CN104404056B

CN104404056B - 一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2及其制备方法

Info

Publication number: CN104404056B
Application number: CN201410637520.3A
Authority: CN
Inventors: 文心田; 曹三杰; 周鹏; 文翼平; 黄小波; 伍锐; 张禄滑; 代科; 何绿琴; 丁玲强
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2014-11-12
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2034-11-12
Also published as: CN104404056A

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的重组HbpA2蛋白及其制备方法。本发明重组HbpA2蛋白良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，说明重组蛋白HbpA2是副猪嗜血杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗。

Description

一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2及其制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)属于巴斯德菌(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)，为革兰阴性细小杆菌，具有多种形态，定植于健康猪上呼吸道，属于正常菌群，在免疫抑制等特定条件下会引起猪格氏病(Glasser’s dis-ease，以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎为主要特征。近些年来由于猪场规模化养殖的快速发展，尤其是工厂集约化养殖，猪格氏病已经呈世界性流行和暴发，表现出突然死亡率、发病率和病死率较高，严重危害养猪业发展，并造成巨大经济损失。

我国近年来才开始逐渐重视对副猪嗜血杆菌病的研究。副猪嗜血杆菌的血清型众多，目前已鉴别十五种血清型，还有15％-41％的未鉴定血清型，其中1，5，10，12，13和14为强毒株，而我国流行的血清型为4型和5。不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，我们对其毒力因子及致病机理知之甚少，至今尚无有效的通用商品苗和敏感的诊断方法，该病尚未得到有效控制，给全球养猪业带来巨大的经济损失。

我国至今没有像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗那样的成熟疫苗来针对副猪嗜血杆菌病，目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，缺乏良好的保护力，导致临床病例多见。而灭活疫苗只能对同种血清型的菌株具有保护作用，缺乏交叉保护力。副猪嗜血杆菌血清型的多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了对具有高效交叉保护力疫苗的研制。亚单位疫苗同时具有活疫苗免疫效力高、交叉保护力强以及灭活苗的安全性好等优点，具有十分广阔的应用前景。大部分不能分型菌株副猪嗜血杆菌及其血清型的多样性影响了人们对于具有高效交叉保护力疫苗的研制。

血红素结合蛋白(heme-binding protein，HbpA)是一种球蛋白，广泛存在于致病菌中。有研究发现HbpA蛋白分子中有一个或多个与血红素结合区域，具有结合、运输和传递血红素，参与机体代谢等生理功能，HbpA蛋白是一种重要的毒力因子，与细菌的致病性密不可分。在巴斯德菌科嗜血杆菌属的流感嗜血杆菌上的研究表明，HbpA蛋白是流感嗜血杆菌的一种重要的毒力因子，HbpA蛋白与血红素的利用有关。目前关于副猪嗜血杆菌HbpA蛋白的功能的研究报道较少，在已进行基因组测序的副猪嗜血杆菌SH0165中发现有两个HbpA基因，两个基因的大小均为1595bp。公开号为CN103288934A的专利申请公开了一种采用基因工程的方式重组表达HbpA基因(Gene ID:7276898)的方法，但是，其制备的重组HbpA蛋白能小鼠感染副猪嗜血杆菌的保护力不佳，其免疫保护效果仅50％。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的重组HbpA蛋白及其制备方法。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pET-39b质粒。

本发明重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明重组HbpA2蛋白，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明制备重组HbpA2蛋白的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2～1.5mmol/L，25～42℃诱导表达1～7h；12h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为1.5mmol/L，诱导表达的温度为30℃；诱导表达的时间为5h。

步骤ⅱ中，所述分离纯化的方法如下：

(1)将上清液用1mmol/L NaOH调pH至8.0，使用0.45μm的滤膜过滤样品；

(2)用上样缓冲液平衡镍离子螯合亲和层析填料层析柱，上样，按顺序用含有30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗头，收集用含有100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱得到的溶液，即可；

其中，上样缓冲液包含如下浓度的成分：50mmol/L NaH₂PO₄,300mmol/L NaCl,5mmol/L咪唑；

洗脱缓冲液包含如下浓度的成分：50mmol/L NaH₂PO₄,300mmol/L NaCl。

本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白HbpA2。该重组蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，保护率高达70％，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，可以制备成为亚单位疫苗，预防副猪嗜血杆菌病，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 HbpA2基因的PCR扩增结果图。M:DNA maker；1、2、3：PCR扩增产物；

