの応答を誘導する可能性が
ある。本発明の一つの側面に従って、二つのキレーター脂質であるニトリロトリ
酢酸ジテトラデシルアミン（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）及びニトリロトリ酢酸ポリエチ
レングリコール（２０００）ホスファチジルエタノールアミン（ＮＴＡ−ＰＥＧ
２０００−ＰＥ）は、ＶＥＧＦの組換え形と共に、インビボで増殖中の血管内皮
細胞を標的とし特異的にこれを破壊する封入されたドキソルビシンを含むＳＬを
開発するために使用され、それにより新生血管形成及び腫瘍の成長が遮断される
。
【００８３】 ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ受容体が実質的に血管形成内皮上に専ら発現するため、
とりわけ魅力的な標的に向かう分子である。本発明にしたがって、封入されたド
キソルビシン及びＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのＮＴＡ−脂質を介して固定された表面
ＶＥＧＦを含有する「ステルス」リポソームを生産することが企図される。本発
明に従って、この薬物は、インビボ投与された場合、増殖中の内皮細胞を標的に
しこれを破壊し、腫瘍形成及び腫瘍転移を阻害することが企図される。
【００８４】 卵黄のホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）などの
一般的な脂質が大部分、そしてガングリオシドＧＭ１（３２）などの立体的に「
安定化させる」脂質、又はポリエチレングリコール（２０００）に結合したホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ2000−ＰＥ）（３３、３４）の少量（〜１
０％）から構成されるリポソームは、安定性を高め血液中での循環時間を長くす
ることが報告されており、細網内皮細胞系による排除を大幅に回避する。ＳＬの
これらの性質は、水との相互作用を増大する非荷電の頭部基を有する脂質の存在
に帰されたが、血漿中のタンパク質上及び細胞上で出会いそうな荷電性構造又は
疎水性構造のいずれかとの相互作用を阻害する（３２、３３）。証拠により、該
ＳＬ表面上の該ＰＥＧ鎖の遠位末端に抗体分子が付着したＳＬ（即ち免疫リポソ
ーム）は、該ＳＬ表面上に直接抗体が付着したリポソームよりそれらの標的とよ
り効果的に相互作用することが示唆される。これは、これらの条件下で抗原と相
互作用する抗体の能力を立体的に妨害する該ＰＥＧ鎖により説明された（３７）
。従って、ガングリオシドＧＭ１又はより短いＰＥＧ鎖長（例えばＰＥＧ２００
０−ＰＥではなくＰＥＧ７５０−ＰＥ）をもつＰＥＧ−脂質を用いて作製された
ＳＬは、リポソーム表面上のＮＴＡ−ＤＴＤＡに直接６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦを結合
させるために、そして植え付けられたＶＥＧＦを標的細胞上のＶＥＧＦ受容体に
最適に結合させるために、より適しているようである。ガングリオシドＧＭ１と
ＰＥＧ７５０−ＰＥはともに市販されており（アヴァンティ・ポラー・リピッド
社）、それぞれがＰＣ、Ｃｈｏｌ、及びＮＴＡ−ＤＴＤＡから成るリポソームを
用いて試験されることになる。可能な立体効果を更に低減するため、本発明者ら
は新規な脂質、即ちＮＴＡ−ＰＥＧ２０００−ＰＥを生産し、これは該ＰＥ上の
該ＰＥＧ鎖の遠位末端に付着したＮＴＡ基から構成される。この化合物はＰＥＧ
２０００−ＰＥと組合わせて使用され、標的化６Ｈｉｓ−タンパク質（６Ｈｉｓ
−ＶＥＧＦなど）が簡便に植え付けできるＳＬを生産する一方で、立体妨害の可
能性を排除する。これは、特定の細胞及び／又は組織に対する標的化を必要とす
る治療適用でのＳＬの使用を非常に促進するアプローチである。
【００８５】 組換え６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦを生産する。ＳＬは、ＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＮＴＡ−Ｄ
ＴＤＡ、を含む脂質とガングリオシドＧＭ１、ＰＥＧ２０００−ＰＥ及びＮＴＡ
−ＰＥＧ２０００−ＰＥなどの「ステルス」脂質との混合物から調製する。該Ｓ
Ｌは、６Ｈｉｓ−ＶＥＧＦを植え付けられた（ＶＥＧＦ−ＳＬ）後、内皮細胞を
標的にするその能力について評価される。培養中の増殖している内皮細胞への該
リポソームの特異的結合のための条件は、ＶＥＧＦ受容体を欠く細胞へのそれら
の結合と比較して最適化される。ドキソルビシンを封入されたＶＥＧＦ−ＳＬの
特異的な細胞障害性は、インビトロでヒトの血管内皮細胞を用いて評価されるこ
とになる。蛍光色素及び／又は放射活性トレーサーで固有に標識されたＶＥＧＦ
−ＳＬは、マウスに静脈内投与され種々の組織における経時的分布を決定する。
ＳＬを製造するために用いられるそれぞれの安定化脂質部分は、該リポソームの
