KR20100139096A

KR20100139096A - 조성물, 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20100139096A
Application number: KR1020107024065A
Authority: KR
Inventors: 토마스 플로처; 매뉴얼 캄포스; 리차드 하랜드; 토드 존슨; 트렌트 하비슨; 단 케일
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2010-12-31
Also published as: CA2719041C; EP2262828B1; HK1149770A1; KR101647159B1; EP2262828A1; CN101981052B; CL2009000768A1; CN101981052A; CA2719041A1; RU2555530C2; CO6290771A2; WO2009118273A1; US20110014225A1; BRPI0909493A2; ES2551699T3; US10261092B2; US9046528B2; AR071104A1; US20150293118A1; RU2010143903A

Abstract

교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 면역학적으로 교차-반응성을 갖는 분자를 결정하는 조성물 및 방법, 특히, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질을 결정하는 조성물 및 방법, 특히, 교차-반응성을 갖는 H. 파라수이스(H. parasuis) 단백질을 결정하는 조성물 및 방법을 비롯한 것으로서, 동물에게 순차적인 면역학적 시험감염을 사용함으로써 혈청학적 스크린에 기초하여 교차-반응성을 갖는 단백질을 결정하는 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 감염원, 특히, 감염성 미생물과 관련된 질환, 질병, 병태 또는 그의 증상의 진단, 및 그를 예방 또는 치료하는 방법을 위한, 특히, H. 파라수이스 감염과 관련된 질환, 질병, 병태 또는 그의 증상을 예방 및 치료하는 방법을 위해 상기 분자를 사용하는 조성물, 백신, 및 키트를 제공한다.

Description

조성물, 방법 및 키트{COMPOSITIONS, METHODS AND KITS}

본 발명은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 면역학적으로 교차-반응성을 갖는 분자를 결정하는 조성물 및 방법, 특히, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질을 결정하는 조성물 및 방법, 특히, 교차-반응성을 갖는 H. 파라수이스(H. parasuis) 단백질을 결정하는 조성물 및 방법을 비롯한 것으로서, 동물에게 순차적인 면역학적 시험감염을 사용함으로써 혈청학적 스크린에 기초하여 교차-반응성을 갖는 단백질을 결정하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 감염원, 특히, 감염성 미생물과 관련된 질환, 질병, 병태 또는 그의 증상의 진단, 및 그를 예방 또는 치료하는 방법, 특히, H. 파라수이스 감염과 관련된 질환, 질병, 병태 또는 그의 증상을 예방 및 치료하는 방법을 위해 상기 분자를 사용하는 조성물, 백신, 및 키트를 제공한다.

면역화의 원리는 본질적으로 두가지 중요한 면역 요소, 즉, 특이성 및 기억을 기초로 한다. 대개의 항원에 대한 반응으로 B 세포가 활성화되고 분화되기 위해서는 항원에 대해 2차로 노출되었을 때, 보다 신속한 반응을 매개할 준비가 되어 있는 항체 분비 혈장 세포 또는 기억 B 세포를 형성하도록 B 세포를 유도하는 각종의 신호가 필요하다. 기억 세포를 통해서 면역계는 항원과의 2차 조우시 보다 강력한 반응에 오를 수 있다. 이러한 2차 반응은 1차 반응보다 더 빠르게 나타날 뿐만 아니라, 더 효과적이기도 하다. 그러나, 본질상 항체는 매우 특이적이기 때문에, 그리고 감염원의 다양성을 고려하면, 다수의 다른 유형의 병원체 간의 또는 그들 내의 교차-반응성을 보이는 항체를 개발한다는 것이 여전히 중요한 문제로 남아있다.

그에 대한 교차-반응성을 보이는 항체를 개발한다는 것이 중요한 시험 과제로 남아있는 감염원의 일례로는, 돼지 다발장막염 및 관절염 (글래서병)의 병인체인 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis) (H. 파라수이스)가 있다. H. 파라수이스는 장액섬유소성 흉막염, 심장막염, 복막염, 관절염, 및 수막염에 걸린 돼지의 장액성 삼출물로부터 단리되는 그람-음성의, 때로는 캡슐형이고, 비운동성이고, 다형태인 세균이다. 1910년 글래서(Glasser)에 의해 최초로 설명된 이 유기체는, 비록 혐의 유기체가 원래는 헤모필루스 수이스(Haemophilus suis)로 지칭되기는 하였지만, 1922년 셔머(Schermer)와 에를리히(Ehrlich)에 의해 최초로 단리되었다고 볼 수 있다. 그러나, 1969년 비버슈타인(Biberstein)과 화이트(White)는 글래서의 병원체가 오직 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드 (NAD)만을 필요로 한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 철 포르피린 및 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드 (NAD), 두가지 모두를 필요로 하는 유기체인 헤모필루스 수이스가 이 질환에서 잠행성 특징이 되는 것은 아니며, "파라"라는 접두사를 추가함으로써 H. 파라수이스에게 새로운 유기체로 다시 이름을 붙여주었다.

H. 파라수이스에 대한 특징 규명은 지난 50여년 동안 상당한 진화를 이루었다. 바코스(Bakos) 등은 침강 시험을 사용하여 4개의 혈청형을 동정하게 되었으며, 그는 4개의 혈청형을 A-D로 명시하였다 (문헌 [Nordic Veterinary Medicine , 4:241-255 (1952)]). 1986년 상기 4개의 혈청형은 7개가 되었다 (문헌 [J Clin Microbiol, 23:1022-1025 (1986)]). 문헌 [Kielstein et al., Zentralbl Veterinarmed B, 38:315-320 (1991)]을 통해서는 6개가 더 추가되었고, 문헌 [Rapp-Gabrielson, Am J Vet Res, 53:659-664 (1992)]의 도움으로 추가의 또다른 5개의 부가되었다. 결국, 상기 분류는 개선되었다. 여러 명칭을 갖는 소수의 혈청형을 비롯한, 혈청형들 모두는 특이적인 토끼 혈청을 사용하여 수행되는 면역확신 시험에 기초하여 그들의 특징이 규명되었다. 그 결과는 전 세계적으로 수용되고 있는 적어도 15개의 혈청형을 나타내는 목록으로 나와 있다. 불행하게도, 혈청형을 결정할 수 없는 단리물 또한 상당수 존재한다. 추가로, 특정 국가에서는 H. 파라수이스의 혈청형 프로파일이 다수의 공개문헌 상에 기재되어 있다. 미국, 독일, 일본, 스페인, 캐나다 및 중국에서는 혈청형 4와 5가 흔한 것으로 제안되었다. 혈청형 5와 13은 호주와 덴마크에서 우세한 것으로 보고되었다.

H. 파라수이스의 발병 인자가 정의되지는 않았다. 몇몇은 더 높은 이환율과 사망률에 상응하기는 하지만, 대부분은 혈청형에 따라 발병력과 연관시켰다. 복강내 감염시, 혈청형 1, 5, 10, 12, 13, 및 14는 4일 이내에 높은 이환율과 사망률을 유발하는 것으로 보고되었다. 이에, 이러한 균주는 고도로 유독한 것으로 간주된다. 3가지 혈청형 (즉, 2, 4, 및 15)은 사망을 일으키지 않으면서 다발장막염을 유발함으로써 중간 정도 수준의 발병력을 나타내었다. 남아있는 혈청형의 경우, 병에 걸린 돼지에서는 임상적 질환이 나타나지 않았기 때문에 무발병성인 것으로 간주된다.

H. 파라수이스의 특이적인 발병 인자를 결정하려고 시도되어 왔다. 파스퇴렐라(Pasteurellaceae) 과의 한 구성원인 바, 몇몇 후보 물질은 캡슐, 섬모, 지질다당질 (LPS), 및 외막 단백질 (OMP)을 포함할 것으로 생각되었다. 그러나, 현재 H. 파라수이스의 이러한 특질들과 발병력 사이에 존재하는 어떤 상관관계도 도출해 내지 못하고 있다. 캡슐형의 균주는 건강한 돼지와 임상적인 증상을 나타내는 동물, 둘 모두의 비강에서 공통적으로 나타난다. 발병성 및 무발병성 혈청형 사이의 LPS 생산에는 어떤 유의적인 차이도 없음을 제안하면서, 그리고, LPS 및 OMP, 둘 모두를 포함한 제시는 오직 OMP에 대한 반응만을 유도하였다는 것을 보여준 보고를 통해 LPS의 중요성은 틀렸다는 것이 다소 폭로되었다.

OMP는 강한 체액 반응을 생성하는 것으로 나타났고, 이러한 카테고리로부터의 방어 면역원에 대한 후보물질로서 제안된 바 있다. OMP의 일반적인 프로파일은 두가지로 제시되고, 이는 발병력과 연관이 있을 수 있다. 대개의 발병성 혈청형은 두번째 프로파일을 특징으로 하는데, 이는 37 kDa 단백질에 의해 지배되는 것이다. 무발병성 혈청형은 다수의 밴드를 나타내는데, 23-40 kDa 사이에서 강한 밴드가 나타날 뿐만 아니라, 대략 68 kDa에서도 단백질 밴드가 나타난다.

H. 파라수이스 감염과 관련된 수개의 기타 다른 단백질이 제안되었다. P2 및 P5로 지정된 2가지의 콜로니 형성 단백질이 보고되었는데, 이들 두가지 모두 면역원성을 갖는다. 놀랍게도 P2는 혈청형 발병력에 따라 다르게 나타난다. 이는 무발병성 혈청형에서는 55 kDa 단백질로서, 및 발병성 혈청형에서는 48 kDa 단백질로서 지배적으로 나타난다. 이러한 단백질은 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)의 P2 단백질과 상동성을 나타낸다. 기타 다른 단백질들도 동정되었으며, 이는 H. 파라수이스 게놈의 TonB 영역의 상향조절을 설명한다. 이러한 영역은 철-결핍 환경에 반응하는 수개의 유전자를 포함한다. 구체적으로, 철을 제한하였을 때에 트랜스페린-결합 단백질이 동정되었고, 상향조절되는 것으로 나타났다. 철은 숙주에서 격리되어 있기 때문에, 상기와 같은 유전자는 숙주 내에 있는 병원체의 생존에 중요할 수 있다고 제안되었다.