图2 诱导时间优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：诱导时间为：0、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h；

图3 IPTG诱导浓度优化。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2～9：IPTG:终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L；

图4 诱导温度优化。M：蛋白maker；1、3、5、7：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；2：诱导温度为25℃；4：诱导温度为30℃；6：诱导温度为37℃；7：诱导温度为42℃；

图5 HbpA2蛋白在pET-39b-HbpA2(BL21)中表达的形式检测。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)；2：pET-39b-HbpA2(BL21)超声波破碎后；3：上清；4：沉淀；

图6 重组HbpA2表达的SDS-PAGE。M：蛋白maker；1：pET-39b(BL21)诱导前；2：pET-39b(BL21)诱导后；3：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导前；4：pET-39b-HbpA2(BL21)诱导后；5：HbpA2蛋白纯化后(100mmol/L咪唑洗脱)；

图7 重组蛋白Western blotting；

图8 小鼠存活率与时间的关系。

具体实施方式

实验材料和试剂：

副猪嗜血杆菌CVCC3361，来源于国家兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号：CVCC3361。大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。限制性内切酶、Ex-Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNAMarker、pMD19-T simple载体等均购自宝生物(大连)工程有限公司。细菌基因组提取试剂盒为Omega公司产品。预染蛋白Ladder为NEB公司产品。小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。

LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.2-7.4，高压蒸汽灭菌30min。

上样缓冲液配方：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,5mM imidazole,pH8.0。

洗脱液：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,pH8.0。

实施例1本发明副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原HbpA2的制备

1、重组表达

1.1 HbpA2基因的克隆及表达载体的构建

1.1.1引物设计及合成

根据副猪嗜血杆菌HbpA2基因序列(Gene ID：7278927)，用生物软件PremierPrimer5.0设计l对引物，扩增HbpA2基因。

上游引物：5’-AGTACTCCGACAAATACATTGGTCAACTGT-3’；

下游引物：5’-CTCGAGTTAAGGCTTCAGACTTACGCCATA-3’；

1.1.2 HbpA2基因的PCR扩增

以副猪嗜血杆菌CVCC3361基因组DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增，扩增体系25μL，4个重复。扩增体系：

材料	体积
		基因组模板	1μL
引物(上、下游)	2μL
		EX-Taq MasterMix	12.5μL
ddH2O	9.5μL
		总体积	25μL

循环参数：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA胶回收试剂盒对电泳后的PCR片段进行胶回收纯化(按照Omega胶回收试剂盒说明书进行操作)，将纯化后的PCR片段进行测序。