「ステルス」性を最適化するように変えられる。これは、血管新生中の腫瘍と比
べ、肝臓、脾臓及び他の主要器官により取り込まれるリポソーム部分の減少によ
り判断され。該ＶＥＧＦ受容体はそのリガンドに結合するとエンドサイトーシス
されるため、封入されたドキソルビシンを含むように作製されたＶＥＧＦ−ＳＬ
は増殖中の血管内皮細胞により取り込まれ、破壊される。この方法の実行可能性
は、インビボで腫瘍成長を阻害し及び／又は定着した腫瘍を撲滅するリポソーム
の能力を調べることにより試験される。従って、この研究は抗血管形成癌治療に
対する新規なアプローチを提供する。
【００８６】 実施例５ 組換え受容体の植え付けにより細胞の表面を改変するために用いる本方法は、 イン・ビボで使用される場合、免疫学的応答を改変できる細胞系ワクチンを作成 するために用いることができる。
【００８７】 これは、該共刺激分子であるＢ７．１及びＣＤ４０を植え付けられたＰ８１５
細胞が腫瘍免疫を強化するためのワクチンとして使用できるという事実により証
明される。同様に、これらの又は任意の他の組換えタンパク質又は分子（適切な
タグを有する）は、任意の他の生体膜構造（例えば、細胞及び／又は原形質膜小
胞等の細胞下成分に由来する膜構造）上に植え付けうる。次に、この植え付けら
れた構造物は、治療目的で腫瘍免疫を強化し及び／又はインビボで免疫応答を改
変するためのワクチンとして用いることができる。好ましい方法は、 (i) ＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのキレーター脂質と該細胞又は膜物質とをインキュ
ベートして該脂質を該細胞又は膜に組み込ませる工程、 (ii)遠心分離又は濾過により組み込まれなかった脂質を洗い落とし、該構造物
を適当な溶液又は緩衝液に再懸濁する工程、 (iii) 組込まれたキレーター脂質を含む該膜構造物と適切な親和性標識を有す
る適切な組換えタンパク質（単数又は複数）とをインキュベートする工程、並び
に (iv)組み込まれなかったタンパク質材料を洗い流す工程、次いで、インビボで
の免疫応答を改変するためなどの治療目的で、インビボ投与可能なワクチンとし
て改変された該構造物を使用する工程を含む。
【００８８】 このアプローチは合成膜構造物（即ち、任意のリン脂質（例えばＰＣ若しくは
ＰＥ）と該ＮＴＡ−ＤＴＤＡの混合物から構成される合成リポソーム又は合成小
胞）とともに用いることもできる。該合成構造物は該ＮＴＡ−ＤＴＤＡを組み込
んで作製でき、従って、上記の工程（iii)から（ｖ）までのみが必要とされる。
【００８９】 実施例６ 予備実験は、適切な組換え受容体タンパク質を植え付けられた合成リポソーム
（１０：１の比で例えばＰＣとＮＴＡ−ＤＴＤＡから構成される）が同種の受容
体又はリガンドをもつ細胞を特異的に標的とするために使用できることを示して
いる（図５参照）。このようなリポソームは生体応答を改変するためにも使用で
きる（図６参照）。従って、本発明は、封入された薬物又は他の治療用作用物質
を体内の細胞若しくは組織に送達する治療適用で用いるためのリポソームの表面 を改変する 方法を提供する。このようなリポソームは、病気治療のため、又は治
療目的で特定の細胞（例えば腫瘍細胞）を破壊するべく細胞障害性薬物若しくは
作用物質の送達を該細胞に標的化するための生体応答（単数又は複数）の改変に
使用される。
【００９０】 当業者は、本明細書に記載された本発明が詳細に記載されたもの以外の変形及
び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明はこのようなあ
らゆる変形及び修飾を包含すると理解されるべきである。本発明は、この明細書
中で言及した又は示した工程、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に又は集合
的に包含し、並びに任意の二つ以上の該工程若しくは特徴の任意の組合わせ又は
あらゆる組合わせをも包含する。
【００９１】 参照文献 １ シャオ，ゼット、(1995) Quart. Revs Biophys. 28:195-251。 ２ ガーランド，ピイ・ビイ、(1996) Quart. Revs Biophys. 29:91-117。 ３ キルコら、(1995) J. Immunol. Meth. 183:77-94。
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、細胞、生体膜構造物及び／又は合成膜構造物の特性を変え、それによ り該構造物を治療目的に使用することを目的としてこれらの構造物の表面を改変 するための、金属キレート結合の使用の例示である 。この例示は、細胞の原形質
膜又は細胞レベルの下の膜構造物の膜などの生体膜／合成膜の表面の上へのそし
て人工的小胞若しくはリポソームの表面の上への、ヘキサ−ヒスチジンタグを保
持する受容体の植え付けを図示する。組換えタンパク質は、該タンパク質上のヘ
