JPH02264731A - アイメリア膜結合タンパク質免疫原 - Google Patents
アイメリア膜結合タンパク質免疫原Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
コクチジウム病（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）は原生動物
門の商量の１つである、コクチジウム（ｅｏｃｃｉｄｉ
ｕｏ＋）に属する多（の種の１つまたはそれ以上の感染
によってひき起される病気である。コクチジウムは細胞
内寄生体であり。
門の商量の１つである、コクチジウム（ｅｏｃｃｉｄｉ
ｕｏ＋）に属する多（の種の１つまたはそれ以上の感染
によってひき起される病気である。コクチジウムは細胞
内寄生体であり。
多（の宿主に感染することができ、そして羊、山羊、牛
、豚および家禽類の産業に重大な経済的損失を与えるこ
とがある。事実、アイメリア（Ｅｉｍｅｌｉａ）種の感
染によって家禽類の産業は経済的に重大な損害を蒙って
きた。
、豚および家禽類の産業に重大な経済的損失を与えるこ
とがある。事実、アイメリア（Ｅｉｍｅｌｉａ）種の感
染によって家禽類の産業は経済的に重大な損害を蒙って
きた。
なお、ここで家禽類とは卵や肉の供給源として有用な飼
育鳥を意味するものであり、経済的に重要なものとして
は鶏、七面鳥、あひる、がちょう、はろほろちょう、き
じ、鳩、くじゃく等が例示される。これらの飼育鳥の中
で最もコクチジウム病による経済的被害を受しづやすい
のは鶏である。また七面鳥、あひる、がちょう、はろほ
ろちょうにも被害が出る。コクチジウム病はまた鳥小屋
で生育さねているくじゃくやうずら類にも深刻な被害を
及ぼす。コクチジウム病は急性の場合は破滅的な集団死
を招きまた慢性の場合は体重が増加しなくなる。
育鳥を意味するものであり、経済的に重要なものとして
は鶏、七面鳥、あひる、がちょう、はろほろちょう、き
じ、鳩、くじゃく等が例示される。これらの飼育鳥の中
で最もコクチジウム病による経済的被害を受しづやすい
のは鶏である。また七面鳥、あひる、がちょう、はろほ
ろちょうにも被害が出る。コクチジウム病はまた鳥小屋
で生育さねているくじゃくやうずら類にも深刻な被害を
及ぼす。コクチジウム病は急性の場合は破滅的な集団死
を招きまた慢性の場合は体重が増加しなくなる。
家禽類はこの寄生体の成長期、すなわち。
胞子化接合子嚢（ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄ ｏｏｃｙｓｔ
ｌを摂取することによってコクチジウムに感染する。
ｌを摂取することによってコクチジウムに感染する。
感染間、すなわち１神主（ｓ’ｐｏｒｏｚｏｉｔ、ｅ）
は腸に放出され、そ１：で急速に上皮細胞に侵入し、続
いて急速な細胞内無性増殖（シゾゴニー＝ｓｃｈｉｚｏ
ｇｏｎｙ）の数世代を経過した後、性分化と接合の段階
（ガメトゴニー： ｇａｍｅｔ、ｏｇｏｎｙ）に入る。
は腸に放出され、そ１：で急速に上皮細胞に侵入し、続
いて急速な細胞内無性増殖（シゾゴニー＝ｓｃｈｉｚｏ
ｇｏｎｙ）の数世代を経過した後、性分化と接合の段階
（ガメトゴニー： ｇａｍｅｔ、ｏｇｏｎｙ）に入る。
これにより未熟接合子嚢が形成され、これは糞として排
せつされそしてそのあと細胞外胞子形成の過程（スボロ
ゴニー：ｓｐｏｒｏｇｎｎｙｌを経過して成熟接合子嚢
の世代となる。アイメリアのいずれかの種、すなわち、
アイメリア・アセルブリナ （Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌ １ｎａｌ 、アイメリア・ミ
バティ（Ｅ。
せつされそしてそのあと細胞外胞子形成の過程（スボロ
ゴニー：ｓｐｏｒｏｇｎｎｙｌを経過して成熟接合子嚢
の世代となる。アイメリアのいずれかの種、すなわち、
アイメリア・アセルブリナ （Ｅ、 ａｃｅｒｖｕｌ １ｎａｌ 、アイメリア・ミ
バティ（Ｅ。
イメリア・プレアコクス（４匹匣ｃｏｘ）、アーイメリ
ア・ハガニ（ｆｉ、 Ｉ且肝」） 、アイメリア・ナク
トリクス（Ｅ、 ｎａｅｔｒｉｘ）、アイメリア・マキ
シマ（Ｅ、 ｍａｘｉｍａ）、アイメリア・ブルネッテ
４ （Ｅ、 ｂｕｒｎｅｔｔｉ） 、”アイメリア・テ
ネルラｆＥ、 Ｌｅｎｅｌｌａｌのいずれかに低度感染
すると再感染に対する保護免疫が得られる。この寄生体
の成長には１２ていどの異なる細胞型が含まれ、それぞ
れ形態学的かつ抗原的に区別される。これら細胞型の少
なくとも３つのものは宿主の体内で保護免疫応答を誘導
することが知られている。これについては下記文献が参
照される： Ｒｏｓｅと Ｈｅ５ｋｅｔｈの論文、Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ、 ７３． ２５−３７ベージ（１９７６年）、 ＭｃＤｏｎａｌｄ等の論文、Ｐａｒａｓｉｔｏｉ、 ９
３．１７ペ一ジロ９８６年）、 ＢｈａｎｕｓｈａＬ ｉとＬｏｎｇの論文″Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ １ｎＡｖｉａｎ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ”
Ｐｒｏｃ、 ｏｆ ｔｈｅ ＧｅｏｒｇｉａＣｏｃｃｉ
ｄｉｏｓｉｓ Ｃｏｎｆ、、 Ａｔｈｅｎｓ、 ＧＡ、
ＩＪＳＡ、５２６−５３４ページ（１９８６年）。
ア・ハガニ（ｆｉ、 Ｉ且肝」） 、アイメリア・ナク
トリクス（Ｅ、 ｎａｅｔｒｉｘ）、アイメリア・マキ
シマ（Ｅ、 ｍａｘｉｍａ）、アイメリア・ブルネッテ
４ （Ｅ、 ｂｕｒｎｅｔｔｉ） 、”アイメリア・テ
ネルラｆＥ、 Ｌｅｎｅｌｌａｌのいずれかに低度感染
すると再感染に対する保護免疫が得られる。この寄生体
の成長には１２ていどの異なる細胞型が含まれ、それぞ
れ形態学的かつ抗原的に区別される。これら細胞型の少
なくとも３つのものは宿主の体内で保護免疫応答を誘導
することが知られている。これについては下記文献が参
照される： Ｒｏｓｅと Ｈｅ５ｋｅｔｈの論文、Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ、 ７３． ２５−３７ベージ（１９７６年）、 ＭｃＤｏｎａｌｄ等の論文、Ｐａｒａｓｉｔｏｉ、 ９
３．１７ペ一ジロ９８６年）、 ＢｈａｎｕｓｈａＬ ｉとＬｏｎｇの論文″Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ １ｎＡｖｉａｎ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ”
Ｐｒｏｃ、 ｏｆ ｔｈｅ ＧｅｏｒｇｉａＣｏｃｃｉ
ｄｉｏｓｉｓ Ｃｏｎｆ、、 Ａｔｈｅｎｓ、 ＧＡ、
ＩＪＳＡ、５２６−５３４ページ（１９８６年）。
神主の世代も第１、第２無性増殖世代も共に鶏に免疫効
果をもたらす抗原を含有していると思われる。
果をもたらす抗原を含有していると思われる。
単一の主抗原からなるマラリア原虫
（Ｐｌａｓｎ＋ｏｄｉｕｍ ハ江紅肛朋１のような他の
寄生体の神主表面とは異なり［５ａｎｔｏｒｏ等の論文
、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 １５８３３４１−３
３４５（１９８３１参照１．アイメリア、特にアイメリ
ア・テネルラ（Ｅ、 ｔｅｎｅｌｌａｌの神主表面は抗
原として複雑のようである［Ｗｉｓｈｅｒの論文、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ。
寄生体の神主表面とは異なり［５ａｎｔｏｒｏ等の論文
、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 １５８３３４１−３
３４５（１９８３１参照１．アイメリア、特にアイメリ
ア・テネルラ（Ｅ、 ｔｅｎｅｌｌａｌの神主表面は抗
原として複雑のようである［Ｗｉｓｈｅｒの論文、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、 ２１．７−１５（１９８６）参
照１０種虫押のこの寄生体は試験管培養できないから、
また、通常の生化学的分析のためならびに亜単位ワクチ
ン評価のためには大量の神主材料が必要であるから、こ
れら抗原の精製が問題となっている。ここで、亜単位と
はアイメリアのいずれかの種の生活間の１つまたはそれ
以上から単離された、あるいは組換えＤＮＡの技術によ
って産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質であって、単独または他の類似のペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質と組合せてワクチン接種した後で
家禽に保護免疫を誘発するようなペプチド。
照１０種虫押のこの寄生体は試験管培養できないから、
また、通常の生化学的分析のためならびに亜単位ワクチ
ン評価のためには大量の神主材料が必要であるから、こ
れら抗原の精製が問題となっている。ここで、亜単位と
はアイメリアのいずれかの種の生活間の１つまたはそれ
以上から単離された、あるいは組換えＤＮＡの技術によ
って産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質であって、単独または他の類似のペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質と組合せてワクチン接種した後で
家禽に保護免疫を誘発するようなペプチド。
ポリペプチドまたはタンパク質をいう０組換え抗原また
は免疫原はアイメリアの生活史の１つまたはそれ以上の
段階から単離されたペプチド、ポリペプチドまたはタン
パク質と同じであるか類似物であろう６免疫原とは体内
に導入された時に微生物に対する免疫をつくるためワク
チンとして使用しつるような１本来の免疫応答を刺激す
る物質と定義される。
は免疫原はアイメリアの生活史の１つまたはそれ以上の
段階から単離されたペプチド、ポリペプチドまたはタン
パク質と同じであるか類似物であろう６免疫原とは体内
に導入された時に微生物に対する免疫をつくるためワク
チンとして使用しつるような１本来の免疫応答を刺激す
る物質と定義される。
免疫とは外来生物の侵害的または病原的作用あるいは外
来生物の産物の毒作用に対して非感受性になることを意
味する。保護免疫は体液性または細胞媒介性の免疫であ
りうる。
来生物の産物の毒作用に対して非感受性になることを意
味する。保護免疫は体液性または細胞媒介性の免疫であ
りうる。
体液性免疫は体内のプラズマ、リンパおよび組織液に存
在し、そして細胞に付加しつる抗体を介してもたらされ
る特異性免疫である。
在し、そして細胞に付加しつる抗体を介してもたらされ
る特異性免疫である。
細胞媒介免疫はＴリンパ球による特異性免疫である。な
お、抗原とは特異的に特定抗体と結合しつる物質と定義
される。
お、抗原とは特異的に特定抗体と結合しつる物質と定義
される。
不活性アイメリア・テネルラ（Ｅ、 ｔｅｎｅｆｌａ）
に対して製造されたモノクローナル抗体によって同定さ
れる可溶化アイメリア・テネルラ神主タンパク質は感染
性接合子嚢の攻撃にたいして鶏を保護することが判明し
ている（欧州特許願第１３５７１７号、５ｃｈｅｎｋｅ
１等の出願）、同様の結果が同じ技術で製造されたアイ
メリア・テネルラのメロゾイト １ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ）によっても得られた（欧州特
許願第１３５０７３号、 ５ｃｈｅｎｋｅ１等の出願）
、アイメリア・テネルラ神主から免疫原タンパク質が単
離されている（ ＭｕｒｒａｙとＧａ１ｕｓｋａの米国
特許第４６３９３７２号）、シかし、いずれのポリペプ
チドがアイメリア・テネルラの攻撃に対して鶏を保護す
るのであるかは確定されていない。
に対して製造されたモノクローナル抗体によって同定さ
れる可溶化アイメリア・テネルラ神主タンパク質は感染
性接合子嚢の攻撃にたいして鶏を保護することが判明し
ている（欧州特許願第１３５７１７号、５ｃｈｅｎｋｅ
１等の出願）、同様の結果が同じ技術で製造されたアイ
メリア・テネルラのメロゾイト １ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ）によっても得られた（欧州特
許願第１３５０７３号、 ５ｃｈｅｎｋｅ１等の出願）
、アイメリア・テネルラ神主から免疫原タンパク質が単
離されている（ ＭｕｒｒａｙとＧａ１ｕｓｋａの米国
特許第４６３９３７２号）、シかし、いずれのポリペプ
チドがアイメリア・テネルラの攻撃に対して鶏を保護す
るのであるかは確定されていない。
組換えＤＮＡの技術により免疫原アイメリアポリペプチ
ドの同定ならびにワクチン開発のだめに十分な量の該ポ
リペプチドの生産が可能となった。Ｎｅｗｍａｎ等の欧
州特許願第１６４１７６号明細書にはｌ ７０００ダル
トンと８０００ダルトンの２つの亜単位からなる２５０
００ダルトンのポリペプチドがアイメリア・テネルラか
ら単離されたことが記載されている。この２５０００ダ
ルトンのポリペプチドはゲノムＤＮＡクローンを使用し
た組換えＤＮＡの技術によってつくられたものであり、
そしてアイメリア・テネルラに起因するコクチジウム病
に対して鶏を保護することが判明している。また、別の
免疫原アイメリア・テネルラボリペブチドがＡｎｄｅｒ
ｓｏｎとＭｃＣａｎｄｌｉｓｓの特許協力条約出願Ｗ
０８６７００５２８号明細書に開示されている。このペ
プチドは２８０のアミノ酸が配列されて構成されている
ものであり、組換えＤＮＡ技術により、接合子嚢ゲノム
ＤＮＡクローンと全接合子嚢ｍＲＮＡから単離されたク
ローンとの両者から製造された。そして鶏をコクチジウ
ム病に対して保護することが判明している。さらに、Ｃ
１ａｒｋ等はその論文［Ｍｏ１．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅ
＋＋＋。
ドの同定ならびにワクチン開発のだめに十分な量の該ポ
リペプチドの生産が可能となった。Ｎｅｗｍａｎ等の欧
州特許願第１６４１７６号明細書にはｌ ７０００ダル
トンと８０００ダルトンの２つの亜単位からなる２５０
００ダルトンのポリペプチドがアイメリア・テネルラか
ら単離されたことが記載されている。この２５０００ダ
ルトンのポリペプチドはゲノムＤＮＡクローンを使用し
た組換えＤＮＡの技術によってつくられたものであり、
そしてアイメリア・テネルラに起因するコクチジウム病
に対して鶏を保護することが判明している。また、別の
免疫原アイメリア・テネルラボリペブチドがＡｎｄｅｒ
ｓｏｎとＭｃＣａｎｄｌｉｓｓの特許協力条約出願Ｗ
０８６７００５２８号明細書に開示されている。このペ
プチドは２８０のアミノ酸が配列されて構成されている
ものであり、組換えＤＮＡ技術により、接合子嚢ゲノム
ＤＮＡクローンと全接合子嚢ｍＲＮＡから単離されたク
ローンとの両者から製造された。そして鶏をコクチジウ
ム病に対して保護することが判明している。さらに、Ｃ
１ａｒｋ等はその論文［Ｍｏ１．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅ
＋＋＋。
Ｐｒａｓｉｔ、 ２２．７９−８７（１９８７） ］で
発現ベクターλａｎ＋ｐ３を使用して大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内のアイメリア・テネルラ
（Ｅ、 ｔｅｎｅｌｌａ）からつくられたゲノムＤＮＡ
発現ライブラリーを最近開示している。アイメリア・テ
ネルラ免疫原を発現するクローンはつきとめられたが、
免疫原的作用について試験されたペプチドはない、アイ
メリア・テネルラ神主表面膜に各種の技術により標識を
つけて潜在的表面免疫原を特徴づけることが試みられた
［胃１ｓｈｅｒの論文、［Ｍｏ１．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
発現ベクターλａｎ＋ｐ３を使用して大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内のアイメリア・テネルラ
（Ｅ、 ｔｅｎｅｌｌａ）からつくられたゲノムＤＮＡ
発現ライブラリーを最近開示している。アイメリア・テ
ネルラ免疫原を発現するクローンはつきとめられたが、
免疫原的作用について試験されたペプチドはない、アイ
メリア・テネルラ神主表面膜に各種の技術により標識を
つけて潜在的表面免疫原を特徴づけることが試みられた
［胃１ｓｈｅｒの論文、［Ｍｏ１．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
Ｐａｒａｓｉｔ、 ２１．７−１５（１９８６） １．
抗−アイメリア・テネルラ抗体と反応した主表面ポリペ
プチドは下記の分子量範囲にあるものであった＋ Ｉ
ｌ ３−９６ ｋｏ、７３−６７に０．５４−４２ｋＤ
。３７−３２ｋＤ、１８−１４ｋＤ。
抗−アイメリア・テネルラ抗体と反応した主表面ポリペ
プチドは下記の分子量範囲にあるものであった＋ Ｉ
ｌ ３−９６ ｋｏ、７３−６７に０．５４−４２ｋＤ
。３７−３２ｋＤ、１８−１４ｋＤ。
本発明は免疫原性を有する新規なアイメリア膜結合タン
パク質を同定し、精製しかつ特徴づけだものである。膜
結合タンパク質の細胞内位置は洗浄剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
１１４中でのその分離特性および疎水性糖脂質アンカー
（ａｎｃｈｏｒｌのタンパク質の一部分上に存在するこ