纯化后的目的基因片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

ccgacaaata cattggtcaa ctgtattgcg acagcaccga tgaaacttag tccggcaatt 60

acaaatgatg ctaatgactt caatgccagc tcacaacaag tctataaccg cttagtcgaa 120

ttcaaagccg gtaaaattga agtagagccg ggtctagccg aacgttggga aatcagtgaa 180

gacggtttgg tctatacatt ttatctacgc caaaatgtga aattccacag caacaaaacc 240

tttagcccaa cccgcccgtt aaatgccgat gatgtggtgt tctcattcca acgccaagcg 300

gacaaaaatc atccttatca taatgtttcg gcaggaacct acttctactt taactggatg 360

aacttaccga gtatcttaaa atccgttgaa aaagtggatg actacaccgt taaaattacg 420

ctgaataaac cgaatacgcc gtttattacc acggttgcca tggacttttt atctatttat 480

tcaaaagaat atgccgatca gcttcttgcc cagggtaagc ccgaaactct tgatcaacaa 540

ccgattggaa cggggccttt tattttccaa acttatcaga ccgaccacgc ggtacgttac 600

actgctaacg tagattattg gaaaggcaaa gcagacattg aacgtttaat ttttagcatt 660

acccctgatg ccggaacacg ttatgccaag ttaaaagccg gcgagtgtga tgtgattgat 720

tttccgaata tctcggacat tgctcagatg aaaaaagatc ctcaaatcaa tctacttgag 780

cgtgagggat taaacttagc ttacattggg ctaaatacca ccaaasctga actaaacaac 840

gtaaaagttc gccaagccct tcaccatgct accgataaaa aagcgattgt tgatgcggtt 900

tatcaaggcg gcggaacggt tgcaaccaat ccgttccctg atgcagtatt aggttataac 960

ccgcatttgc cacaatatga atttaacttg gaaaaagcaa aagcattatt ggcagaagcc 1020

ggctatccaa acggttttga aacggaaatt tgggtgcaac ctgtggttcg tccatccaat 1080

ccgaaccctc gccgcacggc tgaaattatt caagcagact gggctaaaat tggcgtgaaa 1140

gcaaaactag tcacacatga atgggcggat tttaataaac gcacccgtga aggcgaattt 1200

gccgcaggta cttatggttg gacaagtcgt aacggtgatc ctgataattt tctattccct 1260

ttatttagcc aagcaaatat ccccggcacc aattactctc gctggacaga tgaaaaattt 1320

gaggcgctac tcgcctcagc ggtacaaact caagacacac aaacacgtgc aaaactatat 1380

caacaggcag tcgaaatttt ccaacaaaac agcccgatca ttccgtttgc ccactccatt 1440

aactacgtac cgttaaataa acgggtacaa ggctttgttc aaaatccgtt tggctatacc 1500

gcattttatg gcgtaagtct gaagccttaa 1530

也可以采取合成的方式直接合成目的基因片段。

1.1.3表达载体的构建

将目的及基因片段(PCR回收产物)克隆到T载体上得到pMD19-T-HbpA2，T载体克隆连接体系：

材料试剂	体积
		PCR回收产物	3μL
pMD19-T载体	1μL
		T4 DNA Ligase	0.5μL
10×Buffer	1μL
		ATP	1μL
ddH₂O	3.5μL
		总体积	10μL

16℃连接过夜，PCR快速鉴定连接产物，连接后的产物用CaCl₂法转化进入感受态细胞大肠杆菌DH5a，其步骤如下：(1)用移液枪取-70℃冻存的感受态细胞DH5a 50μL于冰上溶解，加入pMD19-T-HbpA2质粒10μL混匀，-20℃冰浴30min,42℃水浴锅中热激90s，迅速在-20℃冰浴5min。(2)将经上述处理的样品加入600μL预热的LB培养基，37℃，180转/分钟培养1.5h。(3)取出100μL菌液涂布于含Amp抗性的LB固体培养基上，于37℃恒温箱培养12～24h。筛选阳性转化子，挑取疑似菌落进行PCR，鉴定出含有pMD19-T-HbpA2的重组子并扩大培养，提取质粒进行测序鉴定。

测序正确的pMD19-T-HbpA2用XhoI和ScaI定向克隆到原核表达载体pET-39b中，构建重组表达载体pET-39b-HbpA2，其步骤如下：(1)用XhoI和ScaI对pMD19-T-HbpA2质粒和pET-39b质粒进行双酶切，37℃酶切3h。(2)酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后用DNA胶回收试剂盒对电泳后的目的片段进行胶回收纯化(按照Omega胶回收试剂盒说明书进行操作)，－20℃保存备用。(3)将酶切后的目的片段进行连接转化得到重组表达载体pET-39b-HbpA2(连接转化的方法同T载体克隆)，并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。

1.1.4重组菌的构建

最后将构建好的重组表达载体pET-39b-HbpA2转化进表达宿主菌BL21(DE3)，即得重组菌。

1.2重组大肠杆菌的诱导表达

1.2.1重组蛋白初表达及鉴定

将含重组质粒pET-39b-HbpA2的大肠杆菌BL21(DE3)接种含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃、280r/min振摇培养3～4h，至OD值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度1mmoL/mL，继续振摇培养3～4h，离心去上清，于沉淀中加SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5min，进行SDS-PAGE。凝胶经考马斯亮兰染色后脱色，利用凝胶成像系统照相分析。

1.2.2重组蛋白表达条件的优化

1.2.2.1诱导时间的优化

将重组菌以1:100的比例接种于含Kan的LB液体培养基试管中，待培养至OD值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度1mmoL/mL，分别在诱导表达0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h后取1ml菌液，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳。

