KR20160062041A - 단백질 함유 막소포를 포함하는 항원조성을 이용하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법 - Google Patents

단백질 함유 막소포를 포함하는 항원조성을 이용하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 항원성 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 포함하는 면역성 조성물을 숙주에 적용하여 숙주에서 면역 반응을 유도하는 단계; 및 숙주의 혈청에서 상기 타켓 단백질에 대응되는 항체를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 방법의 더 구체적인 실시예에서는 최소한 다음의 단계를 포함한다: a) 타켓 단백질을 코팅하는 핵산 템플릿과 막소포를 포함하는 세포 용해액을 포함하는 반응 용액에서 체외 번역 방법을 통해 타켓 단백질을 합성하는 단계; b) 용액에서 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 분리하는 단계; c) 생리학적으로 호환되는 용액에 상기 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 투입하는 단계; d) 상기 c) 단계의 막소포를 숙주에 적용하는 단계; e) 숙주의 혈청 샘플로 상기 타켓 단백질에 대한 특정 면역반응을 테스트하는 단계; 및 f) 상기 타켓 단백질에 대해 특정 변역 반응을 보이는 숙주의 혈청으로부터 상기 타켓 단백질에 대응되는 특정 항체를 얻는 단계.

Description

단백질 함유 막소포를 포함하는 항원조성을 이용하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법 {Method for producing polyclonal antibodies using an antigenic composition comprising protein-containing membrane vesicles}
본 발명은 단백질 함유 막소포를 포함하는 항원조성을 이용하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
항체는 진단학 및 치료학에 있어서 강력하고 가치 높은 도구이다. 고도로 특정된 항체에 대한 수요가 증가함에 따라, 충분한 양의 신뢰할만한 항원의 생산하기 위한 수많은 방법들이 개발되었다.(e.g.,J.S. Haurum, Drug Discovery Today, 2006. 11(13-14), 655-660). 이러한 관점에서, 1975년 하이브리도마 기술의 개발은 중요한 진전으로서, 마우스 하이브리도마가 단클론성 항체의 최초의 신뢰할만한 소스가 되었다.
이론적으로, 단클론성 항체는 어떠한 타켓으로도 만들어낼 수 있다. 타겟의 준비는 절대적으로 중요하다. 유전적 면역 케이스에서도 항원은 스크리닝이나 확인목적으로 필요하다. 불행히도, 어떤 경우에는 항원 분리 또는 세포기반 항원생산이 성공적이지 못하여 항원 준비가 문제가 되는 경우도 있다.
일반적으로, 항원은 단백질 또는 펩타이드이지만, 다당류, 지질, 그리고 폴리뉴클레오타이드와 같은 다른 물질도 면역원이 될 수 있다. 대부분의 경우, 항체는 자연적인 항원에 대응하여 생성된다. 만약 항원이 재조합 DNA기술에 의해 생산된 경우, 구조적 차이가 면역성에 차이를 초래할 수 있으므로, 재조합기술에 의해 생산된 단백질 또는 펩타이드와 그에 대응되는 자연적 물질을 특성을 비교하는 것이 중요하다. 단밸질과 펩타이드는 항체생산을 위한 흥미로운 타겟이다. 에피토프(eptitope; 항원결정기)는 선형으로서 전체 단백질의 3차원 구조에 영향을 받지 않으므로, 펩타이드 합성은 세포 기반 발현의 대안이 된다. 다른 한편으로, 펩타이드 합성은 3차원적 에피토프의 일종인 번역후 변형(PTMs)을 갖는 단백질과 펩타이드에 있어서는 한계점을 가진다. 나아가, 항원으로 펩타이드와 펩타이드 혼합물 사용은 교차 반응성 항체의 형성을 유도하게 된다.
막단백질은 모든 게놈에서 거의 1/3을 차지한다. 막단백질이 신호전달, 메타볼리즘, 수송 및 인식 등 세포 과정에 있어 중요한 역할을 함에도 불구하고 그 구조 및 기능에 대해서는 많은 정보가 알려져 있지 않다. 막단백질의 생물학적 활성 제어에 실패하는 경우 심각한 질병을 야기, 흥미로운 약리학적 타겟이 되게 한다. 따라서 막단백질에 특이적인 항체의 수요가 증가되고 있다.
막단백질에 대응되는 특정 항체의 형성은 특정 타켓 막단백질의 생산 또는 분리가 불가능함으로써 제약이 되곤 한다. 체내에서 막단백질의 과발현은 단백질 오접힘(misfolding), 불용해성, 응집, 낮은 생산성 및 세포독성에 의해 종종 방해가 된다. 하지만, 막단백질의 무세포발현은 상기의 장애물들을 국복할 수 있다.
지난 수십년간, 무세포 단백질합성은 막단백질, 세포질, 심지어 독성 단백질을 포함하는 서로 다른 단백질 종류들을 생산하는 데에 중요한 수단이 되었다.(see, e.g. Katzen et al., Trends Biotechnol., 2005. 23(3), 150-156) 효율적인 무세포 발현 시스템의 기본은 리보솜, 번역요소 및 효소와 같은 번역에 필수적인 요소들을 포함하는 번역 활성적 세포 추출물이다. 나아가, 세포 용해물은 아미노산, ATP,GTP, 그리고 에너지 생성 시스템(예를 들어, 크레아틴-포스페이트/크레아틴-카이네이즈 에너지 생성 시스템)에 의해 보조된다. 타겟 단백질의 합성은 DNA 또는 mRNA형태의 적합한 템플레이트를 추가함으로써 시작된다. 지금까지는, 많은 다른 형태의 기능적으로 활성적인 타겟 단백질이 원핵 그리고 진핵 무세포 시스템에서 발현되었다. 원핵세포 추출물에 대비하여 진핵세포 용해물은 번역후 변형을 필요로 하는 복잡한 단백질의 발현에 여러 가지 이점을 준다.
