CN1191854C - 模型膜系统 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及为了改变免疫性，或用于在体内施用时将药物和其他试剂导向体内特定细胞型或组织，以达到治疗效果而修饰生物和/或合成膜或脂质体或其组合。膜的修饰通过掺入和/或结合金属螯合基团实现，从而使得能移入一种或多种具有金属亲和尾的导向分子，和已移入的膜向体内特定细胞型或组织的导向。本发明因而提供一种改变生物和/或合成膜和脂质体的性质的方法，目的在于用作疫苗时改变或增强免疫性，或者当体内施用时向特定细胞或组织导向包封/掺入的药物或其他试剂，以达到治疗效果或反应，或用于改变生理反应或生物学功能。

Description

模型膜系统
发明领域
本发明一般地涉及金属螯合脂为了改变生物反应，或用于将这些结构导向特定细胞型或组织，以在体内施用时达到治疗效果而改变生物和/或合成膜或脂质体的用途。本发明提供一种改变生物和/或合成膜和脂质体的性质的方法，目的在于当用作疫苗时改变免疫性，或者当体内施用时向特定细胞或组织导向药物和其他试剂，用于治疗目的或改变生理反应或生物学功能。
发明背景
在本说明书中以数字引用的公开文本的详细目录集中在说明书最后。
在生物系统如细胞、细菌或病毒中，表面膜相关的生物分子或受体通常作为由两种或两种以上的称作亚基的分子成分组成的分子结构存在；这些亚基可以是相同的，或是分子不同的。天然配体分子与受体亚基的结合可诱导这些受体成分在脂膜结构上的非共价聚集或寡聚。寡聚事件通常是受体传导跨膜信号的机制的一个必要部分，用于引发配体分子对生物反应的诱导。另外，某些受体或其成分自发聚集的能力可影响它们与配体相互作用的能力。配体分子可以是生长因子、细胞因子、激素、蛋白质、糖蛋白、多糖或细胞的任何暴露表面或亚细胞成分、病毒或亚病毒颗粒，或其他传染物，它们能与受体结合。
最近描述了一种技术，其中利用重组六组氨酸标记的蛋白质与次氮基三乙酸的连接将六组氨酸标记的蛋白质可逆地固定于BIAcore表面胞质团共振生物传感器的固体传感表面上(1-5)。杂合十八烷硫醇/磷脂膜在BIAcore传感表面上的形成也已经有描述(6)，使得能分析链霉亲和素与双层中的生物素化磷脂酰乙醇胺的结合。另外，组氨酸标记的生物分子通过螯合脂(如NTA-双十八胺)在双层膜上的固定已经通过表面荧光显微镜术和薄膜平衡技术证明(7-8)。
这些现有技术没有描述一种为了在用作疫苗时改变免疫性而改变生物和/或合成膜和脂质体的性质，或者为了治疗目的或改变生理反应或功能在体内施用时向特定细胞或组织导向药物和其他试剂的方法。
因此，需要发展将分子锚定于膜材料上的新技术，例如，在疫苗制剂中用作改变免疫应答和导向药物输送系统的试剂。
发明概述
在本说明书中，除非内容需要，否则单词“包含”或其变化可理解为包含所述成分(或整体)，或成分(或整体)集合，而不是排除其他任何成分(或整体)，或成分(或整体)集合。
本发明提供一种为了改变免疫性，或为了治疗目的在体内施用时向特定细胞型或组织导向药物或其他试剂而改变生物和/或合成膜或脂质体(或其组合)的性质的方法。该方法包括使用已经掺入所述膜或脂质体中的某些两亲性分子，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得某些金属螯合基团朝向该膜的外表面；该方法包括下列步骤：在足以使多肽尾(polypeptide tag)通过该膜的面向外金属螯合残基与膜结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜或脂质体相互作用一定时间，使得受体域能与体内细胞和组织上的配体分子特异地相互作用。优选地，受体域与相关膜之间的特异相互作用提供了一种在用作疫苗时改变免疫性，或在体内施用时为了治疗目的或改变生理反应或生物功能而向特定细胞型或组织导向包膜的或掺入膜的药物和其他试剂的方法。
本发明一方面提供了一种为了改变免疫性，或在体内施用时向特定细胞型或组织导向药物或其他试剂以达到特定治疗效果而修饰生物和/或合成膜或脂质体(或其组合)的方法，该方法包括向所述膜或脂质体中掺入两亲性分子，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得某些金属螯合基团朝向该膜的外表面；该方法也包括下列步骤：在足以使多肽尾通过该膜或脂质体的面向外金属螯合残基与膜或脂质体结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜或脂质体相互作用一定时间，使得受体域能与体内特定细胞型或组织上存在的配体分子特异地相互作用。
本发明另一方面提供一种通过向脂质体上移入特异靶向分子，向特定细胞型或组织导向包封/掺有药物或治疗剂的合成脂质体的方法，该方法包括：
(i)由第一种脂或磷脂和第二种脂或磷脂制备掺有螯合脂的脂质体悬液，其中第二种脂或磷脂已经通过金属螯合基团如次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，与微团(例如脂质体)悬液的第二种脂或磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；这些脂质体也能在存在能向脂质体中包封/掺入的任何合适的药物或治疗剂的情况下制备，或使之在制备后含有它们；
(ii)在足以使多肽尾通过NTA-螯合键与所述脂质体的面向外NTA残基结合的条件下，将该脂质体与含有合适的金属亲和尾(tag)的重组蛋白或靶分子温育；
(iii)必要时，通过洗涤、过滤或其他洗涤方法除去过量的蛋白质，并将脂质体悬浮于合适的溶液中；和
(iv)体内施用含有包封/掺入药物或试剂的移入脂质体，以便能向特定细胞型或组织定向输送，以达到治疗效果。
本发明另一方面涉及一种改变靶细胞或其膜成分的免疫原性的方法，该方法包括通过下列步骤将一种分子移至该靶细胞或成分的膜上：
(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；
(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂(或含螯合脂的脂质体)悬液一起温育，以使螯合脂能掺入细胞膜或膜成分中；
(iii)必要时洗去过量的或未掺入的脂或脂质体；
(iv)将该细胞或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)必要时洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该细胞或结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
本发明另一方面提供一种修饰生物和/或合成膜和脂质体的方法，以在体内施用时达到特定治疗效果，如免疫应答或其他生理或生物反应的诱导或调节，该方法包括：
(i)制备螯合脂或由脂和螯合脂组成的脂质体的悬液；或
(ii)通过将细胞或膜悬液与含螯合脂的脂质体悬液一起温育，并在必要时洗去过量的或未掺入的脂或脂质体，将螯合脂掺入细胞或膜上；
(iii)将该脂质体、细胞或膜结构与具有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子的溶液一起温育；和
(iv)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该脂质体、细胞或膜结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
本发明另一方面涉及一种将细胞生物和/或合成膜和脂质体导向体内特定细胞型或组织的方法，该方法包括通过下列步骤向膜结构上移入一种在特定细胞或组织上具有结合配偶体的分子：
(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；或
(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育，以使脂掺入；
(iii)必要时洗去过量的或未掺入的脂；
(iv)将该脂质体或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)必要时洗去过量的或未结合的可溶分子，并将该脂质体或结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