1.2.2.2 IPTG浓度的优化

将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan(即卡拉霉素)n的LB液体培养基试管中，37℃振荡培养至OD值为0.5～0.6时，分别加入IPTG至终浓度为：0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L，诱导培养上述试验得出的最佳诱导时间，各取菌液1mL，对样品进行后处理，SDS-PAGE电泳。

1.2.2.3诱导温度的优化

将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，待培养至OD值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为上述试验得出的最佳IPTG浓度，分别在25℃、30℃、37℃、42℃诱导培养上述试验得出的最佳诱导时间，各取菌液1mL，对样品进行后处理，SDS-PAGE电泳。

1.2.3重组蛋白的大量表达

将重组菌以1:100分别接种于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，培养至OD值为0.5～0.6时，在菌液中加IPTG至终浓度为最佳诱导表达的浓度，而后在最佳温度下培养至最佳时间。

(1)接种上述重组菌的单克隆于LB培养基(100μg/ml Amp)，37℃250r/min摇床培养12h；

(2)将该菌液按1：100的接种量转接至新鲜的LA培养基，在37℃摇床中继续培养，转速为200r/min，用分光光度计进行实时检测，当菌液OD₆₀₀值达到0.6～0.8(细菌对数生长期)时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h。

(3)诱导表达的菌液在13000g下离心10min，弃掉上清，用细菌裂解液充分重悬菌体，在室温下裂解处理30min。

(4)通过离心分别收集菌液上清和沉淀，裂解处理后的标本通过12％SDS-PAGE进行分析。

1.3分离纯化

(1)将诱导表达后的菌液12000g/min离心5min，收集菌体，加入含有1mg/mL溶菌酶的菌体裂解液80mL，悬浮沉淀。置于4℃反应过夜。

(2)于-20℃与室温间反复冻融悬液3次。

(3)溶化后悬液置于冰上使用超声波细胞破碎仪40％强度破碎约10min。12000g/min离心10min，收集上清液，用1mmol/L NaOH调pH至8.0，使用0.45μm的滤膜过滤样品，进行后续纯化。

(4)将Ni离子填料装填入柱中过夜，待填料压实后备用，即镍离子螯合亲和层析填料层析柱。

(5)以流速为2ml/min的超纯水洗脱酒精，至层析柱平衡。再用上样缓冲液以lml/min的流速平衡层析柱，约30min。然后以0.5ml/min流速上样，样品上完后用上样缓冲液平衡层析柱至平衡。按顺序用含有30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液，以1ml/min的流速洗脱蛋白，当出现上升峰开始收集洗脱液至下降峰结束，待平衡后换下一浓度的咪唑洗脱缓冲继续洗脱。收集用含有100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱得到的溶液，即为含有本发明重组蛋白HbpA2的溶液，-80℃储存备用，SDS-PAGE分析收集蛋白纯度。

2、测定

2.1 Western blotting

将纯化后的HbpA2蛋白经12％的凝胶进行SDS-PAGE电泳后，进行Westernblotting。其具体步骤如下：

(1)将SDS-PAGE电泳后的凝胶块经适当剪切，同时剪切六张与凝胶大小一致的滤纸和一张NC膜；浸泡入转移缓冲液中放置1h；

(2)打开转移盒，将经转移缓冲液浸泡过的滤纸、凝胶和NC膜，按“滤纸--凝胶--NC膜--滤纸”在转移盒负极上进行叠放，并用一干净小试管轻轻滚过，以消除气泡，关上转移盒并插入转移池；

(3)接通电源，25V转移30min；

(4)转移结束后，取出NC膜，加入适量封闭缓冲液封闭1h左右；倒掉封闭液，TBST洗膜3次，10min/次；

(5)将NC膜放入封口小塑料袋中，加入1：1000稀释的兔抗CVCC3361一抗，于37℃作用lh，弃一抗，用TBST洗膜3次，10min/次；

(6)将NC膜放入封口小塑料袋中，加入1：1000稀释的羊抗兔IgG二抗，于37℃作用1h；TBST洗膜3次，10min/次；

(7)加入适量显色液，显色20min～30min，待目的条带清晰可见，用去离子水洗膜终止显色，吸水纸吸干膜上水分，避光干燥。

(8)凝胶图象处理系统拍照分析。

3、测定结果

如图1所示，以菌株CVCC3361基因组DNA为模板，经PCR扩增，出现1条与预期片段(159bp)大小一致的条带(图1)。测序结果显示，扩增出的片段与Gen-Bank上公布的HbpA2基因序列的同源性为99.9％。构建的重组表达质粒pET-39b-HbpA2经XhoI和ScaI双酶切可见2条带，大小与预期的条带大小一致。说明HbpA2基因已成功插入到pET39b载体上。