キサ−ヒスチジンタグが、膜中に組み込まれたキレーター脂質の上のＮＴＡ金属
キレート頭部基（ＮＴＡ−ＤＴＤＡと記され、これはｄｉ−Ｃ１４−ＮＴＡとも
呼ばれる）に結合することにより、膜構造物の上に植え付けられる。
【図２】 図２は、ビオチン化され且つヘキサ−ヒスチジン標識されたＣＤ４０分子及び
Ｂ７．１分子を植え付けられ次いでストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色された
Ｐ８１５細胞の、蛍光活性化セルソーティングで測定したときの蛍光の側面であ
る。
【図３】 図３は、植え付けられた共刺激分子を保持する腫瘍細胞でワクチン注射された
マウスから単離されたＴリンパ球における腫瘍特異的細胞毒の誘導を示す図式的
表示である。同遺伝子型のＤＢＡ／２マウスを、ＰＢＳか又は示された組換えタ
ンパク質、即ち、ＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、及びＢ７．１−６Ｈ＋ＣＤ
４０−６Ｈを植え付けられた１×１０5 γ−照射Ｐ８１５細胞で皮下免疫した。
免疫化後１４日のマウスから脾臓を切取り、Ｔリンパ球（エフェクターＴ細胞）
を単離し、インキュベーション培地に懸濁し、１×１０5 細胞／ウェルの濃度で
２４穴平底プレートに分配し、次いで１×１０5 γ−照射天然Ｐ８１５細胞と共
培養した。５％ＣＯ2 の存在下に３７℃で５日間共培養した後、その細胞を51Ｃ
ｒ−標識化天然Ｐ８１５細胞標的と、示されたＥ：Ｔ比で、３７℃で６時間イン
キュベートした後、上清を収穫し、特異的溶解の後に放出された51Ｃｒの量を測
定した。結果を材料と方法で記述したように計算して、特異的溶解百分率±ＳＥ
Ｍとして表す。
【図４ａ】 図４ａは、組換え共刺激分子を植え付けられたＰ８１５腫瘍細胞での免疫によ
る腫瘍免疫の誘導を示す図式的表示である。マウスを、ＰＢＳか又は示された組
換えタンパク質、即ち、ＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、及びＢ７．１−６Ｈ
＋ＣＤ４０−６Ｈを植え付けられた１×１０5 γ−照射Ｐ８１５細胞の注射によ
り免疫した。注射の２週間後に、各群のマウスに１×１０5 天然Ｐ８１５細胞を
皮下注射によりチャレンジし、次いで腫瘍の成長と生存をモニターした。各点は
最初の５週についての、時間の関数としてのマウスの各群の平均腫瘍直径を表す
。
【図４ｂ】 図４ｂは、組換え共刺激分子を植え付けられたＰ８１５腫瘍細胞での免疫によ
る腫瘍免疫の誘導を示す図式的表示である。マウスを、ＰＢＳか又は示された組
換えタンパク質、即ち、ＥＰＯＲ−６Ｈ、Ｂ７．１−６Ｈ、及びＢ７．１−６Ｈ
＋ＣＤ４０−６Ｈを植え付けられた１×１０5 γ−照射Ｐ８１５細胞の注射によ
り免疫した。注射の２週間後に、各群のマウスに１×１０5 天然Ｐ８１５細胞を
皮下注射によりチャレンジし、次いで腫瘍の成長と生存をモニターした。このデ
ータは時間による動物の生存百分率を示す。
【図５】 図８は、蛍光標識リポソームのＤ１０細胞（ネズミＣＤ４＋Ｔ細胞）への結合
が、リポソームが共刺激分子ＣＤ４０及びＢ７．１のいずれかを植え付けられた
場合、対照タンパク質ＥＰＯＲを植え付けられた場合よりも有意に大きいことを
示す図式的表示である（Ｄ１０細胞がＢ７．１及びＣＤ４０のリガンドを発現す
るがＥＰＯＲに対するリガンドは発現しないことに注意せよ）。ＰＣ：ＮＴＡ−
ＤＴＤＡ：ＦＩＴＣ−ＰＥ（１０：１：０．１モル比）の脂質から構成されるこ
のリポソームは、それぞれがヘキサ−ヒスチジンタグを保持する一つ以上の組換
えタンパク質（示すように、ＥＰＯＲ、Ｂ７．１及びＣＤ４０）を植え付けられ
た。この細胞の各条件（リポソームの細胞への結合の程度を反映する条件）にお
ける蛍光の側面を蛍光活性化セルソーティングにより測定した。比較のために、
細胞のバックグラウンド蛍光（「細胞」と記す）を示す。その結果は、適当な組
換えタンパク質を植え付けられたリポソームの結合は植え付けられたタンパク質
の型に特異的であり、従って、植え付けられた組換えタンパク質を保持するリポ
ソームは適当な同種の受容体を発現する細胞に標的化できることを示す。
【図６】 図９は、共刺激分子Ｂ７．１及びＣＤ４０を植え付けられた合成リポソームが
Ｄ１０細胞（ネズミＣＤ４＋Ｔ細胞）の該細胞皿への接着を特異的に刺激するこ
とを示す図式的表示である。培養したＤ１０細胞を完全成長培地（ＲＰＭＩ１６
４０プラス１０％ｖ／ｖＦＣＳ、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、抗生物質及び５０μ
Ｍのβ−メルカプトエタノール））に懸濁した。組換えタンパク質ＥＰＯＲ、Ｃ
Ｄ４０及びＢ７．１（それぞれヘキサ−ヒスチジンタグを持つ）を可溶型かＰＣ
及びＮＴＡ−ＤＴＤＡ（１０：１）（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ−ＥＰＯＲ、ＮＴＡ−Ｄ