本发明另一方面涉及一种治疗方法，该方法包括对患者施用有效量的脂质体制剂或膜物质，其含有包封的或掺入的药物或活性物质，和在将要体内导向的特定细胞或组织上具有结合配偶体的移入的导向分子。
本发明的另一方面提供一种疫苗组合物，其包含细胞、脂质体、囊泡或膜物质，其中移入了能改变对施用疫苗的患者的免疫应答的分子，该疫苗还包含一种或多种药学载体和/或稀释剂。
附图简述
图1是金属螯合连接修饰细胞表面、生物和/或合成膜结构的用途，以改变这些结构的性质，从而使它们能用于治疗目的。该图显示带有六组氨酸尾的重组受体向细胞表面或生物/合成膜如细胞质膜或亚细胞膜结构和人工囊泡或脂质体表面上的转移。重组蛋白质通过蛋白质上的六组氨酸标记与已经掺入磷脂膜中的螯合脂上的NTA金属螯合首基(称为NT-DTDA；也可称为di-C14-NTA)结合而移至膜结构上。
图2是通过荧光激活细胞分选确定的P815细胞的荧光图，该细胞与生物素化和六组氨酸标记的CD40和B7.1分子结合，然后用链霉亲和素-FITC染色。
图3是一张图示，显示在从接种含移入共刺激分子的肿瘤细胞的小鼠中分离的T淋巴细胞中，肿瘤特异性细胞毒性的诱导。同系DBA/2小鼠用PBS或1×105γ-照射的P815细胞皮下免疫，该细胞中下列重组蛋白：EPOR-6H、B7.1-6H和B7.1-6H加CD40-6H。免疫14天后从小鼠中取出脾脏，分离T淋巴细胞(效应T细胞)，悬浮于温育培养基中，并以1×105细胞/孔的浓度等分至24孔平底板中，然后与1×105γ-照射的原初P815细胞共培养。在5％CO2存在下37℃共培养5天后，以指定的E∶T比，将细胞与51Cr标记的原初P815细胞靶标37℃温育6小时，之后收集上清液，测定特异裂解释放的51Cr的量。结果表示为百分比裂解±SEM，如材料与方法中所述计算。
图4(a)和(b)是显示通过用重组共刺激分子的P815肿瘤细胞免疫诱导肿瘤免疫的图示。如述，通过注射PBS或1×105γ-照射的P815细胞免疫小鼠，该细胞了包括EPOR-6H、B7.1-6H和B7.1-6H加CD40-6H的重组蛋白。注射2周后，通过皮下注射用1×105原初P815细胞攻击每组小鼠，然后监测肿瘤生长和存活率。(A)中的每个点代表前5周中每组小鼠随时间改变的平均肿瘤直径。(B)中的数据显示动物随时间改变的百分存活率。
图5是一张图示，显示荧光标记的脂质体与D10细胞(鼠CD4+T细胞)的结合在脂质体与共刺激分子CD40或B7.1任一个结合时比与对照蛋白质EPOR结合时显著提高。(注意D10细胞表达B7.1和CD40的配体，而不表达EPOR的配体)。由脂类PC∶NTA-DTDA∶FITC-PE(10∶1∶0.1摩尔比)组成的脂质体中带有六组氨酸尾的一种或多种重组蛋白(表示为EPOR、B7.1和CD40)。每种条件下细胞的荧光图(反映脂质体与细胞的结合程度)通过荧光激活细胞分选确定；显示细胞(标为“细胞”)的背景荧光用于对比。结果表明，移入合适的重组蛋白的脂质体的结合对于移入蛋白质的类型是特异的，因此，带有移入重组蛋白的脂质体能被导向表达合适的同源受体的细胞。
图6是一张图示，显示移入共刺激分子B7.1和CD40的合成脂质体能特异刺激D10细胞(鼠CD4+T细胞)与培养皿的粘附。培养的D10细胞悬浮于完全生长培养基(RPMI 1640加10％v/v FCS、50U/ml IL-2、抗生素和50μM β-巯基乙醇)中。重组蛋白EPOR、CD40和B7.1(每一个均含有六组氨酸尾)与可溶形式(表示为sEPOR、sB7.1和sCD40)或移至由PC和NTA-DTDA(10∶1)组成的脂质体上的细胞混合(表示为NTA-DTDA-EPOR、NTA-DTDA-B7.1和NTA-DTDA-CD40)，之后将细胞转移到12孔Linbro组织培养板的各孔中，并在生长培养基中37℃温育2小时。温育后，用PBS洗涤3次从孔中除去未附着的细胞，用1mM EDTA溶液除去剩余的附着细胞，显微镜计数。数据显示每种条件下附着细胞的比例。结果证明，带有移入共刺激分子(即B7.1和/或CD40)的脂质体能用来改变免疫应答。
优选实施方案详述
在一个实施方案中，本发明涉及一种将受体的膜外域或跨膜域移至生物和/或合成膜或脂质体上的方法的应用，以克服现有技术的一种或多种上述缺点。
因此，本发明提供一种为了改变免疫性，或为了达到特定治疗效果在体内施用时向特定细胞型或组织导向药物和其他试剂而修饰生物和/或合成膜或脂质体(或其组合)的方法。该方法包括向所述膜或脂质体中掺入两亲性分子，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得至少某些金属螯合基团朝向该膜或脂质体的外表面。该方法也包括下列步骤：在足以使多肽尾通过该膜或脂质体的面向外金属螯合残基与膜或脂质体结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜或脂质体相互作用一定时间，使得受体域能与体内特定细胞型或组织上存在的配体分子特异地相互作用。
受体域也可由蛋白质、糖蛋白或蛋白聚糖、寡糖或其片段或功能相当物组成。
供本发明使用的一种优选的金属螯合基团是次氮基三乙酸(NTA)。
生物膜代表由生物系统如细胞、组织、细菌、病毒或其成分获得的任何膜或含脂物质。
合成膜和/或脂质体可以是任何人工含脂结构，如由两亲性分子形成的微团(例如脂质体)悬液，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合而修饰。合成膜或脂质体能通过机械搅拌脂在水或水缓冲液中的混合物形成，如利用超声处理和/或利用挤压/过滤技术和/或向两亲性分子在有机溶剂中的合适溶液中加入水或水缓冲液，或其任意组合。
两亲性分子通常是含有亲水“头”部分和一个或多个疏水“尾”的表面活性剂。表面活性剂可以是任何已知类型的，即，阳离子的(例如季铵盐)、阴离子的(例如有机磺酸盐)、两性离子的(例如磷脂：磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)、跨膜脂或非离子的(例如聚醚物质)。
合成膜和/或脂质体可以由一种以上的两亲性分子组成。在一个优选实施方案中，合成膜或脂质体由第一种磷脂和第二种磷脂构成。
因此，一种优选形式，本发明涉及一种修饰生物和/或合成膜和脂质体的方法，方法是利用金属螯合基团将膜外或跨膜受体域移至该膜或脂质体上，从而使这些结构在体内施用时能导向任何表达受体域配体的细胞型或组织，用以达到治疗效果，或诱导或改变生理反应。
一种更优选的形式是，第一种磷脂是磷脂酰胆碱(PC)，第二种脂是磷脂酰乙醇胺-NTA(PE-NTA)，PC∶PE-NTA之比(w/v)约为10∶1。然而，第一种磷脂可以是能形成脂质体悬液的任何磷脂或碳氢化合物，或任何磷脂或碳氢化合物的混合物；第二种磷脂可以是含有金属螯合首基的任何脂类，它能用来利用该域上适当改造的尾锚定或转移受体域。另外，第一种与第二种磷脂的比例可因生物膜或脂质体上将要达到的受体域分子的希望的密度而不同。
优选地，多肽尾含有至少6个氨基酸残基(如六组氨酸分子)的序列，但可以是能通过与含金属螯合基团(如NTA)的脂类的金属螯合成分形成复合体而强烈结合的任何氨基酸序列。在本发明的一个用途中，该分子的代表是T细胞共刺激分子B7.1(CD80)和CD40。在本发明的另一种形式中，该分子是称作血管内皮细胞生长因子(VEGF)的配体。更具体而言，受体可以是任何细胞表面受体或配体，或这些受体或配体的结构域。
能用标准重组DNA技术构造受体域，使之含有六组氨酸COOH-尾，或NH2-尾。六组氨酸尾也可通过化学方法与受体域、蛋白质、糖蛋白、多糖和其他分子共价结合。
本发明因此利用金属螯合脂改变生物和/或合成膜和脂质体的性质，用于治疗目的和体内生物导向，以达到治疗效果。该技术在优选实施方案中是理想的，用于为了在用作疫苗时改变免疫性而改变生物和/或合成膜和脂质体的性质，或为了治疗目的或改变生理反应或生物学功能，在体内施用时向特定细胞或组织导向药物和其他试剂。
金属螯合连接改变本发明的膜系统的生物学性质的用途也可用于导向脂质体或囊泡，当体内施用脂质体时，它们能通过移入分子的脂质体的特异性，向特定细胞型或组织中导向和输送能被包封于或掺入脂质体中的药物、DNA/RNA或任何治疗剂。
