CN105612178B - 利用包含含蛋白膜囊泡的抗原组合物制备多克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备针对抗原靶蛋白的多克隆抗体的方法，所述方法包括通过向宿主施用包含并入所述抗原靶蛋白的膜囊泡的免疫原性组合物来在所述宿主中诱导免疫反应，以及从所述宿主血清获得针对所述靶蛋白的抗体。这种方法的更具体的实施方式至少包括以下步骤：a)通过体外翻译反应在反应介质中合成所述靶蛋白，所述反应介质包含编码所述靶蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的细胞裂解物；b)从所述介质分离包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；c)在生理上相容的介质中提供包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；d)向宿主施用步骤c)的膜囊泡；e)测试所述宿主的血清样品针对所述靶蛋白的特异性免疫反应；以及f)从表现出针对所述靶蛋白的特异性免疫反应的宿主的血清获得针对所述靶蛋白的特异性抗体。

Description

利用包含含蛋白膜囊泡的抗原组合物制备多克隆抗体的方法
背景技术
在诊断学和治疗学中抗体是强大和非常宝贵的工具。根据高特异性抗体的需求不断增长，随着时间已开发许多不同策略以允许可靠地生产足量的抗体(参见例如，J.S.Haurum,Drug Discovery Today,2006.11(13-14),655-660)。在这种背景下，1975年杂交瘤技术的发现代表重大突破，因为小鼠杂交瘤是单克隆抗体的第一种可靠来源。
在理论上，可以针对选定的任何靶标开发单克隆抗体。选定的靶标的提供是绝对必要的。即使在基因免疫的情况下，也需要抗原用于筛选和证实目的。不幸的是，在某些情况下，如果在基于细胞的测定中抗原分离或制备均不成功，则抗原的提供可能成为问题。
通常，抗原属于蛋白和肽的类别，但是原则上其他物质类别也可以用作免疫原，例如多糖、脂质和多核苷酸。在大多数情况下，应当针对天然抗原产生抗体。如果抗原是通过重组DNA技术产生的，则比较所得的重组蛋白或肽与其天然对应物的特性是非常重要的，因为蛋白结构的差异可以导致免疫原性的差异。对于抗体制备，蛋白和肽是高度感兴趣的靶标。鉴于免疫原性表位是线性的且不依赖于完整蛋白的三级结构的事实，肽合成代表基于细胞的表达的另一种选择。在另一方面，肽合成具有其局限性，因为蛋白和肽具有翻译后修饰(PTM)，这是三维表位的部分。此外，使用肽和肽混合物作为抗原可以诱导产生交叉反应性抗体。
膜蛋白占所有测序的基因组的近三分之一。与它们在细胞过程如信号传导、代谢、转运和识别中的重要参与相反，关于膜蛋白结构和功能性可获得的信息很少。在体内它们生物学活性的下调可以导致严重疾病，使得它们成为高度感兴趣的药理学靶标。这种发展引起对膜蛋白特异性抗体的需求增加。
针对膜蛋白的特异性抗体的产生常受到不能制备或分离某种靶膜蛋白的限制。在体内过量表达膜蛋白常受到蛋白错误折叠、不溶性、聚集、低产率和细胞毒性的妨碍。但是，膜蛋白的无细胞表达可以克服这些障碍。
在过去的十年里，无细胞蛋白合成已成为制备包括膜蛋白、胞质蛋白或甚至毒性蛋白在内的不同蛋白类别的有价值的工具(参见例如，Katzen etal.,TrendsBiotechnol.,2005.23(3),150-156)。高效无细胞表达系统的基础是具翻译活性的细胞提取物，其包含翻译的必要组分如核糖体、翻译因子和酶。此外，细胞裂解物补充了氨基酸、ATP和GTP和能量再生系统(例如肌酸-磷酸/肌酸-激酶能量-再生系统)。靶蛋白的合成通过添加DNA或mRNA形式的适当模板来起始。到目前为止，已在原核和真核无细胞系统中表达许多不同类型的功能活性靶蛋白。与原核细胞提取物相比，真核细胞裂解物在表达需要翻译后修饰的复杂蛋白中提供几个优势。