그럼에도 불구하고, 특정 항체 생산을 위한 종래의 기술에 의한 원핵 그리고 진핵 세포 용해물을 이용한 단백질 합성은 원하는 타겟 단백질을 적절한 형태의 면역성 물질로 사용하기 위해서, 여전히 추가적인 실험실 정화 및/또는 분리 단계를 추가적으로 필요로 한다.
종래기술의 단점에 대해 본 발명의 주요한 목적은 특정 타겟 단백질에 대응하는 다중클론성 항체를 생산하기 위한 향상된 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
위와 같은 목적은 본 발명의 하기한 청구항 1 및 청구항 2에 따라 단백질 함유 막 소포를 포함하는 항원 조성물을 이용해 특정단백질에 대응하는 다중클론성 항체를 생산하는 새로운 방법을 제공함으로써 이루어졌다.
청구항 1에 따른 항원성 타겟 단백질에 대응하는 다중클론성 항체를 생산하는 방법은 항원성 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 포함하는 면역성 조성물을 숙주에 적용하여 숙주에서 면역 반응을 유도하는 단계; 및 숙주의 혈청에서 상기 타켓 단백질에 대응되는 항체를 얻는 단계를 포함한다.
청구항 2에 따른 더욱 구체적인 방법은 최소한 다음의 단계를 포함한다.
a) 타켓 단백질을 코팅하는 핵산 템플릿과 세포 용해액을 포함하는 반응 용액에서 체외 번역 방법을 통해 타켓 단백질을 합성하는 단계;
b) 용액에서 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 분리하는 단계;
c) 생리학적으로 호환되는 용액에 상기 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 투입하는 단계;
d) 상기 c) 단계의 막소포를 숙주에 적용하는 단계;
e) 숙주의 혈청 샘플로 상기 타켓 단백질에 대한 특정 면역반응을 테스트하는 단계; 및
f) 상기 타켓 단백질에 대해 특정 변역 반응을 보이는 숙주의 혈청으로부터 상기 타켓 단백질에 대응되는 특정 항원을 얻는 단계
본 발명자들의 실험에 의해, 최소한 하나의 타겟 단백질이 함입된 막 소포를 포함한 조제용 물질을 타겟 단백질에 대응되는 특정 항체를 만들기 위한 면역성 조성물로 바로 사용할 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 막 소포 조제용 물질은 필수적으로 숙주에 대해 비독성이며, 추가적인 면역자극보조제의 첨가 없이 강한 면역반응을 유도할 수 있다.
적합한 막 소포 조제용 물질은, 예를 들어, 타겟 단백질을 코딩하는 핵산 템플릿과 막 소포를 포함하는 세포 용해물을 포함하는 반응 용액에서 무세포 번역 반응을 수행하고, 용액에서의 번역반응 후 단백질을 포함한 소포를 분리하여 얻을 수 있다.
바람직하게는, 세포 용해물은 진핵 세포 용해물이다.
상기의 진핵 세포 용해물은 특별히 한정되지 않으며, 핵산 템플릿의 체외 번역반응에 필요한 모든 요소와, 선택적으로 합성된 타겟 단백질의 변형에 필요한 요소를 포함하는 어느 세포 용해물도 될 수 있다.
더 구체적으로, 진핵세포 용해액은 밀배아 용해물, 곤충, 특히 sf21 세포 용해물, 망상적혈구 용해물, 케라티노사이트 용해물, CHO 세포, HeLa 세포, 골수종 세포, 하이브리도마 세포 또는 배양된 림프종 세포의 세포추출물을 포함하여 이우러진 그룹에서 선택된다.
상기의 세포 용해물은 그 자연적인 형태 또는 특정 요소가 추가하거나 제거된 변형된 형태로 사용될 수 있다.
하기 실시예에서 사용된 무세포 시스템은 배양된 곤충세포(Spodoptera Frugiperda , Sf21)로부터 만들어진 번역 활성형태의 용출물에 기반한 것이다. 세포내 소기관을 온전하게 유지하기 위한 부드러운 용해물 준비 과정을 통해, 소포체(ER)의 핵심적인 부분이 용출물에 기능적으로 활성적인 막 소포로 유지될 수 있다. 소포를 포함하는 용해물을 이용하여, 글리코실화, 신호 펩타이드 절단, 지질화, 인산화, 그리고 이황화 결합 형성 등의 번역후 변형(PTMs)이 타겟 단백질에 행해질 수 있다.
특정 세포 라인에서 얻어진 첫번째 세포 용해물이 막 소포를 포함하지 않는 경우(예를 들어, 망상 적혈구), 소포는 예를 들어 다른 세포라인의 용해물과 같이 다른 소스로부터 더해질 수 있다.
바람직하게는, 막 소포와 세포 용해물은 같은 세포라인에서 유래한다.
나아가, 하나 이상의 요소가 합성되어 만들어진 인위적 세포 용해물도 사용될 수 있다.
체외 번역 반응을 위한 반응용액은 리보솜, 번역 요소 (translation factor)와 효소와 같은 번역을 위한 필수 요소를 포함하는 세포 용해물을 포함한다. 나아가, 용액 또는 세포 용해물은 아미노산, ATP, GTP, 그리고 에너지 생성 시스템(예를 들어, 크레아틴-포스페이트/크레아틴-카이네이즈 에너지 생성 시스템)에 의해 보조될 수 있다. 타겟 단백질의 합성은 DNA 또는 mRNA 형태의 타겟 단백질 핵산 템플릿을 첨가함으로써 시작된다.
합성된 타겟 단백질을 포함하는 막 소포는 해당 기술분야에서 알려진 적합한 방법, 특히 원심분리 또는 여과에 의해 반응 용액으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, a) 단계의 상기 체외 번역반응은 막 소포 내 합성된 단백질을 풍부하게 하는 조건에 영향을 받는다.