추가로, 파스투렐라 멀토시다(Pasturella multocida)의 35 kDa MOMP에 대하여 유도된 폴리클로날 항체를 사용하여 42 kDa의 주요 외막 단백질 (MOMP)을 검출하였다. 밀접한 관련성을 가진 종인 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi)의, 잠재적으로 유사한 42 kDa 단백질을 분석한 결과, OmpA와 항원적으로 유사한 단백질인 것을 특징으로 하였다. 이러한 부류의 열-가변성 막 단백질은 H. 파라수이스 막 시료에 대하여 유도되는 모노클로날 항체를 발생시킴으로써 추가로 조사하였다. 상기 실험에서 하나는 35 kDa OMP에 대해 유도되고, 다른 하나는 LPS에 대해 유도되는 것인 2개의 모노클로날 항체를 사용하였다. 이러한 모노클로날 항체는 공통된 혈청형과 특이적으로 반응하는 것으로 보고되었으며, 진단학적 도구 또는 잠재적인 백신 표적으로서의 그의 잠재된 가치가 제안되었다.

뉴라미니다제가 또하나의 잠재적인 발병 인자이다. 야생 단리물 중 90％ 초과에서는 뉴라미니다제를 생산하는 것으로 보여진다. 상기 효소는 H. 파라수이스 성장기 중 후기에 발현이 되고, 필수적인 콜로니 형성 수용체의 노출과 숙주 내 뮤신 분해, 둘 모두와 상관관계가 있다.

H. 파라수이스는 숙주의 여러 부위를 감염시킬 수 있다. 그 결과, 임상적 징후는 감염 부위에 따라서 다르게 나타난다. 감염의 1차 형태로는 글래서병 (섬유소성 다발장막염), 패혈증 (다발장막염은 포함하지 않음), 급성 근염 (교근), 및 호흡기 질환인, 이 4가지가 있다. 감염 부위 또는 감염 유형과는 상관없이, H. 파라수이스 감염의 증상은 다소 일반적인 것으로 보고되었다. 보편적으로는 체온 상승, 무관심, 및 식욕 감퇴가 보고되어 있다. 보편적으로 나타나는 기타 다른 증상으로는 기침, 호흡곤란 (숨참), 체중 감소, 절름발이, 협응 부족, 청색증, 및 탈진을 포함하는 것으로 보고되어 있다.

특정-무병원체 (SPF) 무리가 널리 퍼진 후에야 H. 파라수이스가 주요 이슈가 되었다. 부분적으로는, 돼지 생산 사업의 진화로 인하여, 상기 사업은 특정-무병원체 무리의 확립을 포함하기도 하는데, H. 파라수이스는 경제적으로 상당한 병원체인 것으로 나타났다. 전형적으로, 감염은 부적절한 위생 상태 하에서 사육된 동물 또는 먹이를 충분하게 공급받지 못한 동물인 순수한 동물을 표적으로 한다. 추가로, 불안정한 수송과 연령대가 다른 돼지들의 혼합이 발병의 현저한 원인이 되어왔다. 고도한 밀집 상태로 존재하는 동물과, 이들 보호된 무리들 중 상대적으로 순수한 돼지 군집의 조합이 H. 파라수이스에 의해 유도되는 질환의 발병을 증가시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 추가로 문제를 복잡하게 만드는 것은 H. 파라수이스가 수개의 다른, 영역이 특이적인 혈청형에 존재한다는 사실이다. 하나의 혈청형에 대해 노출시키거나 그에 대해 면역화를 하여도 그외 다른 혈청형으로부터 반드시 보호되는 것은 아니라고 보고되었다. 따라서, 자기 백신을 개발하는 것이 미상의 혈청형 확산에 대한 제어 장치로서 제안되었다. 부분적으로는 상기와 같은 문제, 및 자가 세균 백신 생성과 돼지에의 노출 사이의 지체로 인하여, 국부적으로 혈청형이 널리 퍼지는 것과는 상관없이 자신있게 투여될 수 있는 교차-방어 백신이 필요시 되었다.

항생제를 사용하여 H. 파라수이스 감염을 치료하는 것은 임상적인 징후가 발생하였을 때 즉시 적용시키는 것으로 제안되었다. 불행하게도, 병원체의 침투적인 성질로 인하여 항생제의 유효량은 고투여량이어야 하고, 대개 비용도 많이 든다.

시판용 백신과 자가 백신, 이 둘 모두를 사용하는 면역화를 통해 구제하려고 시도되어 왔다. 교차-방어는 드문 일이기 때문에 H. 파라수이스 혈청형의 다양성으로 인하여 면역화 요법은 복잡해졌다. 혈청형을 결정할 수 없는 균주와 함께 조합을 이룬, 이와 같은 수많은 항원 프로파일을 통해 백신 개발이 어려워졌다.

동종의 시험감염에 대한 면역화에 의해서 방어하는 것 또한 제안된 바 있다. 사멸된 세균 백신 생성물은 공지된 혈청형 및 혈청형이 결정되지 않은 야생 단리물과 함께 생성될 때 동종의 시험감염에 대하여 방어할 수 있다는 것이 3개의 연구를 통해서 제안되었다. 본 연구를 통해 발병을 제어하여 사망률을 감소시키는 자가 백신의 용도가 밝혀졌다.

몇몇을 통해서는 기타 다른 발병성 균주로부터의 이종의 시험감염에 대하여 방어하기 위해 발병성 균주를 사용하는 것도 제안되었다. 한 연구를 통해서는 혈청형 13 및 14에 대하여 방어되는 혈청형 4 및 5를 포함하는 2가 백신에 대해 보고된 바 있다. 그러나, 그외 연구에서는 혈청형 2와 5 사이의 교차-방어를 밝혀내는 데 실패하였다.

추가로 다른 연구를 통해서는 저투여량의 살아있는 발병성 H. 파라수이스에 새끼 돼지를 제한적으로 노출시키는 것이 제안되었다. 그러나, 부분적으로 기타 다른 병원체, 예를 들면, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)와 함께 동시에 감염시키는 것은 해롭기 때문에, 이러한 접근법은 기능성을 갖는 구제 방법으로서 권고되지는 못했다.

부분적으로는 질환-유발 물질, 예컨대 H. 파라수이스가 다양하기 때문에 현재 이용가능한, 각종의 질환-유발 감염 구제 방법의 유효성이 제한되어 있는 바, 치료 및 예방용의 효과적인 방법 및 조성물이 필요시 되고 있으며, 특히, H. 파라수이스에 의한 감염 치료 및 예방용으로 효과적인 백신이 개발될 수 있도록 하며, 교차-반응성을 갖는 단백질을 동정하는 것이 특히 필요시 되고 있다.

본 발명의 요약

하나의 측면에서, 본 발명은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시키는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 항체는 순차적으로 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제1 면역학적 시험감염에 노출시킨 후에 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제2 면역학적 시험감염에 노출시킨 동물로부터 수득된 것이다. 적어도 하나의 항체가 제1 및 제2 항원 결정기에 결합하였다는 것은 교차-반응성을 시사하는 것이고, 이로써 상기 분자를 결정할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은

a) 동물에서 기억 B 세포를 활성화시켜 적어도 하나의 항체를 생산하고, 여기서 활성화시킨다는 것은 기억 B 세포를 활성화시키는 면역학적 반응을 유도하는 분자를 사용하여 동물을 면역학적으로 시험감염시키는 것을 포함하는 것인 단계; 및

b) 적어도 하나의 항체를 제2 분자와 접촉시키고, 여기서 적어도 하나의 항체가 상기 분자 및 제2 분자와 결합하였다면, 이로써 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자가 결정되는 것인 단계

를 포함하는, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는

로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 단리된 폴리펩티드는 H. 파라수이스의 적어도 2개의 혈청형에 의해 발현되는 단백질에 존재하는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 더 포함한다.

몇몇 측면에서, 본 발명은

로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 더 포함하며, H. 파라수이스 혈청형 5에 의해 발현되는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 예방학적 또는 치료학적 유효량의 단리된 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체 또는 부형제를 포함하는 백신을 제공한다. 상기 폴리펩티드는

또다른 측면에서, 본 발명은 동물의 H. 파라수이스 감염과 관련된 질환, 병태 또는 그의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 유효량의 예방학적 또는 치료학적 유효량의 단리된 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 비히클, 담체 또는 부형제를 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩티드는

다른 측면에서, 진단용 조성물, 방법, 및 키트를 본 발명에 따라 제공한다.

본 발명의 이점 및 이익은 본 명세서의 판독으로부터 당업자에게 자명해질 것이다.

도 1은 기관지 림프 (BL) 체액에 대한 초기 스크리닝에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 샘플 12를 제외한 모든 샘플을 2회에 걸쳐 진행시켰다. 샘플 1-4 및 8-11은 H. 파라수이스 혈청형 5에 대한 것으로서 시험하고, 샘플 5-6 및 12-15는 H. 파라수이스 혈청형 13에 대한 것으로 시험한다. 1: 음성 CDCD 혈청, 2: BL46, 3: BL47, 4: BL50, 5: BL46, 6: BL47, 7: BL50, 8: BL96, 9: BL98, 10: BL99, 11: BL142, 12: BL96, 13: BL98, 14: BL99, 15: BL142.
도 2는 BL47을 사용한 H. 파라수이스 혈청형 5, 13, 및 4의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 래인 1, 7-MW 마커 (상단에서부터: 200, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 및 20 kDa); 래인 3-H. 파라수이스 혈청형 5; 래인 5-H. 파라수이스 혈청형 13; 래인 9-H. 파라수이스 혈청형 4. 래인 2, 4, 6, 8, 10-어느 것도 포함하지 않은 빈 상태. 화살표는 관심의 대상이 되는 뚜렷이 나타난 밴드를 표시한다.
도 3은 전 세포 H. 파라수이스 혈청형 5 및 트윈(Tween)-20 추출된 H. 파라수이스 혈청형 5의 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE를 나타낸다. 블롯: 래인 1, 5-MW 마커 (상단에서부터: 200, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 및 20 kDa); 래인 3-전 세포 혈청형 5; 래인 7-혈청형 5의 트윈-20 추출물, 래인 2, 4, 6-어느 것도 포함하지 않은 빈 상태. SDS-PAGE: 래인 1, 5-MW 마커; 래인 3-전 세포 혈청형 5; 래인 7-1 1-혈청형 5의 트윈-20 추출물; 래인 2, 4, 6, 12-어느 것도 포함하지 않은 빈 상태.
도 4는 (a) 약 76 kDa; (b) 약 63 kDa; (c) 약 56 kDa; 및 (d) 약 28 kDa에 상응하는 겔에서 절단해 낸 밴드의 질량-분광분석법 (MALDI MS/MS)을 나타낸다.