如图2～4所示，诱导表达时，IPTG最佳浓度为1.5mmol/L下，诱导温度最佳为30℃，最诱导时间最佳为5h。

如图5～6所示，对本发明含有重组质粒pET-39b-HbpA2的大肠杆菌诱导表达后，SDS-PAGE分析在70kd处出现1条明显变粗的条带，其大小与预期融合蛋白理论分子量大小一致，说明获得了重组蛋白HbpA2，按照本发明方法分离纯化后，获得了纯品蛋白。

重组蛋白-HbpA2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)为：

PTNTLVNCIA TAPMKLSPAI TNDANDFNAS SQQVYNRLVE FKAGKIEVEP GLAERWEISE 60

DGLVYTFYLR QNVKFHSNKT FSPTRPLNAD DVVFSFQRQA DKNHPYHNVS AGTYFYFNWM 120

NLPSILKSVE KVDDYTVKIT LNKPNTPFIT TVAMDFLSIY SKEYADQLLA QGKPETLDQQ 180

PIGTGPFIFQ TYQTDHAVRY TANVDYWKGK ADIERLIFSI TPDAGTRYAK LKAGECDVID 240

FPNISDIAQM KKDPQINLLE REGLNLAYIG LNTTKELNNV KVRQALHHAT DKKAIVDAVY 300

QGGGTVATNP FPDAVLGYNP HLPQYEFNLE KAKALLAEAG YPNGFETEIW VQPVVRPSNP 360

NPRRTAEIIQ ADWAKIGVKA KLVTHEWADF NKRTREGEFA AGTYGWTSRN GDPDNFLFPL 420

FSQANIPGTN YSRWTDEKFE ALLASAVQTQ DTQTRAKLYQ QAVEIFQQNS PIIPFAHSIN 480

YVPLNKRVQG FVQNPFGYTA FYGVSLKP 508

如图7所示，本发明重组蛋白HbpA2与免疫血清充分反应后，在重组蛋白的位置有特异性显色条带，证实了该蛋白具有良好的反应原性。

实验结果说明，本发明通过基因工程的方式，重组表达得到了纯品的重组蛋白HbpA2，其具有良好的反应原性。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明重组蛋白HbpA2的体内保护效果

一、实验方法

1.1副猪嗜血杆菌CVCC3361半数致死量(LD50)的测定

1.1.1 LD0和LD100的测定

10只小鼠为一组，每只小鼠腹腔注射活菌液1×10⁹CFU(预实验中估计的LD0)，7天后统计小鼠死亡情况，若死亡两只或两只以上，则攻毒剂量减少0.1×10⁹CFU，若全部存活，则攻毒剂量增加0.1×10⁹CFU，直至一组小鼠中只有一只死亡为止，则与此相临的低剂量即为LD0。同法求得LD100。

1.1.2实验组攻毒剂量的确定

将小鼠随机平均分为7组，每组小鼠均为10只，其中7组为对照组，1-6组为试验组。按下列公式求出r值，其中G为组数，Dm/Dn为LD100与LD0之比。则试验组的攻毒剂量分别为D1＝Dn＝LD0，D2＝D1×r，D3＝D2×r，D4＝D3×r，D5＝D4×r，D6＝D5×r。按照上述剂量攻毒后，观察记录小鼠的死亡情况。

1.1.3 LD50的计算

通过Bliss-LD50软件计算LD50，在程序中输入各组攻毒剂量、动物数、死亡数，不用输入对照组数据，单击“计算”即可显示CVCC3361对小鼠的LD50等参数。