根据本发明的这一方面，提供了一种通过向脂质体上移入特异导向分子，向体内特定细胞型或组织中导向包封/掺有药物或治疗剂的合成脂质体的方法，该方法包括：
(i)由第一种脂或磷脂和第二种脂或磷脂制备掺有螯合脂的脂质体悬液，其中第二种脂或磷脂已经通过金属螯合基团如次氮基三乙酸(NTA)的共价结合而修饰，与微团(例如脂质体)悬液的第二种脂或磷脂结合的某些NTA残基朝向膜的外表面；这些脂质体也能在存在能向脂质体中包封/掺入的任何合适的药物或治疗剂的情况下制备，或使之在制备后含有它们；
(ii)在足以使多肽尾通过NTA-螯合键与所述脂质体的面向外NTA残基结合的条件下，将该脂质体与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子温育；
(iii)必要时，通过洗涤、过滤或其他洗涤方法除去过量的蛋白质，并将脂质体悬浮于合适的溶液中；和
(iv)为了治疗目的体内施用含有包封/掺入药物或试剂的移入脂质体，以便能向特定细胞型或组织定向输送。
在一个优选实施方案中，分子可通过下列方法移至脂质体上：
(i)在水性溶液如含有浓度约等于NTA-DTDA的Ni2+和Zn2+的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，以约0.5mM的浓度，由磷脂如1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)和螯合脂如NTA-DTDA的混合物制备脂质体悬液。脂质体能通过在高于Tm的温度下超声处理该混合物5-10分钟产生。此外，脂质体也能如下产生，将脂在乙醇溶液中溶解，然后在水性缓冲液中分散，或通过适当孔径的聚碳酸酯或类似滤膜挤出脂的水性悬液。NTA-DTDA∶POPC的摩尔比一般可为10∶1，最终总脂浓度可以是约0.5mM，但也可以是不同的；
(ii)通过沉淀(在4℃下以～95000×g离心30分钟)，并弃除上清液，或通过过滤技术，洗涤脂质体，然后将脂质体悬浮于适当体积的缓冲溶液中，以利于与标记蛋白质的温育；
(iii)将脂质体与重组蛋白(例如人六组氨酸标记的VEGF、血管内皮生长因子)或不同重组蛋白的组合一起温育，它们都含有六组氨酸或其他合适的金属亲和尾，使之能锚定于脂质体上；和
(iv)如以上步骤(ii)所述，通过洗涤脂质体去除过量的可溶性或未结合的蛋白质，然后将其悬浮于PBS或其他适于体内施用的缓冲液中。
不同脂类或脂的组合也能与螯合脂一起使用，以得到脂质体特异的性质。例如，(以上步骤(i)中的)混合物能含有神经节苷脂GM1或衍生物聚乙二醇，以产生具有“隐密”性质的脂质体(9)，避免当用作体内疫苗时被巨噬细胞或被肝脏或脾脏吸收。另外，步骤(i)也能在药物、DNA或其他治疗剂存在下进行，目的是包封该物质，并在体内施用时使之能输送到移入分子的特异性所限定的特定细胞或组织中。例如，含有移入VEGF(血管内皮生长因子)的脂质体能用来导向已知表达VEGF受体并且是肿瘤生长所需的生血管上皮。因此，含有移入VEGF的脂质体能用来输送能阻断肿瘤生长所需新血管生长的细胞毒性药物或试剂。细胞毒性药物或试剂被包封于脂质体中。
根据本发明此方面的合适的分子的例子包括治疗分子、药物化合物和核酸分子，如RNA和DNA。一种特别有用的分子是VEGF或其同源物。VEGF及其同源物也可用于将脂质体导向携带VEGF受体的细胞。因此，本发明此方面涉及的分子包括在靶组织上具有结合配偶体的分子。优选地，这些分子被移至也含有包封或掺有药物或治疗剂的脂质体上。
活性物质的例子包括但不限于：重组多肽、共刺激分子、治疗药物或核酸分子。在一个实施例中，VEGF被移至脂质体上，导向细胞毒性药物，以阻断肿瘤生长所需的新血管的生长。
生物和/或合成膜、脂质体或囊泡中也能移入重组分子，用于发展疫苗和/或在体内施用时产生特定生物学或治疗作用。
修饰用作疫苗的细胞表面以改变对疾病的免疫性(例如对肿瘤的免疫应答——见下文)的现有方法通常需要对肿瘤细胞的转染或遗传操作，以诱导它们在其表面表达一种或多种特异蛋白质(10-12)。例如，在动物和人类肿瘤模型中，有证据表明，用诱导它们在表面上表达T细胞共刺激分子如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40和ICAM-1的基因转染肿瘤细胞，可能是制备在接种中用来提高荷肿瘤宿主中肿瘤免疫的细胞的有用方法(13-21)。遗憾的是，在临床状况如人体癌症治疗中，用这些基因转染肿瘤细胞可能是耗时且不便的。因此，转染频率通常较低，用多种基因成功转染(诱导多种蛋白质在肿瘤细胞表面表达)可能难以实现。此外，转染技术，甚至在利用表面上似乎无害的病毒载体施行时，可能与由于难以精确控制基因表达或其向基因组中的整合引起的患者的危险相关。
本发明还提供一种更为方便且安全的方法，用于将共刺激分子和其他分子直接移至细胞(如肿瘤细胞)表面和其他膜结构上(无论生物的还是合成的)，它们能用作疫苗，以提高或改变对人类肿瘤和其他疾病的免疫。
因此，能利用NTA-金属螯合连接，在螯合脂(例如NTA-DTDA)掺入膜内后，将分子直接锚定在生物膜(例如细胞或亚细胞颗粒的膜)上，从而提供一种改变这些膜的生物性质的方便方法。
本发明另一方面于是用于改变靶细胞或膜成分或结构的免疫原性。这可通过向细胞或膜结构上转移外源多肽、多糖、糖蛋白、受体、配体和其他分子容易地实现。改变细胞(如肿瘤细胞或其成分)的免疫原性是生产能增强对肿瘤细胞免疫应答的基于细胞的疫苗或试剂的一种有用方法。
因此本发明该方面提供了一种改变靶细胞或其膜成分的免疫原性的方法，该方法包括通过下列步骤向所述靶细胞膜或成分上转移分子：
(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；
(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂(或含螯合脂的脂质体)悬液一起温育，以使螯合脂能掺入细胞膜或膜结构中；
(iii)必要时洗去过量的或未掺入的脂或脂质体；
(iv)将该细胞或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)必要时洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该细胞或结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
在一个优选实施方案中，本发明用于利用下列方法改变靶细胞或其膜成分的免疫原性：
(i)用PBS或其他水性缓冲液洗涤细胞或膜结构悬液，以除去过量的可溶性和/或松散结合的蛋白质。这可如下进行：通过适当离心(例如，对于鼠和人细胞，200-500×g离心5分钟)沉淀该结构，然后将其重悬浮于PBS中；根据结构，可通过过滤或其他洗涤方法除去过量的可溶性或松散结合的蛋白质；
(ii)通过在PBS溶液中超声处理适量的脂5-10分钟，在含有大约相等浓度的Zn2+或Ni2+的PBS中制备螯合脂悬液(例如NTA-DTDA，浓度为～0.1mM)。其他脂类或磷脂(例如POPC)或其他试剂也能与螯合脂一起存在，以促进脂质体向膜结构中的融合和掺入；
(iii)将细胞或膜结构与螯合脂(例如0.1mM NTA-DTDA)在PBS中的悬液，在使悬液中的某些脂类能融合和/或掺入结构中的适当时间内和温度下(例如30分钟，37℃)，一起温育。注意：可改变使用的温育条件，来适应使用的螯合脂和将要掺入脂类的特定膜结构的性质；另外，在含有添加剂如聚乙二醇的缓冲液中的温育或洗涤步骤能用来促进脂类融合和掺入；
(iv)必要时通过如以上步骤(i)的沉淀和洗涤，用PBS洗涤细胞或膜结构，从混合物中除去未结合的脂；
(v)将洗涤过的含掺入螯合脂的细胞或膜结构与重组蛋白溶液或不同重组蛋白混合物溶液一起温育，这些重组蛋白均含有六组氨酸或其他任何合适的金属亲和尾；和
(vi)用PBS洗涤细胞或结构(如以上步骤(i))，除去过量的或未结合的可溶重组蛋白。
能用一种类似的方法改变任何靶细胞或其亚细胞膜成分的免疫原性。这样处理的结构将含有由于掺有螯合脂和移入蛋白质而修饰的表面，并能在接种中用来改变体内免疫应答。当在体内施用时，这些修饰的结构也能用来导向体内的特定细胞型或组织，从而诱导一种反应，或改变这些细胞或组织的功能。例如，含已知可结合树突细胞上受体的分子的肿瘤细胞的移入能用来将移入的肿瘤细胞导向树突细胞，以增强肿瘤抗原递呈，从而增强对肿瘤的免疫应答。