とによって特徴づけられる。洗浄剤相タンパク質に対し
て生成した抗血清は特異的にアイメリア種虫の表面と反
応する。このアイメリアタンパク質は家禽類をコクチジ
ウム病から保護することができる。
パク質を同定し、精製しかつ特徴づけだものである。膜
結合タンパク質の細胞内位置は洗浄剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
１１４中でのその分離特性および疎水性糖脂質アンカー
（ａｎｃｈｏｒｌのタンパク質の一部分上に存在するこ
とによって特徴づけられる。洗浄剤相タンパク質に対し
て生成した抗血清は特異的にアイメリア種虫の表面と反
応する。このアイメリアタンパク質は家禽類をコクチジ
ウム病から保護することができる。
したがって、本発明の１つの目的は鶏をコクチリウム病
に対して免疫化するために用いることのできるアイメリ
ア種の新規な膜結合タンパク質を提供することである。
に対して免疫化するために用いることのできるアイメリ
ア種の新規な膜結合タンパク質を提供することである。
本発明のいま１つの目的は胞子化してない接合子嚢、胞
子化した接合子嚢および積出の膜と特異的に結合した免
疫原タンパク質を提供することである。
子化した接合子嚢および積出の膜と特異的に結合した免
疫原タンパク質を提供することである。
本発明のさらにいま１つの目的はこれらの膜結合免疫原
タンパク質を得る手段を提供することである。
タンパク質を得る手段を提供することである。
本発明のさらにいま１つの目的は主として家禽類のコク
チジウム病の原因となるアイメリアに属する種に対して
保護作用を示すコクチジウム病ワクチンを提供すること
である。
チジウム病の原因となるアイメリアに属する種に対して
保護作用を示すコクチジウム病ワクチンを提供すること
である。
さらにいま１つの目的はこのタンパク質免疫原を予防的
に投与するための組成物を提供することである。
に投与するための組成物を提供することである。
本発明の上記ならびその他の目的は以下の記載からさら
に明らかになろう。
に明らかになろう。
本発明は、天然のまたは組換えによって得られた、精製
された膜結合タンパク質免疫原、ならびに未胞子化また
は胞子化アイメリア接合子嚢あるいは積出と結合したそ
のタンパク質の微小異形型または亜単位免疫原型をベー
スとしたコクチジウム病ワクチンに関する。ここで天然
タンパク質とは宿主内の適当なアイメリア種によって生
産された完全な長さのタンパク質のことをいう、さらに
天然タンパク質という言葉は、タンパク質および最初か
ら糖脂質膜付着アンカーに結合していた付加炭水化物を
含むものと理解されたい［Ｌｏｗの論文、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｊ、 ２４４．１−１３［１９８７）） 、組換え
により得るとは所望のタンパク質の遺伝子（ｇｅｎｅ）
の単離ならびに精製されたその遺伝子を所望のタンパク
質を過剰に生産するであろう細菌または他の細胞型を構
成するために使用することを意味する。亜単位免疫原型
とは本来の免疫原よりも少ないアミノ酸を有するもので
あるが、しかし免疫原の免疫作用個所は含有している免
疫原タンパク質、ポリペプチドまたは糖タンパク質の一
部分と定義される。また、本明細書でいう微小異形型と
は単一遺伝子産物、すなわち。
された膜結合タンパク質免疫原、ならびに未胞子化また
は胞子化アイメリア接合子嚢あるいは積出と結合したそ
のタンパク質の微小異形型または亜単位免疫原型をベー
スとしたコクチジウム病ワクチンに関する。ここで天然
タンパク質とは宿主内の適当なアイメリア種によって生
産された完全な長さのタンパク質のことをいう、さらに
天然タンパク質という言葉は、タンパク質および最初か
ら糖脂質膜付着アンカーに結合していた付加炭水化物を
含むものと理解されたい［Ｌｏｗの論文、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｊ、 ２４４．１−１３［１９８７）） 、組換え
により得るとは所望のタンパク質の遺伝子（ｇｅｎｅ）
の単離ならびに精製されたその遺伝子を所望のタンパク
質を過剰に生産するであろう細菌または他の細胞型を構
成するために使用することを意味する。亜単位免疫原型
とは本来の免疫原よりも少ないアミノ酸を有するもので
あるが、しかし免疫原の免疫作用個所は含有している免
疫原タンパク質、ポリペプチドまたは糖タンパク質の一
部分と定義される。また、本明細書でいう微小異形型と
は単一遺伝子産物、すなわち。
翻訳に続いて構造的に変更されたＤＮＡの１つの遺伝子
単位から生産されたタンパク質のことをいう。ただし、
かかる構造的変更はそのタンパク質の免疫原作用になん
ら重大な変化をもたらさないものとする。このような変
更は寄生体の体内でも、また単離、精製の段階でも起こ
りつる。生体内の変更には、限定的ではないが、Ｎ−末
端のアセチル化、タンパク質分解、グリコジル化または
ホスホリル化などがある。タンパク質分解すなわちプロ
テオリシスにはエキツブロチオリシスが含まれる。この
場合には、１つまたはそれ以上の末端アミノ酸が順に、
酵素的に開裂して元の遺伝単位産物よりもアミノ酸の数
が少ない微小異形型がつくられる。さらにプロテオリシ
スにはエンドブロチオリシスも含まれ、この場合にはア
ミノ酸配列内の特定の位置でペプチドを開裂させるエン
ドプロテアーゼの作用による異形型が生じる。同様な変
形が精製工程においても起こり、微小異形型が生じる。
単位から生産されたタンパク質のことをいう。ただし、
かかる構造的変更はそのタンパク質の免疫原作用になん
ら重大な変化をもたらさないものとする。このような変
更は寄生体の体内でも、また単離、精製の段階でも起こ
りつる。生体内の変更には、限定的ではないが、Ｎ−末
端のアセチル化、タンパク質分解、グリコジル化または
ホスホリル化などがある。タンパク質分解すなわちプロ
テオリシスにはエキツブロチオリシスが含まれる。この
場合には、１つまたはそれ以上の末端アミノ酸が順に、
酵素的に開裂して元の遺伝単位産物よりもアミノ酸の数
が少ない微小異形型がつくられる。さらにプロテオリシ
スにはエンドブロチオリシスも含まれ、この場合にはア
ミノ酸配列内の特定の位置でペプチドを開裂させるエン
ドプロテアーゼの作用による異形型が生じる。同様な変
形が精製工程においても起こり、微小異形型が生じる。
精製の間に起こる最も一般的な変化はタンパク質分解で
あり、これは通常プロテアーゼ抑制剤を使用することに
よって最少限におさえることができる。
あり、これは通常プロテアーゼ抑制剤を使用することに
よって最少限におさえることができる。
本発明はさらに各タンパク質の遺伝情報の単離と精製、
および対応する免疫原タンパク質の発現方法に関する。
および対応する免疫原タンパク質の発現方法に関する。
ここでいうポリペプチドまたはタンパク質とはアミド結
合により相互に結合されたアミノ酸の線状重合体である
。鎖の中のアミノ酸の配列がそのタンパク質またはポリ
ペプチドの生物学的機能の上で特に重要である。なお、
ここではポリペプチドとタンパク質は互換可能な言葉と
して使用されている。また、ここでいう免疫原とは動物
体内に入れられた時に本来の体液性右よび／または細胞
性免疫応答、すなわちその動物を特定の感染から保護す
る免疫を刺激促進するような分子または巨大分子のこと
である０本発明の場合では、免疫原はコクチジウム病を
ひき起こすアイメリアの感染から家禽類を保護する免疫
応答、すなわち体液性免疫、細胞性免疫または両者をも
たらす。
合により相互に結合されたアミノ酸の線状重合体である
。鎖の中のアミノ酸の配列がそのタンパク質またはポリ
ペプチドの生物学的機能の上で特に重要である。なお、
ここではポリペプチドとタンパク質は互換可能な言葉と
して使用されている。また、ここでいう免疫原とは動物
体内に入れられた時に本来の体液性右よび／または細胞
性免疫応答、すなわちその動物を特定の感染から保護す
る免疫を刺激促進するような分子または巨大分子のこと
である０本発明の場合では、免疫原はコクチジウム病を
ひき起こすアイメリアの感染から家禽類を保護する免疫
応答、すなわち体液性免疫、細胞性免疫または両者をも
たらす。
アイメリア接合子嚢は種類に応じて４乃至１０日前に約
７．５ｘｌＯ’個の胞子化（胞子を形成した）接合子嚢
で経口的に感染させた鶏の糞便または盲腸の内容物から
単離される。盲腸の内容物または糞はＷａｒｉｎｇ Ｂ
ｌｅｎｄｅｒ混合器の蒸留水の中でタンパク質分解酵素
、好ましくはペプシンを使用して、約２０ｍｇ／＋＋＋
ｌ、ｐＨ２，０で消化される。破片とペプシンを蒸留水
の中の遠心分離で除去する。あるでいと純粋な接合子嚢
留分を約１．１モルのスクロース液中のフロチージョン
によって集める［Ｊａｃｋｓｏｎの論文、Ｐａｒａｓｉ
ｔｏｌ、 ５４ 、８７−９３１１９６４）］ 、そし
てさらに約５乃至６％濃度。
７．５ｘｌＯ’個の胞子化（胞子を形成した）接合子嚢
で経口的に感染させた鶏の糞便または盲腸の内容物から
単離される。盲腸の内容物または糞はＷａｒｉｎｇ Ｂ
ｌｅｎｄｅｒ混合器の蒸留水の中でタンパク質分解酵素
、好ましくはペプシンを使用して、約２０ｍｇ／＋＋＋
ｌ、ｐＨ２，０で消化される。破片とペプシンを蒸留水
の中の遠心分離で除去する。あるでいと純粋な接合子嚢
留分を約１．１モルのスクロース液中のフロチージョン
によって集める［Ｊａｃｋｓｏｎの論文、Ｐａｒａｓｉ
ｔｏｌ、 ５４ 、８７−９３１１９６４）］ 、そし
てさらに約５乃至６％濃度。
好ましくは５．２５％濃度の次亜塩素酸ナトリウム水溶
液中で、４℃の温度で約１０分間培養処理する。約ｐＨ
７，６の無菌リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中で数回
法７て次亜塩素酸ナトリウムを除去すると精製された無
菌接合子嚢が得られる。リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ
）に抗生物質／抗菌物質（Ｇｉｂｃｏ）を加えた液中的
２ｘｌＯ’／ｍｌの接合子嚢は振動水浴内約２９℃の温
度で約３６時間放置すると胞子となる［ Ｅｄｇａｒの
論文、 Ｔｒａｎｓ、 Ａ＋ｓ。
液中で、４℃の温度で約１０分間培養処理する。約ｐＨ
７，６の無菌リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中で数回
法７て次亜塩素酸ナトリウムを除去すると精製された無
菌接合子嚢が得られる。リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ
）に抗生物質／抗菌物質（Ｇｉｂｃｏ）を加えた液中的
２ｘｌＯ’／ｍｌの接合子嚢は振動水浴内約２９℃の温
度で約３６時間放置すると胞子となる［ Ｅｄｇａｒの
論文、 Ｔｒａｎｓ、 Ａ＋ｓ。
Ｍｉｃｒ、 Ｓａｃ、 ６２．２３７−２４２ （１９
５４１１。
５４１１。
神主（スポロゾイト）は胞子化接合子嚢からＰａｔｔｏ
ｎと Ｂｒｉｇｎ＋ａｎの方法ｒＰａｒａｓｉｔｏ１．
６５゜５２６−５３０ （１９７９） ！’照１にＤｕ
ｌｓｋｉとＴｕｒｎｅｒの変更［Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ、３２．２３５−２３９（１９８８）参照ｌを
加えてつくられる。すなわち、胞子化接合子嚢なＰＢ５
１ｍｌ当り約１ｘｌｏ”細胞の割合で約３ＩＩＩｍのガ
ラス玉と一緒に振りまぜることにより破壊させる。胞子
前を約５０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌ）中、約１００
００ｘｇで約１分間乃至約１７６００ｘｇで約２０分間
の密度勾配遠心分離で精製する。ベレットになった胞子
前、約１ｘｌＯ’細胞／ａＩｌをトリプシン約０．２５
％、タウロデオキシコール酸約４％、 ＭｇＣｔ、 １
０ミリモルからなる包嚢脱出液に再懸濁して約４１”Ｃ
の温度で約６０分間培養する。放出された神主を約１０
分間、７ＱＯｘｇで遠心分離し、再度ＰＢＳ内で洗い、
このベレットを約１ｘｌｏ”細胞／ｍｌの密度で約５０
％のパーコールに再懸濁しそして再度遠心分離する。こ
の精製された神主をＰＥＳの中で洗って遠心分離で集め
る。
ｎと Ｂｒｉｇｎ＋ａｎの方法ｒＰａｒａｓｉｔｏ１．
６５゜５２６−５３０ （１９７９） ！’照１にＤｕ
ｌｓｋｉとＴｕｒｎｅｒの変更［Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ、３２．２３５−２３９（１９８８）参照ｌを
加えてつくられる。すなわち、胞子化接合子嚢なＰＢ５
１ｍｌ当り約１ｘｌｏ”細胞の割合で約３ＩＩＩｍのガ
ラス玉と一緒に振りまぜることにより破壊させる。胞子
前を約５０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌ）中、約１００
００ｘｇで約１分間乃至約１７６００ｘｇで約２０分間
の密度勾配遠心分離で精製する。ベレットになった胞子
前、約１ｘｌＯ’細胞／ａＩｌをトリプシン約０．２５
％、タウロデオキシコール酸約４％、 ＭｇＣｔ、 １
０ミリモルからなる包嚢脱出液に再懸濁して約４１”Ｃ
の温度で約６０分間培養する。放出された神主を約１０
分間、７ＱＯｘｇで遠心分離し、再度ＰＢＳ内で洗い、
このベレットを約１ｘｌｏ”細胞／ｍｌの密度で約５０
％のパーコールに再懸濁しそして再度遠心分離する。こ
の精製された神主をＰＥＳの中で洗って遠心分離で集め
る。
変形血糖タンパク質（ＶＳＧｓ）の単離のためおよびホ
スファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼＣ類似
作用物質 （Ｐ Ｉ ＰＬＣ，Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ）の単
離のためにはＣｒｏｓｓ等によりＰａｒａｓｉｔｏｌ、
７１゜３９４−４１７ ＋１９７５１に記載された。
スファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼＣ類似
作用物質 （Ｐ Ｉ ＰＬＣ，Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ）の単
離のためにはＣｒｏｓｓ等によりＰａｒａｓｉｔｏｌ、
７１゜３９４−４１７ ＋１９７５１に記載された。
抗原型１１１ＴａＲ１を示すトリバノゾーム、ｋｕｙ巨
肥懸ｂｒｕｃｅｊのクローン細胞系統、およびＭｉｌｌ
ｅｒとｔｕｒｎｅｒによりＰａｒａｓｉｔｏｌ、 ８２
．６３−８０（１９８１）に記載された、ＩＬＴａＲ１
血清デームが使用される［Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅａｐ
、 ２６１．１３８１３−１３８１９（１９８６１参照
１．トリバノゾームは［、ａｎｈａｍとＧｏｄｆｒｅｙ
の方法 ［Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、 ２８
． ５２１−５３４（１９７０） 参照１により感染ラ
ットの血液から精製される。可溶性ＶＳＧ （ｓＶＳＧ
）の標準製剤と脱型ＶＳＧ （＠ｆＶｓＧ）とはそれぞ
れＣｒｏｓｓの方法［Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 ２４．７９−９０＋１９８４） ｌ と、Ｇｕｒｎ
ｅｔ、を等の方法［Ｊ、 Ｍｏｌ。
肥懸ｂｒｕｃｅｊのクローン細胞系統、およびＭｉｌｌ
ｅｒとｔｕｒｎｅｒによりＰａｒａｓｉｔｏｌ、 ８２
．６３−８０（１９８１）に記載された、ＩＬＴａＲ１
血清デームが使用される［Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅａｐ
、 ２６１．１３８１３−１３８１９（１９８６１参照
１．トリバノゾームは［、ａｎｈａｍとＧｏｄｆｒｅｙ
の方法 ［Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、 ２８
． ５２１−５３４（１９７０） 参照１により感染ラ
ットの血液から精製される。可溶性ＶＳＧ （ｓＶＳＧ
）の標準製剤と脱型ＶＳＧ （＠ｆＶｓＧ）とはそれぞ
れＣｒｏｓｓの方法［Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 ２４．７９−９０＋１９８４） ｌ と、Ｇｕｒｎ
ｅｔ、を等の方法［Ｊ、 Ｍｏｌ。
ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ｐａｒａｓｉｔｏｌ、
２０． １−１３（１９８６１）により製造される
。活性トリバノゾームリパーゼを含有するＴ、 ｂｒｕ
ｃｅｉの半精製製剤はＭＩＴａＴｌ、６ トリパノゾー
ムからあるいは適当な工、ｂｒｕｃｅｉクローンから製
造される。トリバノゾームは約０．３ミリモルＣａ（：
１＊中。
２０． １−１３（１９８６１）により製造される
。活性トリバノゾームリパーゼを含有するＴ、 ｂｒｕ
ｃｅｉの半精製製剤はＭＩＴａＴｌ、６ トリパノゾー
ムからあるいは適当な工、ｂｒｕｃｅｉクローンから製
造される。トリバノゾームは約０．３ミリモルＣａ（：
１＊中。
約１ｘｌｏ”細胞／ｓｓｌの密度、そして約０℃の温度
で約５分間溶解される。溶解物を約３０００ｘｇで約５
分間遠心分離し、その上澄み液を除去しそしてベレット
を、約０． １ミリモルのＮａ−ｐ−トシル−１−リジ
ンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）と０．１ミリモルの