막 소포 내 합성된 단백질을 풍부하게 하기 위한 한가지 예시적 접근은 청구항 2의 방법을 변형한 것으로, 청구항 2의 b)단계 이후 아래의 추가적인 b')단계를 포함할 수 있다.
분리된 막소포를, 타켓 단백질을 코딩하는 핵산 템플릿과 막세포를 포함하지 않는 세포용해물을 포함하는 제2 반응용액에 넣고 상기 제2 반응용액에서 체외 번역반응을 수행하며, 증가된 합성 타겟 단백질을 포함하는 막세포를 분리하는 단계;
를 포함하며, 상기 b') 단계는 한번 이상 반복될 수 있음.
또 다른 실시예에서, a) 단계의 체외번역반응은 반응물 또는 생산물을 추가 및/ 또는 제거하는 연속적인 투석 기반 방법을 포함할 수 있다. 이 반응 포맷은 반응가능시간을 연장하여 전체 단백질 수율을 증가시킨다.
특히 위 실시예는 투석막으로 분리된 적어도 두개의 격실을 포함하고, 상기 두개의 격실 중 적어도 제1 반응 격실에는 번역 반응이 발생하고, 그리고, 번역 반응 동안, 반응물질이 적어도 하나의 공급 및 배출 격실로부터 상기 반응 격실 안으로 확산되고 그리고 반응 부산물은 상기 반응 격실로부터 상기 공급 및 배출 격실 속으로 확산되는 것을 특징으로 하는 기구로 실현될 수 있다.
바람직하게는, 카스파제 억제제가 적어도 반응 격실에 존재한다. 함께 출원중인 특허출원 DE 10 2013 015 977.6(출원일: 2013.9.25.)에서 보는 바와 같이 체외 번역 반응에서 카스파제 억제제의 존재는 진핵 세포 용해물이 사용된 무세포 번역 시스템에서 단백질 수율을 상당히 높힌다.
청구된 방법의 대표적인 실시예에서, 숙주에 적용되는 단백질 함유 막 소포를 포함하는 면역성 조성물은 추가적인 면역자극 보조제를 함유하지 않는다. 이미 언급한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 면역성 조성물은 추가적인 보조물질과 함께 제조될 수 있다.
상기 면역성 조성물에서 소포는 당 기술 분야에서 알려진 모든 형태의 적합한 생리학적으로 호환되는 용액 또는 버퍼 안에 포함될 수 있다. 특히, 생리학적으로 호환되는 용액 또는 버퍼는 의도된 숙주의 몸에 생리적으로 호환되어야 한다. 생리학적으로 호환되는 용액은 예를 들어 PBS일 수 있으나, 당 분야의 통상의 기술자에 의해 채용될 수 있는 다른 적합한 것도 가능하다.
면역화와 특정 다중클론성 항체를 얻기 위한 숙주는 당 기술분야에서 상기의 목적으로 사양되는 어떠한 숙주 동물도 가능하다. 대표적으로, 마우스(mouse), 랫(rat)과 같은 설치류, 염소, 양, 소 와 같은 인간이 아닌 포유류가 있다.
본 발명에 관련된 것으로 막 소포 조제조성물의 소포들 내에 타켓 단백질을 축적시키는 방법으로서, 최소한 다음의 단계들을 포함한다.
a) 타켓 단백질을 코팅하는 핵산 템플릿과 세포 용해액을 포함하는 반응 용액에서 체외 번역 방법을 통해 타켓 단백질을 합성하는 단계;
b) 용액에서 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 분리하는 단계;
c) 분리된 막소포를, 타켓 단백질을 코딩하는 핵산 템플릿과 막세포를 포함하지 않는 세포용해물을 포함하는 제2 반응용액에 넣고 상기 제2 반응용액에서 체외 번역반응을 수행하며, 증가된 합성 타겟 단백질을 포함하는 막세포를 분리하는 단계를 포함하며, 상기 c) 단계는 한번 이상 반복될 수 있음.
본 발명은 번역후 변형을 가지는 단백질과 막단백질과 같이 발현이 어려운 프로테이노제닉(proteinogenic) 단백질에 대응되는 다중클론성 항체의 생성을 빠르고 효율적으로 가능하게 하는 신규의 방법을 개시한다. 본 방법의 기본은 진핵 무세포 번역 시스템을 타겟 단백질의 합성, 이송 및 용해물 내 존재하는 소포체 유래 막 소포에의 함침에 이용하는 것이다. 무세포 단백질 합성 이후에, 함침된 타겟 단백질을 가진 소포는 용해물의 세포질 분획에서 분리되어 함침된 항원의 과정을 위한 수송 소포로 사용될 수 있다.
전체 방법은 도 1의 타겟 막 단백질에 대한 5개 주요 단계로 설명될 수 있다.
1. 타겟 단백질의 무세포 합성. 타겟단백질의 무세포 합성은 타겟 단백질이 용해성이고 올바르게 접힘이 일어날 수 있는 번역 시스템에서 이루어져야 한다. 막단백질의경우 합성 또는 자연적인 지질 또는 계면활성제(detergent)가 필요하다. 소포의 내강으로 타겟 단백질의 번역 위치 선점 또는 드 노보 합성된 타겟 막 단백질의 지질 이중층으로의 함침은 단백질 서열내 하나 이상의 신호 서열에 의해 시작된다.