ＴＤＡ−Ｂ７．１及びＮＴＡ−ＤＴＤＡ−ＣＤ４０と示す）からなるリポソーム
上に植え付けられた状態のいずれかで、細胞と混合した後、この細胞を１２穴リ
ンブロ組織培養プレートの別々のウェルに蒔き、３７℃で２時間成長培地中でイ
ンキュベートした。インキュベーションの後、ＰＢＳで３回洗浄することにより
接着していない細胞を除去し、残っている接着細胞を１ｍＭのＥＤＴＡの溶液で
取得して顕微鏡により数を数えた。このデータは各条件における接着細胞の割合
を示す。その結果は共刺激分子（即ち、Ｂ７．１及び／又はＣＤ４０）を植え付
けられたリポソームが免疫学的応答を改変するために使用できることを証明する
。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 47/48 39/395 Ａ６１Ｐ 35/00 47/48 37/04 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 37/04 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パリッシュ，クリストファー，リチャード オーストラリア国、エイシーティー 2601、キャンベル、ベイジー クレッセン ト 62番地 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA91X AA92X AA94X BD50 CA44 CA45 4C076 AA19 CC41 4C084 AA01 MA24 NA14 ZB26 4C085 AA03 CC21 CC33 DD62 DD88 4C086 AA01 EA16 EA20 MA24 NA14 ZB09 ZB26

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生体膜若しくは合成膜、細胞若しくは細胞小器官などの膜
    構造物をイン・ビボの特定の細胞型若しくは組織に向かわせる方法であって、該
    膜構造物を標的に向かわせそして生物学的若しくは生理学的応答を変えるために
    用いられるようにするため、該膜構造物中に、受容体などの、標的に向かう分子
    の固定を容易にするキレーター脂質及び／又は両親媒性分子を組み込む工程を含
    む方法。
  2. 【請求項２】 該両親媒性分子が該膜構造物の外部表面に向けられた金属
    キレート基の共有結合接着により修飾されるものである、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 下記の工程、即ち (i) 混合及び／又は共インキュベーションにより、又はキレーター脂質及び
    一つ以上の他の脂質若しくはリン脂質を含む脂質複合体混合物から該膜を製造す
    ることにより、該膜構造物中にキレーター脂質を組み込む工程、及び (ii) 該膜構造物の外側に向いているキレート残基を介して該膜構造物に結合
    するのに十分な時間及び適当な条件の下で、標的に向かう分子を該膜構造物と相
    互作用させて、受容体ドメイン若しくは標的に向かいうる分子が横に移動でき、
    ダイマー化／オリゴマー化でき及び／又はリガンドと相互作用できるようにする
    工程、 を含む、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 標的に向かう分子が、金属に結合するポリペプチドタグを
    持つように工学処理された受容体ドメイン及び／又は他の標的に向かいうる分子
    である、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 キレーター脂質に結合するポリペプチドタグが膜構造物中
    に組み込まれるために十分な時間及び条件の下で、該受容体ドメイン又は標的に
    向かいうる分子が該膜構造物と相互作用させられるものである、請求項４記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 該膜構造物が、超音波処理、又は押出し濾過技法（extrus
    ion/filtration techniques)により両親媒性分子から形成されるミセル若しくは
    リポソームの懸濁液である、請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 該金属キレート基がニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）である、
    請求項２記載の方法。
  8. 【請求項８】 両親媒性分子の一部が金属キレート基の共有結合接着によ
    り改変されるものである、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 該両親媒性分子が親水性頭部と一つ以上の疎水性尾部を有