然而，使用通过原核和真核细胞裂解物合成的蛋白根据现有技术的常规方法制备特异性抗体仍涉及额外的费力的纯化和/或分离步骤，以便提供合适形式的期望靶蛋白用作免疫原性物质。
鉴于现有技术的缺点，本发明的主要目的是提供改进的方法和手段用于制备针对特定靶蛋白的多克隆抗体。
这个目的已通过提供制备针对特定靶蛋白的多克隆抗体的新方法实现，所述方法利用包含权利要求1和2的含蛋白膜囊泡的抗原组合物进行制备。本发明的其他方面和更多具体实施方案是其他权利要求的主题。
发明内容
根据权利要求1制备针对抗原靶蛋白的多克隆抗体的方法包括通过向宿主施用包含掺有所述抗原靶蛋白的膜囊泡的免疫原性组合物来在所述宿主中诱导免疫反应，以及从所述宿主血清获得针对所述靶蛋白的抗体。
根据权利要求2的更具体的方法至少包括以下步骤：
a)通过体外翻译反应在反应介质中合成所述靶蛋白，所述反应介质包含编码所述靶蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的细胞裂解物；
b)从所述介质分离包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；
c)在生理上相容的介质中提供包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；
d)向宿主施用步骤c)的膜囊泡；
e)测试所述宿主的血清样品针对所述靶蛋白的特异性免疫反应；以及
f)从表现出针对所述靶蛋白的特异性免疫反应的宿主的血清获得针对所述靶蛋白的特异性抗体。
本发明人的研究令人惊讶地证实可以使用掺有至少一种靶蛋白的膜囊泡的制品，直接作为免疫原性组合物用于在宿主中产生针对靶蛋白的特异性抗体。这样的膜囊泡制品对于宿主基本上是无毒的，并且可以用来有利地诱导强免疫反应而不添加任何其他免疫刺激剂。
合适的膜囊泡制品是例如这样获得的，在包含编码靶蛋白的核酸模板和包含膜囊泡的细胞裂解物的反应介质中进行无细胞翻译反应，并且在翻译反应之后从所述介质分离含蛋白的囊泡。
优选地，所述细胞裂解物为真核细胞裂解物。
不特别限制所述真核细胞裂解物，原则上可以是任何细胞裂解物，其包含所使用的核酸模板的体外翻译以及任选地所合成靶蛋白的修饰所需要的所有组分。
更具体地，所述真核细胞裂解物选自小麦胚芽裂解物，昆虫细胞裂解物特别是Sf21细胞裂解物，网织红细胞裂解物，角质形成细胞裂解物，来自CHO细胞、HeLa细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞或培养的淋巴瘤细胞的细胞提取物。
这些细胞裂解物可以以它们的天然形式使用，或者通过添加或去除特定组分进行修饰。
下文实例中使用的无细胞系统是基于产生自培养的昆虫细胞(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，Sf21)的具翻译活性的裂解物。通过保留亚细胞组分完整性的非常温和的裂解物制备方法，内质网(ER)的重要部分可以保留在裂解物中作为功能活性膜囊泡。利用含有囊泡类型的裂解物，可以对靶蛋白进行翻译后修饰(PTM)如糖基化、信号肽切割、脂质化、磷酸化和二硫键形成。
如果获得自特定细胞系的原始细胞裂解物不含膜囊泡(例如网织红细胞裂解物)，则可以添加来自不同来源的囊泡，例如来自不同细胞系的裂解物。
优选地，膜囊泡和细胞裂解物源自相同细胞系。
此外，还可以使用其中一种或多种组分已合成制备的人工细胞裂解物。
用于体外翻译反应的反应介质包含所述裂解物，所述裂解物包含翻译的必要组分如核糖体、翻译因子和酶。此外，所述介质或细胞裂解物补充了氨基酸、ATP和GTP和能量再生系统(例如肌酸-磷酸/肌酸-激酶能量-再生系统)。靶蛋白的合成通过添加DNA或mRNA形式的靶蛋白的适当核酸模板来起始。
包含合成的靶蛋白的膜囊泡可以通过本领域已知的任何合适的方法自反应介质分离，特别是通过离心或过滤的方式。