在该形式中，本发明涉及一种改变生物膜(如细胞膜和亚细胞膜成分)的生物学和免疫学性质的方法。特别是，本发明为修饰能掺入螯合脂的细胞(例如肿瘤细胞)、任何细胞或亚细胞膜成分、传染剂或颗粒(例如细菌)，以及任何生物或合成膜(包括合成囊泡或脂质体)的表面的方便策略提供基础。在所有这些情况中，通过蛋白质上的肽尾与掺入膜结构中的螯合脂上的NTA首基之间形成金属螯合键，移入重组蛋白。生物膜通过锚定具有合适的尾的任何重组蛋白、糖蛋白和其他任何分子结构而修饰，并且在作为疫苗或试剂在体内施用，用于将这些生物膜导向特定细胞和组织中时，用来增强对疾病的免疫。
在一个更特别的实施方案中，本发明也描述了细胞、生物和/或合成膜或脂质体向体内特定细胞型或组织的导向，以达到治疗效果，该方法包括通过下列步骤转移在所定向的特定细胞型或组织上具有结合配偶体的分子：
(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；
(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育，以便能掺入该脂；
(iii)必要时洗去过量的或未掺入的脂；
(iv)将该脂质体、细胞或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)必要时洗去过量的或未结合的可溶蛋白，然后将该脂质体、细胞或结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
因此，本发明能向肿瘤细胞膜中掺入螯合脂如NTA-DTDA，随后移入含有合适的尾的重组共刺激和/或其他分子(或分子的组合)，这可能是发展基于细胞的疫苗来增强肿瘤免疫的一种方便方法。类似于得到证明的其改变肿瘤免疫的能力，预期该技术也能提供一种方便的方法，用于将特定共刺激和/或其他细胞表面分子(或这些分子的组合)移至其他细胞型包括T细胞、B细胞和树突细胞上，来观察这些分子在调节免疫功能中起什么作用。因此，除了其在癌症免疫治疗中的潜在用途之外，此处所述的技术在显著提高我们对免疫功能的理解方面将具有用途。
本发明另一方面提供一种修饰生物和/或合成膜和脂质体的方法，以在体内施用时达到特定治疗效果，如免疫应答或其他生理或生物反应的诱导或调节，该方法包括：
(i)制备螯合脂或由脂和螯合脂组成的脂质体的悬液；
(ii)通过将细胞或膜结构悬液与含螯合脂的脂质体悬液一起温育，并在必要时洗去过量的或未掺入的脂或脂质体，将螯合脂掺入细胞或膜上；
(iii)将该脂质体、细胞或膜结构与具有合适的金属亲和尾的重组蛋白或靶分子的溶液一起温育；和
(iv)洗去过量的或未结合的可溶蛋白，并将该脂质体、细胞或膜结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
如上所述，本发明提供改变细胞免疫原性的方法。因此，本发明提供一种治疗方法，该方法包括对患者施用有效量的脂质体制剂或膜物质，其含有活性物质，和任选的具有结合配偶体或靶组织的锚定或移入的分子。
更具体而言，本发明提供一种治疗方法，该方法包括对患者施用有效量的脂质体制剂或膜物质，其含有包封或掺入的药物或活性物质，和在将要导向的靶细胞型或组织上具有结合配偶体的移入的导向分子。
本发明另一方面提供一种含有细胞或膜物质疫苗组合物，其中已经移入了能改变对施用疫苗的患者的免疫应答的分子，该疫苗还含有一种或多种药学载体和/或稀释剂。优选地，移入细胞或膜物质的分子是共刺激分子。此外，该疫苗优选地通过下列步骤生产：
(i)将细胞或膜物质与螯合脂如NTA-DTDA一起温育，使脂掺入细胞或膜中；
(ii)通过离心或过滤，并将这些结构在合适的溶液或缓冲液中重悬浮，洗去任何未掺入的脂；
(iii)将掺有螯合脂的膜结构与将要移入的分子温育；和
(iv)洗去未掺入的分子物质。
在一个相关实施方案中，本发明提供一种含有细胞、脂质体、囊泡或膜物质疫苗组合物，其中已经移入了能改变对施用疫苗的患者的免疫应答的分子，该疫苗还含有一种或多种药学载体和/或稀释剂。
本发明还提供含有移入、包封和/或锚定的试剂的膜系统在生产用于改变动物免疫应答的药物中的用途。
根据本发明的优选动物是人、灵长类动物、家畜、实验动物和捕获的野生动物。
术语如“锚定”和“移入”在本说明书中可交替使用。术语“移入(engrafting)”也包括术语“移植(grafting)”。术语“膜”和“脂膜”包括生物和合成的膜以及脂层。“螯合脂”可以是任何合适的螯合脂，例如但不限于NTA-DTDA。
本发明另一方面涉及一种将细胞生物和/或合成膜和脂质体导向体内特定细胞型或组织的方法，该方法包括通过下列步骤向膜结构上移入一种在欲导向的特定细胞或组织上具有结合配偶体的分子：
(i)制备螯合脂或含螯合脂的脂质体的悬液；或
(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育，以使该脂掺入；
(iii)必要时洗去过量的或未掺入的脂；
(iv)将该脂质体或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)必要时洗去过量的或未结合的可溶分子，并将脂质体或结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
以下的材料与方法涉及下列某些实施例。
试剂
在所有实验中使用分析级试剂。低聚甲醛获自BDH Chemicals。ZnSO4用于向所有缓冲液和生长培养基中添加Zn2+。RPMI 1640和EMEM(Eagles基本必需培养基)都获自Gibco(Life Technologies，Melbourne，澳大利亚)。胎牛血清(FCS)获自Trace Scientific(Noble Park，Vic.澳大利亚)。磺基-NHS-LC-生物素获自Pierce(Rockford，IL)。Na51CrO4、[3H]-胸苷和异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的链霉亲和素(链霉亲和素-FITC)获自Amersham(UK)。二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、α-棕榈酰-β油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱(DMPC)、Isopaque、ficoll、没食子酸丙酯和聚乙二醇(PEG)制剂PEG400、PEG600、PEG900和PEG1500全部获自Sigma-Aldrich Pty Ltd(Castle Hill，NSW，澳大利亚)。供Topcount NXT微量板闪烁计数仪使用的MicroScint闪烁液和其他物品如滤片和96孔板封盖获自Canberra Packard(Canberra，ACT，澳大利亚)。
小鼠和细胞系
雌性或雄性DBA/2J小鼠(H-2d)用于为了T细胞增殖分离淋巴组织(脾脏)，测定T细胞毒性，接种和监测体内肿瘤生长。C57BL/6J小鼠(H-2b)在实验中用于估测T细胞增殖的异体刺激。小鼠在6-8周龄时使用，获自Animal Breeding Establishment，John Curtin School of MedicalResearch(JCSMR)，澳大利亚国立大学(ANU)，堪培拉。鼠细胞系P815[鼠DBA/2(H-2d)肥大细胞瘤]和EL4[鼠C57BL/6(H-2b)]T细胞淋巴瘤分别从P.Waring(免疫学与细胞生物学室，JCSMR)和H.O’Neill(生物化学与分子生物学室)博士，ANU处获得。这两种细胞系都在由含10％v/v FCS的EMEM组成的完全培养基中培养。
NTA-DTDA的合成