위 첫번째 단계는 막 또는 소포체 유래 소포 내강의 타겟 (막) 단백질의 축적을 풍부하게 하는 것도 포함된다. 내생의(기존에 있던) 단백질 분획에 비해 드 노보 합성된 반백질의 분획을 풍부하게 하기 위해서는, 반복적인 합성이 수행될 수 있다. 여기서, 타겟 단백질은 여러 부분 반복 수행되는 무세포 반응에서 곤충 소포의 동일 배치(batch)에서 합성된다. 각각의 합성 단계이후에 소포는 수확되어 다음과정의 합성 과정에 적용되어 소포 막에 존재하는 외생적 막단백질의 연속적인 증가를 초래한다. 따라서 표준 배치 반응에서 1 내지 10μg/ml 정도 얻어지는 것과 비교하여 20 내지 30 μg/ml 로 단백질 수율이 향상될 수 있다.
2. 드 노보 합성된 (막) 단백질을 포함하는 소포체 유래 소포의 수확, 바람직하게는 원심분리에 의한. 소포체 유래 소포는 한번의 원심분리 단계에 의해 용해물의 세포질 부분으로 부터 분리될 수 있다. 원심분리된 소포를 생리적 pH 와 염분 농도를 가진 용액 또는 버퍼, 예를 들어 인산완충식염수(PBS)에 재부유된 후, 소포에 붙은 세포질 단백질을 제거하기 위해 위 용액/버터로 세척한다.
3. 수확되고 세척된 타겟 단백질을 포함한 소포는 면역원으로 사용될 수 있다. 소포 버퍼 용액은 실험 동물에 바로 주사된다.
4. 바람직하게는 적합한 휴식기간 후, 예를 들어 4주, 혈액을 채취한다.
5. 다원항체성 마우스 항혈청의 항원 인식력과 같은 능력이, 예를 들어 웨스턴 블랏 등에 의해 측정된다.
긍정적인 결과에 있어, 혈액 공여자는 단원클론성 항체의 생산을 위한 소스로 간주될 수 있다.
본 발명은 특정 타겟 단백질에 대응하는 다중클론성 항체를 생산하기 위한 향상된 방법 및 수단을 제공하는 것으로, 번역후 변형을 가지는 단백질과 막단백질과 같이 발현이 어려운 프로테이노제닉(proteinogenic) 단백질에 대응되는 다중클론성 항체의 생성을 빠르고 효율적으로 가능하게 하는 신규의 방법을 개시한다. 본 방법의 기본은 진핵 무세포 번역 시스템을 타겟 단백질의 합성, 이송 및 용해물 내 존재하는 소포체 유래 막 소포에의 함침에 이용하는 것이다. 무세포 단백질 합성 이후에, 함침된 타겟 단백질을 가진 소포는 용해물의 세포질 분획에서 분리되어 함침된 항원의 과정을 위한 수송 소포로 사용될 수 있다.
도 1은 원핵, 소포 기반의 번역 시스템을 이용한 무세포 합성 막단백질로 생쥐를 면역화하여 특정 항체를 생성하는 것을 표현한 도식화된 개요도.
도 2는 곤충 소포로 생쥐를 면역화하기 전/ 후의 생쥐 다원항체성 항혈청의 웨스턴블랏 분석도.
도 3은 무세포 합성된 Mel-trunc-EGFR의 TCA-침전과 이어진 지질 섬광 계수 및 방사선 사진을 이용한 분석도,
도 4는 곤충 용해액을 이용한 무세포 합성 Mel-trunc-EGFR-His의 His tag 정제도로서,
a) 전기영동 후 SDS-PAGE 젤을 Coomassie 염색
b) 1차 항체로 상업적으로 이용가능한 항 EGF 수용체 항체(Anti-EGF receptor D38B1 XP)를 사용하고, HRP-결합-항 토끼 항체를 2차 항체로 사용(HRP-cunjugated Anti-rabbit IgG)
도 5는 드노보 합성된 Mel-trunc-EGFR을 포함한 곤충 소포로 생쥐를 면역화하기 전/ 후의 생쥐 다원항체성 항혈청의 웨스턴블랏 분석도.
하기 실시예들은 제시된 특정 경계 조건 및 파라미터에 한정되지 않는다는 전제 하에 본 발명을 보다 상세하게 설명하는 역할을 한다.
레퍼런스 실시예
내재성 단백질을 함유한 막 소포로 쥐과 숙주를 면역화 후 항혈청 분석
본 실험에서 사용된 진핵 번역 시스템은 배양된 Spodoptera Frugiperda (Sf21) 세포로부터 유래된 번역적으로 활성화된 용해물에 기반하였고 sf21 곤충 세포의 소포체(ER)에서 유래한 기능적으로 내재된 막 소포를 포함한다.
첫번째 단계에서 곤충 소포와 그에 포함된 내재성 단백질을 생쥐에 주사하였을 때 면역 반응을 유도할 수 있는지 실험하였다. 두번째로, 프로이드 어주번트(Freund’s adjuvant)의 추가 없이도 곤충 세포가 면역 반응을 유도할 수 있지 실험하였다.
이러한 목적으로 8마리의 실험용 생쥐에 곤충 소포, 프로이드 어주번트, 그리고 PBS(표 1)의 서로 다른 혼합물을 주사하였다. 8마리 중 7마리는 마지막 혈액채취 후에도 생존했다. 모든 동물에서의 혈액채취는 첫번째 면역화 직전과 두번째 및 마지막 면역화 1주일 후에 수행되었다.
표 1: 적용된 면역원의 개요. 모든 실험쥐는 총 120 μl의 항원용액으로 면역화 되었다.