在本发明的一优选实施方式中，步骤a)的体外翻译反应在促进膜囊泡中合成靶蛋白的富集的条件下发生。
获得这样的膜囊泡中合成靶蛋白的富集的一种示例性方法包括权利要求2的方法的修改，其中权利要求2的步骤b)之后是额外的步骤b`)，其包括将分离的膜囊泡转移入第二反应介质，所述第二反应介质包含编码靶蛋白的核酸模板和不含膜囊泡的细胞裂解物，在所述第二反应介质中进行体外翻译反应，以及从第二介质分离包含增加量的合成靶蛋白的膜囊泡，其中步骤b`可以重复一次或多次。
在一可选实施方式中，步骤a)中的体外翻译反应是通过基于连续透析的方法进行的，所述方法包括在翻译反应的过程中添加和/或排出反应物或产物。这种反应形式延长反应时间，因此增加总蛋白产率。
通常，这个实施方式在包含至少2个通过透析膜分隔的隔室的装置中实现，其中翻译反应在至少一个第一隔室，反应隔室中发生，并且在翻译反应的过程中，来自至少一个另外的隔室，装载和排出隔室的反应物扩散入反应隔室，并且反应副产物从反应隔室扩散入装载和排出隔室。
优选地，胱天蛋白酶抑制剂至少存在于反应隔室中。如25.09.2013提交的共同待决的专利申请DE 10 2013 015 977.6所示，在体外翻译反应期间胱天蛋白酶抑制剂的存在大大增加其中使用真核细胞裂解物的无细胞翻译系统中的蛋白产率。
在要求保护的方法的一典型实施方式中，施用于宿主的具有含蛋白膜囊泡的免疫原性组合物不含任何额外的免疫刺激佐剂。如已经提到的，本发明中使用的免疫原性组合物有利地允许免除其他辅助剂。
在所述免疫原性组合物中，囊泡可以在本领域已知的任何合适的生理上相容的介质或缓冲液中提供。具体地，“生理上相容的”介质或缓冲液的pH和盐浓度必须与预期宿主的身体在生理上相容。
生理上相容的介质可以是例如PBS，但是本领域技术人员会容易地识别合适的可选物。
用于免疫和获得特异性多克隆抗体的宿主可以是在本领域中用于这类目的的任何宿主动物。通常，其为非人哺乳动物，如包括小鼠或大鼠的啮齿动物、山羊、绵羊、牛等。
本发明的密切相关的方面涉及一种在膜囊泡制品的囊泡内积累靶蛋白的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)通过体外翻译反应在反应介质中合成所述靶蛋白，所述反应介质包含编码所述靶蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的细胞裂解物；
b)从所述介质分离包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；
c)将所分离的膜囊泡转移入第二反应介质，所述第二反应介质包含编码靶蛋白的核酸模板和不含膜囊泡的细胞裂解物，在所述第二反应介质中进行体外翻译反应，以及从第二介质分离包含增加量的合成靶蛋白的膜囊泡，其中步骤c)可以重复一次或多次。
本申请公开了一种新的方法，其使得能够以快速和高效的方式产生针对难以表达的蛋白原性抗原(例如膜蛋白和具有翻译后修饰的蛋白)的多克隆抗体。这种方法的基础是使用真核无细胞翻译系统用于合成、易位以及包埋靶蛋白进裂解物中存在的ER衍生的膜囊泡中。无细胞蛋白合成之后，具有它们所包埋的靶蛋白的囊泡可以从裂解物的胞质级分分离，并且随后可以用作货物媒介物用于所包埋抗原的加工。
如图1所示，对于靶膜蛋白，整个方法可以描述为5个主要步骤。
1.靶蛋白的无细胞合成。靶蛋白的无细胞合成应当在翻译系统中进行，所述翻译系统使得能够合成可溶性和正确折叠状态的给定靶蛋白。在膜蛋白的情况下，需要存在合成或天然的脂质或去污剂支架。通过各蛋白序列中的一个或多个信号序列起始靶蛋白进入囊泡内腔的共翻译易位或者从头合成的靶膜蛋白进入脂质双层的包埋。