상세한 설명

각종 측면과 실시태양은, 항원적으로 관련이 있는 분자를 인식하는 교차-반응성 항체를 제공할 수 있고, 이로써, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 세균, 바이러스 등과 관련된 것을 비롯한, 광범위한 범위의 병태 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 백신, 진단학적 적용, 및 방법에서 사용될 수 있는 분자를 동정하는 것을 포함하는 본 발명에 의해 제공한다. 본원에 기술된 신규한 접근법은 숙주를 예를 들면, 순차적으로 H. 파라수이스의 하나의 혈청형으로 시험감염시킨 뒤, 회복될 수 있도록 한 후, 다른 혈청형으로 시험감염시키는 것인, 시차를 두고 진행된 면역학적 시험감염 모델을 사용하여 교차-반응성 분자를 동정하기 위하여 숙주를 사용한다.

I. 정의

달리 구체적으로 명시되지 않는 한, "분자"라는 용어는 예로서, 당단백질 및 지질단백질, 다당질 (예로서, 지질다당질 포함), 핵산, 및 그의 단편을 비롯한 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다.

"면역원" 또는 "면역원성"이라는 용어는 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "항원 결정기"라는 용어는 B 세포 (즉, B 림프구) 및 B 세포에 의해 분비된 항체에 의해 인식되는 분자 (예로서, 폴리펩티드)의 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "교차-반응성을 갖는 항원 결정기"라는 용어는 같은 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 2개 이상의 분자 (예로서, 세균 단백질 변이체)에 존재하는 항원 결정기의 능력을 지칭한다. 추가로, 같은 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 항원 결정기를 포함하는 2개 이상의 분자는 같은 분자 또는 그의 단편, 서로의 변이체 또는 다른 분자일 수 있음을 이해하여야 한다. 같은 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 항원 결정기를 포함하는 단백질 (예로서, 세균 단백질 변이체)과 관련된 일례로, 단백질은 같거나 다른 1차 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 그러나, 단백질은 각각 같은 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 항원 결정기를 포함한다 (즉, "교차-반응성").

본원에서 사용되는 바, "교차-반응성 항체"라는 용어는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "치료하는"이라는 용어는 질환, 질병, 병태 또는 질환, 질병 또는 병태의 증상을 호전, 개선 또는 고치는 것을 지칭한다.

"예방"이라는 용어는 질환, 질병, 병태 또는 질환, 질병 또는 병태의 증상을 중단 또는 방지하는 것을 의미한다.

II . 교차-반응성 결정

하나의 측면에서, 본 발명은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항체는 순차적으로 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제1 면역학적 시험감염에 노출시킨 후에 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제2 면역학적 시험감염에 노출시킨 동물로부터 수득된 것이고, 여기서 적어도 하나의 항체가 제1 및 제2 항원 결정기에 결합하였다는 것은 교차-반응성을 시사하는 것이고, 이로써 상기 분자를 결정할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 제1 면역원성 조성물은 추가로 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제2 면역원성 조성물은 추가로 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제1 미생물에 의해 발현되고, 제2 폴리펩티드는 제2 미생물에 의해 발현되고, 여기서 제1 및 제2 미생물은 동일 종의 다른 혈청형인 것을 특징으로 한다. 또다른 실시태양에서, 제1 및 제2 미생물은 세균이다. 몇몇 실시태양에서, 세균은 H. 파라수이스이다.

일반적으로, 본 방법은 시험감염 사이에 회복 시간을 포함하면서, 동물에서 2회 이상 순차적으로 면역학적 시험감염을 하는 것을 포함한다. 이어서, 마지막 시험감염 이후의 시점에 예를 들면, 적어도 하나의 항체를 포함하는 동물의 림프절 및/또는 기타 다른 기억-세포가 풍부한 조직을 수거함으로써 적어도 하나의 항체를 동물로부터 수득한다. 임의의 특정 이론으로 제한되지 않고, 림프절 및/또는 기타 다른 기억-세포가 풍부한 조직을 수거함으로써 제1 시험감염에 대해 생성되는 기억 B 세포를 후속 시험감염에 대한 반응으로 기억 B 세포가 활성화된 이후에 수집할 수 있을 것으로 여겨진다. 활성화된 기억 B 세포는 제1 시험감염을 유도하는 제1 항원 결정기의 제거를 담당하며, 제2 항원 결정기에 의해 유도되는 후속 시험감염에 대한 반응으로 활성화된 기억 B 세포가 생산하게 되는 항체를 시험하여 제1 및 제2 항원 결정기와 그의 교차-반응성을 결정함으로써 그들 각각의 교차-반응성 분자를 결정할 수 있다.

본 방법에 사용하기에 적합한 동물로는 돼지(swine) (예로서, 돼지(pig)), 소, 양, 기니아 피그, 토끼, 마우스, 래트, 염소, 및 말을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 동물은 제왕절개 유래의 초유를 먹이지 않은 동물이다. 또다른 실시태양에서, 동물은 돼지이다. 몇몇 실시태양에서, 제왕절개 유래의 초유를 먹이지 않은 동물은 제왕절개 유래의 초유를 먹이지 않은 돼지이다. 다른 실시태양에서, 동물은 적어도 약 1주령, 예시적으로, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10주령된 것이다.

기억 B 세포가 제1 시험감염에 대하여 생성되고, 제2 항원 결정기를 사용한 동물의 후속 시험감염시에 활성화된다면, 다수의 어느 방식으로든 동물은 제1 및 제2 면역학적 시험감염에 노출될 수 있다. 바람직하게, 항원은 시험감염 조성물 중에 함유되어 있다. 예를 들면, 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 시험감염 조성물 및 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 시험감염 조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 진피내, 경피, 경구, 및 비내를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적절한 투여 경로에 의해서 동물에게 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 범주 내에서 시험감염에 노출시킬 수 있는 기타 다른 방법으로는 면역화 및 면역원 (예로서, 감염원)에의 자연적인 노출을 포함한다. 따라서, 면역학적 시험감염은 또한 예를 들면, 감염원 (예로서, 세균, 바이러스, 기생충)에 동물을 노출시키는 것을 통해 동물을 항원 결정기에 자연적으로 노출시킴으로써 유도되는 시험감염을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 제1 면역학적 시험감염은 제1 혈청형에 속하는 세균 균주에 의해 동물을 자연적으로 감염시킴으로써 유도되는 시험감염일 수 있고, 이에 후속하여 균주의 제2 혈청형 (즉, 제2 항원 결정기)을 갖는 제2 시험감염 조성물의 비내 투여를 포함하는 제2 시험감염이 수행된다.

항원을 포함하는 시험감염 조성물은 임의로 추가로 완충액을 포함할 수 있고/거나, 원하는 시험감염 효능을 달성하고/거나, 시험감염을 받은 동물에게 일어나는 부작용을 최소화시키는 데 도움이 되는 기타 다른 성분들을 더 포함할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 제1 및 제2 시험감염 조성물은 펩톤 완충액 또는 생리 식염수를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제1 및 제2 시험감염 조성물은 펩톤 완충액을 포함하고, 여기서 제1 시험감염 조성물은 추가로 제1 세균을 포함하고, 여기서 제2 시험감염 조성물은 제2 세균을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 세균은 동일 종의 다른 혈청형에 속하는 것이다.

하나의 실시태양에서, 제1 시험감염을 동물에게 투여한 후 적어도 약 1주 경과하였을 때, 예시적으로 제1 시험감염 후 약 1주 내지 약 1년, 약 2주 내지 약 10개월, 약 3주 내지 약 8개월, 약 1개월 내지 약 6개월, 및 약 2개월 내지 약 4개월 경과하였을 때, 제2 시험감염이 동물에게 투여된다.

이에, 면역학적 기억이 본 발명에 대한 기본 원리를 제공한다. 따라서, 본 방법은 제2 면역학적 시험감염 이후 동물로부터 유래된 생물학적 샘플을 제공하는 것을 포함하고, 여기서 생물학적 샘플은 항체-생산 기억 세포를 포함한다. 생물학적 샘플은 임의의 적합한 유형의 것일 수 있다. 생물학적 샘플은 동물의 조직, 기관, 혈액, 림프 또는 림프절로부터 유래된 것일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 예를 들면, 림프절 중의 감염 부위 또는 형성될 수 있는 병소 부위 또는 감염 부위 또는 병소에 밀접해 있는 부위로부터 채취될 수 있다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 기억 B 세포를 제공하는 동물의 림프절 및/또는 기타 다른 기억-세포가 풍부한 조직을 수거함으로써 수득한다.

일반적으로, 생물학적 샘플은 제2 시험감염 이후의 시점에 동물로부터 채취한다. 샘플을 채취하는 상기 시점은 동물, 시험감염 조성물, 샘플 채취 이후 임의의 고려시 되는 단계 (예로서, 후속 배양 조건) 등을 비롯한, 다수의 인자에 따라 달라질 수 있고, 통상의 실험을 통해 미리 결정될 수 있다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 기억 세포가 충분히 활성화된 시점에 제2 시험감염 이후 동물로부터 채취된다. 하나의 실시태양에서, 생물학적 샘플은 제2 시험감염 이후 약 24시간이 경과하였을 때, 예시적으로 마지막 시험감염 이후 약 1일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 10일, 및 약 6일 내지 약 8일이 경과하였을 때 채취된다.