PBS 양
[μl]		 소포용액 양
[μl]		 프로이드 어주번트 양
[μl]		 면역화반응이 일어난
생쥐의 수
120 - - 2
60 60 - 2
- 60 60 2
60 - 60 2
막 소포로 면역화하기 전에 다음과 같이 준비되었다. : 곤충 소포를 16.000g(10min, 4℃)에서 원심분리하여 용해물의 용해성 분획으로부터 분리하였다. 상층액(SN)은 버리고, 소포 분획(VF)은 2배양의 PBS 버퍼로 3회 세척하였다. 3번째 세척단계이후 VF는 동일 부피의 곤충 용해물에 재부유되었다. 이 용액의 부분 표본은 PBS 버퍼에 1:2로 희석되었다. 이 용액의 120μl가 두 실험용 생쥐의 복강내 면역화에 사용되었다(strain BALB/c). 나머지 실험용 생쥐 여섯마리는 다음의 용액이 주사되었다: 두마리는 120μl PBS, 두마리는 PBS에 부유된 곤충 소포 및 프로이드 어주번트 (1:1 비율), 그리고 두마리는 PBS 버퍼와 프로이드 어주번트의 혼합물(1:1 비율). 두 주 휴식 후, 두번째 면역화(“boost”)가 첫번째 면역화와 유사하게 수행되었다. 두번째 면역화 후 1주일 경과 후, 모든 살아있는 동물에서 혈액을 채취하였다. 얻어진 항혈청은 다음 사용 전까지 20℃에서 보관되었다.
항혈청의 분석
얻어진 다중클론성 생쥐 항혈청은 웨스턴 블랏으로 분석되었다. 보통, 다중클론성 항혈청은 ELISA, 면역화에 사용된 항원이 미량정량판 위에 도포되는 방법, 에 의해 분석된다. 여기서는, 표준 방법을 이용하여 고정하기 어려운 지질 단백질 혼합물에 해당하는 항원이기에 다른 방법이 채용되었다. 따라서 항체와 항원간의 상호작용은 웨스턴 블랏에 의해 분석되었다.
이러한 목적으로 면역화를 위해 사용된 항원은 다음과 같이 준비되었다.: 곤충 소포를 위에서 설명한 원심분리로 용해물의 세포질 분획으로부터 분리하여 PBS에 3회 세척하였다. 다음으로, SN과 VP의 부분 표본은 아세톤에 침전되어 10% SDS-PAGE(NuPAGE®,10%Bis-TrisgelsMESSDSbuffer,Lifetechnologies)로 분리하였다.
단백질은 semi-dry-blot기술을 이용하여 폴리비닐리덴 플로오라이드 (PVDF) 멤브레인(life technologies)에 이동되었다(semi-dry blotting; iBlot system, life technologies, program 3). 블라팅 후에, 멤브레인은 상온에서 5분간 25ml TBS 버퍼에 담근 후, 25ml 블라킹 용액에 상온에서 한시간 또는 4℃에서 오버나잇(over night)으로 인큐베이션되었다. 블라킹 후에 멤브레인은 15ml TBS/Tween 에서 3회 세척되었다. 그후, 멤브레인은 SN과 VF 용해물 분획물을 포함하는 부분들로 조각내어졌다.
멤브레인 조각들은 상온에서 1시간동안 블라킹 버퍼에 1:2000의 비율로 희석된 서로 다른 다중클론성 생쥐 항혈청에서 인큐베이션되었다. TBS/Tween 에서 3회 세척 후, 멤브레인 조각들은 홀스래디쉬 과산화효소가 결합된 항-생쥐 항체(anti-mouse conjugated IgG, 1 : 1000 in blocking buffer). TBS/Tween 에서 3회 세척 후 멤브레인 조각들을 화학발광 검출 시약(ECL plus western blotting detection reagent, GE Healthcare)으로 멤브레인 조각을 5분간 인큐베이션 후 2차 항원을 감지하였다. 발관되는 빛은 phosphorimager system을 이용하여 감지되었다(Typhoon TRIO + Imager, GE Healthcare) (emission maximum 425 nm).
웨스턴 블랏 결과를 도 2에 나타내었다: 곤충 소포로 생쥐를 면역화하기 전/ 후의 생쥐 다원항체성 항혈청의 웨스턴블랏 분석. 동물의 면역화는 120μl PBS(A), 총 120μl 의 PBS 함유 소포(B), 총 120μl 의 PBS함유 소포+ 프로이드 아주번트(C), 120μl의 프로이드 아주번트(D). 면역원 A는B와 C에 대한 대조군을 나타낸다. 면역원 D는 C에 대한 대조군을 나타낸다. 멤브레인 조각은 1시간동안 상온에서 다중클론성 생쥐 혈청( 블라킹 버퍼에 1:2000으로 희석)에 인큐베이션된 후, HRP-결합 항-생쥐 항체(anti-mouse conjugated IgG, dilution 1 : 1000 in blocking buffer). M=단백질 마커(SeeBlue®Plus2,.Lifetechnologies),C=2차 HRP-결합 항-생쥐 항체에 대한 특정 대조군. 이 멤브레인 조각은 다중클론성 생쥐 혈청에 인큐베이션되지 않았다는 것을 제외하고는 다른 멤브레인 조각들과 같은 방법으로 취급되었다.
면역화하기 전의 생쥐 항혈청은 두개의 분석된 SN과 VF 용해물 분획에서 곤충 단백질을 특정하게 감지할 수 없었다. 오로지, SN으로부터 유래된 단백질에 대한 2차 항체의 비특정적 반응만이 관찰되었다. (도 2. C열, 멤브레인 조각은 생쥐 혈청에서 인큐베이션되지 않고, 2차 항체로만 인큐베이션되었다)
면역화 후 얻어진 생쥐혈청으로 SN 및 VP 멤브레인 조각을 인큐베이션 한 것은 VF에서 넓은 범위의 다양한 단백질 감지가 일어났지만, SN에서는 일어나지 않았다. 이러한 관점에서 곤충 소포에 프로이드 아주번트를 첨가한 것은 면역 반응의 세기에 있어서 긍정적 효과를 가지지 않았다.
도 2에서 보여주는 결과에서 내재성 단백질을 함유한 곤충 소포는 생쥐에서 충분한 면역 반응을 유도할 수 있었다. 대조군으로 두마리 생쥐는 PBS+프로이드 아주번트 만으로 면역화 되었다. 예상한데로 위 생쥐에서 얻어진 혈청에서는 단백질들이 감지되지 않았다.
