CN1325441A - 经修饰的胞外体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明与生物学和免疫学的领域有关。本发明涉及含具有特定结构的分子的膜囊泡,特别是含抗原分子的膜囊泡,及其用途。更特别涉及含主要组织相容性复合体的重组分子的囊泡(胞外体),及其作为免疫原性试剂或作为诊断或治疗工具的用途。本发明亦涉及制备这些囊泡、基因构建体、细胞及组合物的方法,其可用以实施本发明的方法。

Description

经修饰的胞外体及其用途
本发明与生物学和免疫学的领域有关。其涉及含具有特定结构的分子的膜囊泡，特别是含抗原分子的膜囊泡，及其用途。其更特别涉及含主要组织相容性复合体的重组分子的囊泡，及其作为免疫原性试剂或作为诊断或治疗工具的用途。本发明亦涉及制备这些囊泡、基因构建体、细胞和组合物的方法，其可用以实施本发明方法。
抗原识别的特异性为免疫系统细胞的主要特性。B淋巴细胞识别天然形式的抗原。T淋巴细胞识别由抗原降解衍生的肽与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合形成的复合物。从生物细胞合成的抗原(肿瘤或病毒抗原)衍生的肽与Ⅰ类MHC分子结合，其为细胞毒性T淋巴细胞所识别。从外源抗原衍生的肽与Ⅱ类MHC分子结合，其为辅助T淋巴细胞所识别。为MHC分子所呈递及为细胞毒性(CD8)或辅助(CD4)T淋巴细胞识别的肽的鉴定是新颖的治疗与疫苗策略的开始。此免疫疗法的进展需要评估抗原特异免疫性反应的技术的发展。
抗原肽与MHC分子在细胞内区室结合。以Ⅱ类分子而言，其由属于细胞内吞途径的较大颗粒中所含的囊泡组成(Peters等人，自然(Nature)349(1991)669)。其与质膜的融合首先导致肽-MHC复合物在细胞表面上的表达，其次导致称为胞外体(exosome)的这些囊泡的分泌。
Raposo等人的研究(J.Exp.Med.183(1996)1161)已显示B淋巴细胞能分泌载有Ⅱ类MHC分子的胞外体囊泡。而且，Zitvogel等人(自然医学(Nature Medicine)4(1998)594)已证明由具有利性质的树状细胞(称为右体)产生特殊的膜囊泡。因此，这些囊泡表达Ⅰ类和Ⅱ类MHC分子，并在对相应抗原敏感后，能刺激细胞毒性T淋巴细胞的体内产生及能引起肿瘤的全部或部分再吸收。
本发明涉及可用于生物学和免疫学领域的新颖方法及组合物。更特别的是，本发明描述新颖膜囊泡，其组成已以限定方式修饰。特别是，本发明描述一种新颖方法，其能特供产生表达已知组成的MHC复合物分子且视情况与限定结构的抗原肽复合的膜。因此，有可能用本发明以控制方式修饰膜囊泡的组成，并因而创造在治疗、诊断或甚至实验水平下特别有利的产物。
截至目前，在最佳情形下，所述的囊泡含内源MHC分子，即由其所衍生的细胞表达的MHC分子。在此考量下，这些分子具有变化的结构，其结构不总是经过鉴定的，且这些分子通常是多重的，这依其所产生的生物HLA型而定。相反地，使用本发明，有可能产生载有规定组成的MHC分子的膜囊泡。而且，本发明的囊泡具有以下的优点，即含以此方式确定的高数目MHC分子，及其提供有力的免疫原性。
本发明特别涉及含具有特定结构分子的膜囊泡，特别是含具有特定结构的MHC分子的膜囊泡。本发明特别涉及含具有特定结构的MHC-肽复合物的膜囊泡。本发明亦涉及一种修饰膜囊泡组成的方法，包括将含由与寻址区域融合的编码区域所组成的杂交区域的核酸、或编码蛋白质或多肽的核酸(其蛋白质或多肽(单独或与一个或多个蛋白质结合)被自然地寻址至这些膜囊泡中)插入产生该囊泡的细胞中。
本发明亦涉及膜囊泡，包括锚挂在膜部分的确定的抗原分子。该分子可暴露在囊泡外面，或相反地，内含在胞液中。本发明进一步涉及含具有特定结构的分子并暴露在其表面的膜囊泡，这使其特别能使用亲合方法纯化。本发明亦涉及膜囊泡，如上面定义的亦包括示踪剂的膜囊泡。借助该示踪剂，特别有可能在样品中侦测囊泡，例如其在体内的跟踪。
本发明亦涉及制备以上规定囊泡的方法，及这些囊泡的用途。例如，这些囊泡可作为免疫原性试剂以制备抗体。以特别有利的方式，这些囊泡被用以制备MHC限制的抗体，其特异于肽-MHC分子复合物。
本发明的第一个目的更特别为膜囊泡，其特征在于其含主要组织相容性复合体的重组分子。
膜囊泡一词，在本发明的意义中，特别指由脂双层组成的任何囊泡，且其中装入了胞质部分。这些囊泡通常经从细胞射出而产生，并因此在本申请中亦称为“胞外体”。本发明的膜囊泡(或胞外体)通常具有约60至80纳米的直径。而且，这些囊泡有利地载有膜蛋白质，其具有与在衍生出它们的细胞质膜中相同的取向。
本发明将在下面证明，以控制、特定的方式，有可能修饰胞外体的组成。更特别是，本发明显示了有可能产生表达已(预)确定组成的重组分子复合物的膜囊泡。如将在本说明书中其后说明，从治疗观点及从诊断与实验观点，该囊泡具有特别有利的性质。
本发明首先从选定制备膜囊泡的特别细胞群体开始。本发明亦经以下发现开始，即有可能由基因途径插入重组分子至这些细胞中，且这些重组分子其后以密集、功能性方式表达于胞外体中。
本发明的首要要素之一在于规定及鉴定用以制备膜囊泡的细胞群体。有利地是，使用的细胞为含内分泌囊泡的细胞、可经培养、基因修饰且其内囊泡可优选在外界刺激作用下分泌的细胞。此主要涉及哺乳类细胞，特别是动物细胞，也涉及人源的细胞。而且，初级培养物可被使用或无限增殖化细胞系。
以特别有利的方式，起始细胞实质上无MHC分子，即其不表达或仅表达一些内源MHC分子。如下说明，可证实此特性在一些应用中极具有重要性。
胞外体生成的细胞的不同类型已述于文献中，例如树状细胞或B淋巴细胞。但是，这些细胞通常难以转染，并含高数目的内源MHC细胞。在此考量下，虽然其可用以实施本发明，但本发明的囊泡更优选能从肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞获得。
在一个特殊实施例下，本发明的膜囊泡优选从肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞制备。
肥大细胞与由位于上皮(如皮肤、肺、肠或脾中)内的髓前体衍生的分化后的细胞型在一起，(Smith和Weis，今日免疫学(ImmunologyToday)17(1996)60)。这些细胞实质上特征在于，其细胞质大部分为粒子组成，这些粒子含组胺以及肝素或蛋白酶，且因此其在其表面上表达受体，该受体对E免疫球蛋白(IgE)具有强亲合力。而且，根据本发明使用肥大细胞的进一步优点在于由不同处理起始(特别是强烈刺激)胞外体的胞外分泌(即释放)的可能性。因此，有可能由在钙离子载体存在下的处理来调节囊泡的产生，或以更生理的方式由刺激具有IgE强亲合力的受体来调节囊泡的产生。
这些细胞提供用于实施本发明的特别有兴趣的性质，即内分泌囊泡的存在、其可能培养物及大量胞外分泌的诱导。而且，如实施例所示，这些细胞亦可以稳定方式被基因修饰，这提供实施本发明的特别有利的性质。
更具体而言，本发明囊泡具有约60至80纳米的直径并是从肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞产生。
在优选实施例中，本发明的膜囊泡实质上无内源MHC分子。内源MHC分子(即来自囊泡生成细胞的MHC分子)的缺乏可使用特定抗体以传统技术证明。其亦可由以囊泡免疫获得的抗体的选择性证明。如示于实施例中，在特别有利的实施例中，本发明的囊泡能在动物中诱导对其表达的规定重组分子的特定抗体的产生，而未检出抗非基因修饰细胞的抗体。“实质上无”一词指一些MHC分子可以极低量存在，其难以由传统方法检出，及对本发明囊泡的抗原特异性不具有明显的影响。
本发明的特殊膜囊泡更特定地经以下性质表征：
-其实质上无内源MHC分子；
-其载有一个或多个规定结构的重组分子，例如规定组成的重组肽-MHC复合物。
本发明的该囊泡有利地从实质上无内源MHC分子的肥大细胞衍生的细胞产生。在此情况下，已知肥大细胞蓄积Ⅱ类MHC分子在其分泌粒中，特别是，肥大细胞能以优先方式蓄积MHC-Ⅱ-肽复合物于特定多囊泡细胞内区室，其为分泌粒子(Raposo等人，Mol.Biol.Cell 8(1997)2619)。取自哺乳类的这些细胞因此含内源MHC分子。以特别有利的方式，用于本发明的细胞是从实质上无内源MHC分子的肥大细胞衍生。不同的肥大细胞已述于文献中。本发明将在下面论证，这些细胞系具有低含量的MHC分子，并因此特别有利于实施本发明。所举例说明的方法，可提及从RBL(大鼠嗜碱性细胞白血病)细胞衍生的系，其ATCC登记为CRL1378(Kulczycki等人，J.Exp.Med.139(1974)6007)；KU-812系(Butterfield等人，Leukemia Res.12 198)345)，或甚至未成熟人肥大细胞系，如HMC系(Nilsson等人，Scand.J.Immunol.39(1994)489)。特殊的系实例为RBL-2H3系(Barsumian等人Eur.J.Immunol.11(1981)317)。明显地，具有上述性质的任何其他细胞均可使用。
对于本发明，“规定组成”一词特别表示以下的事实，即本发明的囊泡具有例如极大的抗原特异性和单体型特异性。现有技术所述的囊泡通常表达不同的未知单体型的MHC分子。相反地，本发明的优选囊泡表达重组分子，其单体型以准确方式预先确定。“重组”一词指出囊泡生成细胞中，分子由编码此分子的重组核酸的表达生成。本发明的膜囊泡因此优选由经基因修饰以表达特定结构成份的细胞系产生。
如上所示，本发明的囊泡有利地表达规定的MHC分子。
人MHC的分子被归类为两个不同的类别，Ⅰ类MHC分子及Ⅱ类MHC分子。
在一个特殊实施例中，本发明的囊泡表达一种或多种Ⅱ类主要组织相容性复合体重组分子。对于这种情况，人MHC的Ⅱ类分子由两个链组成，即α链及β链，β链将等位基因特异性授予复合物。