동물로부터 생물학적 샘플을 제거한 후, 생물학적 샘플 중에 존재하는 항체-생산 기억 세포를 추가로 공정처리하여 적어도 하나의 항체를 수득할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 동물로부터 생물학적 샘플을 제거한 후, 생물학적 샘플 중에 존재하는 항체-생산 기억 세포를 시험관내에서 배양한다. 항체-생산 기억 세포를 시험관내에서 배양하는 것은 세포의 하위-군집을 분리해 내는 사전 단계 이후에 또는 그러한 사전 단계없이 수행될 수 있다. 배양 기법은 당업계에 공지되어 있다.

배양물의 상등액은 시험관내에서 배양하는 동안 기억 세포에 의해 분비된 항체를 포함할 수 있고, 따라서, 적어도 하나의 항체를 수거하는 것은 배양 배지로부터 상등액을 수거함으로써 수행될 수 있다. 배양된 세포에 의해 생산된 항체는 또한 적어도 하나의 항체를 방출하는 기억 B 세포의 용해에 의해 배양된 세포로부터 방출될 수 있다.

세포 증식을 촉진시키고/거나, 항체 생산 및/또는 분비를 증진시키는 물질을 세포 배양물에 첨가함으로써 활성화된 기억 세포에 의한 적어도 하나의 항체의 시험관내 생산 및/또는 배양 배지 내로의 분비는 증진될 수 있다. 그러한 물질은 단독으로 또는 조합으로 사이토카인, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 인터루킨, 예로서, IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8, 콜로니 자극 인자, 인터페론, 및 B 세포 활성화, 증식, 및/또는 항체 생산 및/또는 분비에 대해 증진 효과를 갖는 것으로 보여질 수 있는 임의의 기타 다른 인자를 포함한다. 예를 들면, 세포 활성화는 미토겐, 및 백혈구에 의해 생산된 인자 또는 그의 합성 등가물 또는 그의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 활성화 제제를 배양 배지에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 항미생물제가 배양 배지에 포함된다.

적어도 하나의 항체를 포함하는 세포 배양물 상등액은 적어도 하나의 항체가 제1 및 제2 항원 결정기에 결합하는지를 결정하는 데 직접적으로 사용될 수 있다. 다시 말해, 적어도 하나의 항체는 간단하게 배양 배지로부터 수거된 상등액 형태로 사용될 수 있다.

다른 실시태양에서, 생물학적 샘플은 동물로부터 수거될 수 있고, 그에 함유되어 있는 B-림프구는 무한증식성일 수 있고/거나, 클로닝될 수 있다. 융합 파트너는 당업계에 공지되어 있는데, 이는 B-림프구를 무한증식시킬 수 있다. 융합을 위해 사용되는 방법은 융합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 예로서, 비-이온성 계면활성제와 같은 융합 유도 물질의 존재하에서 B-림프구를 융합 파트너와 조합한 후, 융합 파트너에 존재하는 마커를 통해 생성된 하이브리도마를 선별해 내는 것을 포함한다. 이어서, 오염 세포가 없는 클론을 제공하기 위해 세포를 제한 희석법으로 희석시킴으로써 동종 항체 조성물을 제공할 수 있다. 이어서, 하이브리도마를 배양물 중에서 증식시킬 수 있거나, 숙주 동물, 예로서, 마우스 또는 래트 내로 도입하여 항체가 풍부한 복수액을 생산할 수 있다.

원한다면, 적어도 하나의 항체를 정제 및/또는 분획 방법을 사용하여 처리할 수 있다. 예를 들면, 혈청 또는 혈장으로부터 면역글로불린을 정제하는 데 사용되는 것, 예로서, 흡착법, 황산암모늄을 사용한 침전법, 카프릴산을 사용한 분획법, 이온 교환 크로마토그래피 또는 고정된 단백질 G 또는 단백질 A로부터의 결합 및 용출에 의한 방법과 같은 기법이 사용될 수 있다. 또한, 특정의 설정 또는 적용에 따라 적어도 하나의 항체는 또한 적합한 지지체, 예로서, 친화성 크로마토그래피 지지체에 커플링될 수 있다.

따라서, 예를 들면, 적어도 하나의 항체를 포함하는 용액은 또한 적어도 하나의 원치않는 비-특이성 항체를 함유할 수 있는데, 이는 적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시키는 단계 동안 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 원한다면, 원치않는 항체는, 예로서, 적어도 하나의 항체를 포함하는 용액을, 예로서, 난황, 조직 분말, 미생물 현탁액을 비롯한 각종 반응물을 사용하여 흡착시킴으로써 용액으로부터 제거할 수 있다. 동물로부터 수집된 면역전 혈청 또한 흡착에 사용될 수 있다. 예시적으로, 또다른 일례로서, 1종의 세균을 사용한 시험감염에 대한 반응으로 생산된 적어도 하나의 항체를 포함하는 용액을 예를 들면, 계면활성제로 추출된, 또다른 종의 세균 세포 현탁액과 함께 인큐베이션시킨 후, 원심분리하고, 적어도 하나의 항체를 포함하는 상등액을 수집할 수 있다. 관련이 없는 항체에 기인한 비-특이성 결합을 최소화시키기 위해 흡착을 1회 초과로 수행할 수 있다.

본 발명에 따라, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정하는 방법은 적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시키는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 항체의 제1 및 제2 항원 결정기에의 결합이 분자를 결정하게 된다. 접촉은 당업계에 공지된 하나의 기법 또는 기법을 조합하여 사용함으로써 수행될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 적어도 하나의 항체가 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기에 결합하였는지 여부를 결정하는 것을 더 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 예시적인 기법으로는 제한없이, 웨스턴 블롯팅, 면역침전법, 방사선면역분석법, 효소-결합 면역분석법 (ELISA), 및 면역 형광 분석법을 포함한다. 그러한 기법은, 항원 결정기를 포함하는 분자가 단백질일 경우에 특히 바람직하다. 하나의 실시태양에서, 접촉 단계를 웨스턴 블롯을 사용하여 적어도 하나의 항체가 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기에 결합하였는지 여부를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 단백질은 각각 제1 및 제2 항원 결정기를 포함한다.

예를 들면, 결정하고자 하는 분자가 단백질일 경우, 제1 항원 결정기를 갖는 제1 단백질을 포함하는 제1 조성물과, 제2 항원 결정기를 갖는 제2 단백질을 포함하는 제2 조성물을 각각 개별적으로 표준 완충액과 함께 혼합하고, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS/PAGE)에 가하여 처리한 후, 적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시킨 후에 니트로-셀룰로스, 나일론 또는 기타 다른 막으로 옮길 수 있다. 이어서, 적어도 하나의 항체의 제1 및 제2 항원 결정기에의 결합은 예를 들면, 적어도 하나의 항체의 공급원 (즉, 동물)에 따라 표지되고 분비될 수 있는 2차 항체를 첨가함으로써 시각화될 수 있다. 이어서, 제1 및 제2 단백질에 상응하는 검출가능한 밴드의 비교 분석을 수행함으로써 적어도 하나의 항체의 제1 및 제2 항원 결정기에의 결합을 검출할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 항체가 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기에 결합하였다는 것은 적어도 하나의 항체가 제1 및 제2 항원 결정기와 교차-반응성이라는 것을 시사하는 것이다. 따라서, 제1 및 제2 항원 결정기는 교차-반응성이고, 이로써, 상기 분자 (즉, 단백질)를 결정할 수 있으며, 이 분자는 당업자에 공지된 기법을 사용함으로써 그의 특징이 추가로 규명될 수 있다.

일례로, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기가 단백질에 의해 생성된 경우, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 것으로 결정된 단백질의 특징을 추가로 규명하는 다수의 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, SDS/PAGE 또는 막으로의 겔 전달 이후, 단백질에 상응하는 겔 또는 막에 있는 영역을 겔 또는 막으로부터 절단하거나 용리시킬 수 있고, 질량 분광분석법 및 N-말단 아미노산 서열 분석 (예로서, 에드만 분해(Edman degradation))을 비롯한 공지된 기법을 사용하여 추가로 분석하기 위해 적어도 부분적으로 정제시킬 수 있다. 추가로, 아미노산 서열 정보를 임의의 공지된 아미노산 서열과 (예로서, 상동성 비교에 의해) 비교함으로써 단백질의 동일성을 측정하고/거나, 추가로 그 특징을 규명할 수 있다. 추가로, 아미노산 서열 정보를 이용하여 상응하는 핵산 서열 정보를 도출해 낼 수 있으며, 이를 통해서 그 중에서도 특히 특이적인 핵산 증폭 및/또는 클로닝 목적을 위한 프라이머 및 프로브를 제공할 수 있다. 따라서, 다른 실시태양에서, 본 방법은 추가로 분자의 적어도 일부분의 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 분자는 단백질이다.

따라서, 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질을 결정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항체는 순차적으로 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제1 면역학적 시험감염에 노출시킨 후에 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제2 면역학적 시험감염에 노출시킨 동물로부터 수득되고, 여기서 적어도 하나의 항체가 제1 및 제2 항원 결정기에 결합하였다는 것은 교차-반응성을 시사하는 것이고, 이로써 상기 단백질을 결정할 수 있다. 접촉은 상기 기술된 바와 같이 수행된다.

하나의 실시태양에서, 단백질은 H. 파라수이스에 의해 발현된다. 또다른 실시태양에서, 제1 면역원성 조성물은 추가로 제1 혈청형으로부터의 H. 파라수이스 세균을 포함하고, 여기서 제2 면역원성 조성물은 추가로 제2 혈청형으로부터의 H. 파라수이스를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 제1 혈청형은 H. 파라수이스 혈청형 5이고, 제2 혈청형은 H. 파라수이스 혈청형 13이다.