ジチオトレイトール（ＤＴｒ）を含有している約１０ミ
リモルのリン酸ナトリウム中に、約１ｘ１０”細胞７ｓ
１に相当する密度で再懸濁する。この混合物を約３７℃
の温度で約１５分間培養し、その後約０℃まで急冷し約
１１００Ｏｘで約１５分間遠心分離する。このベレット
を約２．５Ｘ１０’細胞／ｍｌ相当の密度で、５０モリ
モルＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−２−
エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ） 、 １ミルモルＤＤ
Ｔ、０．１ミリモルＴ Ｌ ＣＫの溶液中で２回洗い、
そして約１、０００００ ｘ ｇで約１時間遠心分離す
る。
で約５分間溶解される。溶解物を約３０００ｘｇで約５
分間遠心分離し、その上澄み液を除去しそしてベレット
を、約０． １ミリモルのＮａ−ｐ−トシル−１−リジ
ンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）と０．１ミリモルの
ジチオトレイトール（ＤＴｒ）を含有している約１０ミ
リモルのリン酸ナトリウム中に、約１ｘ１０”細胞７ｓ
１に相当する密度で再懸濁する。この混合物を約３７℃
の温度で約１５分間培養し、その後約０℃まで急冷し約
１１００Ｏｘで約１５分間遠心分離する。このベレット
を約２．５Ｘ１０’細胞／ｍｌ相当の密度で、５０モリ
モルＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−２−
エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ） 、 １ミルモルＤＤ
Ｔ、０．１ミリモルＴ Ｌ ＣＫの溶液中で２回洗い、
そして約１、０００００ ｘ ｇで約１時間遠心分離す
る。
このベレットをほぼ同じ体積、約３．３ｘ１０ｇ細胞等
価物１５０ミリモルＨｅｐｅｓ １ ｍｌの密度、約ｐ
Ｈ７，４，約１％のＮ−才クチル−〇−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ｎ０Ｇ）に再懸濁しそして再度的１０００００
ｘｇで約１時間遠心分離する。最終的上澄み液は活性リ
パーゼを含有しており、これは使用前に約５０ミリモリ
Ｈｅｐｅｓ 、約ｐＨ７，４，約１％のｎＯＧを含有す
る液で約１：ｌＯに稀釈される。この留分をＴ、 ｂｒ
ｕｃｅｉ リパーゼという。
価物１５０ミリモルＨｅｐｅｓ １ ｍｌの密度、約ｐ
Ｈ７，４，約１％のＮ−才クチル−〇−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ｎ０Ｇ）に再懸濁しそして再度的１０００００
ｘｇで約１時間遠心分離する。最終的上澄み液は活性リ
パーゼを含有しており、これは使用前に約５０ミリモリ
Ｈｅｐｅｓ 、約ｐＨ７，４，約１％のｎＯＧを含有す
る液で約１：ｌＯに稀釈される。この留分をＴ、 ｂｒ
ｕｃｅｉ リパーゼという。
アイメリア溶解物は未胞子化接合子嚢または胞子化接合
子前約５ ｘ １０ ’ ／ｎｇｌを水に懸濁しそして
直径的３ｍｍのガラス玉と一緒に渦巻ミキサーを使用し
て室温で約５分間攪拌することによって製造される。こ
の懸濁物を接合子嚢と胞子嚢が完全に破裂されているか
否かを顕微鏡で調べ、必要ならば、さらに５分間撹拌し
て完全に溶解させる。神主は約４ｘ１０”／ｍｌの密度
で水に懸濁して超音波破壊で溶解させる８ 抗−交差反応決定因子（ＣＨＤ）抗体はうさぎにＰＢＳ
約２５０ｕｊ２中精製ＩＬＴａｔ１．２５ｓＶＳＧ約１
ｍｇを注射することにより得られる。これを許容アジュ
バントで均質化し、１匹またはそれ以上のうさぎの背中
の複数個所に皮下注射する。約２週間後に、ＰＢＳ約２
５０ｕ９中５ＶＳＧ約１ ｍｇ（７）液の２回目の注射
を行なう、最後の注射の２週間後に血液を採取しそして
標準方法で血清を単離する。この血清を集めｐＨ約８．
０のホウ酸塩０．１モル溶液でｌ：１の割合で稀釈しそ
してＲｅａｃｔｉ Ｇｅｌ ６Ｘ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社）に結合されたＭＩＴａｔｌ、６ｓＶ
ＳＧの異種構造５ＶＳＧカラムに通す。貫通流を廃棄し
そして抗−ＣＨＤ抗体をｐＨ約２．４．約０．１ミリモ
ルのグリシン−ＨＣｌ溶液を使用して溶離する。この抗
体はウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇｌのために約１＝５０に稀釈して、約４ｕ
ｇ／ｍｌの量で使用される。
子前約５ ｘ １０ ’ ／ｎｇｌを水に懸濁しそして
直径的３ｍｍのガラス玉と一緒に渦巻ミキサーを使用し
て室温で約５分間攪拌することによって製造される。こ
の懸濁物を接合子嚢と胞子嚢が完全に破裂されているか
否かを顕微鏡で調べ、必要ならば、さらに５分間撹拌し
て完全に溶解させる。神主は約４ｘ１０”／ｍｌの密度
で水に懸濁して超音波破壊で溶解させる８ 抗−交差反応決定因子（ＣＨＤ）抗体はうさぎにＰＢＳ
約２５０ｕｊ２中精製ＩＬＴａｔ１．２５ｓＶＳＧ約１
ｍｇを注射することにより得られる。これを許容アジュ
バントで均質化し、１匹またはそれ以上のうさぎの背中
の複数個所に皮下注射する。約２週間後に、ＰＢＳ約２
５０ｕ９中５ＶＳＧ約１ ｍｇ（７）液の２回目の注射
を行なう、最後の注射の２週間後に血液を採取しそして
標準方法で血清を単離する。この血清を集めｐＨ約８．
０のホウ酸塩０．１モル溶液でｌ：１の割合で稀釈しそ
してＲｅａｃｔｉ Ｇｅｌ ６Ｘ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社）に結合されたＭＩＴａｔｌ、６ｓＶ
ＳＧの異種構造５ＶＳＧカラムに通す。貫通流を廃棄し
そして抗−ＣＨＤ抗体をｐＨ約２．４．約０．１ミリモ
ルのグリシン−ＨＣｌ溶液を使用して溶離する。この抗
体はウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇｌのために約１＝５０に稀釈して、約４ｕ
ｇ／ｍｌの量で使用される。
アイメリア未胞子化接合子嚢、胞子化接合子嚢および神
主の溶解物の約２μβを Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼで処理する。この溶解物を
約１０％のｎＯＧ、 １ミリモルのフェニルメタンスル
ホニルフッ化物（ＰＭＳＦ） 、１０ミリモルのＴＬＣ
Ｋを含有するｐＨ７，４の約５００ミリモルのＨｅｐｅ
ｓからなる緩衝液約２μβと混合する。１ｘｌＯ”細胞
に相当するリパーゼを溶解物に添加して、約３７℃で約
２０分間培養する。培養に続いて各試料にＬａｅａ＋ｍ
ｌｉサンプル緩衝液（後記参照）を添加しそして３分間
煮沸する。この後、Ｌａｅｍ厘１１の方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ ２２７．６３０−６８４（１９７０）］により７乃
至２０％のアクリルアミドを含有する勾配ゲル上でドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤ（：）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行なう、電気泳動実施後、タ
ンパク質な染料、コオマシーブリリアントブルーＲ （Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ
Ｒ）で染色して特性化するかまたはニトロセルロース
に移し１次ぎに抗体を使用して検出を行なう、後者の方
法はＴｏｗｂｉｎ等の方法によるウェスタンブロッティ
ングとして当技術分野で公知である［ Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ４３０−
４３５ （１９７９）参照１．移転された溶解物をＶＳ
Ｇ糖脂質アンカーの炭水化物部分と特異的に反応する抗
ＣＲＤ抗体と反応させる。結合抗体は （１１１１１］
タンパク質Ａ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）約１ｘ１０’カウ
ント／分／ ｎｉｌ、 ３０ ｍｃｉ／ｍｇタンパク質
の添加とそれに続くオートラジオグラフィーによって検
出される。溶解物はすべて抗ＣＲＤ抗体と結合しつるが
、結合は溶解物をＴ、 ｂｒｕｃｅｉ リパーゼで処理
した後においてのみ起こる。
主の溶解物の約２μβを Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼで処理する。この溶解物を
約１０％のｎＯＧ、 １ミリモルのフェニルメタンスル
ホニルフッ化物（ＰＭＳＦ） 、１０ミリモルのＴＬＣ
Ｋを含有するｐＨ７，４の約５００ミリモルのＨｅｐｅ
ｓからなる緩衝液約２μβと混合する。１ｘｌＯ”細胞
に相当するリパーゼを溶解物に添加して、約３７℃で約
２０分間培養する。培養に続いて各試料にＬａｅａ＋ｍ
ｌｉサンプル緩衝液（後記参照）を添加しそして３分間
煮沸する。この後、Ｌａｅｍ厘１１の方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ ２２７．６３０−６８４（１９７０）］により７乃
至２０％のアクリルアミドを含有する勾配ゲル上でドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤ（：）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行なう、電気泳動実施後、タ
ンパク質な染料、コオマシーブリリアントブルーＲ （Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ
Ｒ）で染色して特性化するかまたはニトロセルロース
に移し１次ぎに抗体を使用して検出を行なう、後者の方
法はＴｏｗｂｉｎ等の方法によるウェスタンブロッティ
ングとして当技術分野で公知である［ Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ４３０−
４３５ （１９７９）参照１．移転された溶解物をＶＳ
Ｇ糖脂質アンカーの炭水化物部分と特異的に反応する抗
ＣＲＤ抗体と反応させる。結合抗体は （１１１１１］
タンパク質Ａ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）約１ｘ１０’カウ
ント／分／ ｎｉｌ、 ３０ ｍｃｉ／ｍｇタンパク質
の添加とそれに続くオートラジオグラフィーによって検
出される。溶解物はすべて抗ＣＲＤ抗体と結合しつるが
、結合は溶解物をＴ、 ｂｒｕｃｅｉ リパーゼで処理
した後においてのみ起こる。
アイメリア抗ＣＲＤ結合タンパク質の疎水性を試験する
ため、溶解物をＢｏｒｄｉｅｒの方法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅ＋＋＋、 ２５６．１６０４−１６０７（１
９８１）］によりＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４中で相分離さ
せる。この方法はＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４の曇り点で疎
水性タンパク質の大部分を含有する洗浄剤豊富留分と親
水性タンパク質の大部分を含有する洗浄剤貧乏留分とが
形成されるという利点がある。未胞子化または胞子化接
合子嚢の溶解物的２．５ｘｌＯ’細胞／ｍｕｓよび神主
の溶解物約２ｘ１０’細胞／ｍｌを約１％の予備濃縮Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ１１４ 、約ｌミリモルのＴｒｉｓ、ｐＨ
約７．４．約１５０ミリモルのＮａＣ１および約ｌミリ
モルのＰＭＳＦを含有する液中、約０℃の温度で約１時
間培養する。培養後、試料を約１ ｏｏｏｏｏｘｇで約
１時間遠心分離してその上澄み液を集める。このＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ１１４上澄み液を約１０ミリモルのＴｒｉｓ
、ｐＨ７，４と１５０ミリモルのＮａＣ１を含有してい
る約６％スクロース溶液の等最上に慎重に層展開させる
かまたはさらに処理を行なわずに培養する。約３０℃の
温度で約１５分間培養すると曇った溶液となる。この溶
液から約１０００ｘｇで約１５分間の遠心分離により相
分離させる。３つの相留分を集める。すなわち、最上の
水性相と、中間のスクロース相と、底の洗浄剤相の３つ
である。スクロースを使用しなかった場合には中間相は
存在しない、各留分を約４＠量の水冷アセトンで沈殿さ
せそして５Ｏ３−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング
による分析のための準備をする。
ため、溶解物をＢｏｒｄｉｅｒの方法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅ＋＋＋、 ２５６．１６０４−１６０７（１
９８１）］によりＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４中で相分離さ
せる。この方法はＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４の曇り点で疎
水性タンパク質の大部分を含有する洗浄剤豊富留分と親
水性タンパク質の大部分を含有する洗浄剤貧乏留分とが
形成されるという利点がある。未胞子化または胞子化接
合子嚢の溶解物的２．５ｘｌＯ’細胞／ｍｕｓよび神主
の溶解物約２ｘ１０’細胞／ｍｌを約１％の予備濃縮Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ１１４ 、約ｌミリモルのＴｒｉｓ、ｐＨ
約７．４．約１５０ミリモルのＮａＣ１および約ｌミリ
モルのＰＭＳＦを含有する液中、約０℃の温度で約１時
間培養する。培養後、試料を約１ ｏｏｏｏｏｘｇで約
１時間遠心分離してその上澄み液を集める。このＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ１１４上澄み液を約１０ミリモルのＴｒｉｓ
、ｐＨ７，４と１５０ミリモルのＮａＣ１を含有してい
る約６％スクロース溶液の等最上に慎重に層展開させる
かまたはさらに処理を行なわずに培養する。約３０℃の
温度で約１５分間培養すると曇った溶液となる。この溶
液から約１０００ｘｇで約１５分間の遠心分離により相
分離させる。３つの相留分を集める。すなわち、最上の
水性相と、中間のスクロース相と、底の洗浄剤相の３つ
である。スクロースを使用しなかった場合には中間相は
存在しない、各留分を約４＠量の水冷アセトンで沈殿さ
せそして５Ｏ３−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング
による分析のための準備をする。
抗血清はアイメリア種虫の洗浄剤相の内容物に対して製
造される。免疫化処置の開始前に抗体産生動物、好まし
くはうさぎから血液を採取しそして前免疫血清を単離し
て対照の目的で保存する。複数のうさぎに上記の洗浄剤
槽タンパク質免疫原を複数回免疫化注射する。１回につ
きタンパク質約２０μｇ乃８０μｇ、好ましくは約５０
μｇを注射する。最初の免疫化注射は許容アジュバント
を使用して１通常は免疫原とアジュバントを等量使用し
て行なう、許容アジュバントの例は完全フロインドアジ
ュバント、不完全フロインドアシュバンド、ミョウバン
沈殿物、 Ｃａｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ 巳■叩とｔＲＮＡを
含有する油中水型エマルジョンなどである。完全フロイ
ンドアジュバントを最初の免疫化のために使用するのが
好ましい、その後の増強免疫化の場合にはすべて不完全
フロインドアジュバントが好ましい、最初の免疫化はエ
マルジョン約１ｍｌをうさぎの背中の複数個所に皮下注
射することにより行なわれる。同じ量の免疫原を使用し
て行なわれる増強免疫化は約１ケ月の間隔でそして各う
さぎの血清に十分なレベルの抗体が存在するようになる
まで続けられる０通常は、約３０日乃至９０日である。
造される。免疫化処置の開始前に抗体産生動物、好まし
くはうさぎから血液を採取しそして前免疫血清を単離し
て対照の目的で保存する。複数のうさぎに上記の洗浄剤
槽タンパク質免疫原を複数回免疫化注射する。１回につ
きタンパク質約２０μｇ乃８０μｇ、好ましくは約５０
μｇを注射する。最初の免疫化注射は許容アジュバント
を使用して１通常は免疫原とアジュバントを等量使用し
て行なう、許容アジュバントの例は完全フロインドアジ
ュバント、不完全フロインドアシュバンド、ミョウバン
沈殿物、 Ｃａｒ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ 巳■叩とｔＲＮＡを
含有する油中水型エマルジョンなどである。完全フロイ
ンドアジュバントを最初の免疫化のために使用するのが
好ましい、その後の増強免疫化の場合にはすべて不完全
フロインドアジュバントが好ましい、最初の免疫化はエ
マルジョン約１ｍｌをうさぎの背中の複数個所に皮下注
射することにより行なわれる。同じ量の免疫原を使用し
て行なわれる増強免疫化は約１ケ月の間隔でそして各う
さぎの血清に十分なレベルの抗体が存在するようになる
まで続けられる０通常は、約３０日乃至９０日である。
採血して公知方法で血清を単離する。 ＴｒｉｔｏｎＸ