由次氮基三乙酸(NTA)首基与双十四烷胺(DTDA)共价连接组成的螯合脂次氮基三乙酸双十四烷胺(NTA-DTDA)，由C.Easton博士(ReserchSchool of Chemistry，ANU)按照类似于以前所述的方法(22)合成。简言之，DTDA由溴十四烷和氨合成。DTDA然后用琥珀酸酐N-琥珀酰化，产生N-琥珀酰-DTDA(DTDA-suc)，它与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，产生N-[(羟基琥珀酰亚胺酰)琥珀酰]-DTDA(DTDA-suc-NHS)。DTDA-suc-NHS的琥珀酸亚胺基被替换为Nα-叔丁氧基羰基-赖氨酸(N-Bos-lys)基，除去丁氧基羰基(Boc)，产生Nε-[(DTDA)琥珀酰]-L-赖氨酸(DTDA-suc-Lys)。DTDA-suc-Lys最后与溴乙酸反应，产生Nα，Nε-双[羰基甲基]-Nε-[(DTDA)suc]-L-赖氨酸，它被称为NTA-DTDA。每种产物的纯度通过薄层层析测定，终产物的身份通过核磁共振光谱法、傅立叶红外光谱法和质谱法证实。终产物的纯度估计超过99％。
NTA-DTDA脂质体悬液的制备
为了向细胞中掺入NTA-DTDA，通过用TOSCO 100W超声波破碎机以最大振幅超声处理2分钟，将干燥的NTA-DTDA悬浮于含0.5mM Zn2+的PBS中至浓度0.5mM。用相同步骤产生DMPC悬液，和NTA-DTDA和DMPC、POPC或DPOE的混合液。脂类的贮存悬液保存于-20℃下，并在用于实验之前再次超声处理并稀释为指定浓度。
单克隆抗体
单克隆抗体(mAb)及其来源如下：鼠抗-CD40(克隆3/23，大鼠IgG2a)和鼠抗-CD3(克隆145-2C11，美洲仓鼠IgG)mAb都获自Pharmingen；鼠抗-B7.1(克隆16-10A1，美洲仓鼠IgG)mAb来自The Walter and ElizaHall Institute of Medical Research，Melbourne，澳大利亚。指明时，如以前所述(23)通过与磺基-LC-生物素(Pierce)反应将mAb生物素化。
重组蛋白
重组形式的鼠T细胞共刺激分子B7.1(CD80)和CD40胞外区，人促红细胞生成素受体(EPOR)的胞外区，均带有六组氨酸(6His)尾，分别命名为B7.1-6H、CD40-6H和EPOR-6H，用杆状病毒表达系统产生。简言之，编码鼠B7.1、CD40和EPOR胞外区的基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，用含有尾序列的引物经PCR将6His尾序列掺入每种基因的末端(对应于蛋白质的羧基端)。然后将构建体分别连接于pVL1393质粒杆状病毒转移载体中，用来转化大肠杆菌。筛选合适的转化子，来自这些转化子的重组pVL1393质粒与杆状病毒AcMNPV共转染SF9昆虫细胞。通过噬斑测定法筛选病毒基因组中掺有pVL1393质粒的病毒所感染的细胞，进一步扩增，并用这些病毒原种感染Express-5培养基中生长的High-5昆虫细胞。通过Ni2+-NTA亲和层析(使用Ni2+-NTA Superflow，来自QIAGEN Pty Ltd，Cifton Hill，Victoria，澳大利亚)，随后用Superdex-75 HR 10/30柱经FPLC(Pharmacia Biotech，Upsalla，瑞典)大小排阻凝胶过滤，从重组病毒感染的High-5细胞上清液中纯化重组蛋白；经SDS-PAGE分析判断，每种蛋白质的终纯度均＞95％。对于某些实验，如以前所述(23)通过与磺基-LC-生物素(Pierce)反应将重组蛋白生物素化。蛋白质通常以0.2-0.6mg/ml的浓度在-20℃下贮存于PBS中，在用于每次实验之前，37℃融解并轻轻振荡。
NTA-DTDA的掺入和掺入的优化
培养的P815肿瘤细胞用PBS洗涤两次，从培养基中除去蛋白质，并以1×107细胞/ml浓度悬浮于PBS中。然后将细胞以1.8×105细胞/孔等分于96孔V底Serocluster平板(Costar，Corning，NY)中，并与溶于含125μM Zn2+的PBS中的125μM NTA-DTDA(单独或作为与所述其他脂类的混合物)或125μM DMPC(对照)一起37℃温育40分钟。温育后，用含0.1％v/v BSA的PBS(PBS-0.1％v/v BSA)洗涤3次除去未掺入的脂。通常在将细胞与生物素化的6His肽(B-6His)(0.2μg/ml)4℃温育30分钟，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，并用链霉亲和素-FITC染色后，通过FACS分析(见下文)估计掺入的NTA-DTDA的相对水平。细胞与溶于含0.1％v/vBSA的PBS(PBS-0.1％v/v BSA)中的链霉亲和素-FITC(33μg/ml)一起4℃温育30分钟，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤三次，用2％v/v低聚甲醛PBS溶液固定，然后通过FACS分析FITC-荧光。
为了促进NTA-DTDA脂质体的融合，和NTA-DTDA向细胞膜中的掺入，检测了以前报道可加强细胞和囊泡与脂层融合的大量试剂。如上所述被等分于96孔V底Serocluster平板中的P815细胞与125μM NTA-DTDA、DMPC、POPC或DOPE，或与125μM NTA-DTDA加DMPC、POPC或DOPE(以指定的摩尔比)在含125μM Zn2+的PBS中37℃温育40分钟。对于某些实验，细胞在温育后用PEG处理：沉淀细胞，悬浮于15％PEG400中，与无血清EMEM混合并稀释10×，然后用含血清EMEM洗涤一次，用PBS-0.1％v/vBSA洗涤两次，之后向细胞中移入生物素化的重组蛋白(见下文)，并如以上对于FACS分析所述用链霉亲和素-FITC染色。
向细胞上转移重组蛋白
含掺入NTA-DTDA的细胞与单独(每一种为50μg/ml)或组合(100μg/ml总蛋白质，B7.1-6H∶CD40-6H摩尔比为4∶1)的纯化B7.1-6H和CD40-6H(或其生物素化形式)在96孔V底Serocluster平板中4℃温育1小时。然后用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，除去未结合的蛋白质，之后用含有移入蛋白质的细胞进行免疫或用于T细胞增殖实验。对于通过FACS分析测定结合蛋白质水平的实验，细胞用链霉亲和素-FITC染色(用于含有移入生物素化蛋白质的细胞)，或首先与适当生物素化的mAb(B-mAb)温育(4℃30分钟)，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，然后用链霉亲和素-FITC染色。
时程
含有掺入NTA-DTDA和DMPC、含或不含移入CD40-6H的细胞，悬浮于含10％v/v FCS和添加50μM Zn2+的EMEM中，在12孔平底组织培养板(Linbro，ICN Biomedicals Inc，Aurora，OH)中37℃温育约2分钟(时间0)或4小时或24小时。经过指定的温育时间后，从12孔平底平板中收集细胞，转移到96孔V底Serocluster平板中，用PBS-0.1％v/v BSA洗涤两次，之后用链霉亲和素-FITC染色(用于含有NTA-DTDA和移入B-CD40-6H的细胞)，或首先与CD40-6H温育，然后用PBS-0.1％v/v BSA洗涤，并用链霉亲和素-FITC染色(用于只含NTA-DTDA的细胞)。
流式细胞术
荧光素激活细胞分选仪(FACS)分析用来定量在与B-6His结合后掺入细胞膜中的NTA-DTDA的相对水平，和通过掺入的NTA-DTDA锚定于细胞表面的生物素化重组蛋白的水平。流式细胞分析用装配有15mW氩离子激光器的FACSort流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行。根据前向光散射(FSC)、侧向光散射(SSC)和FITC-荧光分析细胞；高于背景的荧光强度相对偏移得到NTA-DTDA掺入水平和细胞表面上肽或重组蛋白水平的半定量测量。一般而言，对于每一条件用对数放大器收集10000个细胞的荧光信息，数据用CELLQuest(Becton Dickinson)软件处理。数据如下分析，用FSC对SSC点图判断，开启(gating)活细胞，并将荧光图绘成直方图。用对照样品作为背景，通过测定从峰到峰的荧光强度偏移，确定高于背景的荧光强度的增加倍数。独立实验的结果表示为平均值±平均数标准误(SEM)。
聚焦显微镜术