在特定的变异体中，本发明的囊泡更特别表达Ⅱ类主要组织相容性复合体分子的重组α链。在另一个特定变异体中，本发明的囊泡更特别表达Ⅱ类主要组织相容性复合体分子的重组α链与重组β链。
不同类型的人MHCⅡ分子被鉴定、表征及定序(例如见免疫遗传学(Immunogenetics)36(1992)135)。可优先提及DR1至DR13型的分子，特别是DR1、DR2、DR3、DR4、DR5、DR6及DR7。编码人DR(特别是DR1至13)的DNA可容易地从细胞、基因库或质粒使用传统分子生物技术分离。这些序列已特别述于Bodmer等人(组织抗原(Tissue antigens)44(1994)1)。优选本发明的胞外体因此表达Ⅱ类MHC分子，其α链和β链选自单体型DR1至DR13，更优选选自DR1至DR7。
在特定的实例中，本发明涉及任何膜囊泡，其包含DR1单体型MHC-Ⅱ分子的重组α和/或β链。
在另一个实施例中，本发明的囊泡表达一种或多种主要组织相容性复合体的Ⅰ类重组分子。Ⅰ类MHC分子亦由两条链组成，即跨膜与多态的α链及恒定且可溶的β2-微球蛋白。在人体中，3个基因座位编码α链，其命名为A、B和C。传统MHC-Ⅰ分子中，α链的各座位A、B及C发生等位基因变异。因此，等位基因被命名为A1、A2、A3等，A10、B1、B7、B37、B54等，CW3、CW6等(例如见Bodmer等人，如上引用，及免疫遗传学(Immunogenetices)36,1992，亦引用于上)。
优选本发明的胞外体表达跨膜与多态的传统MHC-Ⅰ分子的α链。更优选其为等位基因A1、A2或A3的MHC-Ⅰ分子的α链。
在一个特定的实施例中，本发明的胞外体表达非传统MHC-Ⅰ分子(即非多态的)的α链。不象实质为多态的所谓“传统”MHC-Ⅰ分子，在人体中存在着“非传统”MHC-Ⅰ分子，其实质上为非多态的。如此分子已例如述于Bendelac等人(Ann.Rev.Immunol.(1997)535)。根据本发明非传统MHC-Ⅰ的优选实施例为分子Cd1。
明显地，人MHC-Ⅰ的任何其他分子可在本发明的范畴内表达。
在一个特定的实例中，本发明因此涉及含MHC-Ⅰ分子重组蛋白质的任何膜囊泡。
在另一个特殊的实例中，本发明的囊泡包括一些Ⅰ类和/或Ⅱ类MHC分子。一种有利的囊泡例如包括不同单体型的两种或更多MHC-Ⅱ分子。MHC分子的任何其他组合是明显可能的，例如MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ。
表达一种或多种规定MHC复合物的本发明囊泡是特别有利的，因为其能在规定的MHC中呈递给定的抗原肽。在此情况下，在本发明的更优选实施例中，膜囊泡含由规定肽与主要组织相容性复合体的重组分子形成的复合物。
除上述MHC分子外或将其替代，本发明的囊泡亦可包括一种或多种其他异源的目的分子。对于这种情况，在一个特殊的变异体中，本发明涉及从肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞产生的膜囊泡，其特征在于其包括一种或多种异源的目的分子。肥大细胞“衍生的”一词指是经转化和/或无限增殖化细胞系及/或从肥大细胞或嗜碱性细胞获得并具有肥大细胞的性质的(内分泌囊泡的蓄积)。“异源”一词指目的分子不以此形式存在于处于其天然状态的本发明胞外体中。
由本发明胞外体所载或内含的目的分子可为任何蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质及任何目的物质(化学的、生物的或合成的)。这些分子可为重组的并可被插入生成细胞中，或直接插入在胞外体中/上。更特别优选目的分子型特别为MHC分子、抗原(全部或以肽形式)、受体配体、配体的(特定)受体、核酸、药理产物、示踪剂或甚至是使囊泡纯化的肽或蛋白质。
作为抗原，可特定提及的是任何蛋白质，特别是细胞质蛋白质或源自病毒或肿瘤的蛋白质。作为源自病毒的蛋白质的优选实例，由EBV、CMV、HIV病毒、麻疹、肝炎等表达的任何细胞质或膜蛋白质可被引用。这些更优选为细胞质蛋白质，即它们在传统感染过程中实质不出现于免疫系统，并因此在天然状态下较少具有免疫原性，或其还可为膜蛋白质或蛋白质片断。作为肿瘤源蛋白质的优选实例，可特别提及的是p53蛋白质(野生或肿瘤中存在的任何突变形式)、MAGE(特别是MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、MAGE5与MAGE6)、MART(特别是MART1)、Gp100、ras蛋白质(野生或突变p21)等。明显地，使用本说明书的教导，任何其他目的蛋白质可在本发明胞外体中或表面上表达。
对于这种情况，重组抗原分子可存在于囊泡的表面上(暴露)，或于囊泡的内部。事实上，以特别惊人的方式，本发明者发现，在其胞质中含重组抗原(特别是p53)的本发明囊泡能在动物中诱导抗此抗原的抗体的极高量产生。
在配体受体中，通常可提及的是天然的或经基因操纵衍生的任何配体受体。特别是，其可为任何激素、生长因子、淋巴因子、营养因子、抗原受体等。可特别提及的是白细胞介质IL1至IL15的受体、生长激素受体、粒细胞和/或巨噬细胞(G-CSF、GM-CSF、CSF等)群落刺激因子的受体。一个特殊实例是配体受体由单链抗体(ScFv)组成，该单链抗体能与特定配体相互作用。在本发明意义中的另一个特别有利的实例是T淋巴细胞抗原受体(TcR)。本发明胞外体在其表面上表达一个或多个规定的TcR，并形成特别有利的分析及诊断工具有，这将详见于后。
作为药物产品，可提及的是化学本质的任何活性物质，例如使用传统化学技术制备的药物产品。具有生物活性的任何蛋白质、多肽或肽亦可被引用，例如毒素、激素、细胞因子、生长因子、酶、肿瘤抑制物等。
核酸可为编码如上述蛋白质、多肽或药理肽的任何DNA或RNA，及具有特殊性质(反义、抗原、启动子、抑制子、转录因子的结合位点等)的任何其他核酸。其可为寡核苷酸、编码区、人工染色体等。
载有配体受体的本发明囊泡可用于检测在任何生物样品中具有特别低亲合力的任何配体-受体型相互作用，这将更详尽说明于本公开的后面。而且，如此囊泡亦可用以输送目的物质(蛋白质、肽、核酸、化学物质等)至细胞中。因此，本发明的胞外体通常可用于在试管中、体外或体内将任何分子运送与转移至细胞。本发明因此涉及如上述包含目的异源分子的任何囊泡，其可作为该分子转移至细胞中的载体。
在更优选的实施例中，本发明的胞外体被用以定向转移目的物质至选定的细胞群中。结果，有可能制备本发明的囊泡，该囊泡包含目的物质(毒素、激素、细胞因子、重组核酸等)并在其表面上表达配体受体或受体配体，并将所述囊泡与表达对应配体或受体的细胞接触。因此，用此研究途径有可能完成对准目的的有效转移。
对于这种情况，本发明的特殊目的在于如上述的囊泡，其特征是其表达配体受体并包含目的异源分子。
本发明囊泡亦可含能使囊泡纯化的肽或重组蛋白质。结果，本发明实际上描述基因修饰胞外体组成的可能性，及因此导致其表达特殊“标记”分子的可能性，这使其能够纯化。特别是，有可能获得暴露特殊结构肽的胞外体，其可被容易地检测并由受体分子捕捉。在一个特殊实例中，产生的胞外体在其结构中包含His6形态的肽分子(即6个连续组氨酸残基)。如此残基在胞外体表面上的存在使其在以镍功能化的载体上的纯化简单。此型的其他重组肽可使用，例如c-myc标签、VSV或HA。
最后，在另一个特殊的实例中，本发明囊泡亦含示踪剂。示踪剂可为不同本质(酶、荧光、放射性等)并存在于囊泡中或在其表面上。优选标记为非放射性的，例如荧光标记。更优选所用的示踪剂为荧光色素或具有发色性的酶。标记可直接在生产细胞上、或在产生的胞外体上制成。
本发明亦涉及任何组合物，其包括如上述的一个或多个膜囊泡。本发明的组合物亦可包括多个如上述载有不同重组分子的膜囊泡。特别是，本发明组合物可包括如上述的膜囊泡，其载有与一种相同抗原肽结合的不同单体型的重组MHC分子。组合物亦可为包括如上述膜囊泡的组合物，该膜囊泡载有例如与不同抗原肽结合的一种相同单体型的重组MHC分子。本发明囊泡的其他组合亦是明显可能的。
本发明组合物通常包括媒介物，如缓冲液、盐水或生理溶液等，其使囊泡的结构可保存。其亦可包括任何稳定化的表面活性剂等，优选其相容于生物用途(试管中或体内)。这些组合物可保存在任何适当装置中，如试管、瓶子、安瓿、烧瓶、小袋等，并例如保存在4℃或在-20℃下。根据本发明的典型组合物包括5至500微克的胞外体，例如5至200微克的胞外体。
本发明囊泡是从基因修饰细胞获得的。如上述，本发明实际上从以下发现得到，即有可能由基因途径插入重组分子至一些细胞中，这些分子然后以密集的功能性方式在胞外体中表达。
为产生载有限定组成的重组分子的本发明囊泡，第一阶段包含将能表达选定重组分子的基因构建体插入如上述的囊泡产生细胞中。
用于生产细胞的基因构建体通常可包括置于所用细胞中功能性启动子(表达盒)的控制下的编码区域。
通常，所用的启动子因此为哺乳类细胞内的功能性启动子。其例如可为病毒、细胞或细菌启动子。其可为组成型或经调节的启动子，优选其允许细胞内的高量蛋白质表达。在可使用的启动子中，可借实例提及的是巨细胞病毒(CMV)的立刻早期启动子、SV40的启动子、胸苷激酶基因(特别是HSV-1 TK)的启动子、反转录病毒LTR(特别是LTR-RSV)的启动子，或甚至是肥大细胞的强内源启动子。特别优选的实施例包括SRα启动子的使用，这更详尽述于实施例中。
所用的编码区域通常由互补性、基因组的或合成的(经修饰(例如)以包括一些内含子或以获得密码子的优先使用)DNA组成。更通常地，其为cDNA。此核酸可由任何已知分子生物技术、特别是由基因库筛选、扩增、合成、酶切割及连接获得。