１１４洗浄剤相内に見出されたコクチジウムタンパク質
に対して得られた抗血清を抗ＴＸ１１４Ｂとよぶ、うさ
ぎ抗ＴＸ１１４Ｂ抗血清は未胞子化または胞子化接合子
嚢および神主からの抗原を使用したウェスタンブロッテ
ィング分析によって特性化され、神主を使用する間接免
疫フルオレセンスのために使用される。また、ｆＩ虫を
使用し７た凝集検査によって特性化される。ここで、抗
原とは抗体と結合しつる物質と定義される。上記のごと
き免疫原は特定の抗体を特性化するために使用された場
合には抗原と考えられる。
１１４洗浄剤相内に見出されたコクチジウムタンパク質
に対して得られた抗血清を抗ＴＸ１１４Ｂとよぶ、うさ
ぎ抗ＴＸ１１４Ｂ抗血清は未胞子化または胞子化接合子
嚢および神主からの抗原を使用したウェスタンブロッテ
ィング分析によって特性化され、神主を使用する間接免
疫フルオレセンスのために使用される。また、ｆＩ虫を
使用し７た凝集検査によって特性化される。ここで、抗
原とは抗体と結合しつる物質と定義される。上記のごと
き免疫原は特定の抗体を特性化するために使用された場
合には抗原と考えられる。
アセトンで沈殿させたアイメリア未胞子化または胞子化
接合子嚢の相分離溶解物はｎｏＧｌ％を含有するｐＨ７
，４のＨｅｐｅｓ ５０ミリモル溶液中に再懸濁される
（約１ｘｌＯ’細胞／２０μ２に相当）、水性相、中間
相、洗浄剤相はＴ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ（約５ Ｂ
ｉ！ ）で処理されそして５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウ
ェスタンブロッティング分析によって分析される１積山
試料も同様方法で、ただし約８ｘ１０６細胞／２０μｎ
＋Ｌ相当を使用して調製される。これら３つのすべての
段階からの抗ＣＲＤ結合タンパク質の大部分は底の洗浄
剤相に集められる。
接合子嚢の相分離溶解物はｎｏＧｌ％を含有するｐＨ７
，４のＨｅｐｅｓ ５０ミリモル溶液中に再懸濁される
（約１ｘｌＯ’細胞／２０μ２に相当）、水性相、中間
相、洗浄剤相はＴ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ（約５ Ｂ
ｉ！ ）で処理されそして５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウ
ェスタンブロッティング分析によって分析される１積山
試料も同様方法で、ただし約８ｘ１０６細胞／２０μｎ
＋Ｌ相当を使用して調製される。これら３つのすべての
段階からの抗ＣＲＤ結合タンパク質の大部分は底の洗浄
剤相に集められる。
上記溶解物をトリバノゾームリバーゼで処理すると疎水
性ＣＲＤ担持タンパク質が水溶性分子に変化する。溶解
物はリパーゼ処理にかける前または後でＴｒｉｔｏｎ
Ｘ１１４処理にかけられる。抗ＣＲＤ抗体によるウェス
タンブロッティング分析の結果は、リパーゼを相分離の
前に添加した場合には、ＣＨＤ保有保有タンパク一番上
の水性相内に見出され、そしてリパーゼを相分離の後で
添加した場合には、同じタンパク質が洗浄剤槽内に見出
されることを示している。抗ＣＲＤ抗体を抗ＴＸｌ１４
Ｂ抗血清に換えると、抗ＴＸ１１４Ｂによって認知され
るタンパク質のほとんどは、リパーゼ処理を相分離より
先に行なった場合には水性相に移行する。これらタンパ
ク質は抗ＣＲＤ抗体によって認知されるタンパク質と共
に移動するから、抗ＴＸ１１４Ｂによって認知されるタ
ンパク質のほとんどは糖脂質保有タンパク質であると結
論される。
性ＣＲＤ担持タンパク質が水溶性分子に変化する。溶解
物はリパーゼ処理にかける前または後でＴｒｉｔｏｎ
Ｘ１１４処理にかけられる。抗ＣＲＤ抗体によるウェス
タンブロッティング分析の結果は、リパーゼを相分離の
前に添加した場合には、ＣＨＤ保有保有タンパク一番上
の水性相内に見出され、そしてリパーゼを相分離の後で
添加した場合には、同じタンパク質が洗浄剤槽内に見出
されることを示している。抗ＣＲＤ抗体を抗ＴＸｌ１４
Ｂ抗血清に換えると、抗ＴＸ１１４Ｂによって認知され
るタンパク質のほとんどは、リパーゼ処理を相分離より
先に行なった場合には水性相に移行する。これらタンパ
ク質は抗ＣＲＤ抗体によって認知されるタンパク質と共
に移動するから、抗ＴＸ１１４Ｂによって認知されるタ
ンパク質のほとんどは糖脂質保有タンパク質であると結
論される。
抗ＣＲＤ抗体と抗ＴＸ１１４Ｂ抗体の両方と反応しつる
アイメリアタンパク質の分子量と等電点が決定された。
アイメリアタンパク質の分子量と等電点が決定された。
分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ニトロセルロースへの
移転、適当な抗体を使用したウェスタンブロッティング
による免疫検査によって決定された。適当な分子量制御
も含まれる１等電点はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌの方法［Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｌｌ、 ２５０．４００７−４０
２１（１９７５１９照１にＧｒｏｐｐｉの方法［Ｍｏ１
．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 １８゜４２９−４３７ （１
９８０）参照１に類似の変更を加えて二次元ゲルのウェ
スタンブロッティングによって決定された。これらの決
定操作に必要な抗体は上記した方法で製造された。この
方法で決定された結果は後記の表２に示されている。
移転、適当な抗体を使用したウェスタンブロッティング
による免疫検査によって決定された。適当な分子量制御
も含まれる１等電点はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌの方法［Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｌｌ、 ２５０．４００７−４０
２１（１９７５１９照１にＧｒｏｐｐｉの方法［Ｍｏ１
．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 １８゜４２９−４３７ （１
９８０）参照１に類似の変更を加えて二次元ゲルのウェ
スタンブロッティングによって決定された。これらの決
定操作に必要な抗体は上記した方法で製造された。この
方法で決定された結果は後記の表２に示されている。
間接的免疫フルオレセンス検査は熱不活性化した抗ＴＸ
１１４Ｂ抗血清を約ｌ：５０の割合で稀釈し、最終体積
を約２００μβとしたものを生きている精製神主約５ｘ
ｌＯ’とＰ Ｂ Ｓ中牛血清アルブミンＬ（ＢＳＡ）約
０．０５％（Ｗ／Ｖ）の液中、約４℃の温度で約１時間
反応させることにより実施される。この神主をＰＢＳ中
０．０５％ＢＳＡ溶液で３回洗浄しそして各洗浄の間に
約４℃の温度で約１０分間、１０００ｘｇで遠心分離し
てペレット化する。洗浄された積出を約２．５％のホル
ムアルデヒド溶液で約５分間固定し、ＰＢＳ中約０．０
５％のＢＳＡ溶液で２回洗浄しそして約１：１５に稀釈
したフロオレスセイン共役やぎ抗ウサギＩ ｇ Ｇ （
ＭｉｌｔｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品）を使用し
約４℃の温度で約３０分関東色する。ＰＢＳ中約０．０
５％のＢＳＡ溶液で３回洗浄した後１種虫を遠心分離で
集めて約５０ミリモルＴｒｉｓ−ＨＣＩ中約６６ ％（
Ｖ／Ｖ）グリセリンのｐｉ約９．０の溶液的２５Ｂ １
２に再懸濁し、位相顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察する
。抗−ＴＸ１１４Ｂ抗体で処理された積出は細胞面上に
拡散染色模様を示し、他方、前免疫血清はなんらバック
グランド免疫蛍光を現さない。
１１４Ｂ抗血清を約ｌ：５０の割合で稀釈し、最終体積
を約２００μβとしたものを生きている精製神主約５ｘ
ｌＯ’とＰ Ｂ Ｓ中牛血清アルブミンＬ（ＢＳＡ）約
０．０５％（Ｗ／Ｖ）の液中、約４℃の温度で約１時間
反応させることにより実施される。この神主をＰＢＳ中
０．０５％ＢＳＡ溶液で３回洗浄しそして各洗浄の間に
約４℃の温度で約１０分間、１０００ｘｇで遠心分離し
てペレット化する。洗浄された積出を約２．５％のホル
ムアルデヒド溶液で約５分間固定し、ＰＢＳ中約０．０
５％のＢＳＡ溶液で２回洗浄しそして約１：１５に稀釈
したフロオレスセイン共役やぎ抗ウサギＩ ｇ Ｇ （
ＭｉｌｔｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品）を使用し
約４℃の温度で約３０分関東色する。ＰＢＳ中約０．０
５％のＢＳＡ溶液で３回洗浄した後１種虫を遠心分離で
集めて約５０ミリモルＴｒｉｓ−ＨＣＩ中約６６ ％（
Ｖ／Ｖ）グリセリンのｐｉ約９．０の溶液的２５Ｂ １
２に再懸濁し、位相顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察する
。抗−ＴＸ１１４Ｂ抗体で処理された積出は細胞面上に
拡散染色模様を示し、他方、前免疫血清はなんらバック
グランド免疫蛍光を現さない。
抗−ＴＸ］１４Ｂ抗血清はア、イメリア神主を凝集させ
るように見えるので、抗体作用が免疫蛍光検査で確認さ
れた場合には、その抗血清を凝集作用について試験する
。凝集検査はリンボ（Ｌｉｎｂｏ） ９６丸底区画マイ
クロタイター皿を使用して実施される。イーグルの最少
必須媒質（ＭＥＭ）に稀釈した熱不活性化抗血清と精製
神主約２ｘｌＯ’細胞／区画との混合物的０．１ｍｌを
二重に接種しそして約４℃の温度で約１時間培養する。
るように見えるので、抗体作用が免疫蛍光検査で確認さ
れた場合には、その抗血清を凝集作用について試験する
。凝集検査はリンボ（Ｌｉｎｂｏ） ９６丸底区画マイ
クロタイター皿を使用して実施される。イーグルの最少
必須媒質（ＭＥＭ）に稀釈した熱不活性化抗血清と精製
神主約２ｘｌＯ’細胞／区画との混合物的０．１ｍｌを
二重に接種しそして約４℃の温度で約１時間培養する。
培養後、各区画にゲルタールアルデヒドの最終濃度が約
０，５％となるＭＥＭ中グルクールアルデヒド溶液約０
．０１ｍ１を加えそして各区画の内容物をカウンター、
Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ型を使用して
数える。前免疫およびＴＸｌ１４Ｂ血清の凝集力価曲線
は第１図に示されている。免疫血清は精製稚虫を強力に
凝集する。
０，５％となるＭＥＭ中グルクールアルデヒド溶液約０
．０１ｍ１を加えそして各区画の内容物をカウンター、
Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ ＺＢＩ型を使用して
数える。前免疫およびＴＸｌ１４Ｂ血清の凝集力価曲線
は第１図に示されている。免疫血清は精製稚虫を強力に
凝集する。
上記により得られた洗浄剤豊富留分を糖脂質複合タンパ
ク質の単離と精製のために使用する。タンパク質的５ａ
＋ｇのアリコートをアセトンのごときケトンを使用して
沈殿させる。
ク質の単離と精製のために使用する。タンパク質的５ａ
＋ｇのアリコートをアセトンのごときケトンを使用して
沈殿させる。
すなわち、洗浄剤豊富留分約１容量部に対して冷アセト
ン約４容量部を使用して約−２０℃の温度で一晩沈殿さ
せ、約１００００ｘｇで約１５分間遠心分離してペレッ
ト化する。
ン約４容量部を使用して約−２０℃の温度で一晩沈殿さ
せ、約１００００ｘｇで約１５分間遠心分離してペレッ
ト化する。
このペレットを緩衝液Ａに再懸濁する。この緩衝液は０
，０５％のＴＸｌｏｏを含有するｐＨ６，９のＢ１５−
Ｔｒｉｓすなわちビス［２−ヒドロキシエチル］イミノ
ートリス−［ヒドロキシメチル］−メタン約４ｏ＋１か
らなる。不溶物を約１３０００ｘｇで約２分間遠心分離
して除去する。そして上澄み液を陰イオン交換高性能液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかける、タンパク
質をバイオゲルＴＳＫ、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム （Ｂｉｏｒａｄ）に通じそして０．０５％のＴＸｌｏｏ
を含有するｐＨ５，８のＢ１５−Ｔｒｉｓの１００ミリ
モルで溶離する。集めた留分アリコートなＬａｅｍ■ｌ
ｉの方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分析しそして銀染色してそのタンパク質の数と分子量
を確定するかあるいはニトロセルロースに移転して抗Ｃ
ＲＤ抗血清で検査してその糖脂質を有するタンパク質を
同定する。主要糖脂質複合タンパク質の数と分子量がこ
れにより確認された。糖脂質複合タンパク質を含む留分
はタンパク質配列を調べるためまたは特定抗体の製造の
ために使用される。
，０５％のＴＸｌｏｏを含有するｐＨ６，９のＢ１５−
Ｔｒｉｓすなわちビス［２−ヒドロキシエチル］イミノ
ートリス−［ヒドロキシメチル］−メタン約４ｏ＋１か
らなる。不溶物を約１３０００ｘｇで約２分間遠心分離
して除去する。そして上澄み液を陰イオン交換高性能液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかける、タンパク
質をバイオゲルＴＳＫ、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム （Ｂｉｏｒａｄ）に通じそして０．０５％のＴＸｌｏｏ
を含有するｐＨ５，８のＢ１５−Ｔｒｉｓの１００ミリ
モルで溶離する。集めた留分アリコートなＬａｅｍ■ｌ
ｉの方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分析しそして銀染色してそのタンパク質の数と分子量
を確定するかあるいはニトロセルロースに移転して抗Ｃ
ＲＤ抗血清で検査してその糖脂質を有するタンパク質を
同定する。主要糖脂質複合タンパク質の数と分子量がこ
れにより確認された。糖脂質複合タンパク質を含む留分
はタンパク質配列を調べるためまたは特定抗体の製造の
ために使用される。
ニトロセルロースに移された試料を抗体処理に先立ちＴ
、 ｂｒｕｃｅｉ リパーゼで処理する。
、 ｂｒｕｃｅｉ リパーゼで処理する。
ニトロセルースをＥＤＴＡ約５ミリモルと塩化ナトリウ
ム約１５０ミリモルを含有しているｐＨ約７．４．約５
０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液で洗う、このセル
ロースをｐＨ約７．３．約２０ミリモルの１（ｅｐｅｓ
で洗浄しそして過剰の緩衝液を吸い取って除く、リパー
ゼ（前記のＴ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ）を約１％のｎ
−オクチルグルコシド１ｎＯＧ）を含有する。
ム約１５０ミリモルを含有しているｐＨ約７．４．約５
０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液で洗う、このセル
ロースをｐＨ約７．３．約２０ミリモルの１（ｅｐｅｓ
で洗浄しそして過剰の緩衝液を吸い取って除く、リパー
ゼ（前記のＴ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ）を約１％のｎ
−オクチルグルコシド１ｎＯＧ）を含有する。
約２０ミリモルのＨｅｐｅｓ 、 ｐＨ７，３のＨｅｐ
ｅｓ／ｎＯＧで１＝１０まで稀釈し全量を約３ｍｉとし
そして上記のニトロセルロースと一緒に泡のないプラス
チックの袋に封入する。これを時々撹拌しながら約３γ
℃の温度で約２時間培養する。リパーゼを捨てそしてニ
トロセルロースを抗ＣＲＤ抗体で検査する。このカラム
留分内のタンパク質の部分集合の糖脂質の性質が確認さ
れる。
ｅｓ／ｎＯＧで１＝１０まで稀釈し全量を約３ｍｉとし
そして上記のニトロセルロースと一緒に泡のないプラス
チックの袋に封入する。これを時々撹拌しながら約３γ
℃の温度で約２時間培養する。リパーゼを捨てそしてニ
トロセルロースを抗ＣＲＤ抗体で検査する。このカラム
留分内のタンパク質の部分集合の糖脂質の性質が確認さ
れる。
４つの主要糖脂質複合タンパク質のうちの１つ、２６ｋ
Ｄのものは根株ゲルによって示されるようにカラム留分
として純粋な形で得られる。このタンパク質は直接にア
ミノ末端配列分析のために使用される（表３）、そして
このタンパク質は鶏をコクチジウム病の感染から保護す
ることができる（表４）。
Ｄのものは根株ゲルによって示されるようにカラム留分
として純粋な形で得られる。このタンパク質は直接にア
ミノ末端配列分析のために使用される（表３）、そして
このタンパク質は鶏をコクチジウム病の感染から保護す
ることができる（表４）。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された精
製糖脂質複合クンバク質はタンパク質特異性抗体を製造
するために使用される。電気泳動に続いて、そのゲルを
２０％メタノールと７％酢酸中コマジーブリリアントブ
ルーＲ約０．１％の溶液で染色しそして約２０％のメタ
ノールと７％酢、酸で色を抜く。
製糖脂質複合クンバク質はタンパク質特異性抗体を製造
するために使用される。電気泳動に続いて、そのゲルを
２０％メタノールと７％酢酸中コマジーブリリアントブ
ルーＲ約０．１％の溶液で染色しそして約２０％のメタ
ノールと７％酢、酸で色を抜く。
関心のあるバンド域を切取り、凍結乾燥で乾燥し、リン