따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은

a) 동물에서 기억 B 세포를 활성화시켜 적어도 하나의 항체를 생산하고, 여기서 활성화시킨다는 것은 기억 B 세포를 활성화시키는 면역학적 반응을 유도하는 제2 분자를 사용하여 동물을 면역학적으로 시험감염시키는 것을 포함하는 것인 단계; 및

b) 적어도 하나의 항체를 상기 분자 및 제2 분자와 접촉시키고, 여기서 적어도 하나의 항체가 상기 분자 및 제2 분자와 결합하였다면, 이로써 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자가 결정되는 것인 단계

III . 단리된 분자

다른 측면에서, 본 발명은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단리된 분자 또는 그의 단편을 제공한다. 단리된 분자는 단백질이다. 또다른 실시태양에서, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기는 H. 파라수이스의 적어도 2개의 혈청형에서 발현되는 단백질에 존재한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은

로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 H. 파라수이스의 적어도 2개의 혈청형에 의해 발현되는 단백질에 존재하는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 더 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은

로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 더 포함하고, H. 파라수이스 혈청형 5에 의해 발현된 것이다.

서열번호: 1-5의 아미노산 서열을, 진뱅크(GENBANK)에 제출된 H. 파라수이스 아미노산 서열의 각종 세그먼트와 비교함으로써 적어도 하기와 같은 상동성을 밝혀냈다: 서열번호: 1 ＆ 수탁번호: ZP_02478744; 서열번호: 2 ＆ 수탁번호: ZP_02477919; 서열번호: 3 ＆ 수탁번호: ZP_02478157; 서열번호: 4 ＆ 수탁번호: ZP_02478801; 및 서열번호: 5 ＆ 수탁번호: ZP_02477404. 수탁번호: ZP_02478744, ZP_02477919, ZP_02478157, ZP_02478801, 및 ZP_02477404는 그 전체 내용이 본원에서 참고로 인용된다.

IV . 조성물, 백신, 진단, 및 키트

본 발명의 각종의 기타 다른 측면에서, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 것으로 결정된 분자에 기초한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 바람직하게, 결정된 분자는 질환-유발 병원체에 의해 발현되는 단백질이다. 질환-유발 병원체는 바람직하게 세균, 바람직하게, H. 파라수이스이지만, 그러나, 본 발명은 그에 대한 것으로 제한되지 않고, 하기의 설명은 단지 본 발명의 H. 파라수이스, 및 H. 파라수이스 단백질 및 폴리펩티드에 대한 언급을 통해 예시된다.

능동 면역화용 백신

하나의 측면에서, 본 발명은 H. 파라수이스 감염으로부터 치료하거나 그로부터 보호하기 위한 목적으로 디자인된 능동 면역화용 백신을 제공하며, 이러한 백신은 당업계에 주지되어 있는 통상의 백신 제조 방법을 사용함으로써 상기 기술된 바와 같이 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 H. 파라수이스 단백질 또는 그의 단편으로부터 제조될 수 있다. 전형적으로, 면역학적 양의, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편을 적합한 제약상 허용되는 비히클, 담체 또는 부형제와 조합하고, 인간 또는 동물을 면역화시키는 데 유효한 양으로 상기 백신을 적절히 투여할 수 있다. 면역학적 양이란 인간 또는 동물에서 면역원성 반응을 일으키기에 충분한, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편의 양을 지칭하는 것으로 당업계의 숙련인은 이해할 것이다.

본 발명의 백신의 활성 성분으로서의 역할을 하는, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 원하는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다수의 접근법들 중 어느 하나에 의해서 폴리펩티드 그 크기에 따라 다르게 제조될 수 있다.

예를 들면, 원하는 폴리펩티드 서열이 상대적으로 단쇄일 경우, 예로서, 본질적으로 교차-반응성을 갖는 항원 결정기로 구성된 아미노산에 상응하는 것인 경우, 당업계의 현 표준 방법을 사용하는 화학적 합성법이 적합하다. 전형적인 방법으로, C-말단 아미노산을 고체 지지체에 결합시키고, 자가-축합을 막기 위해 아미노기가 보호되어 있는 서열의 다음 아미노산과 반응시킬 수 있다. 최초 커플링 이후에 NH₂ 보호기를 제거할 수 있고, 커플링 과정은 순서대로 다음에 있는 아미노산을 사용함으로써 반복될 수 있다.

또는, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면, 발효기 배양물로부터 천연 단백질을 정제한 후, 각종 기법에 의해 원하는 단편을 생성해 내고, 원하는 단편을 정제해 냄으로써 제조할 수 있다. 재조합 DNA 방법은 원하는 펩티드를 합성하는 또다른 방법을 제공한다. 원하는 펩티드 또는 단백질에 대한 DNA 코딩 서열 (예로서, cDNA, 게놈 분해물)을 수혜자 균주를 형질전환시키는 데 적합한 발현 벡터로 결찰시킴으로써 유전자를 발현시키고 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래되었건, 화학적 방법을 사용하는 올리고뉴클레오티드 합성법에 의한 것이건 간에, 코딩 서열은 원하는 코딩 서열의 삽입을 위해 편리한 제한 부위를 포함하는 플라스미드 중 세균 숙주와 화합성을 띠는 프로모터 서열의 제어하에 배치될 수 있다. 생성된 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적합한 세균 숙주 내로 형질전환될 수 있다. 성공적으로 형질전환이 이루어진 형질전환체는 재조합 또는 천연 균주에서 발견되는 것보다 더 높은 수준으로 원하는 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있다. 별법으로, 이러한 펩티드는 적절한 제어 서열, 벡터, 및 형질전환 기법의 사용으로 비세균성 재조합 숙주에서도 생산될 수 있다.

교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 펩티드 서열이 너무 작아 면역원성을 띨 수 없다고 판단되는 경우에는, 상기 펩티드 서열에 면역원성 특성을 부여하기 위해 이를 캐리어 물질에 결합시킬 수 있다. 당업계에 공지된 상기와 같은 결합을 형성하는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 하나의 관능기 말단에 디설피드 결합, 및 나머지 다른 한쪽 말단에 펩티드 결합을 생성하는 이종이작용성 제제가 다수 존재하며, 이는 광범위하게 사용되어 왔다. 이중 가장 보편적으로 사용되는 것은 N-숙시디미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP)이다. 이러한 시약은 그 자신과 단백질 중의 시스테인 잔기 사이의 디설피드 결합을 형성하고, 리신 상의 아미노 또는 나머지 다른 하나의 기타 다른 유리 아미노기를 통해 아미드 결합을 형성한다. 각종의 상기와 같은 디설피드/아미드 형성제가 공지되어 있다. 기타 다른 이작용성 커플링제는 디설피드 결합보다는 티오에테르를 형성한다. 다수의 이러한 티오에테르 형성제가 상업적으로 이용가능하며, 6-말레이미도카프로산, 2 브로모아세트산, 2-요오도아세트산, 4-(N-말레이미도-메틸) 사이클로헥산-1-카르복실산의 반응성 에스테르 등을 포함한다. 카르복실기는 그와 숙신이미드 또는 1-하이드록시-2-니트로-4-설폰산, 나트륨 염과의 조합에 의해 활성화될 수 있다. 펩티드가 적합한 시스테인을 포함하지 않는다면, 펩티드 제조시에 어느쪽 말단에든 추가의 시스테인 잔기를 첨가할 수 있다. 전형적으로는 오직 단쇄의 펩티드만이 캐리어에 접합될 필요가 있기 때문에 이러한 잔기는 화학적으로 합성되는 동안에 적절하게 포함시킬 수 있다.

활성 성분으로서 펩티드 서열을 포함하는 백신을 제조하는 것은 당업계에 주지되어 있다. 전형적으로, 상기와 같은 백신은 액상 용액 또는 현탁액의 주사제로서 제조되고; 주사되기 이전에 액상의 용액 또는 현탁액으로 제조되기에 적합한 고체 제형으로도 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 대개 제약상 허용가능하고 활성 성분과 화합성인 부형제와 함께 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 그의 조합물이다. 추가로, 원한다면, 백신은 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제, 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효능을 증진시켜 주는 애주번트를 함유할 수 있다. 백신은 통상 주사에 의해 비경구적으로, 예를 들면, 피하로 또는 근육내로 투여된다. 기타 다른 투여 방식에 적합한 추가의 제제로는 좌제, 및 몇몇 경우에는 경구용 제제를 포함한다. 좌제의 경우, 종래의 결합제 및 캐리어는 예를 들면, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있고; 그러한 좌제는 활성 성분을 0.5％ 내지 10％, 바람직하게 1-2％의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제제는 예를 들면, 제약 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같이 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 지효성 제제 또는 분제의 형태를 취하고, 활성 성분을 10％-95％, 바람직하게는 25-70％ 포함한다.

본 발명의 아미노산 서열은 (펩티드의 유리 아미노기로 형성되고) 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 예로서, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가 염을 비롯한, 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

백신은 투여 제제와 화합성인 방식으로, 및 예방학적 또는 치료학적으로 유효하고 면역학적인 양으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 치료하고자 하는 피험체, 항체를 합성할 수 있는 피험체의 면역계의 능력, 및 원하는 보호 정도에 따라 달라질 수 있다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 의료 돌보미/진료의의 판단에 따라 달라질 수 있다. 피하 또는 근육 주사에 적합한 투여량 범위는 예를 들면, 피험체 1명당 활성 성분 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg일 수 있다. 경구용, 직장 좌제용, 요도용 또는 질내용 제제의 경우, 투여량은 예시적으로 약 10 ㎍ 내지 약 100 mg 범위일 수 있다. 최초 투여 및 추가 주사에 적합한 요법 또한 달라질 수 있지만, 최초 투여한 후, 후속 주사 또는 기타 다른 투여는 약 1 내지 약 2주 간격으로 수행되는 것이 대표적이다.