根据使用的编码区域类型，亦可对构建体进行一些修饰。例如，在一些例中可特别有利地将信号序列插入编码区域中，该信号序列使表达产物能寻址至细胞特殊区室，特别是朝向膜区室(内部的、浆的等)寻址。此寻址信号可位于编码区域上游(5′)、下游(3′)或在编码区域内。优选寻址信号位于编码区域的3′上；更特别是在其细胞质区域中，及在具有编码区域的读码相中。使用寻址信号可特别有用地促进表达产物在给定细胞内区室中或表面上蓄积，特别是在分泌囊泡中或表面上蓄积。此实施例经特殊调适以表达一种分子，如标记肽、抗原、MHC-Ⅰ分子，甚至受体配体。另一方面，以特殊有利的方式，本说明书论证人MHC-Ⅱ的分子可直接在分泌囊泡的肥大细胞(甚至为异种的)中表达，而无需加入特殊信号。
为实施本发明，特别有可能使用作为寻址信号的核酸片断，其具有部分以下基因的序列：Lamp1、CD63、LIMPⅡ、Cdlc、FcγR。这些基因包括编码向细胞内区室的蛋白质寻址信号的区域(Sandoval和Bakke，细胞生物趋势(Trends in Cell Biol.)4(1994)292)。可用于本发明的寻址信号例如符合式G-Y-X-X-I，其中X代表任何氨基酸残基。特别适于本发明的寻址信号由具有序列SHAGYQTI的LAMPI蛋白质的肽信号组成。允许朝向膜区室寻址的另一型信号包括蛋白质跨膜区域的全部或部分。
表达产物寻址至细胞区室使此产物能存在于胞外体中，亦可通过将此编码区域融合至编码膜蛋白或跨膜蛋白质的区域的全部或部分而进行，特别是胞外体中表达的膜蛋白或跨膜蛋白质。在本文中，本发明的特殊实施例必须伴有，通过生产细胞内重组产物的表达，以与膜或跨膜蛋白质的融合体形式插入此产物至胞外体中。该蛋白质的特殊实例为例如MHC插在生产细胞中的重组蛋白质，特别是β链，优选Ⅱ类MHC的β链。因此，实施例中给定的结果显示如此融合使任何目的肽在胞外体中有效蓄积，而不影响其性质或MHC分子的性质。本发明的此方面将新颖概念带入在胞外体中重组产物的引导，并可将其施用至插在任何型胞外体中的任何重组产物。对于这种情况，本发明因此涉及任何胞外体，其包括目的多肽与寻址信号间形成的重组融合分子。其可为从肥大细胞、树突或肿瘤细胞或亦从例如B淋巴细胞产生的胞外体。目的多肽可为抗原(或抗原片断)或任何其他目的生物学产物。寻址信号可为具有引导融合产物朝向膜区室、特别是如上规定的细胞内区室的性质的任何肽、多肽或蛋白质。有利地，其为MHC分子的链。
在本发明的特殊实施例中，这些囊泡由嵌合型核酸插入生产细胞中而产生，该嵌合型核酸编码包含结合至MHC分子β链C-端的重组产物的融合蛋白质，优选Ⅱ类MHC。
在使用的构建体中，编码区域以功能性方式结合至启动子，如此允许其在细胞内表达。
而且，本发明的构建体可有利地包括位于编码区域3′的区域，其指明了转录末端信号(例如poly A区域)。
本发明的表达盒有利地为载体、质粒、病毒、游离体、人工染色体型等的部分。对于这种情况，该载体有利地包括能选定其所内含细胞的系统。特别是，载体有利地包括编码对一作用物具有抗性的产物的基因，例如抗生素(氨苄青霉素、潮霉素、遗传霉素、新霉素、zeocine等)。在一个特殊的实施例中，各载体包括如上述的单一表达盒。在此实施例中，在一些分子(例如MHC-Ⅱ的α链和β链)要表达于囊泡中时，细胞因此经插入一些载体而得到修饰。在此实施例中，所用的各型载体有利地包括不同的选择系统，其允许容易地选择多种转染物。
在另一个实施例中，载体可包括如上规定的一些表达盒，例如一个编码MHC-Ⅱ的α链及另一个编码β链。
所用的载体优选为质粒型的，并包括例如细菌复制源，这使其易于操作及在体内产生。该载体特别是可从pBR322、pUC、pBS、pSR型等质粒构建。
为产生根据本发明的胞外体，基因修饰的细胞因此被用以表达选定的分子。这些基因修饰的细胞通过将亦如上述的基因构建体插入如上规定的选定细胞中而制备。
基因构建体的插入可以多种方式进行，这主要根据所用的细胞类型。因此，核酸的转移可使用任何已知技术进行，如电穿孔、磷酸钙沉淀、化学剂(阳离子肽、聚合物、脂质等)、标记试剂等。在病毒载体的情况下，转移通常由简单感染细胞而获得。所用的载体量亦可由本领域的技术人员根据转移类型及所用的细胞类型而调适。对于这种情况，插入核酸至肥大细胞的一个特殊有效方法包括载体的电穿孔。
而且，当一些构建体(载体)需要插入细胞时，后者可同时或以相继方式转移。
转移后，已有效导入核酸的细胞被选定与克隆，这基于其通过被转移的DNA中存在的抗性基因而对化合物(例如抗生素)具有的抗性。这些细胞可即席用于制备本发明的胞外体，或保存供未来使用。对于这种情况，细胞可在通常的保存媒介物中在4℃下保存一段足够时间，以获得若干生产批次的胞外体。细胞亦可以冷冻形式(例如在氮气中)保存供其后作用。对于这种情况，因此有可能根据本发明去形成具有特殊性质的胞外体生产细胞库。特别是，有可能根据本发明形成表达主要HLA型Ⅱ类MHC分子的细胞库。然后将有可能根据预期应用及根据HLA型，从库中选择相对应MHC的分子生产细胞，而不需依各案的基础重新构建这些细胞。
对于这种情况，本发明的一个特殊目的为如上规定的胞外体生产细胞，特别是肥大细胞，其特征在于其含编码主要组织相容性复合体分子的重组核酸。本发明亦涉及如上规定的任何胞外体生产细胞，特别是肥大细胞，其特征在于其含编码li不变链的重组核酸，特别是一个经修饰以包括替代CLIP区域的抗原肽，或编码使胞外体能纯化的肽的重组核酸。
更特别是，其为哺乳类细胞，特别是动物源的细胞，尤其是啮齿类动物源的细胞。其亦可为人源的细胞。在一个特殊的实施例中，其为从肥大细胞衍生的细胞系，特别是从例如嗜碱性细胞白血病的肥大细胞系衍生。借助特殊的实例，可提及RBL系，特别是RBL-2H3、KU-812系的细胞或HMC-1。
优选重组核酸编码Ⅱ类主要组织相容性复合体分子的α链和/或β链，和/或Ⅰ类主要组织相容性复合体分子。在另一个实施例中，细胞包括分别编码Ⅱ类主要组织相容性复合体分子的α链与β链的一些核酸。
借助本发明，有可能以简单可再现的方式，产生基本量的已知组成的胞外体。为产生胞外体，上述的基因修饰细胞在适当培养基中培养，并收集胞外体。
本发明的特殊目的因此在于一种制备含规定重组分子的胞外体的方法，其必须有以下的阶段：
a)培养肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞，这些细胞含编码该规定重组分子的重组核酸，
c)回收由该细胞产生的胞外体，这些胞外体含该规定的重组分子。
有利地，本发明方法亦包括中间阶段b)，在此期间，细胞被刺激以诱导和/或增加胞外体的分泌。
而且，借助本发明方法，有可能制备囊泡，其中规定的重组分子暴露在胞外体外面，或全部或部分包括在胞外体的胞质部分中。
如上所示，在本发明方法中，重组分子可例如为主要组织相容性复合体的分子、抗原分子、受体配体、配体受体或纯化肽，或任何其他目的多肽。而且，如上说明，在一些实施例中，方法中所用的核酸除包括编码朝向膜区室的寻址信号的区域，还特别包含肥大细胞的内分泌囊泡。
本发明的进一步特殊目的在于一种制备膜囊泡的方法，其包含：
-培养胞外体生产细胞，其含编码重组MHC分子(特别是Ⅰ类或Ⅱ类，尤其是人的)的重组核酸，及
-视情况在刺激胞外分泌后，收集产生的胞外体。
对于这种情况，本发明亦涉及一种制备含规定组成的肽-MHC复合物的胞外体的方法，其特征在于其包括
-培养胞外体生产细胞，该细胞含编码规定重组MHC分子的一个或多个重组核酸，
-细胞刺激以诱导释放胞外体，
-收集由该细胞产生的胞外体，该胞外体在其表面上表达该规定的重组MHC分子，及
-将胞外体与肽(类)接触。
为实施本发明，所用的肽(类)可为合成肽、肽混合物、细胞萃取物，例如从肿瘤细胞萃取的肽混合物。肽(类)可为分离形式、或纯化的、或如上示的混合物。而且，在胞外体与肽类接触后，胞外体可使用传统方法分离或纯化。
在另一个实施例中，本发明涉及一种制备含规定组成肽-MHC复合物的胞外体的方法，其特征在于其包括
-培养胞外体生产细胞，该细胞含编码规定的重组MHC分子的一个或多个重组核酸及包括编码规定的重组肽区域的核酸，
-刺激细胞以诱导释放胞外体，
-收集由该细胞产生的胞外体，这些胞外体在其表面上表达该规定的与该重组肽结合的重组MHC分子。
更特殊地，在本方法中，含有编码重组肽的区域的核酸编码不变li链的衍生物，其中CLIP区域已被删除并由该肽取代。此实施例确保在形成肽-MHC复合物中的重要特异性。
在另一个实施例中，核酸包括编码肽的区域及朝向细胞内区室的寻址区域。而且，核酸可含编码相同或不同抗原肽的一些区域。
优选用于本方法的生产细胞为肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞。在此实施例中，刺激细胞以诱导释放胞外体，这优选借助一个或多个钙离子载体，或IgE。
在特别优选的实施例中，用于本发明的生产细胞实质上无内源MHC分子。
本发明的进一步目的包括一种修饰胞外体组成的方法，包括
-将编码规定分子的核酸插入胞外体生产细胞中，该分子结合至膜区室的寻址信号上，及
-从该细胞产生胞外体。
借助本方法，有利地，有可能产生表达规定且可变的重组分子的胞外体。
本发明的胞外体可用于多种应用，例如作为分析、诊断、治疗或实验工具有。例如其可用于分析特异的T抗原反应；用于研究低亲合力的受体/配体相互作用，其中需要不同配偶体的多聚体化，以期增加这些分子复合物的亲合力，因而超越了免疫学的应用范畴；用于诊断与治疗及用于产生特殊抗体，特别是MHC限制的抗体。这些不同应用及其他被说明于下。
a)用于制备抗体。
本发明胞外体的首要应用之一在于制备抗体。给定本发明胞外体的规定组成，有可能制备具有确定特异性的抗体。而且，如示于实施例中，本发明胞外体具有极强的免疫原性，特别是考量到在其表面上高密度的MHC-肽复合物、其功能性及其对免疫系统的有效存在。