    する界面活性分子である、請求項１又は請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該ポリペプチドタグがアミノ酸残基の配列を含むもので
    ある、請求項１〜請求項９いずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該アミノ酸残基がヒスチジン残基である、請求項１０記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 該ポリペプチドタグが少なくとも５個のアミノ酸残基を
    含むものである、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該ポリペプチドタグが少なくとも６個のアミノ酸残基を
    含むものである、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該ポリペプチドタグがヘキサ−ヒスチジンを含むもので
    ある、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 (i) ワクチン開発のため、(ii)生物学的応答（単数又は
    複数）を改変するため、及び／又は（iii)治療効果を達成すべく体内の特定の組
    織若しくは細胞型へ薬物若しくは作用物質を標的として向かわせるため、生体膜
    又は合成膜を改変する方法であって、 （i) 薬物若しくは作用物質を封入し又は封入せずに、キレーター脂質の組み
    込まれたリポソーム懸濁液を調製する工程、 （ii) 該リポソームを、適当な金属親和性タグを保持する組換えタンパク質若
    しくは標的分子とインキュベートする工程、及び （iii)必要ならば、洗浄、濾過若しくは他の洗浄手段により過剰のタンパク質
    若しくは分子を除去し、それらを適当な溶液に懸濁する工程、 を含む方法。
  16. 【請求項１６】 植え付けられ、固定され、又はリポソーム内に封入され
    た分子が治療用分子、医薬化合物、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡである、請求項１５
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 リポソーム表面上に植え付けられ若しくは固定された分
    子がＶＥＧＦ若しくはその同族体である、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該リポソームが、腫瘍の増殖のための新血管の増殖を阻
    止するため、細胞障害性の薬物若しくは作用物質を、植え付けられたＶＥＧＦ若
    しくはその同族体と共に封入しているものである、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該リポソームが、免疫原性若しくは免疫学的応答を変え
    るため、免疫細胞及び腫瘍細胞などの体内の異なる細胞型に該リポソームを標的
    として向かわせる物質と共に、免疫原性物質を含むものである、請求項１５記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 生体膜の上に直接組換え分子を固定する方法であって、 （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
    る工程、 （ii) 細胞又は生体膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベ
    ートしてキレーター脂質を該構造物の中に組み込ませる工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該膜構造物を、適当な金属親和性タグを有する組換えタンパク質若し
    くは標的分子の溶液とインキュベートする工程、及び （v) 過剰のタンパク質若しくは未結合のタンパク質を洗い流し、且つ、該構
    造物をイン・ビボ投与に適する溶液中に懸濁する工程、 を含む方法。
  21. 【請求項２１】 該組換え分子が共−刺激性分子である、請求項２０記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 該生体膜が腫瘍細胞由来のものである、請求項２０又は
    請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 腫瘍又は他の疾病状態に対する免疫を増強し又は改変す
    る際に使用するための、請求項２０又は請求項２１又は請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該組換え分子が受容体又はリガンドである、請求項２０
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該組換え分子が、体内の特定の細胞型の上又は病気の結