실시예
이종(heterogeneous)의 타겟 단백질을 함유한 막 소포로 쥐과 숙주를 면역화 후 혈청 분석
곤충 용해물에서 막 단백질의 무세포 합성
본 발명의 주요 목적은 발현이 어려운 막 단백질에 대응되는 항체를 빠르고 효율적으로 생산하는 새로운 방법 개발에 관한 것이다. 모델 단백질로 사람 표피성장인자수용체(EGFR)의 잘린 변종(VIII-Deletion)이 선택되었다. 이 멤브레인 단백질은, 여기서 Mel-trunc-EGFR로 지칭, 흥미로운 실험 후보가 되는데, 이는 특정 암 소분류의 유발에 관여하는 단백질인 EGFR의 full length 형태에 대비하여 항상 활성화된 형태의 돌연변이체이기 때문이다.
곤충 소포 막의 타겟 단백질의 분획을 증가시키기 위해서, 다섯번의 반복적인 단백질 합성이 같은 종류의 소포 세트에서 수행되었다. 14C-leucine 이있는 상태에서 무세포 단백질 합성이 다음과 같이 수행되었다.: 배치 포맷의 번역 반응(1.5시간, 600rpm) 후에 번역 혼합물(TM)을 원심분리(16,000g, 10min, 4℃)하여 SN과 VF로 분리하였다. SN은 버리고 VF는 신선하고 번역 활성된 용해물로서 타겟 핵산(여기서는 mRNA)을 포함하고 소포는 포함하지 않는 용해물에 재부유하였다. 이 과정은 최대 4번까지 반복되어 총 5번의 연속적인 단백질 합성이 수행된다. 이러한 방법으로 타겟 단백질 Mel-trunc-EGFR은 전체과정동안 같은 세트의 소포에 이동된다.
첫번째 및 마지막 합성 과정에서 5μl의 부분 샘플을 TM, SN 그리고 VF에서 채취하여 단백질 수율, 단백질 크기 및 균질성을 분석하였다.
도 3: 무세포 합성된 Mel-trunc-EGFR의 TCA-침전과 이어진 지질 섬광 계수 및 방사선 사진을 이용한 분석. 무세포 단백질 합성은 14C-leucine 이있는 상태에서 곤충 용해물에 기반한 진핵 번역 시스템을 이용하여 수행되었다. 첫번째 합성(1X synthesis) 과 다섯번째 합성(2X synthesis) 후 번역 혼합물(TM), 원심분리 후의 상층 분획(SN), 그리고 소포 분획(VF) 내 Mel-trunc-EGFR를 분석하였다. Mel-trunc-EGFR는 겉보기 분자량으로 대략 98kDa(계산된 분자량은 105kDa)이었다. Mel-trunc-EGFR의 비방사성 샘플이 나란히 준비되어 면역화되었다. 도 3에서 나타는 바와 같이 5번의 반복된 합성 후에 VF내 Mel-trunc-EGFR의 단백질 수율은 7.8μg/ml에서 20.1μg/ml로(면역화 1),6.7μg/ml에서 15.6μg/ml으로(면역화 2)증가되어, 첫번째에서 다섯번째 합성에 이를 때까지 VF에서는 Mel-trunc-EGFR가 2.5배 증가하였다. 14C-leucine 이 있는 상태에서 합성된 Mel-trunc-EGFR과 나란히, Mel-trunc-EGFR의 비방사성 샘플도 준비되었다. 곤충 소포는 다섯번의 반복된 합성 후에 수확되어 상기와 같이 처리하였다. 외래 타겟 단백질을 포한하는 곤충 소포가 두마리 실험쥐 면역화에 사용되었다. 면역화 과정은 상기와 같은 방법으로 수행되었다.
곤충 소포로부터 Mel - trunc - EGFR -His의 정제
얻은 다중클론성 생쥐 혈청 내 EGFR-특이적인 항체의 존재를 확인하기 위해서 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다.
상기 목적을 위해 항원(무세포 합성된 Mel-trunc-EGFR)이 SDS-PAGE로 분리된 후 PVDF 멤브레인에 블랏팅 되었다. 항원 Mel-trunc-EGFR의 무세포 합성은 첫번째 합성 단계에서 1.5시간동안 500rpm, 27℃조건에서 수행되었다. 다음으로, 앞서 설명한 방법과 같이 곤충 소포를 수확 후 PBS에서 세차례 세척하였다.
이후, Mel-trunc-EGFR는 His-Tag 정제를 통하여 소포로부터 정제되었다. 이를 위해, C-말단에 His-Tag이 붙은 Mel-trunc-EGFR의 DNA-템플릿이 사용되었다. C-말단에 His Tag이 붙은 Mel-trunc-EGFR(Mel-trunc-EGFR-His)의 정제는 다음과 같은 과정으로 수행되었다. : Mel-trunc-EGFR-His의 무세포 합성이 Mel-trunc-EGFR에서와 같은 방법으로 첫번째 합성 단계에서 수행되었다. 합성 후, 번역 혼합물은 SN과 VF 용해물 분획으로 분리되었다.
곤충 소포에서 막 단백질을 배출하도록 하기 위해, VF를 1%의 마일드한 계면활성제 dodecyl-β-D-maltoside(DDM)을 함유한 PBS에 재부유하고, 4℃에서 오버나잇으로 인큐베이션 하였다. 그 후, 용액을 원심분리(20.000g, 1시간, 4℃)하고, 용해성 막 단백질을 포함하는 상층액을 Nichel-NTA 매트릭스에 적용하였다. Mel-trunc-EGFR-His의 정제는 Qiagen®Ni-NTA 막 단백질 키트를 이용하여 제조사의 지시법에 따라 수행되었다. 모든 각기 다른 분획의 샘플들은 1차 항체로 상업적으로 이용가능한 항 EGF 수용체 항체(Anti-EGF receptor D38B1 XP, 토끼 단원클론성 항체, 블로킹 버퍼에 1:1000으로 희석)를 사용하고, HRP-결합-항 토끼 항체를 2차 항체로 사용(HRP-cunjugated Anti-rabbit IgG, 1:2000으로 블로킹 버퍼에 희석)를 사용하여 SDS-PAGE gel과 웨스턴 블랏을 이용하여 분석되었다. 항체의 감지는 화학발광 검출 시약(ECL plus western blotting detection reagent, GE Healthcare)을 이용하여 수행되었다.