以此方式产生的抗体可是多克隆或单克隆的。其可使用传统免疫学技术制备，包括动物免疫、血清收集(多克隆抗体)和/或脾淋巴细胞与不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞融合(以生成产生单克隆的杂种瘤)。
本发明的进一步目的因此涉及由以如上述的胞外体免疫产生的抗体或抗体片断。抗体片断可例如为Fab、(Fab’)2、ScFv片断等，及更通常为维持抗体特异性的任何片断。特别是，本发明涉及一种制备抗体的方法，包括动物以如上述载有规定的肽-MHC复合物的胞外体免疫，及回收抗体和/或回收产生抗体的或参与免疫应答的细胞。有利地，借助本发明方法，有可能制备单克隆抗体，特别是MHC限制的单抗，即特异于MHC-肽结合的单抗。优选在本发明方法中使用实质上无内源MHC分子的胞外体，其表达重组MHC-肽复合物并且从细胞产生，该细胞是免疫动物所固有的。因此，如示于实施例中，借助本方法，有可能在不需添加物下获得抗肽的有力抗体，特别是受MHC限制的抗体，即特异于以构象与规定MHC分子结合的肽。如此抗体在实验、诊断及治疗水平上特别有利。而且，本发明抗体可由任何已知技术(酶、荧光、放射性等)使用本领域技术人员已知的方法标记。
b)诊断应用
本发明的胞外体与抗体具有诊断用途的有利性质。
例如，根据本发明获得的抗体或抗体片断可用于任何诊断应用，以检测生物样品中相对应特异抗原的存在，其中使用不同传统技术，如流式细胞计数法、免疫组织化学或免疫荧光法。在受MHC限制的抗体的特殊例中，其有利地允许检测相对应MHC-肽复合物，并因此诊断相对应的病状。这些抗体可特别应用至病状的诊断，该病状涉及免疫系统的反应缺陷或不适当反应，以期确定先前规定的可被T淋巴细胞识别的形式的抗原的表达。例如，以非彻底的方式，以下诊断可予考虑：
-肿瘤病状，其中对由结合Ⅰ类MHC分子的蛋白质(如p53、Her2、MAGE、BAGE、MART、GP100)衍生的不同肽的肿瘤样品进行的检测能使肿瘤显型化及促进治疗选择性；
-在感染前或潜伏阶段的病毒疾病，其中病毒粒子不可检出(肝炎、HIV、CMV或其他病毒感染)；
-自身免疫疾病，如多发性硬化、自身免疫糖尿病、自身免疫甲状腺机能障碍、类风湿性关节炎、红斑狼疮，其中检测显示自体抗原衍生的肽的MHC分子可指示疾病进一步发展。
本发明的胞外体亦可用以检测生物样品中蛋白质分子的特异性配偶体。因此，本发明载有MHC-肽复合物的胞外体可用以检测生物样品中对这些复合物特异的T淋巴细胞，例如生物样品处于不同的病理状态，特别是处于上述的病状中。对于这种情况，胞外体可由本领域技术人员所知的任何标记系统(酶、荧光、放射性等)标记，以允许其在生物样品中检出。
在一个特殊的实施例中，本发明因此涉及使用标记的胞外体，特别是如上述的荧光标记的胞外体，以检测生物样品中特异于抗原肽-MHC复合物的T淋巴细胞。生物样品可为血液、血清、组织、肿瘤、活体组织切片、皮肤、尿液等的任何样品。而且，生物样品可经预处理，例如解离细胞、在培养物中扩增细胞、制备膜部分等。有利地，生物样品是衍生自人类生物。为此目的，本发明亦涉及一种在生物样品中检测对抗原-MHC复合物特异的T淋巴细胞存在的方法，包括将该样品与含该抗原-MHC复合物的如上述标记的胞外体接触，及在该样品中检测T淋巴细胞的标记。
再者，检测这些T淋巴细胞不仅能检测及因此诊断生理病理状态，而且亦能跟踪例如免疫程序的效力及在不同疾病阶段下免疫应答的状态，并因此评估给予治疗的效力。
在一个特殊的应用中，载有TcR受体的本发明胞外体被用于检测生物样品中此受体的特异肽-MHC复合物。
而且，载有规定组成的任何型蛋白质的本发明荧光胞外体亦形成能检测潜在受体的荧光探针。由胞外体打开的新颖领域因此通常可延伸至在体内检测低亲合力的任何蛋白质/蛋白质相互作用。本发明的进一步目的因此为胞外体的用途，优选标记的胞外体，特别是经如上述的荧光标记的胞外体，
-用以检测生物样品中蛋白质分子的特异受体。在此实施例中，所用的胞外体因此在其表面上包含该规定结构的生物分子，
-用以检测生物样品中配体的存在。在此实施例中，所用的胞外体因此在其表面上含该配体的特定受体。
c)治疗应用
受限制的抗体或其片断能潜在地抑制T淋巴细胞的受体与其特异的MHC-肽复合物间的相互作用。同样地，在其表面上载有单一类型的MHC-肽复合物的胞外体可经与特异于这些复合物的T淋巴细胞相互作用，而与其天然配体一T淋巴细胞竞争，并导致其失活。
受限制的抗体及胞外体因此可用于任何情况，其中其需要降低或抑制由T淋巴细胞介导的证实对生物有害的免疫应答，如以下的例子，例如：
-器官移植或骨髓移植，其中通常借助强剂量的免疫抑制剂以中和宿主对移植的反应；
-自身免疫疾病或病毒性病状，在此期间TCD8或CD4免疫应答慢慢地导致组织破坏；
-过敏与哮喘。
在这些类型的病状中，本发明胞外体在其表面上表达规定肽-MHC复合物，其被已知涉及病理状态的发展，因此该胞外体可被用以阻断免疫应答的发展，并因此阻断病理反应的发展。
载有MHC-肽复合物的本发明胞外体亦可用以体外扩增(扩展)细胞毒性T淋巴细胞的群体。它被直接从血液样品使用，因此可形成对抗不同细胞靶的细胞治疗的基础。因此，胞外体可用以挑选出可变组合的T细胞，这些T细胞特异于由作为治疗目的的细胞(如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)所表达的复合物。本发明进一步目的因此是使用如上述的胞外体以克隆扩增和/或刺激细胞毒性和/或辅助T淋巴细胞。本发明亦涉及一种体外克隆扩增(或扩展)T淋巴细胞的方法，特别是细胞毒性淋巴细胞，该方法必须伴随含有与含规定的肽-MHC复合物的如上述胞外体接触的T淋巴细胞的生物样品、特异的T淋巴细胞的收集及其扩增。此方法特别有利于克隆扩增特异于MHC分子与肿瘤或病毒抗原肽间形成的复合物的细胞毒性T淋巴细胞。
本发明囊泡特别目的进一步应用为朝向细胞转移分子。利用其组成，本发明囊泡能在试管中、体外及体内在分子朝向细胞的转移中扮演载体的角色。对于这种情况，本发明涉及使用如上述含目的物质的胞外体以制备意在将该物质转移至细胞的组合物。有利地，其为在其表面上含配体受体或受体配体的胞外体，这使之有可能定向朝向一个或多个选定的细胞群体的转移。本发明亦涉及一种试管中、体外或体内转移物质至细胞的方法，其必须伴有该细胞与含该物质的本发明囊泡的接触。更优选所用的囊泡亦表达配体受体及本发明方法能朝向表达相对应配体的细胞定向转移物质。为了在体内实施，本发明囊泡由传统途径(静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射等)施用(优选至哺乳类，特别是人)。为了在试管中或体外使用，细胞通过在适当的设备(盘、烧瓶、袋、安瓿等)中、优选在无菌条件下培养而发生接触。发生接触阶段的参数(囊泡量、接触时间、温度、培养基等)可容易地由本领域技术人员根据设定的目的及本说明书的教导而调整。
d)研究领域的应用
这些明显涉及所有上述的应用，它们经使用能检测及分析不同的正常或病理状态中MHC-肽复合物形成阶段的抗体，以分析在抗体出现中的分子机制。
经使用荧光胞外体及其检测的能力，它们亦有关于分析与分子表征能识别确定的MHC-肽复合物的T淋巴细胞群体。
在这些不同应用(诊断、治疗、实验、产生T淋巴细胞等)中，本发明胞外体可以如此被实施，或以在载体介质上固定化的形式实施。因此，实施例中给定的结果显示有可能将胞外体固定在载体介质上，而不降低其功能特性，特别是例如其抗原特异性。对于这种情况，本发明的一个特殊目的在于含固定在载体介质上的胞外体的组合物。载体介质优选为固体或半固体载体如小珠、滤纸或相似物。其优选为在塑胶材料中的聚合物型载体，例如胶乳珠或磁性珠。明显地，任何其他合成的或生物的材料可被使用，只要其不导致胞外体或细胞品质的任何实质性恶化。有利地，使用具有1至10微米直径的珠体，例如2至5微米。胞外体在载体介质的固定有利地由共价键获得，例如通过醛或其他任何化学结合试剂的活化。通常，胞外体的固定化由胞外体与载体在溶液中在允许固定的条件下培养而形成，然后载体经离心收集。以此方式获得的功能化载体可用以表征胞外体或检测或扩增试管中的T淋巴细胞，这将详述于实验一节中。
本发明的其他方面及优点将在阅读以下实施例时见到，实施例被认为是说明性的及非限制性的。而且，在本发明书中所引的所有文献作为参考被引入。
附图中的主要内容
图1：RBL 2H3系中功能性MHC-DR1-HA肽复合物的产生。
A．在转染编码RBL 2H3系中DR1的α与β链的cDNA之前(左)及之后(右)，人MHC-ⅡDR1分子表面表达的流式细胞仪分析。DR1分子用L243抗体(黑线)检测，该抗体自身由与FITC偶联的山羊血清抗小鼠-IgG显像。
B．在表达不变链的系(liHA)中DR1的表面表达，其中CLIP肽已被从流感病毒红血球凝集素衍生的308-319肽所代替。在RBL DR1liHA系和由相同单体型EBV(Hom2)转化的B淋巴细胞上用L243抗体(黑线)检测DR1分子。
C．特异于DR1-HA复合物的T淋巴细胞被表达此复合物的RBL系或相同单体型的B-EBV刺激。RBL DrlliHA系与B-EBV Hom2系在培养皿中用对DR1HA复合物特异的T淋巴细胞稀释。B-EBVHom2系亦在饱和浓度(10毫摩尔每升)的HA肽的存在下培养。在培养上清液中IL2的产生被用以评估THA淋巴细胞(特异于HA肽的T淋巴细胞)的刺激。IL2借助氚化胸苷导入试验在CTIL2系中测定，该CTIL2系的增殖为IL2依赖性的。
D．RBL DR1 liHA系的HA肽饱和分析。细胞Hom2与RBL DR1liHA在递增浓度的HA肽与THA淋巴细胞的存在下培养(每盘100个细胞)。淋巴细胞的刺激如前评估。
图2：DR1分子在RBL 2H3的分泌区室中的蓄积。