    果として生ずる腫瘍細胞などの細胞の上の受容体に対するリガンドである、請求
    項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 標的細胞又はその膜成分の免疫原性を変える方法であっ
    て、 (i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
    る工程、 (ii) 細胞又は膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベート
    する工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該膜構造物を、固定すべき該分子の溶液とインキュベートする工程、
    及び （v) 過剰の可溶性分子又は未結合の可溶性分子を洗い流し、且つ該構造物
    をイン・ビボ投与に適する溶液に懸濁する工程、 により該標的細胞の膜に分子を固定する工程を含む方法。
  27. 【請求項２７】 該標的細胞が腫瘍細胞である、請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 該分子がリガンド、受容体、組換えタンパク質、多糖類
    、糖タンパク質又は抗原である、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 リポソーム又は生体膜構造物を特定の細胞又は組織に標
    的として向かわせる方法であって、標的化の対象となる特定の細胞若しくは組織
    の上に結合相手を有する分子を （i) キレーター脂質又はキレーター脂質を含むリポソームの懸濁液を調製す
    る工程、 （ii) 細胞又は生体膜構造物の懸濁液をキレーター脂質の懸濁液とインキュベ
    ートする工程、 （iii) 過剰の脂質又は組み込まれなかった脂質を洗い流す工程、 （iv) 該リポソーム又は膜構造物を、固定すべき分子の溶液とインキュベート
    する工程、及び （v) 過剰の可溶性分子又は未結合の可溶性分子を洗い流し、且つイン・ビボ
    投与に適する溶液に該構造物を懸濁する工程、 により固定若しくは植え付ける工程を含む方法。
  30. 【請求項３０】 活性物質を含み、且つ結合相手若しくは標的組織を持つ
    固定され若しくは植え付けられた分子を任意選択的に含む、リポソーム調製物若
    しくは膜物質の有効量を、被験者に投与する工程を含む治療方法。
  31. 【請求項３１】 該活性物質が、リポソーム若しくは膜物質の表面に植え
    付けられるか又はその内部に封入された組換えポリペプチド、共−刺激分子、治
    療用の薬物若しくは核酸分子である、請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 該固定され又は植え付けられた分子が受容体、リガンド
    、糖タンパク質、多糖類、又は組換えポリペプチドである、請求項３０又は請求
    項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 該固定された分子がＶＥＧＦである、請求項３２記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 特定の腫瘍又は疾病に対する免疫を増強するために使用
    される、請求項２６〜請求項３３いずれか１項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 該共−刺激分子がＣＤ４０又はＢ７．１である、請求項
    ３１記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ワクチン組成物であって、該ワクチンが、投与された被
    験者の免疫学的応答を変えることができる分子の植え付けられた細胞又は膜物質
    を含み、一つ以上の薬学的担体及び／又は希釈剤をさらに含むワクチン組成物。
  37. 【請求項３７】 該細胞又は膜物質に植え付けられた分子が共−刺激分子
    である、請求項３６記載のワクチン。
  38. 【請求項３８】 請求項３６又は請求項３７記載のワクチンであって、下
    記の工程、即ち （i) リポソーム、細胞又は膜物質を、ＮＴＡ−ＤＴＤＡなどのキレーター脂
    質とインキュベートして該脂質を該細胞又は膜に組み込ませる工程、 （ii) 遠心分離又は濾過により組み込まれなかった脂質を洗い落とし、且つ該
    リポソーム、細胞又は膜構造物を適当な溶液又は緩衝液に再懸濁する工程、 （iii)キレーター脂質の組み込まれた該リポソーム、細胞又は膜構造物を、植
    え付けるべき該分子とインキュベートする工程、及び （iv) 組み込まれなかった分子材料を洗い流す工程、 により調製される、請求項３６又は請求項３７記載のワクチン。
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