항체

또다른 측면에서, 본 발명은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 인식할 수 있도록 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편으로부터 생성될 수 있는 단리된 항체를 제공하고, 여기서 단백질은 H. 파라수이스에 의해 발현되는 것이다. 이러한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 폴리클로날 항체가 바람직하다면, 이는 당업계에 공지된 다수의 종래 방법들 중 어느 방법으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편은 적합한 숙주 동물, 예로서, 마우스 또는 토끼 내로 주사될 수 있고, 적합한 시간이 경과한 후, 항체는 숙주 동물로부터 단리되고 회수될 수 있다. 모노클로날 항체와 관련하여 본 발명에 따라 상기 항체는 예로서, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495497 (1975)]의 주지된 방법 또는 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,331,415호, 제5,981,216호, 제5,807,715호, 및 제4,816,567호에 개시된 방법 (이들 문헌은 모노클로날 항체에 관한 교시를 위한 본원에서 참고로 인용된다)을 비롯한 임의의 여러 방법으로 생산될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함한다. 모노클로날 항체는 또한 단일 쇄, 예를 들면, 경쇄 또는 중쇄로부터 제조될 수 있고, 추가로는 또한 전 항체의 결합 특징 (예로서, 교차-반응성, 특이성, 및/또는 친화성)을 보유하는 항체의 활성 단편으로부터 제조될 수 있다. 활성 단편이란, H. 파라수이스의 다른 혈청형으로부터 유래된 특정의 교차-반응성을 갖는 항원 결정기에 결합하는 완전한 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체 단편이고, 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 상기 단편을 포함한다는 것도 의미한다. 추가로, 본 발명에 따라 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 제조된 항혈청 또한 주시되고, 당업자가 이해할 수 있는 적합한 다수의 방법으로 제조될 수 있다.

교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는, 재조합 형태의 단백질 또는 그의 단편을 사용하여 항체를 생산하는 것이 바람직하기는 하지만, 항체는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는, 천연의 단리되고 정제된 버전의 단백질 또는 그의 단편으로부터 생성될 수 있으며, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 상기 항체를 수득하는 것에 관해 상기 기술된 것과 동일한 방식으로 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편을 사용하여 생성될 수 있다.

수동 면역화

면역학적 양의, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편의 투여를 통해 항체가 환자에서 생성되는 것인 활성 백신 이외에도, 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 활성 단편은 또한 H. 파라수이스 감염에 대해 수동 면역화시키기 위한 제약 조성물 및/또는 백신 개발에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 (즉, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 인식할 수 있는 항체)는 또한 H. 파라수이스 세균에 의해 유발된 감염을 치료 또는 예방하기 위한 목적으로 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합한 제약 조성물로 형성될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 유효 단편을 함유하는 제약 조성물은 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 기타 다른 치료학적 화합물, 그의 조합물을 비롯한, 당업계에서 보편적으로 사용되는 임의의 적합한 제약 비히클, 부형제 또는 담체와 함께 조합하여 제조될 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 사용되는 특정의 비히클, 부형제 또는 담체는 의도된 수혜자 및 수혜자의 상태에 따라 달라질 것이고, 당업계의 숙련인이 이해하고 있는 바와 같이, 다양한 투여 방식이 본 발명의 조성물에 적합할 것이다. 제약 조성물의 적합한 투여 방법으로는 국소, 경구, 항문, 질내, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 및 진피내 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

국소 투여의 경우, 조성물은 연고, 크림, 겔, 로션, 점적제 (예를 들면, 점안제 및 점이제) 또는 액제 (예를 들면, 예를 들면, 구강 청결제)의 형태로 제조될 수 있다. 상처 또는 외과용 드레싱, 봉합사 및 에어로졸에 본 조성물이 주입될 수 있다. 본 조성물은 종래의 첨가제, 예를 들면, 방부제, 투과 촉진 용매, 및 완화제를 함유할 수 있다. 국소용 제제는 또한 종래의 담체, 예를 들면, 크림 또는 연고 베이스, 에탄올 또는 올레일 알코올을 함유할 수 있다.

본 발명의 항체 조성물은 또한 면역원성 반응을 증진시키는 데 유효한 양으로 적합한 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 적합한 애주번트로는 알룸 (인산알루미늄 또는 수산화알루미늄) (이는 인간에서 널리 사용된다), 및 기타 다른 애주번트, 예를 들면, 사포닌 및 그의 정제된 성분인 Quil A, 프로인트 완전 애주번트, RIBBI 애주번트, 및 연구용 및 수의학적 용도로 사용되는 기타 다른 애주번트를 포함한다. 기타 다른 화학적으로 정의된 제제의 예로는 무라밀 디펩티드, 모노포스포릴 지질 A, 인지질 접합체, 프로테오리포좀 내 접합체의 캡슐화, 및 지질 소포체 중의 단백질 캡슐화를 포함한다.

상기 기술된 바와 같이 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 인식하는 본 발명의 항체 조성물은 H. 파라수이스 감염을 예방 또는 치료하는 방법에서 유용할 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 H. 파라수이스 감염을 예방 또는 치료하기 위해 상기 기술된 바와 같은 교차-반응성을 갖는 항원 결정기에 대한 항체를 유효량 투여하는 단계를 포함하는, H. 파라수이스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 항체 조성물의 투여를 위한 바람직한 투여량은 H. 파라수이스 감염을 예방 또는 치료하는 데 유효한 양이 되고, 상기 양은 감염의 성질, 및 피험체의 상태에 따라 달라질 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 항체 또는 제약 제제의 "유효량"이란 원하는 예방학적 또는 치료학적 효과를 발휘할 수 있는, 비독성이되 충분한 상기 제제의 양을 의미하는 것으로 한다. 요구되는, 항체 또는 특정 제제의 정확한 양은 피험체의 종, 연령, 및 일반적인 건강 상태, 치료하려는 병태의 중증도, 사용되는 특정 담체 또는 애주번트, 및 그의 투여 방식 등에 따라 피험체마다 달라질 것이다. 따라서, 임의의 특정 항체 조성물의 "유효량"은 특정의 환경을 토대로 하여 달라질 것이고, 적절한 유효량은 각각 적용시마다 통상의 실험을 사용함으로써 당업계의 숙련인에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 조성물을 투여받는 각개의 피험체에게 적합하도록 조절될 수 있으며, 이는 각 개체의 연령, 체중, 및 대사에 따라 달라질 것이다. 조성물은 또한 안정화제 또는 제약상 허용되는 방부제를 함유할 수 있다.

이에, 본 발명의 항체는 따라서 유효량의 항체 조성물을 인간 또는 동물에게 투여할 때 인간 또는 동물에서 H. 파라수이스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공할 것이고, 여기서 유효량은 상기 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양이다. 당업계의 숙련인이 이해하고 있는 바와 같이, 감염을 치료 또는 예방하는 데 유효할 수 있게 하는 데 필요한 항체 역가 수준은 피험체의 성질 및 상태, 및/또는 임의의 기존 감염의 중증도에 따라 달라질 것이다.

추가로, 본 발명의 항체는 투여시에 더 작은 면역원성을 갖도록 변형될 수 있다. 항체의 인간 수혜자와 관련된 일례로, 항체는 하이브리도마-유래 항체의 상보성 결정 영역을 인간 모노클로날 항체로 이식함으로써 "인간화"될 수 있거나, 상동성인 인간 프레임워크 대응부를 모사하기 위해 면역글로불린 가변 영역 중의 표면에 노출된 뮤린 프레임워크 잔기를 변형시킴으로써 "버니어링(veneer)"될 수 있다. 또한 추가로, 원할 경우, 본 발명의 모노클로날 항체는 필요에 따라 세균 감염의 퇴치할 수 있는 본 조성물의 능력을 추가로 증진시키는 적합한 항생제와 함께 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 단백질 또는 그의 단편은 활성 백신으로서 사용될 수 있고, 본 발명의 항체는 H. 파라수이스 감염을 치료 또는 예방하는 데 적합한 항체를 제공함에 있어 유용한 수동 백신으로서 사용될 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 백신은 예를 들면, 비경구 (예로서, 근육내, 진피내 또는 피하) 투여 또는 코인두 (예로서, 비내) 투여에 의한 것과 같이 다수의 적합한 방식으로 투여하기 위한 백신으로 패키징될 수 있다. 백신은 투여시 재현탁을 위해 동결건조될 수 있거나, 용액 상태일 수 있다.

진단제

다른 측면에서, 본 발명의 항체는 또한 H. 파라수이스 단백질의 특이적인 검출을 위해 또는 연구용 도구로서 사용될 수도 있다. 상기 기술된 항체는 H. 파라수이스 세균의 확인 및 정량화를 위해 검출가능한 표지로 직접 표지화될 수 있다. 면역분석법에서 사용하기 위한 표지는 당업자에게 공지되어 있으며, 효소, 방사성동위원소 (예로서, ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I), 및 형광성 물질 (플루오레세인 및 유도체, 피코에리트린, 알로-피코시아닌, 피코시아닌, 로다민, 및 텍사스 레드(Texas Red)), 발광성 물질 (예로서, 초파리 루시페린) 및 발색성 물질 (색상을 띠는 입자, 예를 들면, 콜로이드 금 또는 라텍스 비드 포함)을 포함한다. 적합한 면역분석법으로는 효소-결합 면역흡착분석법 (ELISA)을 포함한다. 원하는 경우, 면역글로불린에 대한 친화성을 갖는 표지된 물질과 반응시킴으로써 간접적으로 표지화할 수 있다. 항체를 제2 물질과 접합시킬 수 있고, 항체에 접합된 제2 물질에 대한 친화성을 갖는 표지된 제3의 물질을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 항체를 비오틴에 접합시킬 수 있고, 항체-비오틴 접합체를 표지된 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용함으로써 검출할 수 있다. 항체를 또한 합텐에 접합시킬 수 있고, 항체-합텐 접합체를 표지된 항-합텐 항체를 사용함으로써 검출할 수 있다. 항체 및 분석 접합체를 표지화하는 상기 방법 및 기타 다른 방법이 당업자에게 주지되어 있다. 섬광 계수, 감마선 분광분석법, 자가방사기록법, 및 형광성 검출을 비롯한 각종 방법에 의해 표지를 검출할 수 있다.