A．在RBL 2H3中DR1分子的细胞内蓄积位点分析。细胞RBLDRLHA以0.5％戊二醛固定，然后以0.05％皂角苷渗透。DR1分子与不变链分别以抗体L243与PIN1及随后的与FITC偶联的驴血清抗小鼠-IgG检测。特异性兔血清检测5-羟色胺，使用以与德克萨斯红偶联的驴血清抗兔-IgG进行显像。影像由共焦显微镜(Leica)获得。切片厚度为0.5微米。
B．RBL DrlliHA的胞外体的纯化。在DMEM中清洗后，细胞在1毫摩尔每升离子霉素存在下在37℃下培养30分钟。胞外体由差速超速离心从细胞上清液中纯化。被放回PBS悬浮液中的胞外体残留物由SDS-PAGE分离(5毫克)，然后转至尼龙膜上。DR1的β链以单克隆抗体IB5检测，以用于胞外体的制备及在相同条件下迁移的RBLDRLHA与Hom2细胞的溶胞产物(相当于每盘105个细胞)中的对照组。
图3：使用胞外体产生抗DR1 HA的抗体。
A．以胞外体免疫的小鼠血清的递增稀释液与表达(右)或不表达(左)DR1HA分子的RBL细胞一起培养。获得的标记用流式细胞仪分析。
B．以胞外体免疫的大鼠的血清(稀释至1/100)与表达或不表达(左)DR1 HA分子的RBL细胞一起培养。在右边，表达DR1的细胞经或未经预先在37℃下与10毫摩尔每升HA肽培养2小时，随后再与相同免疫大鼠的血清稀释液培养。
C．免疫大鼠的脾与X63A8系在传统制备单克隆抗体的条件下融合。不同杂交瘤的上清液用免疫荧光法在表达或不表达DR1或DR1HA分子的RBL 2H3细胞上测试。a40、b82及a15克隆为获得抗体的代表性实例。
图4：使用胞外体检测特异于DR1 HA复合物的T淋巴细胞。
A．细胞RBL DR1 liHA在5毫摩尔每升“绿示踪剂”(蓄积在细胞溶酶体区室中的荧光脂质)的存在下在37℃下培养30分钟，然后洗涤并在37℃下在无荧光示踪剂下再培养1小时。将细胞固定(3％多聚甲醛)，然后在共焦显微镜下分析。
B．同样地，胞外体DR1 HA从A中所述的细胞中纯化。样品中存在的荧光以荧光计定量并在共焦显微镜下直接显像。
C.D．荧光胞外体DR1 HA在50毫克/毫升下与特异于DR1 HA复合物的THA淋巴细胞或与特异于另一种复合物(D)的TH30淋巴细胞在37℃下在叠氮化物存在下培养2小时以阻断内在化。细胞的荧光由流式细胞仪评估。
图5：载有Ⅱ类MHC分子的胞外体的制备。
A．Ⅱ类分子IAb的表达由单克隆抗体Y3P检测并由流式细胞仪分析。细胞RBL 2H3中获得的转染物表达与B414对照组B淋巴瘤相似的由Y3P识别的Ⅱ类分子水平。
B．分子IAb在RBL中的表达的Westem印迹分析。10毫克细胞的溶胞产物及从细胞RBL IAbIi衍生的胞外体制备物由Western印迹法用特异于分子IAα链胞质区域的兔血清分析。
C．胞外体组成的流式细胞仪分析。胶乳床以胎牛血清(FCS)、或以从细胞RBL 2H3衍生的胞外体(胞外体RBL)或以此细胞使用鼠Ⅱ类分子IAbIi(胞外体DR1 IAbIi)或人DR1 IiHA(胞外体DR1IiHA)的转染物包被。大鼠的分子CD63以抗体AD1检测，分子IAb以抗体Y3P检测，而分子DR1由抗体L243检测。这些不同抗体由与藻红蛋白偶联的二抗显像。
图6：由RBL-2H3产生的胞外体的形态表征。
A．以HLA-DR1转染的细胞RBL-2H3以多聚甲醛固定。超细冷冻切片被制备并以抗分子HLA-DR的多克隆抗体免疫标记。这些抗体以与10纳米胶体金粒子偶联的蛋白质A显像。Ⅱ类分子主要在以具有囊泡外形的膜填充的区室中检测。柱形：250纳米。
B.C．由RBL-2H3细胞分泌的胞外体的形态表征。胞外体以2％多聚甲醛在pH7.4的0.2摩尔每升磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)中固定并放置在以碳酸盐化的聚醋酸甲基乙烯酯膜覆盖的电子显微镜玻片上。胞外体被对比并于4％乙酸双氧铀和甲基纤维素的溶液中包被，或(b)在包被(c)前以抗Ⅱ类分子的抗体免疫标记。如图(a)所示，抗体以与10纳米胶体金粒子偶联的蛋白质A显像。柱形：250纳米。
图7：胞外体内部组成的操纵，重组蛋白质的插入。
A．Ⅱ类DR1分子的表达由单克隆抗体L243检测并由流式细胞仪分析。在细胞RBL 2H3中，分子的转染诱导与B414对照组B-淋巴瘤中的相似的由Y3P识别的Ⅱ类分子表达水平。
B．RBL中分子DR1 GFP表达的Western印迹法分析。10微克细胞的溶胞产物及20微克从细胞RBL DRI GFP衍生的胞外体制备物以GFP-特异的单克隆抗体偶联物进行Western印迹分析。
C．胞外体组成的流式细胞仪分析。胶乳珠以胎牛血清(FCS)或以从细胞RBL DRI GFP衍生的胞外体包被。DR1分子由L243抗体及由L243抗体和与藻红蛋白偶联的二抗检测，而GFP的存在直接在FL1通道中检测。
图8
A．荧光胞外体与特异T细胞结合。从以绿细胞示踪剂标记的RBLDR1 liHA细胞产生的胞外体在两种类型T细胞存在下培养：具有对HLA-DR1/HA复合物特异的TCR的THA，及不含此受体的野生T-Jurkat。荧光胞外体在37℃下与两个T淋巴细胞系培养3小时，生成的标记然后经FACS分析。
B．获取具有特异标记的T细胞的胞外体示踪剂。如A进行相同标记，但胞外体(未以绿细胞示踪剂标记)与T细胞的结合以小鼠单克隆抗体AD1抗大鼠CD63检测，其后以标记着藻红蛋白的驴抗体抗小鼠IgG显像(Jackson Immuno Research,West Grove,PA)。在未暴露于胞外体的T细胞上平行进行相同标记。
C．胞外体对淋巴细胞的刺激。从DR1 GFP细胞纯化的胞外体在以与用于流式细胞仪相同的方式制备的胶乳珠上交联，但在完全培养基中清洗。各珠残留物在100微升中收集，50微升被置于96孔多孔板的第1孔中，50微升以2倍增量进行稀释。T细胞(T-Jurkat和THA1.7)被调至106个细胞/毫升且50微升被置在有或无5微摩尔每升HA307-319肽的各孔中，培养板置于培养箱(37℃,5％CO2,H2O)中20小时，然后收集上清液，IL2的浓度以CTL.L2试验评估。
图9：HMC-Ⅰ细胞与胞外体的表征。
A．用流式细胞仪分析HMC-Ⅰ细胞，粗实线：细胞本身；细实线：抗小鼠抗体-FITC本身；密点线：特异抗体+抗小鼠-FITC。
B．粘连至胶乳珠的HMC-Ⅰ胞外体的流式细胞仪分析，粗实线：胶乳珠-HMC-Ⅰ胞外体本身；细实线：抗小鼠抗体-FITC本身；密点线：参照胶乳珠-SVF+特异抗体+抗小鼠-FITC；疏点线：胞外体-胶乳珠+特异抗体+抗小鼠-FITC。
C．MHC-Ⅰ细胞的溶胞产物的Western印迹分析，与其胞外体比较；每孔10或3微克蛋白质；HC10:1/10上清液；1B5:1/10上清液；CD63:5微克/升，Lamp1:2微克/毫升；H68.4:1/10上清液。胞外体富集于CD63、Lamp1、TfR。Ⅱ类MHC不存在于溶胞产物和胞外体中，这证实细胞荧光分析的结果。Ⅰ类MHC的比例在细胞的溶胞产物及在胞外体中皆相同。
材料与方法细胞
在实验部分中用以制备胞外体的细胞为鼠或人肥大细胞。更特殊地是，使用粘液肥大细胞表型的嗜碱肿瘤细胞系，其命名为RBL-2H3(Barsumian等人，Eur.J.Immunol.(11(1981)317)，和未成熟的人肥大细胞(MHC-1)系。可使用其他肥大细胞，特别是其他系，如从RBL细胞衍生的系(大鼠嗜碱性细胞白血病)，其ATCC归档在编号CRL1378下(Kulczycki等人，J.Exp.Med.139(1974)600)。
能在人MHC-Ⅱ范围(DR1)中识别特殊抗原的T淋巴细胞系亦可使用。特别是，Jurkat系以编码T(“T-HA”)细胞受体的cDNA转染，该受体特异于与HLA-DR1结合的流感病毒血球凝集素的肽306-318(Sidhu等人，J.Exp.Med.176(1992)875)。由非洲淋巴细胞瘤病毒(Hom-2系)转化的人B细胞系被作为对HLA-DR1限制性反应的对照。
细胞被培养于DMEM培养基(Gibco BRL)、RPMI或“CLICK”:RPMI培养基补充有10％胎牛血清(Sigma)、1毫克/毫升青霉素-链霉素、1毫克/毫升谷氨酰胺、5毫摩尔每升丙酮酸钠及50毫摩尔每升β-疏基乙醇。适合培养真核细胞、特别是哺乳类的任何其他培养基明显可使用。
细胞主要培养于25或15毫升培养瓶。因为RBL-2H3细胞为粘附细胞，所以其被从其载体上使用胰蛋白酶-EDTA(Seromed)提起。为了大量产生后者，亦有可能在“旋转器”中将其培养至106个细胞/毫升的密度。质粒
为基因修饰肥大细胞，制备以下的基因构建体。
编码人HLA-DR1α链(Larhammer等人，细胞(Cell)30(1982)153)、人HLA-DR1β链(Bell等人，PNAS 82(1985)3405)及人不变链p33li(Ciaesson等人，PNAS 80(1983)7395)的cDNA被分离。编码不变链p33li的cDNA然后由PCR修饰，以用限制位点置换编码CLIP肽(残基87-102)的区域。借助此cDNA，有可能替代CLIP肽插入编码抗原肽的任何目的cDNA片断(Stumptner等人，EMBO J.16(1997)5807)。在一个明确实例中，编码流感病毒血球凝集素的HA308-319肽的DNA片断被插入此编码嵌合型li多肽(HA308-319)的cDNA。
上述的核酸然后在SRα启动子的控制下，被分别克隆入pSRα质粒(Takebe等人，Mol.Cell.Bio.8(1988)466)。各质粒然后被修饰，以并入不同抗性基因，其允许选择出各质粒，并因此选择出各链；链α具有对新霉素的抗性基因；链β具有对潮霉素的抗性基因，不变链具有对zeocine的抗性基因。转染