通过激光扫描聚焦显微镜术研究P815细胞表面上NTA-DTDA的分布，其中使用掺有与生物素化CD40-6H结合的NTA-DTDA的细胞，并用链霉亲和素-FITC染色。简言之，将细胞悬浮于包埋培养基(2％没食子酸丙酯溶于87％v/v甘油)中，沉淀到用具孔Scotch 465转移胶带形成的显微镜玻片上的0.05mm深小室中，然后用盖玻片密封小室。用MRC-500激光扫描聚焦成像系统(BioRad)检测细胞在520nm的荧光，该系统由Nikon聚焦荧光显微镜(×60 Nikon物镜)和BioRad UV-激光扫描仪和产生氩离子激光的Ion Laser Technology激光头(5425型，BioRad)组成。通过对10次连续激光扫描的Kalman平均获得图像，储存，并用图像处理计算机(BioRad)分析，用NIH Image 1.61软件处理。
T细胞增殖试验
如述(24)从异体或同系小鼠的脾脏中分离纯化供T细胞增殖试验中使用的T细胞。简言之，将脾脏破碎成单细胞悬液，应用Isopaque-Ficoll梯度通过密度梯度离心去除死亡细胞和红细胞。离心(400×g 20分钟)后，从梯度顶层收集活细胞，主要是淋巴细胞，悬浮于含10％v/v FCS、5×10-5M2-β-巯基乙醇、100i.u./ml青霉素、100μg/ml新霉素、IL-2和10mMHEPES的RPMI 1640中。T细胞用平衡尼龙毛柱纯化(25)。然后将纯化的T细胞以2×104细胞/50μl/孔的浓度悬浮于96孔平底板(Cell Wells，Corning，NY)中的生长培养基中，以在5％CO2空气中37℃培养。
T细胞增殖试验如述进行(25)。同系淋巴细胞或应答细胞与γ-照射(5000rad)的刺激细胞以2×104细胞/50μl/孔的浓度共培养。刺激细胞包括原初P815肿瘤细胞，在其表面上掺有NTA-DTDA的P815细胞，和含有移入重组蛋白的P815细胞，如示。37℃共培养4天后，细胞用每孔1μCi[3H]-胸苷脉冲6小时。然后用Filtermate 196细胞收集器(Packard)收集细胞，并用MicroScint闪烁和应用Topcount软件的Topcount NXT微量滴定板闪烁计数器(Packard)估计[3H]-胸苷掺入。
细胞毒性测定
体内肿瘤特异性CTL的测定通过类似于Chen等人(26)所述的方法进行。同系DBA/2小鼠用PBS(对照)或1×105γ-照射(5000rad)的与移入重组蛋白的P815细胞皮下免疫。免疫14天后从小鼠中取出脾脏，如上所述，使用Isopaque-Ficoll和尼龙毛分级分离，通过密度梯度离心分离T淋巴细胞(效应T细胞)。然后将效应T细胞悬浮于温育培养基中，以1×105细胞/孔的浓度等分到24孔平底板中，与1×105γ-照射(5000rad)的原初P815细胞其培养。其培养5天后，如述(26)用标准51Cr释放试验估计效应细胞的溶细胞活性。简言之，2×106原初P815细胞用250μCi51Cr(Na51CrO4)标记90分钟。标记的靶细胞洗涤3次，并重悬浮于培养基中。效应和靶细胞与效应细胞以所示的不同效靶比37℃共温育6小时。收集上清液，用应用Topcount软件(Packard)的Topcount NXT微量滴定板闪烁计数器(Packard)估计51Cr释放。百分比裂解如下计算：
Figure C0080917400271
动物的免疫和体内肿瘤攻击
小鼠用类似于所述的方法(26)免疫。简言之，如示的PBS(对照)或1×105γ-照射的含移入重组蛋白的P815细胞，悬浮于0.2ml体积的PBS中，并用25规格针头和1ml注射器注射右背剃毛的同系DBA/2小鼠。14天后，小鼠在使用从小鼠脾脏分离的T细胞的细胞毒性测定中使用，或用1×105原初P815细胞通过皮下注射剃毛的左背攻击。为了监测肿瘤生长，通过用卡尺以毫米为单位测量两个垂直直径，每周一次对小鼠的肿瘤大小评分(29)。存活数据代表在评分时仍然存活的动物；濒死的动物在评分后实施安乐死，并且认为死于肿瘤。每种实验条件显示了一组总共10或12只小鼠的数据。
                              实施例1
利用本发明通过转移六组氨酸标记的分子修饰细胞表面和其他生物和/或合成膜和脂质体(参见图1)，用于疫苗的研发和药物体内导向。
图2的直方图显示鼠肥大细胞瘤P815细胞的荧光激活细胞分选(FASC)图，这些细胞携带移入的重组六组氨酸标记鼠B7.1和CD40。P815细胞与对照脂二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC；也称为di-C14-PC；对照)或螯合脂NTA-DTDA的悬液(0.1mM)37℃预温育30分钟，之后用PBS洗涤，并与六组氨酸标记的B7.1和CD40(每一种为～20mg/ml)的混合物温育。然后再次用PBS洗涤细胞，并通过与所述生物素化16-10Al或生物素化B-3/23单克隆抗体(即生物素化抗-B7.1或抗-CD40)温育(4℃30分钟)，随后与FITC-结合的链霉亲和素温育染色。与DMPC和重组蛋白温育的细胞在用任一种单克隆抗体染色后显示低水平荧光(对照)。与NTA-DTDA预温育的P815细胞的荧光比与DMPC预温育的细胞(对照)高10-100倍。每一结果都代表一式两份进行的两次实验。结果显示螯合脂(在该情况下为NTA-DTDA)能掺入这些细胞膜中，掺入的脂类能用来将六组氨酸标记的B7.1和CD40通过NTA-DTDA直接锚定或移至P815细胞表面。在其他研究中，我们显示，携带六组氨酸尾的重组鼠B7.1和CD40能被移至测试的所有不同细胞系表面；其包括鼠P815和EL4肿瘤细胞、人白血病Jurkat细胞和酵母细胞。
                              实施例2
本实施例涉及修饰肿瘤细胞表面，以增强肿瘤免疫。
最近的研究表明，B7-1和B7-2的跨膜和细胞质区不是T细胞共刺激所必需的(20)，当B7-1在肿瘤细胞表面以GPI锚定形式表达时也发生T细胞共刺激(21)。此外，也能产生任何细胞表面受体分子(如鼠T细胞共刺激分子B7.1和CD40)的胞外区，使之在羧基端含有六组氨酸或其他合适的肽尾。以这种形式，本发明提供一种将这些共刺激分子以正确方向直接锚定于细胞表面的方法，从而模拟抗原递呈细胞表面上这些分子的共刺激功能。因此本发明可通过提供一种更方便、安全的转染备选方法，用于使肿瘤细胞上的共刺激和/或其他相关分子在免疫中用于增强对肿瘤的免疫，用于肿瘤疫苗研发。
利用移入分子的生存力能通过测定取决于结合分子的功能反应来检测。因此，携带移入六组氨酸标记B7.1和/或CD40的鼠P815肥大细胞瘤(DBA/2，H-2d)细胞在异体系统中刺激T细胞增殖反应的能力，用从C57Bl/6(H-2b)小鼠分离的脾细胞检测，该脾细胞与适量的γ-照射的P815细胞(作为对照)或移入六组氨酸标记的B7.1和/或CD40的P815细胞共培养。用3H胸苷掺入测定T细胞增殖的预实验显示，携带移入的六组氨酸标记的B7.1和/或CD40的P815细胞能在混合细胞反应中刺激水平提高的T细胞增殖。这些结果与可用于修饰细胞以在接种中用来增强抗肿瘤反应的发明一致。
                           实施例3
为了测试携带移入的共刺激分子的P815细胞诱导体内抗肿瘤反应的能力，用携带移入分子的P815细胞免疫小鼠，观察这是否能在同系动物中刺激CTL活性和/或影响肿瘤生长。各组DBA/2小鼠用PBS或γ-照射的携带移入的EPOR-6H、B7.1-6H或B7.1-6H加CD40-6H的P815细胞免疫。免疫两周后，从小鼠中取出脾脏，分离脾T细胞，并在标准51Cr释放试验中估计其杀伤原初P815细胞的能力。图3的数据显示，以指定的所有效应靶细胞比(0.5∶1，1∶1，5∶1)，来自PBS免疫小鼠(对照)的T细胞只诱导低水平(2-5％)的裂解。来自P815-EPOR(作为对照蛋白质)免疫小鼠的T细胞的裂解活性也较低，为7-16％。有趣的是，对于测试的所有效应细胞：靶细胞比，在效应T细胞来源于携带一种或多种移入共刺激分子的P815细胞免疫的小鼠的条件下，肿瘤细胞比裂解的水平较高(见图3)。在5∶1的效应细胞∶靶细胞比时观察到最高细胞裂解活性，从携带移入B7.1的P815细胞、含移入B7.1和CD40的P815细胞免疫的小鼠获得的T细胞诱导的特异细胞裂解分别比从移入对照蛋白质的P815细胞免疫的小鼠获得的T细胞高3倍和5倍(见图3)。使用原初EL4细胞代替P815细胞的平行实验只显示背景水平的裂解，表明细胞裂解反应对于作为靶标的P815细胞特异。结果表明，能在用携带移入B7/CD40的P815细胞免疫的小鼠中产生针对P815细胞的CTL反应。