따라서, 적합한 표지 또는 기타 다른 적합한 검출가능한 생체분자 또는 화학물질과 함께 사용할 때, 본원에 기술된 항체는 예를 들면, H. 파라수이스 감염에 대한 생체내 및 시험관내 진단 또는 H. 파라수이스 세균의 검출 목적으로 유용하다.

키트

또다른 측면에서, 본 발명은 H. 파라수이스 세균 및 감염을 단리시키고, 결정하기 위한 키트를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 키트는 H. 파라수이스 세균을 함유할 것으로 의심되는 수성 샘플을 첨가함으로써 활성화될 수 있는 본 발명의 단리된 교차-반응성 항체를 적합한 형태로, 예를 들면, 단일 베쓸 중 동결건조된 형태로 포함한다. 상기와 같은 키트는 전형적으로 적합한 면역검출 시약과 함께 적합한 형태의 항체를 수용하고 있는 적합한 용기를 포함할 것이다. 일반적으로, 이러한 키트는 본 발명에 따른 항체, 및 피험체로부터의 샘플을 항체에 도입할 때 상기 항체의 결합을 결정하는 것에 관한 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 면역검출 시약은 적절한 검출가능한 신호 또는 표지, 예를 들면, 검출가능한 색상을 발색시키는 비오틴 또는 효소 등을 포함할 수 있으며, 이는 항체에 연결될 수 있거나, 항체가 항원에 결합하였을 때 검출가능한 결과를 제공할 수 있도록 하는 기타 다른 방법으로 사용될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 키트는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 H. 파라수이스 단백질 또는 그의 단편을 포함한다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이다.

실시예

실시예 1

순차적인 시험감염

실험 동물의 인도적 관리와 사용에 관한 공중보건원 정책(Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals) 개정안, 동물 복지법 조항(Provision of the Animal Welfare Act), 및 기타 다른 적용가능한 법 및 규정에 기술된 절차에 따라 모든 실험 동물을 처리하였다.

시험감염 조성물은 하기와 같이 제조하였다: 멸균 면봉을 대략 5 x 10⁸의 콜로니 형성 단위 (CFU)/ml로 해동된 H. 파라수이스 스톡에 침지시키고, 서서히 도말시켜 초콜릿 아가 플레이트의 표면을 덮었다. 배양물을 5％ CO₂를 포함하는 대기 중에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포 스크레이퍼를 사용하면서 3 ml의 펩톤 완충액을 사용함으로써 플레이트를 세척하고, 치즈클로쓰(cheesecloth)를 통해 통과시킴으로써 임의의 아가 파편을 제거하였다. 포획된 유체를 펩톤 완충액을 사용하여 1 OD에 대해 정규화시켰다. 이 수준은 대략 1:11의 희석율에 도달하였다. 상기 물질을 사용전 대략 1시간 동안 4℃에서 보관하였다.

5주령된 초유를 먹이지 않은, 제왕절개 유래의 (CDCD) 돼지 18마리를 스트루브 랩스 인크.(Struve Labs, Inc.)로부터 입수하였다. 동물을 무작위적으로 3개의 군 중 하나에 위치시켰다: 9마리의 돼지는 실험군에 위치시키고, 4마리의 돼지는 대조군에, 그리고 5마리의 돼지는 보초군(sentinel group)에 위치시켰다 (표 1). 모든 동물에게 비내 캐눌라를 제공하여 상부 호흡계에 직접적으로 접근할 수 있게 하고, 군에 따라 접근이 제한된 장소에 수용시켰다.

7주령째 되었을 때, 실험군에 있는 동물을 펩톤 완충액 중 530 nm에서 0.001 광학 밀도 (OD)로 희석된 1 ml의 혈청형 5를 사용하여 비내로 시험감염시켰다. 보초군과 대조군에 있는 돼지는 펩톤 완충액으로 시험감염시켰다. 시험감염 이후, 돼지가 회복될 수 있도록 하였다. 필요에 따라 광범위한 범위의 항생제를 투여하였다.

제1 시험감염 후 9주가 경과하였을 때, 실험군 및 보초군에 있는 동물을 펩톤 완충액 중 530 nm에서 0.001 OD로 희석된 1 ml의 혈청형 13을 사용하여 비내로 시험감염시켰다.

제2 시험감염 후 24시간이 경과하였을 때 각 군으로부터 무작위로 선택된 3마리의 동물을 검시하였다. 호흡기 조직 및 림프 조직을 상기 동물로부터 수거하고, 멸균 외과용 메스를 사용하여 침연시키고, 항균제를 포함하는 세포 배양 배지를 함유하는 24-웰 플레이트 중에 위치시킴으로써 활성화된 세포가 증식할 수 있도록 하였다. 추가 시험을 위해 상기 배지 상등액을 사용하였다. 남아있는 동물은 2주 더 관찰하고, 검시하였다.

실시예 2

SDS/PAGE 및 웨스턴 블롯

1 ml의 냉동 H. 파라수이스 스톡을 5 x 10⁸ CFU/ml로 초콜릿 아가 플레이트 상에 확산-플레이팅시켰다. 배양물을 5％ CO₂를 포함하는 대기 중에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 현탁시키기 위해 피펫으로 유도된 유동을 사용함으로써 4 ml의 인산염 완충처리된 염수 (PBS)를 사용하여 플레이트를 세척하였다. 재현탁된 세포를 4℃에서 보관하고, 1주 이내에 사용하였다. 2 ml의 현탁액을 원심분리하고 (9,000 g, 1 hr), 펠릿화된 세포를 200 ㎕의 PBS 중에 재현탁시키고, PBS로 2회에 걸쳐 세척한 후, 18-게이지 바늘을 통해 통과시켜 분쇄하였다. 세척된 세포 현탁액을 2％ 트윈-20을 함유하는 PBS와 1:1로 혼합하고, 37℃에서 90분 동안 시험관 회전자 상에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 원심분리하여 (48,000 g, 1 hr) 세포를 제거하였다. 배양 상등액을 4℃에서 저장 및 보관하고, 1주 이내에 사용하였다.

12.5％ 아크릴아미드 겔을 포함하는 크라이테리온(Criterion)™ 시스템 (캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories))을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. H. 파라수이스 세포 현탁액을 PBS 중 1:3의 희석율로 겔 상에서 진행시켰다. 트윈-20 추출물은 희석시키지 않고 진행시켰다. 겔을 쿠마시계 겔 염료인 겔코드 블루 염료 시약(GelCode Blue Stain Reagent) (일리노이주 록퍼드 소재의 피어스 바이오테크놀러지 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.))로 염색하였다. 웨스턴 블롯은 단백질 검출용 키트(Protein Detector kit) (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL, 인크.(KPL, Inc.))를 사용하여 진행시켰다. 시험감염된 돼지로부터 생성된 면역 체액을 사용하여 1차 프로빙을 수행하였다. 염소 항-돼지-HRP를 검출 항체로서 사용하였다. 1 성분 TMB 막 퍼옥시다제 기질 (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL, 인크.)을 사용하여 시각화하였다.

9마리 동물의 각종 조직으로부터 단리되어진 활성화된 세포로부터 수거된 상등액을 전체 혈청형 5 H. 파라수이스 세포에 대해 스크리닝하였다. 웨스턴 블롯팅에 의한 시각화를 위해 고농도의 상기 상등액을 사용하였다. 돼지 47의 기관지 림프절 (BL47)로부터 고농도 및 특정 농도의 항체를 수득하였다 (도 1). 상기 웨스턴 블롯에 존재하는 조 밴딩 패턴이 시험감염된 동물에 의해 인식되는, H. 파라수이스 중에 존재하는 단백질을 가리켰다. 추가의 비교 분석을 위해 BL47을 선택하였다.

제2 세트의 웨스턴 블롯을 통해 혈청형 간에 인식되는 단백질의 특징을 추가로 규명하였다. 혈청형 5와 13을 먼저 스크리닝하였다. 혈청형 5는 대략 28, 33, 45, 56, 63, 및 76 kDa에서 뚜렷한 밴드를 나타내었다. 혈청형 13으로부터 얻은 밴딩 패턴은 혈청형 5와 유사하였고, 28, 45, 55, 62, 및 75 kDa에서 뚜렷한 밴드를 포함하였다. 돼지 시험감염에 관여하지 않은 혈청형인 혈청형 4에 대해 BL47을 사용하여 시험한 경우에도 역시 28, 34, 41, 47, 57, 62, 및 77 kDa에서 뚜렷한 밴드가 생성되었다. 3개의 혈청형을 직접적으로 비교한 결과를 도 2에 나타낸다. 시험된 혈청형 모두에 존재하는 것으로 나타난, 대략 28, 45, 55, 62, 및 75 kDa의 단백질을 추가로 조사하였다.

순차적인 시험감염으로부터 생성된 체액을 사용하여 다중 혈청형에 존재하는 단백질을 동정하였다. 샘플 중 막-결합 단백질의 상대 농도를 증가시키기 위하여 트윈-20 추출 공정과정을 통해 혈청형 5의 배양물을 공정처리하였다. 상기 방법은 세포의 외막을 단리시키는 것으로 종래 밝혀졌었다. 상기 방법을 수행함으로써 SDS-PAGE 프로파일에 있어서 미처리 세포와의 차이는 거의 없었다 (도 3; SDS-PAGE). 또한, 밴딩은 웨스턴 블롯에서와 유사하였는데, 이는 본 발명자가 처음에 표적화한 단백질이 존재한다는 것을 입증하는 것이다.