酸塩緩衝食塩水ＰＢＳの０．５ｍｌ中に浸して軟らかく
する。各０．５ｍｌのアリコートにタンパク質約３乃至
１５μｇを使用する。この精製されたタンパク質をアジ
ュバントと混合して上記したように動物に皮下注射する
。それらの動物にさらにブースター注射をしそ、して前
記したように抗血清を採集する。
酸塩緩衝食塩水ＰＢＳの０．５ｍｌ中に浸して軟らかく
する。各０．５ｍｌのアリコートにタンパク質約３乃至
１５μｇを使用する。この精製されたタンパク質をアジ
ュバントと混合して上記したように動物に皮下注射する
。それらの動物にさらにブースター注射をしそ、して前
記したように抗血清を採集する。
精製糖脂質複合タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の
解析は実質的に粉子の方法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｗ、 ２６２． １００３５−１００３８ （１
９８７）］によって行なわれる。すなわち、３２ｋＤタ
ンパク質と２９ｋＤタンパク質の試料をＬａｅｍｍｌ
ｒの方法により７乃至２０％ポリアクリルアミドゲル上
に分離させる。このゲルを移転緩衝液（Ｃａｐｓすなわ
ち３−［シクロへキシルアミノ］−１−プロパンスルホ
ン酸約ｌＯミリモル、メタノール約ｌＯ％、ＤＤＴ約５
ミリモルからなる）に約５分間浸漬しそして約０．５ア
ンペアの電流で約１時間半電気泳動によりポリビニルニ
フッ化物（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ、 ０
．４５ｇ １４細孔、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移転させ
る。このＰＶＤＦ膜を洗い、コマジ−ブリリアントブル
ーＲで染色し、色抜きして洗浄しそして自然乾燥する。
解析は実質的に粉子の方法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｗ、 ２６２． １００３５−１００３８ （１
９８７）］によって行なわれる。すなわち、３２ｋＤタ
ンパク質と２９ｋＤタンパク質の試料をＬａｅｍｍｌ
ｒの方法により７乃至２０％ポリアクリルアミドゲル上
に分離させる。このゲルを移転緩衝液（Ｃａｐｓすなわ
ち３−［シクロへキシルアミノ］−１−プロパンスルホ
ン酸約ｌＯミリモル、メタノール約ｌＯ％、ＤＤＴ約５
ミリモルからなる）に約５分間浸漬しそして約０．５ア
ンペアの電流で約１時間半電気泳動によりポリビニルニ
フッ化物（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ、 ０
．４５ｇ １４細孔、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移転させ
る。このＰＶＤＦ膜を洗い、コマジ−ブリリアントブル
ーＲで染色し、色抜きして洗浄しそして自然乾燥する。
関心バンド域を切取りそして配列を調べる。
上記により得られた天然または組換えによるアイメリア
膜結合免疫原の免疫投与量を家禽に投与する。免疫原の
鶏への投与は経口的または非経口的に実施されつる。ま
たは卵の殻を通して鶏の胚に接種してもよい、これらの
いずれかの経路による免疫原の投与は免疫原のみを与え
ること、および生理学的に許容される媒質を使用した溶
液または懸濁物として免疫原を与えることを包含する。
膜結合免疫原の免疫投与量を家禽に投与する。免疫原の
鶏への投与は経口的または非経口的に実施されつる。ま
たは卵の殻を通して鶏の胚に接種してもよい、これらの
いずれかの経路による免疫原の投与は免疫原のみを与え
ること、および生理学的に許容される媒質を使用した溶
液または懸濁物として免疫原を与えることを包含する。
生理学的に許容される媒質の例を非限定的に例示すれば
生理食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、リン酸塩緩衝サリン
グルコース、緩衝サリンなとである。非経口投与法の例
としては特に、筋肉的注射、腹膜的注射、皮下注射およ
び静脈注射などが本アイメリア膜結合免疫原の導入に適
当な方法として例示される。経口的に投与される免疫原
は水性溶液または懸濁物の形態でありうる。懸濁物は、
たとえば、ゼラチンやアルギン酸塩からなるゲルに本免
疫原を佇在させたものでありうる。経口的に投与される
免疫原はまた飼料の中に配６合することもできる。胚形
成された卵に１種またはそれ以上のアイメリア免疫原の
免疫量を注射して免疫化することもできる。筋肉内また
は皮下ワクチン接種の場合は、免疫原は許容されるアジ
ュバントと一緒に与えることもできる。許容されるアジ
ュバントの例を非限定的にあげれば、完全フロインドア
ジュバント、不完全フロインドアジュバント、複合エマ
ルジョン、無水油類、ミョウバン沈殿物、 Ｃａｒ ｎｅｂａｅｔｅｒｉｕｍ Ｌ■すとｔ−ＲＮＡ
を含有している油中水型エマルジョンなどである。好ま
しいアジュバントは免疫原がアルヒドロゲル口のごとき
水酸化アルミニウムと共に沈殿させたミョウバン沈殿物
である。鶏をアイメリア膜結合タンパク質免疫原で免疫
化するとコクチジウム病に対する免疫が得られる。
生理食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、リン酸塩緩衝サリン
グルコース、緩衝サリンなとである。非経口投与法の例
としては特に、筋肉的注射、腹膜的注射、皮下注射およ
び静脈注射などが本アイメリア膜結合免疫原の導入に適
当な方法として例示される。経口的に投与される免疫原
は水性溶液または懸濁物の形態でありうる。懸濁物は、
たとえば、ゼラチンやアルギン酸塩からなるゲルに本免
疫原を佇在させたものでありうる。経口的に投与される
免疫原はまた飼料の中に配６合することもできる。胚形
成された卵に１種またはそれ以上のアイメリア免疫原の
免疫量を注射して免疫化することもできる。筋肉内また
は皮下ワクチン接種の場合は、免疫原は許容されるアジ
ュバントと一緒に与えることもできる。許容されるアジ
ュバントの例を非限定的にあげれば、完全フロインドア
ジュバント、不完全フロインドアジュバント、複合エマ
ルジョン、無水油類、ミョウバン沈殿物、 Ｃａｒ ｎｅｂａｅｔｅｒｉｕｍ Ｌ■すとｔ−ＲＮＡ
を含有している油中水型エマルジョンなどである。好ま
しいアジュバントは免疫原がアルヒドロゲル口のごとき
水酸化アルミニウムと共に沈殿させたミョウバン沈殿物
である。鶏をアイメリア膜結合タンパク質免疫原で免疫
化するとコクチジウム病に対する免疫が得られる。
保護免疫は約１．Ｏｎｇ乃至１００μｇ、好ましくはｌ
ｏｏｎｇ乃至ｌＯμｇの投与により達成される。
ｏｏｎｇ乃至ｌＯμｇの投与により達成される。
以下、本発明を実施例によってさらに説明する。なお、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。
鶏に約７．５ｘｌＯ’個のアイメリア・テネルラ（Ｅ、
ｔｅｎｅｌｌａ）胞子化接合子嚢な経口的に感染させ
た。感染７日後に寄生体を盲腸から採集した。未胞子化
接合子嚢をＪａｃｋｓｏｎの方法（前記Ｊａｃｋｓｏｎ
の論文、１９６４年）によって製造した。簡単に説明す
ると、盲腸の内容物を均質化しそして３７℃の温度でペ
プシン（２０ｖａｇ／ ｍｌ、 ｐＨ２，０）で処理す
る。この未胞子化接合子嚢なペレット化しく１７０◎ｘ
ｇで１０分間遠心分離）そしてこれを１モルのスクロー
スに再懸濁する。遠心分離（１７００ｘｇで１０分間）
後、浮遊接合子嚢層を水に再懸濁してペレット化する（
１７００ｘｇで１０分間遠心分離）、このベレットを水
中で洗いそして５．２５％次亜塩素酸ナトリウム冷水溶
液に再懸濁する。氷上で１０分間培養後、５回水洗して
次亜塩素酸ナトリウムを除去する。この未胞子化接合子
嚢を最終的にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁す
る。この細胞［ＰＢＳプラス抗生物質／抗菌物質（Ｇｉ
ｂｃｏｌ中約２ｘｌＯ’／ｍｌｌを連続撹拌しながら２
９℃の温度で３６時間培養して胞子形成させた。
ｔｅｎｅｌｌａ）胞子化接合子嚢な経口的に感染させ
た。感染７日後に寄生体を盲腸から採集した。未胞子化
接合子嚢をＪａｃｋｓｏｎの方法（前記Ｊａｃｋｓｏｎ
の論文、１９６４年）によって製造した。簡単に説明す
ると、盲腸の内容物を均質化しそして３７℃の温度でペ
プシン（２０ｖａｇ／ ｍｌ、 ｐＨ２，０）で処理す
る。この未胞子化接合子嚢なペレット化しく１７０◎ｘ
ｇで１０分間遠心分離）そしてこれを１モルのスクロー
スに再懸濁する。遠心分離（１７００ｘｇで１０分間）
後、浮遊接合子嚢層を水に再懸濁してペレット化する（
１７００ｘｇで１０分間遠心分離）、このベレットを水
中で洗いそして５．２５％次亜塩素酸ナトリウム冷水溶
液に再懸濁する。氷上で１０分間培養後、５回水洗して
次亜塩素酸ナトリウムを除去する。この未胞子化接合子
嚢を最終的にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁す
る。この細胞［ＰＢＳプラス抗生物質／抗菌物質（Ｇｉ
ｂｃｏｌ中約２ｘｌＯ’／ｍｌｌを連続撹拌しながら２
９℃の温度で３６時間培養して胞子形成させた。
稚虫はＰａｔｔｏｎとＢｒｉｇｍａｎの方法［ｐａｒａ
ｓｉｔｏｌ、 ６５． ５２６−５３０（１９７９）
］ にＤｕｌｓｋｉとＴｕｒｎｅｒの変更［Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３２，２３５−２３９（１
９８８）］を加えて胞子化接合子嚢からつくられた。す
なわち、胞子化接合子嚢をガラス玉と一緒に振とうした
（直径３ｍｍの玉、細胞数はＰＢＳ１ｍｌ当り約１ｘｌ
Ｏ”）、胞子嚢を約５０％パーコール（Ｐｅｒｃ’ｏｌ
ｌ中の密度勾配遠心分離（マイクロファージではｌ Ｏ
ＯＯＯｘｇで１分間あるいはサイズにより１７６００ｘ
ｇで２０分間）で精製した。ペレットになった胞子嚢（
ｌ ｘ ｌ Ｏ’細胞／ｍｌ）を包嚢脱出液（０，２５
％トリプシン１． Ｇ ｉ−ｂ ｃ ｏ ｔ４％タウロ
デオキシコール酸、１０ミリモルＭｇＣ１，）に再懸濁
して４１”Ｃの温度で６０分間培養した。放出された稚
虫を１０分間。
ｓｉｔｏｌ、 ６５． ５２６−５３０（１９７９）
］ にＤｕｌｓｋｉとＴｕｒｎｅｒの変更［Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３２，２３５−２３９（１
９８８）］を加えて胞子化接合子嚢からつくられた。す
なわち、胞子化接合子嚢をガラス玉と一緒に振とうした
（直径３ｍｍの玉、細胞数はＰＢＳ１ｍｌ当り約１ｘｌ
Ｏ”）、胞子嚢を約５０％パーコール（Ｐｅｒｃ’ｏｌ
ｌ中の密度勾配遠心分離（マイクロファージではｌ Ｏ
ＯＯＯｘｇで１分間あるいはサイズにより１７６００ｘ
ｇで２０分間）で精製した。ペレットになった胞子嚢（
ｌ ｘ ｌ Ｏ’細胞／ｍｌ）を包嚢脱出液（０，２５
％トリプシン１． Ｇ ｉ−ｂ ｃ ｏ ｔ４％タウロ
デオキシコール酸、１０ミリモルＭｇＣ１，）に再懸濁
して４１”Ｃの温度で６０分間培養した。放出された稚
虫を１０分間。
７００ｘｇで遠心分離してペレット化し、再度ＰＢＳで
洗い、このペレット（ｌｘｌｏ”細胞／ｍｌ）を５０％
のパーコールに再懸濁しそして上記と同様にパーコール
を介して再度遠心分離した。最後に、ペレット化された
稚虫をＰＢＳの中でもう一度洗った。
洗い、このペレット（ｌｘｌｏ”細胞／ｍｌ）を５０％
のパーコールに再懸濁しそして上記と同様にパーコール
を介して再度遠心分離した。最後に、ペレット化された
稚虫をＰＢＳの中でもう一度洗った。
！鼻当ユ
トリパノゾーム、ＶＳＧ精製およびリパーゼ使用された
トリバノゾームはＣｒｏｓｓ等によりＰａｒａｓｉＬｏ
ｌ、 ７１．３９４−４１Ｈ１９７５）に記載されたク
ローン抗原型Ｍ Ｉ Ｔ ａ Ｒ１およびＭｉｌｌｅｒ
とｔｕｒｎｅｒによりＰａｒａｓｉｔｏｌ、 ８２．６
３−８０（１９８１）に記載されたＩＬＴａＲ１血清デ
ームであった。トリパノゾームはＬａｎｈａｍとＧｏｄ
ｆｒｅｙの方法［Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、 ２
８．５２１−５３４（１９７０） ］により感染ラット
の血液から精製された。
トリバノゾームはＣｒｏｓｓ等によりＰａｒａｓｉＬｏ
ｌ、 ７１．３９４−４１Ｈ１９７５）に記載されたク
ローン抗原型Ｍ Ｉ Ｔ ａ Ｒ１およびＭｉｌｌｅｒ
とｔｕｒｎｅｒによりＰａｒａｓｉｔｏｌ、 ８２．６
３−８０（１９８１）に記載されたＩＬＴａＲ１血清デ
ームであった。トリパノゾームはＬａｎｈａｍとＧｏｄ
ｆｒｅｙの方法［Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、 ２
８．５２１−５３４（１９７０） ］により感染ラット
の血液から精製された。
５ＶＳＧとｍｆＶＳＧの標準製剤はそれぞれＣｒｏｓｓ
の方法（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２４．７
９−９０（１９８４） ］ とＧｕｒｎｅｔｔ等の方法
［Ｊ、 Ｍｏ１． ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍ、 ｐａｒａ
ｓｉｔｏｌ、 ２０．１−１３（１９８６） ］により
製造された。活性トリバノゾームリバーゼを含有する半
精製製剤はＭＩＴａＴｌ、６トリバノゾームから（ある
いは適当なＴ：、 ｂｒｕｃｅｉクローンから）製造さ
れた。トリバノゾームは０．３ミリモルＣａＣ１１中、
１ｘｌＯ’細胞／ｍｌの密度、そして０℃の温度で５分
間溶解された。溶解物を３０００ｘｇで５分間遠心分離
し、そのベレットを、０．１ミリモルのＴＬＣＫとＯ，
１ミリモルのＤＴＴを含有している、ｐＨ８，０の１０
ミリモルリン酸ナトリウム中に、１ｘｌＯ’細胞／ｍｌ
に相当する密度で再懸濁した。この混合物を３７℃の温
度で１５分間培養し、その後０℃まで急冷し１００００
ｘｇで１５分間遠心分離した。このペレット（２，５ｘ
１０ ”細胞／ｎ＋１相当）を５０モリモルＨｅｐｅ
ｓ 、 １ミリモルＤＤＴ。
の方法（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２４．７
９−９０（１９８４） ］ とＧｕｒｎｅｔｔ等の方法
［Ｊ、 Ｍｏ１． ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍ、 ｐａｒａ
ｓｉｔｏｌ、 ２０．１−１３（１９８６） ］により
製造された。活性トリバノゾームリバーゼを含有する半
精製製剤はＭＩＴａＴｌ、６トリバノゾームから（ある
いは適当なＴ：、 ｂｒｕｃｅｉクローンから）製造さ
れた。トリバノゾームは０．３ミリモルＣａＣ１１中、
１ｘｌＯ’細胞／ｍｌの密度、そして０℃の温度で５分
間溶解された。溶解物を３０００ｘｇで５分間遠心分離
し、そのベレットを、０．１ミリモルのＴＬＣＫとＯ，
１ミリモルのＤＴＴを含有している、ｐＨ８，０の１０
ミリモルリン酸ナトリウム中に、１ｘｌＯ’細胞／ｍｌ
に相当する密度で再懸濁した。この混合物を３７℃の温
度で１５分間培養し、その後０℃まで急冷し１００００
ｘｇで１５分間遠心分離した。このペレット（２，５ｘ
１０ ”細胞／ｎ＋１相当）を５０モリモルＨｅｐｅ
ｓ 、 １ミリモルＤＤＴ。
０．１ミリモルＴ Ｌ ＣＫの溶液中で２回洗い、そし
てｌ ＯＯｏｏｏｘｇで１時間遠心分離した。このベレ
ット（３，３ｘｌＯ’細胞／ｍｌ相当）をｎＯＧ １％
含有のｐＨ７，４の５０ミリモルＨｅｐｅｓ中に再懸濁
しそして再度１０００００ｘｇで１時間遠心分離した。
てｌ ＯＯｏｏｏｘｇで１時間遠心分離した。このベレ
ット（３，３ｘｌＯ’細胞／ｍｌ相当）をｎＯＧ １％
含有のｐＨ７，４の５０ミリモルＨｅｐｅｓ中に再懸濁
しそして再度１０００００ｘｇで１時間遠心分離した。
最終的上澄み液は活性リパーゼを含有しており、これは
実験に使用する前に約５０ミリモリ、ｐＨ７，４かつ１
％のｎＯＧを含有するＨｅｐｅｓ液で約１：１０に稀釈
された。
実験に使用する前に約５０ミリモリ、ｐＨ７，４かつ１
％のｎＯＧを含有するＨｅｐｅｓ液で約１：１０に稀釈
された。
実施例２からの精製ＩＬＴａｔ１．２５Ｓ Ｖ Ｂ Ｇ
を使用してうさぎに体内で抗体をつくらせた。すなわち
、ＰＢＳ （２５０μｇ、）中１ｍｇの５ＶＳＧを完全
フロインドアジュバントで均質化しそしてうさぎの背中
の複数個所に皮下注射した。約２週間後に、ＰＢＳの２
５０ｕｆｆ中のｓＶＳＧ（１ｍｇ）の２回目の注射を行
なった。さらに２週間後に血液を採取しそして標準方法
で血清を単離した。この血清を集めｐｌｔ８．０のホウ
酸塩０．１モル溶液でｌ：１の割合で稀釈しそしてＲｅ
ａｃｔｊＧｅｌ ６Ｘ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社）に結合されたＭＩＴａｔｌ ６ｓＶＳＧの異
種構造５ＶＳＧカラムに通した０貫通流を廃棄しそして
抗−ＣＨＤ抗体をｐＨ２，４の０．１ミリモルのグルシ
ン−１ＩＣＩ溶液を使用して溶離した。この抗体はウェ
スタンブロッティング分析のために１＝５０に稀釈して
（４μｇ／＋１．）使用した。ウェスタンブロッティン
グはドデシル硫酸丈トリウムーポリアクリルアミドゲル
（Ｓ Ｄ Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ）で分離されたクン