도 4: Mel-trunc-EGFR-His의 His-Tag 정제. Mel-trunc-EGFR-His 무세포 합성이 곤충 용해물에 기반한 진핵 번역 시스템을 이용하여 수행되었다.
a) 전기영동 후 SDS-PAGE 젤을 Coomassie 염색
b) 1차 항체로 상업적으로 이용가능한 항 EGF 수용체 항체(Anti-EGF receptor D38B1 XP)를 사용하고, HRP-결합-항 토끼 항체를 2차 항체로 사용(HRP-cunjugated Anti-rabbit IgG)한 웨스턴 블랏에 의한 Mel-trunc-EGFR-His의 감지. Mel-trunc-EGFR-His는 겉보기 분자량으로 대략 98kDa(계산된 분자량은 105kDa)이었다.
Marker=단백질 마커 SeeBlue®Plus2,Lifetechnologies.
도 4에서 SDS-PAGE 젤의 Coomassie 염색은 자연 번역 혼합물(TM)과 비교하여 eluate(용리) 분획 1 내지 5에서 내재성 용해물 단백질의 성공적인 제거를 나타낸다. 타겟 단백질 Mel-trunc-EGFR-His는 washing(세척) 분획 2 및 eluate 1, 2를 제외한 모든 테스트된 분획에서 감지되었다.
Mel - trunc - EGFR으로 면역화 후 다중클론성 생쥐 혈청의 분석
다음 과정으로, 드노보 합성된 Mel-trunc-EGFR를 함유하는 곤충 소포로 생쥐를 면역화한 후 얻은 다중클론성 생쥐 혈청으로 웨스턴 블랏에서 Mel-trunc-EGFR 감지를 실험하였다. 상기 목적을 위해 세가지 서로 다른 항원이 준비되었다:(i)처리되지 않은 곤충 소포, (ii) 무세포 합성된 Mel-trunc-EGFR를 함유한 곤충소포, 그리고 (iii) 정제된 Mel-trunc-EGFR-His. 항원은 SDS-PAGE로 분리되어 PVDF 막에 블랏팅 되었다. 웨스턴 블랏 멤브레인 조각은 세가지 종류의 생쥐 혈청에서 인큐베이션되었다:(a) 면역화 후 얻어진 생쥐 혈청(자연 형태) (b) 외래 막 단백질이 없는 곤충 소포로 면역화한 후 얻어진 생쥐 혈청, 그리고 (c) 무세포합성되어 막에 함침된 Mel-trunc-EGFR을 함유한 곤충 소포로 면역화 후에 얻어진 혈청.
상기 실험에 따른 결과는 도 5 및 표 2에 나타나 있다.
도 5: 드노보 합성된 Mel-trunc-EGFR을 포함한 곤충 소포로 생쥐를 면역화하기 전/ 후의 생쥐 다원항체성 항혈청의 웨스턴블랏 분석. Mel-trunc-EGFR이 없는 곤충 소포와 외래 무세포 합성된 Mel-trunc-EGFR(“EGFR”)을 함유한 곤충소포가 아세톤에 침전되고, 내재 단백질과 외래 타겟 단백질을 포함하는 함침된 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하였다. 다음으로, 무세포 합성되고 정제된 Mel-trunc-EGFR-His(“EGFR-His”)를 SDS-PAGE에 적용하였다. semi dry wetern blot을 이용하여 PVDF 멤브레인에 단백질을 성공적으로 이동시킨 후, 멤브레인 조각을 다중클론성 생쥐 혈청에서 인큐베이션하고, 다음으로 HRP-결합 항-생쥐 항체와 인큐베이션하였다. (anti-mouse conjugated IgG, 1 : 1000로 블라킹 버퍼에 희석)화살표는 Mel-trunc-EGFR/Mel-trunc-EGFR-His의 감지를 나타낸다(SeeBlue®Plus2,Lifetechnologies).
표 2: 다중클론성 생쥐 항혈청의 웨스턴 블랏에 의한 분석 개요. 서로 다른 항원(처리되지 않은 Mel-trunc-EGFR을 포함한 곤충 소포, 정제된 Mel-trunc-EGFR-His)이 SDS PAGE에서 분리되어 PVDF 멤브레인(semi-dry blotting technique)에 블라팅되었다. 곤충 소포 단독 또는 함침된 Mel-trunc-EGFR을 포함한 곤충 소포로 면역화 후 얻어진 생쥐 혈청이 Mel-trunc-EGFR와 Mel-trunc-EGFR-His의 감지를 위해 사용되었다. Minus(-)=무반응, Plus(+)= 단백질 감지.