这个第一步还可以包括在ER衍生的囊泡中累积富集靶(膜)蛋白。为了与内源性蛋白级分相比富集从头合成的蛋白级分，可以进行重复合成。这里，靶蛋白在几个随后进行的无细胞反应中合成进入相同批次的昆虫囊泡。在每个合成步骤之后，将囊泡收获并应用于下一合成步骤，导致囊泡膜中存在的外源性膜蛋白连续增加。因此可以将蛋白产率从标准分批反应中获得的通常1-10μg/ml增加至约20-30μg/ml。
2.收获ER衍生的囊泡，其包含从头合成的(膜)蛋白，优选通过离心。可以通过单一离心步骤从裂解物的胞质部分分离ER衍生的囊泡。离心之后将囊泡重悬于具有生理pH和盐浓度的介质或缓冲液中，如磷酸缓冲盐水(PBS)，并且在这种介质/缓冲液中洗涤以去除可能粘附至囊泡的胞质蛋白。
3.经收获并洗涤的具有它们所掺有的靶蛋白的囊泡可以用作免疫原。将囊泡-缓冲液溶液直接注射入实验室动物。
4.采血，优选在合适的休息时间例如4周之后。
5.例如通过蛋白印迹，评价多克隆小鼠抗血清关于抗原识别的性能。
在阳性结果的情况下，可以考虑将相应的血液供体作为制备单克隆抗体的来源。
附图说明
图1通过利用真核的基于囊泡的翻译系统无细胞合成的膜蛋白免疫小鼠来产生特异性抗体的原理概述
图2用昆虫囊泡免疫小鼠之前和之后获得的小鼠多克隆抗血清的蛋白印迹分析
图3通过TCA-沉淀分析无细胞合成的Mel-trunc-EGFR以及随后的液体闪烁计数和放射自显影
图4利用昆虫裂解物的无细胞合成的Mel-trunc-EGFR-His的His-标签纯化
A)凝胶电泳之后SDS-PAGE凝胶的考马斯染色
B)利用可商购的抗EGF受体抗体(抗EGF受体D38B1XP)作为一抗和HRP-偶联的抗兔抗体作为二抗(HRP-缀合的抗兔IgG)通过蛋白印迹检测Mel-trunc-EGFR-His
图5用包含从头合成的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡免疫小鼠之前和之后获得的小鼠多克隆抗血清的蛋白印迹分析
提供以下非限制性实例以更详细地说明本发明，但是不相同地限制其特征和参数。
参考例
用包含内源性蛋白的膜囊泡免疫小鼠宿主和抗血清的分析
用于这些实验的真核翻译系统是基于源自培养的草地夜蛾(Sf21)细胞的翻译活性裂解物，并且包含功能性内源膜囊泡，所述功能性内源膜囊泡具有它们在Sf21昆虫细胞的内质网(ER)中的来源。
在第一步中，研究将昆虫囊泡和它们所掺有的内源性蛋白注射入小鼠是否可以引起免疫反应。其次，研究即使不添加弗氏佐剂，昆虫囊泡是否仍可以引起免疫反应。
为了这个目的，用昆虫囊泡、弗氏佐剂和PBS的不同混合物(表1)注射8只实验室小鼠。8只动物中的7只存活直至最终采血。在第一次免疫之前立即以及在第二次和最终免疫之后一周进行从所有动物采血。
表1：施用的免疫原的概况。用总体积120μl的抗原溶液免疫每只实验室小鼠。
PBS体积[μl] 囊泡溶液体积[μl] 弗氏佐剂体积[μl] 免疫的小鼠
1 120 - - 2
2 60 60 - 2
3- 60 60 2
4 60 - 60 2
免疫之前，用以下方式制备膜囊泡：通过在16.000g下的离心步骤(10min，4℃)从裂解物的可溶性级分分离昆虫囊泡。丢弃上清液(SN)，并且将所得的囊泡级分(VF)在两倍体积的PBS缓冲液中洗涤3次。第三次洗涤步骤之后，将VF重悬于原始体积的昆虫裂解物中。将这种溶液的等分试样在PBS缓冲液中1:2稀释。将120μl的这种溶液用于腹腔内免疫2只实验室小鼠(品系BALB/c)。用以下溶液注射6只额外的实验室动物：2只动物用120μl PBS，2只动物用重悬于PBS中且与弗氏佐剂混合(比例1:1)的昆虫囊泡，以及2只动物用PBS缓冲液和弗氏佐剂的混合物(比例1:1)。休息2周之后，与第一次免疫类似地进行第二次免疫(“增强”)。第二次免疫之后一周，从存活的所有动物采血。将获得的抗血清储存在-20℃下直至进一步使用。
抗血清的分析
通过蛋白印迹分析获得的多克隆小鼠抗血清。通常，通过ELISA分析多克隆抗血清，ELISA是其中将已用于免疫的抗原包被在微量滴定板上的测试方法。这里，采用另一策略，因为抗原代表脂质-蛋白-混合物，其难以利用标准方法固定。因此，通过蛋白印迹分析抗体和抗原之间的相互作用。