バク質で実施された。７乃至２０％のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルはＬａｅｍ＋ｎｌｉの方法［Ｎａｔ、ｕｒ
ｅ ２２７．６３０−６８４（１９７０）］によって製
造された。電気泳動後、ゲルをコマジ−ブリリアントブ
ルーＲで染色するかまたはニトロセルロースに移転し、
そして次ぎに抗体を使用して検出を行なう［Ｔｏｗｂｉ
ｎ等の論文、 Ｐｒｏｃ。
を使用してうさぎに体内で抗体をつくらせた。すなわち
、ＰＢＳ （２５０μｇ、）中１ｍｇの５ＶＳＧを完全
フロインドアジュバントで均質化しそしてうさぎの背中
の複数個所に皮下注射した。約２週間後に、ＰＢＳの２
５０ｕｆｆ中のｓＶＳＧ（１ｍｇ）の２回目の注射を行
なった。さらに２週間後に血液を採取しそして標準方法
で血清を単離した。この血清を集めｐｌｔ８．０のホウ
酸塩０．１モル溶液でｌ：１の割合で稀釈しそしてＲｅ
ａｃｔｊＧｅｌ ６Ｘ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社）に結合されたＭＩＴａｔｌ ６ｓＶＳＧの異
種構造５ＶＳＧカラムに通した０貫通流を廃棄しそして
抗−ＣＨＤ抗体をｐＨ２，４の０．１ミリモルのグルシ
ン−１ＩＣＩ溶液を使用して溶離した。この抗体はウェ
スタンブロッティング分析のために１＝５０に稀釈して
（４μｇ／＋１．）使用した。ウェスタンブロッティン
グはドデシル硫酸丈トリウムーポリアクリルアミドゲル
（Ｓ Ｄ Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ）で分離されたクン
バク質で実施された。７乃至２０％のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルはＬａｅｍ＋ｎｌｉの方法［Ｎａｔ、ｕｒ
ｅ ２２７．６３０−６８４（１９７０）］によって製
造された。電気泳動後、ゲルをコマジ−ブリリアントブ
ルーＲで染色するかまたはニトロセルロースに移転し、
そして次ぎに抗体を使用して検出を行なう［Ｔｏｗｂｉ
ｎ等の論文、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７６、４
３５０−４３５４（１９７９）参照１．タンパク質を水
冷へツファー装置（Ｈｏｅｆｆｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｊ
ｊ、ｃ Ｉｎ５ｔｒｕａ＋ｅｎｔｓ社、サンフランシス
コ市所在、製品）へ０．２アンペアで１６時間かけて移
す。結合した抗体は＋２１＋１タンパク質Ａ ＣＡＭＥ
Ｒ３ＨＡ＆１． ｌ ｘ ｌ Ｏ’ｃｐｍ／ ｍｌ、
３０ｎ＋Ｃｉ／Ｈタンパク質）を使用し、オートラジオ
グラフィーによって検出された。
３５０−４３５４（１９７９）参照１．タンパク質を水
冷へツファー装置（Ｈｏｅｆｆｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｊ
ｊ、ｃ Ｉｎ５ｔｒｕａ＋ｅｎｔｓ社、サンフランシス
コ市所在、製品）へ０．２アンペアで１６時間かけて移
す。結合した抗体は＋２１＋１タンパク質Ａ ＣＡＭＥ
Ｒ３ＨＡ＆１． ｌ ｘ ｌ Ｏ’ｃｐｍ／ ｍｌ、
３０ｎ＋Ｃｉ／Ｈタンパク質）を使用し、オートラジオ
グラフィーによって検出された。
実−施例４
アイメリア・テネルラ（Ｅ、 ｔｅｎｅｌｌａｌタンパ
ク質はＴ、 １）ｒｕにｅｉ ＶＳＧのＣＲＤと共通な
決定因子を している Ｔ、 ｈｒｕｃｅｉ リパーゼで処理された実施例１か
らのアイメリア・テネルラの未胞子化接合子女、胞子化
接合子女および積山の分解物を実施例３からのうさぎの
抗ＣＲＤ抗体（これはＶＳＧ糖脂質アンカーの炭水化物
部分に対抗する）を使用してＳ Ｄ Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ
Ｅおよびウェスタンブロッティング分析にかけた。抗
体に結合された各段からのタンパク質の部分集合はＴ、
ｂｒｕｃｅｉ Ｖ Ｓ ＧのＣＲＤと共通な決定因子
を所有する多数のタ２ンバク質が存在することを示した
。糖タンパク質がリパーゼ処理の前では抗体と結合しな
いという事実はＶＳＧの研究結果と一致する［Ｃａｒｄ
ｏｓｏ ｄｅＡｌｍｅｉｄａとＴｕｒｎｅｒの論文、
Ｎａｔｕｒｅ ３０２．３４９−３５２ ｆ１９８３１
参照１．コマシーブルー染色模様の点でトリパノゾーム
で処理したまたは処理しないアイメリア・テネルラ溶解
物を比較した場合なんらの差異も見られなかった。
ク質はＴ、 １）ｒｕにｅｉ ＶＳＧのＣＲＤと共通な
決定因子を している Ｔ、 ｈｒｕｃｅｉ リパーゼで処理された実施例１か
らのアイメリア・テネルラの未胞子化接合子女、胞子化
接合子女および積山の分解物を実施例３からのうさぎの
抗ＣＲＤ抗体（これはＶＳＧ糖脂質アンカーの炭水化物
部分に対抗する）を使用してＳ Ｄ Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ
Ｅおよびウェスタンブロッティング分析にかけた。抗
体に結合された各段からのタンパク質の部分集合はＴ、
ｂｒｕｃｅｉ Ｖ Ｓ ＧのＣＲＤと共通な決定因子
を所有する多数のタ２ンバク質が存在することを示した
。糖タンパク質がリパーゼ処理の前では抗体と結合しな
いという事実はＶＳＧの研究結果と一致する［Ｃａｒｄ
ｏｓｏ ｄｅＡｌｍｅｉｄａとＴｕｒｎｅｒの論文、
Ｎａｔｕｒｅ ３０２．３４９−３５２ ｆ１９８３１
参照１．コマシーブルー染色模様の点でトリパノゾーム
で処理したまたは処理しないアイメリア・テネルラ溶解
物を比較した場合なんらの差異も見られなかった。
実ｍ互
水中５ ｘ ｌ Ｏ’ ／ ｍｌの未胞子化接合子嚢ま
たは胞子化接合子嚢（実施例１からのもの）をガラス玉
（直径３ ｍｍ）を加えて室温で５分間渦巻撹拌した。
たは胞子化接合子嚢（実施例１からのもの）をガラス玉
（直径３ ｍｍ）を加えて室温で５分間渦巻撹拌した。
この溶解物を接合子嚢および胞子嚢の壁が完全に破壊さ
れているか否かを顕微鏡で調べそして、必要な場合には
さらに５分間渦巻撹拌して完全溶解させる。溶解物は後
で使用するため一７０℃で凍結させてあく。稚虫（水中
４Ｘ１０”／＋ａｌ）を超音波破壊（Ｂｒａｎｓｏｎ
５ｏｎｉｆｉｅｒ使用、２０パワーユニツトにセット、
２０秒、５０％ＯＮ時間）により溶解しそして後で使用
するため一７０℃で凍結した６ アイメリア・テネルラのタンパク質を Ｂｏｒｄｉｅｒの方法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、
２５６．１６０４１６０７ （１９８１１］によりＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ１１４中で相分離させた。未胞子化また
は胞子化接合子嚢の溶解物（２，５ｘｌＯ’細胞／ｍｌ
）および稚虫の溶解物（２ｘｌＯ’細胞／ｍ１）を１％
予備濃縮Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４ 、 １０ミリモルの
Ｔｒｉｓ。
れているか否かを顕微鏡で調べそして、必要な場合には
さらに５分間渦巻撹拌して完全溶解させる。溶解物は後
で使用するため一７０℃で凍結させてあく。稚虫（水中
４Ｘ１０”／＋ａｌ）を超音波破壊（Ｂｒａｎｓｏｎ
５ｏｎｉｆｉｅｒ使用、２０パワーユニツトにセット、
２０秒、５０％ＯＮ時間）により溶解しそして後で使用
するため一７０℃で凍結した６ アイメリア・テネルラのタンパク質を Ｂｏｒｄｉｅｒの方法［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、
２５６．１６０４１６０７ （１９８１１］によりＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ１１４中で相分離させた。未胞子化また
は胞子化接合子嚢の溶解物（２，５ｘｌＯ’細胞／ｍｌ
）および稚虫の溶解物（２ｘｌＯ’細胞／ｍ１）を１％
予備濃縮Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４ 、 １０ミリモルの
Ｔｒｉｓ。
ｐＨ７，４，１５０ミリモルのＮａＣ１および１ミリモ
ルのＰＭＳＦからなる液中氷上で１時間培養した。培養
後、試料を１０００００ｘｇで約１時間遠心分離しベレ
ットを捨てた。上澄み液をｌＯミリモルＴｒ ｉ ｓ、
ｐＨ７，４と１５０ミリモルＮａＣ１を含有している
６％スクロース液の等最上に慎重に層展開させるかまた
はさらに処理を行なわずに培養した。３０℃の温度で１
５分間培養して洗浄剤ミセルな形成させそしてｌ ＯＯ
Ｏｘｇで１５分間の遠心分離により相分離させた。３つ
の相留分を集めた。すなわち、最上の水性相と、中間ス
クロースクツション相および底の洗浄剤相の３つである
。スクロースを使用しなかった場合には中間相は存在し
なかった。各留分を約４倍量の水冷アセトンで沈殿させ
そしてゲル電気泳動のために準備した。
ルのＰＭＳＦからなる液中氷上で１時間培養した。培養
後、試料を１０００００ｘｇで約１時間遠心分離しベレ
ットを捨てた。上澄み液をｌＯミリモルＴｒ ｉ ｓ、
ｐＨ７，４と１５０ミリモルＮａＣ１を含有している
６％スクロース液の等最上に慎重に層展開させるかまた
はさらに処理を行なわずに培養した。３０℃の温度で１
５分間培養して洗浄剤ミセルな形成させそしてｌ ＯＯ
Ｏｘｇで１５分間の遠心分離により相分離させた。３つ
の相留分を集めた。すなわち、最上の水性相と、中間ス
クロースクツション相および底の洗浄剤相の３つである
。スクロースを使用しなかった場合には中間相は存在し
なかった。各留分を約４倍量の水冷アセトンで沈殿させ
そしてゲル電気泳動のために準備した。
疎水性タンパク質は洗浄剤豊富槽内に集りそして親水性
タンパク質は上側の水性相に集る傾向があった。テスト
された３つの段すべてからの抗ＣＲＤ結合タンパク質の
大部分は予期されたごとく一番下の洗浄剤相に集められ
たと思われる。適当なリパーゼが存在しない場合、すべ
ての抗ＣＲＤ結合タンパク質は疎水性であるはずである
。
タンパク質は上側の水性相に集る傾向があった。テスト
された３つの段すべてからの抗ＣＲＤ結合タンパク質の
大部分は予期されたごとく一番下の洗浄剤相に集められ
たと思われる。適当なリパーゼが存在しない場合、すべ
ての抗ＣＲＤ結合タンパク質は疎水性であるはずである
。
ＶＳＧの糖脂質アンカーと共通なエピトープを保有する
糖タンパク質は洗浄剤ミセルに集るが、しかしそれはこ
の留分に見出されるタンパク質のすべてではない、胞子
化接合子嚢および稚虫の場合、洗浄剤可溶性抗ＣＲＤ結
合タンパク質はコマシーブルーで染色されたゲルで観察
されるバンド域の高い割合を占めていると思われる。未
胞子化接合子嚢の場合では、抗ＣＲＤ結合タンパク質は
洗浄剤豊富槽内の全タンパク質の小部分である。相分離
の前にリパーゼが添加された場合には、ＣＨＤ保有タン
パク質は最上の水性相内に見られる。 リパーゼ処理を
相分離の後で行なうと同じタンパク質が洗浄剤槽内に残
る。洗浄剤に富むＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４留分にかかわ
るタンパク質は疎水、性でありそして膜結合していると
思われる。
糖タンパク質は洗浄剤ミセルに集るが、しかしそれはこ
の留分に見出されるタンパク質のすべてではない、胞子
化接合子嚢および稚虫の場合、洗浄剤可溶性抗ＣＲＤ結
合タンパク質はコマシーブルーで染色されたゲルで観察
されるバンド域の高い割合を占めていると思われる。未
胞子化接合子嚢の場合では、抗ＣＲＤ結合タンパク質は
洗浄剤豊富槽内の全タンパク質の小部分である。相分離
の前にリパーゼが添加された場合には、ＣＨＤ保有タン
パク質は最上の水性相内に見られる。 リパーゼ処理を
相分離の後で行なうと同じタンパク質が洗浄剤槽内に残
る。洗浄剤に富むＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４留分にかかわ
るタンパク質は疎水、性でありそして膜結合していると
思われる。
実ｍ旦
相分離前または後でＴ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼで処理
されたアイメリア・テネルラ溶 物 アイメリア・テネルラの未胞子化接合子嚢、胞子化接合
子女および稚虫を前記のごとく水中で溶解した（未胞子
化および胞子化接合子嚢は５ ｘ １０ ’／ｍ１．種
虫は４積重Ｏ”７ｍ１１．１０％ｎＯＧとｌＯミリモル
ＴＬＣＫを含有するｐＨ７，４の５００ミリモルＨｅｐ
ｅｓの１００μβを各溶解物に添加した。各溶解物から
１つのアリコート（８０μ！２）を取り。
されたアイメリア・テネルラ溶 物 アイメリア・テネルラの未胞子化接合子嚢、胞子化接合
子女および稚虫を前記のごとく水中で溶解した（未胞子
化および胞子化接合子嚢は５ ｘ １０ ’／ｍ１．種
虫は４積重Ｏ”７ｍ１１．１０％ｎＯＧとｌＯミリモル
ＴＬＣＫを含有するｐＨ７，４の５００ミリモルＨｅｐ
ｅｓの１００μβを各溶解物に添加した。各溶解物から
１つのアリコート（８０μ！２）を取り。
Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼの２０μ２と混合した（第
１セツト）、第２のアリコート（８０μ２）を各溶解物
から取りＩ％ｎＯＧを含有する５０ミリモルＨｅｐｅｓ
の２０μ２と酵素なしの対照として混合した（第２セツ
ト）、これらのアリコートな３０℃の温度で３０分間培
養し、その後ｌＯミリモルのＴｒｉｓ、ｐＨ７，４，１
５０ミリモルのＮａＣ１および１ミリモルのＰＭＳＦを
含有している１％Ｔｒｉ ｔｏｎＸ１１４の２ｍｌと混
合した。この試料を氷上で１時間培養し、ｌ Ｏｏｏｏ
ｏｘｇで１時間遠心分離しそして上澄みを集めた。各上
澄み液を１０ミリモルＴｒ ｉ ｓ、 ｐＨ７，４と１
５０ミリモルＮａＣ１を含有している６％スクロース液
の等量上に慎重に層展開させ、３０℃で１５分間培養し
そして遠心分離（１０００ｘ ｇでｉ５分間）で相分離
させた。３つの相留分を集めた。すなわち、最−Ｆの水
性相と、中間スクロース相と底の洗浄剤槽の３つの留分
を集めた。水を加えて容量を等しくし、そして約４倍量
の水冷アセトンを添加して沈殿させ、−２０℃の温度で
一晩培養し、ｌｏｏｏＯｘｇで１５分間遠心分離した。
１セツト）、第２のアリコート（８０μ２）を各溶解物
から取りＩ％ｎＯＧを含有する５０ミリモルＨｅｐｅｓ
の２０μ２と酵素なしの対照として混合した（第２セツ
ト）、これらのアリコートな３０℃の温度で３０分間培
養し、その後ｌＯミリモルのＴｒｉｓ、ｐＨ７，４，１
５０ミリモルのＮａＣ１および１ミリモルのＰＭＳＦを
含有している１％Ｔｒｉ ｔｏｎＸ１１４の２ｍｌと混
合した。この試料を氷上で１時間培養し、ｌ Ｏｏｏｏ
ｏｘｇで１時間遠心分離しそして上澄みを集めた。各上
澄み液を１０ミリモルＴｒ ｉ ｓ、 ｐＨ７，４と１
５０ミリモルＮａＣ１を含有している６％スクロース液
の等量上に慎重に層展開させ、３０℃で１５分間培養し
そして遠心分離（１０００ｘ ｇでｉ５分間）で相分離
させた。３つの相留分を集めた。すなわち、最−Ｆの水
性相と、中間スクロース相と底の洗浄剤槽の３つの留分
を集めた。水を加えて容量を等しくし、そして約４倍量
の水冷アセトンを添加して沈殿させ、−２０℃の温度で
一晩培養し、ｌｏｏｏＯｘｇで１５分間遠心分離した。
第１セツトからのベレットを１％ｎＯＧを含有するｐｌ
！７．４の５０ミリモル１４ ｅ ｐ ｅ ｓに再懸濁
しそして同じ緩衝液２０μ！で処理した。第２セツトか
らのペレットは１％ｎＯＧを含有するｐＨ７，４の５０
ミリモルＨｅｐｅｓに再懸濁しそしてＴ、 ｂｒｕｅｅ
ｉリパーゼ２ＯＬ１ｇで処理した。３０℃で３０分間培
養した後、等量の１．ａｅｎｕｎｌｉ試料緩衝液を各試
料に添加してＰＡＧＥの準備をした。
！７．４の５０ミリモル１４ ｅ ｐ ｅ ｓに再懸濁
しそして同じ緩衝液２０μ！で処理した。第２セツトか
らのペレットは１％ｎＯＧを含有するｐＨ７，４の５０
ミリモルＨｅｐｅｓに再懸濁しそしてＴ、 ｂｒｕｅｅ
ｉリパーゼ２ＯＬ１ｇで処理した。３０℃で３０分間培
養した後、等量の１．ａｅｎｕｎｌｉ試料緩衝液を各試
料に添加してＰＡＧＥの準備をした。
各試料の２０％を各トラックに負荷し、タンパク質をニ
トロセルロースに移し、抗ＣＲＤまたは抗丁Ｘ１１４Ｂ
で検査した。
トロセルロースに移し、抗ＣＲＤまたは抗丁Ｘ１１４Ｂ
で検査した。
抗ＣＲＤによる検査データは相分離の後で溶解物がリパ
ーゼ処理された場合には疎水性糖脂質複合タンパク質は
洗浄剤槽に見出されることを示している。これに対し、
リパーゼ（これはそれらタンパク質の暉水性性質を変え
る）が相分離の前に添加された場合には該タンパク質は
水性相内に見出される。抗ＴＸ１１４Ｂで検査されたも
のはきわめて類似したパターンを示し、ＴＸｌ１４Ｂの
タンパク質の大部分が糖脂質と複合していることを示唆
している。（実施例７参照） 実施例７− 抗ＴＸ１１４Ｂ 血 の製造と使用 抗血清が神主からの洗浄剤槽の内容物に対して製造され
た（実施例５参照）。この製造は完全フロインドアジュ
バント中のタンパク質の５０μｇをうさぎの背中の複数
個所に皮下注射し、さらに３０日ｌ８９０日１に不完全
フローインドアジュバント中５０μｇのタンパク質を補
強注射することによって実施された。これにより得られ
た抗血清を抗ＴＸ１１４Ｂとよぶ。
ーゼ処理された場合には疎水性糖脂質複合タンパク質は
洗浄剤槽に見出されることを示している。これに対し、
リパーゼ（これはそれらタンパク質の暉水性性質を変え