혈청

항원 		면역화 전 곤충소포로 면역화 후 Mel-trunc-EGF를 포함하는 곤충소포로 면역화 후
처리되지 않은
곤충소포		 - + +
Mel-trunc-EGF를
함유하는 곤충소포		 - + +
정제된 Mel-trunc-EGF-His - - +
예상한 대로, 면역화 전 얻어진 생쥐 혈청의 적용은 단백질 밴드가 감지되지 않았다. 반대로, 곤충 소포로 면역화한 후 얻어진 생쥐 혈청은 Mel-trunc-EGFR을 포함하는 곤충 소포와 Mel-trunc-EGFR을 포함하지 않는 곤충소포 lane 모두에서 서로 다른 사이즈의 많은 단백질이 감지되었다. 이러한 관찰은 곤충 소포가 실험 동물에 잠재적으로 면역 반응을 초래할 수 있는 서로 다른 많은 내재적 막단백질을 포함하므로 예상된 것이다. 곤충 소포로 면역화 된 후 얻어지고 Mel-trunc-EGFR을 포함한 생쥐 혈청을 사용한 경우 비슷한 감지 패턴을 보였다. 예상한 대로, 정제된 Mel-trunc-EGFR은 Mel-trunc-EGFR을 포함하는 곤충 소포로 면역화된 후 얻어진 생쥐 혈청을 이용한 경우에만 감지되었고, 곤충 소포로만 면역화된 후 얻어진 생쥐 혈청을 이용한 경우에는 감지되지 않았다. 이러한 관찰은 다중클론성 생쥐 혈청(무세포 합성 Mel-trunc-EGFR을 포함하는 곤충 소포로 면역화된)을 사용함으로써 Mel-trunc-EGFR의 특정 감지되었다는 가정을 뒷받침한다.
다중클론성 생쥐 항혈청에 더하여, 상업적으로 이용가능한 항-EGFR 항체가 위 얻어진 결과를 검증하기 위한 Mel-trunc-EGFR 의 성공적인 블랏팅을 수행하기 위해 사용되었다.
상기 목적을 위해, 강한 버퍼조건 아래에서 PVDF 막으로부터 1차 및 2차 항체가 제거된다(“membrane stripping”). Membrane stripping 이후, 1차 항체로 상업적으로 이용가능한 항 EGF 수용체 항체(Anti-EGF receptor D38B1 XP, 토끼 단원클론성 항체, 블로킹 버퍼에 1:1000으로 희석)를 사용하고, HRP-결합-항 토끼 항체를 2차 항체로 사용(HRP-cunjugated Anti-rabbit IgG, 1:2000으로 블로킹 버퍼에 희석)하여 인큐베이션하였다. Mel-trunc-EGFR와 Mel-trunc-EGFR-His는 분리된 단백질 밴드로 감지되어 분석된 멤브레인 스트립에 무세포 합성된 단백질의 존재를 확인했다.

Claims (13)

  1. 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법으로서,
    상기 항원성 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 포함하는 면역성 조성물을 숙주에 적용하여 숙주에서 면역 반응을 유도하는 단계; 및
    숙주의 혈청에서 상기 타켓 단백질에 대응되는 항체를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    최소한 다음의 단계들을 포함하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법:
    a) 타켓 단백질을 코팅하는 핵산 템플릿과 세포 용해액을 포함하는 반응 용액에서 체외 번역 방법을 통해 타켓 단백질을 합성하는 단계;
    b) 용액에서 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 분리하는 단계;
    c) 생리학적으로 호환되는 용액에 상기 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 투입하는 단계;
    d) 상기 c) 단계의 막소포를 숙주에 적용하는 단계;
    e) 숙주의 혈청 샘플로 상기 타켓 단백질에 대한 특정 면역반응을 테스트하는 단계; 및
    f) 상기 타켓 단백질에 대해 특정 면역 반응을 보이는 숙주의 혈청으로부터 상기 타켓 단백질에 대응되는 특정 항원을 얻는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포용해물은 진핵세포용해물 인 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포 용해물은 밀배아 용해물, 곤충, 특히 sf21 세포 용해물, 망상적혈구 용해물, 케라티노사이트 용해물, CHO 세포, HeLa 세포, 골수종 세포, 하이브리도마 세포 또는 배양된 림프종 세포의 세포추출물을 포함하여 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막소포와 상기 세포 용해물은 동일 세포주로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포가 원심분리를 이용하여 용액에서 분리되는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 단계의 상기 체외 번역반응은 막 소포 내 합성된 단백질을 풍부하게 하는 조건에 영향을 받는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    제2항의 b)단계는 다음의 b')단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
    b')분리된 막소포를, 타켓 단백질을 코딩하는 핵산 템플릿과 막소포를 포함하지 않는 세포용해물을 포함하는 제2 반응용액에 넣고 상기 제2 반응용액에서 체외 번역반응을 수행하며, 증가된 합성 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 분리하는 단계를 포함하며, 상기 b') 단계는 한번 이상 반복될 수 있음.
  9. 제7항에 있어서,
    a)단계의 체외 번역 반응은 반응물 또는 생산물을 추가 및/ 또는 제거하는 연속적인 투석 기반 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    a)단계의 체외 번역 반응은 카스파제 억제제 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주에게 적용된 단백질 함유 막소포를 포함하는 면역 조성물은 다른 추가적인 면역자극 보조제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주는 인간이 아닌 포유류인 것을 특징으로 하는 항원성 타켓 단백질에 대응하여 다중클론성 항체를 제조하는 방법.
  13. 막 소포들 내에 타켓 단백질을 축적시키는 방법으로서, 최소한 다음의 단계들을 포함하는 방법.
    a) 타켓 단백질을 코팅하는 핵산 템플릿과 막소포를 포함하는 세포 용해액을 포함하는 반응 용액에서 체외 번역 방법을 통해 타켓 단백질을 합성하는 단계;
    b) 용액에서 합성된 타켓 단백질을 포함하는 막소포를 분리하는 단계;
    c) 분리된 막소포를, 타켓 단백질을 코딩하는 핵산 템플릿과 막세포를 포함하지 않는 세포용해물을 포함하는 제2 반응용액에 넣고 상기 제2 반응용액에서 체외 번역반응을 수행하며, 증가된 합성 타겟 단백질을 포함하는 막세포를 분리하는 단계를 포함하며, 상기 c) 단계는 한번 이상 반복될 수 있음.
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