为了这个目的，用以下方式制备用于免疫的抗原：如上文所述通过离心从裂解物的胞质级分分离昆虫囊泡，并且在PBS中洗涤3次。之后，将SN和VF的等分试样在丙酮中沉淀并在10％SDS-PAGE(10％Bis-Tris凝胶MES SDS缓冲液，Life technologies)分离。
利用半干印迹技术(半干印迹；iBlot系统，life technologies，程序3)将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(life technologies)上。印迹之后，将膜在室温下用25ml的TBS缓冲液覆盖5min，然后在室温下于25ml封闭液(1x Roti Block，Roth)中温育1h或者在4℃下过夜。封闭之后，将膜用15ml TBS/Tween洗涤3次。然后，将膜切为包含裂解物级分SN和VF的部分。
将膜切片在室温下用封闭缓冲液中1:2000稀释的不同多克隆小鼠抗血清温育1h。用TBS/Tween洗涤3次之后，将膜切片用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠抗体(抗小鼠缀合的IgG，在封闭缓冲液中1:1000)温育。在TBS/Tween中洗涤3次之后，通过用化学发光的检测试剂(ECL加蛋白印迹检测试剂，GE Healthcare)温育膜切片来检测二抗，将其温育5min。利用磷相仪(phosphorimager)系统(Typhoon TRIO+成像仪，GE Healthcare)(发射最大425nm)检测发射光。
所得的蛋白印迹在图2中示出：用昆虫囊泡免疫小鼠之前和之后获得的小鼠多克隆抗血清的蛋白印迹分析。用120μl PBS(A)、120μl PBS中的囊泡(B)、120μl补充了弗氏佐剂的PBS中的囊泡以及120μl弗氏佐剂进行动物的免疫。免疫原A代表B)和C)对照；免疫原D代表C)的对照。将膜切片在室温下用多克隆小鼠血清(在封闭缓冲液中1:2000稀释)温育1h，然后用HRP偶联的抗小鼠抗体(抗小鼠缀合的IgG，在封闭缓冲液中1:1000稀释)温育。M＝蛋白标记(
Figure BDA0000958538520000082
Plus2,.Life technologies)。C＝第二HRP偶联的抗小鼠抗体的特异性对照。与其他膜切片一样处理这张膜切片，除了不用多克隆小鼠血清温育。
应用免疫之前获得的小鼠抗血清不能使得在两个分析的裂解物级分SN和VF中特异性地检测昆虫蛋白。唯一地，观察到二抗与来自SN的蛋白的非特异性反应(图2，泳道C，未将膜切片与小鼠血清温育，而是仅与二抗温育)。
SN和VF膜切片与免疫之后获得的小鼠血清的温育导致在VF中检测到广泛的不同蛋白，但是在SN中未检测到。在这个背景下，观察到用弗氏佐剂补充昆虫囊泡对免疫反应的强度没有正面影响。
图2中示出的结果证实具有它们包埋的内源性蛋白的昆虫囊泡能够在小鼠中诱导足够的免疫反应。作为对照，将2只小鼠单独用PBS和弗氏佐剂免疫。正如预期的，获得自这些小鼠的血清不能使得检测蛋白。
实施例
用包含异质靶蛋白的膜囊泡免疫小鼠宿主和抗血清的分析
昆虫裂解物中膜蛋白的无细胞合成
这个发明的主要目的是开发一种新的方法，其使得能够以快速和高效的方式制备针对难以表达的膜蛋白的抗体。
作为模型蛋白，选择人表皮生长因子受体(EGFR)的截短变体(vIII-缺失)。此后称作Mel-trunc-EGFR的这种膜蛋白代表感兴趣的测试候选物，因为其是全长EGFR的永久活性突变体，全长EGFR是参与某些癌症亚型的发展的蛋白。