る）が相分離の前に添加された場合には該タンパク質は
水性相内に見出される。抗ＴＸ１１４Ｂで検査されたも
のはきわめて類似したパターンを示し、ＴＸｌ１４Ｂの
タンパク質の大部分が糖脂質と複合していることを示唆
している。（実施例７参照） 実施例７− 抗ＴＸ１１４Ｂ 血 の製造と使用 抗血清が神主からの洗浄剤槽の内容物に対して製造され
た（実施例５参照）。この製造は完全フロインドアジュ
バント中のタンパク質の５０μｇをうさぎの背中の複数
個所に皮下注射し、さらに３０日ｌ８９０日１に不完全
フローインドアジュバント中５０μｇのタンパク質を補
強注射することによって実施された。これにより得られ
た抗血清を抗ＴＸ１１４Ｂとよぶ。
抗ＴＸｌ１４Ｂ抗血清が実施例５で製造されたものと同
様なゲルのプロッティングのために使用された。その結
果は、抗１’Ｘ１１４Ｂによって認知される胞子化接合
子嚢および神主内のタンパク質のほとんどは、リバーぜ
処理を相分離より先に行なった場合には水性相に移行す
ることを示す。これらタンパク質は抗ＣＲＤ抗体によっ
て認知されるタンパク質と共に移動するから、抗ＴＸ１
１４Ｂによって認知されるタンパク質のほとんどは糖脂
質保有タンパク質であるといえる。
様なゲルのプロッティングのために使用された。その結
果は、抗１’Ｘ１１４Ｂによって認知される胞子化接合
子嚢および神主内のタンパク質のほとんどは、リバーぜ
処理を相分離より先に行なった場合には水性相に移行す
ることを示す。これらタンパク質は抗ＣＲＤ抗体によっ
て認知されるタンパク質と共に移動するから、抗ＴＸ１
１４Ｂによって認知されるタンパク質のほとんどは糖脂
質保有タンパク質であるといえる。
肌１匹狡ＩＪ才し梵２Δ
うさぎの抗ＴＸ１１４Ｂ血清を５６℃の温度で３０分間
熱不活性化しそして１：５０の割合で稀釈して最終体積
を約２００ｕｆ２とし、これに生きている精製神主（５
ｘｌＯ’）を加え、ＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡの溶液中
４℃の温度で１時間培養した。この神主をＰＢＳ中０．
０５％ＢＳＡ溶液で３回洗浄しそして各洗浄の間に１０
分間、ｌ ０００ｘｇで遠心分離してベレット化した。
熱不活性化しそして１：５０の割合で稀釈して最終体積
を約２００ｕｆ２とし、これに生きている精製神主（５
ｘｌＯ’）を加え、ＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡの溶液中
４℃の温度で１時間培養した。この神主をＰＢＳ中０．
０５％ＢＳＡ溶液で３回洗浄しそして各洗浄の間に１０
分間、ｌ ０００ｘｇで遠心分離してベレット化した。
この神主を２．５％ホルムアルデヒドで５分間固定し、
ＰＢＳ中０．０５％のＢＳＡ溶液で２回洗浄し、そして
稀釈したフロオレスセイン共役やぎ抗ウサギ Ｉ ｇ
Ｇ （１： 夏 ５ 、 Ｍｉｌｔｅｓ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、インデイアナ州、エルクハ
ルト所在、製品）を使用し４℃の温度で３０分間関東し
た。
ＰＢＳ中０．０５％のＢＳＡ溶液で２回洗浄し、そして
稀釈したフロオレスセイン共役やぎ抗ウサギ Ｉ ｇ
Ｇ （１： 夏 ５ 、 Ｍｉｌｔｅｓ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、インデイアナ州、エルクハ
ルト所在、製品）を使用し４℃の温度で３０分間関東し
た。
ＰＢＳ中０，０５％ＢＳＡ溶液で３回洗浄した後１種型
を集め、５０ミリモルＴｒｉｓ−ＨＣＩ。
を集め、５０ミリモルＴｒｉｓ−ＨＣＩ。
ｐＨ９，０中６６％（Ｖ／ｖ）グリセリンの溶液２５μ
βに再懸濁し、Ｌｅｉｔｚ顕微鏡（Ｖａｒｉ。
βに再懸濁し、Ｌｅｉｔｚ顕微鏡（Ｖａｒｉ。
Ｏｒｔｈｏｍａｔ）で観察した。熱不活性化されたウサ
ギ抗ＴＸ１１４Ｂで処理された神主の免疫フルオレセン
スはホルムアルデヒドで固定しそしてＦＩＴＣ共役抗ウ
サギつｇＴで検出された後の神主の表面上全体に拡散染
色模様を示した。他方、ウサギの前免疫血清はなんらバ
ックグランド免疫蛍光を現さなかった。ウサギ抗ＣＲＤ
は免疫蛍光も凝集も与えなかった。
ギ抗ＴＸ１１４Ｂで処理された神主の免疫フルオレセン
スはホルムアルデヒドで固定しそしてＦＩＴＣ共役抗ウ
サギつｇＴで検出された後の神主の表面上全体に拡散染
色模様を示した。他方、ウサギの前免疫血清はなんらバ
ックグランド免疫蛍光を現さなかった。ウサギ抗ＣＲＤ
は免疫蛍光も凝集も与えなかった。
斂１
ウサギ抗ＴＸ１１４Ｂとウサギ前採血血清の凝集の力価
曲線が表１に示されている。凝集した寄生体は一緒にな
ってＣｏｕｌｔｅｒカウンターの穴を通過し、１つの粒
子としてカウントされる。したがって、凝集はＣｏｕｌ
ｔｅｒカウントに逆比例する。力価が低い時には前免疫
血清は神主を弱く凝集させた。ウサギ抗ＣＲＤは同じ検
査で凝集を示さなかった。
曲線が表１に示されている。凝集した寄生体は一緒にな
ってＣｏｕｌｔｅｒカウンターの穴を通過し、１つの粒
子としてカウントされる。したがって、凝集はＣｏｕｌ
ｔｅｒカウントに逆比例する。力価が低い時には前免疫
血清は神主を弱く凝集させた。ウサギ抗ＣＲＤは同じ検
査で凝集を示さなかった。
血清稀釈度
１：２５
１：２５０
１：５００
１：１０００
１：２０００
１：４０００
１：８０００
１ ： １６ 、０００
１：３２，０００
１：６４，０００
１：１２８，０００
注：
表 １
前免疫血清
抗ＴＸｌ１４Ｂ
、８３５
．８８２
．９７４
．９８７
．９９９
．９９７
１．０３０
．９２７
．９７４
．９６３
．９８２
．２２８
．２９１
ａ）無血清対照のカウントは７２３０゜ｂ）データは７
２３０ （無血清対照）で除したカウント数で表わされ
ている。
２３０ （無血清対照）で除したカウント数で表わされ
ている。
Ｃ）数値は凝集に逆比例している。
実ｊ１」旦
糖 Ａタンパク の 製
洗浄剤に富む留分なアイメリア・テネルラ神主（ＴＸ１
１４Ｂｌから得た。実施例５参照。
１４Ｂｌから得た。実施例５参照。
タンパク質５ｍｇを含有するこの留分のアリコートをア
セトンで沈殿させた。すなわち、ＴＸ１１４Ｈの１容量
部に対して冷アセトン４容量部を使用して一２０℃の温
度で一晩沈殿させ、ｌ ００００ｘｇで１５分間遠心分
離してペレット化した。上澄みは廃棄した。このペレッ
トを０．０５％ＴＸ１００を含有するビス［２−ヒドロ
キシエチルＪイミノートリス−［ヒドロキシメチル］−
メタン（４ｍ１．１００ｏ＋ＭＢｊｓ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ６，９） （緩衝液Ａ）に再懸濁した。
セトンで沈殿させた。すなわち、ＴＸ１１４Ｈの１容量
部に対して冷アセトン４容量部を使用して一２０℃の温
度で一晩沈殿させ、ｌ ００００ｘｇで１５分間遠心分
離してペレット化した。上澄みは廃棄した。このペレッ
トを０．０５％ＴＸ１００を含有するビス［２−ヒドロ
キシエチルＪイミノートリス−［ヒドロキシメチル］−
メタン（４ｍ１．１００ｏ＋ＭＢｊｓ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ６，９） （緩衝液Ａ）に再懸濁した。
不溶物を１３０００ｘｇで２分間遠心分離して除去した
。そして上澄み液を陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｂｉ
ｏＧｅｌＴＳＫ、 ＤＥＡＥ −５Ｐ Ｗ、 ７５ｘ７
．５ｍｍ、 Ｂｉｏｒａｄ）に通じた。このＨＰＬＣク
ロマトグラフィー装置はＷａｔｅｒｓ６００Ｅ溶剤供給
系、 Ｗａｔｅｒｓ４８１検出器および０６に注入口よ
り構成されていた。タンパク質ハ０ 、 ０５ ％ （
７）ＴＸｌｏｏを含有ｔルｐｌ［５，８ｃ７）Ｂｉｓ−
Ｔｒｉｓの１００ミリモルでカラムから溶離された６カ
ラム流出物は２８０ｎｍで監視されそして１ｍｌずつ留
分を集めた。集めた留分アリコートをＬａｅｍｍｌｉの
方法に１よりポリアクリルアミドゲル上で分析しそして
銀染色するかまたはニトロセルロースに移転して抗ＣＲ
Ｄで検査した。後者の場合には、そのニトロセルロース
を抗体検査に先立ってＴ。
。そして上澄み液を陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（Ｂｉ
ｏＧｅｌＴＳＫ、 ＤＥＡＥ −５Ｐ Ｗ、 ７５ｘ７
．５ｍｍ、 Ｂｉｏｒａｄ）に通じた。このＨＰＬＣク
ロマトグラフィー装置はＷａｔｅｒｓ６００Ｅ溶剤供給
系、 Ｗａｔｅｒｓ４８１検出器および０６に注入口よ
り構成されていた。タンパク質ハ０ 、 ０５ ％ （
７）ＴＸｌｏｏを含有ｔルｐｌ［５，８ｃ７）Ｂｉｓ−
Ｔｒｉｓの１００ミリモルでカラムから溶離された６カ
ラム流出物は２８０ｎｍで監視されそして１ｍｌずつ留
分を集めた。集めた留分アリコートをＬａｅｍｍｌｉの
方法に１よりポリアクリルアミドゲル上で分析しそして
銀染色するかまたはニトロセルロースに移転して抗ＣＲ
Ｄで検査した。後者の場合には、そのニトロセルロース
を抗体検査に先立ってＴ。
ｂｒｕｃｅｉ リパーゼ含有留分て処理した６ニトロセ
ルースを最初ＴＥＮ （５０ミリモルＴｒｉｓＨＣ１，
ｐＨ７，４，５ミリモルＥＤＴＡ。
ルースを最初ＴＥＮ （５０ミリモルＴｒｉｓＨＣ１，
ｐＨ７，４，５ミリモルＥＤＴＡ。
１５０ミリモルＮａＣ１）で洗う（２００ｍｌで３回）
、このあと１（ｅｐｅｓ （２０ミリモル、ＰＨ７，
３）の１００ｍ１で洗浄した。濾紙で過剰の緩衝液を吸
い取って除いた。 Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ含有留
分（実施例２）をＨｅ ｐ ｅ ｓ ／ ｎ ＯＧ（５
０ミリモルＨｅｐｅｓ、 ｐＨ７，３，１％ｎ−オクチ
ルグルコシド、全ｆｆ１３ｍ１）で１＋１０まで稀釈し
そして上記のニトロセルロースシートと一緒に泡のない
プラスチックの袋に封入した。これを時々袋を撹拌しな
がら３７℃の温度で２時間培養した。リパーゼを捨てそ
してニトロセルロースを抗ＣＲＤで実施例記載のごとく
検査した。糖脂質複合タンパク質を含有している留分は
タンパク質のアミノ酸配列を調べるため、また、抗体製
造の際に使用された。結果は後記の表に示されている。
、このあと１（ｅｐｅｓ （２０ミリモル、ＰＨ７，
３）の１００ｍ１で洗浄した。濾紙で過剰の緩衝液を吸
い取って除いた。 Ｔ、 ｂｒｕｃｅｉリパーゼ含有留
分（実施例２）をＨｅ ｐ ｅ ｓ ／ ｎ ＯＧ（５
０ミリモルＨｅｐｅｓ、 ｐＨ７，３，１％ｎ−オクチ
ルグルコシド、全ｆｆ１３ｍ１）で１＋１０まで稀釈し
そして上記のニトロセルロースシートと一緒に泡のない
プラスチックの袋に封入した。これを時々袋を撹拌しな
がら３７℃の温度で２時間培養した。リパーゼを捨てそ
してニトロセルロースを抗ＣＲＤで実施例記載のごとく
検査した。糖脂質複合タンパク質を含有している留分は
タンパク質のアミノ酸配列を調べるため、また、抗体製
造の際に使用された。結果は後記の表に示されている。
銀染色ゲル分析は、陰イオン交換カラム留分からのいく
つかの留分が純粋２６ｋＤ糖脂質複合タンパク質を含有
していることを示した。この留分はいくつかプールされ
、アセトンで沈殿されそして鶏の免疫化のため使用され
た（実施例１１参照）、また、アミノ酸配列解析の資料
に供された（実施例１０参照）。
つかの留分が純粋２６ｋＤ糖脂質複合タンパク質を含有
していることを示した。この留分はいくつかプールされ
、アセトンで沈殿されそして鶏の免疫化のため使用され
た（実施例１１参照）、また、アミノ酸配列解析の資料
に供された（実施例１０参照）。
実ｊｕｌ旦
アイメリア・テネルラ神主から得られた４つの主要糖脂
質複合タンパク質の分子１と等重点の” アイメリア・テネルラ神主から得られた４つの主要糖脂
質複合タンパク質の分子量と等電点が決定された。分子
量はＳ Ｄ Ｓ −ＰＡＧＥ分析、ニトロセルロースへ
の移転、抗ＣＲＤ抗体（実施例３で製造）を使用したウ
ェスタンブロッティングによる免疫検査によって決定さ
れた。適当な分子量制御も含まれた１等電点はＯ’Ｆａ
ｒｒｅｌｌの方法［Ｊｔ Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ。
質複合タンパク質の分子１と等重点の” アイメリア・テネルラ神主から得られた４つの主要糖脂
質複合タンパク質の分子量と等電点が決定された。分子
量はＳ Ｄ Ｓ −ＰＡＧＥ分析、ニトロセルロースへ
の移転、抗ＣＲＤ抗体（実施例３で製造）を使用したウ
ェスタンブロッティングによる免疫検査によって決定さ
れた。適当な分子量制御も含まれた１等電点はＯ’Ｆａ
ｒｒｅｌｌの方法［Ｊｔ Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ。
２５０、４００７−４０２１ （１９７５１参照ｌにＧ
ｒｏｐｐｉの方法［Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 １
８，４２９−４３７（１９８０） 参照１に類似の変更
を加えて二次元ゲルの分析によって決定された６ 洗浄剤に富む留分を実施例５に記載したようにアイメリ
ア・テネルラ神主から得た。この留分のアリコートをア
セトン沈殿させそしてペレットをＴ、 ｂｒｕｃｅｉリ
パーゼで処理した（実施例６）、１１−ラックにつき全
タンパク質量が５０μｇの試料が５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析
のために使用され、全タンパク質量１００μｇが二次元
ゲル分析のために使用された。
ｒｏｐｐｉの方法［Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 １
８，４２９−４３７（１９８０） 参照１に類似の変更
を加えて二次元ゲルの分析によって決定された６ 洗浄剤に富む留分を実施例５に記載したようにアイメリ
ア・テネルラ神主から得た。この留分のアリコートをア
セトン沈殿させそしてペレットをＴ、 ｂｒｕｃｅｉリ
パーゼで処理した（実施例６）、１１−ラックにつき全
タンパク質量が５０μｇの試料が５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析
のために使用され、全タンパク質量１００μｇが二次元
ゲル分析のために使用された。
結束を次ぎの表２に示す。
及−−２
アイメリア・テネルラ神主からの４つの主要人タンパク
の と、１占 分子量 等電点 止Ｌ１」ｊ工 −１１ ３２４、６ ２９４，８ ２６４，９ ２６５、０ １８４，８ 糖 注＋ ２６ｋＤタンパク質は時により記載のＰＩ値をも
つ２つの融合したスポットに分解された。
の と、１占 分子量 等電点 止Ｌ１」ｊ工 −１１ ３２４、６ ２９４，８ ２６４，９ ２６５、０ １８４，８ 糖 注＋ ２６ｋＤタンパク質は時により記載のＰＩ値をも
つ２つの融合したスポットに分解された。
火あ」ＬＬ旦
精製糖脂質複合タンパク質に対する抗体の製箔
糖脂質複合タンパク質を含有しているＤＥＡＥ−ＨＰ
Ｌ Ｃカラムからの留分を、切取りバンド１つにつき１
乃至５ｕｇを使用して、７乃至３０％ポリアクリルアミ
ドＬａｅｍｒａｌｉゲルに付与した。電気泳動後、その
ゲルを２０％メタノールと７％酢酸中コマシーブルー０
．１％の溶液で染色しそして２０％のメタノールと７％
酢酸で色を抜いた。関心のあるバンドを切取り、凍結乾
燥で乾燥し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の０．５ｒ
ｎｌ中でエッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕ
ｂｅｌ を介して遠心分離（１３０００ｘｇ、１分間）
することにより浸軟した。使用したエッペンドルフ管は
０．５信ｌ管であり、底にｌｌｌｌ１１の孔を有し。
Ｌ Ｃカラムからの留分を、切取りバンド１つにつき１
乃至５ｕｇを使用して、７乃至３０％ポリアクリルアミ
ドＬａｅｍｒａｌｉゲルに付与した。電気泳動後、その
ゲルを２０％メタノールと７％酢酸中コマシーブルー０
．１％の溶液で染色しそして２０％のメタノールと７％
酢酸で色を抜いた。関心のあるバンドを切取り、凍結乾
燥で乾燥し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の０．５ｒ
ｎｌ中でエッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕ
ｂｅｌ を介して遠心分離（１３０００ｘｇ、１分間）
することにより浸軟した。使用したエッペンドルフ管は
０．５信ｌ管であり、底にｌｌｌｌ１１の孔を有し。
１．５ｍｌのエッペンドルフ管の中に通じていた。約８
サイクルの遠心分離が実施された。
サイクルの遠心分離が実施された。
浸軟は２６ゲージの注射針を複数回通過させて完了され
た。各ＰＢ３０．５ｍｌのアリコート中にタンパク質３
乃至１５μｇが使用された。このアリコートを完全フロ
インドアジュバントの０．５ｍｌと混合し、ウサギの背
中の複数個所に皮下注射した。さらに不完全フロインド
アジュバントを使用して同様に２回目以下の補強免疫注
射（ブースター）を実施した。
た。各ＰＢ３０．５ｍｌのアリコート中にタンパク質３
乃至１５μｇが使用された。このアリコートを完全フロ
インドアジュバントの０．５ｍｌと混合し、ウサギの背
中の複数個所に皮下注射した。さらに不完全フロインド
アジュバントを使用して同様に２回目以下の補強免疫注
射（ブースター）を実施した。