为了确定用携带移入共刺激分子的P815细胞免疫小鼠能否诱导肿瘤免疫，也监测用γ-照射的携带移入蛋白质的细胞免疫的小鼠组，监测其肿瘤生长和用原初P815细胞攻击后的存活率。这些结果表明，与用携带对照蛋白质的细胞免疫的小鼠相比，用携带移入共刺激分子的P815细胞免疫的小鼠有较低的肿瘤生长率。因此，在肿瘤攻击后第5周，用携带移入B7.1-6H和B7.1-6H加CD40-6H的P815细胞免疫的小鼠，平均肿瘤直径分别为3.36±1.0mm和1.1±0.9mm；用PBS和移入EPOR-6H的P815细胞免疫的小鼠，分别为10.7±2.5mm和8.3±2.7mm。只显示攻击后前5周的平均肿瘤直径所反映的肿瘤生长数据，因为此后某些动物死于肿瘤。肿瘤攻击后第14周，对照小鼠的存活率为～17％，移入B7.1的P815细胞免疫的小鼠为～30％，移入B7.1和CD40的P815细胞免疫的小鼠为～60％(见图4(a)和(b))。与观察到的CTL活性的升高一致，结果表明用携带移入共刺激分子的P815细胞免疫同系动物能抑制肿瘤生长，并在原初P815肿瘤攻击后延长动物的存活期。
                            实施例4
血管内皮生长因子(VEGF)是～40kDa的同型二聚糖蛋白激素，也是最有力的生血管有丝分裂原之一，是一种主要的血管生成调节剂(27)。有相当多的证据表明，VEGF由肿瘤细胞和缺氧的其他细胞分泌，VEGF是实体瘤发展中的一种主要的生血管因子(28)。除了有力的生血管活性外，VEGF还可提高血管通透性，促进内皮细胞通过血管外基质的迁移，肿瘤血管生成、肿瘤扩散和转移所必需的过程(29)。人VEGF已知可通过结合高亲和力VEGF受体如激酶域受体(人KDR，或鼠flk-1)和Fms样酪氨酸激酶-1(Flt-1)刺激内皮细胞生长和分化。这些受体只在增殖的血管内皮细胞上表达，已知其表达通常由肿瘤产生的大量因子增强(27-30)。VEGF及其受体对于肿瘤生长是重要的，利用抗体(31)或重组可溶性受体域(32)中和VEGF显示出作为能抑制肿瘤生长和体内转移的制剂的治疗潜力这一事实证明了这一点。
VEGF受体基本上只是在增殖的内皮细胞上的表达表明，VEGF受体能在针对肿瘤血管形成的治疗策略中用作导向分子。能避免被免疫系统(例如肝和脾中的网状内皮系统)的吞噬细胞消灭的空间稳定的或“隐密”的脂质体(SL)的发展，最近为癌症化学治疗中的脂质体药物施用提供了较大进展(33-35)。与体内施用后被快速从血液中清除(通常在数分钟内)的常规脂质体不同，SL在几天后仍存在于血液循环中。大量研究证明了含有包封的细胞毒性药物如阿霉素的SL在治疗AIDS相关卡波西肉瘤和特征在于渗漏脉管系统的其他损伤中的治疗优点(35)。最近的研究也描述了SL向特异肿瘤的导向，导向主要利用“免疫脂质体”或含有与脂质体表面共价结合的特异抗体(或F(ab’)2片段)的脂质体实现(36)。在包封阿霉素的SL上固定导向蛋白质如抗体不改变其隐密样特征，但能赋予脂质体特异导向性质(37-40)。
在出现本发明以前，靶分子与脂质体的偶联是困难的，有可能诱导对使用的抗体的不希望的抗独特性应答。根据本发明的一个方面，两种螯合脂，次氮基三乙酸二-四-癸基胺(NTA-DTDA)和次氮基三乙酸聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺(NTA-PEG2000-PE)与重组形式的VEGF一起使用，来发展含有包封的阿霉素的SL，它们将在体内针对并特异破坏增殖的血管内皮细胞，从而阻断新血管形成和肿瘤生长。
VEGF是一种特别有吸引力的导向分子，因为VEGF受体基本上只在生血管内皮上表达。根据本发明，提议产生一种含有包封阿霉素和通过NTA脂类如NTA-DTDA锚定的表面VEGF的“隐密”脂质体。根据本发明提出，当体内施用时，该制剂将针对并破坏增殖的内皮细胞，并将抑制肿瘤发生和肿瘤转移。
主要由常规脂类如卵黄磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(Chol)和小比例(～10％)空间“稳定”脂类如神经节苷脂GM1(32)或与聚乙二醇(2000)结合的磷脂酰乙醇胺(PEG2000-PE)组成的脂质体(33，34)，据报道显示提高的稳定性和在血液中延长的循环时间，大多数能避免被网状内皮系统消灭。SL的这些性质已经归因于存在含有不带电首基的脂类，它们能增强与水的相互作用，但抑制与可能存在于血浆中蛋白质和细胞上的带电或疏水结构的相互作用(32，33)。有证据表明，含有与SL表面上PEG链远端结合的抗体分子的SL(或免疫脂质体)，比含有直接结合于SL表面上的抗体的脂质体更有效地与其靶标结合。这已经用PEG链在这些条件下空间干扰抗体与抗原相互作用的能力来解释(37)。因此，用神经节苷脂GM1或有较短PEG链长的PEG-脂类(例如PEG750-PE，而不是PEG2000-PE)制成的SL，可能更适于6His-VEGF与脂质体表面上NTA-DTDA的直接结合，并用于移入的VEGF与靶细胞上VEGF受体的最佳结合。神经节苷脂GM1和PEG750-PE都可购得(来自Avanti Polar Lipids)，均用由PC、Chol和NTA-DTDA构成的脂质体检测。为了进一步减少可能的空间作用，发明者生产了一种新型脂类，即NTA-PEG2000-PE，它由与PE上PEG链远端结合的NTA基团组成。该化合物与PEG2000-PE结合使用，生产允许方便地移入导向6His-蛋白质(如6His-VEGF)的SL，而消除空间阻碍的可能性。这一研究大大促进了SL在需要导向特定细胞和/或组织的治疗用途中的应用。
生产了重组6His-VEGF。SL由包括PC、Chol、NTA-DTDA和“隐密”脂类如神经节苷脂GM1、PEG2000-PE和NTA-PEG2000-PE在内的脂类混合物产生。SL中移入6His-VEGF(VEGF-SL)，然后估计其导向内皮细胞的能力。相对于脂质体与缺乏VEGF受体的细胞的结合，优化与培养中的增殖内皮细胞特异结合的条件。包封阿霉素的VEGF-SL的特异细胞毒性将用人血管内皮细胞体外估计。向小鼠中静脉施用荧光染料和/或放射性示踪剂标记的VEGF-SL，确定其随时间在不同组织中的分布。改变用于生产SL的每种稳定脂类的比例，来优化脂质体的“隐密”性质，这根据肝脏、脾脏和其他主要器官与血管化肿瘤相比吸收脂质体的比例减少来判断。由于VEGF受体在结合配体后被胞吞，含有包囊的阿霉素的VEGF-SL被增殖的血管内皮细胞吸收，致使其被破坏。通过检查脂质体抑制肿瘤生长和/或消灭体内建立的肿瘤的能力，测试该方法的能力。该研究因此提供一种抗血管生成癌症治疗的新方法。
                            实施例5
用于通过转移重组受体修饰细胞表面的方法，能用来生产在体内使用时能改变免疫应答的基于细胞的疫苗。
这被下列事实证明，移入共刺激分子B7.1和CD40的P815细胞能用作疫苗来增强肿瘤免疫。类似地，这些或其他任何重组蛋白或分子(具有合适的尾)可被移至其他任何生物膜结构上(例如来源于细胞和/或亚细胞成分的膜结构，如质膜囊泡等)。移入的结构然后能用作疫苗，来增强肿瘤免疫和/或为了治疗目的改变体内免疫应答。优选方法包括：
(i)将细胞或膜物质与螯合脂如NTA-DTDA一起温育，使脂掺入细胞或膜中；
(ii)通过离心或过滤，并将这些结构重悬浮于合适的溶液或缓冲液中，洗去任何未掺入的脂；
(iii)将掺有螯合脂的膜结构与具有适当亲和尾的适当重组蛋白温育；和
(iv)洗去未掺入的蛋白质物质；然后用修饰的结构作为可体内施用的疫苗，用于治疗目的，如改变体内免疫应答。
本方法也能使用合成膜结构(即由任何磷脂(例如PC或PE)与NTA-DTDA的混合物组成的合成脂质体或囊泡)。合成结构中能掺入NTA-DTDA，因此，只需要以上的步骤(iii)-(v)。
                           实施例6