为插入不同核酸至肥大细胞中，相对应的质粒载体被Scal限制酶线性化。50微克各质粒经线性化，然后乙醇沉淀，残留物在1×107个细胞/毫升的浓度下在RBL-2H3细胞存在下再次悬浮。稳定的转化细胞由电穿孔5×106个细胞而获得，其中使用“基因脉冲器”(Bio-Rad,Richmond,CA)，在以下条件下：260伏特，960微法拉弟。电穿孔72小时，转染细胞通过于选择培养基中培养选定，该培养基包括250微克/毫升G418(Génétine,Gibeo)、1毫克/毫升潮霉素及500微克/毫升zeocine。在选择培养基中培养8天后，60％至90％现存的细胞被转染。转染细胞然后接种于具有能开始个体化粘附群落的浓度的选择培养基的培养皿中。以此方式获得的克隆经收集并分别置于培养物中。这些克隆可以冷冻形式保存，供未来使用。抗体
Y3P(MHC-Ⅰ(IA))为小鼠单克隆抗体，其识别IAb aβ复合物(Janeway等人，1984)。抗-IAα为抗IAα链细胞质部分的兔血清。抗-GFP为抗“绿荧光蛋白质”的两种单克隆抗体(克隆7.1和13.1)的混合物，其由Boehringer Mannheim销售。在流式细胞仪实验中，使用的二抗为F(ab’)2片断，其偶联至藻红蛋白，由驴产生并抗小鼠IgG(H+L)(杰克森免疫研究实验室(Jackson ImmunoresearchLaboratories))。珠
胶乳珠：无表面活性剂的白色的醛/硫酸胶乳，D:3.9微米(InterfacialDynanics Corp.,Partland,Or.USA)。电子显微镜
以HLA-DR1转染的RBL-2H3细胞以pH7.4的0.2摩尔每升磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)中2％的多聚甲醛固定。固定后，细胞以PB缓冲液-50毫摩尔每升甘氨酸洗涤，然后在10％明胶中包被。固化块被制备后，灌入2.3摩尔每升蔗糖并在液氮中冷冻。超细冷冻切片被制备并以抗HLA-DR分子的多克隆抗体免疫标记。这些抗体以与10纳米胶体金粒子偶联的A蛋白质显像。
胞外体以pH7.4的0.2摩尔每升磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)中2％多聚甲醛固定，并放置在以碳酸盐化的聚醋酸甲基乙烯酯膜覆盖的电子显微镜玻片上。
胞外体被对比并在乙酸双氧铀和甲基纤维素的4％液体中包被，或在包被前以抗Ⅱ类分子的抗体免疫标记。抗体以与10纳米胶体金粒子偶联的A蛋白质显像。结果1-DR1HA胞外体的制备1.1基因修饰生产细胞的构建及表征
为以受控制的方式制备载有规定组成的MHC-肽复合物的胞外体，Ⅱ类MHC分子的链α和β、DR1在RBL 2H3 lo肥大细胞系中表达，此细胞系衍生自大鼠嗜碱性细胞白血病。为此目的，分别载有编码各链的核酸的两种载体在SRa启动子控制下同时转染至细胞中(见材料与方法)。由流式细胞仪获得的结果显示，转染的细胞有效地表达DR1分子(图1A)。
这些RBL-2H3细胞然后被制成敏感于明确组成的给定肽，以期生成规定组成的MHC-肽复合物。为此目的，不同技术可予考虑。在简单的实施例中，肽可直接与胞外体培养。在另一个方法中，编码肽的核酸可插入细胞中，以便亦表达此肽。在实施此特殊实例中，为产生含单一抗原特异性的呈递细胞，选定的抗原肽以与不变的人li链基因融合的形式插入细胞中。更特别是，不变链的CLIP肽被选定肽的序列置换，其从已知与DR1分子结合的流感病毒血球凝集素(HA308-309)衍生。此构建体(liHA)在细胞中在述于材料与方法的条件下转染。表达于RBL-2H3 DR+细胞的杂交链能构建细胞，其在相似于对照DR1单体型的B-EBV(Hom2)系的量下表达由L243抗体识别的DR1分子(图1B)。这些结果最终显示本发明的肥大细胞有效地表达具预定的受限制组成的人功能性肽-MHC复合物。
由本发明细胞表达的肽-MHC复合物的功能特质由特异于被细胞运载的DR1-HA联合体的T淋巴细胞的刺激试验确认。为此目的，本发明的细胞在THA淋巴细胞存在下培养，且通过测定释放至上清液的白细胞介质-2、由IL-2依赖的细胞系的生长试验来确定刺激。使用的对照组为以DR1单体型的EBV(Hom2)转化的B淋巴细胞系，其以饱和浓度(10毫摩尔每升)的HA肽脉冲。
得到的结果被给定于图1C及1D。其显示本发明的肥大细胞表达能刺激特异于此联合体的T淋巴细胞的DR1-HA复合物。其亦显示在本发明细胞存在下所得的刺激较由饱和浓度(10毫摩尔每升)HA肽脉冲的对照组细胞(DR1单体型的B-EBV)产生的刺激更有效。最后，得到的结果显示DR1分子似乎仅呈递HA肽，因为加入饱和浓度的肽不显著增加RBL DR1 liHA细胞刺激THA淋巴细胞的能力(图1D)。
所有这些结果因此论证产生的肽-MHC复合物的功能特质。其亦说明得到细胞的特异性特质及因此说明本发明方法的特异性特质，其使载有规定、受控制的组成的分子的细胞(及胞外体)能够获得。1.2功能化胞外体的制备
免疫荧光试验显示重组MHC-肽复合物(DR1 HA)蓄积在RBL-2H3细胞系的分泌粒中。图2A给予DR1分子与5-羟色胺在囊泡细胞内结构中共同定位的证据。
功能胞外体可由这些细胞释放的可能性因此被检测。为此目的，细胞在钙离子载体存在下培养，随后产生膜囊泡。更特别是，细胞在300g下在室温下离心5分钟。在各细胞残留物上，加入钙离子载体的溶液(1毫摩尔每升离子霉素)(约300微升)，在37℃下培养继续30分钟。胞外分泌作用由快速在冰中冷却及加入300微升冷的1毫摩尔每升PBS-EGTA溶液而停止。细胞然后在300g下在4℃离心5分钟。上清液被回收，并再次离心：先在1200g下离心5分钟，然后在10000g下离心5分钟，最后在70000g下离心1小时。在此差速离心后，残留物(包括胞外体)被收集及在缓冲溶液(30微升Laemml -DDT缓冲液(1X或2X)中溶解。残留物的一部分亦溶于解离缓冲液中，以测定蛋白质浓度。胞外体溶液可由凝胶迁移(12％聚丙烯酰胺微凝胶)在20毫安培下被分离，然后转移至Immobilon上。胞外体的分析然后由Western印迹法用Ⅱ类MHC分子不同链的特异抗体进行。
得到的结果显示，胞外体可从RBL-2H3系以实质方式在适当作用物刺激后释放。这些胞外体可被分离与纯化，例如通过制备胞外体组合物的差速超速离心法。最后，图2B中给定的结果显示，这些胞外体为功能化的。Western印迹分析论证，得到的胞外体表达Ⅱ类MHC分子的不同重组链。此外，这些结果亦显示在本发明胞外体的表面上高密度的肽-MHC复合物。
以下实施例特别说明DR1 HA胞外体的用途，其用以制备特异于此联合体的抗体，及DR1 HA胞外体结合特异于此相同联合体的T淋巴细胞的能力。2．特异于DR1 HA复合物的抗体的产生
此实施例说明本发明胞外体的用途，其用以制备抗体，特别是所谓的“受限制”抗体，即其特异于与MHC分子结合的抗原肽。此实施例特别是说明本发明胞外体的极强免疫原性，因为其能在无任何添加剂的情况下产生抗体。
从RBL DR1 HA细胞的上清液纯化的胞外体(实施例1)被再次悬浮于PBS。这些胞外体然后在无任何添加剂的条件下被用以免疫Balb/c小鼠或LOU大鼠，过程与以下一致：
-小鼠在由3周的时段分开的2次注射中由皮下途径注射10微克胞外体，然后由腹膜内注射30微克胞外体，在血清收集前3天由静脉注射30微克。
-大鼠由腹膜内途径在由3周的时段分开的2次注射中注射胞外体(10微克)，然后在血清收集前3天由静脉内途径注射胞外体(50微克)。
如示于图3A，从免疫小鼠收集的血清显示出抗RBL系的极强反应性，不论RBL系表达或不表达DR1 HA复合物，但低至3万倍稀释的血清只显示出表达细胞DR1 HA的RBL系的反应性。
如示于图3B，免疫大鼠的血清以惊人的方式显示抗表达DR1 HA复合物的RBL系的反应性，而相同血清以较低强度对初始RBL-2H3系反应。而且，加入HA肽至DR1表达细胞(RB1-2H3 DR1)使产生的抗血清反应性的显著增加(图3B)。
这些结果因此显示RBL系的胞外体能诱导抗体反应，其以未预期的方式在大鼠中主要被引导对抗DR1 HA复合物。
免疫大鼠的脾与X63A8系的细胞融合。得到的杂交瘤通过克隆稀释使用传统免疫学技术分类，然后由免疫荧光法选定具有产生的单克隆抗体的特异性的杂交瘤。不同的单克隆抗体以此方式获得，一些抗RBL系的蛋白质，另一些抗DR1单体型人Ⅱ类分子的单体型决定簇，最后一些抗由DR1分子构成的复合物，此DR1分子与从流感病毒HA蛋白质衍生的肽结合(图3C)。这些后者单克隆抗体形成受限制抗体，并因此具有特别有利的性质用于诊断或治疗应用。3-特异于DR1 HA复合物的T淋巴细胞的检测。
此实施例说明使用本发明的胞外体以在生物样品中检测特异T淋巴细胞。此实施例亦显示胞外体如何可用以选择及扩增特殊T淋巴细胞群体，其特别意在被再次注射至个体(细胞治疗)。此研究途径可明显地延展至使用述于实施例2的受限制抗体，及检测任何配位特异的受体。
为实施此应用，标记的胞外体被产生。为此目的，在纯化DR1 HA系的胞外体前，后者与荧光示踪剂一起培养，该示踪剂强烈蓄积于内含于分泌粒中的胞外体。使用的示踪剂“绿示踪剂”为荧光脂质，其蓄积于细胞溶酶体中。在固定后，细胞在共焦显微镜下的分析显示荧光标记存在于细胞的分泌粒中(图4A)。荧光胞外体然后被产生并从这些细胞在述于实施例1的条件下纯化。因此制成荧光性的这些胞外体(图4B)被用以在生物样品中检测特异于DR1 HA联合体的T淋巴细胞(THA淋巴细胞)的存在。明显，任何其他标记可在本发明的范畴内使用，应用至生产细胞或至产生的胞外体上。
为此目的，胞外体在THA淋巴细胞及特异于另一种复合物的TH30淋巴细胞的样品存在下培养。由流式细胞仪得到的结果显示，表达DRLHA的胞外体以特异的方式与THA淋巴细胞结合(图4C)，其中这些相同胞外体不能识别具有另一种特异性的淋巴细胞(图4D)。这些结果显示由本发明肥大细胞系产生的胞外体检测特异于此相同复合物的T淋巴细胞的独特、意外的能力。此应用可使用任何类型的生物样品实施。