为了增加昆虫囊泡膜中靶蛋白的分数，在同一组的囊泡中进行5种代表性的蛋白合成。如下文所述在14C-亮氨酸的存在下进行无细胞蛋白合成：以分批形式的翻译反应(1.5h,600rpm)开始实验，然后将翻译混合物(TM)离心(16,000g,10min,4℃)并分离为SN和VF。丢弃SN，同时将VF重悬于新鲜的翻译活性裂解物中，所述裂解物没有囊泡但是补充了靶核酸(这里为mRNA)。重复这个步骤多达4次，导致总计5次连续蛋白合成。通过这种方式，在整个过程中靶蛋白Mel-trunc-EGFR易位入同一组的囊泡。
从第一个和最后一个合成步骤的TM、SN和VF采集5μl的等分试样并分析蛋白产率、蛋白大小和同质性。
图3：通过TCA-沉淀分析无细胞合成的Mel-trunc-EGFR以及随后的液体闪烁计数和放射自显影。利用基于昆虫裂解物的真核翻译系统在14C-亮氨酸的存在下进行无细胞的蛋白合成。在单次合成(1x合成)之后和5次重复合成(5x合成)之后进行翻译混合物(TM)、离心之后的上清液级分(SN)和囊泡级分(VF)中的Mel-trunc-EGFR的分析。Mel-trunc-EGFR表现出约98kDa的表观分子量(计算分子量105kDa)。平行制备Mel-trunc-EGFR的非放射性样品并用于免疫。
图3中示出的结果显示在5次重复合成之后，VF中Mel-trunc-EGFR的蛋白产率从7.8μg/ml增加至20.1μg/ml(免疫1)，以及从6.7μg/ml增加至15.6μg/ml(免疫2)，导致从合成1至5，VF中的Mel-trunc-EGFR增加2.5倍。与在14C-亮氨酸的存在下的合成平行，制备Mel-trunc-EGFR的非放射性样品。5次重复合成之后收获昆虫囊泡，并且如上文所述处理。将具有它们包含的外源靶蛋白的昆虫囊泡用于免疫2只实验室小鼠。如前所述进行免疫过程。
从昆虫囊泡纯化Mel-trunc-EGFR-His
为了证实所得的多克隆小鼠抗血清中EGFR特异性抗体的存在，通过蛋白印迹进行分析。
为了该目的，通过SDS-PAGE分离抗原(无细胞合成的Mel-trunc-EGFR)，随后将其印迹在PVDF膜上。在一个合成步骤中进行抗原Mel-trunc-EGFR的无细胞合成1.5h、500rpm和27℃。之后，如上文所述收获昆虫囊泡并在PBS中洗涤3次。
此外，通过His-标签纯化从囊泡纯化Mel-trunc-EGFR。为此，使用Mel-trunc-EGFR的DNA-模板，其表现出C-末端融合的His-标签。如下文所述进行包含C-末端His-标签的Mel-trunc-EGFR(Mel-trunc-EGFR-His)的纯化：在一个合成步骤中以与Mel-trunc-EGFR相同的方式进行Mel-trunc-EGFR-His的无细胞合成。合成之后，将翻译混合物分离为裂解物级分SN和VF。
为了从昆虫囊泡释放膜蛋白，将VF重悬于包含1％的温和去污剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的PBS中，并且在4℃下温育过夜。然后，将溶液离心(20.000g,1h,4℃)，并且将所得的包含溶解的膜蛋白的上清液应用于Nickel-NTA基质上。利用
Figure BDA0000958538520000101
Ni-NTA膜蛋白试剂盒根据制造商的说明书进行Mel-trunc-EGFR-His的纯化。通过SDS-PAGE和蛋白印迹利用可商购的抗EGFR抗体作为一抗(抗EGF受体D38B1XP，兔单克隆抗体，在封闭缓冲液中1:1000)和HRP-偶联的抗体作为二抗(HRP-缀合的抗兔IgG，在封闭缓冲液中1:2000)分析所有不同级分的样品。利用化学发光检测试剂(ECL加蛋白印迹检测试剂，GE Healthcare)进行抗原的检测。
图4：Mel-trunc-EGFR-His的His-标签纯化。利用基于昆虫裂解物的真核翻译系统进行Mel-trunc-EGFR-His的无细胞合成。
A)凝胶电泳之后SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。