初步实验表明，移入适当重组受体蛋白的合成脂质体(由所述PC和NTA-DTDA以10∶1的比例组成)能用来特异地导向带有同源受体或配体的靶细胞(见图5)。这些脂质体也能用来改变生物应答(见图6)。本发明因此提供一种修饰脂质体表面的方法，以在治疗用途中用来向体内细胞或组织中输送包封的药物或其他治疗剂。这些脂质体用来改变生物反应，用于疾病的治疗，或定向细胞毒性药物或试剂向特定细胞(例如肿瘤细胞)的输送，以为了治疗目的破坏这些细胞。
本领域技术人员应当理解，此处所述的本发明可以具有特定描述之外的变化和修改。应当理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明也包括单个或组合的本说明书中提及或指出的所有步骤、特点、组合物和化合物，以及任两种或多种所述步骤或特征中的任一个和全部组合。
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Claims (36)

1.一种为了改变作为疫苗使用时的免疫性、或在体内施用时向特定细胞型或组织导向药物或其他试剂以达到特定治疗效果、或改变生理应答或生物学功能而修饰选自生物和/或合成膜或脂质体、或其组合，的膜结构的方法，该方法包括向所述膜结构中掺入两亲性分子，其中一部分两亲性分子已经通过金属螯合基团的共价结合修饰，使得某些金属螯合基团朝向该膜结构的外表面，该方法也包括下列步骤：在足以使多肽尾通过该膜结构的面向外金属螯合残基与膜结构结合的条件下，使与多肽尾共价结合的受体域与该膜结构相互作用一定时间，使得受体域能与体内特定细胞型或组织上存在的配体分子特异地相互作用。
2.根据权利要求1的方法，其包括下列步骤：
(i)通过混合和/或共温育，或通过由包括螯合脂和一种或多种其他脂类或磷脂在内的脂类混合物产生膜结构，将螯合脂单独或作为螯合脂与其他两亲性分子或磷脂的混合物掺入膜结构中；和
(ii)在通过该膜结构的面向外的金属螯合残基与该膜结构结合的合适条件下，使受体域与该膜结构相互作用一段时间，使得受体域为了治疗用途或为了生物应答改变在体内施用时能够与特定细胞型和/或组织相互作用。
3.根据权利要求2的方法，其中所述受体域经改造后具有金属结合多肽尾。
4.根据权利要求3的方法，其中所述受体域在足以使多肽尾与掺入膜结构中的螯合脂结合的条件下与膜结构相互作用一段时间。
5.根据权利要求2-4中任一项的方法，其中膜结构是通过超声处理或挤压/过滤技术由两亲性分子形成的微团或脂质体悬液。
6.根据权利要求2的方法，其中金属螯合基团是次氮基三乙酸(NTA)。
7.根据权利要求1或5的方法，其中生物和/或合成膜或脂质体中的两亲性分子是含有亲水头部分和一个或多个疏水尾的表面活性剂分子。
8.根据上述任一权利要求的方法，其中多肽尾含有氨基酸残基的一种序列，该序列能结合与该生物和/或合成膜或脂质体结合的金属螯合基团。
9.根据权利要求8的方法，其中氨基酸残基是组氨酸残基。
10.根据权利要求8或9的方法，其中多肽尾含有至少5个氨基酸残基。
11.根据权利要求10的方法，其中多肽尾含有至少6个氨基酸残基。
12.根据权利要求11的方法，其中多肽尾含有六组氨酸。
13.通过掺入或结合金属螯合基团修饰的生物和/或合成膜用于制备如下药物的用途：(i)疫苗开发；(ii)生物反应的改变；和/或(iii)向体内特定组织或细胞型导向药物或其它试剂以达到治疗作用，其中所述生物和/或合成膜通过如下方法修饰，包括：
(i)制备掺有螯合脂的生物和/或合成膜悬液，含或不含包封的药物或试剂；
(ii)将该生物和/或合成膜与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或导向分子温育；和
(iii)必要时，通过洗涤、过滤或其他洗涤方法除去过量的蛋白质，并将所述生物和/或合成膜悬浮于适于体内施用的溶液中。
14.根据权利要求13的用途，其中移入、锚定、掺入或包封于脂质体内的分子是治疗分子、药用化合物、DNA和/或RNA。
15.根据权利要求14的用途，其中移入或锚定于脂质体表面的导向分子是VEGF或其同源物。
16.根据权利要求15的用途，其中脂质体包封/掺有一种细胞毒性药物或试剂以及移入的VEGF或其同源物，以阻断肿瘤生长所需的新血管的生长。
17.根据权利要求16的用途，其中脂质体含有一种免疫原性试剂以及一种可将脂质体导向体内不同细胞型包括免疫细胞和肿瘤细胞的试剂，以改变免疫原性或免疫应答。
18.一种将重组蛋白或导向分子直接锚定于细胞或生物膜上的方法，该方法包括：
(i)制备螯合脂悬液或含螯合脂的脂质体的悬液；
(ii)将细胞或生物膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育以允许螯合脂掺入细胞或结构中；
(iii)洗去过量的或未掺入的脂；
(iv)将该细胞或膜结构与含有合适的金属亲和尾的重组蛋白或导向分子溶液一起温育；和
(v)洗去过量的或未结合的重组蛋白或导向分子，并将该细胞或膜结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
19.根据权利要求18的方法，其中重组分子是一种共刺激分子。
20.根据权利要求18或19的方法，其中生物膜来源于一种肿瘤细胞。
21.根据权利要求18或19或20的方法，用于增强或改变对肿瘤或的免疫，改变任何生物反应，或任何病症的治疗。
22.根据权利要求18的方法，其中重组分子是一种受体或配体。
23.根据权利要求22的方法，其中重组分子是体内特定细胞型上的或作为疾病后果的细胞如肿瘤细胞上的受体的一种配体。
24.一种改变靶细胞或其膜成分的免疫原性的方法，该方法包括通过下列步骤将一种分子锚定于该靶细胞的膜上：
(i)制备螯合脂悬液或含螯合脂的脂质体的悬液；
(ii)将细胞或膜结构悬液与螯合脂悬液一起温育；
(iii)洗去过量的或未掺入的脂；
(iv)将细胞或膜结构与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)洗去过量的或未结合的分子，并将该细胞或膜结构悬浮于适于体内施用的溶液中。
25.根据权利要求24的方法，其中靶细胞是一种肿瘤细胞。
26.根据权利要求24或25的方法，其中分子是一种配体、受体、重组蛋白、多糖、糖蛋白或抗原。
27.一种将细胞或生物和/或合成膜或脂质体导向体内特定细胞或组织的方法，该方法包括通过下列步骤将一种具有结合配偶体的分子锚定或移至欲导向的特定细胞或组织上：
(i)制备螯合脂悬液或含螯合脂的脂质体的悬液；
(ii)将细胞、膜或脂质体悬液与螯合脂悬液一起温育；
(iii)必要时洗去过量的或未掺入的脂；
(iv)将该细胞、膜或脂质体与将要锚定的分子的溶液一起温育；和
(v)洗去过量的或未结合的分子，并将细胞、膜或脂质体悬浮于适于体内施用的溶液中。
28.脂质体制剂或膜物质在制备用于治疗受试者的药物中的用途，其中所述脂质体制剂或膜物质含有活性物质和具有结合配偶体或靶组织的锚定或移入的分子。
29.根据权利要求28的用途，其中活性物质是移至脂质体制剂或膜物质表面或者包封于/掺入其中的重组多肽、共刺激分子、治疗药物或核酸分子。
30.根据权利要求28或29的用途，其中锚定或移入的分子是一种受体、配体、糖蛋白、多糖或重组多肽。
31.根据权利要求30的用途，其中锚定分子是VEGF。
32.根据权利要求28-35中任一项的方法，其中所述药物用来增强对特定肿瘤或疾病的免疫。
33.根据权利要求29的用途，其中共刺激分子是CD40或B7.1。
34.一种包含脂质体、细胞或膜物质的疫苗组合物，所述脂质体、细胞或膜物质中移入了能改变对施用疫苗的患者的免疫应答的分子，该疫苗还包含一种或多种药学载体和/或稀释剂。
35.根据权利要求34的疫苗，其中移至细胞或膜物质的分子是共刺激分子。
36.通过下列步骤制备的根据权利要求34或35的疫苗：
(i)将脂质体、细胞或膜物质与螯合脂如NTA-DTDA，或含螯合脂的两亲性分子的混合物一起温育，使脂掺入细胞或膜中；
(ii)通过离心或过滤，并将这些脂质体、细胞或膜物质重悬浮于合适的溶液或缓冲液中，洗去任何未掺入的脂；
(iii)将掺有螯合脂的脂质体、细胞或膜物质与将要移入的分子温育；
(iv)洗去未掺入的分子物质。
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