而且，此技术可以相同方式施至表达MHCⅠ-肽复合物的胞外体的制备及用途。借助本发明，因此有可能在呈递细胞(甚至肿瘤细胞)的表面上检测从肿瘤表达的抗原衍生的肽的MHCⅠ类与Ⅱ类分子的呈递。本发明因此亦能检测、甚至纯化能识别这些相同复合物的T淋巴细胞。它们因此可被用于扩增特异于特定肽-MHC的T淋巴细胞群体，例如扩增CTL淋巴细胞群体以用于其治疗用途。例如已发展用于癌症或病毒感染的不同免疫治疗方法，其基于从个体收集淋巴细胞样品及体内扩展特异于参与病症的抗原(例如肿瘤或病毒抗原)的T淋巴细胞的特殊克隆。这些经扩增的克隆然后被再次作为治疗剂施至个体。在选择与扩增T淋巴细胞的特异克隆，及因此潜在应用与实施这些治疗途径中，本发明带来更大的简便性。4-载有鼠MHCⅡ类分子的胞外体的制备(图5A、5B)。
编码IAb单体型鼠Ⅱ类分子的α和β链与鼠不变链的互补DNA被插入NT真核生物表达载体，其中cDNA转录处在αSR启动子的控制下。各质粒亦载有抗性基因，其针对潮霉素(用于αIAb链)、对新霉素(用于βIAb链)或zeocine(用于不变链)。RBL 2H3细胞由电穿孔转染(材料与方法)后，细胞基于其对三种抗生素的抗性选定，然后抗性细胞由有限稀释法克隆，并由流式细胞仪使用特异的Y3P抗体表征对IAb分子的表达。
图5显示得到的一些结果。流式细胞仪分析显示RBL IAbIi细胞由Y3P抗体(特异于IAb分子)以对B淋巴细胞系B414等价的方式识别，而在初始RBL系上未检测出标记(图5A)。因为显微镜的形态分析确立，鼠Ⅱ类IAb分子，如人DR1分子一样，蓄积在细胞的分泌粒中(未示出)，此导致我们去搜寻其在胞外体中的定位。细胞的胞外分泌作用由添加1毫摩尔每升离子霉素而起始，且得到的胞外体由差速超速离心纯化(参阅实施例1、2)。这些胞外体制备物的Western印迹显示，其含与该对照组细胞的溶胞产物中检测到的完全相同的Ⅱ类MHC鼠分子(图5B)。
这些结果论证，Ⅱ类人分子(DR1)以及鼠分子(IAb)可被表达，并可蓄积于相对应的RBL 2H3系的胞外体中。5-由RBL 2H3产生的胞外体的形态表征(图6)
用共焦显微镜在RBL细胞的冷冻免疫标记切片上的观察揭示出存在着充满膜的多数细胞内区室。这些膜的大多数部分相对应于充满区室内腔的囊泡(图6A)。当转染至这些细胞中时，Ⅱ类分子蓄积在具有内囊泡的区室中，并特别是在与这些囊泡膜结合下被显像(图6A)。
当RBL细胞经刺激，以诱导其去粒化(IgE-抗原或离子霉素)时，细胞内区室与质膜融合。与Ⅱ类分子结合的内囊泡被释放至细胞外介质中。这些囊泡然后被称为胞外体。
电子显微镜中检测胞外体的形态与其蛋白质内容物的精选方法为“全支持”方法。借助此技术，有可能显像无任何其他细胞内容物的全胞外体。借助此方法，亦可能在高效力下检测与胞外体膜结合的分子。借助使用此技术，我们观察到RBL细胞分泌的胞外体具有从30至120纳米的不均匀大小及对电子具有可变的密度(图6B)。Ⅱ类分子在具有80至100纳米大小及对电子具有平均密度的囊泡群中大量存在。富含Ⅱ类分子的大多数这些囊泡为碟形的(图6C)。6-在载体介质上胞外体的固定化(图5C)。
本实施例描述胞外体固定在固体载体上，并显示以此方式固定的胞外体维持其功能性质。这些新颖产物(胞外体载体)可用以表征及分析胞外体；或例如作为诊断或试剂产品以检测和/或刺激试管中T淋巴细胞。
由无论是否表达Ⅱ类人或鼠分子的RBL细胞产生的不同胞外体制备物与由醛硫酸盐活化的4微米胶乳珠一起培养。更特别是，从RBL2H3去粒化上清液纯化的胞外体在PBS中洗涤(在50000rpm下在TLA100.4上离心30分钟)。30微克胞外体与10微升无菌收集的胶乳珠混合、均质化，然后在室温下培养10分钟至15分钟。珠体积然后用1×PBS达到1毫升，然后在室温下培养2小时。其后，与胞外体交联的珠：
-通过加入终浓度100毫摩尔每升甘氨酸饱和(在室温下30分钟)，
-在2200g下在4℃下离心2分钟，然后珠残留物在1毫升1×PBS3％SVF0.01％NaN3中收集。
为使用珠体供细胞荧光测定法：
-在1×PBS3％SVF0.01％NaN3中洗涤珠残留物2至3次，
-在1毫升1×PBS0.01％NaN3中收集，
-使用每点在5微升至20微升间及在第1孔中传统地培养二抗。读取在Facscalibur(Becton Dickinson)上进行。
借助此技术，有可能以胞外体覆盖这些胶乳珠的表面，而保留其结构。
当胞外体在珠体上时，其处理变成更简单。其例如可在低速下离心及由传统流动细胞计数法技术检测。图5C显示由流动细胞计数法检测进入胞外体组成的不同蛋白质的一些实例。以醛硫酸盐活化的胶乳珠或与由非转染的RBL 2H3细胞产生的胞外体一起培养，或与表达Ⅱ类人分子DR1和IiHA构建体或Ⅱ类鼠分子IAb的RBL 2H3细胞的胞外体一起培养，或与胎牛血清(FCS)一起培养作为对照组。以此方式制备的胶乳珠然后与不同单克隆抗体培养；抗体包括识别存在于RBL 2H3分泌粒中CD63分子的AD1、特异于分子IAb的Y3P抗体、及特异于DR1分子的L243抗体。这些不同抗体由与藻红蛋白偶联的二抗显像，然后得到的标记由流式细胞仪以FACScalibur(Beckman)分析。
因此观察到CD63分子明显地存在于从细胞RBL衍生的所有胞外体上，不论其是否表达Ⅱ类分子，而以IAb胞外体包被的胶乳珠特异地由Y3P及非由L243识别，而相反地，DRIiHA胞外体由L243而非由Y3P识别。这些抗体无一识别覆盖以胎牛血清的胶乳珠(图5C)。
这些结果显示此技术能灵敏地特异检测进入胞外体组成的不同蛋白质的表达。实施例8亦显示借助如此产物(胞外体载体)，有可能亦能检测或刺激特异T淋巴细胞的增殖。7-胞外体组成的操作处理(图7)
胞外体为脂质双层所包围的囊泡，其中被插入大量分子，如先前所提及的Ⅱ类MHC分子或CD63。在这些囊泡内部发现前面跨膜分子的胞质区域，亦发现从细胞质衍生的可溶性蛋白质。为论证有可能任意修饰这些囊泡的内容物，我们使用绿荧光蛋白质(GFP)作为示踪剂。
编码GFP的cDNA在人DR1分子β链的羧基末端上融合。此被插入载有潮霉素抗性基因的NT表达载体中的构建体，与载有DR1α链及新霉素抗性基因的载体共转染至细胞RBL 2H3中。对这两种抗生素具有抗性的细胞被选定，然后阳性挑选表达GFP的细胞。
更特别是，我们制成结合DRβ链的细胞质部分(在C端上)至GFP的N端的构建体。DRβ的cDNA在位置565上具有PstⅠ位点。此cDNA3’侧的约200个碱基对片断由PCR从载体pcDNA3/RSV/Dra扩增，其中借助包括5’PstⅠ位点及3’NcoⅠ位点的两个寡核苷酸，其附加消除终止密码子。得到的PCR片断以PstⅠ与NcoⅠ消化，并克隆进载体pEGFP N1(Clontech)的相同位点。以PstⅠ与Xbal消化生成的质粒能使相对应于其后跟着GFP的Dra最后30个氨基酸的片断释放。同样地，质粒pcDNA3/RSV以EcoRV/PstⅠ消化，因而释放相对应于DRa链剩余部分的片断(从起点至PstⅠ位点)。2个片断然后被组装及克隆进pcDNA3/CMV EcoRV与Xbal间。
这些细胞(DR1 GFP)由流动细胞计数法分析显示，由L243抗体识别而特异于DR1分子的细胞亦放出在管道FL1中检测的绿荧光，而以未包括GFP的DR1α与β链转染的细胞在管道FL1中未放出任何荧光(图7A)。
为了论证GFP真的内含于细胞RBL 2H3的胞外体中，从细胞RBLDR1 GFP衍生的胞外体由差速超速离心制备，然后用Western印迹法(图7B)及在胶乳珠上交联后用流动细胞计数法(图7C)分析。在Western印迹法下，GFP的特异抗体在细胞DR1 GFP及在其胞外体中检测相对应于与GFP融合的DR1β链分子量的65 kDa的蛋白质(图7B)，而在细胞RBL 2H3的溶胞产物中没有检测到信号，不论其是否单独表达DR1分子。以胎牛血清或以从DR1 GFP细胞衍生的胞外体交联的胶乳珠之间的比较显示，单独地以胞外体包被的珠体在管道FL1中诱导荧光(FITC)，并由L243抗体识别，其特异于DR1，并由与藻红蛋白偶联的二抗检测。
这些结果因此论证有可能插入外源蛋白质至由RBL 2H细胞产生的胞外体内部。这些结果进一步显示，有可能由在生产细胞中的表达以与跨膜分子如MHC分子融合的形式引导蛋白质至胞外体上。8-胞外体的功能件表征(图8)
此实施例显示由RBL 2H3细胞产生并载有Ⅱ类MHC分子的胞外体能结合抗原肽并能刺激表达此肽-MHCⅡ类复合物的特异抗体的T淋巴细胞。
从以绿细胞示踪剂标记的RBL DR1 IiHA细胞产生的胞外体在两个类型的T细胞存在下培养：具有特异于HLA-DR1/HA复合物的TCR的THA，及无该受体的野生T Jurkat。结合实验使用圆底孔的96孔多重盘，RPMI 1640培养基补充以10％胎牛血清、缓冲以10毫摩尔每升Hepes至终体积为每孔50微升，每格105个T细胞及可变量的荧光胞外体，在37℃下培养3小时。然后在以FACS在400微升PBS中分析收集的细胞前，在相同培养基中进行两次洗涤。
剂量作用范围被拟定显示THA的标记强度与使用的胞外体量成比例。108个RBL DR1 IiHA细胞得到700微升胞外体。每孔从32至2微升胞外体范围的剂量被测试。每点16微升而得的标记被保留，其相对应于产生由2300万个细胞制成的胞外体(结果未示出)。
得到的结果显示THA群体由荧光胞外体标记，其产生在FL1上细胞荧光测定法可检出的荧光，而野生Jurkat则未经修饰(图8A)。