４つの主要糖脂質複合タンパク質に対して形成された抗
血清を１：１００の稀釈度でウェスタンブロッティング
に使用した。抗１８ｋＤ糖脂質複合タンパク質（抗１８
ｋＤという）抗血清は神主溶解物（アイメリア・テネル
ラ）に対して試験した時に最低の非特異性結合を有する
ように思われた。この抗血清はさらにＴＸ１１４最上相
と最下相（アイメリア・テネルラ神主からのもの）に対
して特性が調べられた。相分離はＴ、 ｂｒｕｃｅｉ
リパーゼで溶解物を処理する前および後で実施された。
血清を１：１００の稀釈度でウェスタンブロッティング
に使用した。抗１８ｋＤ糖脂質複合タンパク質（抗１８
ｋＤという）抗血清は神主溶解物（アイメリア・テネル
ラ）に対して試験した時に最低の非特異性結合を有する
ように思われた。この抗血清はさらにＴＸ１１４最上相
と最下相（アイメリア・テネルラ神主からのもの）に対
して特性が調べられた。相分離はＴ、 ｂｒｕｃｅｉ
リパーゼで溶解物を処理する前および後で実施された。
抗血清は２６ｋＤ糖脂質複合タンパク質と共に移動する
主タンパク質と結合し、かつまた、１８ｋＤタンパク質
とも結合する。さらに、その最大の反応性は相分離がリ
パーゼ処理なしで実施された場合には底部留分て見られ
た。この反応性の幾分かはリパーゼ処理が相分離の前に
実施された場合には最上相留分に移動する。このような
変化は抗ＣＲＤ抗体を使用した時に観察された変化を反
映しており、抗１８ｋＤ抗体が糖脂質複合タンパク質と
結びつくことの強力な証明である。
主タンパク質と結合し、かつまた、１８ｋＤタンパク質
とも結合する。さらに、その最大の反応性は相分離がリ
パーゼ処理なしで実施された場合には底部留分て見られ
た。この反応性の幾分かはリパーゼ処理が相分離の前に
実施された場合には最上相留分に移動する。このような
変化は抗ＣＲＤ抗体を使用した時に観察された変化を反
映しており、抗１８ｋＤ抗体が糖脂質複合タンパク質と
結びつくことの強力な証明である。
１五五１ユ
イモピロンを使用したポリアクリルアミドゲルによるタ
ンパク のアミノ の 実施例７からの３２ｋＤおよび２９ｋＤの脂質複合タン
パク質のアミノ酸配列の分析が検子の方法［Ｊ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２６２．１００３５−１００３８
＋１９８７） ］によって行なわれた。簡単に説明する
と、当該試料（１乃至５μｇ／レーン）をＬａｅｍｎ＋
ｌｉの方法により７乃至２０％ポリアクリルアミドゲル
上に負荷して電気泳動にかける。完成したゲルを移転緩
衝液（Ｃａｐｓすなわち３−［シクロへキシルアミノ］
−１−プロパンスルホン酸ｌＯミリモル、メタノール１
０冗、ＤＤＴ５ミ９モルからなる）に５分間浸漬しそし
て０．５アンペアの電流で１時間半電気泳動によりポリ
ビニルニフッ化物（ＰＶＤＦ）膜（Ｉ＋＋ｃｓｓｏｂｉ
ｌｏｎ、 ０．４５ μＭ細孔、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｌ
に移転させる。移転後、この膜を水中で５分間洗い、コ
マシーブルー（５０％メタノール中コマシーブルー０．
１％溶液）で５分間染色し、約５乃至ｌＯ分間色抜きし
く５０％メタノール、１０％酢酸）そして最後に水中洗
浄して自然乾燥する。関心バンドをこのゲルから切取り
そしてタンパク質配列分析に供する。簡単にこの分析を
説明すると、ポリブレン塗布ガラス繊維盤をオンライン
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）分析器を具備した
４７０シーケネー、夕のカートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｓｓ社、カルフォルニア州、フォ
スターシティ）に装填する。
ンパク のアミノ の 実施例７からの３２ｋＤおよび２９ｋＤの脂質複合タン
パク質のアミノ酸配列の分析が検子の方法［Ｊ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２６２．１００３５−１００３８
＋１９８７） ］によって行なわれた。簡単に説明する
と、当該試料（１乃至５μｇ／レーン）をＬａｅｍｎ＋
ｌｉの方法により７乃至２０％ポリアクリルアミドゲル
上に負荷して電気泳動にかける。完成したゲルを移転緩
衝液（Ｃａｐｓすなわち３−［シクロへキシルアミノ］
−１−プロパンスルホン酸ｌＯミリモル、メタノール１
０冗、ＤＤＴ５ミ９モルからなる）に５分間浸漬しそし
て０．５アンペアの電流で１時間半電気泳動によりポリ
ビニルニフッ化物（ＰＶＤＦ）膜（Ｉ＋＋ｃｓｓｏｂｉ
ｌｏｎ、 ０．４５ μＭ細孔、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｌ
に移転させる。移転後、この膜を水中で５分間洗い、コ
マシーブルー（５０％メタノール中コマシーブルー０．
１％溶液）で５分間染色し、約５乃至ｌＯ分間色抜きし
く５０％メタノール、１０％酢酸）そして最後に水中洗
浄して自然乾燥する。関心バンドをこのゲルから切取り
そしてタンパク質配列分析に供する。簡単にこの分析を
説明すると、ポリブレン塗布ガラス繊維盤をオンライン
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）分析器を具備した
４７０シーケネー、夕のカートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｓｓ社、カルフォルニア州、フォ
スターシティ）に装填する。
メーカの指示書に従ってフィルター清浄化のため３回空
運転をする。切取ったＰＶＤＦ標本をガラス繊維盤の上
に置きそして配列分析を実行する。
運転をする。切取ったＰＶＤＦ標本をガラス繊維盤の上
に置きそして配列分析を実行する。
銀染色したゲルは陰イオン交換カラムからのいくつかの
留分が純粋な２６ｋＤ糖脂質タンパク質を含有している
ことを示した。このような留分をいくつかプールし、ア
セトンで沈殿させそしてタンパク質アミノ酸配列解析の
ために使用した。解析は上記のようにして実行された。
留分が純粋な２６ｋＤ糖脂質タンパク質を含有している
ことを示した。このような留分をいくつかプールし、ア
セトンで沈殿させそしてタンパク質アミノ酸配列解析の
ために使用した。解析は上記のようにして実行された。
ただし、精製されたタンパク質が３回の予備運転終了後
直接ポリブレン塗布フィルター上に吸い取られた。糖脂
質複合タンパク質の２つのものについてそのアミノ酸配
列が得られた（表２）、２９ｋＤは１つの保護されたア
ミノ末端を有しつる。
直接ポリブレン塗布フィルター上に吸い取られた。糖脂
質複合タンパク質の２つのものについてそのアミノ酸配
列が得られた（表２）、２９ｋＤは１つの保護されたア
ミノ末端を有しつる。
３２シＤ
２６ ｋＤ
人−一一旦
２つのアイメリア・テネルラ糖脂質複合タンパク から
されたアミノ ５ １０
１！５Ｃｆｆ、ｕ Ｓｅｒ Ｇ１．ｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｅ Ｔｈｒ
Ｘ Ａｌａ Ｘ Ｌｅｕ Ｐｒ。
されたアミノ ５ １０
１！５Ｃｆｆ、ｕ Ｓｅｒ Ｇ１．ｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｅ Ｔｈｒ
Ｘ Ａｌａ Ｘ Ｌｅｕ Ｐｒ。
Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｘ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｘ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｘ Ｘ Ａｉｎ ＡｌａＸ・未同定部位 １つの部位に２つのアミノ酸が示されているところは不
明確であることを示す。
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｘ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｘ Ｘ Ａｉｎ ＡｌａＸ・未同定部位 １つの部位に２つのアミノ酸が示されているところは不
明確であることを示す。
Ｘ血訓±ｌ
アイメリア・テネルラ糖脂質複合タンパク質原による
護 化 ブロイラー雌鶏を２日令、９日令、１６日令の３回筋肉
注射により免疫化した。注射には実施例３からの精製糖
脂質複合タンパク質免疫原０．０１乃至１． ＯＯｎ
ｇを含有する試料のＯ，１％ＳＤＳ溶液が使用され、０
．１ｍｌ／１羽の１で注射された９最後の注射から７日
目の、２３日令の時に実験鶏および対照鶏に５乃至３０
ｘ ｌ Ｏ３の胞子化接合子嚢を経口的に接種させた。
護 化 ブロイラー雌鶏を２日令、９日令、１６日令の３回筋肉
注射により免疫化した。注射には実施例３からの精製糖
脂質複合タンパク質免疫原０．０１乃至１． ＯＯｎ
ｇを含有する試料のＯ，１％ＳＤＳ溶液が使用され、０
．１ｍｌ／１羽の１で注射された９最後の注射から７日
目の、２３日令の時に実験鶏および対照鶏に５乃至３０
ｘ ｌ Ｏ３の胞子化接合子嚢を経口的に接種させた。
この量は３０日令の非免疫化対照に少な（とも２．５点
の平均病変得点を与えるのに十分な量である。接種７日
後に実験鶏を殺しそして盲腸内の病変の程度をＪｏｈｎ
ｓｏｎとＲｅ１ｄの方法ｉ：Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔ
ｏｌ 。
の平均病変得点を与えるのに十分な量である。接種７日
後に実験鶏を殺しそして盲腸内の病変の程度をＪｏｈｎ
ｓｏｎとＲｅ１ｄの方法ｉ：Ｅｘｐ、 Ｐａｒａｓｉｔ
ｏｌ 。
２８、３Ｏ−３６（１９７９）１によって判定した８次
表に代表的の結果例を示す。
表に代表的の結果例を示す。
２６Ｋｄ糖脂肪質複合タンパク質によるコクヂジウム
から鶏の 護試験 抗原投与量／鶏 病変評価点 （ｎ ｇ） ２゜４４ ２．１３ ２．０９ ２．００ ２．２９ ２．７６ 表の結果はアイメリア・テネルラ糖脂質複合膜結合タン
パク質が２日令の鶏をコクチジウム病に対して免疫化す
るために使用しうろことを示している１通常の生の感染
後において免疫類に重い病変がなかったことから３回の
筋肉内予防接種で病気に対する十分な保護が与えられる
ことがわかる。
から鶏の 護試験 抗原投与量／鶏 病変評価点 （ｎ ｇ） ２゜４４ ２．１３ ２．０９ ２．００ ２．２９ ２．７６ 表の結果はアイメリア・テネルラ糖脂質複合膜結合タン
パク質が２日令の鶏をコクチジウム病に対して免疫化す
るために使用しうろことを示している１通常の生の感染
後において免疫類に重い病変がなかったことから３回の
筋肉内予防接種で病気に対する十分な保護が与えられる
ことがわかる。
手続補正書
平成２年４月５日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化することの
できる、アイメリア種の接合子 嚢、胞子化接合子嚢および種虫から得られた実質的に純
粋な糖脂質複合膜結合タンパク質免疫原。 ２、免疫原の糖脂質部分がリパーゼ処置後抗ＣＲＤ抗体
に結合する請求項１記載の実質的に純粋なアイメリア免
疫原。 ３、種がアイメリア・アセルブリナ、アイメリア・ミバ
ティ、アイメリア・ミチス、アイメリア・ブレアコクス
、アイメリア・ハガ ニ、アイメリア・ナクトリクス、アイメリ ア・マキシマ、アイメリア・ブルネッティおよびアイメ
リア・テネルラからなるアイメリア種の群から選択され
る請求項１記載のアイメリア糖脂質複合膜結合タンパク
質免疫原。 ４、アイメリア種がアイメリア・テネルラである請求項
３記載のアイメリア糖脂質複合膜結合タンパク質免疫原
。 ５、該タンパク質が実質的に結合糖脂質膜アンカーを含
有していない請求項１記載のタンパク質免疫原。 ６、該タンパク質が約３２０００ダルトンの分子量と約
４．６の等電点を有している請求項５記載のタンパク質
免疫原。 ７、該タンパク質が約２９０００ダルトンの分子量と約
４．８の等電点を有している請求項５記載のタンパク質
免疫原。 ８、該タンパク質が約２６０００ダルトンの分子量と約
５．０の等電点を有している請求項５記載のタンパク質
免疫原。 ９、該タンパク質が約１８０００ダルトンの分子量と約
４．８の等電点を有している請求項５記載のタンパク質
免疫原。 １０、少なくとも下記アミノ酸配列を有するアイメリア
・テネルラタンパク質免疫原およびその微少異種または
亜単位免疫原型。 【アミノ酸配列があります】 １１、少なくとも下記アミノ酸配列を有するアイメリア
・テネルラタンパク質免疫原およびその微少異種または
亜単位免疫原型。 【アミノ酸配列があります】 １２、請求項１記載の糖脂質複合膜結合タンパク質免疫
原の製造方法において、 ａ）未胞子化接合子嚢、胞子化接合子嚢および種虫の細
胞溶解産物を製造し、 ｂ）該細胞溶解産物をトリトーン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１
１４の処理にかけ、 ｃ）上記洗浄剤に富む相を集め、 ｄ）該洗浄剤に富む相のタンパク質を沈殿させ、そして ｅ）陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離するこ
とよりなる方法。 １３、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項１記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有す
るアイメリア免疫原組成物。 １４、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項５記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有す
るアイメリア免疫原組成物。 １５、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項６記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有す
るアイメリア免疫原組成物。 １６、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項７記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有す
るアイメリア免疫原組成物。 １７、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項８記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有す
るアイメリア免疫原組成物。 １８、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項９記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有す
るアイメリア免疫原組成物。 １９、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項１０記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有
するアイメリア免疫原組成物。 ２０、生理学的に許容される媒質中に免疫学的に有効量
の請求項１１記載の１種またはそれ以上の免疫原を含有
するアイメリア免疫原組成物。 ２１、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１３記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２２、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１４記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２３、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１５記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２４、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１６記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２５、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１７記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２６、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１８記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２７、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項１９記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。 ２８、コクチジウム病に対して家禽類を免疫化する方法
において、免疫学的に有効投与量の請求項２０記載の免
疫原組成物を投与することを特徴とする方法。
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