B)利用可商购的抗EGF受体抗体(抗EGF受体D38B1XP，兔单克隆抗体，在封闭缓冲液中1:1000)作为一抗和HRP-偶联的抗兔抗体作为二抗(HRP-缀合的抗兔IgG，在封闭缓冲液中1:2000)通过蛋白印迹检测Mel-trunc-EGFR-His。Mel-trunc-EGFR-His表现出约98kDa的表观分子量(计算分子量105kDa)。标记＝蛋白标记
Figure BDA0000958538520000111
Plus2,Lifetechnologies。
图4中示出的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色显示与天然翻译混合物(TM)相比，在洗脱液级分1-5中成功耗尽内源性裂解物蛋白。除了洗涤级分2以及洗脱液1和2，在所有测试的级分中均检测到靶蛋白Mel-trunc-EGFR-His。
用Mel-trunc-EGFR免疫之后多克隆小鼠血清的分析
在下一步中，测试用包含从头合成的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡免疫小鼠之后获得的多克隆小鼠血清以在蛋白印迹中检测Mel-trunc-EGFR。为了该目的，制备3种不同抗原：(i)未处理的昆虫囊泡，(ii)包含无细胞合成的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡以及(iii)纯化的Mel-trunc-EGFR-His。通过SDS-PAGE分离抗原并将其印迹在PVDF膜上。将蛋白印迹膜切片用3种不同类型的小鼠血清温育：(a)免疫之前获得的小鼠血清(阴性对照)，(b)用没有外源性膜蛋白的单独昆虫囊泡免疫之后获得的小鼠血清，以及(c)用包含无细胞合成且膜包埋的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡免疫之后获得的血清。
相应结果在图5和表2中示出。
图5：用包含从头合成的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡免疫小鼠之前和之后获得的小鼠多克隆抗血清的蛋白印迹分析。在丙酮中沉淀没有Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡和具有外源性无细胞合成的Mel-trunc-EGFR(，，EGFR“)的昆虫囊泡，并且在SDS-PAGE中分离包埋的蛋白-内源性蛋白以及外源性膜蛋白。此外，将无细胞合成和纯化的Mel-trunc-EGFR-His(，，EGFR-His“)应用于SDS-PAGE。通过半干蛋白印迹将蛋白成功转移至PVDF膜上之后，将膜切片用多克隆小鼠抗血清温育，然后用HRP-偶联的抗小鼠抗体(抗小鼠缀合的IgG，在封闭缓冲液中1:1000)。箭头指示Mel-trunc-EGFR/Mel-trunc-EGFR-His的检测。M＝蛋白标记(
Figure BDA0000958538520000122
Plus2,Life technologies)。
表2：通过蛋白印迹分析的多克隆小鼠抗血清的表现的概述。通过SDS-PAGE分离不同抗原(未处理的昆虫囊泡、具有所含的Mel-trunc-EGFR和纯化的Mel-trunc-EGFR-His的昆虫囊泡)并将其印迹在PVDF膜上(半干印迹技术)。将用单独的昆虫囊泡或具有包埋的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡免疫之后获得的小鼠抗血清分别用于检测Mel-trunc-EGFR和Mel-trunc-EGFR-His。减号(-)＝无反应性。加号(+)＝蛋白的检测。
Figure BDA0000958538520000121