进行同一类型标记，但是，在胞外体结合后，T细胞与AD1小鼠单克隆抗体抗大鼠CD63一起培养，其后由藻红蛋白标记的驴抗体抗小鼠IgG显像(Jackson Immuno Research,West Grove,PA)。相同标记同样地在T细胞上制成，该T细胞曾暴露至胞外体。可见地(图8B)，如由其在FL1上的荧光证实，仅结合THA细胞的胞外体亦在FL2上标记，其指示在其表面上新存在着大鼠CD63。
我们的结果因此显示荧光胞外体可由流动细胞计数法用以显像T淋巴细胞群体，其特异于由胞外体载有的HLA-DR/抗原肽复合物。
为评估胞外体以依赖肽存在的方式刺激T淋巴细胞的能力，将从DR1 GFP细胞获得的胞外体交联在胶乳珠上，然后在T Jurkat淋巴细胞系的细胞存在下培养，不论该细胞系是否表达复合物DR1-HA肽307-319的特异T受体。
胶乳珠以与用于流动细胞计数法相同的方式制备，但在完全培养基(RPMI,10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺、0.1％β-疏基乙醇、4％丙酮酸钠)中洗涤。为刺激T淋巴细胞，各珠残留物在100微升中收集：50微升，放在96孔多重盘的第1孔及50微升被稀释成两半。对照组以相同方式用在胎牛血清中培养的珠进行。T细胞(TJurkat Pasteur及THA1.7)被调至106个细胞/毫升，每孔被放置50微升。在完全培养基中被稀释至15微摩尔每升的肽亦加入至每格50微升的部分中。在无肽的系列中，每孔50微升完全培养基被加入。培养盘置于培养箱(37℃,5％CO2,H2O)中20小时，然后上清液被收集，IL2的浓度以CTL.L2试验来评估。
观察到HA肽(5毫摩尔每升)的加入特异地诱导对表达DR1-HA(THA)复合物的受体的T Jurkat细胞的刺激，而其对对照组T淋巴细胞(T Jurkat)不具有影响。而且，一些胞外体在无HA肽存在下不能刺激THA(图8C)。9．人肥大细胞系的胞外体(图9)
本实施例显示根据本发明修饰的胞外体可产生自其他细胞，特别是人细胞。特别是，我们得到的结果论证，人MHCⅠ源的肥大细胞系能在增加细胞内钙的推动下及在与诱导由大鼠系RBL 2H3分泌胞外体相同的条件下产生胞外体。
由流动细胞计数法对MHCⅠ系的表征指出，这些细胞的表面表达Ⅰ类MHC分子(W6.32)，但非Ⅱ类分子(L243)。而且，其对分子CD9、CD63和CD81为阳性，但对分子Lamp1和Lamp2为阴性(图9A)。
胞外体从MHCⅠ系经加入离子霉素(1毫摩尔每升)产生，但从上清液经差速超速离心纯化。在交联至胶乳珠上后由流动细胞计数法及由Western印迹法分析其组成。
以使用胶乳珠的方法对胞外体分析的显示，其载有分子Lamp1、CD9、CD63、CD81及Ⅰ类MHC分子，但无Ⅱ类分子，亦无Lamp2分子(图9B)。此外，在电子显微镜下观察的这些胞外体的形态与该由RBL 2H3系产生的胞外体的形态完全相同。最后，由Western印迹法所观察的蛋白质组成确认这些结果，因为，借助此技术，我们发现分子CD63、Lamp1、MHCⅠ类，而Lamp2、MHCⅡ类仍为阴性的(图9C)。
总结，系MHCⅠ似乎为RBL 2H3大鼠系的人同系物，这是由于在增加细胞内钙后MHCⅠ产生具有相同结构与分子特征的胞外体的能力。借助这些细胞，因此有可能产生表达Ⅱ类MHC分子或特异性寻址至它们的任何其他分子的重组人胞外体。

Claims (46)

1．一种膜囊泡，其特征在于其包含人主要组织相容性复合体的重组分子。
2．如权利要求1的囊泡，其特征在于主要组织相容性复合体的重组分子为Ⅱ类分子。
3．如权利要求2的囊泡，其特征在于主要组织相容性复合体的重组Ⅱ类分子为α链。
4．如权利要求2的囊泡，其特征在于主要组织相容性复合体的重组Ⅱ类分子包括α链与β链。
5．如权利要求2至4中任一项所述的囊泡，其特征在于主要组织相容性复合体的重组Ⅱ类分子从血清型DR1至DR13中选择，优选从DR1至DR7中选择。
6．如权利要求1的囊泡，其特征在于主要组织相容性复合体的重组分子为Ⅰ类分子。
7．如权利要求1至6中任一项所述的囊泡，其特征在于其含有由规定肽与主要组织相容性复合体的重组分子形成的复合物。
8．如前述任一项权利要求所述的囊泡，其特征在于其亦含一种或多种目的异源分子。
9．如前述任一项权利要求所述的囊泡，其特征在于其亦含一种肽或使其能纯化的重组蛋白质。
10．如前述任一项权利要求所述的囊泡，其特征在于其包含示踪剂。
11．如前述任一项权利要求所述的囊泡，其特征在于其基本上不含内源MHC分子。
12．一种膜囊泡，其特征在于其是从肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞获得，并且其含一种或多种目的异源分子。
13．如权利要求12的囊泡，其特征在于所述的目的分子为蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质，或化学、生物或合成的物质。
14．如权利要求13的膜囊泡，其特征在于异源分子为主要组织相容性复合体分子、抗原、受体配体、配体受体、核酸、药物产品、示踪剂和/或纯化肽。
15．如权利要求14的囊泡，其特征在于其表达配体受体，并且其包含另一种目的异源分子。
16．一种膜囊泡，其特征在于其含有在目的多肽与寻址信号间形成的重组融合分子。
17．一种胞外体生产细胞，其特征在于其含一种或多种编码主要组织相容性复合体分子的重组核酸。
18．如权利要求17的细胞，其特征在于其为肥大细胞。
19．如权利要求18的细胞，其特征在于其为嗜碱性细胞白血病的肥大细胞系，特别是RBL系，优选RBL-2H3。
20．如权利要求17至19的细胞，其特征在于其包含编码Ⅱ类主要组织相容性复合体分子的α链和/或β链和/或编码Ⅰ类主要组织相容性复合体分子的重组核酸。
21．一种制备含规定的重组分子的胞外体的方法，其包括以下步骤：
a)培养含有编码所述规定的重组分子的重组核酸的肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞，
c)回收由该细胞产生的胞外体，这些胞外体含有所述规定的重组分子。
22．如权利要求21的方法，其特征在于其包括一中间步骤b)，在该步骤b)中，细胞被刺激而诱导和/或增加胞外体的分泌。
23．如权利要求21或22的方法，其特征在于所述规定的重组分子被暴露在胞外体外面，或全部或部分地包含在胞外体的胞质部分中。
24．如权利要求21至23中任一项所述的方法，其特征在于重组分子为主要组织相容性复合体分子、抗原分子、受体配体、配体受体、纯化肽或任何其他目的多肽。
25．如权利要求21至24中任一项所述的方法，其特征在于所述核酸亦包括编码朝向肥大细胞膜区室的寻址信号的区域。
26．一种制备含规定组成的肽-MHC复合物的胞外体的方法，其特征在于包括：
-培养含一种或多种编码规定的MHC重组分子的重组核酸的胞外体生产细胞，
-刺激细胞以诱导胞外体的释放，
-回收由该细胞产生的胞外体，这些胞外体在其表面上表达所述规定的MHC重组分子，及
-使胞外体与肽或肽类接触。
27．一种制备含规定组成的肽-MHC复合物的胞外体的方法，其特征在于包括：
-培养含一种或多种编码规定的MHC重组分子的重组核酸及含编码规定的重组肽的区域的核酸的胞外体生产细胞，
-刺激细胞以诱导胞外体的释放，
-回收由该细胞产生的胞外体，这些胞外体在其表面上表达与该重组肽结合的所述规定的重组MHC分子。
28．如权利要求27的方法，其特征在于编码重组肽的核酸编码li不变链的衍生物，其中CLIP区域被删除并由所述肽取代。
29．如权利要求26至28中任一项所述的方法，其特征在于所述生产细胞为肥大细胞或肥大细胞衍生的细胞。
30．如权利要求26至29中任一项所述的方法，其特征在于所述生产细胞基本上不含内源MHC分子。
31．一种修饰胞外体组成的方法，包括：
-将一种编码规定分子的核酸插入胞外体生产细胞，所述核酸与膜区室中的寻址信号结合，及
-从所述细胞产生胞外体。
32．含一种或多种如权利要求1至16中任一项所述的膜囊泡的组合物。
33．一种如权利要求1至16中任一项所述的囊泡用以制备多克隆和/或单克隆抗体的用途。
34．一种制备抗体的方法，包括以权利要求7的囊泡免疫动物，回收抗体和/或回收产生抗体或参与免疫应答的细胞。
35．如权利要求34的方法，该方法用以制备单克隆抗体，特别是特异于MHC-肽结合体的单克隆抗体。
36．如权利要求34或35所得的抗体或该抗体的片断的用途，用以在生物样品中检测相对应的特异抗原的存在。
37．如权利要求34或35产生的抗体、或该抗体的片断、或如权利要求1的囊泡的用途，用以制备治疗组合物，该组合物用以抑制T淋巴细胞的受体与其所特异的MHC-肽复合物间的相互作用。
38．如权利要求1至16中任一项所述的膜囊泡的用途，用以在生物样中检测特异于蛋白质分子的配偶体。
39．如权利要求38的载有MHC-肽复合物的胞外体的用途，用以在生物样品中检测特异于此复合物的T淋巴细胞。
40．如权利要求38的载有TcR受体的胞外体的用途，用以在生物样品中检测特异于此受体的肽-MHC复合物。
41．如权利要求38的载有配体受体的胞外体的用途，用以在生物样品中检测所述配体的存在。
42．在生物样品中检测特异于抗原-MHC复合物的T淋巴细胞存在的方法，包括将该样品与如权利要求7标记且含所述抗原-MHC复合物的胞外体接触，及在该样品中证实T淋巴细胞的标记。
43．一种如权利要求7的囊泡的用途，用以克隆增殖及/或体外刺激细胞毒性和/或辅助T淋巴细胞。
44．一种如权利要求11至16中任一项所述的囊泡的用途，用以制备意在将所述分子向细胞转移的组合物。
45．含一种或多种固定在载体上的胞外体的组合物。
46．如权利要求1至16中任一项所述的膜囊泡的用途，特别是固定在载体上的膜囊泡的用途，用以纯化细胞。
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