서열분석을 위해 트윈-20으로 공정처리된 물질을 사용하였다. 이 물질은 교차-반응성 단백질을 포함하였고, 공정처리되는 동안 대다수의 세포 파편은 제거되었다. 따라서, 밴드 절단 및 서열분석을 위해 PVDF 막 상에 존재하는 수개의 인접한 래인에서 상기의 트윈-20 제제를 진행시켰다 (도 3; 블롯). 서열분석을 위해 혈청형 5로부터 선택된 밴드는 약 28, 약 45, 약 56, 약 63, 및 약 76 kDa에 있는 밴드를 포함하였다.

실시예 3

서열분석 결과

서열분석을 위한 샘플을 먼저 SDS-PAGE 상에서 진행시킨 후에, PVDF 막으로 옮겼다. 상기 막을 염색시키고, 면도날을 사용하여 밴드를 절제하였다. 면도날을 사용하여 절제된 겔 플러그 상에서 질량 분광분석법을 수행하였다. 이동 완충액은 20％ MeOH를 포함하는 표준 트리스/글리신 완충액이었다. 막을 쿠마시계 겔코드 블루 염료 시약 (일리노이주 록퍼드 소재의 피어스 바이오테크놀러지 인크.)로 염색하고, 물 중 약 25％ 이소프로판올로 탈색시켰다. 다량의 정제된 탈이온수를 사용하여 막 단편을 세정하였다.

질량-분광분석법 (도 4a-d) 및 N-말단 (에드만 분해) 서열분석을 사용하여 샘플 (즉, 약 28, 약 45, 약 56, 약 63, 및 약 76 kDa 밴드)의 특징을 추가로 규명하였다. N-말단 서열분석 결과가 부분적인 서열 정보를 제공하였으며, 이는 표 2에 제시되어 있다.

이어서, 단백질 단편에 대한 서열 정보는 스위스-프로트(Swiss-Prot) 데이타베이스 중 H. 인플루엔자에(H. influenzae) 및 H. 듀크레이(H. ducreyi)에 대한 BLASTp'd였다. 10개 초과의 아미노산 (aa)을 포함하거나, 3개 미만의 위치에서 다중 아미노산의 가능성을 갖는 것인 단백질을 추가로 분석하였다. 그 결과를 표 3에 제시한다.

표 3은 세포 표면 상에 노출될 수 있는 가능성을 보이는 적어도 2개의 단백질 (단백질 6 및 7) 및 철과 결합할 수 있을 것으로 보이는 적어도 하나의 단백질 (단백질 5)을 포함한다.

실시예 4

PCR 및 클로닝

표 3에 제시된 단백질 5 및 6, 이들 둘 모두 돼지 면역 체액에 의해 인식되었기 때문에 면역원성을 갖는 것으로 볼 수 있다. 이들 단백질은 철 획득과 관련이 있었다. ABC형 수송체는 보고된 바 매우 다양한 기능을 갖고 있고, 이는 시아노세균에서 철 흡수와 관련이 있었다. 헴-결합 단백질은 헴 기에 결합된 철을 수거하는 바, 이는 혈류에서의 H. 인플루엔자에의 생존에 대단히 중요한 것이다. 추가로, 헴-결합 단백질은 같은 속에 포함된 유기체 내에서 고도로 보존되는 것이다.

공개된 H. 인플루엔자에 및 H. 듀크레이 게놈 정보를 사용하여, 선택된 두 단백질 (즉, 단백질 5 및 6)을 H. 파라수이스 염색체 시료로부터 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 디자인하였다. 사용된 PCR 프라이머는 표 4에 제시되어 있다.

단백질 5에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해, 표 4에 제시된 프라이머와 PFU 터보 폴리머라제(PFU Turbo polymerase), 및 주형으로서는 H. 파라수이스 염색체 시료를 사용하여 PCR을 수행하였다. 헴 반응에서 2개의 짙은 밴드가 관찰되었고 (약 1.8 kb 및 약 800 bp), 약 1.8kb 증폭 생성물에 상응하는 밴드를 겔 정제하였다.

단백질 6에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해, 표 4에 제시된 프라이머와 PFU 터보 폴리머라제, 및 주형으로서는 H. 파라수이스 염색체 시료를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 반응에서 이중선이 관찰되었고 (약 1.5 kb 및 약 1.3 kb), 이중선 중 상단에 있는 밴드 (즉, 약 1.5 kb)는 겔 용리 키트를 사용하여 겔 정제하였다.

증폭된 생성물을 함유하는 겔 정제된 유체를 A-테일링하고(A-tailed), pGEM-T에 결찰시켰다. 결찰물을 TOP10 적격 세포 (캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))로 형질전환시켰다. 형질전환체를 선별하여 밤새도록 37℃에서 성장시켰다. 이어서 삽입체를 확인하고, pTRCHis-A 발현 벡터 (캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)로 서브클로닝하여 N-말단 6 x His 태그를 포함하는 재조합 단백질을 발현시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG Plocher, Thomas Campos, Manuel Harland, Richard Todd, Johnson Harbison, Trent Kiel, Dan <120> Cross-Reactive Determinants and Methods for Their Determination <130> PAT052674-US-pct <150> US 61/040,260 <151> 2008-03-28 <150> PCT/EP09/053281 <151> 2009-03-20 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 1 Glu Leu Ala Asn Ala Ile 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 2 Thr Val Leu Ala Glu Lys Gln Glu Ile Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 3 Ala Pro Ala Lys Gly Ser Thr Ile Glu Ala Gly Ile Ala Tyr Pro Ile 1 5 10 15 Ser Thr <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 4 Met Lys Asn Leu Ile Ser Ile 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 5 Ser Pro Ser Asp Lys Thr Phe Lys Ile Ser Ala Ile Pro Asp Tyr Asn 1 5 10 15 Ala Ala Glu Met Thr 20 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 6 Ser Pro Ala Lys Gly Ser Thr Ile Glu Ala Gly Ile Ala Tyr Pro Ile 1 5 10 15 Ser Arg Ala <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 7 Ser Glu Pro Gln Ala Thr Xaa Asp Ala Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 8 Met Lys Asn Leu Ile Ser Ile Ala Lys Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 9 Gly Glu Ile Glu Glu Leu Ala Leu Gly Ile 1 5 10 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 10 Met Glu Lys Asp Val Lys Phe Gly Asn Asp Ala Arg Val Gly Met Leu 1 5 10 15 Lys Gly Val Asn Xaa Lys Ala Asp Ala 20 25 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Ser Glu Ile Xaa Glu Leu Ala Asn Ala Ile Thr Phe Leu Ser Met Gly 1 5 10 15 Val Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 12 Gly Lys Val Pro Glu Thr Thr Val Leu Ala Xaa Lys Gln Glu Ile Ile 1 5 10 15 Xaa <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Ala Pro Ala Lys Gly Ser Thr Ile Glu Ala Gly Ile Ala Tyr Pro Ile 1 5 10 15 Ser Thr Ala Xaa Asp Asp Met Met Ser 20 25 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Haemophilus parasuis <400> 14 Ser Pro Ser Asp Lys Thr Phe Lys Ile Ser Ala Ile Pro Asp Tyr Asn 1 5 10 15 Ala Ala Glu Met Thr Ser 20 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Haemophilus parasuis <400> 15 tataggatcc atgcttatga aactaaaagc aacattaact 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Haemophilus parasuis <400> 16 tatactcgag ttatttacca tcaacactca caccataaaa 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Haemophilus parasuis <400> 17 tataggatcc atgacttctc attttgaata caatcaatct 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Haemophilus parasuis <400> 18 tatactcgag ttatgtacga cctacaccaa ggaaagacaa 40

Claims

적어도 하나의 항체를 제1 항원 결정기 및 제2 항원 결정기와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항체는 순차적으로 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제1 면역학적 시험감염에 노출시킨 후에 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 면역원성 조성물에 의해 유도되는 제2 면역학적 시험감염에 노출시킨 동물로부터 수득된 것이고, 여기서 적어도 하나의 항체가 제1 및 제2 항원 결정기에 결합하였다는 것은 교차-반응성을 시사하는 것이고, 이로써 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정할 수 있는 것인, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 제1 면역원성 조성물이 추가로 제1 항원 결정기를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하고, 제2 면역원성 조성물이 추가로 제2 항원 결정기를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제1 미생물에 의해 발현되고, 제2 폴리펩티드는 제2 미생물에 의해 발현되고, 여기서 제1 및 제2 미생물은 동일 종의 다른 혈청형인 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 제1 및 제2 미생물이 세균인 방법.
제3항에 있어서, 세균이 H. 파라수이스(H. parasuis)인 방법.
제4항에 있어서, 제1 미생물이 혈청형 5이고, 제2 미생물이 혈청형 13인 방법.
제4항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 각각 헴-결합 단백질 또는 ABC형 수송체인 방법.
a) 동물에서 기억 B 세포를 활성화시켜 적어도 하나의 항체를 생산하고, 여기서 활성화시킨다는 것은 기억 B 세포를 활성화시키는 면역학적 반응을 유도하는 분자를 사용하여 동물을 면역학적으로 시험감염시키는 것을 포함하는 것인 단계; 및
b) 적어도 하나의 항체를 제2 분자와 접촉시키고, 여기서 적어도 하나의 항체가 상기 분자 및 제2 분자와 결합하였다면, 이로써 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자가 결정되는 것인 단계
를 포함하는, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 분자를 결정하는 방법.
제7항에 있어서, 제2 분자가 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 기억 B 세포를 활성화시킨 후에 이를 시험관내에서 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, H. 파라수이스의 적어도 2개의 혈청형에 의해 발현되는 단백질에 존재하는 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 더 포함하는 단리된 폴리펩티드.
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 교차-반응성을 갖는 항원 결정기를 더 포함하고, H. 파라수이스 혈청형 5에 의해 발현되는 단리된 폴리펩티드.
예방학적 또는 치료학적 유효량의 제10항의 단리된 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 비히클, 담체 또는 부형제를 포함하는 백신.
제11항의 백신을 동물의 H. 파라수이스 감염과 관련된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 충분한 유효량으로 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 H. 파라수이스 감염과 관련된 질환, 병태 또는 그의 증상을 치료 또는 예방하는 방법.