1.2小鼠的攻毒保护试验

40只小鼠随机分成4组，每组10只。第l组背部皮下多点免疫50微克纯化的HbpA2+佐剂(首次免疫为弗氏完全佐剂，第二次免疫为弗氏不完全佐剂)；第2组免疫副猪嗜血杆菌CVCC3361灭活苗+佐剂作为阳性对照组；第3组用生理盐水作为阴性对照组；第4组用佐剂作为阴性对照组。首免后第14天加强免疫1次，免疫剂量和方式同首免。二免后的第14天所有小鼠用副猪嗜血杆菌CVCC3361通过腹腔攻毒。攻毒之前，采集小鼠血清，检测HbpA2特异性抗体效价。攻毒后每天观察并记录小鼠的临床表现和死亡情况，直到第5天。5d后对小鼠施行安乐死，并对所有死亡小鼠进行细菌的分离鉴定，以确认为副猪嗜血杆菌的感染。

1.3特异性抗体的检测

用于检测HbpA2特异性抗体的血清采自攻毒之前。小鼠断尾采血，采到的血清于-20℃保存备用。抗体的检测用间接ELISA法，具体方法如下：HbpA2纯化后，用pH9.6的碳酸盐稀释，96孔ELISA板每孔加100μL于37℃孵育1h，4℃包被过夜。次日，用PBST洗涤3次后，用5％脱脂牛奶于37℃封闭1.5h。弃封闭液，用PBST洗3次。将待测血清从l：100至l：12500稀释后每孔加100μL，37℃孵育1h。洗3次后，将羊抗小鼠IgG用PBST稀释，每孔加100μL，37℃作用30min。洗3次，每孔加100μLTMB溶液于室温避光反应15min，加50μL2.0mol/L硫酸溶液终止反应，用酶标仪于450nm处读数。值大于0.2的孔被认为是有HbpA2特异性抗体存在。

二、实验结果

1、鼠血清抗体检测

结果如表1所示：

表1小鼠血清抗体检测结果

HbpA2免疫组的抗体滴度明显高于阴性对照组和阳性对照组，说明表达的HbpA2具有良好的免疫原性。

2、攻毒保护试验

为评价HbpA2免疫的保护效率，本研究以小鼠作为动物模型，经过2次免疫后，以6x10⁹CFU(5×LD50)强毒菌株CVCC3361攻毒，观察并记录小鼠的临床症状和死亡情况，实验结果如表2和图8所示：

表2攻毒保护试验结果

由如表2和图8可以看出，阴性对照组小鼠均在攻毒后1天内全部死亡，解剖后发现多脏器病变，病变脏器能分离到攻毒用菌株；HbpA2免疫组攻毒后在2天内死亡3只，其余小鼠观察至5天仍然存活。阳性对照组小鼠攻毒后在2天内死亡2只。

结果说明，本发明HbpA2免疫能显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌强毒菌株的攻击，免疫保护性较好，保护率高达70％，保护效果接近全菌灭活疫苗。

综上，本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白HbpA2。该重组蛋白HbpA2具有良好的免疫原性和保护原性，免疫后产生的HbpA2特异性抗体水平高，可以显著保护小鼠抵抗副猪嗜血杆菌血清5型强毒菌株的攻击，说明重组蛋白HbpA2是副猪嗜血杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗，临床应用前景良好。

Claims

1.一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；其中，所述的重组载体是重组pET-39b质粒。

3.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2所述的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。

5.一种重组HbpA2蛋白，其特征在于：它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。

6.根据权利要求5所述的重组HbpA2蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.一种制备权利要求6所述重组HbpA2蛋白的方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求4所述的重组大肠杆菌，接种到添加有终浓度为50μg /ml 的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、280 r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2~1.5 mmol /L，25~42℃诱导表达1~7h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为1.5 mmol /L，诱导表达的温度为30℃；诱导表达的时间为5h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤ⅱ中，所述分离纯化的方法如下：

（1）将上清液用1mmol/L NaOH调pH至8.0，使用0.45μm的滤膜过滤样品；

（2）用上样缓冲液平衡镍离子螯合亲和层析填料层析柱，上样，按顺序用含有 30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗头，收集用含有100mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱得到的溶液，即可；

其中，上样缓冲液包含如下浓度的成分：50 mmol/L NaH₂PO₄, 300 mmol/L NaCl, 5mmol/L咪唑；

洗脱缓冲液包含如下浓度的成分：50 mmol/L NaH₂PO₄, 300 mmol/L NaCl。