正如预期的，应用免疫之前获得的小鼠血清未导致蛋白条带的检测。相比之下，用昆虫囊泡免疫之后获得的小鼠抗血清导致在具有印迹的的昆虫囊泡(不含Mel-trunc-EGFR和具有Mel-trunc-EGFR)的泳道中检测到许多不同大小的蛋白。这个观察是按照预期，因为昆虫囊泡包含许多可能在实验室动物中诱导免疫反应的不同内源性膜蛋白。使用昆虫囊泡和所含的Mel-trunc-EGFR免疫之后获得的小鼠血清导致相似的检测模式。正如预期的，利用昆虫囊泡和所含的Mel-trunc-EGFR免疫之后获得的小鼠血清单独检测到纯化的Mel-trunc-EGFR，但是用单独的昆虫囊泡免疫之后获得的小鼠抗血清未检测到。这个观察支持通过使用多克隆小鼠血清(用包含无细胞合成的Mel-trunc-EGFR的昆虫囊泡免疫)特异性检测Mel-trunc-EGFR的假设。
除了使用多克隆小鼠抗血清，将可商购的抗EGFR抗体用于证实Mel-trunc-EGFR的成功印迹以验证所得的结果。
为了该目的，通过在苛刻缓冲液条件下处理(“膜剥离”)来从PVDF膜去除一抗和二抗。剥离之后，随后将膜用可商购的抗EGFR抗体作为一抗(抗EGF受体D38B1XP，兔单克隆抗体，在封闭缓冲液中1:1000)和HRP-偶联的抗体作为二抗(HRP-缀合的抗兔IgG，在封闭缓冲液中1:2000)温育。Mel-trunc-EGFR和Mel-trunc-EGFR-His检测为不同蛋白条带，证实在所分析的膜条纹中存在无细胞合成的蛋白。

Claims (10)

1.一种制备针对抗原靶膜蛋白的多克隆抗体的方法，所述方法包括通过向非人哺乳动物宿主施用包含掺有所述抗原靶膜蛋白的内质网衍生的膜囊泡的免疫原性组合物来在所述宿主中诱导免疫反应，以及从所述宿主血清获得针对所述靶膜蛋白的抗体，其中所述方法至少包括以下步骤：
a)通过体外翻译反应在反应介质中合成所述靶膜蛋白，所述反应介质包含编码所述靶膜蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的细胞裂解物；
b)从所述介质分离包含所合成的靶膜蛋白的膜囊泡；
c)在生理上相容的介质中提供包含所合成的靶膜蛋白的膜囊泡；
d)向宿主施用步骤c)的膜囊泡；
e)测试所述宿主的血清样品针对所述靶膜蛋白的特异性免疫反应；以及
f)从表现出针对所述靶膜蛋白的特异性免疫反应的宿主的血清获得针对所述靶膜蛋白的特异性抗体；
其中所述细胞裂解物为昆虫细胞裂解物。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞裂解物为草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞裂解物。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞裂解物为Sf21细胞裂解物。
4.权利要求1的方法，其中所述膜囊泡和细胞裂解物源自相同细胞系。
5.权利要求1的方法，其中通过离心自所述介质分离包含所合成的靶膜蛋白的膜囊泡。
6.权利要求1的方法，其中步骤a)的体外翻译反应在促进膜囊泡中合成的蛋白富集的条件下发生。
7.权利要求6的方法，其中步骤b)之后是额外的步骤b`)，其包括将分离的膜囊泡转移入第二反应介质，所述第二反应介质包含编码靶膜蛋白的核酸模板和不含膜囊泡的细胞裂解物，在所述第二反应介质中进行体外翻译反应，以及从第二介质分离包含增加量的合成的靶膜蛋白的膜囊泡，其中步骤b`可以重复一次或多次。
8.权利要求6的方法，其中步骤a)中的体外翻译反应是通过基于连续透析的方法进行的，所述基于连续透析的方法包括在翻译反应的过程中添加和/或排出反应物或产物。
9.权利要求8的方法，其中步骤a)中的体外翻译反应在胱天蛋白酶抑制剂的存在下进行。
10.权利要求1的方法，其中施用于宿主的具有含蛋白膜囊泡的免疫原性组合物不含任何额外的免疫刺激佐剂。
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